CN102459570A - 具有改善的阿拉伯糖利用率的发酵单胞菌属细菌 - Google Patents

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CN102459570A CN201080027108XA CN201080027108A CN102459570A CN 102459570 A CN102459570 A CN 102459570A CN 201080027108X A CN201080027108X A CN 201080027108XA CN 201080027108 A CN201080027108 A CN 201080027108A CN 102459570 A CN102459570 A CN 102459570A
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Abstract

本发明涉及工程化若干个阿拉伯糖利用发酵单胞菌属菌株以表达阿拉伯糖-质子同向转运体，其被发现向所述菌株提供改善的阿拉伯糖利用能力。这些菌株在包含阿拉伯糖的培养基中具有改善的乙醇产量，所述阿拉伯糖作为唯一碳源，或者作为糖混合物中的其中一种糖。

Description

具有改善的阿拉伯糖利用率的发酵单胞菌属细菌
政府权利声明
本发明根据能源部授予的合同号DE-FC36-07GO17056受到美国政府的支持。美国政府拥有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及微生物学和发酵的领域。更具体地讲，描述了赋予改善的阿拉伯糖利用率的发酵单胞菌属菌株以及使用该菌株制备乙醇的方法。
发明背景
通过微生物生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。希望生产乙醇以及其他产品的微生物以能够利用木糖和阿拉伯糖作为碳源，因为这些糖是水解木质纤维质材料中的主要戊糖，它们能够提供丰富可利用的低成本碳底物源用于在发酵中的生物催化利用。
天然不可利用木糖和阿拉伯糖的运动发酵单胞菌和其他产乙醇细菌可进行遗传工程化以利用这些糖。为了提供木糖利用能力，已经对菌株进行工程化以表达编码以下蛋白的基因：1)木糖异构酶，其催化木糖转化成木酮糖；2)木酮糖激酶，其将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶(US 5514583，US 6566107；Zhang等人(1995)Science 267：240-243)。为了提供阿拉伯糖利用能力，已经导入了编码以下蛋白的附加基因：1)L-阿拉伯糖异构酶，其将L-阿拉伯糖转化成L-核酮糖，2)L-核酮糖激酶，其将L-核酮糖转化成L-5-磷酸核酮糖，和3)L-5-磷酸核酮糖-4-差向异构酶，其将L-5-磷酸核酮糖转化成D-木酮糖(US5843760)。
虽然已经将一些运动发酵单胞菌的菌株进行工程化以利用阿拉伯糖，但这些工程化菌株通常仅利用发酵培养基中存在的低百分比的阿拉伯糖。当在包含阿拉伯糖的培养基中进行发酵时，需要改善发酵单胞菌属和其他产乙醇细菌的阿拉伯糖利用率以促进乙醇生产。
发明概述
本发明涉及发酵单胞菌属和发酵杆菌属菌株，它们通过导入表达阿拉伯糖-质子同向转运体的基因进行遗传工程化以具有改善的阿拉伯糖利用能力，并利用这些菌株生产乙醇。当在包含阿拉伯糖的培养基中生长时，这些菌株具有改善的乙醇生产。
因此，本发明提供发酵单胞菌属或发酵杆菌属的重组微生物，它们利用阿拉伯糖以生产乙醇，所述微生物包含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。
此外，本发明提供生成发酵单胞菌属或发酵杆菌属重组微生物的方法，它们具有提高的阿拉伯糖利用率，所述方法包括：
a)提供在合适条件下利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株；以及
b)将至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因导入(a)的菌株。
在另一个实施方案中本发明提供生产乙醇的方法，所述方法包括：
a)提供利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株，所述菌株包含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因；
b)在包含阿拉伯糖的培养基中培养(a)的菌株，从而由所述菌株将阿拉伯糖转化成乙醇。
在另一个实施方案中本发明提供由利用阿拉伯糖的微生物改善阿拉伯糖利用率的方法，所述方法包括：
(a)提供利用阿拉伯糖的微生物，其中所述微生物选自利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株；
(b)将至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因导入所述微生物的基因组，其中所述转运体由所述微生物表达；以及
(c)使(b)的所述微生物接触包含阿拉伯糖的培养基，其中所述微生物以比缺乏阿拉伯糖-质子同向转运体的所述微生物提高的速率代谢所述阿拉伯糖。
附图简述和序列描述
通过下面的具体实施方式、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些详细描述、附图和序列描述形成本专利申请的一部分。
图1示出经工程化以利用木糖和阿拉伯糖的发酵单胞菌属中的乙醇发酵途径，其中glf指葡萄糖易化扩散转运蛋白。
图2是pARA205的质粒图谱。
图3是pARA354的质粒图谱。
图4示出在96小时内MRM3A5中的ZW705(a)、ZW705-ara354(b)、和ZW705-ara354A7(c)的生长和代谢特征图。
图5示出在96小时内MRM3A2.5X2.5G5中的ZW705(a)、ZW705-ara354(b)、和ZW705-ara354A7(c)的生长和代谢特征图。
图6是pARA112的质粒图谱。
图7是pARA113的质粒图谱。
图8示出在96小时内MRM3A5中的ZW705-ara354A7(a)、ZW705-ara354A7-ara112-2(b)和ZW705-ara354A7-ara112-3(c)的生长和代谢特征图。
图9示出在96小时内MRM3A2.5X2.5G5中的ZW705-ara354A7(a)、ZW705-ara354A7-ara112-2(b)和ZW705-ara354A7-ara112-3(c)的生长和代谢特征图。
图10示出在96小时内MRM3A5中的ZW705-ara354(a)、ZW705-ara354-ara112-1(b)和ZW705-ara354-ara112-2(c)的生长和代谢特征图。
图11示出在96小时内MRM3A2.5X2.5G5中的ZW705-ara354(a)、ZW705-ara354-ara112-1(b)和ZW705-ara354-ara112-2(c)的生长和代谢特征图。
图12示出在96小时内MRM3A5中的ZW801-ara354(a)、ZW801-ara354-ara112-5(b)和ZW801-ara354-ara112-6(c)的生长和代谢特征图。
图13示出在96小时内MRM3A2.5X2.5G5中的ZW801-ara354(a)、ZW801-ara354-ara112-5(b)和ZW801-ara354-ara112-6(c)的生长和代谢特征图。
下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)，以及行政指导的208节和附录C)相一致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
表1：araE编码的阿拉伯糖-质子同向转运体的蛋白和编码区SEQ ID  NO
  生物  SEQ ID NO：编码区  SEQ ID NO：肽
  大肠杆菌   1   2
  福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)   3   4
  鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)   5   6
  痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)   7   8
  鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)   9   10
  肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)   11   12
  肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)   13   14
  产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)   15   16
  致癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)   17   18
  解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)   19   20
SEQ ID NO：21和22分别是大肠杆菌araA基因的氨基酸序列和编码区。
SEQ ID NO：23和24分别是大肠杆菌araB基因的氨基酸序列和编码区。
SEQ ID NO：25和26分别是大肠杆菌araD基因的氨基酸序列和编码区。
SEQ ID NO：27是araB-araA DNA片段PCR产物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：28和29是用于PCR扩增araB-araADNA片段的引物核苷酸序列。
SEQ ID NO：30是araD DNA片段PCR产物的核苷酸序列，包括RBS和3’UTR。
SEQ ID NO：31和32是用于PCR扩增araD DNA片段的引物核苷酸序列，包括RBS和3’UTR。
SEQ ID NO：33是运动发酵单胞菌的Pgap启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：34和35是用于PCR扩增Pgap启动子DNA片段的引物核苷酸序列。
SEQ ID NO：36是Pgap启动子DNA片段PCR产物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：37和38是PCR扩增抗奇放线菌素盒的引物核苷酸序列。
SEQ ID NO：39和40是诱变Pgap以除去加入的NcoI位点的引物核苷酸序列。
SEQ ID NO：41是pARA205质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：42和43是用于PCR扩增LDH-L DNA片段的引物核苷酸序列。
SEQ ID NO：44是LDH-L DNA片段PCR产物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：45和46是用于PCR扩增LDH-R DNA片段的引物核苷酸序列。
SEQ ID NO：47是LDH-R DNA片段PCR产物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：48是LoxPw-aadA-LoxPw DNA片段PCR产物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：49是pARA354质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：50和51是用于PCR扩增以检查Pgap-araBAD-aadA的5’整合的引物核苷酸序列。
SEQ ID NO：52和53是用于PCR扩增以检查Pgap-araBAD-aadA的3’整合的引物核苷酸序列。
SEQ ID NO：54和55是用于PCR扩增araE编码区的DNA片段的引物核苷酸序列。
SEQ ID NO：56是araE DNA片段PCR产物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：57和58是用于PCR扩增araFGH DNA片段的引物核苷酸序列。
SEQ ID NO：59是araFGH DNA片段PCR产物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：60和61是用于PCR扩增密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)Pgi DNA片段的引物核苷酸序列。
SEQ ID NO：62是在质粒中用作PCR模板的密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)GI启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：63是密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)Pgi DNA片段PCR产物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：64是抗氯霉素标记的核苷酸序列。
SEQ ID NO：65是pARA112质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：66是pARA113质粒的核苷酸序列。
发明详述
本发明描述具有改善的阿拉伯糖利用率的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株以及通过导入编码阿拉伯糖-质子同向转运体的基因来工程化菌株的方法，所述菌株进一步被工程化以表达阿拉伯糖-质子同向转运体。在其他方面，本发明描述了用于改善阿拉伯糖利用率的方法和使用所述菌株在包含阿拉伯糖的培养基中生产乙醇的方法。表达阿拉伯糖-质子同向转运体的阿拉伯糖利用菌株具有改善的阿拉伯糖利用率并且可用于在包含阿拉伯糖的培养基中生产乙醇。
由本发明具有改善的阿拉伯糖利用率的菌株生产的乙醇可用作替代化石燃料的能源。
以下缩写和定义将用于说明书和权利要求的判读。
如本文所用，术语“包含”、“由组成”、“包括”、“涵盖”、“具有”、“含有”、“包容”或“容纳”或其任何其它变型旨在包括非排他的包含物。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件A或B：A是真实的(或存在的)且B是虚假的(或不存在的)，A是虚假的(或不存在的)且B是真实的(或存在的)，以及A和B都是真实的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分例证(即出现)次数的位于本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一种或至少一种，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
“基因”指能够表达特定蛋白的核酸片段，其可包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”或“野生型”基因指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含非天然一起存在的调节序列和编码序列。因此嵌合基因可包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或者来源于相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调节序列和编码序列。“内源性基因”指在生物基因组中的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可以包含插入到非天然生物内的天然基因，或嵌合基因。
术语“araE”指编码细菌阿拉伯糖-质子同向转运体蛋白的基因或基因构建体，其具有低亲和力和高容量阿拉伯糖转运蛋白，Km为1.25×10-4M。编码阿拉伯糖-质子同向转运体蛋白的基因可分离自多种细菌，并且来自肠道细菌如埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、和志贺氏菌属(Shigella)的那些细菌尤其可用于本发明。
术语“阿拉伯糖利用率”当用于微生物时指微生物利用阿拉伯糖生产产品尤其是乙醇的能力。
术语“适应菌株”指为了改善其利用特定碳源生产产品的能力已经被选择在该碳源上生长的微生物。例如“阿拉伯糖适应菌株”是已经经选择在高浓度阿拉伯糖上生长的微生物菌株。
术语“基因构建体”指编码表达一种或多种特定蛋白的核酸片段。在基因构建体中基因可以是天然的、嵌合的、或外来的。通常基因构建体将包含“编码序列”。“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。
“启动子”或“启动控制区”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整体源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至可包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。
如本文所用，术语“表达”指转录和衍生自基因的有义(mRNA)或反义RNA的稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。“超表达”指在转基因生物中生产基因产物的水平超过在正常或非转化生物中的生产水平。“共抑制”指生产的有义RNA转录物或片段能够抑制相同的或基本上类似的外源或内源基因的表达(美国专利5,231,020)。
如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物内，导致在基因上稳定遗传。转化的核酸可以是宿主细胞中保留的质粒形式，或者一些转化的核酸可以被整合进宿主细胞基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。
如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可为源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起导入细胞中。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
术语“选择性标记”指一种鉴定因子，通常是抗生素或化学药品抗性基因，该因子能基于标记基因的效应，即，对抗生素的抗性进行选择，其中所述效应用于追踪遗传的受关注核酸和/或用于鉴定遗传了受关注核酸的细胞或生物。
如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
术语“经密码子最优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物通常的密码子使用。
术语“碳源”指在发酵过程中能被微生物利用以生产产品如乙醇的糖，例如低聚糖和单糖(“可发酵糖”)。微生物可具有利用单一碳源生产产品的能力，并且同样地碳源本文指“单一”碳源。
术语“木质纤维质”指包含木质素和纤维素的组合物。木质纤维质材料也可包含半纤维素。
术语“纤维质”指包含纤维素和包括半纤维素在内的附加组分的组合物。
术语“糖化”指从多糖中生产可发酵糖或碳源。
术语“预处理的生物质”意指在糖化之前已经经过预处理的生物质。
“生物质”指任何纤维质或木质纤维质材料，并包括包含纤维素的材料，以及任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于玉米芯、作物残余如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、蔗渣、高粱渣或秸秆、大豆秸秆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及矮树丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的研磨物的组分。
“生物质水解产物”指来源于生物质糖化的产物。生物质也可在糖化前进行预处理或预加工。
术语“异源”指非天然存在于受关注的位置。例如异源基因指宿主生物中非天然存在的但是通过转基因被导入到宿主生物中的基因。例如，存在于嵌合基因中的异源核酸分子是与其他嵌合基因片段相关的非天然存在核酸分子，例如具有彼此非天然相关的编码区和启动子片段的核酸分子。
如本文所用，“分离的核酸分子”是RNA或DNA的聚合物，它是单链或双链的，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离型核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并例示于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning： A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)，尤其是其中的第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格度”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤可确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC，0.5％SDS在室温洗涤15分钟，然后用2X SSC，0.5％SDS在45℃重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％SDS在50℃重复洗涤两次，每次30分钟。一组较优选的严格性条件使用较高温度，其中洗涤步骤与上述那些步骤相同，不同的是最后两次用0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1X SSC、0.1％SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1％SDS中于65℃下杂交，并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格度，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格度取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域内熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。可杂交核酸的最小长度优选地为至少约15个核苷酸；更优选地为至少约20个核苷酸；最优选地长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Altschul，S.F.，等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定真菌蛋白质的完整的氨基酸和核苷酸序列。受益于本文所报道的序列，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的基本部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括在附随序列表中报道的完全序列，以及那些上述序列的主要部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
术语“同源性”或“同源”本文互换使用。它们指这样的核酸片段，即其中一个或多个核苷酸碱基改变并不会影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，该修饰基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域的技术人员应当理解的，本发明涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。
此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的同源核苷酸序列也由它们在中等严格条件(如0.5X SSC，0.1％SDS，60℃)下，与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本发明核苷酸序列的任何部分以及杂交至与本文所公开的任何核苷酸序列功能相当的序列的能力所限定。
如本领域所熟知的，术语“％同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过此类序列串之间的匹配情况进行测定。“同一性”和“相似性”能够通过已知的方法容易地计算，包括但不限于以下文献中所述的方法：1.)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)，Oxford University：NY(1988)；2.)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)，Academic：NY(1993)；3.)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)，Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in Molecular  Biology(von Heinje，G.编辑)，Academic(1987)；和5.)Sequence Analysis  Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.，Eds.)Stockton：NY(1991)。
设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和％同一性计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.，Madison，WI))中的MegAlignTM程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于称为ClustalV比对方法的“Clustal V比对方法”，该方法描述于Higgins和Sharp，(CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))中，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于缺口罚分(GAP PENALTY)＝10和缺口长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的％同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4和DIAGONALS SAVED＝4。在用Clustal V程序进行序列比对后，有可能通过观察相同程序中的“序列距离”表来获得“％同一性”。此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法相当于称为Clustal W(在Higgins和Sharp，CABIOS；5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992)中有所描述)和可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM v6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数(缺口罚分＝10、缺口长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30、DNA转换权重(DNA TransitionWeight)＝0.5、蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列和DNA权重矩阵(DNA Weight Matrix)＝IUB)。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“％同一性”。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其他物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。％同一性的有用实例包括但不限于：24％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或者从24％至100％的任何整数百分比可用于描述本发明，例如25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1)GCG程序软件包(Wisconsin PackageVersion 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)Sequencher(GeneCodes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版；Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，New York，1989(下文称为“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.Experiments with GeneFusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，New York，1984；以及Ausubel，F.M.等人，In Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing和Wiley-Interscience出版，1987。
本发明涉及利用阿拉伯糖的发酵单胞菌属或发酵杆菌属工程化菌株和使用所述菌株生产乙醇的方法，所述菌株当在包含阿拉伯糖的培养基中发酵时具有改善的阿拉伯糖利用率。通过在培养基中的生物催化剂进行发酵改善乙醇生产的一个挑战是获得高效的阿拉伯糖利用率，所述培养基包括生物质水解产物，其通常通过预处理或糖化生物质来生产。阿拉伯糖是水解木质纤维质材料中的其中一种主要戊糖，另一种是木糖。申请人已经发现当在包含阿拉伯糖的培养基中发酵时，表达阿拉伯糖-质子同向转运体导致阿拉伯糖利用菌株的阿拉伯糖利用率提高，因此导致乙醇产量提高。
利用阿拉伯糖的宿主菌株
可使用能利用阿拉伯糖作碳源的任何发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株作为制备本发明所用的菌株的宿主。已经进行过工程化以将阿拉伯糖发酵成乙醇的发酵单胞菌属菌株如运动发酵单胞菌是尤其有用的。发酵单胞菌属已经通过导入基因进行工程化以利用阿拉伯糖，所述基因编码1)L-阿拉伯糖异构酶，其将L-阿拉伯糖转化成L-核酮糖，2)L-核酮糖激酶，其将L-核酮糖转化成L-5-磷酸核酮糖，和3)L-5-磷酸核酮糖-4-差向异构酶，其将L-5-磷酸核酮糖转化成D-木酮糖(US5843760并描述于本文实施例1和2中；参见图1中的图表)。编码这些酶的DNA序列可获取自能够代谢阿拉伯糖的任何微生物。编码区的来源包括克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、根瘤菌属(Rhizobium)、农杆菌属(Agrobacterium)、和沙门氏菌属(Salmonella)。尤其有用的是L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌编码区：araA编码区(编码区SEQ IDNO：21；蛋白质SEQ ID NO：22)、L-核酮糖激酶的大肠杆菌编码区：araB编码区(编码区SEQ ID NO：23；蛋白质SEQ ID NO：24)、和L-5-磷酸核酮糖-4-差向异构酶的大肠杆菌编码区：araD编码区(编码区SEQ IDNO：25；蛋白质SEQ ID NO：26)。这些蛋白和它们的编码区在其他利用阿拉伯糖的微生物如上述那些微生物中可为易于由本领域技术人员鉴别的，鉴别使用下述用于araE的生物信息学或实验方法。
此外，在从阿拉伯糖到木糖的生物合成途径中利用转酮醇酶和转醛醇酶活性(参见图1)。转酮醇酶和转醛醇酶是戊糖磷酸化途径中的两种酶，它们将5-磷酸木酮糖转化成连接戊糖代谢与Entner-Douderoff糖酵解途径的中间体，该途径使阿拉伯糖或木糖代谢成乙醇。这些可为内源活性，或者内源活性可补充这些酶导入的活性。
通常也工程化利用阿拉伯糖的发酵单胞菌属以利用木糖。如以引用方式并入本文的US 5514583所述，通常已将四个基因导入运动发酵单胞菌中表达四种涉及木糖代谢(图1)的酶。这些包括编码如上所述的转酮醇酶和转醛醇酶以及木糖异构酶的基因，所述酶催化木糖转化成木酮糖，并且木酮糖激酶磷酸化木酮糖以形成5-磷酸木酮糖(参见图1)。编码这些酶的DNA序列可从能够代谢木糖的多种微生物中的任何一种获得，例如肠细菌和一些酵母以及真菌。编码区的来源包括黄单胞菌属(Xanthomonas)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、红细菌属(Rhodobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、农杆菌属(Agrobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonads)、和发酵单胞菌属(Zymomonas)。尤其有用的是大肠杆菌的编码区。
就表达而言，用于利用阿拉伯糖的蛋白和利用木糖的蛋白的编码DNA序列被可操作地连接至在运动发酵单胞菌细胞中表达的启动子和转录终止子上。可使用的启动子的实例包括运动发酵单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的启动子(GAP启动子；Pgap)、运动发酵单胞菌烯醇化酶编码基因的启动子(ENO启动子；Peno)、和密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)木糖异构酶编码基因的启动子(GI启动子，Pgi)。编码区可通常以嵌合基因形式从启动子上单个表达，或者两个或更多个编码区可在操纵子中接合，从相同启动子上表达。所得嵌合基因和/或操纵子通常在载体中构建或转移到载体中用于进一步的操纵。
载体是本领域熟知的。尤其可用于在发酵单胞菌属中表达的是能在大肠杆菌属和发酵单胞菌属中复制的载体，例如在美国专利5,514,583中描述的pZB188。载体可包括在细胞中自主复制的质粒和携带载体整合进细胞基因组的质粒。用于DNA整合的质粒可包括转座子、与靶细胞基因组同源的核酸序列区域、定点整合序列、或其他支持整合的序列。在同源重组中，侧接靶整合位点的DNA序列位于邻接抗奇放线菌素基因或其他选择性标记的位置，并且期望的嵌合基因导致选择性标记和嵌合基因插入如本文实施例2所述的靶基因组位点。此外，选择性标记可由位点特异性的重组位点限定，以便在表达对应的位点特异性重组酶后可从基因组中切除抗性基因。
特别有用的是利用木糖的菌株，它们包括CP4(pZB5)(US5514583)、ATCC31821/pZB5(US 6566107)、8b(US 20030162271；Mohagheghi等人，(2004)Biotechnol.25；321-325)、和具有衍生物ZW800和ZW801-4的ZW658(共有的和共同未决的美国专利申请公布#US20080286870；保藏号ATTCC#PTA-7858)。也可使用ZW705，其在共同拥有和共同未决的美国专利申请#12/641642中描述，该专利以引用方式并入本文。可使用的阿拉伯糖利用菌株在以引用方式并入本文的US5843760中公开，以及在本文实施例1和2中描述。
对阿拉伯糖利用的适应
申请人发现如上所述经工程化用于木糖和阿拉伯糖利用的运动发酵单胞菌菌株在测试生长条件下利用其中阿拉伯糖是唯一碳源(50g/L)的培养基中约33％的阿拉伯糖以及包括混合糖的培养基中约68％的阿拉伯糖，所述混合糖含25g/L阿拉伯糖、25g/L木糖、和50g/L葡萄糖。在获得具有改善的阿拉伯糖利用率的菌株的尝试中，申请人通过如本文实施例2所述在以50g/L阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基中通过连续培养使来自木糖和阿拉伯糖利用菌株的细胞适应。使用这种方法，获得分离的菌株，其具有在利用培养基中的阿拉伯糖方面的显著改善，其中阿拉伯糖是培养基中的唯一碳源，该菌株是阿拉伯糖适应菌株。例如，一种菌株利用培养基中约83％的阿拉伯糖，其中50g/L的阿拉伯糖是唯一的碳源。在包含25g/L阿拉伯糖、25g/L木糖、和50g/L葡萄糖的混合糖培养基中，改善幅度较低：约74％的阿拉伯糖被利用。在混合糖培养基中阿拉伯糖的利用率与葡萄糖和木糖的利用率相比也较低。
为了获取具有改善的阿拉伯糖利用率的菌株，进行工程化以表达上述阿拉伯糖利用基因的菌株可通过在包含阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基中连续生长进行了适应，培养基中的阿拉伯糖浓度介于约20g/L和100g/L之间或更高。适应可对较低浓度的阿拉伯糖发生，但是初始生长浓度为约20g/L或更高。连续生长通常为至少约25次倍增。适应可在利用阿拉伯糖的菌株导入下述异源阿拉伯糖-质子同向转运体之前或之后发生。此外，细胞可在导入异源阿拉伯糖-质子同向转运体之前和之后发生适应。
工程化改善阿拉伯糖利用率的发现
申请人工程化发酵单胞菌属木糖和阿拉伯糖利用菌株以表达大肠杆菌中存在的两种不同的阿拉伯糖转运系统。两个系统是1)ABC转运蛋白，其由araFGH编码的三种蛋白组成：araF编码的33kD周质阿拉伯糖结合蛋白、araG编码的55kD膜结合ATP酶、和araH编码的34kD膜结合蛋白；和2)由一种蛋白组成的阿拉伯糖-质子同向转运体：由araE编码的52kD的阿拉伯糖-质子同向转运体。ABC转运蛋白是高亲和力和低容量的阿拉伯糖转运蛋白，它具有3×10-6M的Km，而阿拉伯糖-质子同向转运体是低亲和力和高容量阿拉伯糖转运蛋白，其具有1.25×10-4M的Km。申请人发现表达ABC转运蛋白实际上导致仅有阿拉伯糖的培养基中的阿拉伯糖利用率降低。表达阿拉伯糖-质子同向转运体提高仅有阿拉伯糖的培养基和混合糖培养基中的阿拉伯糖利用率。因此申请人已经发现不是大肠杆菌ABC转运蛋白改善阿拉伯糖利用率，而是阿拉伯糖-质子同向转运体改善发酵单胞菌属中的阿拉伯糖利用率。随着阿拉伯糖-质子同向转运体的表达，在仅有阿拉伯糖的培养基和混合糖培养基中的阿拉伯糖利用率显著提高。
表达阿拉伯糖-质子同向转运体在所有测试菌株中提高阿拉伯糖利用率。这些包括不发生适应的阿拉伯糖和木糖利用运动发酵单胞菌菌株、已经在胁迫条件下适应木糖利用的阿拉伯糖和木糖利用运动发酵单胞菌菌株(在共有的和共同未决的美国专利申请#12/641642中公开，其以引用方式并入本文)、已经在胁迫条件下适应木糖利用并且如本文上文及实施例2所述也适应阿拉伯糖利用的阿拉伯糖和木糖利用运动发酵单胞菌菌株。在不适应阿拉伯糖的菌株中，在仅有阿拉伯糖的培养基以及混合糖培养基中的阿拉伯糖利用率提高了至少约28％。在适应阿拉伯糖的菌株中，在混合糖培养基中的阿拉伯糖利用率也提高了至少约28％。在仅有阿拉伯糖的培养基中，不表达阿拉伯糖-质子同向转运体的阿拉伯糖适应亲本菌株的阿拉伯糖利用率水平已经为约80％，因此阿拉伯糖利用率的提高程度不能超过20％，为约18％。
因此能够利用阿拉伯糖的任何发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株也称为阿拉伯糖利用菌株，它们可用于产生本发明的菌株。尤其有用的是附加地利用木糖和葡萄糖的菌株。在这些菌株中通过表达阿拉伯糖-质子同向转运体改善的阿拉伯糖利用率为至少约10％。阿拉伯糖利用率可改善至少约10％、12％、16％、18％、20％、24％、28％或更高。％改善可取决于使用的生长条件、包括培养基类型，和用于工程化表达阿拉伯糖-质子同向转运体的亲本微生物以及特定的所得工程化菌株而不同。引起不同的因素包括导入的阿拉伯糖-质子同向转运体的表达水平和所得转运蛋白活性水平，它们可在转化体之间不同。
阿拉伯糖-质子同向转运体的表达
在本发明工程化的发酵单胞菌属或发酵杆菌属细胞中，可表达任何细菌阿拉伯糖-质子同向转运体以提供提高的阿拉伯糖利用率。在发酵单胞菌属或发酵杆菌属中表达的细菌阿拉伯糖-质子同向转运体蛋白以及它们的编码序列是异源的，因为它们不天然存在于发酵单胞菌属或发酵杆菌属中。阿拉伯糖-质子同向转运体蛋白和可表达的编码序列的实例包括由以下菌种的araE基因编码的那些：大肠杆菌(编码区SEQ ID NO：1；蛋白质SEQ ID NO：2)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)(编码区SEQID NO：3；蛋白质SEQ ID NO：4)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)(编码区SEQ ID NO：5；蛋白质SEQ ID NO：6)、Shigella dysenteriae(痢疾志贺氏菌)(编码区SEQ ID NO：7；蛋白质SEQ ID NO：8)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(编码区SEQ ID NO：9；蛋白质SEQID NO：10)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)(编码区SEQ ID NO：11；蛋白质SEQ ID NO：12)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)(编码区SEQ ID NO13；蛋白质SEQ ID NO：14)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(编码区SEQ ID NO：15；蛋白质SEQ ID NO：16)、生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)(编码区SEQ ID NO：17；蛋白质SEQ IDNO：18)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)(编码区SEQ IDNO：19；蛋白质SEQ ID NO：20)。
因为如上文列出的和表1给出的SEQ ID NO所例示的阿拉伯糖-质子同向转运体编码区和编码蛋白的序列为人们所熟知，附加的适用阿拉伯糖-质子同向转运体可由本领域的技术人员基于序列相似度，使用生物信息学方法容易地鉴定。典型地，利用已知的阿拉伯糖-质子同向转运体氨基酸序列，例如本文所提供的那些，对可公开获得的数据库的BLAST(参见上文)检索被用于鉴定可在本文的菌株中使用的附加阿拉伯糖-质子同向转运体和它们的编码序列。这些蛋白可具有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、或20的任何阿拉伯糖-质子同向转运体至少约80-85％、85％-90％、90％-95％或95％-99％的序列同一性，同时具有阿拉伯糖-质子同向转运体活性。同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.1的默认参数和Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵。
除了使用蛋白或编码区序列以及生物信息学方法鉴定附加的阿拉伯糖-质子同向转运体之外，本文所述序列或本领域所述的那些序列还可用于实验鉴定天然的其他同源物。例如每个编码本文所述的核酸片段的阿拉伯糖-质子同向转运体可用于分离编码同源蛋白的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于：1)核酸杂交方法；2)DNA和RNA扩增方法，例如多种核酸扩增技术[例如，聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，S.等人，Proc.Acad.Sci.USA 82：1074(1985)；或链置换扩增反应(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；以及3)文库构建和互补筛选方法。
例如，与本文所述的阿拉伯糖-质子同向转运体编码序列相似的蛋白质或多肽的编码区，可以用本领域的技术人员所熟知的方法，通过将本发明的核酸片段的全部或部分用作DNA杂交探针来筛选来自任何目标生物的文库而被直接分离。基于所公开的核酸序列的特异性寡核苷酸探针，可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计和合成。而且，整个序列可用于通过技术人员已知的方法(如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术)直接合成DNA探针，或使用可用的体外转录体系合成RNA探针。另外，可设计特异性引物并将其用于扩增部分(或全长)的本发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并被用作探针，以通过在适当严格度的条件下的杂交分离全长的DNA片段。
通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域中常见且熟知的(Thein和Wallace，“The use of as specific hybridization probes in theDiagnosis of Genetic Disorders”、in Human Genetic Diseases：A PracticalApproach，K.E.Davis编辑，(1986)第33-50页，IRL：Herndon，VA；和Rychlik，W.，In Methods in Molecular Biology，White，B.A.Ed.，(1993)Vol.15，第31-39页，PCR Protocols：Current Methods andApplications.Humania：Totowa，NJ)。
通常，可以将本文所述序列的两个短片段在聚合酶链反应规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。聚合酶链反应也可以用克隆的核酸片段的文库进行，其中一个引物的序列源自本文所述核酸片段，而另一个引物的序列利用编码微生物基因的mRNA前体的3′端的多腺苷酸片的存在。
作为另外一种选择，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员能够按照RACE规程(Frohman等人，PNAS USA 85：8998(1988))，通过利用PCR扩增转录物中的一个单独位点和3′或5′末端之间的区域的拷贝，生成cDNA。以3′和5′方向取向的引物可用本发明的序列设计。使用可商购获得的3′RACE或5′RACE体系(例如BRL，Gaithersburg，MD)，能够分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，PNAS USA 86：5673(1989)；Loh等人，Science 243：217(1989))。
作为另外一种选择，所述阿拉伯糖-质子同向转运体编码序列可作为用于鉴定同源物的杂交试剂。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有所关注基因或基因片段的样本及特定的杂交方法。探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。探针长度可从5个碱基至数万个碱基不等，这将取决于具体待完成的测试。通常约15个碱基至约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的一定比率的碱基未与正确的互补碱基配对。
杂交方法是有严格规定的的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交都可发生。混合物中的探针或标记的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可以加入离液剂。离液剂通过抑制核酸酶活性来稳定核酸。此外离液剂允许短的寡核苷酸探针在室温下进行灵敏的严格性杂交(Van Ness和Chen，Nucl.Acids Res.19：5143-5151(1991))。合适的离液剂包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯，等等。通常，离液剂将以约3M的终浓度存在。如果需要，技术人员可将甲酰胺加到杂交混合物中，通常为30-50％(v/v)。
可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(例如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％去垢剂(例如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500kdal)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5％至2％重量/体积的甘氨酸。还可以包含其他添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。
核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要组分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。
阿拉伯糖-质子同向转运体的表达通过用编码阿拉伯糖-质子同向转运体的序列进行转化来完成。本领域已知由于遗传密码的简并性，在编码氨基酸序列的DNA序列中可存在变异。编码序列可经密码子优化以最大化靶向发酵单胞菌属或发酵杆菌属宿主细胞的表达，这是本领域技术人员熟知的。包括在发酵单胞菌属细胞中具有活性的启动子以及转录终止子在内的嵌合基因通常用于表达，所述启动子可操作地连接至期望的编码区。可使用任何在发酵单胞菌属细胞中具有活性的启动子，例如上述表达用于阿拉伯糖利用的蛋白的实例。用启动子和阿拉伯糖转运体编码区构建的嵌合基因是用于在发酵单胞菌属或发酵杆菌属中表达的异源基因，因为所述编码区来自如上所述的不同生物。用于表达和/或整合的载体如上所述用于表达蛋白以利用阿拉伯糖。
改善的乙醇生产
本发明的菌株在以阿拉伯糖作为唯一碳水化合物来源的培养基中和包括阿拉伯糖的混合糖培养基中具有改善的阿拉伯糖利用率，本发明菌株也具有改善的乙醇生产。与在导入阿拉伯糖-质子同向转运体表达基因之前的亲本菌株相比，表达阿拉伯糖-质子同向转运体的菌株的乙醇生产提高了。乙醇生产的增加可取决于发酵使用的培养基和生长条件以及用作生物催化剂的阿拉伯糖-质子同向转运体表达菌株而不同。乙醇生产通常可提高至少约10％，并且可提高约10％、12％、16％、18％、20％、24％、28％或更多。
改善阿拉伯糖利用的菌株的发酵
表达阿拉伯糖-质子同向转运体和基因或操纵子的工程化阿拉伯糖利用菌株可在发酵中用于生产菌株天然产物的产品或工程化菌株产生的产品，所述操纵子用于表达L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶、L-5-磷酸核酮糖-4-差向异构酶、转醛醇酶和转酮醇酶。例如，运动发酵单胞菌和棕榈发酵细菌是天然的产乙醇细菌。优选的是也利用木糖并此外进行工程化以表达木糖异构酶和木酮糖激酶的菌株。例如描述了通过本发明的运动发酵单胞菌菌株生产乙醇，所述菌株利用木糖和阿拉伯糖。运动发酵单胞菌也天然利用葡萄糖。
就乙醇生产而言，表达阿拉伯糖-质子同向转运体的重组木糖和阿拉伯糖利用运动发酵单胞菌与包含阿拉伯糖的培养基接触。通常所述培养基包含包括阿拉伯糖、木糖、和葡萄糖的混合糖。所述培养基也包含包括这些糖的生物质水解产物，它们来源于经处理的纤维质或木质纤维质生物质。
当混合糖浓度高至足以抑制生长时，所述培养基包括山梨醇、甘露糖醇、或它们的混合物，这公开于共有的和共同未决的美国专利公布#US20080081358A1中。半乳糖醇或核糖醇可代替或与山梨醇或甘露糖醇组合。运动发酵单胞菌在其中进行发酵并且产生乙醇的培养基中生长。发酵在不补充空气、氧气、或其它气体(这可包括各种条件如厌氧、微氧、或微需氧发酵)的情况下运行至少约24小时，并且可运行30小时或更长时间。达到最大乙醇产量的时间是不确定的，取决于发酵条件。如果抑制剂存在于培养基中，通常需要更长的发酵时间。发酵可在介于约30℃和约37℃之间的温度、约4.5至约7.5的pH下进行。
可以在实验室规模的发酵罐中和按比例增加的发酵中(其中生产了商业规模量的乙醇)，在包含包括阿拉伯糖在内的混合糖培养基中培养本发明的运动发酵单胞菌。当需要商业生产乙醇时，可使用多种培养方法。例如，从本发明的运动发酵单胞菌属菌株中的大规模生产可以通过分批培养方法和连续培养方法进行。经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需的生物接种培养基，并且不向系统中添加任何物质可以发生生长或代谢活性。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。在某些系统中对数期中的细胞通常负责最终产物或中间产物的批量生成。在其他系统中可以获得稳定或指数后期生成。
标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。分批补料培养方法也适用于本发明运动发酵单胞菌菌株的培养，并且包括典型的分批系统，不同的是：底物随着培养进行以递增方式添加。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有用的。补料-分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并因此根据可测量因素例如pH和废气如CO2的分压的改变来评估。分批和补料-分批培养方法是常见的和本领域熟知的，实例可见于Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Crueger，Crueger，and Brock，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，or Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)，将其以引用方式并入本文。
乙醇的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式系统，其中将设定好的培养基连续加入生物反应器里，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由本领域技术人员已知的天然材料和/或合成材料组成。
连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法将维持限制性营养物质例如碳源或氮水平处于固定速率并允许所有其他参数适度。在其它系统中，影响生长的许多因素能够连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳态生长条件，且因此由于培养基取出导致的细胞丧失必须针对培养基中的细胞生长速度进行平衡。对于连续培养过程调节营养物质和生长因子的方法以及用于使产物形成速率达到最大的技术是工业微生物学领域熟知的，并且各种方法由上面Brock所述。
尤其适用于乙醇生产的发酵方法如下所述。期望的本发明运动发酵单胞菌属菌株在包含半复合培养基的摇瓶中生长，培养温度为30℃至约37℃，在回旋振荡器中以约150rpm的转速振荡培养，然后将其转移到包含相似培养基的10L种子发酵罐中。种子培养物在种子发酵罐中厌氧生长直至OD600介于3和6之间，然后将其转移到生产发酵罐中，其中的发酵参数经最优化用于乙醇生产。从种子罐转移到生产罐的典型种菌体积在约2％至约20％v/v的范围内。典型的发酵培养基包含基本培养基组分如磷酸钾(1.0-10.0g/L)、硫酸铵(0-2.0g/L)、硫酸镁(0-5.0g/L)、复合氮源如酵母提取物或大豆基产物(0-10gL)。培养基中存在终浓度约5mM的山梨醇或甘露糖醇。包括阿拉伯糖和至少一种附加糖如葡萄糖(或蔗糖)的混合糖提供碳源，当初始批次碳源(50-200g/l)耗尽时将混合糖持续加入发酵罐中以最大化乙醇比率和滴定量。碳源进料速率进行动态调节以确保培养物不过度积聚葡萄糖，过多的葡萄糖会导致积聚毒性副产物如乙酸盐。为了最大化从利用的底物中生产的乙醇产量，通过磷酸盐的量来限制生物量增长，磷酸盐是初始时成批加入的或在发酵期间加入的。使用苛性碱溶液(如氢氧化铵、氢氧化钾、或氢氧化钠)和硫酸或磷酸将发酵控制在pH 5.0-6.0。将发酵罐的温度控制在30℃至约35℃。为了最小化泡沫，按需加入消泡剂(任何种类-硅氧烷基的、有机物基的等)到罐中。可任选地使用抗生素(菌株中有该抗生素的抗性标记)如卡那霉素以最小化污染。
此外，利用SSF(同时糖化和发酵)方法，发酵可与糖化同时进行。在这个方法中，当它们被生产生物催化剂代谢时，从生物质中生产糖。
上述任何一组条件和本领域熟知的这些条件的其他变型是通过利用阿拉伯糖的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株生产乙醇的适用条件，所述菌株通过导入阿拉伯糖-质子同向转运体的异源编码区进行工程化以表达阿拉伯糖-质子同向转运体。
实施例
本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
一般方法
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，公布于Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987)。
缩写词的含义如下：“kb”指千碱基，“bp”指碱基对，“nt”指核苷酸，“hr”指小时，“min”指分钟，“sec”指秒钟，“d”指天，“L”指升，“ml”指毫升，“μL”指微升，“μg”指微克，“ng”指纳克，“mM”指毫摩尔每升，“μM”指微摩尔每升，“nm”指纳米，“μmol”指微摩尔，“pmol”指皮摩尔，“Cm”指氯霉素，“Cmr”指氯霉素抗性，“Cms”指氯霉素敏感，“Spr”指奇放线菌素抗性，“Sps”指奇放线菌素敏感，“UTR”指非翻译区，“RBS”指核糖体结合位点。
除非另外指明，引物由Sigma(St.Luis，MO)合成。
实施例1
在发酵单胞菌属中构建并表达阿拉伯糖利用蛋白的操纵子
为了工程化运动发酵单胞菌以利用阿拉伯糖利用率，将大肠杆菌araA、araB、和araC编码区构建在一个操纵子内，其具有运动发酵单胞菌启动子并在运动发酵单胞菌细胞内的质粒上表达。AraB、araA、和araD分别编码蛋白L-核酮糖激酶、L-阿拉伯糖异构酶、和L-5-磷酸核酮糖-4-差向异构酶，它们与转酮醇酶和转醛醇酶活性一起提供阿拉伯糖同化途径(参见图1)。
1.克隆大肠杆菌araBAD编码序列和运动发酵单胞菌P gap 启动子
大肠杆菌的araB、araA、和araD编码区(分别是SEQ ID NO：23、21、和25)存在于araBAD操纵子中。使用寡核苷酸引物ara1(SEQ IDNO：28)和ara2(SEQ ID NO：29)(它们分别是正向和反向引物)制备araB-araA DNA片段(araBA；SEQ ID NO：27)。引物ara1将核苷酸CC加到araB编码区的起始密码子ATG之前以形成NcoI位点。引物ara2将XbaI位点加到araA编码区的终止密码子之后。使用寡核苷酸引物ara3(SEQ ID NO：31)和引物ara4(SEQ ID NO：32)(它们分别是正向和反向引物)制备araD DNA片段(SEQ ID NO：30)。引物ara3将一个Xba位点加到核糖体结合位点(RBS)序列的5’末端，该序列是araD编码区的5’端。引物ara4将一个HindIII位点加到3′非翻译区(UTR)，该区是araD编码区的3’端。在标准PCR反应中使用成对引物，所述PCR反应包括50μL AccuPrime Pfx SuperMix(Invitrogene，Carlsbad，CA)，1μL10μM正向和反向引物，和2μL(大约50到100ng)大肠杆菌基因组DNA，所述大肠杆菌基因组DNA从MG1655(ATCC#700926；K12菌株)中使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega，Madison，WI)制备得到。使用引物ara1和ara2的反应如下进行：95℃5分钟，随后是35个循环的95℃30秒/56℃30秒/68℃3.5分钟，然后在68℃保持7分钟结束。结果产生3226-bp的araB-araA片段，该片段具有5’NcoI位点和3’XbaI位点(SEQ ID NO：27)。使用引物ara3和ara4的另一个反应利用相似的程序进行，不同的是在68℃的延伸时间缩短到1.5分钟。结果得到889-bp的araD片段(包括araD 3’UTR)，该片段具有5’XbaI位点和3’HindIII位点(SEQ ID NO：30)。
araBAD操纵子的天然大肠杆菌启动子是诱导型启动子，它不适用于在运动发酵单胞菌中的期望表达。使用运动发酵单胞菌GAP(3-磷酸甘油醛脱氢酶)启动子(Pgap；SEQ ID NO：33)，因为它是在运动发酵单胞菌中表达的强组成型启动子。使用寡核苷酸引物ara10和ara11制备包含运动发酵单胞菌Pgap的DNA片段。引物ara10(SEQ ID NO：34)是正向引物，它将SacI和ApeI位点加到启动子DNA片段的5’末端。引物ara11(SEQ ID NO：35)是反向引物，它将启动子的最后两个核苷酸从AC变成CC，因此它将一个NcoI位点加到启动子DNA片段的3’末端。这两个引物被用于如上所述的标准PCR反应，该反应使用包含Pgap的质粒作为DNA模板以生产323-bp的Pgap启动子DNA片段，它具有5’SacI和SpeI位点以及3’NcoI位点(SEQ ID NO：36)。
按照制造商的说明书将每一种这些PCR产物克隆进TOPO BluntZero载体(Invitrogen，Calsbad，CA)。所得质粒pTP-araB-araA、pTP-araD和pTP-Pgap在大肠杆菌DH5a细胞(Invitrogen)中增殖，并且使用QiagenDNA Miniprep试剂盒制备每一个质粒。通过DNA测序确认它们的序列。
2.在穿梭载体中装配P gap -araBAD操纵子
在称为pZB188aada的发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体中装配Pgap-araBAD操纵子，所述载体基于包括2，582bp的运动发酵单胞菌基因组DNA片段的载体pZB188(Zhang等人(1995)Science 267：240-243；US 5514583)构建，它包含一个复制区，允许所述载体在发酵单胞菌属细胞中复制。在pZB188aada中pZB188的抗四环素盒(Tcr-盒)被抗奇放线菌素盒(Specr-盒)置换。Specr-盒通过PCR生成，该PCR使用质粒pHP15578(Cahoon等人，(2003)Nature Biotechnology 21：1082-1087)作为模板，并使用引物1(SEQ ID NO：32，来自CL4236)和2(SEQ IDNO：33，来自CL4236)。质粒pHP15578包含Specr盒及其启动子的全核苷酸序列，它基于编码3’(9)-O-核苷酸转移酶的Tranposon Tn7 aadA基因(GenBank保藏号X03043)的公布序列。
引物1(SEQ ID NO：37)：
CTACTCATTTatcgatGGAGCACAGGATGACGCCT
引物2(SEQ ID NO：38)：
CATCTTACTacgcgtTGGCAGGTCAGCAAGTGCC
引物1(正向引物)的用下划线标示的碱基与Specr盒的启动子上游杂交(GenBank保藏号X03043的nts 4-22)，而小写字母对应于加到引物5’末端的ClaI位点。引物2(反向引物)的用下划线标示的碱基与Specr盒的终止密码子下游的约130个碱基杂交(GenBank保藏号X03043的nts 1002-1020)，而小写字母对应于加到引物5’末端的AflIII位点。PCR生成的1048bp的Specr-盒用ClaI和AflIII进行双酶切，所得DNA片段使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Cat.No.28104)按照供应商推荐的规程进行纯化。质粒pZB188(分离自大肠杆菌SSC110(dcm-，dam-)，为了获得非甲基化的质粒DNA，用ClaI(它对dam甲基化敏感)酶切，该质粒用ClaI和BssHII进行双酶切以除去Tcr-盒，并且通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得大载体片段。然后把该DNA片段和纯化PCR产物连接到一起，并且把转化反应混合物导入大肠杆菌JM110化学感受态细胞中，所述细胞购得自Stratagene(Cat.No.200239)。注意BssHII和AflIII生成相容的“粘性末端”，但是当把它们连接到一起时两个位点均被破坏。将转化子置于包含奇放线菌素(100μg/ml)的LB培养基上并在37℃下生长。通过用NotI和所谓的pZB188/aada进行的限制性酶切分析鉴定包含具有合适大小插入序列的质粒的抗奇放线菌素转化体。
将pTP-Pgap SpeI-NcoI Pgap片段、pTP-araB-araA NcoI-XbaIaraB-araA片段、和pTP-araD XbaI-NotI araD片段全部克隆进NotI-SpeIpZB188/aada载体中，形成pZB188aada-based穿梭载体，该载体包含Pgap-araBAD操纵子。所得质粒称为pARA201，它在大肠杆菌DH5a中增殖并用Qiagen DNA Miniprep试剂盒制备。从pARA201中制备pARA205(图2；SEQ ID NO：41)，这通过将Pgap 3’末端的核苷酸从CC恢复成初始的AC核苷酸来完成。这使用QickChange XL定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)完成。为了进行这一诱变，使用正向引物ara31(SEQ ID NO：30)和反向引物ara32(SEQ ID NO：40)按照制造商的说明书制造改变。pARA205在大肠杆菌DH5a中增殖并使用QiagenDNA Miniprep试剂盒制备。
3.在运动发酵单胞菌中表达araBAD
为了确认Pgap-araBAD是运动发酵单胞菌中的功能性操纵子，将pARA205导入运动发酵单胞菌菌株ZW801-4中表达。ZW801-4是利用木糖的运动发酵单胞菌菌株。菌株ZW658、ZW800和ZW801-4的构建和表征在共有的和共同未决的美国专利公开申请公布US20080286870A1中进行了描述，其以引用方式并入本文。ZW658(ATCC#PTA-7858)通过经由序贯转座事件将两个操纵子整合到ZW1(ATCC#31821)基因组中，然后通过包含木糖的选择培养基筛选进行构建，所述操纵子是PgapxylAB和Pgaptaltkt，它们包含编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的四个木糖利用基因。ZW800是在编码葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的序列中具有抗奇放线菌素盒的双交叉插入序列以敲除这种活性的ZW658的衍生物。ZW801-4是ZW800的衍生物，其中抗奇放线菌素盒通过位点特异性重组删除，留下过早截短蛋白的框内终止密码子。
ZW801-4的感受态细胞通过在30℃、150rpm振荡条件下在MRM3G5(1％酵母提取物，15mM KH2PO4，4mM MgSO4，和50g/L葡萄糖)中培养种子细胞过夜至OD600值接近5进行制备。收获细胞并将其重悬在新鲜培养基中至OD600值为0.05。它们在相同条件下进一步生长至对数期的早期或中期(OD600接近0.5)。收获细胞并用冰水洗涤两次，然后用冰冷的10％甘油洗涤一次。收集所得感受态细胞并重悬在冰冷的10％甘油中至OD600值接近100。因为转化运动发酵单胞菌需要非甲基化的DNA，将pARA205质粒转化进大肠杆菌SCS110感受态细胞(Stratagene)。转化细胞的一个菌落在37℃下，在10mL LB-Amp100(LB肉汤，包含100mg/L的氨苄青霉素)中生长过夜。使用Qiagen DNAMiniprep试剂盒从10mL培养物中制备DNA。
大约500ng非甲基化的pARA205质粒DNA与50μL ZW801-4感受态细胞在1MM电穿孔管(VWR，West Chester，PA)中混合。在2.0KV下使用BT720 Transporater Plus(BTX-Genetronics，San Diego，CA)将质粒DNA电穿孔到细胞中。转化细胞在30℃下，在1mL MMG5培养基(50g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，5g/L胰蛋白胨，2.5g/L(NH4)2SO4，0.2g/L K2HPO4，和1mM MgSO4)中恢复4小时，并且在30℃下，在带有AnaeroPack(Mitsubishi Gas Chemical，New York，NY)的厌氧广口瓶内的MMG5-Spec250平板(MMG5带有250mg/L的奇放线菌素和15g/L的琼脂)上生长2天。将单个菌落重复划线接种到MMA5-Spec250平板(与MMG5-Spec250相同，但是葡萄糖用50g/L的阿拉伯糖置换)和新MMG5-Spec250平板上。在如上所述的相同条件下，划线接种的菌落生长良好，但在MMA5-Spec250平板上的生长时间较长。这指示Pgap-araBAD操纵子的表达。
选择在MMG5-Spec250平板上生长的两条转化细胞划线(ZW801-ara205-4和ZW801-ara205-5)用于72小时生长测定。在该测定中，来自每条划线的细胞在30℃、150rpm振荡条件下，在2mLMRM3G5-Spec250(具有250mg/L奇放线菌素的MRM3G5)中生长过夜。收获细胞，用MRM3A5(与MRM3G5相同，不同的是葡萄糖被阿拉伯糖代替)洗涤并重悬在MRM3A5-Spec250(包含250mg/L奇放线菌素的MRM3A5)中以具有0.1的起始OD600。将四mL悬浮液置于14mL带盖Falcon管中并在30℃、150rpm振荡条件下生长72小时。在生长末期测量OD600.然后在10,000x g下离心1mL培养物以除去细胞。将上清液滤过0.22μm的Costar Spin-X离心管过滤器(Corning Inc，Corning，NY)并通过Agilent 1100HPLC系统(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)上的BioRad Aminex HPX-A7H离子排斥柱(BioRad，Hercules，CA)进行分析以测定乙醇和糖浓度，该柱在55℃下0.01N H2SO4的流速为0.6mL/分钟。在平行试验中，培养(不含抗生素)并分析ZW801-4作为对照物。表2给出的结果展示表达araBAD使运动发酵单胞菌ZW801-4能够利用阿拉伯糖作为唯一碳源生长并生产乙醇。
表2：ZW801-ara205菌株在MRM3A5中的72小时生长测定
  菌株  生长(OD600)   乙醇(g/L)  阿拉伯糖(g/L)
  ZW801-4   0.106   0   51.20
  ZW801-ara205-4   1.75   7.22   33.15
  ZW801-ara205-5   1.96   10.68   27.16
实施例2
将利用阿拉伯糖的操纵子整合进运动发酵单胞菌基因组并表征所 得菌株
这个实施例描述将Pgap-araBAD操纵子稳定整合进两个利用木糖的运动发酵单胞菌菌株。
1.在自杀载体中构建P gap -araBAD操纵子。
为了将Pgap-araBAD操纵子整合进运动发酵单胞菌的基因组，制备DCO(双交叉)同源重组自杀载体。除了Pgap-araBAD外，这个载体还包括DCO同源重组片段以直接整合Pgap-araBAD和aadA基因以提供抗奇放线菌素的选择标记。我们选择ldhA基因座作为插入位点。通过PCR，利用运动发酵单胞菌ZW801-4DNA作为模板合成DCO、LDH-L和LDH-R的两个ldhA DNA片段。该反应使用AccuPrime Mix并按照实施例1所述的标准PCR程序进行。使用正向引物ara20(SEQ ID NO：42)和反向引物ara21(SEQ ID NO：43)合成LDH-L DNA片段。所得产物是895-bp的DNA片段，它包括ldhA编码区的序列5’和ldhA编码区的核苷酸1-493，具有5’SacI位点和3’SpeI位点(SEQ ID NO：44)。使用正向引物ara22(SEQ ID NO：45)和反向引物ara23(SEQ ID NO：46)合成LDH-R DNA片段。所得产物是1169bp的片段，它包括ldhA编码区的核苷酸494-996和ldhA编码区的序列3’，具有5’EcoRI位点和3’NotI位点(SEQ ID NO：47)。
使用pBS SK(+)(Bluescript质粒；Stratagene)作为自杀载体，因为pBS载体不能在发酵单胞菌属中复制。pARA354(SEQ ID NO：49)通过将pARA205的Pgap-araBAD操纵子、LDH-L片段、和LDH-R片段克隆进pBS SK(+)来构建。此外包含由野生型LoxP位点(LoxPw-aadA-LoxPw片段；SEQ ID NO：48)限定的aadA标记(奇放线菌素抗性标记)的DNA片段被包括在pARA354中。pARA354具有Pgap-araBAD操纵子和LoxPw-aadA-LoxPw标记片段，它们位于LDH-L和LDH-R序列之间。
图3显示10,441bp pARA354的图谱。它具有一个f1(+)起点和一个氨苄青霉素抗性基因用于在大肠杆菌中的质粒增殖。因为LDH-L和LDH-R分别包含ldhA编码序列的前493个碱基对和剩余的503个碱基对，设计pARA354以引导Pgap-araBAD和aadA直接插入运动发酵单胞菌的ldhA编码序列，它们通过交叉重组位于核苷酸#493和#494之间。
2.开发P gap -araBAD整合菌株
运动发酵单胞菌菌株ZW705是运动发酵单胞菌工程化菌株，它在胁迫条件下具有改善的木糖利用率，通过在连续培养中发生的适应来源于ZW801-4，如共同未决的和共有的美国专利申请12/641642所述，其以引用方式并入本文。ZW801-4木糖利用发酵单胞菌属细胞在包含至少约50g/L木糖的培养基中连续生长以生产包含乙醇的培养物，然后加入氨和乙酸产生胁迫培养物。细胞在胁迫培养物中继续生长并分离具有改善的木糖利用率的细胞，包括ZW705菌株。
为了将pARA354转化到ZW705和ZW801-4菌株中，将800ng非甲基化的质粒DNA电穿孔到50μL感受态细胞中，所述感受态细胞从每个菌株制备得到。如实施例1所述进行DNA脱甲基、感受态细胞制备、和电穿孔。每种菌株的转化细胞的菌落在30℃下，在带有AnaeroPack的厌氧广口瓶内的MMG5-Spec250平板上生长2天。因为pARA354不能在运动发酵单胞菌中复制，奇放线菌素抗性指示这些菌落是整合菌株。将菌落重复划线接种到新MMG5-Spec250平板和MMA5-Spec250平板上并分别生长2天和4天。它们在MMA5-Spec250平板上的生长也指示整合。为了进一步展示整合，通过标准35个循环的PCR反应检查Pgap-araBAD-aadA片段和运动发酵单胞菌基因组DNA之间的连接，所述PCR反应包含PCR Super Mix(Invitrogen)、一对引物、和测试的转化细胞。一个PCR循环包括在95℃变性45秒，在58℃退火45秒，并在72℃延伸2分钟。引物ara45(SEQ ID NO：50)和引物ara42(SEQ IDNO：51)分别是位于运动发酵单胞菌基因组DNA的LDH-L序列上游的正向引物和位于pARA354的araB基因内的反向引物。这对引物从通过PCR检查的所有菌落中扩增1694-bp的片段。也使用引物ara46(SEQ IDNO：52)和引物ara43(SEQ ID NO：53)，它们分别是位于pARA354的aadA基因内的正向引物和位于运动发酵单胞菌基因组DNA的LDH-R序列下游的反向引物。这对引物从通过PCR检查的所有菌落中扩增1521-bp的片段。因此已经通过DCO方法成功地将Pgap-araBAD-aadA片段整合进ZW801-4和ZW705基因组中。因为DCO同源重组是靶向特异性整合，来自ZW801-4或ZW705整合的每个菌落将具有相同的基因型。来自每个整合的菌落在30℃、150rpm振荡条件下在5mLMRMG5-Spec250中生长过夜。离心收集细胞，重悬于0.5mL 50％甘油中，然后储存在-80℃。所述菌株称为ZW705-ara354和ZW801-ara354。
为了进一步改善整合Pgap-araBAD操纵子的功能，ZW705-ara354菌株经过适应过程。为此目的，离心收集ZW705-ara354的过夜培养物，用MRM3A5洗涤，并重悬在MRM3A5-Spec250中，OD600为0.1。将四mL这种悬浮液置于14mL带盖Falcon管中并在30℃、150rpm振荡器中生长72小时直至OD600大于1。然后将培养物接种到新falcon管中，管内包含4mL新鲜MRM3A5-Spec250以达到接近0.1的起始OD600用于第二轮生长。总计完成9轮连续生长。每轮生长将OD600从大约0.1提高到大于1并需要3至4天，不同的是第4轮需要6天，因为细胞生长要慢的多。为了表征适应菌株，将第9轮生长产物稀释100倍，并将10μL稀释液涂布在MMA5-Spec250平板上并置于30℃的带有AnaeroPack的厌氧广口瓶内生长3天。挑取单个菌落(即适应菌株)并在30℃下、150rpm振荡器内的3mL MRM3G5-Spec250中生长过夜。如实施例1所述，它们在MRM3A5-Spec250中经受72小时的生长测定。在该测定中使用ZW705-ara354菌株作为对照物。5个适应菌株(ZW705-ara354A4至A8)的分析数据在表3中给出，结果显示所有适应菌株的表现要优于ZW705-ara354。根据生长、乙醇产量、和阿拉伯糖利用率，ZW705-ara354A7是最好的菌株。
表3：在MRM3A5中的适应菌株ZW705-ara354的72小时生长测 定
  菌株   生长(OD600)   乙醇(g/L)   阿拉伯糖(g/L)
  ZW705-ara354   1.03   9.10   32.71
  ZW705-ara354A4   3.29   19.03   10.31
  ZW705-ara354A5   3.71   18.56   10.07
  ZW705-ara354A6   3.61   18.47   9.23
  ZW705-ara354A7   4.04   19.73   7.36
  ZW705-ara354A8   2.96   17.37   12.18
3.表征适应和未适应的P gap -araBAD整合菌株的生长和代谢特征。
进一步表征Pgap-araBAD整合菌株的利用在包含阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基和包含混合糖的培养基中的阿拉伯糖维持细胞生长和乙醇生产的能力。为了表征在包含阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基中的这些菌株，第一批ZW705-ara354和ZW705-ara354A7细胞在30℃、150rpm振荡器内的2mL MRM3G5-Spec250中生长过夜。收获细胞，用MRM3A5洗涤，并重悬在MRM3A5-Spec250中，起始OD600为0.1。将二十mL悬浮液置于50mL带螺旋盖的VWR离心管中并在30℃、150rpm振荡条件下生长96小时。在这段时间内，分别在0-、24-、48-、72-、和96-小时测量OD600。在每个时间点移出1mL培养物并在10,000x g下离心以除去细胞。将上清液滤过0.22μm的Costar Spin-X离心管过滤器并通过Agilent 1100HPLC系统上的BioRad Aminex HPX-A7H离子排斥柱进行分析以测定乙醇和糖浓度，该柱在55℃下使用的0.01N H2SO4的流速为0.6mL/分钟。在平行试验中，在不含抗生素的培养基中培养并分析ZW705作为对照物。结果在图4中给出。这些结果指示不含Pgap-araBAD的情况下，ZW705不能代谢阿拉伯糖并且不能在阿拉伯糖是唯一碳源的情况下生长(图4A)。在整合Pgap-araBAD后，ZW705-ara354能够利用阿拉伯糖维持生长并生产乙醇(图4B)。阿拉伯糖消耗的最大速度为0.2g/L/hr。在时间段的末期，培养基中的阿拉伯糖浓度减少32.8％，为34g/L。适应极大改善ZW705-ara354A7的阿拉伯糖利用率、细胞生长和乙醇产量。阿拉伯糖消耗的最大速度为0.73g/L/hr。在时间段的末期，培养基中的阿拉伯糖浓度减少83.4％，为8.4g/L。
为了表征在包含混合糖的培养基中的菌株，如上所述培养并分析ZW705、ZW705-ara354、和ZW705-ara354A7，但是在以前的实验中使用的MRM3A5培养基被MRM3A2.5X2.5G5培养基(MRM3，含25g/L阿拉伯糖、25g/L木糖、和50g/L葡萄糖)代替。由于在MRM3A2.5X2.5G5中的快速生长，加入一个10小时的时间点。如上所述分析使用阿拉伯糖培养基的实验。结果在图5中给出。这些结果显示ZW705有效地利用葡萄糖和木糖维持较强的细胞生长和乙醇生产，但是它不能代谢阿拉伯糖(图5A)。在整合Pgap-araBAD后，ZW705-ara354能够利用阿拉伯糖促进细胞生长和乙醇生产(图5B)。阿拉伯糖消耗的最大速度为0.3g/L/hr。在时间段的末期，培养基中的阿拉伯糖浓度减少67.9％，为8.8g/L。适应菌株ZW705-ara354A7比ZW705-ara354菌株在阿拉伯糖利用率方面存在一些改善，这支持较好的生长和乙醇产量。阿拉伯糖消耗的最大速度为0.36g/L/hr。在时间段的末期，培养基中的阿拉伯糖浓度减少74.1％，为7.1g/L。
实施例3
在发酵单胞菌属中表达来自大肠杆菌的两个阿拉伯糖转运系统的 构建体
存在于大肠杆菌中的两个阿拉伯糖转运体系由araE或araFGH编码，它们中的每一个在发酵单胞菌属中表达并分析其阿拉伯糖利用率。araE编码阿拉伯糖-质子同向转运体，而araFGH编码形成ABC转运蛋白的三个蛋白。
1.构建嵌合araE基因和araFGH操纵子以在发酵单胞菌属中表达
通过如实施例1所述的标准30循环PCR制备大肠杆菌araE和araFGH编码序列DNA片段，所述PCR使用大肠杆菌MG1655(K12菌株：ATCC#700926)DNA作为模板。每个循环包括在94℃变性45秒，在60℃退火45秒，并且在72℃延伸4分钟。在PCR中使用正向引物ara135(SEQ ID NO：54)和反向引物ara136(SEQ ID NO：55)合成1,550-bp araE片段，其包括araE编码序列(1,419bp)及其3’UTR(121bp)，在5’末端加上NcoI位点并在3’末端加上EcoRI位点(SEQ ID NO：56)。在PCR中使用正向引物ara137(SEQ ID NO：57)和反向引物ara138(SEQID NO：58)合成3,744-bp的araFGH片段(SEQ ID NO：59)。这个片段与大肠杆菌araFGH操纵子相同，不同的是缺少启动子。它包括araF编码序列、araG编码序列、araH编码序列、araH 3’UTR、和完整的基因间区域。所述引物加上一个5’NcoI位点和一个3’EcoRI位点。
选择密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)GI启动子(Pgi)引导araE和araFGH的表达。它是木糖异构酶基因的启动子并且已经被证实在运动发酵单胞菌中行使弱组成型启动子的功能。为了克隆密苏里游动放线菌(A.missouriensis)Pgi，设计一对寡核苷酸引物。引物ara12(SEQ ID NO：60)是用于Pgi的PCR正向引物，它将一个SacI和一个SpeI位点加到该启动子的5’末端。引物ara13(SEQ ID NO：61)是用于Pgi的PCR反向引物，它将一个NcoI位点加到该启动子的3’末端。这两个引物用于标准PCR反应并且使用包含密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)GI启动子(SEQ ID NO：62)的质粒作为模板DNA。PCR反应生成201-bp的Pgi DNA片段(SEQ ID NO：63)，其具有5’SacI和SpeI位点以及3’NcoI位点，按照制造商的说明书将该片段克隆进TOPO Blunt Zero载体(Invitrogen，Calsbad，CA)。在大肠杆菌DH5a中增殖所得质粒pTP-Pgi并使用Qiagen DNA Miniprep试剂盒制备质粒DNA。
将来自pTP-Pgi的SpeI-NcoI Pgi片段和NcoI-EcoRI araE PCR片段在pZB 188/aada载体中连同抗氯霉素标记(CM-R；SEQ ID NO：64)一起组合，生成pARA112(图6；SEQ ID NO：65)。pARA112在pZB 188来源的大肠杆菌/发酵单胞菌属穿梭载体中包含Pgi-araE嵌合基因。SpeI-NcoI Pgi片段来自pTP-Pgi，它和NcoI-EcoRI araFGH PCR片段在pZB188/aada载体中连同抗氯霉素标记一起组合，生成pARA113(图7；SEQ ID NO：66)。在大肠杆菌DH5a中增殖所得穿梭载体并使用QiagenDNA Miniprep试剂盒制备质粒DNA。通过测序确认Pgi-araE基因和Pgi-araFGH操纵子。
实施例4
在发酵单胞菌属ZW705-ara354A7中表达大肠杆菌阿拉伯糖转运系 统
两种大肠杆菌阿拉伯糖转运系统对利用阿拉伯糖的发酵单胞菌属细胞的效应通过表达构建的Pgi-araE基因和Pgi-araFGH操纵子进行测试。
1.用pARA112和pARA113转化ZW705-ara354A。
包含Pgi-araE基因的pARA112和包含Pgi-araFGH操纵子的pARA113都在实施例3中进行制备，将它们转化到ZW705-ara354A7(在实施例1和2中制备)细胞中。如实施例1所述制备ZW705-ara354A7菌株的感受态细胞。因为转化运动发酵单胞菌需要非甲基化的DNA，pARA112和pARA113分别被转化到大肠杆菌SCS110感受态细胞中，并且使用Qiagen DNA Miniprep试剂盒从单菌落的10mL-培养物中制备非甲基化的质粒DNA。大约500ng的各种质粒DNA分别与50μL ZW705-ara354A7感受态细胞在1MM VWR电穿孔管中混合并在2.0KV下使用BT720Transporater Plus将其电穿孔到细胞中。
pARA112或pARA113转化细胞(ZW705-ara354A7-ara112和ZW705-ara354A7-ara113)在30℃的1mL MMG5培养基中恢复4小时，然后在30℃下，在带有AnaeroPack的厌氧广口瓶内的MMG5-CM120平板(MMG5，带有120mg/L氯霉素和15g/L琼脂)上生长2天。将单菌落划线接种到新MMG5-CM120平板上并在与最后一步相同的条件下生长。划线接种的菌落在包含氯霉素的平板上生长良好，指示转化成功。
2.在转化菌株中表达P gi -araE和P gi -araFGH。
从MMG5-CM120平板中选择若干个转化菌株的划线以代表ZW705-ara354A7-ara112和ZW705-ara354A7-ara113。通过如实施例1所述的72小时生长测定检查Pgi-araE或Pgi-araFGH的表达。在这个测定中，来自每条划线的细胞在30℃、150rpm振荡条件下，在2mLMRM3G5-CM120(具有120mg/L氯霉素的MRM3G5)中生长过夜。收获细胞，用MRM3A5洗涤并重悬在MRM3A5-CM120(MRM3A5包含120mg/L的氯霉素)中，起始OD600为0.1。四mL悬浮液在30℃、150rpm振荡条件下生长72小时。在生长末期，测量OD600并如实施例1所述使用Agilent 1100HPLC系统上的BioRad Aminex HPX-A7H离子排斥柱分析代谢特征。作为对照，培养ZW705-ara354A7菌株并用Spec250代替CM120进行平行分析。在每个转化中的3个菌株的结果在表4中给出。
表4：在MRM3A5中的ZW705-ara354A7-ara112和 ZW705-ara354A7-ara113的72小时生长测定。
  菌株  生长(OD600)   乙醇(g/L)  阿拉伯糖(g/L)
  ZW705-ara354A7   3.01   18.57   5.98
  ZW705-ara354A7-ara112-1   3.28   19.22   0.43
  ZW705-ara354A7-ara112-2   3.33   21.38   0.34
  ZW705-ara354A7-ara112-3   3.20   19.65   0.40
  ZW705-ara354A7-ara113-5   2.51   16.64   11.95
  ZW705-ara354A7-ara113-6   2.12   15.65   15.97
  ZW705-ara354A7-ara113-7   2.17   15.32   13.91
与它们的亲本比较，所有ZW705-ara354A7-ara112菌株在72小时生长期间利用更多的阿拉伯糖，这证实了较高的生长和乙醇生产水平。实际上这些ZW705-ara354A7-ara112菌株已经消耗了培养基中几乎所有可用的阿拉伯糖。这指示araE促进工程化菌株的阿拉伯糖利用。在另一方面，表达araFGH似乎具有负面影响。它导致ZW705-ara354A7-ara113菌株在72小时生长期内的阿拉伯糖利用率降低、生长水平降低以及乙醇产量降低。
3.表征ZW705-ara354A7-ara112菌株的生长和代谢特征。
因为ZW705-ara354A7-ara112菌株显示易于代谢阿拉伯糖，进一步分析这些菌株。按照如实施例2.3所述的方法进行表征。因为araE从穿梭载体中表达，不同菌株间的表达水平可能不同。因此并列检查两个菌株(ZW705-ara354A7-ara112-2和ZW705-ara354A7-ara112-3)。为了表征单个糖(阿拉伯糖)培养基中的菌株，收获过夜生长的ZW705-ara354A7-ara112-2和ZW705-ara354A7-ara112-3培养物，用MRM3A5洗涤并重悬在MRM3A5-CM120中，起始OD600为0.1。二十mL悬浮液在30℃、150rpm振荡条件下生长96小时。在0、6、12、24、48、72、和96小时测量OD600。在每个时间点使用Agilent 1100HPLC系统上的BioRad Aminex HPX-A7H离子排斥柱分析代谢特征。在平行分析中，亲本菌株ZW705-ara354A7在250mg/L奇放线菌素培养基中生长，而不是在120mg/L氯霉素培养基中生长，并且作为对照物对其进行分析。结果在图8中给出。这些结果指示不含Pgi-araE的情况下，ZW705-ara354A7以0.93g/L/hr的最大速度利用阿拉伯糖。在时间段的末期，培养基中的阿拉伯糖浓度减少80.4％，为9.81g/L。在表达araE的情况下，ZW705-ara354A7-ara112-2和ZW705-ara354A7-ara112-3较有效地利用阿拉伯糖，这证实了较高水平的生长和乙醇产量。在112-2和112-3菌株中的阿拉伯糖消耗最大速度分别提高到1.18g/L/hr和1.28g/L/hr。在时间段的末期，ZW705-ara354A7-ara112-2的培养基阿拉伯糖浓度降低了98％，为1.02g/L，ZW705-ara354A7-ara112-3的培养基阿拉伯糖浓度降低了99.2％，为0.41g/L。实际上ZW705-ara354A7-ara112-2和ZW705-ara354A7-ara112-3分别在72小时和48小时的培养后已经几乎消耗了所有可用的阿拉伯糖。
为了在包含混合糖的培养基中表征菌株，如上所述培养并分析ZW705-ara354A7、ZW705-ara354A7-ara112-2、和ZW705-ara354A7-ara112-3，不同的是使用MRM3A2.5X2.5G5培养基。结果在图9中给出。这些结果说明ZW705-ara354A7在24小时内有效地消耗完了所有葡萄糖和木糖以维持较强的生长和乙醇生产。它的阿拉伯糖代谢是相对较慢的和不完全的。阿拉伯糖消耗的最大速度为0.43g/L/hr。在时间段的末期，培养基中的阿拉伯糖浓度减少62.4％，为9g/L。然而ZW705-ara354A7-ara112-2和ZW705-ara354A7-ara112-3对阿拉伯糖的利用要有效的多。阿拉伯糖消耗的最大速度分别提高到0.73g/L/hr和0.78g/L/hr。在时间段的末期，ZW705-ara354A7-ara112-2的培养基阿拉伯糖浓度降低了90.3％，为2.33g/L，ZW705-ara354A7-ara112-3的培养基阿拉伯糖浓度降低了90.1％，为2.38g/L。实际上两个菌株在48小时内已经将它降低到接近这个水平。因此表达araE也已经促进混合糖培养基中的阿拉伯糖利用率，这导致乙醇生产如图9所示。该表达对葡萄糖代谢无显著效应，但是它减慢了木糖代谢以便两种ZW705-ara354A7-ara112菌株需要48小时以消耗培养基中的所有木糖，而ZW705-ara354A7菌株仅需要24小时。
实施例5
在发酵单胞菌属ZW705-ara354和ZW801-ara354中表达araE
在这个实施例中，分析了在未适应的阿拉伯糖利用运动发酵单胞菌菌株ZW705-ara354和ZW801-ara354中表达araE的效应。
1.用pARA112转化ZW705-ara354和ZW801-ara354。
如实施例2所述，ZW705-ara354和ZW801-ara354是从ZW705和ZW801-4中通过将Pgap-araBAD导入ldhA基因座中开发的工程化运动发酵单胞菌菌株。ZW705-ara354是MRM3A5中未适应的ZW705-ara354A7的亲本菌株。制备两种菌株的感受态细胞。如上文实施例所述，将pARA112的非甲基化DNA电穿孔进感受态细胞。
pARA112转化的ZW705-ara354(ZW705-ara354-ara112)和ZW801-ara354((ZW801-ara354-ara112)在30℃的1mL MMG5培养基中恢复4小时，然后在30℃下，在带有AnaeroPack的厌氧广口瓶内的MMG5-CM120平板上生长2天。将单菌落划线接种到新MMG5-CM120平板上并在与最后一步相同的条件下生长。划线接种的菌落在包含氯霉素的平板上生长良好，指示转化成功。
2.在转化菌株中表达P gi -araE。
从MMG5-CM120平板中选择若干个转化菌株的划线分别代表ZW705-ara354-ara112和ZW801-ara354-ara112。通过在MRM3A5中的72小时生长测定检查Pgi-araE的表达。详细的测定方法与上述实施例中的方法相同。作为对照，平行培养并分析ZW705-ara354和ZW801-ara354菌株，其中用250mg/L奇放线菌素代替生长培养基中的120mg/L的氯霉素。在每个转化中的3个菌株的结果在表5中给出。与它们的亲本菌株相比，所有ZW705-ara354-ara112和ZW801-ara354-ara112菌株在72小时生长期间利用显著更多的阿拉伯糖，这证实了较高的生长和乙醇生产水平。因此araE也促进ZW705-ara354-ara112和ZW801-ara354-ara112菌株的阿拉伯糖利用。
表5：在MRM3A5中的ZW705-ara354-ara112和 ZW801-ara354-ara112的72小时生长测定。
  菌株  生长(OD600)   乙醇(g/L)   阿拉伯糖(g/L)
  ZW705-ara354   1.15   9.56   27.88
  ZW705-ara354-ara112-1   1.56   14.18   17.24
  ZW705-ara354-ara112-2   1.67   16.71   10.93
  ZW705-ara354-ara112-3   1.47   13.76   19.06
  ZW801-ara354   1.39   9.65   27.08
  ZW801-ara354-ara112-4   1.95   15.01   15.12
  ZW801-ara354-ara112-5   2.07   15.51   12.94
  ZW801-ara354-ara112-5   2.29   15.79   13.05
3.表征ZW705-ara354-ara112和ZW801-ara354-ara112菌株的生长 和代谢特征。
进一步表征ZW705-ara354-ara112和ZW801-ara354-ara112菌株在96小时时间段内的生长和代谢特征。按照如实施例4.3所述的相同方法进行表征。检查ZW705-ara354-ara112-1和ZW705-ara354-ara112-2并将它们与它们的亲本ZW705-ara354比较，同时检查ZW801-ara354-ara112-5和ZW801-ara354-ara112-6并将它们与它们的亲本ZW801-ara354比较。在0、6、12、24、48、72、和96小时的时间点测量并分析。
图10示出获取自在MRM3A5中生长的ZW705-ara354和ZW705-ara354-ara112菌株的结果。结果显示在不含Pgi-araE的情况下，ZW705-ara354利用阿拉伯糖的效率很低，其最大速度0.25g/L/hr。在时间段的末期，培养基中的阿拉伯糖浓度仅减少38.19％，为30.22g/L。在表达araE的情况下，ZW705-ara354-ara112-1和ZW705-ara354-ara112-2较有效地利用阿拉伯糖，这证实了较高水平的生长和乙醇产量。阿拉伯糖消耗的最大速度分别提高到0.46g/L/hr和0.48g/L/hr。在时间段的末期，ZW705-ara354-ara112-1的培养基阿拉伯糖浓度降低了65.8％，为16.73g/L，ZW705-ara354-ara112-2的培养基阿拉伯糖浓度降低了69.61％，为14.86g/L。
图11示出获取自在混合糖培养基MRM3A2.5X2.5G5中生长的ZW705-ara354和ZW705-ara354-ara112菌株的结果。结果显示ZW705-ara354有效地利用葡萄糖和木糖维持较强的生长和乙醇生产。它的阿拉伯糖代谢是慢的和不完全的。阿拉伯糖消耗的最大速度为0.29g/L/hr。在时间段的末期，培养基中的阿拉伯糖浓度减少57.32％，为10.21g/L。然而，ZW705-ara354-ara112-1和ZW705-ara354-ara112-2较有效地利用阿拉伯糖。阿拉伯糖消耗的最大速度分别提高到0.32g/L/hr和0.35g/L/hr。在时间段的末期，ZW705-ara354-ara112-1的培养基阿拉伯糖浓度降低了86.33％，为3.27g/L，ZW705-ara354-ara112-2的培养基阿拉伯糖浓度降低了85.2％，为3.54g/L。这些结果证实表达araE促进ZW705-ara354-ara112菌株利用单个糖(阿拉伯糖)培养基和混合糖培养基中的阿拉伯糖。因此，araE效应不需要在ZW705-ara354A7适应期间所需的遗传背景。类似于ZW705-ara354A7-ara112中的结果，表达araE轻微减缓在混合糖培养基中生长的ZW705-ara354-ara112中的木糖代谢。
图12示出获取自在MRM3A5中生长的ZW801-ara354和ZW801-ara354-ara112菌株的结果。结果指示在不含Pgi-araE的情况下，ZW801-ara354利用阿拉伯糖的效率很低，最大速度0.25g/L/hr。在时间段的末期，培养基中的阿拉伯糖浓度仅减少32.99％，为32.76g/L。在表达araE的情况下，ZW801-ara354-ara112-5和ZW801-ara354-ara112-6较有效地利用阿拉伯糖，这证实了较高水平的生长和乙醇产量。阿拉伯糖消耗的最大速度分别提高到0.49g/L/hr和0.47g/L/hr。在时间段的末期，ZW801-ara354-ara112-5的培养基阿拉伯糖浓度降低了69.52％，为14.90g/L，ZW801-ara354-ara112-6的培养基阿拉伯糖浓度降低了65.92％，为16.66g/L。图13示出获取自在混合糖培养基MRM3A2.5X2.5G5中生长的ZW801-ara354和ZW801-ara354-ara112菌株的结果。它显示ZW801-ara354有效地利用葡萄糖和木糖维持较强的生长和乙醇生产。它的阿拉伯糖代谢是慢的和不完全的。阿拉伯糖消耗的最大速度为0.22g/L/hr。在时间段的末期，培养基中的阿拉伯糖浓度减少45.48％，为13.04g/L。然而，ZW801-ara354-ara112-5和ZW801-ara354-ara112-6较有效地利用阿拉伯糖。阿拉伯糖消耗的最大速度分别提高到0.35g/L/hr和0.36g/L/hr。在时间段的末期，ZW801-ara354-ara112-5的培养基阿拉伯糖浓度降低了89.92％，为2.41g/L，ZW801-ara354-ara112-6的培养基阿拉伯糖浓度降低了88.38％，为2.78g/L。这些结果进一步证实表达araE促进ZW801-ara354-ara112菌株利用单个糖培养基和混合糖培养基中的阿拉伯糖。因此araE效应不受ZW705-ara354和衍生菌株的限制。类似于ZW705-ara354A7-ara112和ZW705-ara354-ara112中的结果，araE的表达轻微减缓在混合糖培养基中生长的ZW801-ara354-ara112中的木糖代谢。
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Claims (16)

1.利用阿拉伯糖来生产乙醇的发酵单胞菌属或发酵杆菌属重组微生物，所述微生物包含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。
2.权利要求1的重组微生物，其中，所述阿拉伯糖-质子同向转运体由araE基因的编码区来编码。
3.权利要求1的重组微生物，其中，阿拉伯糖利用率与亲本微生物相比改善了至少约10％，其中所述亲本微生物缺少所述至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。
4.权利要求1的重组微生物，其中，所述菌株额外地利用木糖以生产乙醇。
5.用于生成具有提高的阿拉伯糖利用率的发酵单胞菌属或发酵杆菌属重组微生物的方法，所述方法包括：
a)提供在合适条件下利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株；以及
b)将至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因导入(a)的所述菌株。
6.根据权利要求5的方法，所述方法还包括或者在步骤(b)之前或者在步骤(b)之后、或者既在步骤(b)之前又在步骤(b)之后通过在包含阿拉伯糖作为所述唯一碳源的培养基中连续生长来使所述菌株适应，从而生产适应菌株，并且其中所述菌株与未适应的菌株相比具有进一步改善的阿拉伯糖利用率。
7.根据权利要求6的方法，其中，所述适应菌株在混合糖培养基中额外地利用木糖和葡萄糖来生产乙醇，所述混合糖培养基包含阿拉伯糖、木糖和葡萄糖。
8.生产乙醇的方法，所述方法包括：
a)提供利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株，所述菌株包含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因；以及
b)在包含阿拉伯糖的培养基中培养(a)的所述菌株，从而将阿拉伯糖转化成乙醇。
9.根据权利要求9的方法，其中，所述阿拉伯糖-质子同向转运体由araE基因的编码区编码。
10.根据权利要求8的方法，其中，阿拉伯糖利用率与亲本微生物相比改善了至少约10％，其中，所述亲本微生物缺少编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。
11.根据权利要求8的方法，其中，(a)的所述菌株还能够利用木糖和葡萄糖来生产乙醇。
12.根据权利要求8的方法，其中，(a)的所述菌株已经通过在包含阿拉伯糖作为所述唯一碳源的培养基中连续生长进行了适应，从而生产阿拉伯糖适应菌株，其中所述阿拉伯糖适应菌株与未适应的(a)的所述菌株相比具有提高的乙醇产量。
13.根据权利要求8的方法，其中，阿拉伯糖到乙醇的转化率相对于重组亲本菌株的阿拉伯糖到乙醇的转化率提高，所述重组亲本菌株不含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。
14.根据权利要求13的方法，其中阿拉伯糖到乙醇的转化率比重组亲本菌株的阿拉伯糖到乙醇的转化率提高至少约10％，所述重组亲本菌株不含至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因。
15.根据权利要求8的方法，其中，所述培养基包含：含有阿拉伯糖的糖混合物，或者作为唯一糖的阿拉伯糖。
16.通过利用阿拉伯糖的微生物改善阿拉伯糖利用率的方法，所述方法包括：
(a)提供利用阿拉伯糖的微生物，其中，所述微生物选自利用阿拉伯糖来生产乙醇的重组发酵单胞菌属或发酵杆菌属菌株；
(b)将至少一种编码阿拉伯糖-质子同向转运体的异源基因导入所述微生物的基因组，其中所述转运体由所述微生物表达；以及
(c)使(b)的所述微生物接触包含阿拉伯糖的培养基，其中，所述微生物以与缺乏所述阿拉伯糖-质子同向转运体的所述微生物相比提高的速率代谢所述阿拉伯糖。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676122A (zh) * 2017-01-24 2017-05-17 成都分子脉象生物科技有限公司 一种基于AraF信号肽的双功能DNA元件及其应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110143408A1 (en) * 2009-06-18 2011-06-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Zymomonas with improved arabinose utilization
US8679822B2 (en) 2010-06-29 2014-03-25 E I Du Pont De Nemours And Company Xylose utilization in recombinant zymomonas
US8623623B2 (en) 2010-06-29 2014-01-07 E I Du Pont De Nemours And Company Xylose utilization in recombinant Zymomonas
US8476048B2 (en) 2010-12-17 2013-07-02 E I Du Pont De Nemours And Company Xylose utilizing zymomonas mobilis with improved ethanol production in biomass hydrolysate medium
US20130157332A1 (en) 2011-12-20 2013-06-20 E I Du Pont De Nemours And Company Gene inactivation allowing immediate growth on xylose medium by engineered zymomonas
US9845474B2 (en) 2012-10-24 2017-12-19 Calysta, Inc. Engineering of multi-carbon substrate utilization pathways in methanotrophic bacteria
US8846357B2 (en) 2012-12-20 2014-09-30 E I Du Pont De Nemours And Company Stabilized chlorine dioxide for contamination control in Zymomonas fermentation
US20140273105A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 E I Du Pont De Nemours And Company Gradient pretreatment of lignocellulosic biomass
US20150087040A1 (en) 2013-09-26 2015-03-26 E I Du Pont De Nemours And Company Production of ethanol and recycle water in a cellulosic fermentation process
US20150087041A1 (en) 2013-09-26 2015-03-26 E I Du Pont De Nemours And Company Production of ethanol with reduced contaminants in a cellulosic biomass based process
US20150147786A1 (en) 2013-11-24 2015-05-28 E I Du Pont De Nemours And Company High force and high stress destructuring for starch biomass processing
US9371546B2 (en) 2014-06-24 2016-06-21 E I Du Pont De Nemours And Company Enhancing D-xylose and L-arabinose utilization in Zymomonas cells
EP3400307A1 (en) * 2016-01-08 2018-11-14 Abbott Molecular Inc. Hybridization buffers comprising guanidinium thiocyanate

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843760A (en) * 1994-04-15 1998-12-01 Midwest Research Institute Single zymomonas mobilis strain for xylose and arabinose fermentation
US20030162271A1 (en) * 2000-05-01 2003-08-28 Min Zhang Zymomonas pentose-sugar fermenting strains and uses thereof
US20060141586A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Rybak Konstantin V Method for Producing L-Amino Acids Using Bacteria of the Enterobacteriaceae Family
JP2009050236A (ja) * 2007-08-29 2009-03-12 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth Ｌ−アラビノース利用機能を有するコリネ型細菌形質転換体

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5514583A (en) * 1994-04-15 1996-05-07 Midwest Research Institute Recombinant zymomonas for pentose fermentation
US5686276A (en) * 1995-05-12 1997-11-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Bioconversion of a fermentable carbon source to 1,3-propanediol by a single microorganism
US6566107B1 (en) * 2000-11-01 2003-05-20 Midwest Research Institute Recombinant Zymomonas mobilis with improved xylose utilization
EP2374879A3 (en) * 2002-04-22 2012-01-11 E. I. du Pont de Nemours and Company Promoter and plasmid system for genetic engineering
SE0202090D0 (sv) * 2002-05-08 2002-07-04 Forskarpatent I Syd Ab A modifierd yeast consuming L-arabinose
US7378256B2 (en) * 2004-11-18 2008-05-27 Genencor International, Inc. Aspergillus niger promoter for expressing genes in host cells
US7524660B2 (en) * 2005-05-05 2009-04-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Utilization of fructose in microbial production strains
US7741084B2 (en) * 2006-09-28 2010-06-22 E. I. Du Pont De Nemours And Company Ethanol production using xylitol synthesis mutant of xylose-utilizing zymomonas
US7629156B2 (en) 2006-09-28 2009-12-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Ethanol production in fermentation of mixed sugars containing xylose
US7741119B2 (en) * 2006-09-28 2010-06-22 E. I. Du Pont De Nemours And Company Xylitol synthesis mutant of xylose-utilizing zymomonas for ethanol production
JP2011515067A (ja) * 2007-10-30 2011-05-19 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー ｈｉｍＡ発現の減少した組み換えザイモモナス株を使用する、キシロースを含む培地からエタノールを産生する方法
ES2385857T3 (es) * 2007-10-30 2012-08-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Zymomonas con producción aumentada de etanol en medio que contiene azúcares concentrados y acetato
EP2271743A2 (en) * 2008-03-27 2011-01-12 E. I. du Pont de Nemours and Company Zymomonas with improved xylose utilization
US8247208B2 (en) 2008-12-22 2012-08-21 Alliance For Sustainable Energy Llc Zymomonas with improved xylose utilization in stress conditions
US20110143408A1 (en) * 2009-06-18 2011-06-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Zymomonas with improved arabinose utilization

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843760A (en) * 1994-04-15 1998-12-01 Midwest Research Institute Single zymomonas mobilis strain for xylose and arabinose fermentation
US20030162271A1 (en) * 2000-05-01 2003-08-28 Min Zhang Zymomonas pentose-sugar fermenting strains and uses thereof
CN1665919A (zh) * 2002-04-27 2005-09-07 米德韦斯特研究院 发酵戊糖的发酵单胞菌菌株及其应用
US20060141586A1 (en) * 2004-12-23 2006-06-29 Rybak Konstantin V Method for Producing L-Amino Acids Using Bacteria of the Enterobacteriaceae Family
JP2009050236A (ja) * 2007-08-29 2009-03-12 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth Ｌ−アラビノース利用機能を有するコリネ型細菌形質転換体

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《APPL ENVIRON MICROBIOL》 19961231 DEANDA ET AL 《Development of an Arabinose-Fermenting 》 4465 - 4470 1-16 第62卷, 第62期 *
《BIOCHEM. J》 19811231 DARUWALLA ET AL 《Energization of the transport systems 》 611-627 1-16 第200卷, *
《J BACTERIOL》 20041231 HASONA ET AL 《Pyruvate Formate Lyase and Acetate Kinase 》 7593-7600 1-16 第186卷, 第22期 *
DARUWALLA ET AL: "《Energization of the transport systems 》", 《BIOCHEM. J》 *
DEANDA ET AL: "《Development of an Arabinose-Fermenting 》", 《APPL ENVIRON MICROBIOL》 *
HASONA ET AL: "《Pyruvate Formate Lyase and Acetate Kinase 》", 《J BACTERIOL》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676122A (zh) * 2017-01-24 2017-05-17 成都分子脉象生物科技有限公司 一种基于AraF信号肽的双功能DNA元件及其应用
CN106676122B (zh) * 2017-01-24 2019-10-29 成都分子脉象生物科技有限公司 一种基于AraF信号肽的双功能DNA元件及其应用

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