CN116144510A - 黑酵母菌出芽短梗霉及其在发酵提高β-胡萝卜素含量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种黑酵母菌出芽短梗霉及其在发酵提高β‑胡萝卜素含量中的应用。所述黑酵母菌出芽短梗霉，于2022年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 20221742，分类命名：Aureobasidium melanogenum XYN202201；本发明特殊保藏的黑酵母菌出芽短梗霉菌株能够在胡萝卜发酵过程中提高β‑胡萝卜素的含量；且获得的β‑胡萝卜素抗氧化性和稳定性都相对高于普通发酵菌制备的；该菌株进一步提高了β‑胡萝卜素的营养价值和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵提取技术领域，具体涉及一种黑酵母菌出芽短梗霉及其在发酵提高β-胡萝卜素含量中的应用。
背景技术
胡萝卜里含有丰富的胡萝卜素，以及维生素C、B等营养元素，具有增强免疫力、改善贫血、改善视力和预防便秘的作用。胡萝卜中富含β-胡萝卜素，β-胡萝卜素是人体合成维生素A的前体，β-胡萝卜素摄入人体消化器官后，可贮存于肝脏中，根据需要逐步转化为维生素A，是目前最安全补充维生素A的产品；它可以维持眼睛和皮肤的健康，改善夜盲症、皮肤粗糙的状况，有助于身体免受自由基的伤害。
从胡萝卜中最大限度得提取β-胡萝卜素并将其纯化和工业化生产是胡萝卜综合开发利用的一个重要环节，将极大地提高胡萝卜的产品附加值。近些年来，随着各方面的需要和进展，β-胡萝卜素的提取和制备以及在保健和医疗领域中的应用日益得到了人们的重视。
目前从胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素的方法主要是(1)从植物中提取；(2)从大面积养殖的岩藻中获得β-胡萝卜素；(3)利用微生物的发酵生产β-胡萝卜素的。本发明旨在探索一种新的菌株，利用微生物发酵进一步提取胡萝卜中β-胡萝卜素等营养成分物质。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种黑酵母菌出芽短梗霉及其在发酵提高β-胡萝卜素含量中的应用。本发明保藏的黑酵母菌出芽短梗霉应用于胡萝卜发酵过程中，能够获取到更高含量的β-胡萝卜素，β-胡萝卜素含量能够达到92.15mg/100g。
本发明具体是通过如下技术方案实现的：
本发明提高了一种黑酵母菌出芽短梗霉，于2022年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 20221742，分类命名：Aureobasidiummelanogenum XYN202201。
本发明还提供了黑酵母菌出芽短梗霉在发酵提高β-胡萝卜素含量中的应用。所述的黑酵母菌出芽短梗霉通过发酵提高β-胡萝卜素含量。
上述黑酵母菌出芽短梗霉在发酵提高β-胡萝卜素含量中的应用，具体的应用方法如下：
(1)将洗净后的胡萝卜切碎，加水，均质，灭菌，获得均质液；
(2)菌种活化：将产黑色素短梗霉菌株接至培养基中进行活化培养；
(3)种子液培养：将步骤(2)中已活化菌株用接种环挑去2-3环接种于种子液培养基中培养，获得种子液；
(4)将步骤(3)种子液按0.08-1.5wt％接种量接入步骤(1)均质液中，调整pH，于发酵罐中发酵，发酵过程中控制溶氧为18-22％。
优选的，上述步骤(1)中，加水量为：按重量体积比，加入10-20％水；均质条件为：压力50-120MPa；均质时间60-150s。
优选的，上述步骤(1)中，加水量为：按重量体积比，加入10-20％水；均质条件为：压力60-120MPa；均质时间80-140s。
优选的，上述步骤(1)中，灭菌条件为115-121℃下灭菌15-30min。
优选的，上述步骤(2)中，培养基的组成为：1-3％的葡萄糖，1-3％的蛋白胨，0.5-2％的酵母抽提物，1-4％的琼脂，110-130℃下灭菌20-40min；培养条件为：在25-30℃恒温培养箱培养2-3天。
优选的，上述步骤(2)中，培养基的组成为：1.5-3％的葡萄糖，1.5-3％的蛋白胨，0.5-2％的酵母抽提物，1-3％的琼脂，110-130℃下灭菌25-40min；培养条件为：在25-30℃恒温培养箱培养2-3天。
优选的，上述步骤(3)中，种子液培养基组成：1-3％的葡萄糖，1-3％的蛋白胨，0.5-3％的酵母抽提物，50ml置于250ml锥形瓶中，封口膜封口，于110-140℃下灭菌20-40min；培养条件为在25-30℃摇床中，150-300r/min培养1-3d。
优选的，上述步骤(4)中，种子液接种量0.1-1.5wt％。
优选的，上述步骤(4)中，种子液接种量0.2-1.4wt％。
优选的，上述步骤(4)中，发酵条件如下：发酵时间36-120h，发酵温度25-28℃，发酵pH4.5-7.2，通气25-50L/min，200-700转速/rpm，罐压0.06-0.09/Mpa。
优选的，上述步骤(4)中，发酵条件为：发酵时间50-120h，发酵温度26-28℃，发酵pH4.7-7.0，通气25-50L/min，转速200-700/rpm，罐压0.06-0.09/Mpa。
优选的，上述步骤(4)中，发酵条件为：发酵时间50-120h，发酵温度27-28℃，发酵pH5.0-6.9，通气25-50L/min，200-700转速/rpm，罐压0.06-0.09/Mpa。
微生物发酵法和从植物中提取方法均是是目前提取天然β-胡萝卜素的方法；本发明将两者结合，将微生物菌株应用到胡萝卜发酵过程中对胡萝卜素进行提取。经检测，本发明从短梗霉菌种库中经筛选、系列条件优化后获得的黑酵母菌出芽短梗霉(本发明保藏)，参与到胡萝卜发酵过程中，能够提高β-胡萝卜素的含量，效果远优于现有技术中较为常用的三孢布拉霉菌、红酵母、红酵母等酵母菌，及普通市售的黑酵母菌出芽短梗霉。
本发明的优异效果在于：
1.开发了优势菌株
本发明中特殊保藏的黑酵母菌出芽短梗霉对胡萝卜进行发酵，相较于其它普通菌株(三孢布拉霉菌、红酵母、红酵母等酵母菌)，发酵产物中β-胡萝卜素的提取含量大幅度提高，能够达到92.15mg/100g；
2.提高了β-胡萝卜素含量和营养价值、应用价值
黑酵母菌出芽短梗霉参与发酵制备的β-胡萝卜素在稳定性及抗氧化性等方面远优于普通发酵菌制备产品：β-胡萝卜素含量能够在3个月时保持在75mg/100g以上；其自由基清除率(SA)能够达到76.35％。
附图说明
图1为出发菌株XYN202201的系统发育树；
图2为出发菌株XYN202201的菌落图以及显微观察图；
(A)：XYN202201菌株在YPD培养基上的形态；(B)：XYN202201菌株在PDA培养基上的形态；
图3为XYN202201菌株在显微镜下照片。
具体实施方式
一、实施
实施例1目标菌株的分离与鉴定
1.菌株的筛选与鉴定
2.菌株的鉴定
(1)菌落形态观察：将分离到的菌株接种到YPD平板培养基和PDA平板培养基中，于28℃培养箱中培养，观察并记录菌株生长的颜色、形态、大小及质地的变化；XYN202201菌株在YPD平板上菌落呈粉白色，菌落边缘呈放射状，中间有突起，菌落嵌合在培养基中，不易挑取(如图2(A)所示)；XYN202201菌株在PDA平板上边缘呈放射状，菌落表面粘稠且光滑，培养168h以上时，菌落呈黑色，说明XYN202201菌株在生长过程中会产生黑色素(如图2(B)所示)；
(2)显微观察：
通过对菌落形态特征等显微结构特征观察，根据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》可初步鉴定XYN202201菌为黑酵母菌出芽短梗霉菌株，但仅由形态特征难以鉴定到种，需结合分子生物学手段作进一步鉴定；图3为XYN202201菌株在显微镜下照片；
(3)菌株ITS序列鉴定结果：
测定XYN202201的ITS序列结果如下(SEQ-1)：
TGCTTTGGCGGGACCGCTCGGTCTCGAGCCGCTGGGGATTCGTCCCAGGCGAGCGCCCGCCAGAGTTAAACCAAACTCTTGTTATTAAACCGGTCGTCTGAGTTAAAATTTTGAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACACCACTCAAGCTATGCTTGGTATTGGGTGCCGTCCTTAGTTGGGCGCGCCTTAAAGACCTCGGCGAGGCCTCACCGGCTTTAGGCGTAGTAGAATTTATTCGAACGTCTGTCAAAGGAGAGGACTTCTGCCGACTGGAACCTTTATTTTTCTAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT。
运用GenBank的DNA序列局部相似查询系统，搜索与供试菌株DNA序列相似的序列，并进行比对分析。
根据菌落形态特征和菌丝、孢子等显微结构特征观察，以及分子生物学ITS序列测定结果，可以判定，菌株XYN202201为黑酵母菌出芽短梗霉(Aureobasidium melanogenum)。
黑酵母菌出芽短梗霉，于2022年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 20221742，分类命名：Aureobasidium melanogenum XYN202201。
实施例2
黑酵母菌出芽短梗霉在发酵提高β-胡萝卜素含量中的应用，具体的应用方法如下：
(1)将洗净后的胡萝卜切碎，按重量体积比，加入12％水，在50MPa下均质80s，115℃高温高压灭菌15min，获得均质液；
(2)菌种活化：将产黑色素短梗霉菌株接至培养基中进行活化培养；
培养基的组成为：2％的葡萄糖，2％的蛋白胨，1.2％的酵母抽提物，2％的琼脂，110℃下灭菌30min；培养条件为：在27.5℃恒温培养箱培养2天；
(3)种子液培养：将步骤(2)中已活化菌株用接种环挑去3环接种于种子液培养基中培养，获得种子液；
种子液培养基组成：2％的葡萄糖，2％的蛋白胨，1％的酵母抽提物，50ml置于250ml锥形瓶中，封口膜封口，于130℃下灭菌30min；培养条件为在28.5℃摇床中，180r/min培养2d；
(4)将步骤(3)种子液按0.8wt％接种量接入步骤(1)均质液中，调整pH至6，于发酵罐中发酵；发酵时间64h，发酵温度28℃，通气40L/min，转速500/rpm，罐压0.09/Mpa。
实施例3
黑酵母菌出芽短梗霉在发酵提高β-胡萝卜素含量中的应用，具体的应用方法如下：
(1)将洗净后的胡萝卜切碎，按重量体积比，加入20％水，在120MPa下均质130s，117℃高温高压灭菌30min，获得均质液；
(2)菌种活化：将产黑色素短梗霉菌株接至培养基中进行活化培养；
培养基的组成为：3％的葡萄糖，2％的蛋白胨，1％的酵母抽提物，2％的琼脂，130℃下灭菌35min；培养条件为：在30℃恒温培养箱培养3天；
(3)种子液培养：将步骤(2)中已活化菌株用接种环挑去2-3环接种于种子液培养基中培养，获得种子液；
种子液培养基组成：2％的葡萄糖，2％的蛋白胨，2％的酵母抽提物，50ml置于250ml锥形瓶中，封口膜封口，于140℃下灭菌20-40min；培养条件为在30℃摇床中，300r/min培养3d；
(4)将步骤(3)种子液按1.2wt％接种量接入步骤(1)均质液中，调整pH至5.3，于发酵罐中发酵；发酵时间72h，发酵温度28℃，通气45L/min，转速450/rpm，罐压0.09/Mpa。
实施例4
黑酵母菌出芽短梗霉在发酵提高β-胡萝卜素含量中的应用，具体的应用方法如下：
(1)将洗净后的胡萝卜切碎，按重量体积比，加入12％水，在50MPa下均质80s，获得均质液，115℃高温高压灭菌25min；
(2)菌种活化：将产黑色素短梗霉菌株接至培养基中进行活化培养；
培养基的组成为：2％的葡萄糖，2％的蛋白胨，1.2％的酵母抽提物，2％的琼脂，110℃下灭菌30min；培养条件为：在27.5℃恒温培养箱培养2天；
(3)种子液培养：将步骤(2)中已活化菌株用接种环挑去3环接种于种子液培养基中培养，获得种子液；
种子液培养基组成：2％的葡萄糖，1％的蛋白胨，0.5％的酵母抽提物，50ml置于250ml锥形瓶中，封口膜封口，于130℃下灭菌30min；培养条件为在28.5℃摇床中，200r/min培养2d；
(4)将步骤(3)种子液按0.5wt％接种量接入步骤(1)均质液中，调整pH至6.3，于发酵罐中发酵；发酵时间96h，发酵温度28℃，通气40L/min，转速600/rpm，罐压0.06/Mpa。
实施例5
黑酵母菌出芽短梗霉在发酵提高β-胡萝卜素含量中的应用，具体的应用方法如下：
(1)将洗净后的胡萝卜切碎，按重量体积比，加入15％水，在100MPa下均质130s，115℃高温高压灭菌30min，获得均质液；
(2)菌种活化：将产黑色素短梗霉菌株接至培养基中进行活化培养；
培养基的组成为：3％的葡萄糖，2％的蛋白胨，1％的酵母抽提物，2％的琼脂，130℃下灭菌35min；培养条件为：在30℃恒温培养箱培养3天；
(3)种子液培养：将步骤(2)中已活化菌株用接种环挑去2-3环接种于种子液培养基中培养，获得种子液；
种子液培养基组成：1.5％的葡萄糖，1.5％的蛋白胨，0.5％的酵母抽提物，50ml置于250ml锥形瓶中，封口膜封口，于140℃下灭菌40min；培养条件为在30℃摇床中，300r/min培养3d；
(4)将步骤(3)种子液按1.0wt％接种量接入步骤(1)均质液中，调整pH至6.8，于发酵罐中发酵；发酵时间64h，发酵温度28℃，发酵pH4.5-7.2，通气40L/min，转速500/rpm，罐压0.06/Mpa。
对比例1-4
与本发明的发酵菌种不同，其余同实施例2。
表1各对比例发酵菌
| 对比例1 | 三孢布拉霉菌 |
| 对比例2 | 红酵母 |
| 对比例3 | 环黑星霉 |
| 对比例4 | 黑酵母菌出芽短梗霉(市购) |
二、结果与分析
1.β-胡萝卜素含量检测
参考GB 5009.83-2016食品安全国家标准-食品中胡萝卜素的测定，对上述各实施例和对比例的发酵后的样品进行β-胡萝卜素含量检测。
表2β-胡萝卜素含量测定
| 项目 | β-胡萝卜素含量mg/100g |
| 实施例2 | 89.63 |
| 实施例3 | 92.15 |
| 实施例4 | 79.92 |
| 实施例5 | 89.03 |
| 对比例1 | 77.25 |
| 对比例2 | 69.47 |
| 对比例3 | 77.02 |
| 对比例4 | 76.32 |
由上表可知，本发明特殊保藏的出芽短梗霉参与胡萝卜发酵过程中能够显著提高β-胡萝卜素含量；远高于现有技术中常用的三孢布拉霉菌、红酵母等酵母菌及市购黑酵母菌出芽短梗霉发酵制备获得的β-胡萝卜素含量。
2.β-胡萝卜素的稳定性检测
将制备的发酵物放在0-4℃(避光)储存，在测定0天、30天、90天后测定其β-胡萝卜素含量，测定方法同“1.β-胡萝卜素含量检测”，下同。
表3不同温度、储存时间下β-胡萝卜素稳定性检测
由上表可知，在0-4℃内β-胡萝卜素含量损失的差距较小；0℃低温保存时，β-胡萝卜素损失率会更小。β-胡萝卜素含量能够在3个月时保持在75mg/100g以上；表明本发明发酵提取的β-胡萝卜素具有很高的稳定性。
3.测定提取β-胡萝卜素的抗氧化活力
检测方法参考张涛等人在期刊《食品发酵与工业》中《虾青素和β-胡萝卜素的抗氧化活性及其协同作用研究》一文。将实施例和对比例各自用甲醇制备质量浓度为2、4、8、16μg/mL的β-胡萝卜素的待测液，将50μL 2.25mmol/L FeSO4水溶液、50μL 9mmol/L水杨酸甲醇溶液和50μL待测液混合，于暗处室温下反应30min，于520nm波长下测定吸光度值。清除率计算公式如下：
·OH清除率/％＝[A0-(Ax-A1)]/A0×100％；
式中：Ax，添加待测液时的吸光度；A0，待测液用甲醇替代时的吸光度；A1，水杨酸甲醇溶液和H2O2甲醇溶液均用甲醇替代时的吸光度。
表4β-胡萝卜素抗氧化能力检测
由上表可知，本发明保藏菌种发酵获得的β-胡萝卜素，具有更强的抗氧化能力；其自由基清除率(SA)能够达到76.35％；显著高于未经发酵的β-胡萝卜素抗氧化能力及目前常用酵母菌发酵制备提取的β-胡萝卜素抗氧化能力。
Claims (8)
1.黑酵母菌出芽短梗霉，于2022年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO： M 20221742，分类命名：Aureobasidium melanogenum XYN202201。
2.一种如权利要求1所述黑酵母菌出芽短梗霉在发酵提高β-胡萝卜素含量中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，具体的应用方法如下：
（1）将洗净后的胡萝卜切碎，加水，均质，灭菌，获得均质液；
（2）菌种活化：将产黑色素短梗霉菌株接至培养基中进行活化培养；
（3）种子液培养：将步骤（2）中已活化菌株用接种环挑去2-3环接种于种子液培养基中培养，获得种子液；
（4）将步骤（3）种子液按0.08-1.5wt%接种量接入步骤（1）均质液中，调整pH，于发酵罐中发酵，发酵过程中控制溶氧为18-22%。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，加水量为：按重量体积比，加入10-20%水；均质条件为：压力50-120MPa；均质时间60-150s。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，灭菌条件为115-121℃下灭菌15-30min。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，培养基的组成为：1-3%的葡萄糖，1-3%的蛋白胨，0.5-2%的酵母抽提物，1-4%的琼脂，110-130℃下灭菌20-40min；培养条件为：在25-30℃恒温培养箱培养2-3天。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，种子液培养基组成：1-3%的葡萄糖，1-3%的蛋白胨，0.5-3%的酵母抽提物，50ml置于250ml锥形瓶中，封口膜封口，于110-140℃下灭菌20-40min；培养条件为在25-30℃摇床中，150-300r/min培养1-3d。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，发酵条件如下：发酵时间36-120h，发酵温度25-28℃，发酵pH4.5-7.2，通气25-50L/min，转速200-700/rpm，罐压0.06-0.09/Mpa。
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