KR20190033484A - 사료 첨가제를 포함하는 동물 사료 펠릿, 이의 제조 방법 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
동물 사료를 섭취한 동물에게 이익을 주기에 충분한 양으로 사료 펠릿에 혼입된 살아있는 비 병원성 대장균 박테리아를 포함하는 동물 사료 펠릿이 제공된다. 또한, 이의 제조 방법 및 용도가 제공된다.
Description
본 발명은 일반적으로 사료 첨가제를 포함하는 동물 사료 펠릿의 분야, 이의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.
펠릿화 동물 사료는 전형적으로 임의의 기계적 공정에 의해 다이 개구부를 통해 압축 및 압출하여 개별 성분 또는 혼합물을 압출함으로써 형성된 응집된 사료로서 정의된다. 기본적으로, 펠릿화의 목적은 미세하게 분쇄된, 때로는 분진이 많고 먹을 수 없고 취급하기 어려운 사료를 취하여 고열, 수분(증기-컨디셔닝) 및 압력을 사용하여, 큰 입자로 만드는 것이다.
상업용 사료 밀링에서 사용되는 광범위한 컨디셔닝 온도 및 잔류 시간 조합이 있으며(McCracken, Poultry Feeds, Supply, Composition 및 Nutritive Value, CAB International, New York (2002), pp. 301-316), 전형적으로, 펠릿화 공정은 살모넬라 및 대장균(E. coli)과 같은 사료 매개 병원균을 조절하기 위해 적대적인 열, 습기 및 압력 조건을 필요로 한다. 예를 들어, 현재의 산업 관행에서, 일부 사료 공장의 컨디셔너 온도는 90℃에 달할 수 있으며, 사료 업계는 보다 높고 엄격한 사료 가공 조건으로 이동하여 사료 매개 병원체를 제어하려고 한다.
동물 사료 펠릿에 혼입된 프로바이오틱 보충제는 펠릿화 가혹한 압력, 온도 및 습기 조건에 대한 박테리아의 불안정성이 펠릿형 사료에서의 사용에 문제를 일으킬 수 있기 때문에 열에 안정하고 보관에 안정한 박테리아 균주로 가능하다.
예를 들어, 포자 형태로 존재할 수 있는 균주는 동물 사료 펠릿에 혼입하는데 유용할 수 있다. 박테리아 포자는 극한의 온도, 수분 부족/가뭄, 화학 물질 및 방사선에 노출을 포함하는 박테리아 서식지의 극심한 변화에 저항하여 박테리아의 생존을 돕는 휴면 생물 형태다. 따라서 박테리아 포자는 프로바이오틱스를 동물 사료 펠릿에 혼합하려고 할 때 도움이 될 수 있다. 대부분의 포자 형성 박테리아는 바실러스 및 클로스트리디움 종에 포함된다.
포자 형성이 아닌 프로바이오틱 균주는 전형적으로 펠릿에 혼입되지 않고, 즉, 펠릿 성분을 상기 거친 조건에 노출된 후 오히려 펠릿 상에 코팅된다. 예를 들어, WO 2011/094469는 프로바이오틱스 애완 동물 사료 및 어류 사료의 제조를 기술하며, 여기서 사료 펠릿은 먼저 지방-기초 수분 장벽으로 분무되고, 이어서 프로바이오틱스를 함유하는 건조 조성물과 접촉하게 되고, 마지막으로 지방-기초 수분 장벽의 추가 코팅으로 분무되어, 사료 펠릿의 표면 상의 코팅제의 양이 약 10%-15%(wt/wt)가 된다.
이 요약은 상세한 설명에서 하기에서 더 기술되는 단순화된 형태의 개념의 선택을 소개하기 위해 제공된다. 이 요약은 청구된 주요한 양태 또는 필수적 양태를 식별하기 위한 것이 아니다.
본 발명에 구체화되고 광범위하게 기술된 바와 같이, 본 발명은 펠릿에 혼입된 생존 가능한 비 병원성 대장균을 포함하는 동물 사료 펠릿에 관한 것이다. 대장균은 동물 사료를 섭취한 동물에게 유익한 효과를 제공하기에 충분한 양이다. 대장균은 통상적으로 식품과 관련이 없는 미생물이다; 따라서 대장균이 동물 사료에 자발적으로 포함되는 것은 일상적이고 통상적이지 않다.
이전에 논의된 바와 같이, 업계에서 사용되는 펠릿화 조건은 살모넬라 및 대장균과 같은 병원균을 제어(즉, 죽이기)하기 위해 사료 성분을 가혹한 조건에 노출하도록 설계된다. 한 실시태양에서, 본 발명은 병원균을 여전히 제어하면서 비 병원성 대장균을 사료 펠릿에 혼입시킬 수 있도록 필요한 가혹한 조건의 영향을 완화시키는 방법을 제안한다.
한 실시태양에서, 동물 사료 펠릿은 펠릿에 혼입된 적어도 1 x 105 CFU/g의 생존 가능한 비 병원성 대장균 박테리아를 포함한다.
한 실시태양에서, 생존 가능한 비 병원성 대장균은 사료 첨가제에 삽입된다. 사료 첨가제는 동물 사료 펠릿에 혼입된다. 실제 실시태양에서, 사료 첨가제는 다양한 형태로 동물 사료에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 사료 첨가제는 동물 사료와 함께 압출되거나 동물 사료 내에 캡슐화될 수 있다. 당업자는 동물 사료에 사료 첨가제를 혼입시키는 다양한 방법이 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다.
본 발명에서 구체화되고 광범위하게 기술된 바와 같이, 본 발명은 또한 생존 가능한 비 병원성 대장균을 동물 사료 펠릿에 혼입하기 위한 사료 첨가제에 관한 것으로, 상기 사료 첨가제는 매트릭스에 내장된 비 병원성 대장균을 포함하며, 여기서 매트릭스는 펠릿에 혼입되기 전에 ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는다. 매트릭스는 하이드로콜로이드 형성 다당류를 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 사료 첨가제는 다음 특징 세트 중 하나 이상을 추가로 포함한다 :
● 매트릭스는 하이드로콜로이드 형성 다당류와 상이한 제 2 다당류를 포함할 수 있다. 선택적으로, 매트릭스는 이당류를 포함할 수 있다.
● 매트릭스는 이의 표면의 적어도 일부분 상에 배치된 코팅을 포함할 수 있다.
● 매트릭스는 공극을 포함할 수 있다.
● 코팅은 하이드로콜로이드 형성 다당류와 상이한 제 2 다당류를 포함할 수 있다. 선택적으로, 코팅은 이당류를 포함할 수 있다.
● 코팅은 미립자 칼슘 함유 화합물을 포함할 수 있다.
● 매트릭스는 공극을 포함할 수 있으며 코팅은 적어도 공극을 정의하는 표면 상에 배치될 수 있다.
당업자는 사료 첨가제의 실시태양은 상기 특징의 임의의 조합을 포함할 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다.
상기 실시태양에서, 당업자는 매트릭스는 동물 소비에 적합하고 및/또는 비병원성 대장균과 양립할 수 있는 하나 이상의 요소를 포함할 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
비 제한적인 실시태양에서, 사료 첨가제는 대장균의 적어도 1 x 106 CFU/g를 포함한다. 예를 들어, 사료 첨가제는 적어도 1 x 107 CFU/g, 적어도 1 x 108 CFU/g, 적어도 1 x 109 CFU/g, 적어도 1 x 1010 CFU/g, 적어도 1 x 1011 CFU/g를 포함할 수 있다.
비 제한적인 실시태양에서, 사료 첨가제는 입자 형태이다. 실제 구현예에서, 입자의 적어도 일부는 상기한 바와 같이 코팅을 포함하는 가교에 의해 함께 고정된 입자의 응집체를 형성할 수 있다.
하나의 실제 비 제한적인 실시태양에서, 본 발명에 기술된 미립자 칼슘-함유 화합물은 젖산 칼슘을 포함한다.
비 한정적인 실시태양에서, 사료 첨가제는, 박테리아 세포 생존력 및/또는 기능적 특성에 현저하게 유해한 작용 없이, 사료 첨가제로서 및/또는 동물 사료에 혼입된 경우 통상적인 저장/선적 조건을 제공하는 하나 이상의 요소를 포함할 수 있다. 달리 말하면, 특정 실시태양에서 비 병원성 대장균은 자연 대응체를 가질 수 있지만, 후자는 통상적인 저장/선적 조건으로 불리해질 수 있어서 박테리아 세포 생존력의 현저한 감소 및/또는 기능적 특성의 상실을 초래할 것이다. 따라서, 본 발명에 기술된 사료 첨가제는 대장균을 안정화시키고, 예를 들어, 주변 온도 및 상대 습도 이상의 조건을 포함할 수 있는 통상적인 저장/선적 조건하에서 연장된 기간 동안 이의 활성을 보존할 수 있다. 이러한 요소의 예는 이 텍스트의 다른 곳에서 더 논의된다.
추가의 또는 대안적인 실시태양에서, 사료 첨가제는, 예를 들어, 다음의 적어도 하나이나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 요소를 포함하여 대장균이 자연 발생 대장균과 비교하여 현저하게 변화된 성질을 가질 수 있다:
● 사료 첨가제는 박테리아 세포 생존력의 현저한 감소 및/또는 기능적 특성의 상실 없이 사료 첨가제의 제조 및/또는 저장 동안 대장균의 동결 건조 또는 동결을 유리하게 허용할 수 있는 하나 이상의 냉동 보존제를 포함할 수 있다;
● 사료 첨가제는 감각적인 성질에 긍정적인 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 요소를 포함하여, 동물 사료에 혼입시, 동물 사료는 이런 하나 또는 그 이상의 요소가 없는 조성물에 있는 자연 발생 비 병원성 대장균과 비교하여 보다 즐거운 입맛을 가질 수 있다. 예를 들어, 배양액과 혼합된 비 병원성 대장균을 포함하는 사료 첨가제는 동물에게 불쾌감을 주어 사료의 투여를 더욱 어렵게 할 수 있는 일반적인 악취/맛을 가질 수 있는 반면 감각적인 성질에 긍정적인 영향을 미치는 하나 이상의 요소의 존재는 이런 악취/맛을 위장하거나 중화시킬 수 있다.
● 사료 첨가제는 대장균 제형의 형태에 영향을 미칠 수 있는(예를 들어, 젤 유사 퍼짐 일관성 및/또는 다공성 고체 또는 반고체 구조로 변형 등) 하나 이상의 요소를 포함할 수 있고, 이는 펠릿화할 때 동물 사료에 대장균의 혼입을 촉진할 수 있다;
● 사료 첨가제는 맞춤형 입자 크기를 갖는 입자 형태일 수 있으며, 맞춤 크기 또는 크기 범위는 원하는 결과를 얻기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 입자의 제 1 집단은 제 1 평균 직경 크기를 갖도록 선택될 수 있고, 입자의 제 2 집단은 제 2 평균 직경 크기를 갖도록 선택될 수 있다. 제 1 평균 직경 크기 및 제 2 평균 직경 크기는 상이할 수 있는데, 즉 크기 비율(제 1 : 제 2)> 1을 가질 수 있다. 당업자는 이런 입자 크기 분포가 원하는 결과를 얻도록 맞춤가능한 용해 속도를 초래할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
당업자는 사료 첨가제의 실시태양이 상기 특징의 임의의 조합을 포함할 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
상기 실시태양은 자연 발생 대장균의 특성과 현저한 차이를 나타내는 변형 된 특성의 비 제한적인 예를 나타내며, 이는 이 실시태양이 본 발명의 특성과 관련이 있는 방식으로 자연 대응체와 구별되는 동물 사료 펠릿을 제공하기 때문이다.
비 제한적인 실시태양에서, 맞춤가능한 입자 크기는 자연 발생 건조된 대장균의 상응하는 느리고 일관성 없는 용해 속도와 대조적으로, 건조된 대장균의 증가된 및/또는 일관성 있는 용해 속도를 얻는 것을 가능하게 할 수 있다. 실제로, 맞춤형 용해 속도는 입자의 제 1 및 제 2 집단 사이의 적절한 입자 크기 비율의 선택에 기초하여 얻을 수 있다.
비 제한적인 실시태양에서, 맞춤가능한 입자 크기는 자연 발생 대장균 또는 다른 형태(예를 들어, 식수)로 투여된 대장균의 분출 전달과 대조적으로, 비 병원성 균주의 시간-방출 전달을 얻는 것을 가능하게 할 수 있다. 이러한 시간 방출 전달은 대형/소형 입자의 비율을 맞춤화하는 것에 기초할 수 있어서 전체적으로, 대장균이 미리 결정된 기간 동안 가혹한 장관 환경으로부터 보호된다. 차례로, 대장균의 제어된 전달 타이밍은 장관을 따라 미리 선택된 위치에서 전달을 가능하게 할 수 있다. 다시 말해, 당업자는 대장균의 주어진 시간-방출을 가능하게 하도록 특정 입자 크기 분포를 선택하여 장내 전달에 영향을 미치는 다양한 인자를 고려할 때, 대장균은 주로 장관의 미리 결정된 위치에 전달될 수 있다.
본 발명에서 구체화되고 광범위하게 기술된 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명에 기술된 사료 첨가제를 동물 사료 펠릿에 혼힙하기 위한 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 사용자가 동물 사료에 함유된 박테리아의 양 또는 각 동물 사료 차량 및/또는 사료 시스템에 제공하는 박테리아의 양을 제어할 수 있게 하는 사용자 인터페이스를 포함할 수 있다. 이는 다음과 같은 비 제한적인 실제 구현예 중 하나 이상을 통해 얻을 수 있다:
● 사료 첨가제에 삽입된 미리 정해진 양의 살아있지만 잠복해 있는 박테리아를 활성화시킨다. 이는 예를 들어, 소정량의 박테리아/사료 첨가제에 적합한 활성제(예를 들어, 수분, 당 등으로 제한되지 않음)의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 이어서, 사료 첨가제는 동물 사료에 혼힙되어 펠릿을 얻을 수 있다. 펠릿은 동물 사료 시스템 및/또는 사료 공급 차량에 전달될 수 있다.
● 동물 사료 펠릿에 첨가될 사료 첨가제 입자의 특정 비율을 선택한다. 이러한 실제 구현예에서, 입자는 생존 가능한 비 병원성 박테리아의 제 1 양(콜로니 형성 단위, "CFU")을 갖는 입자의 제 1 집단 및 상기 생존 가능한 비 병원성 박테리아의 제 2 CFU를 갖는 입자의 제 2 집단을 포함할 수 있다.
본 발명에서 구체화되고 광범위하게 기술된 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명에 기술된 사료 첨가제를 형성하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 제 1 바이알에, 본 발명에 기술된 제 1 하이드로콜로이드 형성 다당류, 별도의 제 2 바이알에, 본 발명에 기술된 대장균, 별도의 제 3 바이알에, 본 발명에 기술된 제 1 다당류와 상이한 제 2 다당류 및 별도의 제 4 바이알에, 본 발명에 기술된 이당류를 포함한다. 선택적으로, 본 발명에 기술된 제 2, 제 3 및/또는 제 4 바이알 중 하나는 칼슘 염을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 옵션에서, 칼슘 염은 별도의 제 5 바이알에 포함될 수 있다.
당업자는 이전에 기술된 키트가 이와 같이 포함되는 것과 양립가능한 것을 조건으로, 동일한 바이알에 존재하는 나열된 요소 중 하나 이상을 포함할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
한 비 제한적인 실시태양에서, 본 발명에 기술된 이당류는 수크로오스, 트레 할로오스 또는 이의 조합을 포함한다.
한 비 제한적인 실시태양에서, 본 발명에 기술된 칼슘 염은 젖산 칼슘을 포함할 수 있다.
본 발명에서 구체화되고 광범위하게 기술된 바와 같이, 본 발명은 또한 사료 펠릿 및 생존 가능한 비 병원성 대장균을 포함하는 사료 첨가제를 제조하기 위한 성분을 제공하는 단계, 성분 및 동물 사료 펠렛을 얻기 위해 사료 첨가제를 펠렛화하는 단계를 포함하여 동물 사료 펠릿을 제조하는 방법에 관한 것이다.
한 비 제한적인 실시태양에서, 사료 첨가제를 제공하는 단계는 입자의 형태로 사료 첨가제를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 입자는 제 1 평균 직경 크기를 갖는 제 1 입자 집단 및 제 2 평균 직경 크기를 갖는 제 2 입자 집단을 가진다.
본 발명에서 구체화되고 광범위하게 기술된 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명에 기술된 사료 첨가제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하이드로 콜로이드 형성 다당류인 제 1 다당류, 제 1 다당류와 상이한 제 2 다당류 및 수크오로스, 트레할로오스 또는 이의 조합을 포함하는 이당류를 포함하는 입자 및 본 발명에 기술된 대장균을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 ≤0.3의 수분 활성(aw)을 얻기 위해 입자를 건조하는 단계를 포함한다.
한 비 제한적인 실시태양에서, 입자를 제공하는 단계는 혼합물을 형성하기 위해 대장균을 제 1 다당류와 혼합하는 단계; 혼합물로부터 입자를 형성하는 단계; 수크로오스 또는 트레할로오스를 포함하는 보존 용액 및 제 2 다당류와 입자를 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 비 제한적인 실시태양에서, 입자를 제공하는 단계는 혼합물을 형성하기 위해 대장균을 제 1 다당류 및 수크로오스 또는 트레할로스를 포함하는 보존 용액과 제 2 다당류와 혼합하는 단계; 혼합물로부터 입자를 형성하는 단계를 포함한다.
한 실시태양에서, 동물 사료 펠릿은 가금류, 돼지 및 소 중 어느 하나에 의한 소비를 위한 것이다.
본 발명에서 설명되고 상호 배타적이지 않은 실시태양의 모든 특징은 서로 결합될 수 있다. 한 실시태양의 요소는 추가 설명 없이 다른 실시태양에서 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태 및 특징은 첨부된 도면과 함께 특정 실시태양에 대한 다음의 설명을 검토하면 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
특정 실시태양에 대한 상세한 설명은 첨부된 도면을 참조하여 아래에 제공된다.
도 1은 본 발명의 한 실시태양에 따른 박테리아 배양액을 제조하기 위한 비 제한적인 흐름도를 도시한다.
도 2는 본 발명의 한 실시태양에 따른 삽입된 대장균을 갖는 비드를 건조하기 위한 비 제한적인 흐름도를 도시한다.
도 3은 본 발명의 한 실시태양에 따른 사료 첨가제를 분배하기 위한 시스템의 비 제한적인 다이어그램을 도시한다.
도 4는 본 발명의 한 실시태양에 따른, 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S2, S3 및 S4의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 5는 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S5, S6 및 S7의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 6은 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S0, S8 및 S9의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 7은 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S10, S11 및 S12의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 8은 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S13, S14 및 S15의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 9는 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S16, S17 및 S18의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 10은 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1 및 S19의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 11a, 11b 및 11c는 도 4 내지 도 10에 나타낸 미가공 데이터를 도시한다.
도 12는 24주 기간에 걸친 건조 입자 비드에서의 CFU 안정성의 비 제한적인 그래픽 표현을 도시한다. 흑백 채움 원은 동일한 제조 공정을 사용하는 두 가지 상이한 배치 생산의 결과이다.
도 13은 본 발명의 한 실시태양에 따른 사료 첨가제(IP)를 포함하는 동물 사료 및 사료 첨가제 없는 동물 사료("CP)"로 급식된 돼지의 7일 후 평균 체중 증가(Kg)를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다. 막대 오류는 표준 오류를 나타낸다(p = 0.044).
도 14는 도 13의 돼지의 7일 동안의 평균 일일 체중 증가(g/일)를 나타내는 비 제한적 막대 그래프를 도시한다. 막대 오차는 표준 오차를 나타낸다(p = 0.044).
도 15는 본 발명의 한 실시태양에 따른 사료 첨가제 입자의 단면을 도시한다.
도 16은 입자가 공극을 갖는 도 15의 사료 첨가제 입자의 변형예의 횡단면을 도시한다.
도 17은 표 29 및 표 30에 나타낸 미가공 데이터를 포함하는 후속 도면을 읽는 방법을 도시한다. 후속 도면은 17a 내지 17p이다.
도면에서, 실시태양은 예시적으로 도시된다. 설명 및 도면은 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것이며 이해를 돕기 위한 것이다. 청구항의 범위는 본 발명에 기술된 실시태양에 의해 제한되어서는 안 되며, 전체로서 설명과 일치하는 가장 넓은 해석으로 주어져야 한다.
도 1은 본 발명의 한 실시태양에 따른 박테리아 배양액을 제조하기 위한 비 제한적인 흐름도를 도시한다.
도 2는 본 발명의 한 실시태양에 따른 삽입된 대장균을 갖는 비드를 건조하기 위한 비 제한적인 흐름도를 도시한다.
도 3은 본 발명의 한 실시태양에 따른 사료 첨가제를 분배하기 위한 시스템의 비 제한적인 다이어그램을 도시한다.
도 4는 본 발명의 한 실시태양에 따른, 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S2, S3 및 S4의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 5는 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S5, S6 및 S7의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 6은 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S0, S8 및 S9의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 7은 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S10, S11 및 S12의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 8은 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S13, S14 및 S15의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 9는 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1, S16, S17 및 S18의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 10은 본 발명의 한 실시태양에 따른 공기 건조 후의 박테리아 생존력에 대한 보존 용액 S1 및 S19의 효과를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다.
도 11a, 11b 및 11c는 도 4 내지 도 10에 나타낸 미가공 데이터를 도시한다.
도 12는 24주 기간에 걸친 건조 입자 비드에서의 CFU 안정성의 비 제한적인 그래픽 표현을 도시한다. 흑백 채움 원은 동일한 제조 공정을 사용하는 두 가지 상이한 배치 생산의 결과이다.
도 13은 본 발명의 한 실시태양에 따른 사료 첨가제(IP)를 포함하는 동물 사료 및 사료 첨가제 없는 동물 사료("CP)"로 급식된 돼지의 7일 후 평균 체중 증가(Kg)를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다. 막대 오류는 표준 오류를 나타낸다(p = 0.044).
도 14는 도 13의 돼지의 7일 동안의 평균 일일 체중 증가(g/일)를 나타내는 비 제한적 막대 그래프를 도시한다. 막대 오차는 표준 오차를 나타낸다(p = 0.044).
도 15는 본 발명의 한 실시태양에 따른 사료 첨가제 입자의 단면을 도시한다.
도 16은 입자가 공극을 갖는 도 15의 사료 첨가제 입자의 변형예의 횡단면을 도시한다.
도 17은 표 29 및 표 30에 나타낸 미가공 데이터를 포함하는 후속 도면을 읽는 방법을 도시한다. 후속 도면은 17a 내지 17p이다.
도면에서, 실시태양은 예시적으로 도시된다. 설명 및 도면은 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것이며 이해를 돕기 위한 것이다. 청구항의 범위는 본 발명에 기술된 실시태양에 의해 제한되어서는 안 되며, 전체로서 설명과 일치하는 가장 넓은 해석으로 주어져야 한다.
본 발명은 대체로 동물 사료를 섭취한 동물에게 유익한 효과를 제공하기에 충분한 양의 대장균 박테리아를 포함하는 동물 사료 펠릿에 관한 것이다.
한 실제 구현예에서, 동물 사료는 살아있는 대장균 박테리아를 포함하는 동물 사료 펠릿이다. 본 발명에서, 살아있는 이라는 용어는 동물 사료 내의 박테리아가 비활성(휴면) 상태에 있는 것으로 생각될 수 있으나, 이들 박테리아는 박테리아를 특정 조건, 예를 들어, 충분한 온도, 수분 및/또는 산소에 노출시 활성 상태로 복원될 수 있다는 개념을 의미한다.
유리하게는, 동물 사료 펠릿의 투여는 동물 생산자에 의한 최소의 취급을 필요로 할 수 있고 및/또는 투여 준비는 필요하지 않을 수 있다. 또한, 다른 수단(예를 들어, 식수)을 통한 장기간 투여는 본 발명에 기술된 사료와 비교하여 상기 균주의 생존에 상당한 영향을 미칠 수 있다.
대장균(E. coli)은 포자 형성이 없는 박테리아이고, 포자 형성 박테리아보다 가혹한 환경에 잘 견디지 못한다. 또한, 압력, 온도 및 수분 조건과 관련하여 사료를 펠릿화하는 현재 산업 관행은 오염 위험을 줄이기 위해 대장균 및 살모넬라균과 같은 병원균을 최소 수준으로 제어하는 것을 목표로 한다. 현재의 출원은 놀랍게도 대용량의 대장균을 포함하며, 그럼에도 불구하고, 동물 소비에 적절한 동물 사료 펠릿에 관한 것이다. 즉, 본 발명에 기술된 동물 사료 펠릿은 사료를 섭취하는 동물에게 바람직한 이익을 제공하기에 충분한 양의 비 병원성 대장균을 포함하지만, 동물 사료는 여전히 제어된(최소) 수준의 병원성 대장균을 가진 상태에서 소비하기에 적절하다.
본 발명은 적어도 본 발명의 펠릿화 사료를 제조할 때 이전에 논의된 병원체-제어 조건이 여전히 충족되면서, 비 병원성 대장균의 생존력이 펠릿화 단계를 진행하기 전에 원하는 대장균 균주를 적합한 사료 첨가제에 삽입함으로써 충분히 유지된다는 점에서 놀랍다.
본 발명자는 놀랍고 예상치 못하게 본 발명에 기술된 사료 첨가제에 삽입된 생존 가능한 비 병원성 대장균을 포함하는 동물 사료 펠렛이, 상업적 사용을 위해, 25℃에서 26주의 연장된 소정의 기간 동안 충분한 박테리아 CFU의 생존력 및 기능을 보존할 수 있었다 것을 관찰하였다.
사료 첨가제에 대장균 삽입
프로바이오틱스임에도 불구하고 사료 첨가제에 박테리아를 혼입시키는 실제 구현예가 당업계에 제안되어 있다.
예를 들어, WO 2011/094469는 알긴산 나트륨/올리고당의 1:1-10의 중량비로 알긴산 나트륨, 올리고당(이눌린, 말토덱스트린, 덱스트란 등), 이당류 및 가수분해 단백질의 혼합물을 포함하는 조성물을 기술한다. WO 2013/142792는 올리고당, 이당류 및 다당류, 및 가수분해 동물 또는 식물 단백질을 포함하는 단백질 성분을 포함하는 조성물을 기술한다. 이런 문서의 각각은 건조 형태로 사료 첨가제에 캡슐화된 프로바이오틱을 얻기 위한 동일한 절차를 기술한다:
● 제 1 단계에서, 조성물과 프로바이오틱(프로바이오틱은 동결 액체 배양액 또는 상업용 분말 형태의 프로바이오틱 박테리아이다)의 혼합물을 함유하는 동결 된 비드를 형성한다. 동결 비드는 혼합물의 방울을 액체 질소에 담그고 -80℃에서 생성된 비드를 저장하여 얻는다.
● 제 2 단계에서, 동결 비드는 비드가 0.3 미만의 수분 활성에 도달할 때까지 진공하에서 건조된다.
따라서, 이 문헌에 기술된 캡슐화 절차는 액체 질소에서의 가혹한 냉동과 후속 건조 조건을 결합한다. 이런 가혹한 조건은 이 문헌에서 건조 안정화 조성물인 것으로 교시된 조성물의 존재에도 불구하고 0.73-0.90의 얻은 CFU log 손실로 반영되는 박테리아의 생존력에 타격을 준다(예를 들어, WO 2011/094469의 도 7 및 WO 2013/142792의 도 14 참조). 따라서 이 문헌에 기술된 공정 및 조성물은 출발 물질로서 액체 박테리아 배양을 사용하는 경우 산업 환경에 맞게 최적화되지 않아, CFU 로그 손실은 인해 이상적인 경제성을 나타낼 수 없다.
프로바이오틱스에도 불구하고 박테리아를 위한 다른 실용적인 보존 및 저장 조건은 이전에 제안되었다.
동결 건조(freeze-drying)(또한 동결건조(lyophilisation)로 불림)는 건조 동안 낮은 온도 노출 때문에 박테리아의 보존 및 저장에 종종 사용된다(Rhodes, Exploitation of microorganisms ed. Jones, DG, 1993, p.411-439, London: Chapman & Hall). 그러나 이것은 시간과 에너지 집중적인 것뿐만 아니라 생존력을 현저하게 감소시키는 바람직하지 않은 특성을 가지고 있다. 보호제가 제안되었지만, 동결 건조 동안 소정의 첨가제에 의해 제공되는 보호는 미생물의 종류에 따라 변한다(Font de Valdez et al., Cryobiology, 1983, 20 : 560-566).
또한, 건조와 같은 공기 건조는 박테리아의 보존 및 저장을 위해 사용되어 왔다. 진공 건조는 동결 건조와 비슷한 과정이지만, 0°-40℃에서 30분 내지 몇 시간 동안 진행된다. 이 공정의 장점은 제품이 동결되지 않아 에너지 소비 및 관련 경제적 영향이 감소된다는 것이다. 제품의 관점에서, 동결 손상은 피할 수 있다. 그러나, 저온 또는 주변 온도에서의 건조는 느리고, 오염을 피하기 위해 추가 예방 조치가 필요하며, 종종 불만족스런 생존력을 가져온다(Lievense et al., Adv Biochem Eng Biotechnol., 1994, 51 : 71-89).
알긴산 칼슘(Ca-alginate) 비드와 같은 하이드로콜로이드 형성 다당류 매트릭스에서 박테리아를 캡슐화하는 것은 광범위하고 증가하는 범위의 다양한 응용분야에서 박테리아의 보존 및 저장에도 사용되어 왔다(Islam et al., J. Microbiol. Biotechnol., 2010, 20: 1367-1377). 박테리아를 대사적 및 생리학적으로 유능한 상태로 유지하여 원하는 이익을 얻기 위해, 이런 매트릭스에 적합한 방부제를 첨가하는 것이 제안되어 왔다. 방부제 제제는 전형적으로 적합한 담체에 활성 성분 및 저장, 수송 및 표적 영역에서 미생물 세포의 안정화 및 보호를 돕는 첨가제를 함유한다.
그러나, 새로운 제제의 개발은 어려운 과제이며 모든 제제가 주어진 박테리아에 효과적이지는 않다(Youg et al., Biotechnol Bioeng., 2006 Sep 5; 95(1):76-83). 또한, 제품의 적절한 저장 수명을 보장하기 위해, 제조, 저장 및/또는 운송 중에 습기에 대한 박테리아의 노출을 신중하게 최소화해야 한다는 점에서 캡슐화 된 박테리아에 대한 특정 문제가 야기된다.
본 발명에 기술된 물질의 조성물 및 이를 제조하는 방법은 (1) 사료 첨가제를 제조할 때 수행되는 건조 조건 및 (2) 동물 사료를 펠릿화할 때 사용되는 가혹한 온도, 습기 및 압력 조건으로부터 생존 가능한 대장균 박테리아(특히, 액체 배양액로부터 제조될 때)를 보호하는 것을 돕는 사료 첨가제를 제공한다. 실제로, 본 발명에서 얻어진 결과는 건조 단계에 후속하여 예기치 않게 놀랄만한 CFU 평균 로그 손실이 종종 0.30에 가깝다는 것을 보여준다. 예를 들어, 0.70 미만, 0.60 미만, 0.50 미만, 0.40 미만, 0.30 미만, 0.25 미만, 0.20 미만 또는 0.15 미만, 또는 0.10 미만이다.
예를 들어, 생존 가능한 대장균은, 이 내용에서 나중에 기술되는 바와 같이, 사료 첨가제에 삽입되는 절차 동안 현저한 CFU 손실 없이 적어도 0.4, 또는 적어도 0.5, 또는 적어도 0.6, 또는 적어도 0.7의 입자의 aw 배수 감소를 유지할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 기술된 사료 첨가제를 제조하는 방법은 이전에 공지된 절차의 단점 중 적어도 일부 없이 산업 환경에서 구현될 수 있다. 예를 들어, 이것은 산업 환경에서 대규모 생산 배치는, 통상적으로 박테리아를 장시간, 예를 들어, 수 시간 내지 수 일 동안 고온 및/또는 수분에 노출시키는 다소 연속적인 방식으로 생산되는 경우이다. 본 발명에 기술된 절차는 대장균이 장기간 생존을 위한 이상적인 온도/습도 상태에 있지 않는 장기간에도 불구하고, 제안된 바람직한 결과에 대해 충분한 생존(즉, 충분한 CFU)을 가능하게 하도록 이런 조건으로부터 비 병원성 대장균을 충분히 보호한다.
실제 구현예에서, 동물 사료 펠릿을 제조하는 방법은 사료 펠렛을 제조하기 위한 성분 및 생존 가능한 비 병원성 대장균을 포함하는 사료 첨가제를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 동물 사료 펠릿을 얻기 위해 성분 및 펠렛 첨가제를 펠릿화하는 단계를 추가로 포함한다. 펠릿화 절차는 당업계에 공지되어 있으므로 여기에서 추가로 논의되지 않을 것이다.
한 실시태양에서, 상기 방법은 입자 형태의 사료 첨가제를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 유리하게는, 입자는 평균 입자 크기의 이종 집단을 가질 수 있다. 예를 들어, 입자는 제 1 평균 직경 크기를 갖는 입자의 제 1 집단 및 제 2 평균 직경 크기를 갖는 입자의 제 2 집단을 포함할 수 있다. 체질 또는 여과와 같은, 소정의 평균 직경 크기를 갖는 입자를 얻기 위한 절차는 당업계에 공지되어 있으며 여기에서 추가로 논의되지 않을 것이다. 특정 실시태양에서, 사료 첨가제는 >1인 제 1 집단 내지 제 2 집단의 비율을 얻기 위해 선택되는 제 1 집단의 양 및 제 2 집단의 양을 포함할 수 있다. 하나의 비 제한적인 실시태양에서, 입자 평균 크기는 적어도 250마이크론, 또는 적어도 500마이크론, 또는 적어도 1mm이다.
비 제한적인 실시태양에서, 사료 첨가제는 원하는 모양 및 크기로 절단되거나, 자유 유동 분말로 압착되고 연마될 수 있다. 사료 첨가제는 습식 또는 건식 응집, 과립화, 타정, 압축, 펠릿화 또는 당업자가 용이하게 이용할 수 있는 임의의 다른 종류의 전달 공정을 사용하여 추가로 가공될 수 있다. 압착, 연마, 제분 또는 분쇄를 위한 공정은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 해머 연마, 에어 연마, 충격 연마, 제트 연마, 핀 연마, 윌리 연마 또는 유사한 연마 장치가 사용될 수 있다.
사료 첨가제 특성
도 15는 본 발명의 한 실시태양에 따른 사료 첨가제 입자(1600)의 단면도를 도시한다.
도 15에 도시된 특정 실시태양에서, 입자(1600)는 내부에 삽입된 대장균 (1520)을 갖는 매트릭스(1510)를 포함한다. 매트릭스(1510)는 입자(1600)의 표면의 적어도 일부분을 덮는 코팅(1550)을 포함할 수 있다. 코팅(1550)은 코팅 도포 공정의 일부에서 내재할 수 있는 두께의 변화를 갖는 것으로 도시되어 있다.
도 16을 참조하면, 매트릭스(1510)는 공극을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 입자는 매트릭스를 제조하는데 사용되는 재료에 내재할 수있는 공극을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 입자는 입자를 제조할 때 혼합물에 공기/기체를 주입함으로써 제조된 공극을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 입자는 두 개념의 조합으로 인해 공극을 포함할 수 있다. 유리하게는, 공극의 존재는 간극 영역(1530)의 존재로 인해 매트릭스를 제조하기 위한 재료를 덜 필요하고 및/또는 입자 내로의 성분 침투를 증가시킬 수 있다. 도 16에 도시된 바와 같이, 코팅(1550)은 공극을 한정하는 입자 표면의 적어도 일부를 덮을 수 있다.
일부 특정 실시태양의 경우, 코팅(1550)은 사료 첨가제 입자(1600)의 전체 표면을 다소 덮을 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 기술된 바와 같이, 생존 가능한 대장균을 매트릭스에 삽입하는 것은 동물 사료 또는 사료 첨가제 제조 과정 동안 주위 습기, 산소 및/또는 온도에 대한 박테리아의 노출을 최소화할 수 있다. 예를 들어, 압출기를 사용하여 동물 사료 펠릿을 제조할 때, 압출 동안 동물 사료 성분을 상대적으로 높은 압력, 온도 및 습도 조건에 노출시키므로 박테리아가 일부 방식으로 보호되지 않을 때 CFU가 손실을 유도한다. 전형적인 프로바이오틱스를 사용하는 경우와 같이 박테리아가 포자 형성 박테리아일 때 추가 보호가 반드시 필요한 것은 아니다. 그러나,이 경우에, 대장균은 일반적으로 이런 가혹한 압출 조건에 민감하고, 따라서, 본 발명에 기술된 매트릭스에 박테리아를 삽입하는 것은 이런 가혹한 압출 조건에 노출됨으로써 야기되는 손상을 최소화하여 CFU 손실을 최소화하는데 도움을 줄 수 있다.
부가적으로 또는 선택적으로, 본 발명에 기술된 매트릭스에 박테리아를 삽입하는 것은 저장/취급 동안 박테리아 안정성을 도울 수 있다. 사실, 저장/취급 동안 주변 습기, 산소 및/또는 온도에 박테리아가 노출되면 박테리아가 비활성 상태(휴면 상태)에서 활성 상태로 전환될 수 있다. 이 노출이 제어되지 않는 한, 이런 전환은 박테리아의 결정 불가능하고 제어되지 않은 성장을 초래할 수 있고, 이는 박테리아를 포함하는 사료 동물을 섭취하는 동물에 전달되는 유효 투여량에 영향을 미치고 예상 결과의 일관성에 영향을 미칠 것이다.
부가적으로 또는 선택적으로, 본 발명에 기술된 매트릭스에 박테리아를 삽입하는 것은 동물에 의한 섭취 후 동물 사료로부터 박테리아의 제어된 방출을 가능하게 할 수 있어서, 시간-방출 또는 위치-방출 박테리아 전달 시스템을 가능하게 할 수 있다.
예를 들어, 매트릭스가 장 또는 위액에 의해 대부분 소화되지 않는 물질을 포함할 때, 박테리아는 매트릭스에 의해 차폐되는 동안 위 파괴로부터 보호된다. 비 제한적인 실시태양에서, 매트릭스는 적합한 환경, 예를 들어 장내에 도달시 박테리아를 방출시키기에 적합할 수 있다. 이러한 실시태양에서, 매트릭스는 장내 또는 위액에 의해 대부분 소화되지 않는 고 아밀로오스 전분 및/또는 펙틴과 같은 화합물을 포함할 수있는 반면, 전달된 살아있는 박테리아가 손상되지 않은 형태로 방출될 때 장내 미생물에 의해 쉽게 소화될 수 있다. 따라서, 매트릭스 성분의 적합한 농도를 선택하는 것은 동물에 의한 섭취 후 동물 사료로부터 박테리아의 제어된 방출을 가능하게 할 수 있다. 즉, 이 실시태양은 박테리아의 시간 방출 또는 위치 방출을 제공할 수 있다.
다른 예에서, 매트릭스는 입자 형태일 수 있으며, 여기서 입자의 크기는 동물에 의한 섭취 후 동물 사료로부터 박테리아의 제어된 시간 방출 또는 위치 방출을 가능하게 할 수 있다. 다시 말해, 더 큰 크기의 입자는 더 작은 크기의 입자에 비해 주어진 위액 및/또는 장 환경에서 더 긴 시간 후에 완전히 분해될 수 있다. 따라서, 매트릭스의 입자 크기는 동물 사료로부터 박테리아의 제어된 시간 방출 또는 위치 방출이 가능하도록 선택/맞춤화될 수 있다. 비 제한적인 실시태양에서, 입자는 그것이 포함되는 사료 펠릿보다 작은 평균 직경 크기, 예를 들어, 2mm 미만, 또는 1mm 미만 등을 가질 수 있다. 다른 실시태양에서, 매트릭스는 제 1 입자 평균 크기를 갖는 입자의 제 1 집단 및 제 2 입자 평균 크기를 갖는 입자의 제 2 집단을 적어도 포함하는 입자의 형태일 수 있으며, 여기서 제 1 및 제 2 입자 평균 크기 사이의 크기 비율은 1보다 크다. 한 비 제한적인 실시태양에서, 제 1 입자 평균 크기는 적어도 250마이크론, 또는 적어도 500마이크론, 또는 적어도 1mm이다.
바람직하게는, 본 발명에 기술된 동물 사료 펠릿은 이종 사료 첨가제 입자 평균 직경 크기를 포함할 수 있어서, 사료 첨가제는 제어되고 사전 결정된 방식으로 박테리아를 방출할 수 있다. 예를 들어, 펠렛은 이종 직경 사료 첨가제 입자 크기를 포함할 수 있어서 각각의 사료 첨가제 입자는 입자의 실제 평균 직경 크기에 의존하는 소정의 시간 및/또는 소정의 소장 위치에서 효과적으로 소화된다. 예를 들어, 펠릿화 동물 사료는 입자가 동물 사료 펠릿보다 작은 한, 0.1mm, 0.5mm, 1mm, 2mm 등과 같은 다양한 크기의 사료 첨가제 입자를 포함할 수 있다. 당업자는 적합한 사료 첨가제 입자 크기의 임의의 조합이 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
부가적으로 또는 선택적으로, 동물 사료에 이종 직경 사료 첨가제 입자 크기를 포함할 수 있는 입자의 형태의 사료 첨가제를 혼입시키는 것은 장에 도달하는 박테리아의 양을 조절하여 동물에서 박테리아의 방출을 제어할 수 있게 한다. 본 발명에 기술된 사료 첨가제를 포함하는 펠릿화 사료의 섭취시, 펠릿화 사료는 펠렛이 적어도 부분적으로 분해되는 위를 통과하여 사료 첨가제를 적어도 부분적으로 방출할 수 있다. 사료 첨가제는 유익하게는 위산의 pH로부터 박테리아를 보호하는 성분을 포함할 수 있다. 이것은 사료 첨가제 중의 박테리아에 민감하지 않게 될 수있는 동물에서 특히 유리할 수 있는데, 박테리아의 "맥박 형" 전달(즉, 박테리아 전체가 짧은 기간 동안 방출된다)을 제한하는 것이 바람직할 수 있다.
실제 구현예에서, 본 발명에 기술된 사료 첨가제는 소정의 동물 사료에 혼입되는 박테리아의 양을 맞춤화하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 소정의 제어된 농도의 생존 가능한 비 병원성 박테리아를 갖는 사료 첨가제는 특정 동물에 대한 동물 사료 펠릿의 제조에 사용될 수 있다. 예를 들어, 가금류를 대상으로하는 동물 사료 펠릿은 돼지 또는 소를 대상으로 한 필적할만한 동물 사료 펠릿과 같은 유익한 효과를 얻기 위해 동일한 양의 생존 가능한 비 병원성 박테리아를 반드시 필요로 하지는 않을 것이다. 가금류 사료와 반대로 돼지 사료를 만들 때 상이한 비율의 사료 첨가제를 사용하는 대신, 원한다면, 당업자는 비슷한 비율을 사용할 수 있지만 사료 첨가제는 특정 농도의 돼지용 비 병원성 박테리아를 포함한다.
즉, 사료 첨가제는 의도한 동물 규격에 따라 제조될 수 있으며, 즉 "돼지 등급", "소 등급", "가금류 등급" 등에 따라 의도된 동물에 적합한 소정의 CFU/g 양을 포함한다.
선택적으로, 동일한 "등급"은 동물 사료 펠릿을 제조하기 위한 출발 물질로 사용할 수 있지만, 대신 동물 사료 맞춤화는 가축 사료와 반대로 돼지 사료를 사용할 때 사료 첨가제의 상이한 비율을 사용하여 사료 펠릿 제조 수준에서 이루어질 수 있다.
부가적으로 또는 선택적으로, 비 병원성 박테리아의 소정의 제어된 농도를 갖는 사료 첨가제는 특정 동물의 성장 곡선의 특정 단계를 위한 동물 사료 펠릿의 제조에 사용될 수 있다. 예를 들어, 돼지를 위한 동물 사료 펠릿은 이후의 복수의 비육 단계와 비교하여 이유 후의 단계에서 상이한 제어된 양의 살아있는 박테리아를 가질 수 있다.
예를 들어, 비 제한적인 구현예에서, 동물 사료 펠릿은 적어도 104, 또는 적어도 105, 또는 적어도 106, 또는 적어도 107, 또는 적어도 108, 또는 적어도 109, 또는 적어도 1011의 생존 가능한 박테리아의 CFU/g의 수를 포함할 수 있다. 이런 상이한 수의 CFU/g은, 예를 들어, 제어된 양의 생존 가능한 박테리아를 포함하는 증가하는 양의 사료 첨가제를 혼입시킴으로써 또는 동물 사료 펠릿의 제조 동안 상이한 등급의 사료 첨가제를 혼입시킴으로써 얻을 수 있다. 당업자는 이런 맥락에서, 사료 첨가제의 등급이 상이한 제어된 양의 살아 있는 박테리아를 갖는 사료 첨가제에 해당할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 소정의 동물 사료에서의 박테리아 양의 이런 맞춤화는 사슬 공급을 따르는 임의의 위치, 예를 들어 입자 비드 생산 위치, 동물 사료 생산 위치, 최종 사용자 위치 등에서 이루어질 수 있다.
따라서, 독자는 동물 사료 펠릿에서 전술한 CFU/g을 달성하기 위해 사료 첨가제가 적절한 양(CFU/g)의 대장균 균주를 포함한다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 사료 첨가제는 적어도 1 x 106 CFU/g, 또는 적어도 1 x 107, 또는 적어도 1 x 108, 또는 적어도 1 x 109, 또는 적어도 1 x 1010, 또는 적어도 1 x 1011 등을 포함할 수 있다.
소정의 동물 사료에서의 박테리아 양의 본 발명에 기술된 맞춤화는 육류 생산을 위해 사육된 동물, 예를 들어 돼지 산업에서 유용할 수 있으며, 농장은 전형적으로 상이한 사료 단계(예를 들어, 2 내지 4 단계)를 갖는 사료 프로그램을 사용하여 동물에게 사료를 공급하며, 여기서 제 1 사료(즉, 제 1 이유 사료)는 약 1주 내지 2주의 기간 동안 제공될 수 있다. 이런 경우에, 소정의 동물 사료에서 박테리아 양의 이런 맞춤화를 하는 것은 상이한 사료 단계에 대한 동물 사료에서 상이한 수준의 박테리아를 얻기 위해 유용할 수 있다. 예를 들어, 사료 첨가제에 포함된 대장균이 돼지에 대한 특정 장 스트레스를 다루는 경우, 제 1 이유 및 제 1 비육 사료 단계에서 특정 수준의 박테리아를 포함하도록 사료를 맞춤화하는 것이 산업적으로 유용할 수 있는데 이는 이 두 단계는 돼지에 대한 장 스트레스의 두 가지 창을 나타내기 때문이다.
대장균 박테리아
비 제한적인 실시태양에서, 본 발명에 기술된 비 병원성 대장균은 임의의 재조합 또는 야생 대장균 균주 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 대장균 균주는 미국 특허 제7,981,411호(본 발명에 전문이 참조로 포함)에 기재된 수탁 번호 IDAC 210105-01하에 2005년 1월21일에 캐나다의 국제 기탁 기관(IDAC)에 기탁된 균주 또는 2013년 6월20일에 캐나다의 국제 기탁 기관(IDAC)에 기탁되고 미국 특허 제9,453,195호에 수탁 번호 200613-01(본 발명에 전문이 참조로 포함)를 부여받은 균주 또는 이들의 조합이다.
IDAC는 1996년 9월21일에 특허 절차를 위한 미생물 기탁에 관한 국제 인정에 관한 부다페스트 조약(부다페스트 조약)에 대한 캐나다의 가입에 의해 가능해진 미생물에 대한 특허 기탁 기관이다. 부다페스트 조약과의 일치를 보장하기 위한 캐나다 특허법 및 특허 규칙의 개정이 1996년 10월1일에 발효되었다. IDAC의 실제 주소는 캐나다의 위니펙 1015 아링톤 스트릿, R3E 3R2이다.
당업자는 대장균이, 매트릭스에 삽입되기 전에, 건조되고, 신선한 또는 냉동 된 형태일 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 이런 형태는 배양 형태(즉, 배양 배지의 존재하에서의 균주)로부터 직접 얻어질 수 있거나 또는 배양 배지로부터 하나 이상의 요소를 제거 또는 예를 들어, 동결 보존 또는 임의의 다른 후속 처리 단계에 적합한 다른 하나 이상의 요소로 대체하는 것과 같은 하나 이상의 처리 단계 후에 얻을 수 있다.
동결 보존에 적합한 하나 이상의 요소의 예는 다음의 특징의 적어도 하나를 충족시킬 수 있다: 수용성이 높고, 세포 내부로 침투하며, 독성이 낮고, 비 반응성이며, 고농도에서 침전되지 않는다. 예를 들어, 동결 보존에 적합한 하나 이상의 요소는 예를 들어 글리세롤, 수크로오스, 트레할로오스, 소 혈청 알부민(BSA)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
매트릭스
상기 매트릭스는 하이드로콜로이드 형성 다당류를 포함한다. 몇몇 하이드로 콜로이드-형성 다당류는 본 발명에 기술된 바와 같이 단독으로 또는 이들의 임의의 조합으로 사용하기에 적합하다.
고 아밀로오스 전분은 전분 과립을 끓는 물에서 수화시키고, 고 전단 혼합기를 사용하여 과립을 분산시킨 후 용액을 약 0-10℃로 냉각시킨 후 견고한 겔을 형성할 수 있는 적합한 하이드로콜로이드 형성 다당류의 예이다. 겔의 견고함과 강도는 용액 중 전분 농도에 따라 달라지며, 최대 10% w/v의 최대 작업 농도를 가진다.
펙틴은 고 아밀로오스 전분과 매우 유사하게 실행하는 우수한 하이드로콜로이드 형성 다당류의 또 다른 예이다. 펙틴은 당 폴리머의 카복실기 사이에 다리를 형성하는 Ca2+와 같은 2가 양이온의 첨가에 의해 펙틴 겔 매트릭스의 강도가 추가로 증가될 수 있기 때문에 추가적인 장점이 있다.
알긴산 염은 2가 양이온으로 가교 결합하여 단단한 겔 매트릭스를 형성 할 수있는 적합한 하이드로 콜로이드 형성 다당류의 다른 적합한 예이다. 알긴산 염은 알긴산 염 제 1 다당류를 2가 양이온, 예를 들어, Ca2+와 내부적으로 가교 결합시키고, 예를 들어, 얇은 실, 끈 또는 실질적으로 구형의 구슬의 형태로 알긴산 염을 Ca2+ 바스에 압출시킴으로써 단단한 젤 매트릭스로 경화시킬 수 있다. 알긴산 염은 Ca2+와 상호 작용시 경화된다. 당업계에 공지된 매트릭스의 다른 제조 방법은 Ca2+를 함유하는 바스 내로 혼합물의 분무 원자화, 에멀젼-기반 기술뿐만 아니라 유동층 응집 및 코팅을 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 하이드로콜로이드 형성 다당류는 0.1% 내지 20%의 값으로 총 건조 물질의 중량%로 매트릭스에 존재한다. 비 제한적인 실시태양에서, 하이드로콜로이드 형성 다당류는 이 안의 임의의 값을 포함하는 0.1중량% 내지 19중량%, 또는 0.1중량% 내지 18중량%, 0.1중량% 내지 17중량%, 또는 0.1중량% 내지 16중량%, 또는 0.1중량% 내지 15중량%, 또는 0.1중량% 내지 14중량%, 또는 0.1중량% 내지 13중량%, 또는 0.1중량% 내지 12중량%의 값으로 총 건조 중량의 중량%로 매트릭스에 존재한다.
한 실시태양에서, 다당류는 제 1 다당류이고, 매트릭스는 제 1 다당류와 상이한 제 2 다당류를 추가로 포함한다. 선택적으로, 매트릭스는 이당류를 포함할 수있다.
선택적으로 또는 부가적으로, 매트릭스는 매트릭스의 표면의 적어도 일부에 배치된 코팅을 포함할 수 있다. 코팅은 제 1 다당류와 상이한 제 2 다당류를 포함할 수 있다. 선택적으로, 코팅은 이당류를 포함할 수 있다.
비 제한적인 실시태양에서, 이당류 및 제 2 다당류는 1:10 내지 10:1의 이당류/제 2 다당류(중량%/중량%) 비율로, 코팅 및/또는 매트릭스에 존재한다. 다른 비 제한적인 실시태양에서, 이 비율은 이 안의 임의의 값을 포함하는 9:1, 9:2, 9:3, 9:4, 9:5, 9:6, 9:7, 9:8, 8:1, 8:2, 8:3, 8:4, 8:5, 8:6, 8:7, 7:1, 7:2, 7:3, 7:4, 7:5, 7:6, 6:1, 6:2, 6:3, 6:4, 6:5, 5:1, 5:2, 5:3, 5:4, 4:1, 4:2, 4:3, 3:1, 3:2, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 2:3, 2:4, 2:5, 2:6, 2:7, 2:8, 2:9, 3:4, 3:5, 3:6, 3:7, 3:8, 3:9, 4:5, 4:6, 4:7, 4:8, 4:9, 5:6, 5:7, 5:8, 5:9, 6:7, 6:8, 6:9, 7:8, 7:9, 또는 8:9이다.
또 다른 비 제한적인 실시태양에서, 이당류/제 2 다당류(중량%/중량%)의 비율은 10 미만, 또는 더욱 바람직하게는 5 미만이다. 비 제한적인 실시태양에서, 이당류/제 2 다당류(중량%/중량%)는 약 1이다.
비 제한적인 실시태양에서, 이당류는 이 안의 임의의 값을 포함하는 0.1% 내지 90%, 또는 0.1% 내지 75%, 또는 0.1% 내지 50%, 또는 0.1% 내지 35%, 또는 0.1% 내지 20%, 또는 0.1% 내지 15%, 또는 0.1% 내지 10%의 값으로 코팅 및/또는 매트릭스(총 건조 물질의 중량%)에 존재한다.
비 제한적인 실시태양에서, 이당류는 수크로오스를 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 이당류는 트레할로오스를 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 이당류는 수크로오스 및 트레할로스를 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 제 2 다당류는 말토덱스트린을 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 제 2 다당류는 덱스트란을 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 제 2 다당류는 말토덱스트린 및 덱스트란을 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 덱스트란은 20 내지 70 kDa의 분자량을 갖는다.
비 제한적인 실시태양에서, 사료 첨가제(즉, 매트릭스 및/또는 코팅)는 아미노산의 염을 추가로 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 아미노산의 염은 L-글루탐산의 염을 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 염은 L-글루탐산의 나트륨 염이다.
본 발명에 기술된 건조 단계를 빠져 나갈 때, 본 발명에 기술된 매트릭스는 aw≤0.3, 예를 들어 0.04 ≤aw≤0.3, 0.04≤aw≤2.5, 0.04≤aw≤2.0, 0.04 ≤aw≤1.5 등인 수분 활성(aw)을 갖는다. 본 발명의 내용에서 "수분 활성" 또는 "aw"은 물의 이용가능성을 의미하며 시스템에서 물의 에너지 상태를 나타낸다. 일반적으로 시료 위의 물의 증기압을 동일한 온도의 순수한 물의 증기압으로 나눈 값으로 정의된다. 수분 활성은, 예를 들어, Aqualab Water Activity Meter 4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A.)를 사용하여 당업계에 공지된 재료 및 절차에 따라 측정될 수 있다. 건조는 분무 건조, 유동층 건조, 동결 건조, 진공 건조 등과 같은 단계를 포함할 수 있다. 건조 단계의 비 제한적인 실제 구현예는 본 명세서의 뒷부분에서 더 기술된다.
동물 사료 펠릿 덮개 층
또 다른 실제 구현예에서, 동물 사료 펠릿은 동물 사료 펠렛 표면의 적어도 일부를 덮는 층을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 층은 코팅된 동물 사료 펠릿을 형성하는 사료 첨가제를 포함한다. 동물 사료 펠릿의 코팅은 분무 건조, 분무 냉각, 분무 원자화, 유동층 응집 및 에멀젼 기반 기술과 같은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 코팅되지 않은 동물 사료 펠릿 상의 코팅의 완전한 분산은 코팅되지 않은 동물 사료 펠릿에 텀블링 작용을 가함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시태양에서, 펠릿에 대장균의 추가 공급원(즉, 외부 층의 제 1 공급원 및 펠렛에 혼입된 제 2 공급원)이 존재하면 대장균의 시간-방출 또는 위치 특이적인 전달을 가능하게 할 수 있다. 실제로, 외부 층은 동물 위장관을 따라 소정의 속도로 또는 소정의 위치에서 용해되는 성분으로 제제화될 수 있으며, 이것은 동물 사료에 혼입된 대장균의 전달 속도와 다를 수 있다.
일부 실시태양에서, 동물 사료 펠릿의 코팅은 수분 및 부패에 대한 보호를 더욱 강화시킬 수 있으며, 동물 사료 펠렛의 유효 기간을 연장시킬 수 있다. 동물 사료 펠렛의 코팅은 오염 물질에 대한 보호를 더욱 향상시킬 수 있다.
다른 실시태양에서, 동물 사료 펠릿의 코팅은 펠릿에 기호성 증진제를 첨가할 필요성을 추가로 감소시키는 동물 사료 펠렛의 기호성을 개선할 수 있다. 동물 사료 펠릿의 코팅은 강한 냄새 및 향을 가려서 동물에 의한 코팅된 동물 사료 펠릿의 섭취를 더욱 향상시킬 수 있다.
포장
하나의 실제 구현예에서, 본 발명은 내용물을 주변 습기에 노출시키는 것을 제어하기에 충분한 수분 제어 장벽을 갖는 포장에 관한 것이다. 즉, 포장은 본 발명의 생존 가능한 비 병원성 박테리아(즉, 사료 첨가제 및/또는 사료 펠릿에 있는)의 주변 습기에 대한 노출을 제어할 수 있다. 수분 제어 장벽을 갖는 유리한 효과는 내용물에 함유된 박테리아가 실질적으로 비 활성 상태로 남아 있어서, 사료 첨가제 및/또는 사료 펠릿의 유효 저장 수명을 실질적으로 증가시킨다는 것이다.
실제 구현예에서, 포장은 적어도 하나의 구획에 사료 펠릿에 혼입된 사료 첨가제 및 적어도 다른 구획에 있는 수분 제어 요소를 저장하도록 구성된 별도의 구획을 더 포함할 수 있다.
비 제한적인 실시태양에서, 포장은 폴리에틸렌, 폴리우레탄 또는 임의의 다른 적합한 사료-양립 가능한 폴리머를 포함하는 내부 라이너를 포함할 수 있다. 라이닝은 단일 층 또는 다층 재료일 수 있다. 임의의 이론에 구속되기를 바라지 않고, 라이닝은 적어도 누출, 수분, 산소, 오염 및 자외선(UV) 조사에 대한 보호를 제공할 수 있고, 사료 첨가제 및/또는 사료 펠릿의 적합한 저장 수명을 보장할 수 있다고 생각된다.
실제 구현예에서, 포장은 임의의 적절한 밀봉 메카니즘을 통해 상단에 밀봉부를 포함할 수 있다. 상단의 밀봉의 개구부는 사료 첨가제 및/또는 사료 펠릿을 분배하기 위한 출구를 제공할 수 있다.
다른 실제 구현에서, 포장은 적어도 하나의 구획에 사료 첨가제를 저장하도록 구성되고 적어도 다른 구획에 펠렛 성분을 공급하도록 구성된 개별 구획을 포함할 수 있다.
비 제한적인 실시태양에서, 사료 첨가제를 저장하기 위한 적어도 하나의 구획 및 사료 펠릿 성분을 저장하기 위한 적어도 하나의 구획은 이들 사이에서 유체 전달을 방지하도록 구성될 수 있는데, 즉 이들이 상호 연결되지 않는다. 상호 연결의 결여는 사료 펠릿 성분과 사료 첨가제의 조기 혼합을 방지할 수 있다.
비 제한적인 실시태양에서, 사료 첨가제를 저장하기 위한 적어도 하나의 구획은 사료 펠릿 성분을 저장하기 위해 적어도 다른 구획의 내용물의 전체에 첨가하기에 적절한 양의 사료 첨가제(즉, 생존 가능한 박테리아의 CFU 수와 동일)를 저장하도록 구성될 수 있다. 이 실시태양에 따라, 사용자가 펠릿화 사료에 첨가하기 위한 사료 첨가제의 양을 계산할 필요가 없기 때문에 사료 첨가제를 갖는 사료 펠릿의 제조가 단순화된다. 전술한 바와 같이, 사료 첨가제 중의 CFU의 양은 상이한 등급에 따라, 즉 특정 동물 응용분야에 따라 맞춤화될 수 있다. 이런 응용분야에서, 사용자는 펠릿화 사료에 첨가하기 위한 사료 첨가제의 양을 계산하는 대신에, 사료 첨가제 중에 적절한 양의 CFU를 이미 갖는 특정 "돼지" 포장을 요청하여 선택하여 "돼지" 사료 펠릿을 얻을 수 있다. 비 제한적인 예로서, 사료 첨가제의 양(λ)을 갖는 포장은 이유 새끼 돼지를 위한 사료 펠릿의 제조에 적합할 수 있지만, 사료 첨가제의 양(β)을 갖는 포장은 비육 단계에 있는 돼지를 위한 사료 펠릿의 제조에 적합할 수 있다.
다른 실시태양에서, 포장은 상이한 사료 첨가제 또는 다양한 양의 사료 첨가제를 저장하도록 구성된 추가 구획을 더 포함할 수 있다.
바람직하게는, 포장은 "사용" 또는 "판매" 날짜에 원하는 최소량의 CFU(즉, 원하는 CFU/g)를 보장하기 위해 "사용" 또는 "판매" 날짜가 표시될 수 있다. 실제로, 당업자는, 예를 들어, 소정의 시간 후에 수분/온도/산소 노출을 고려함으로써, 소정의 시간 후에 잔존하는 유용한 양의 CFU를 추정할 수 있다.
사료 첨가제 분배 시스템
도 3은 본 발명에 기술된 사료 첨가제를 분배하기 위한 시스템(1000)을 예시한다. 시스템(1000)은 적어도 하나의 원격 제어 유닛(1100), 사료 첨가제(1200)를 저장하도록 구성된 호퍼, 스탠드(1300), 밀봉 장치(1400) 및 분배 장치(1500)를 포함하는 몇몇 개별 구성요소를 포함한다.
비 제한적인 실시태양에서, 원격 제어 유닛(1100)은 컴퓨터를 포함하고 데이터 네트워크(도시되지 않음)를 통해 스탠드(1300)에 견고하게 연결될 수 있는 캐비닛(도시되지 않음) 내에 수용될 수 있다. 실제 구현예에서, 데이터 네트워크는 공용 네트워크(예를 들어, 인터넷), 사설 네트워크(예를 들어, LAN 또는 WAN), 유선 네트워크(예를 들어, 이더넷 네트워크), 무선 네트워크(예를 들어, 802.11 네트워크 또는 Wi-Fi 네트워크), 셀룰러 네트워크(예를 들어, Long Term Evolution(LTE) network), 라우터, 허브, 스위치, 서버 컴퓨터 및/또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
호퍼(1200)는 사료 첨가제를 수용할 수 있도록 상단이 개방될 수 있다. 호퍼(1200)는 밀봉 장치(1400)에 하단에서 연결될 수 있다. 밀봉 장치(1400)는 호퍼 (1200)의 내부가 분배 장치(1500)와 연결되지 않는 폐쇄 위치(도 3에 도시된 바와 같이) 및 호퍼(1200)의 내부가 분배 장치(1500)(도시되지 않음)와 연결되는 개방 위치 사이에서 이동가능할 수 있다.
비 제한적인 실시태양에서, 분배 장치(1500)는 정의된 메쉬 크기의 제거 가능한 메쉬를 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 메쉬 크기는 특정 직경의 사료 첨가제의 비드만이 분배 장치를 통해 분배되도록 선택된다. 비 제한적인 예로서, 메쉬 크기는 250㎛ 이하, 500㎛ 이하, 1mm 이하 또는 2mm 이하의 비드만이 분배 장치를 통해 분배될 수 있도록 선택될 수 있다. 원료 사료 첨가제의 비드 직경 분포에 따라, 분배 장치는 동종 또는 이종 직경의 비드를 분배하는데 사용될 수 있다.
다른 실시태양에서, 분배 장치(1500)는 서로 위에 겹쳐진 별개의 메쉬 크기의 복수의 제거 가능한 메쉬를 포함하여 분배 장치가 유익하게는 이종 비드 크기 분포를 갖는 사료 첨가제를 원료로서 사용하여 동종 직경의 사료 첨가제의 비드를 분배하기 위해 사용될 수 있다. 즉, 구별된 비드 직경을 갖는 여러 사료 첨가제가 혼합되어 호퍼(1200)에 적재되어 이종 비드 크기 분포를 갖는 호퍼(1200) 내의 사료 첨가제를 생성할 수 있다. 메쉬 제거의 적절한 순서를 사용하여, 본 발명의 시스템은 인 이종 비드 크기 분포로부터 제 1 비드 직경 및 따라서 양(X)로 생존 가능한 비 병원성 박테리아의 제 1 CFU를 갖는 사료 첨가제의 제 1 부분 및 제 2 비드 직경 및 따라서 양(Y)로 생존 가능한 비 병원성 박테리아의 제 2 CFU를 갖는 사료 첨가제의 제 2 부분을 분배하는데 편리하게 사용될 수 있다. 따라서, 시스템 (1000)은 본문의 다른 곳에서 논의된 상이한 "등급"의 사료 첨가제/사료 펠릿을 얻는데 사용될 수 있다. 간략하게, 소정량의 CFU는 펠릿을 제조하기 위해 분배되는 특정 입자 크기 비율을 선택함으로써 소정의 응용분야(예를 들어, 동물 종 및/또는 성장 단계)에 대해 선택 및 제공될 수 있다(즉, 맞춤화될 수 있다).
비 제한적인 실시태양에서, 호퍼(1200)는 바람직하게는 스테인리스 강으로 제조된다.
비 제한적인 실시태양에서, 호퍼(1200)는 호퍼(1200)의 하단에서 막힘을 방지하기 위한 혼합 수단(도시되지 않음)을 내부에 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, 사료 첨가제는 시스템의 막힘을 방지하기 위해 물과 같은 액체와 함께 분배될 수 있다.
당업자는 다른 디스펜서 시스템이 본 발명을 벗어나지 않고 적용될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
실시예
하기 실시예에서, 세 가지 보존 용액을 보존 용액(S1)과 함께 테스트하였다. 테스트를 3회 수행하였고, 1회 표준 편차를 다음 공식에 따라 계산하였다:
n: 샘플의 수 및 
: 샘플 집단의 평균.
하기 실시예 각각에서, 박테리아 생존력은 당업계에 공지된 프로토콜에 따라 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 측정함으로써 평가하였다.
하기 실시예에서 사용된 보존 용액을 표 1에 나타내었다.
| 보존 용액 | 제 2 다당류 |
이당류 |
L-글루탐산의 염 | 제 2 다당류/이당류/유기산의 염의 비율 |
| S0 | x 1 | x | x | N/A 2 |
| S1 | 덱스트란 40 | 수크로오스 | 예 | 5:7:1 |
| S2 | 덱스트란 40 (5 wt%) | x | x | N/A |
| S3 | x | 수크로오스 (7 wt%) | x | N/A |
| S4 | 덱스트란 40 | 트레할로오스 | 예 | 5:7:1 |
| S5 | 덱스트란 20 | 수크로오스 | 예 | 5:7:1 |
| S6 | 덱스트란 70 | 수크로오스 | 예 | 5:7:1 |
| S7 | 말토덱스트린 | 수크로오스 | 예 | 5:7:1 |
| S8 | 덱스트란 40 | 수크로오스 | 예 | 10:1:1 |
| S9 | 덱스트란 40 | 수크로오스 | 예 | 1:10:1 |
| S10 | 덱스트란 40 | 수크로오스 | 예 | 5:7:1 |
| S11 | x | 수크로오스 | 예 | 7:1 |
| S12 | 덱스트란 70 | 트레할로오스 | 예 | 5:7:1 |
| S13 | 덱스트란 40 | 수크로오스 | x | 5:7 |
| S14 | 덱스트란 40 | 수크로오스 | 예 | 5:3:1 |
| S15 | 덱스트란 40 | 수크로오스 | 예 | 5:5:1 |
| S16 | 말토덱스트린 | 트레할로오스 | 예 | 5:7:1 |
| S17 | 말토덱스트린 | 트레할로오스 | 예 | 10:1:1 |
| S18 | 말토덱스트린 | 트레할로오스 | 예 | 1:10:1 |
| S19 | 덱스트란 40 | 말토오스 | 예 | 5:7:1 |
1 x는 없음을 의미한다
2 N/A는 적용할 수 없음을 의미한다
1. 실시예 1
이 실시예는 본 발명의 실시태양에 따른 사료 첨가제의 제조를 기술한다. 이 실시예에서, 박테리아는 알긴산염-칼슘으로 제조된 매트릭스에 캡슐화된다. 알긴산염-칼슘 매트릭스는 입자 형태이며, 응용분야에 따라 이종 또는 동종 평균 직경 크기를 가질 수 있다. 비드는 출발 물질로서 액체 박테리아 배양액로 제조되기 때문에, 당업자는 본 발명에 기술된 건조된 대장균 비드의 최종 조성물이 박테리아 배양 배지의 구성요소를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
a. 대장균 배양
도 1을 참조하면, 대장균 균주를 비 동물 기원의 트립틱 소이 아가 상에서 제 1 단계(100)에서 배양하였다. 그런 다음 6개의 분리된 콜로니를 제 2 단계(200)에서 37℃에서 2시간 동안 배양하고 비 동물 기원의 30mL의 트립틱 소이 브로스(TSB)(1L의 TSB의 경우: 20g의 소이 펩톤 A3 SC-(Organotechnie), 2.5g의 무수 덱스트로스 USP-(JT Baker), 5g의 염화나트륨 USP-(JT Baker) 및 2.5g의 이염기성 인산 칼륨 USP-(Fisher Chemical)에서 200rpm으로 교반하였다.
생성된 배양액 1을 TSB에서 10배 희석한 후, 제 3 단계(300)에서 37℃에서 2시간 동안 100mL의 비 동물 기원의 TSB에서 200rpm으로 교반하면서 대장균 균주를 배양하는데 사용하였다. 생성된 배양액 2를 TSB에서 10배 희석한 다음, 제 4 단계(400)에서 37℃에서 5시간 동안 1L의 비 동물성 TSB에서 200rpm으로 교반하면서 대장균 균주를 배양하는데 사용하였다. 생성된 배양액(3)을 사용하여 대장균을 매트릭스에 삽입시켰다. 본 발명에 기술된 배양 프로토콜에 대한 변형 및 개선이 가능하고, 본 교시에 비추어 당업자에게 명백해질 것이다. 예를 들어, 비 병원성 대장균은 또한 당업계에 공지된 프로토콜(Son & Taylor, Curr. Protoc. Microbiol., 2012, 27:5A.4.1 - 5A.4.9)에 따라 혐기성 조건에서 배양될 수 있다. 후속 실시예의 비드를 제조함에 있어, 2005년 1월21일에 IDAC 210105-01로 캐나다 국제 기탁 국(IDAC)에 기탁된 비 병원성 대장균 균주를 사용하였다.
b. 매트릭스 제조
BactoTM 펩톤(1.5 g, BD, Mississauga, Canada)을 1.5L의 가열된 물과 혼합하여 혼합물을 수득하였다. 알긴산염(30g Grindsted®, DuPontTM Danisco®, Mississauga, Canada)를 360rpm에서 자석 막대와 혼합하면서 혼합물에 서서히 첨가 하였다. 알긴산염의 완전한 가용화는 2% 알긴산염(m/v) 용액을 얻기 위해 약 3시간 후에 얻었다. 그 다음, 자석 막대를 포함하는 용액을 표준 조건하에서 가압멸균하였다. 본 발명에 기술된 매트릭스 제조 프로토콜에 대한 변형 및 개선이 가능하고 본 교시의 관점에서 당업자에게 명백해질 것이다.
c. 매트릭스에 대장균 삽입
다음을 자석 막대와 혼합하면서 순서대로 가압 멸균된 매트릭스 용액(1.5L)에 첨가하여 슬러리를 수득하였다: 1L의 비 동물성 기원의 TSB 및 도 1을 참조하여, 0.5L의 대장균 배양액 3.
슬러리(3L)를 중합 바스(300 mM CaCl2, 0.1 wt./v. % BactoTM tryptone, 0.1 wt./v. % BactoTM peptone, 및 0.05 wt./v.% g BactoTM yeast extract in water) 속에 압출하여 Thermo ScientificTM Reacti-VapTM 증발기로부터 개작된 9개의 출구 주사기 시스템을 사용하여 비드를 형성한다. 슬러리를 주입하면서 바스를 부드럽게 교반 하였다. 매트릭스 비드를 약 30분 동안 가교 결합시킨 다음, 생성된 경화 비드를 수거하였다. 본 발명에 기술된 삽입 프로토콜에 대한 변형 및 개선이 가능하고 본 발명의 관점에서 당업자에게 명백해질 것이다. 이어서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 수득한 다음, 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 놓았으며, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되어 건조한 비드를 얻었다.
본 발명자는 놀랍게도 예기치 않게 건조 직전 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액에 삽입된 대장균을 건조 단계 동안 박테리아의 손실을 감소시켜 건조된 비드의 형성으로 이끄는 것을 관찰하였다.
d. 삽입된 대장균의 건조 및 테스트
각 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 도 2를 참조하면, 제 1 단계(500)에서 매트릭스에 삽입된 대장균을 갖는 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S2, 보존 용액 S3 또는 보존 용액 S4에 넣었다. 각각의 경우, 총 CFU의 측정(550)은 보존 용액에 담근 후 수행하였다. 제 2 단계(600)에서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 각각의 경우에, 수분 활성(aw)의 측정(650)을 아쿠아 랩(Aqualab) 수분 활성도 측정기 4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A.)를 사용하여 반 건조 비드 상에서 수행하였다. 제 3 단계(700)에서, 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. 본 발명의 한 실시태양에 따르면, 건조 공정(800)은 적어도 두 단계: 실온에서 24시간 동안 건조 드라이기에 비드를 놓고 반 건조 비드를 얻는 단계(600) 및 64시간 동안 건조기에 반 건조 비드를 놓고 건조 비드를 얻는 단계(700)를 포함한다. 각각의 경우에, 총 CFU의 결정(750) 및 물(aw)의 측정(760)을 건조 비드 상에 수행하였다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 aw 배수 감소를 계산하였다:
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 생존력 손실(CFU log 손실)을 계산하였다:
각각의 경우에, 보존 용액 S1을 사용하여 얻은 결과에 대한 평균 생존력 손실 및 정규화된 평균 생존력 손실을 계산하였다.
결과를 도 4에 나타내었다. 보존 용액 S4는 0.142±0.004의 수분 활성을 유지하면서 0.32의 정규화된 평균 생존력 손실을 나타내었다.
실시예 1의 결과를 종합하여 표 2 및 표 3에 설명하였다. 이들 결과는 보존 용액 S1 및 S4의 요소가 건조된 매트릭스에 삽입된 대장균의 생존력 및 건조 공정(700)에 대한 저항성에 상당한 영향을 제공한다는 것을 입증하였다.
| 샘플 | 단계 550 | 단계 750 | ||
| 평균 CFU | 평균 CFU | 평균 CFU 손실(log10) | 정규화된 CFU 손실 (log10) | |
| S1 | 3 x 1011 ± 9 x 1010 | 1.4 x 1011 ± 4.3 x 109 | 0.32±0.14 | 1 |
| S2 | 2.3 x 1011 ± 5.5 x 1010 | 5.4 x 109 ± 2.7 x 109 | 1.66±0.3 | 5.18 |
| S3 | 2.6 x 1011 ± 4.9 x 1010 | 7.4 x 1010 ± 4.3 x 1010 | 0.61±0.32 | 1.90 |
| S4 | 3.1x 1011 ± 7 x 1010 | 2.5 x 1011 ± 9.7 x 1010 | 0.11±0.08 | 0.34 |
| 샘플 | 단계 650 | 단계 760 | |
| 평균 aw | 평균 aw | aw 배수 감소 | |
| S1 | 0.473 ± 0.020 | 0.165 ± 0.010 | 0.65 |
| S2 | 0.278 ± 0.021 | 0.054 ± 0.009 | 0.81 |
| S3 | 0.423 ± 0.022 | 0.150 ± 0.026 | 0.64 |
| S4 | 0.488 ± 0.022 | 0.142 ± 0.004 | 0.71 |
e. 건조된 삽입된 대장균을 동물 사료에 혼입하기("펠릿화")
동물 사료에, 예를 들어 사료 첨가제의 형태로 건조 매트릭스를 혼입시키는 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다. 이런 수행의 예시적 실시예는, 예를 들어, 500g 내지 1000g의 건조 매트릭스 비드를 1톤의 동물 사료에 혼입시킴으로써 수행될 수 있다. 원한다면, 사료는 또한 불활성화된 효모 생성물을 적당한 양으로 포함 할 수 있다. 예를 들어, 삽입된 대장균(즉, 사료 첨가제)을 포함하는 건조된 매트릭스 비드는 균질화 탱크에서 모든 다른 성분의 적어도 일부와 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 혼합물은 펠릿화 공정 동안 연속적으로 혼합된다. 혼합된 물질은 압출기쪽으로 펌핑된다.
증기는 압출기 또는 압출기 내에 위치한 구획 중 어느 하나에 들어가기 직전일 때 혼합된 재료에 도포된다(즉, 증기-컨디셔닝)(즉, 혼합물의 온도는 이 단계에서 증가한다). 온도의 통상적인 값은 약 70 내지 약 90℃의 범위 내에서 변할 수 있다. 적절한 압력이 압출기 내부로 통과하는 동안 혼합물에 가해진다. 통상적인 압력 값은 약 20 psig 내지 약 80 psig의 범위 내에서 변할 수 있다. 그런 다음 성형된 펠릿을 압출기에서 냉각 탱크로 배출한다(급속 온도가 30-40℃로 떨어지면 다시 냉각되어 주변 온도에 도달함). 사료 첨가제(삽입된 대장균을 포함하는 매트릭스)를 포함하는 펠릿 사료는, 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 예를 들어 백/용기에 저장될 수 있다. 본 발명에 기술된 펠릿화 프로토콜에 대한 변형 및 개선이 가능하며 본 발명의 교시에 비추어 당업자에게 명백해질 것이다.
2. 실시예 2
각 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 도 2를 참조하면, 제 1 단계(500)에서 매트릭스에 삽입된 대장균을 갖는 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S5, 보존 용액 S6 또는 보존 용액 S7에 넣었다. 각각의 경우, 총 CFU의 측정(550)은 보존 용액에 담근 후 수행하였다. 제 2 단계(600)에서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 각각의 경우에, 수분 활성(aw)의 측정(650)을 아쿠아 랩(Aqualab) 수분 활성도 측정기 4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A.)를 사용하여 반 건조 비드 상에서 수행하였다. 제 3 단계(700)에서, 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. 본 발명의 한 실시태양에 따르면, 건조 공정(800)은 적어도 두 단계: 실온에서 24시간 동안 건조 드라이기에 비드를 놓고 반 건조 비드를 얻는 단계(600) 및 64시간 동안 건조기에 반 건조 비드를 놓고 건조 비드를 얻는 단계(700)를 포함한다. 각각의 경우에, 총 CFU의 결정(750) 및 물(aw)의 측정(760)을 건조 비드 상에 수행하였다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 aw 배수 감소를 계산하였다:
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 생존력 손실(CFU log 손실)을 계산하였다:
각각의 경우에, 보존 용액 S1을 사용하여 얻은 결과에 대한 평균 생존력 손실 및 정규화된 평균 생존력 손실을 계산하였다.
결과를 도 5에 나타내었다. 보존 용액 S7은 0.298±0.013의 수분 활성을 유지하면서 0.38의 정규화된 평균 생존력 손실을 나타내었다.
실시예 2의 결과를 종합하여 표 4 및 표 5에 설명하였다. 이들 결과는 보존 용액 S7의 요소가 건조된 매트릭스에 삽입된 대장균의 생존력 및 건조 공정(700)에 대한 저항성에 상당한 영향을 제공한다는 것을 입증하였다.
| 샘플 | 단계 550 | 단계 750 | ||
| 평균 CFU | 평균 CFU | 평균 CFU 손실 (log10) | 정규화된 CFU 손실 (log10) | |
| S1 | 3.3 x 1011 ± 9.2 x 1010 | 1.8 x 1011 ± 2.7 x 1010 | 0.26 ± 0.07 | 1 |
| S5 | 3.5 x 1011 ± 7.7 x 1010 | 2.6 x 1011 ± 6 x 1010 | 0.13 ± 0.17 | 0.5 |
| S6 | 3.1 x 1011 ± 5.8 x 1010 | 2.8 x 1011 ± 1.7 x 1011 | 0.10 ± 0.29 | 0.38 |
| S7 | 3.4 x 1011 ± 3.7 x 1010 | 2.7 x 1011 ± 1 x 1010 | 0.10 ± 0.06 | 0.38 |
| 샘플 | 단계 650 | 단계 760 | |
| 평균 aw | 평균 aw | aw 배수 감소 | |
| S1 | 0.535 ± 0.020 | 0.230 ± 0.012 | 0.57 |
| S5 | 0.530 ± 0.049 | 0.249 ± 0.009 | 0.53 |
| S6 | 0.586 ± 0.143 | 0.260 ± 0.013 | 0.56 |
| S7 | 0.541 ± 0.045 | 0.298 ± 0.013 | 0.45 |
3. 실시예 3
각 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 도 2를 참조하면, 제 1 단계(500)에서 매트릭스에 삽입된 대장균을 갖는 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S0, 보존 용액 S8 또는 보존 용액 S9에 넣었다. 각각의 경우, 총 CFU의 측정(550)은 보존 용액에 담근 후 수행하였다. 제 2 단계(600)에서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 각각의 경우에, 수분 활성(aw)의 측정(650)을 아쿠아 랩(Aqualab) 수분 활성도 측정기 4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A.)를 사용하여 반 건조 비드 상에서 수행하였다. 제 3 단계(700)에서, 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. 본 발명의 한 실시태양에 따르면, 건조 공정(800)은 적어도 두 단계: 실온에서 24시간 동안 건조 드라이기에 비드를 놓고 반 건조 비드를 얻는 단계(600) 및 64시간 동안 건조기에 반 건조 비드를 놓고 건조 비드를 얻는 단계(700)를 포함한다. 각각의 경우에, 총 CFU의 결정(750) 및 물(aw)의 측정(760)을 건조 비드 상에 수행하였다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 aw 배수 감소를 계산하였다:
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 생존력 손실(CFU log 손실)을 계산하였다:
각각의 경우에, 보존 용액 S1을 사용하여 얻은 결과에 대한 평균 생존력 손실 및 정규화된 평균 생존력 손실을 계산하였다.
결과를 도 6에 나타내었다.
실시예 3의 결과를 종합하여 표 6 및 표 7에 설명하였다.
| 샘플 | 단계 550 | 단계 750 | ||
| 평균 CFU | 평균 CFU | 평균 CFU 손실 (log10) | 정규화된 CFU 손실 (log10) | |
| S1 | 2.2 x 1011 ± 2.9 x 1010 | 1.7 x 1011 ± 9.3 x 109 | 0.11 ± 0.05 | 1 |
| S0 | 1.9 x 1011 ± 2 x 1010 | 1.5 x 106 ± 1.5 x 106 | 5.28 ± 0.53 | 47.7 |
| S8 | 2.8 x 1011 ± 4.6 x 1010 | 5.9 x 1010 ± 2.3 x 1010 | 0.70 ± 0.15 | 6.28 |
| S9 | 2.4 x 1011 ± 5.4 x 1010 | 1.5 x 1011 ± 1.5 x 1010 | 0.18 ± 0.04 | 1.64 |
| 샘플 | 단계 650 | 단계 760 | |
| 평균 aw | 평균 aw | aw 배수 감소 | |
| S1 | 0.453 ± 0.010 | 0.241 ± 0.005 | 0.47 |
| S0 | 0.331 ± 0.022 | 0.037 ± 0.002 | 0.89 |
| S8 | 0.366 ± 0.010 | 0.062 ± 0.006 | 0.83 |
| S9 | 0.451 ± 0.010 | 0.275 ± 0.032 | 0.39 |
4. 실시예 4
각 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 도 2를 참조하면, 제 1 단계(500)에서 매트릭스에 삽입된 대장균을 갖는 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S10, 보존 용액 S11 또는 보존 용액 S12에 넣었다. 각각의 경우, 총 CFU의 측정(550)은 보존 용액에 담근 후 수행하였다. 제 2 단계(600)에서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 각각의 경우에, 수분 활성(aw)의 측정(650)을 아쿠아 랩(Aqualab) 수분 활성도 측정기 4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A.)를 사용하여 반 건조 비드 상에서 수행하였다. 제 3 단계(700)에서, 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. 본 발명의 한 실시태양에 따르면, 건조 공정(800)은 적어도 두 단계: 실온에서 24시간 동안 건조 드라이기에 비드를 놓고 반 건조 비드를 얻는 단계(600) 및 64시간 동안 건조기에 반 건조 비드를 놓고 건조 비드를 얻는 단계(700)를 포함한다. 각각의 경우에, 총 CFU의 결정(750) 및 물(aw)의 측정(760)을 건조 비드 상에 수행하였다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 aw 배수 감소를 계산하였다:
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 생존력 손실(CFU log 손실)을 계산하였다:
각각의 경우에, 보존 용액 S1을 사용하여 얻은 결과에 대한 평균 생존력 손실 및 정규화된 평균 생존력 손실을 계산하였다.
결과를 도 7에 나타내었다. 보존 용액 S7은 0.58의 정규화된 평균 생존력 손실을 나타내었다.
실시예 4의 결과를 종합하여 표 8 및 표 9에 설명하였다.
| 샘플 | 단계 550 | 단계 750 | ||
| 평균 CFU | 평균 CFU | 평균 CFU 손실 (log10) | 정규화된 CFU 손실 (log10) | |
| S1 | 3.7 x 1011 ± 5.2 x 1010 | 2.8 x 1011 ± 4.46 x 1010 | 0.12 ± 0.01 | 1 |
| S10 | 4 x 1011 ± 1 x 1011 | 3.3 x 1011 ± 3.11 x 1010 | 0.07 ± 0.12 | 0.58 |
| S11 | 3.3 x 1011 ± 3.9 x 1010 | 1.9 x 1011 ± 1.77 x 1010 | 0.24 ± 0.03 | 1.91 |
| S12 | 4 x 1011 ± 2.9 x 1010 | 5.3 x 1011 ± 9.27 x 1010 | -0.12 ± 0.08 | -0.94 |
| 샘플 | 단계 650 | 단계 760 | |
| 평균 aw | 평균 aw | aw 배수 감소 | |
| S1 | 0.475 ± 0.023 | 0.123 ± 0.007 | 0.74 |
| S10 | 0.490 ± 0.026 | 0.135 ± 0.007 | 0.72 |
| S11 | 0.419 ± 0.016 | 0.201 ± 0.038 | 0.52 |
| S12 | 0.494 ± 0.026 | 0.165 ± 0.006 | 0.66 |
5. 실시예 5
각 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 도 2를 참조하면, 제 1 단계(500)에서 매트릭스에 삽입된 대장균을 갖는 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S13, 보존 용액 S14 또는 보존 용액 S15에 넣었다. 각각의 경우, 총 CFU의 측정(550)은 보존 용액에 담근 후 수행하였다. 제 2 단계(600)에서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 각각의 경우에, 수분 활성(aw)의 측정(650)을 아쿠아 랩(Aqualab) 수분 활성도 측정기 4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A.)를 사용하여 반 건조 비드 상에서 수행하였다. 제 3 단계(700)에서, 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. 본 발명의 한 실시태양에 따르면, 건조 공정(800)은 적어도 두 단계: 실온에서 24시간 동안 건조 드라이기에 비드를 놓고 반 건조 비드를 얻는 단계(600) 및 64시간 동안 건조기에 반 건조 비드를 놓고 건조 비드를 얻는 단계(700)를 포함한다. 각각의 경우에, 총 CFU의 결정(750) 및 물(aw)의 측정(760)을 건조 비드 상에 수행하였다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 aw 배수 감소를 계산하였다:
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 생존력 손실(CFU log 손실)을 계산하였다:
각각의 경우에, 보존 용액 S1을 사용하여 얻은 결과에 대한 평균 생존력 손실 및 정규화된 평균 생존력 손실을 계산하였다.
결과를 도 8에 나타내었다. 보존 용액 S7은 0.35의 정규화된 평균 생존력 손실을 나타내었다.
실시예 5의 결과를 종합하여 표 10 및 표 11에 설명하였다.
| 샘플 | 단계 550 | 단계 750 | ||
| 평균 CFU | 평균 CFU | 평균 CFU 손실 (log10) | 정규화된 CFU 손실 (log10) | |
| S1 | 4.1 x 1011 ± 3.8 x 1010 | 2.7 x 1011 ± 3.44 x 1010 | 0.18 ± 0.10 | 1 |
| S13 | 3.8 x 1011 ± 4.2 x 1010 | 2.6 x 1011 ± 2.7 x 1010 | 0.15 ± 0.02 | 0.85 |
| S14 | 3.8 x 1011 ± 6.1 x 1010 | 2.2 x 1011 ± 3.55 x 1010 | 0.24 ± 0.08 | 1.35 |
| S15 | 4.4 x 1011 ± 1.5 x 1010 | 3.8 x 1011 ± 6.37 x 1010 | 0.06 ± 0.07 | 0.35 |
| 샘플 | 단계 650 | 단계 760 | |
| 평균 aw | 평균 aw | aw 배수 감소 | |
| S1 | 0.501 ± 0.041 | 0.177 ± 0.008 | 0.65 |
| S13 | 0.562 ± 0.101 | 0.247 ± 0.012 | 0.56 |
| S14 | 0.465 ± 0.031 | 0.133 ± 0.013 | 0.71 |
| S15 | 0.502 ± 0.037 | 0.198 ± 0.016 | 0.60 |
6. 실시예 6
각 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 도 2를 참조하면, 제 1 단계(500)에서 매트릭스에 삽입된 대장균을 갖는 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S16, 보존 용액 S17 또는 보존 용액 S18에 넣었다. 각각의 경우, 총 CFU의 측정(550)은 보존 용액에 담근 후 수행하였다. 제 2 단계(600)에서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 각각의 경우에, 수분 활성(aw)의 측정(650)을 아쿠아 랩(Aqualab) 수분 활성도 측정기 4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A.)를 사용하여 반 건조 비드 상에서 수행하였다. 제 3 단계(700)에서, 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. 본 발명의 한 실시태양에 따르면, 건조 공정(800)은 적어도 두 단계: 실온에서 24시간 동안 건조 드라이기에 비드를 놓고 반 건조 비드를 얻는 단계(600) 및 64시간 동안 건조기에 반 건조 비드를 놓고 건조 비드를 얻는 단계(700)를 포함한다. 각각의 경우에, 총 CFU의 결정(750) 및 물(aw)의 측정(760)을 건조 비드 상에 수행하였다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 aw 배수 감소를 계산하였다:
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 생존력 손실(CFU log 손실)을 계산하였다:
각각의 경우에, 보존 용액 S1을 사용하여 얻은 결과에 대한 평균 생존력 손실 및 정규화된 평균 생존력 손실을 계산하였다.
결과를 도 9에 나타내었다. 보존 용액 S7은 0.35의 정규화된 평균 생존력 손실을 나타내었다.
실시예 6의 결과를 종합하여 표 12 및 표 13에 설명하였다.
| 샘플 | 단계 550 | 단계 750 | ||
| 평균 CFU | 평균 CFU | 평균 CFU 손실 (log10) | 정규화된 CFU 손실 (log10) | |
| S1 | 3.3 x 1011 ± 3.4 x 1010 | 3.1 x 1011 ± 4.92 x 1010 | 0.03 ± 0.07 | 1 |
| S16 | 3.6 x 1011 ± 4.1 x 1010 | 4.4 x 1011 ± 9.91 x 1010 | -0.07 ± 0.11 | -2.68 |
| S17 | 3.2 x 1011 ± 4.5 x 1010 | 2.3 x 1011 ± 5.05 x 1010 | 0.15 ± 0.05 | 5.57 |
| S18 | 2.7 x 1011 ± 3.9 x 1010 | 4.2 x 1011 ± 4.76 x 1010 | -0.19 ± 0.06 | -6.98 |
| 샘플 | 단계 650 | 단계 760 | |
| 평균 aw | 평균 aw | aw 배수 감소 | |
| S1 | 0.734 ± 0.164 | 0.155 ± 0.003 | 0.79 |
| S16 | 0.575 ± 0.862 | 0.136 ± 0.015 | 0.76 |
| S17 | 0.742 ± 0.167 | 0.039 ± 0.004 | 0.95 |
| S18 | 0.536 ± 0.003 | 0.176 ± 0.029 | 0.67 |
7. 실시예 7
각 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 도 2를 참조하면, 제 1 단계(500)에서 매트릭스에 삽입된 대장균을 갖는 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1 또는 보존 용액 S19에 넣었다. 각각의 경우, 총 CFU의 측정(550)은 보존 용액에 담근 후 수행하였다. 제 2 단계(600)에서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 각각의 경우에, 수분 활성(aw)의 측정(650)을 아쿠아 랩(Aqualab) 수분 활성도 측정기 4TE(Decagon Devices, Inc., U.S.A.)를 사용하여 반 건조 비드 상에서 수행하였다. 제 3 단계(700)에서, 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. 본 발명의 한 실시태양에 따르면, 건조 공정(800)은 적어도 두 단계: 실온에서 24시간 동안 건조 드라이기에 비드를 놓고 반 건조 비드를 얻는 단계(600) 및 64시간 동안 건조기에 반 건조 비드를 놓고 건조 비드를 얻는 단계(700)를 포함한다. 각각의 경우에, 총 CFU의 결정(750) 및 물(aw)의 측정(760)을 건조 비드 상에 수행하였다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 aw 배수 감소를 계산하였다:
각각의 경우 및 도 2를 참조하여, 다음 식에 따라 생존력 손실(CFU log 손실)을 계산하였다:
각각의 경우에, 보존 용액 S1을 사용하여 얻은 결과에 대한 평균 생존력 손실 및 정규화된 평균 생존력 손실을 계산하였다.
결과를 도 10에 나타내었다.
실시예 7의 결과를 종합하여 표 14 및 표 15에 설명하였다.
| 샘플 | 단계 550 | 단계 750 | ||
| 평균 CFU | 평균 CFU | 평균 CFU 손실 (log10) | 정규화된 CFU 손실 (log10) | |
| S1 | 3.5 x 1011 ± 4.4 x 108 | 3.2 x 1011 ± 4.13 x 1010 | 0.03 ± 0.05 | 1 |
| S19 | 3.3 x 1011 ± 2.6 x 1010 | 2.4 x 1011 ± 2.06 x 1010 | 0.13 ± 0.06 | 3.83 |
| 샘플 | 단계 650 | 단계 760 | |
| 평균 aw | 평균 aw | aw 배수 감소 | |
| S1 | 0.660 ± 0.200 | 0.158 ± 0.026 | 0.76 |
| S19 | 0.561 ± 0.085 | 0.129 ± 0.010 | 0.77 |
8. 실시예 8
본 발명에서 테스트된 각각의 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 실시예 1에서와 같이 제조된 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S2, 보존 용액 S3 및 보존 용액 S4에 넣었다. 이어서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우에, 건조 비드의 CFU/g을 측정하여 4℃ 보관 조건하에서 4주 동안 균주 생존력을 테스트하였다. 테스트는 적어도 3회 수행하였고 1회 표준 편차를 계산하였다.
실시예 8의 결과를 표 16에 나타내었고, 테스트된 모든 보존 용액은 4℃에서 저장될 때 적어도 4주 동안 사료 첨가제 균주 안정성을 제공하였다.
| 보존 용액 | 4주 후 CFU/g 차이 (log) |
| S1 | 0.2 |
| S2 | 0.1 |
| S3 | 0.1 |
| S4 | 0 |
9. 실시예 9
본 발명에서 테스트된 각각의 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 실시예 1에서와 같이 제조된 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S5, 보존 용액 S6 및 보존 용액 S7에 넣었다. 이어서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우에, 건조 비드의 CFU/g을 측정하여 4℃ 보관 조건하에서 4주 동안 균주 생존력을 테스트하였다. 테스트는 적어도 3회 수행하였고 1회 표준 편차를 계산하였다.
실시예 9의 결과를 표 17에 나타내었고, 테스트된 모든 보존 용액은 4℃에서 저장될 때 적어도 4주 동안 사료 첨가제 균주 안정성을 제공하였다.
| 보존 용액 | 4주 후 CFU/g 차이 (log) |
| S1 | 0.2 |
| S5 | 0.1 |
| S6 | 0 |
| S7 | 0.1 |
10. 실시예 10
본 발명에서 테스트된 각각의 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 실시예 1에서와 같이 제조된 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S0, 보존 용액 S8 및 보존 용액 S9에 넣었다. 이어서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우에, 건조 비드의 CFU/g을 측정하여 4℃ 보관 조건하에서 4주 동안 균주 생존력을 테스트하였다. 테스트는 적어도 3회 수행하였고 1회 표준 편차를 계산하였다.
실시예 10의 결과를 표 18에 나타내었고, 테스트된 모든 보존 용액은 4℃에서 저장될 때 적어도 4주 동안 사료 첨가제 균주 안정성을 제공하였다.
| 보존 용액 | 4주 후 CFU/g 차이 (log) |
| S1 | 0 |
| S0 | 2.4 |
| S8 | 0.1 |
| S9 | 0 |
11. 실시예 11
본 발명에서 테스트된 각각의 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 실시예 1에서와 같이 제조된 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S10, 보존 용액 S11 및 보존 용액 S12에 넣었다. 이어서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우에, 건조 비드의 CFU/g을 측정하여 4℃ 보관 조건하에서 4주 동안 균주 생존력을 테스트하였다. 테스트는 적어도 3회 수행하였고 1회 표준 편차를 계산하였다.
실시예 11의 결과를 표 19에 나타내었고, 테스트된 모든 보존 용액은 4℃에서 저장될 때 적어도 4주 동안 사료 첨가제 균주 안정성을 제공하였다.
| 보존 용액 | 4주 후 CFU/g 차이 (log) |
| S1 | 0.1 |
| S10 | 0.1 |
| S11 | 0.4 |
| S12 | 0.2 |
12. 실시예 12
본 발명에서 테스트된 각각의 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 실시예 1에서와 같이 제조된 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S13, 보존 용액 S14 및 보존 용액 S15에 넣었다. 이어서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우에, 건조 비드의 CFU/g을 측정하여 4℃ 보관 조건하에서 4주 동안 균주 생존력을 테스트하였다. 테스트는 적어도 3회 수행하였고 1회 표준 편차를 계산하였다.
실시예 12의 결과를 표 20에 나타내었고, 테스트된 모든 보존 용액은 4℃에서 저장될 때 적어도 4주 동안 사료 첨가제 균주 안정성을 제공하였다.
| 보존 용액 | 4주 후 CFU/g 차이 (log) |
| S1 | 0 |
| S13 | 0 |
| S14 | 0.1 |
| S15 | 0.1 |
13. 실시예 13
본 발명에서 테스트된 각각의 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 실시예 1에서와 같이 제조된 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1, 보존 용액 S16, 보존 용액 S17 및 보존 용액 S18에 넣었다. 이어서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우에, 건조 비드의 CFU/g을 측정하여 4℃ 보관 조건하에서 4주 동안 균주 생존력을 테스트하였다. 테스트는 적어도 3회 수행하였고 1회 표준 편차를 계산하였다.
실시예 13의 결과를 표 21에 나타내었고, 테스트된 모든 보존 용액은 4℃에서 저장될 때 적어도 4주 동안 사료 첨가제 균주 안정성을 제공하였다.
| 보존 용액 | 4주 후 CFU/g 차이 (log) |
| S1 | 0 |
| S16 | 0 |
| S17 | 0 |
| S18 | 0.1 |
14. 실시예 14
본 발명에서 테스트된 각각의 보존 용액에 대해, 건조 및 테스트를 적어도 3회 수행하였다. 실시예 1에서와 같이 제조된 비드를 약 20분 동안 부드럽게 교반하면서 보존 용액 S1 또는 보존 용액 S19에 넣었다. 이어서, 비드를 실온에서 공기 건조기의 트레이 건조기 상에 약 24시간 동안 놓아 반 건조 비드를 얻었다. 반 건조 비드를 약 64시간 동안 건조기에 넣었고, 여기서 건조 및 여과된 공기가 송풍되었다. ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 건조 비드를 수득하였다.
각각의 경우에, 건조 비드의 CFU/g을 측정하여 4℃ 보관 조건하에서 4주 동안 균주 생존력을 테스트하였다. 테스트는 적어도 3회 수행하였고 1회 표준 편차를 계산하였다.
결과를 표 22에 나타내었고, 테스트된 모든 보존 용액은 4℃에서 저장될 때 적어도 4주 동안 사료 첨가제 균주 안정성을 제공하였다.
| 보존 용액 | 4주 후 CFU/g 차이 (log) |
| S1 | 0.1 |
| S19 | 0.1 |
15. 실시예 15
이 실시예는 본 발명의 한 실시태양에 따른 사료 첨가제를 제조하기 위한 변형 공정을 기술한다. 이 실시예에서, 박테리아는 두 가지 상이한 제조 방법, 즉 실시예 1에 기술된 바와 같은 6 단계 공정 또는 하기에 기술된 바와 같은 4 단계 공정에 따라 알긴산염-칼슘으로 제조된 매트릭스에 캡슐화된다. 알긴산염-칼슘 매트릭스는 입자 형태이며, 응용분야에 따라 이종 또는 동종 평균 직경 크기를 가질 수 있다. 상기 비드는 출발 물질로서 액체 세균 배양액으로 제조되기 때문에, 당업자는 본 발명에 기술된 건조된 대장균 비드의 최종 조성물이 박테리아 배양 배지의 구성요소를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
6 단계 공정은 다음 단계를 포함한다:
● 1 단계: 대장균 배양
● 2 단계: 박테리아/일긴산염 슬러리 제조
● 3 단계: 비드 형성 및 중합
● 4 단계: 비드 세척
● 5 단계: 보존 용액과 접촉
● 6 단계: 건조
4 단계 공정은 하기 단계를 포함한다:
● 1 단계: 대장균 배양
● 2 단계: 박테리아/알긴산염 슬러리 준비
● 3 단계: 비드 형성 및 중합
● 6 단계: 건조
a. 대장균 배양
본 실시예에서, 실시예 1과 동일하게 대장균 균주를 제조하였다.
생성된 배양액을 사료 첨가제의 제조에 사용하기 전에 교반 없이 14 내지 18시간 동안 4℃에서 유지하거나 -80℃에서 동결시켰다. 동결시키기 전에, 배양액의 한 부분을 방부제 용액의 일부와 새로운 배양 배지의 일부와 혼합하였다(즉, 1:1:1의 비율로). 보존 용액은 15 wt/v% 말토덱스트린, 21 wt/v% 수크로오스 및 3 wt/v% L-글루탐산 일나트륨을 포함하였다.
b. 매트릭스에 대장균 삽입
다음 단락에서, 대장균은 알긴산염/박테리아 슬러리를 먼저 제조한 다음 그로부터 입자를 형성하여 매트릭스에 삽입된다. 6 단계 공정과 4 단계 공정의 두 가지 변형이 기술된다.
6 단계 공정
박테리아 배양액의 한 부분(예를 들어, 500ml)를 배양 배지의 두 부분(예를 들어, 1L) 및 일간산염 용액의 세 부분(2wt/v% Grindsted® Alginate FD155, 0.1 wt/v BactoTM peptone) (예를 들어, 1.5 L))과 혼합하여 슬러리를 얻었다.
알긴산염-박테리아 배양 슬러리를 3개의 9-포트 Thermo Scientific™ Reacti-Vap™ 증발기를 사용하여 적합하게 된 27개의 바늘(20G, 1/2 인치)을 보유하는 시스템을 통해 액체가 염화 칼슘 중합 용액(300 mM CaCl2, 0.1 wt/v% BactoTM tryptone, 0.1 wt/v% BactoTM peptone, 및 0.05 wt/v% g BactoTM yeast extract in water)의 12L를 함유하는 18-L 탱크에서 적하하여 떨어지게 하여 입자 비드를 형성하는 속도로 펌핑하였다. 비드가 붕괴되지 않도록 중합 용액을 천천히 교반하였다. 일단 알긴산염-배양액 슬러리 전체를 중합 용액으로 옮겼고, 느리게 교반하면서 비드를 용액에 30분 동안 더 보관하여 중합 공정을 완료하였다.
중합 후, 입자 비드를 중합 용액으로부터 배출시키고 세척 용액(50mM CaCl2)에 10분 동안 침지시켰다.
비드를 배출시키고 무게를 재고, 그램 당 1ml 용액의 비율로 보존 용액(10wt/v% 덱스트란 40, 14wt/v% 수크로오스, 2wt/v% L-글루탐산 일나트륨)에 담갔다. 20분 동안 교반하에서 비드를 침지시켰다. 마지막으로, 비드를 배출시키고 건조시켰다.
침지 용액 중에서 14wt/v%의 수크로오스만으로 동일한 방법을 사용하여 추가적인 실험을 또한 수행하였고 동일한 결과를 얻었다.
4 단계 공정
박테리아 배양액의 한 부분(예를 들어, 500ml)을 보존 용액의 한 부분(15 wt/v% 말토덱스트린, 21 wt/v% 수크오로스, 3wt/v% L-글루탐산 일나트륨), 배양 배지의 한 부분(예를 들어, 500ml), 일간산염 용액의 세 부분(2wt/v% Grindsted® Alginate FD155, 0.1 wt/v BactoTM peptone) (예를 들어, 1.5 L))과 혼합하여 슬러리를 얻었다.
알긴산염-박테리아 배양 슬러리를 3개의 9-포트 Thermo Scientific™ Reacti-Vap™ 증발기를 사용하여 적합하게 된 27개의 바늘(20G, 1/2 인치)을 보유하는 시스템을 통해 액체가 12L의 염화 칼슘 중합 용액(5wt/v% 젖산 칼슘)을 함유하는 18-L 탱크에서 적하하여 떨어지게 하여 입자 비드를 형성하는 속도로 펌핑하였다. 비드가 붕괴되지 않도록 중합 용액을 천천히 교반하였다. 일단 알긴산염-배양액 슬러리 전체를 중합 용액으로 옮겼고, 느리게 교반하면서 비드를 용액에 30분 내지 4시간 동안 더 보관하여 중합 공정을 완료하였다. 분말 칼슘 함유 잔류물은 비드의 표면의 적어도 일부에 미립자 코팅을 형성하는 것을 관찰하였다.
c. 삽입된 대장균의 건조 및 테스트
입자 비드를 알루미늄 트레이에 넣고 분산시켜 깊이가 1.5cm 이하인 비드 층을 수득하였다. 이어서, 실시예 1에서와 같이 입자 비드를 공기 건조시켰다. 건조 전후의 입자 비드 중량을 건조 손실을 계산하기 위해 사용하였다.
실시예 15의 결과를 종합하여 다음 표에 나타내었다. 이 결과는 6 단계 공정과 4 단계 공정이 건조 된 매트릭스에 박혀있는 대장균의 생존 가능성과 건조 과정에 대한 저항성에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여줍니다.
4 단계 공정은 6 단계 공정을 최적화하여 재료를 절약하고 공정 시간을 단축하기 위해 개발되었다. 중요한 요구 사항은 박테리아가 건조 단계에서 생존할 수 있도록하는 것이었다. 이것을 달성하기 위해, 6 단계 공정에서, 입자를 비드를 건조시키기 전에 보존 용액과 접촉시켰다.
제 1 프로토 타입 4 단계 공정이 본 발명자에 의해 테스트되었다. 이 프로토 타입 4 단계 공정에서, 본 발명자는 보존 용액 단계와의 접촉을 제거할 수 있는지 여부를 테스트하고 대신에 비드 형성 및 중합 전에 보존 용액을 박테리아/알긴산염 슬러리에 첨가하였다. 이 프로토 타입 4 단계 공정은 두 개의 다른 보존 용액으로 테스트하였다: 덱스트란 40으로 제 1 보존 용액 및 (덱스트란 40 대신) 말토덱스트린으로 제 2 보존 용액. 본 발명자는 또한 염화칼슘에서 중합 후에 세척 단계를 제거할 수 있는지 여부를 테스트하였다.
표 23A에 보고된 결과는 제 1 프로토 타입 4 단계 공정에서 세척 단계를 제거하면 건조된 비드에서 유의한 CFU 손실을 유발한다는 것을 보여준다.
세척 단계를 유지하는 것이 더 나은 결과를 주었지만, 건조된 입자 비드의 CFU 수는 6 단계 공정에 비해 1 log10(3.9 x 108 대 평균 5.9 x 109 CFU/g)보다 더 낮았다. 덱스트란 40으로 테스트 한 첫 번째 프로토 타입 4 단계 공정은 말토덱스트린과 유사한 결과를 나타내었다. 첫 번째 프로토 타입 4 단계 공정으로 인한 비드 간 한 주요 차이점은 건조 공정의 범위이었다. 실제로, 건조 단계 전에 보존 용액 단계와의 세척/접촉을 제거하면 입자 비드가 건조시에 질량의 92-95%를 잃어 버리는 입자 비드를 생성하였다. 이것을 공정이 보존 단계와의 세척/접촉을 포함하고 생성된 입자 비드가 질량의 85%를 잃는 경우와 대조된다(표 23).
| 단계 | 건조 이전 | 건조 이후 | |||
|
대장균 수
(CFU/g) |
건조시 비드 중량 손실
(%) |
대장균 수
(CFU/g) |
대장균 손실
(log 10 CFU) |
||
| 6 | 1.3 x109 | 85 | 5.9 x109 | 0.26 | |
| 4 | 2.7 x109 | 92 | 1.9 x1010 | 0.17 | |
[표 23 A]
본 발명의 한 실시태양에 따른 4 단계 공정으로 수득된 비드에 대한 건조시 살아있는 대장균 수(CFU/g 건조 비드) 및 비드 중량 손실 결과 및 건조 단계 이전의 세척 단계를 실행하는 영향을 평가하였다.
산업 환경에서, 중합 공정 및 입자 비드가 중합 용액과 접촉하는 시간은 제조 공정 중에 크게 변할 수 있다. 실제로, 처리 경로는 사용되는 산업 기계 및 배치 크기와 같은 다양한 조건에 따라 다소 상이할 수 있으며, 따라서 입자 비드가 중합 용액과 접촉하는 시간을 포함하여 처리 시간에 영향을 미친다. 특정 실제 구현예에서, 이러한 가변성은 슬러리를 제조하는 단계와 입자 비드를 형성하기 위해 슬러리를 바늘로부터 떨어 뜨리는 단계 사이에 요구되는 기간에 영향을 줄 수 있다.
제 2 프로토 타입 4 단계 공정에서, 본 발명자는 상이한 중합 용액: 염화칼슘을 포함하는 제 1 중합 용액 및 젖산 칼슘을 포함하는 제 2 중합 용액을 사용하는 효과를 데스트하였다. 본 발명자는 또한 중합 용액과의 다양한 접촉 시간, 즉 1시간, 3시간 또는 4시간을 테스트하였다.
표 24에서 보고된 결과는 두 번째 프로토 타입 4 단계 공정에서, 젖산 칼슘이 염화칼슘에 비해 우수한 결과를 보여 주었으며 공정의 단계 수를 줄이면 전자가 후자보다 더 적합하다는 것을 알 수 있다. 이러한 차이는 중합 시간이 3시간으로 증가한 경우, 즉 중합 용액과의 접촉 시간이 증가할 때 더욱 현저하였다.
| 중합 용액 |
중합 시간
(시) |
수크로오스에 침지되는 비드 |
건조시 비드 중량 손실
(%) |
건조된 비드에서 대장균 수
(CFU/g) |
| 염화 칼슘 및 배지 | 1 | 예 | 91 | 1.8 x108 |
| 3 | 91 | 6.8 x107 | ||
| 염화 칼슘만 | 1 | 예 | 91 | 1.9 x108 |
| 3 | 91 | 7.4 x107 | ||
| 젖산 칼슘 | 1 | 아니오 | 92 | 3.1 x109 |
| 3 | 92 | 1.5 x109 |
본 발명자는 또한 젖산 칼슘 중합 용액과의 접촉 시간을 1시간 내지 4시간으로 증가시킬 때 입자 비드 내의 박테리아의 생존력을 테스트하였다. 표 25에 보고된 결과는 접촉 시간을 4시간으로 증가시켰음에도 불구하고 그 단계 동안 생존력의 손실이 없음을 보여준다.
| 시간(시) |
비드에서 대장균 수
(n = 3) |
|
| 평균 CFU/g | 표준 편차 | |
| 1 | 7.8 x108 | 1.3 x108 |
| 4 | 1.9 x109 | 2.3 x108 |
본 발명자는 슬러리 성분과 접촉시 주변 환경 조건하에서 장시간 동안 박테리아가 생존하는지 여부를 결정하기 위해 슬러리(알긴산염, 박테리아 배양액 및 보존 용액을 함유하는 혼합물) 내의 박테리아의 생존력을 테스트하였다. 두 가지 분석을 수행하였다; 제 1 분석법은 슬러리에 보존 용액을 포함하고, 제 2 분석법은 슬러리에 보존 용액을 포함하지 않았다. 슬러리를 전술한 바와 같이 제조하고 25℃에서 48시간 동안 교반하에 유지시켰다. 표 26에 보고된 결과는 슬러리에 보존 용액이 없는 경우와 비교하여 박테리아가 슬러리 속 보존 용액과 접촉했을 때 48시간 후에 박테리아 CFU의 손실이 없음을 보여주었다.
| 시간 (시) | 슬러리 속 대장균 수 (n = 4) | ||||
| 보존 용액 없음 | 보존 용액 있음 | ||||
| 평균 CFU/ml | 표준 편차 | 평균 CFU/ml | 표준 편차 | ||
| 0 | 2.6 x108 | 4 x107 | 2.5 x108 | 6 x107 | |
| 4 | 3.8 x108 | 9 x106 | 4.8 x108 | 4 x107 | |
| 24 | 7.0 x108 | 4 x107 | 5.4 x108 | 4 x107 | |
| 48 | 2.0 x108 | 1 x107 | 1.6 x109 | 2 x108 | |
제안된 4 단계 공정에서 중합 단계 전에 박테리아 배양액을 보존 용액과 혼합하면 제안된 6 단계 공정에 비해 단계 수가 감소되어 공업적 생산 시간이 단축되고, 자재 비용 및/또는 시장 출시 속도를 가속화할 수 있다. 부가적으로 또는 대안 적으로, 저장 및/또는 운송 목적으로 대장균 배양액을 동결시킬 필요가 있을 때 (예를 들어, -20 또는 -80℃에서) 4 단계 공정을 수행하는 것이 유리할 수도 있으며 또한 생산 체인을 따라 편리한 재고 관리 애플리케이션을 제공한다.
실제로, 본 발명자는 -80℃에서 동결시키고, -20℃에서 24시간 동안 방치한 다음, 해동시켜 4℃에서 14일간 보관한 후에 박테리아의 생존력을 분석하였다. 이러한 종류의 조건은 대개 대규모 산업 공정 동안 예상된다. 결과는 표 28에 제공되며, 동결 배지가 보존 용액을 포함할 때 박테리아의 생존력이 동결-해동 과정에 크게 영향을 받지 않는다는 것을 보여주는데, 즉, 생존력은 4℃에서 14일 동안 서서히 감소하고, 0.35 log10의 최종 손실을 갖는다.
| 4℃에서 시간(일) | 대장균 수 (n = 2) | |
| 평균 CFU/ml | 표준 편차 | |
| 01 | 5.1 x108 | 적용할 수 없음 |
| 1 | 5.5 x108 | 1 x107 |
| 2 | 4.8 x108 | 2 x106 |
| 7 | 4.1 x108 | 3 x107 |
| 8 | 3.3 x108 | 2 x107 |
| 14 | 2.3 x108 | 7 x107 |
1 이 시점은 -80℃에서 동결되기 직전에 한 샘플로 분석한 결과와 해당한다.
본 발명자는 또한 사료 첨가제에서 건조된 박테리아의 안정성을 단독으로 또는 25℃의 저장 조건하에서 펠릿화 동물(돼지) 사료에서 시간에 따라 테스트하였다. 도 12는 24주 저장 후, 사료 첨가제(입자 비드)에 있는 건조된 박테리아가 비교적 안정하다는 것을 보여준다.
16. 실시예 16
본 실시예에서, 동물 사료 첨가제는 본 발명의 실시태양에 따라 동물 사료에 혼입되었다. 이 실시예에서, 본 발명자는 이러한 동물 사료가 이 대장균으로부터 원하는 이익을 얻기에 충분한 생존 가능한 비 병원성 대장균으로 수득될 수 있음을 입증한다.
이 실시예에서, 본 발명자는 미국 국제 특허 공보 제7,981,411호(전문이 본 발명에 참조로 포함됨)에 기술된 수탁 번호 IDAC 210105-01하에서 2005년 1월21일에 캐나다의 국제 기탁 기관에 기탁된 대장균 균주를 혼입하였다. 이 대장균은 장내 분만 후 동물에서 체중 증가를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 테스트의 목적은 따라서 본 발명의 실시태양에 따른 사료 첨가제가 펠릿화 절차 동안 대장균 균주를 충분히 보호하는지를 평가하는 것이어서 사료 첨가제를 포함하는 펠릿화 동물 사료의 투여는 예상되는 성장 촉진 효과를 나타내기 위해 동물에 충분한 생존 가능한 대장균의 투여를 초래할 수 있다.
16.1 동물
스코틀랜드의 이스트 로티안에 있는 농장에서 128 마리의 새끼 돼지. 28일령 +/- 2일, 수컷과 암컷의 대형 백색과 란드라세의 교배. 새끼 돼지는 제 1 식이 요법을 투여하기 전 마지막 3 일 이내에 대장균에 대항하는 어떠한 치료도 받지 못했다. 새끼 돼지는 도착시 건강했으며(0일), 무게는 5.14kg 내지 10.04kg이었다. 동물은 독특한 귀 태그로 개별적으로 번호가 매겨졌다.
16.2 시험
이 연구는 2개의 병행 그룹으로 구성된 제어된, 무작위, 파일럿 연구이었고, 치료된 그룹은 테스트 균주 없이 프리-스타터(Pre-Starter) 사료를 공급한 대조군과 비교하여 테스트 균주로 프리-스타터 사료를 공급하는 것으로 구성되었다.
0일째, 128 마리의 새끼 돼지를 이유 무게에 따라 2 그룹 및 우리에 무작위 배정하였다. 각 그룹당 4 마리의 동물의 16개 우리가 있었다. 테스트 균주 활성 성분인 살아있는 대장균 균주의 특성으로 인해, 동일한 환경 조건을 갖는 2개의 상이한 방(처리 당 1개의 방)에서 처리 당 그룹을 수용하였다. 테스트된 균주를 분석 시작 시점, 즉 0 일째에 투여하였다.
16.3 평가된 매개 변수
본 분석에서, 평가된 매개 변수는 평균 일일 이득(ADG) 및 0일 및 7일째의 전체 체중 증가이었다.
사료 샘플 및 사료 첨가제 박테리아의 양을 살아있는 박테리아 수로 평가하기 위해 사료 샘플을 수집하였다.
돼지새끼의 건강을 매일 모니터링하고 부작용과 수반되는 약물을 기록하였다. 개별 체중은 미리 결정된 날에 측정하였다. 사료 섭취량과 사료 중량은 우리당 기록되었다. PCR 분석에 의해 테스트 균주의 유무를 확인하기 위해 직장 면봉을 0일 및 7일에 수집하였다.
16.4 동물 사료 및 사료 첨가제
사료 첨가제는 상기 실시예에서 기술한 바와 같이 제조하였으며, 6.6 x 109 CFU/g의 대장균 균주를 포함하였다. 이 사료 첨가제는 2 내지 8℃에서 냉장 보관되었으며 폴리에틸렌 "지퍼" 밀봉 백에 250g 포장으로 포장되었다.
동물 사료는 5.4x108 CFU/200g의 대장균 균주의 농도를 포함하였다. 이 "테스트" 동물 사료는 "프리 스타터 식사"라고도 한다. 대조군 제품은 사료 첨가제가 없는 프리 스타터 식사이었다.
16.5 투여
상기 균주는 760g/Ton의 비율로 프리-스타터 식사(제 1 사료)를 통해 투여되었다. 프라 스타터 식사는 항균제 및 항생제 성장 촉진제(AGP) 대안(유기산/염, 높은 수준의 Cu /Zn 등)으로 보충되지 않았다.
프리-스타터 식사는 연구 0일부터 7일까지 7일 동안 공급되었다.
16.6 결과
분석은 프리-스타터 식사 동물 사료에서 활성 성분의 존재와 양을 확인하였다. 테스트된 균주는 처리된 그룹의 모든 돼지 및 대조용 그룹의 대변에서 PCR에 의해 검출되었다.
분석 동안, 표 29에 나타낸 바와 같이, 사료 첨가제에 대장균 주를 혼입하는동물 사료의 7일 섭취 후, 처리된 돼지는 처리되지 않은 돼지(p = 0.044)과 비교하여 143g(일당 21g) 만큼 더 높은 체중 증가를 가졌다. 미가공 데이터는 도 17a 내지 도 17p에 도시되고, 도 17에 도시된 바와 같이 판독된다.
| 테스트 | 대조군 | |
| 평균 | 1.218689 | 1.075156 |
| 분산 | 0.154198 | 0.156365 |
| 관찰 | 61 | 64 |
| 가정된 평균 차이 | 0 | |
| df | 123 | |
| t Stat | 2.035756 | |
| P(T<=t) 일측 검정 | 0.021961 | |
| t 임계치 일측 검정 | 1.657336 | |
| P(T<=t) 양측 검정 | 0.043923 | |
| t 임계치 양측 검정 | 1.979439 |
16.7 분석 및 결론
두 집단 사이의 불균등 분산을 가정하여 t-검정을 수행하였다. 계산된 t-값은 귀무 가설을 거부할만큼 충분히 높았다(즉, 두 집단 사이에 유의적인 차이가 없음), 즉, t Stat> t p-value = 0.044인 임계치 양측 검정. 표준 오차는 각 모집단에 대해 계산되었고, 하나의 표준 오차는 도 13과 14의 각각의 그래프에 표시된다.
도 13은 본 발명의 실시태양에 따른 사료 첨가제를 혼입한 동물 사료(IP) 및 사료 첨가제가 없은 동물 사료("CP")로 급식한 돼지의 7일 후 평균 체중 증가(Kg)를 나타내는 비 제한적인 막대 그래프를 도시한다. 막대 오차는 표준 오차를 나타낸다(p = 0.044). 도 14는 도 13의 돼지의 7일 동안의 평균 일일 체중 증가량(g/일)을 나타내는 비 제한적 막대 그래프를 나타낸다. 막대 오차는 표준 오차(p = 0.044)를 나타낸다.
이 효과는 미국 특허 제7,981,411호(전체가 본 발명에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 식수에서 돼지 새끼에 이 균주를 투여할 때 예상되는 효과와 일치한다. 다시 말해, 사료 첨가제에 대장균을 혼입한 본 발명에 기술된 동물 사료는 동물 사료 펠릿의 제조 동안 가해진 가혹한 조건을 현저하게 겪지 않은 것으로 보이는 충분한 생존 가능한 대장균을 포함하였다.
본 발명 전반에 걸쳐 독자의 편의를 위해서 타이틀이나 서브 타이틀을 사용할 수도 있지만, 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다. 더욱이, 특정 이론들이 여기에 제안되고 공개될 수 있다. 그러나, 그들이 옳은지 여부에 관계없이 어떠한 방식으로도 특정 이론이나 행동 계획을 고려하지 않고 본 발명에 따라 본 발명이 실시되는 한 발명의 범위를 제한해서는 안 된다.
본 발명에 인용된 모든 참고 문헌은 모든 목적을 위해 그 전체가 본 발명에 참고로 포함되어 있다.
본 발명 전반에 걸쳐, 용어 앞에 사용된 용어 "하나"는 하나 또는 그 이상의 용어가 포함하는 실시태양을 포함한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 당업자는 또한, 본 발명 전반에 걸쳐, "포함하는", "함유하는" 또는 "특징으로 하는"과 동의어인 "포함하는"이라는 용어는 포괄적이거나 제한이 없으며, 추가적인, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 갈등이 있는 경우, 정의를 포함한 본 문서가 우선한다.
본 발명에서 사용 된 바와 같이, 용어 "쯤", "약" 또는 "대략"은 일반적으로 당업계에서 일반적으로 허용되는 오차 마진을 의미한다. 따라서, 본 발명에 주어진 수치적 양은 일반적으로 "쯤", "약" 또는 "대략"이라는 용어가 명시적으로 언급되지 않는다면 유추될 수 있는 그러한 오차 마진을 일반적으로 포함한다.
본 발명은 특정 실시태양에 대해 상당히 상세하게 기술하였지만, 본 발명의 교시에 비추어 당업자에게는 변형 및 개선이 가능하고 명백해질 것이다.
Claims (32)
- 펠릿에 혼입된 생존 가능한 비 병원성 대장균 박테리아를 포함하는 동물 사료 펠릿.
- 제 1 항에 있어서,
박테리아의 양은 적어도 1 x 105 CFU/g의 양인 동물 사료 펠릿. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
생존 가능한 비 병원성 대장균은 동물 사료 펠릿에 혼입된 사료 첨가제에 삽입되는 동물 사료 펠릿. - 제 3 항에 있어서,
사료 첨가제는 매트릭스를 포함하고, 매트릭스는 펠릿에 혼입되기 전에 ≤0.3의 수분 활성(aw)을 갖는 동물 사료 펠릿. - 제 4 항에 있어서,
매트릭스는 하이드로콜로이드 형성 다당류를 포함하는 동물 사료 펠릿. - 제 5 항에 있어서,
하이드로콜로이드 형성 다당류는 제 1 다당류이고, 매트릭스는 제 1 다당류와 상이한 제 2 다당류를 추가로 포함하는 동물 사료 펠릿. - 제 5 항에 있어서,
하이드로콜로이드 형성 다당류는 제 1 다당류이고, 사료 첨가제는 그 표면의 적어도 일부분에 배치된 코팅을 추가로 포함하며, 코팅은 제 1 다당류와 상이한 제 2 다당류를 포함하는 동물 사료 펠릿. - 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
매트릭스는 기공을 포함하는 동물 사료 펠릿. - 제 7 항에 있어서,
코팅은 미립자 칼슘-함유 화합물을 포함하는 동물 사료 펠릿. - 제 9 항에 있어서,
칼슘-함유 화합물은 젖산 칼슘을 포함하는 동물 사료 펠릿. - 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
하이드로콜로이드 형성 다당류는 알긴산염을 포함하는 동물 사료 펠릿. - 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
사료 첨가제는 이당류를 추가로 포함하는 동물 사료 펠릿. - 제 12 항에 있어서,
이당류는 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 동물 사료 펠릿. - 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
사료 첨가제는 아미노산의 염을 추가로 포함하는 동물 사료 펠릿. - 제 14 항에 있어서,
아미노산의 염은 L-글루탐산의 염을 포함하는 동물 사료 펠릿. - 생존 가능한 비 병원성 대장균을 동물 사료 펠릿에 혼입시키기 위한 사료 첨가제로서, 사료 첨가제는 매트릭스 내에 삽입된 비 병원성 대장균을 포함하며, 매트릭스는 ≤0.3의 수분 활성(aw)을 가지며 하이드로 콜로이드-형성 다당류를 포함하는 사료 첨가제.
- 제 16 항에 있어서,
하이드로콜로이드 형성 다당류는 제 1 다당류이고, 매트릭스는 제 1 다당류와 상이한 제 2 다당류인 사료 첨가제. - 제 16 항에 있어서,
하이드로콜로이드 형성 다당류는 제 1 다당류이고, 사료 첨가제는 그 표면의 적어도 일부분에 배치된 코팅을 추가로 포함하며, 코팅은 제 1 다당류와 상이한 제 2 다당류를 포함하는 사료 첨가제. - 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
매트릭스는 기공을 포함하는 사료 첨가제. - 제 18 항에 있어서,
코팅은 미립자 칼슘-함유 화합물을 포함하는 사료 첨가제. - 제 20 항에 있어서,
칼슘-함유 화합물은 젖산 칼슘을 포함하는 사료 첨가제. - 제 16 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
하이드로콜로이드 형성 다당류는 알긴산염을 포함하는 사료 첨가제. - 제 16 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
이당류를 추가로 포함하는 사료 첨가제. - 제 23 항에 있어서,
이당류는 수크로오스, 트레할로오스 또는 이들의 조합을 포함하는 사료 첨가제. - 제 16 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
아미노산의 염을 추가로 포함하는 사료 첨가제. - 제 25 항에 있어서,
아미노산의 염은 L-글루타민산의 염을 포함하는 사료 첨가제. - 제 16 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 1x106 CFU/g의 대장균을 포함하는 사료 첨가제. - a. 사료 펠릿을 제조하기 위한 성분 및 사료 첨가제를 제공하는 단계로서 사료 첨가제는 생존 가능한 비 병원성 대장균을 포함하는 단계;
b. 동물 사료 펠릿을 얻기 위해 성분 및 사료 첨가제를 펠릿화하는 단계를 포함하는 동물 사료 펠릿을 제조하는 방법. - 제 28 항에 있어서,
사료 첨가제는 제 16 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 사료 첨가제를 포함하는 방법. - 제 29 항에 있어서,
상기 사료 첨가제를 제공하는 단계는 입자 형태의 사료 첨가제를 제공하는 단계를 포함하며, 입자는 제 1 평균 직경 크기를 갖는 입자의 제 1 집단 및 제 2 평균 직경 크기를 갖는 입자의 제 2 집단을 갖는 방법. - 제 30 항에 있어서,
상기 사료 첨가제를 제공하는 단계는 >1인 제 1 대 제 2의 비율을 얻기 위해 제 1 집단 및 제 2 집단의 양을 선택하는 단계를 포함하는 방법. - 제 28 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펠릿화 단계는 성분 및 사료 첨가제를 증기 컨디셔닝에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
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