PL195890B1 - Sposoby identyfikacji świni odpornej na kolonizację jelit przez E. coli F18 lub zaburzenia jelitowezwiązane z E. coli F18, izolowane cząsteczki DNA,polipeptyd, polinukleotyd, oznaczenie molekularnedo wykrywania receptorów E. coli F18, zestaw do wykrywania receptorów E. coli F18 i zastosowanie zmutowanej postaci genu alfa (1,2)fukozylotransferazy 1 świni - Google Patents
Sposoby identyfikacji świni odpornej na kolonizację jelit przez E. coli F18 lub zaburzenia jelitowezwiązane z E. coli F18, izolowane cząsteczki DNA,polipeptyd, polinukleotyd, oznaczenie molekularnedo wykrywania receptorów E. coli F18, zestaw do wykrywania receptorów E. coli F18 i zastosowanie zmutowanej postaci genu alfa (1,2)fukozylotransferazy 1 świniInfo
- Publication number
- PL195890B1 PL195890B1 PL98364701A PL36470198A PL195890B1 PL 195890 B1 PL195890 B1 PL 195890B1 PL 98364701 A PL98364701 A PL 98364701A PL 36470198 A PL36470198 A PL 36470198A PL 195890 B1 PL195890 B1 PL 195890B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- coli
- ctg
- gcc
- ttc
- ccc
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 6
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 title claims description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 title description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title description 2
- 101710098620 Alpha-1,2-fucosyltransferase Proteins 0.000 title 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims abstract description 87
- 108010079306 galactoside 2-alpha-L-fucosyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 102100039835 Galactoside alpha-(1,2)-fucosyltransferase 1 Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 47
- 102100040837 Galactoside alpha-(1,2)-fucosyltransferase 2 Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 101000893710 Homo sapiens Galactoside alpha-(1,2)-fucosyltransferase 2 Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 30
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims abstract description 19
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 26
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 16
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 3
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 25
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 35
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 30
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 23
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 22
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 20
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 19
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 16
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 16
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 14
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 12
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 101001000966 Caenorhabditis elegans Galactoside 2-alpha-L-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 10
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 10
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 244000144980 herd Species 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 101150048676 FUT1 gene Proteins 0.000 description 8
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004913 RYR1 Human genes 0.000 description 6
- 108060007240 RYR1 Proteins 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 101150010169 FUT2 gene Proteins 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 3
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000013200 Stress disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 101000654311 Androctonus australis Alpha-mammal toxin AaH2 Proteins 0.000 description 2
- 101000583076 Anemonia sulcata Delta-actitoxin-Avd1c Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 101000761697 Hemachatus haemachatus Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000588937 Heteractis magnifica Delta-stichotoxin-Rpa1a Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101100227969 Homo sapiens FUT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010020844 Hyperthermia malignant Diseases 0.000 description 2
- 208000018717 Malignant hyperthermia of anesthesia Diseases 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 101000640206 Tityus serrulatus Alpha-mammal toxin Ts2 Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003132 halothane Drugs 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 201000007004 malignant hyperthermia Diseases 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 206010004053 Bacterial toxaemia Diseases 0.000 description 1
- 229910052684 Cerium Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101001024425 Mus musculus Ig gamma-2A chain C region secreted form Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 102100032122 Ryanodine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108050005124 Ryanodine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102400000096 Substance P Human genes 0.000 description 1
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000013222 Toxemia Diseases 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- OXNGKCPRVRBHPO-XLMUYGLTSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->3)-[alpha-L-Fucp-(1->4)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]2NC(C)=O)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OXNGKCPRVRBHPO-XLMUYGLTSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009582 blood typing Methods 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N cerium Chemical compound [Ce] GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000022602 disease susceptibility Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 210000001061 forehead Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012254 genetic linkage analysis Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 210000000110 microvilli Anatomy 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102000042094 ryanodine receptor (TC 1.A.3.1) family Human genes 0.000 description 1
- 108091052345 ryanodine receptor (TC 1.A.3.1) family Proteins 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000000580 secretagogue effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical class [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
Abstract
1. Sposób identyfikowania swini odpornej na kolonizacje jelit przez E. coli F18 lub zaburzenia jelitowe zwiazane z E. coli F18, znamienny tym, ze: a. okresla sie w próbce biologicznej od swini czy jedyna zasada azotowa w pozycji 307 genu alfa(1,2) fukozylotransferazy 1 jest adenina; i b. identyfikuje sie swinie jako odporna wtedy gdy jedyna zasada azotowa w pozycji 307 jest adenina. 6. Oligonukleotyd, znamienny tym, ze jest komplementarny do sekwencji DNA genu alfa(1,2)fu- kozylotransferazy 1 swini i zawiera sekwencje nukleotydowa rozrózniajaca swinie odporna na kolonizacje jelit przez E.coli F18 od swini wrazliwej, przy czym sekwencja ta obejmuje pozycje nukleotydowa 307 na fig. 1, w której adenina jest podstawiona za guanine, i przy czym wspomniany oligonukleotyd ma zdol- nosc do rozróznienia swini odpornej na kolonizacje jelit przez E. coli F18 od swini wrazliwej. 7. Oznaczenie molekularne do wykrywania receptorów dla E. coli F18, znamienne tym, ze obejmuje izolowanie DNA z komórek jadrzastych swini, amplifikowanie tego DNA w lancuchowej reakcji polimerazy z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych, które sa komplementarne do sekwencji DNA genu al- fa(1,2)fukozylotransferazy 1 swini, przeprowadzanie trawienia enzymem restrykcyjnym z uzyciem co naj- mniej jednego enzymu restrykcyjnego, rozdzial otrzymanych fragmentów na zelu elektroforetycznym, okre- slanie liczby i dlugosci fragmentów, okreslanie w oparciu o liczbe i dlugosc fragmentów, który z receptorów jest obecny. PL PL PL PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sposoby identyfikacji świni odpornej na kolonizację jelit przez E. coli F18 lub zaburzenia jelitowe związane z E. coli F18, izolowane cząsteczki DNA, polipeptyd, polinukleotyd, oznaczenie molekularne do wykrywania receptorów E. coli F18, zestaw do wykrywania receptorów E.coli F18 i zastosowanie zmutowanego postaci genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 świni.
Ważnym problemem w hodowli świń jest utrzymanie ich zdrowia. Szczególnym problemem są zaburzenia jelitowe występujące po odsadzeniu. Pewna liczba serotypów chorobotwórczych szczepów Escherichia (E.)coli jest czynnikiem wywołującym u świń chorobę obrzękową i biegunkę występującą po odsadzeniu, dotyczy to zwłaszcza prosiąt w wieku od 4 do 12 tygodni, i przyczynia się do poważnych strat ekonomicznych dotykających hodowców trzody chlewnej na całym świecie. Typowymi objawami choroby obrzękowej są objawy neurologiczne takie jak ataksja, drgawki i paraliż. W badaniach pośmiertnych stwierdzono, że obrzęki występują zwykle w określonych miejscach takich jak powieki i czoło, ściana żołądka i krezka okrężnicy. Schorzenia są spowodowane przez Shiga-podobny wariant toksyny II i odpowiednio enterotoksyny LT, STa, STb, wytwarzane przez E.coli kolonizujące powierzchnię jelita cienkiego, nie wywołując przy tym znacznych morfologicznych zmian enterocytów (komórek jelita). Pewne rodzaje szczepów E. coli, F18, F4 oraz K88 są głównymi czynnikami letalnymi. Choroba obrzękowa świń jest toksemią pochodzenia jelitowego cechującą się uogólnionym uszkodzeniem naczyń. Jest ono spowodowane przez toksynę, Shiga-podobny wariant toksyny II, wytwarzany przez pewne szczepy E. coli (Bertschinger i wsp. 1993). E. coli rozróżnia się ze względu na trzy typy pili, grupę fimbrii adhezyjnych, które nazywa się zgodnie z ich oznaczeniem, np. K88 lub F18 (Vogeli i wsp. 1997).
Nie wszystkie świnie są podatne na infekcje E. coli. Kolonizacja zależy od zdolności przylegania (adhezji) bakterii do enterocytów, która jest warunkowana przez fimbrie oznaczane jako np. K88 lub F18. Wykazano, że wrażliwość na adhezję, tj. ekspresja u świń receptorów wiążących fimbrie, jest genetycznie kontrolowana przez gospodarza i jest dziedziczona jako cecha dominująca, w przypadku F18, przy czym allel B oznacza wrażliwość a allel b oznacza odporność. (Vogeli i wsp. 1996; Meijerink i wsp., 1996). Lokus genetyczny tego receptora E. coli F18 (ECF18R) został zmapowany na chromosomie 6 świni (SSC6), w oparciu o jego ścisłe sprzężenie z lokus S i innymi lokusami z grupy sprzężenia halotanu (HAL) znajdującymi się na chromosomie 6. Receptor dla E. coli K88 znajduje się na chromosomie 13.
Mechanizm odporności wydaje się być związany z tym, że ściany jelit u zwierząt odpornych nie są kolonizowane przez E. coli, tj. bakterie nie mogą przylegać do ściany jelita świń odpornych. Receptory glikoproteinowe występujące w błonie rąbka szczoteczkowego jelit okazały się być odpowiedzialne za różnice między fenotypem adhezyjnym i nieadhezyjnym związanym z pewnymi E. coli, co dowodzi, że genotyp świni gospodarza determinuje odporność. Badano także bakterie wyposażone w fimbrie (WO 9413811).
Obecne sposoby identyfikowania świń, które są odporne na choroby związane z F18 E. coli obejmują 1) pobieranie próbek jelit świń poddawanych ubojowi i prowadzeniu mikroskopowych testów adhezji, 2) zakażaniu zwierząt wirulentnym E. coli (test kolonizacyjny), lub 3) prowadzeniu typowania grupy krwi w układzie A-O(S) grupy krwi. Pierwsze dwa sposoby są nieprzydatne w identyfikowaniu zwierząt odpornych do zastosowania w inwentarzu hodowlanym. Pomimo tego, że typowanie krwi identyfikuje zwierzęta odporne, to jednak test ten nie jest w stanie określić, czy określić, czy wrażliwe zwierzęta są homozygotami czy heterozygotami w odniesieniu do cechy wrażliwości. Znajomość genotypu zwierząt w odniesieniu do tych alleli (uwarunkowania genowe) jest istotna do przygotowania efektywnego programu hodowlanego. Celem programu hodowlanego jest wytworzenie świń, które są odporne na choroby związane z E. coli F18, które dotykają trzodę po odsadzeniu.
W jednej z publikacji autorzy stwierdzili, w odniesieniu do choroby obrzękowej świń, że Trwają poszukiwania odpowiednich markerów genetycznych... (Bertschinger i wsp., 1993, strona 87) oraz cytowali Walters i Sellwood, 1982:
Hodowla odpornych świń jest atrakcyjnym sposobem zapobiegania chorobom, dla których nie jest znana efektywna profilaktyka. Wykonalność takiego podejścia zależeć będzie od powszechności występowania w populacji świń genu(ów) kodujących odporność, ulepszonych sposobów wykrywania odpornych świń, oraz braku niepożądanych cech genetycznych, które ulegają selekcji wraz z odpornością.
PL 195 890 B1
Lokus genetyczny markera jest to lokus kodujący lub niekodujący, który znajduje się blisko lokus genu będącego przedmiotem zainteresowania, lecz nie koniecznie jest to ten lokus. Wykrywane fenotypy cechują się stałością lub brakiem stałości tych cech, np. polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych, wyrażanie cech, cechy adhezji bakteryjnej, reakcje kolorymetryczne lub enzymatyczne, oraz odporność na antybiotyki. Lokus S kontroluje ekspresję antygenów grup krwi A i O. Świnie będące homozygotami recesywnymi w odniesieniu do lokus S nie ekspresjonują ani antygenów grupy krwi A, ani O. Podobne właściwości występują u człowieka i są powodowane przez mutacje genu alfa (1,2)fukozylotransferazy, który koduje ludzką grupę krwi H (Kelly i wsp., 1994; patrz też WO 9628967). Występujący u świń gen alfa(1,2)fukozylotransferazy został ostatnio zsekwencjonowany (Cohney i wsp, 1996). Gen ten występuje prawdopodobnie w lokus S u świń.
Lokus genów grup krwi H i Se został zmapowany genetycznie i fizycznie na ludzkim chromosomie 19q13.3. Ten region nie uległ zmianom w trakcie ewolucji, i zawiera geny homologiczne do genów grupy sprzężenia HAL u świń. Gen kodujący grupę krwi H nazywany jest FUT1, natomiast gen Se jest odpowiednikiem genu FUT2. FUT1 odpowiada za ekspresję antygenu H w liniach komórek erytroidalnych, natomiast FUT2 reguluje ekspresję antygenu H w nabłonku wydzielniczym i ślinie. Niska zmienność genu FUT1 została zaobserwowana u niższych ssaków, takich jak szczur i królik, a ekspresja mRNA była obserwowana w króliczej tkance mózgowej i szczurzej okrężnicy. U wszystkich tych gatunków stwierdzono istnienie dwóch rodzajów genów alfa(1,2)fukozylotransferazy, które są strukturalnie bardzo podobne do ludzkich genów FUT1 i FUT2, jednak szczególnie geny homologiczne do FUT1 wykazują gatunkowo specyficzny wzorzec ekspresji. U człowieka gen FUT1 jest odpowiedzialny za syntezę antygenów H w prekursorach erytrocytów. Jednakże, u świń erytrocyty adsorbują biernie antygeny H-podobne z surowicy, tak jak w przypadku ludzkich antygenów Lewis. U świń wszystkie Hpodobne antygeny są związane z tkankami zewnątrz wydzielniczymi, a ekspresja genu FUT2 (osobnik wydzielający) jest obecna w tkankach wydzielniczych innych gatunków zwierząt. Dlatego ekspresja determinant grupy krwi A-O u świń reagujących krzyżowo z anty-ludzkimi przeciwciałami specyficznymi wobec grupy H i A może znajdować się pod wpływem genu FUT2.
Dodatkową informacją dotyczącą grup krwi i chorób świń wywoływanych przez E. coli jest fakt, że struktura węglowodanów antygenów grup krwi związana jest z przyłączaniem się do tkanki gospodarza pewnych mikroorganizmów patogennych, np.: Helicobacter pylori przyłącza się do antygenów Lewisb grupy krwi, a E. coli wywołuje infekcje dróg moczowych przyłączając się do substancji P grup krwi. Geny kodujące glukozylotransferazę są odpowiedzialne za tworzenie specyficznej dla grup krwi struktury węglowodanów, i dlatego stanowią one potencjalne geny odpowiedzialne za kontrolę kolonizacji gospodarza przez bakterie. Lokalizacja tych genów dotyczy tego samego regionu chromosomalnego, w którym znajduje się lokus odpowiedzialny za adhezję/brak adhezji F18 pozytywnych E.coli w jelicie cienkim świń. Świnie nie ekspresjonują antygenów grupy krwi A i O do momentu odsadzenia, to znaczy tego samego czasu, w którym stają się one wrażliwe na choroby powodowane przez E. coli F18.
Istnieje zapotrzebowanie na nowe metody diagnozowania i leczenia schorzeń świń wywoływanych przez E. coli. Wykrywanie mutacji genetycznych było proponowane jako sposób służący testowaniu pewnych zaburzeń u świń (hipertermia złośliwa) (Fuji i wsp., 1991; Patent U.S. nr 5,358,649), jednak nie wspominano o markerach polimorficznych przydatnych w diagnozowaniu. Opisano szczepionki uodparniające na kolonizację przez E. coli (Patent U.S. nr 5,552,144; WO 8604604), lecz nie są one najdogodniejszym sposobem zapobiegania schorzeniom wywoływanym przez E. coli ze względu na trudności występujące podczas doustnego podawania żywych szczepionek nowonarodzonym świniom, i ze względu na ograniczenia regulacyjne. Antybiotyki są przydatne w leczeniu, lecz nie są one przydatne w profilaktyce.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikowania świni odpornej na kolonizację jelit przez E. coli F18 lub zaburzenia jelitowe związane z E. coli F18, polegający na tym, że:
a. określa się w próbce biologicznej od świni czy jedyną zasadą azotową w pozycji 307 genu alfa(1,2) fukozylotransferazy 1 jest adenina; i
b. identyfikuje się świnię jako odporną wtedy, gdy jedyną zasadą azotową w pozycji 307 jest adenina.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto izolowana cząsteczka DNA, charakteryzująca się tym, że jest polimorficzna dla genu alfa(1, 2)fukozylotransferazy 1 świni.
PL 195 890 B1
Przedmiotem wynalazku jest też polipeptyd, charakteryzujący się tym, że jest kodowany przez cząsteczkę DNA określoną powyżej, przy czym wspomniana cząsteczka wykazuje aktywność alfa(1,2)fukozylotransferazy.
Przedmiotem wynalazku jest także izolowana cząsteczka DNA o sekwencji nukleotydowej:
| H | W | V | P | s | R | R | II | L | C | L | T | F | L | L | V | C | 17 | |||
| CT | CGA GCC ATG TGG GTC CCC AGC CGC CGC CAC CTC TGT CTG ACC TTC CTG CTA GTC TGT | 5 1 | ||||||||||||||||||
| V | L | A | A | I | F | F | L | Ił | V | V | 0 | D | L | F | Y | S | G | L | D | 37 |
| GTT TTA GCA GCA ATT TTC TTC CTG AAC GTC ΤΛΤ CAA GAC CTC TTT TAC AGT GGC TTA GAC | 1 1 1 | |||||||||||||||||||
| L | I. | A | L | C | P | υ | II | II | V | V | s | S | P | V | A | I | F | C | L | 57 |
| CTG | i CTG | i GCC | ' CTG | ; TGT | CCA | . GAC | : cat | ' AAC GTG GTA TCA TCT CCC GTG GCC ATA TTC | : TGC CTG | 171 | ||||||||||
| Λ | G | T | P | V | łl | P | u | _A_ | _s_ | _ D | s | C | P | K | II | P | A | s | F | n |
| GCG | GCC | ACG | CCC | GTA | CAC | CCC | AAC | GCC | TCC | : GAT | TCC | TGT | CCC | AAG | : cat | CCT | ’ GCC | TCC | : ttt | 23 1 |
| S | G | T | w | T | I | y | P | D | G | R | F | G | II | Q | M | G | Q | Y | A | 97 |
| TCC | GGC, | ACC | TGG | ACT | ATT | TAC | CCG | GAT | GGC | CGG | TTT | GGG | AAC | CAG | ATG | GGA | CAG | TAT | ' GCC | 29 1 |
| T | L | b | Λ | L | A | Q | U | 11 | G | R | 0 | A | F | I | 0 | P | A | M | H | 117 |
| ACG | CTG | CTG | GCC | CTG (3cg | CAG | CTC | AAC | GGC | CGC | CAG | GCC | TTC | ATC | CAG | CCT | GCC | ATG | CAC | 35 1 | |
| A | V | I. | A | P | V | r | R | I | T | L | P | V | L | A | P | E | V | 0 | R | 137 |
| GCC | GTC | CTG | GCC | ccc | GTG | TTC | CGC | ATC | ACG | CTG | CCT | GTC | CTG | GCG | CCC | GAG | GTA | GAC | AGG | 41 1 |
| II | A | P | W | R | E | [, | E | L | II | 0 | H | H | S | E | D | y | A | II | L | 157 |
| CAC | GCT | CCT | TGG | CGG | GAG | CTG | GAG | CTT | CAC | GAC | TGG | ATG | TCC | GAG | GAT | TAT | GCC | CAC | TTA | 47 1 |
| K | E | P | W | b | K | L | T | G | F | P | C | S | W | T | r | F | II | II | L | 177 |
| AAG | GAG | ccc | TGG | CTG | AAG | CTC | ACC | GGC | TTC | CCC | TGC | TCC | TGG | ACC | TTC | TTC | CAC | CAC | CTC | 53 1 |
| R | E | 0 | I | R | s | E | F | T | 1. | l( | D | II | L | R | Q | E | A | Q | G | 197 |
| CGG | GAG | CAG | ATC | CGC | AGC | GAG | TTC | ACC | CTG | CAC | GAC | CAC | CTT | CGG | CAA | GAG | GCC | CAG | GGG | 59 1 |
| V | L | S | 0 | F | R | I, | P | R | T | G | D | R | P | S | Τ | F | V | G | V | 217 |
| GTA | CTG | AGT | CAG | TTC | CGT | CTA | ccc | CGC | ACA | GGG | GAC | CGC | CCC | AGC | ACC | TTC | GTG | GGG | GTC | esi |
| H | V | R | R | G | 0 | Y | L | n | V | H | P | K | R | W | K | G | V | V | G | 237 |
| CAC | GTG | CGC | CGC | GGG | GAC | ΤΛΤ | CTG | CGT | GTG | ATG | CCC | AAG | CGC | TGG | AAG | GGG | GTG | GTG | GGT | 71 1 |
| D | G | A | γ | b | 0 | 0 | A | M | D | W | F | R | A | R | Y | E | A | P | V | 257 |
| GAC | GGC | GCT | TAC | CTC | CAG | CAG | GCT | ATG | GAC | TGG | TTC | CGG | GCC | CGA | TAC | CAA | GCC | CCC | GTC | 77 1 |
| f | V | V | T | S | łl | G | M | E | W | C | R | i; | ti | I | D | T | S | R | G | 277 |
| TTT | GTG | GTC | ACC | AGC | AAC | GGC | ATG | GAG | tgg | TGC | CGG | AAG | AAC | ATC | GAC | ACC | TCC | CGG | GGG | 63 1 |
| l) | V | I | t | A | G | l) | G | R | F. | A | Λ | P | A | R | υ | r | A | I. | L | 29 7 |
| GAC | CTG | ATC | TTT | GCT | GGC | GAT | GGG | cEK | GAG | GCC | GCG | ccc | GCC | AGG | GAC | TTT | GCG | CTG | CTG | 69 1 |
| V | 0 | C | Ił | II | T | 1 | M | T | I | G | T | F | G | F | W | A | A | y | I. | 317 |
| GTG | CAG | TGC | AAC | CAC | ACC | ATC | ATG | ACC | ATT | GGC | ACC | TTC | GGC | TTC | TGG | GCC | GCC | TAC | CTG | 95 1 |
| A | G | G | 0 | T | I | y | L | A | ii | Γ | T | 1. | P | T | S | s | F | L | K | 33 7 |
| GCT | GGT | gg;* | GAT | ACC | ATC | TAC | TTG | GCT | AAC | TTC | ACC | CTG | CCC | ACT | TCC | AGC | TTC | CTG | AAG | 10 1 1 |
| l | F | i; | P | E | A | A | F | 1, | P | E | W | V | G | I | Ił | A | 0 | b | S | 357 |
| ATC | TTT | AA/> | ccc | GAG | GCT | GCC | TTC | CTG | CCC | GAG | TGG | GTG | GCC | ATT | ΑΛΤ | GCA | GAC | TTG | TCT | 107 1 |
| P | 1. | 0 | M | 1. | A | G | P | • | 365 | |||||||||||
| CCA | CTC | CAG | ATG | TTG | GCT | CGG | CCT | TGA | ACC | AGC | CAG | GAG | CCT | TTC | TGG | AAT | AGC | CTC | GGT | 1131 |
| CAA | ccc | AGG | GCC | AGC | GTT | ATG | GGT | CTC | CGG | AAG | CCC | GAG | ΤΑΛ | CTT | CCG | CAG | ATG | CTG | GTG | 119 1 |
| GTC | CTG | TAG | CAG | GCT | GCA | CAC | TTA | TTT | CAA | GAG | TGA | TTC | ΤΛΑ | TTG | GCT | GGA | CTC | AGA | GGA | 1251 |
| AAC | cer | GCA | C, | 12 6 1 |
w której w pozycji nukleotydowej 307 zamiast guaniny występuje adenina.
Przedmiotem wynalazku jest również izolowana cząsteczka DNA, charakteryzująca się tym, że jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej określonej powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest również oligonukleotyd charakteryzujący się tym, że jest komplementarny do sekwencji DNA genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 świni i zawiera sekwencję nukleotydową rozróżniającą świnię odporną na kolonizację jelit przez E. coli F18 od świni wrażliwej, przy czym sekwencja ta obejmuje pozycję nukleotydową 307 na fig. 1, w której adenina jest podstawiona za guaninę, i przy czym wspomniany oligonukleotyd ma zdolność do rozróżnienia świni odpornej na kolonizację jelit przez E. coli F18 od świni wrażliwej.
PL 195 890 B1
Przedmiotem wynalazku jest ponadto oznaczenie molekularne do wykrywania receptorów dla E. coli F18, charakteryzujące się tym, że obejmuje izolowanie DNA z komórek jądrzastych świni, amplifikowanie tego DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych, które są komplementarne do sekwencji DNA genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 świni, przeprowadzanie trawienia enzymem restrykcyjnym z użyciem co najmniej jednego enzymu restrykcyjnego, rozdział otrzymanych fragmentów na żelu elektroforetycznym, określanie liczby i długości fragmentów, określanie w oparciu o liczbę i długość fragmentów, który z receptorów jest obecny.
Korzystnie enzymem restrykcyjnym jest CfoI.
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do wykrywania receptorów dla E. coli F18, charakteryzujący się tym, że zawiera w oddzielnych pojemnikach oligonukleotydy komplementarne do sekwencji DNA polimorfizmów genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 świni.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie zmutowanej postaci genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 świni do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia świń, które chorują na choroby związane z E. coli F18.
Zgodnie z wynalazkiem opracowano nieinwazyjne sposoby identyfikacji świń genetycznie odpornych na schorzenia związane z E. coli, w szczególności zaburzenia jelitowe związane ze szczepem E. coli wyposażonym w fimbrie F18. Polimorfizmy genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 u świń uznano za rozróżniające świnie odporne od świń wrażliwych. Opracowano również oznaczenie i zestaw, użyteczne dla hodowców świń.
Nieinwazyjny sposób według niniejszego wynalazku pozwala wykrywać i eliminować świnie, które są podatne na choroby wywoływane przez E. coli. Nieinwazyjne sposoby identyfikowania świń, które są odporne na kolonizację jelit przez E. coli mogą obejmować następujące etapy: określanie czy polimorfizm genetyczny związany z odpornością na kolonizację występuje w próbie biologicznej pochodzącej ze świni; oraz stwierdzenie czy świnia jest odporna w przypadku gdy jest homozygotą dla tego polimorfizmu 1.
(1Polimorfizm jest zmianą w sekwencji nukleotydowej, która występuje w populacji w wyniku mutacji.)
Dokładniej sposób według wynalazku polega na określeniu w próbie biologicznej pobranej od świni, czy zasada azotowa w pozycji 307 w genie alfa(1,2)fukozylotransferazy świni jest tylko adeniną lub tylko guaniną; oraz identyfikowaniu świni jako odpornej jedynie w przypadku, gdy zasada azotowa w pozycji 307 jest adeniną.
W celu określenia czy w próbie biologicznej występuje polimorfizm, analizowany jest polimorfizm fragmentów restrykcyjnych na żelu porządkującym je pod względem masy cząsteczkowej. Endonukleazy restrykcyjne są enzymami, które przecinają cząsteczki kwasu nukleinowego w powtarzalny sposób w specyficznych miejscach, dając fragmenty kwasu nukleinowego o różnych masach cząsteczkowych, w zależności od umiejscowienia cięcia.
Sposób hodowli świń odpornych na choroby wywoływane przez E. coli obejmuje wybór do hodowli świń z genetycznym polimorfizmem genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1, identyfikującym je jako świnie odporne na choroby jelit wywoływane przez E. coli; oraz hodowlę wybranych świń.
Cząsteczka DNA według wynalazku może być polimorficzna względem genu alfa(1,2)fukozylotransferazy świni, w szczególności o sekwencji przedstawionej na fig. 1. Innymi aspektami wynalazku są cząsteczki o sekwencjach nukleotydowych komplementarnych do sekwencji przedstawionej na fig. 1.
Izolowana cząsteczka DNA może posiadać substytucję adeniny w miejsce guaniny w pozycji 857. Inne izolowane cząsteczki DNA mogą obejmować takie, które posiadają mutację w pozycji nukleotydowej 229 przedstawionej na fig. 1, gdzie kodon CCT jest zmieniony na TTT, kodując aminokwas fenyloalaninę zamiast leucyny. Mutacja w pozycji nukleotydowej 714 to zmiana GAT®GAC, której nie towarzyszy jednak substytucja aminokwasowa w kodowanym produkcie.
Polipeptydy kodowane przez cząsteczki DNA według niniejszego wynalazku mogą wykazywać aktywność alfa(1,2)fukozylotransferazy.
Oznaczenie molekularne służące do wykrywania receptorów E. coli F18 u świń polega na (a) izolowaniu DNA z jądrzastych komórek świń; (b) amplifikowaniu DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) z użyciem oligonukleotydów stosowanych jako startery, które są komplementarne do sekwencji DNA genu świńskiej alfa(1,2)fukozylotransferazy 1; (c) prowadzeniu trawienia enzymem restrykcyjnym z użyciem przynajmniej jednego enzymu restrykcyjnego np. CfoI; (d) rozdziale otrzymanych fragmentów elektroforezą żelową; (e) określaniu liczby i długości fragmentów w żelu oraz (f) określeniu
PL 195 890 B1 na podstawie liczby i długości fragmentów FUT1 jaki genotyp receptora F18 występuje w komórkach świni. Ujawnione tutaj stosowanie większych amplifikowanych fragmentów zamiast krótszych fragmentów, jest mniej kosztowne, ponieważ prążki DNA mogą być rozdzielane na żelu agarozowym o względnie niskim stężeniu. Ponadto, do otrzymywania pewnych fragmentów konieczny jest jeden enzym restrykcyjny rozpoznający stałe miejsce restrykcyjne przyległe do zmiennego miejsca diagnostycznego.
Zestaw do wykrywania polimorfizmu związanego z receptorami E. coli F18 wykorzystuje znajdujące się w osobnych pojemnikach oligonukleotydy, które są komplementarne do sekwencji DNA genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 świni, który odróżnia świnie odporne od wrażliwych. Testowi mogą być poddawane świnie w dowolnym wieku.
Polimorfizmy są także użyteczne do opracowywania leków służących do leczenia świń cierpiących na choroby wywoływane przez E. coli. Zmutowana forma świńskiej alfa(1,2)fukozylotransferazy może oddziaływać z normalnym enzymem, zapobiegając produkcji jelitowego receptora dla F18.
Figura 1 pokazuje sekwencję nukleotydową (FUT1) (dolna) i przewidywaną sekwencję aminokwasową (górna) polimorfizmu świńskiej a1®2 fukozylotransferazy stosując jednoliterowy kod oznaczeń aminokwasów. Ciągła podwójna linia poniżej sekwencji aminokwasowej (=) oznacza domniemany region przezbłonowy; kropkowana linia poniżej sekwencji aminokwasowej pokazuje potencjalne miejsca N-glikozylacji (...).
□ oznacza miejsca, w których u świń odpornych adenina (A) została zastąpiona guaniną (G).
* oznacza kodon terminacyjny
Skróty, które zastosowano do oznaczania reszt aminokwasowych: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; oraz Y, Tyr.
Opis zalecanych realizacji.
Analiza molekularna polimorfizmów DNA związanych z odpornością świń na choroby wywoływane przez E. coli umożliwia testy diagnostyczne służące do selekcji świń odpornych do hodowli. Świnie odporne różnią się od świń wrażliwych w lokus receptora E. coli F18 określonym poprzez markery polimorficzne zgodnie z wynalazkiem.
Zgodnie z wynalazkiem dostarczono nieinwazyjny sposób służący do rozróżniania z wysoką czułością i specyficznością, które świnie są genetycznie podatne na infekcje wywoływane przez E. coli F18 a które są odporne. Polimorfizm DNA genu alfa(1,2)fukozylotransferazy (FUT1) został zidentyfikowany jako różnicujący świnie odporne od świń wrażliwych. Polimorfizm pojawia się wwyniku mutacji (zmiany) w sekwencji nukleotydowej prowadzącej do uzyskania nowego allelu. Allel jest stanem realizującym dany gen. W populacji może istnieć kilka alleli genu różniących się substytucjami zasad azotowych, przypuszczalnie wywołanych przez mutacje w pierwotnej cząsteczce DNA. Współistnienie w populacji więcej niż jednego allelu (czasem określanego jako wariant) jest nazywane polimorfizmem genetycznym. Lokus, w którym może występować więcej niż jeden allel jako stały składnik populacji jest lokus polimorficzny. Zwykle jeden z loci polimorficznych występuje w populacji z niższą częstotliwością.
W wyniku badań prób biologicznych, zwłaszcza krwi, świnie odporne cechują się polimorfizmem w swoich genomach, w którym jedyną zasadą wykrywaną w pozycji 307 (patrz fig. 1) sekwencji nukleotydowej jest adenina, natomiast zasadą występującą w tej samej pozycji u homozygotycznych świń wrażliwych jest guanina. Heterozygotyczne świnie posiadają obydwa typy DNA i są wrażliwe. Polimorfizm ten oznacza zmienność sekwencji świńskiego genu, o której pisał Cohney i wsp. 1996.
Przeprowadzono analizę sprzężeń genetycznych w rodzinach świń i określono związki pomiędzy polimorfizmami FUT1 i odpornością na choroby tych świń. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, odkryto polimorfizmy w genie alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 (FUT1). Polimorfizm posiadający pojedynczą substytucję zasady nukleotydu w pozycji 307 został zastosowany do ustalenia ścisłego sprzężenia pomiędzy genem fukozylotransferazy a systemem S, lokus ECF18R i innymi loci z grupy sprzężenia HAL.
Wykrycie ścisłego sprzężenia pomiędzy mutacją w FUT1 i ECF18R pozwoliło na opracowanie oznaczenia molekularnego do identyfikacji świń odpornych na adhezję E. coli F18, wrażliwych świń heterozygotycznych (nosicieli) i homozygotycznych. To oznaczenie diagnostyczne identyfikuje, z wysoką czułością i specyficznością, świnie które są wrażliwe na chorobę obrzękową i biegunkę występującą po odsadzeniu. Częstość występowania polimorfizmów tu opisanych różni się w zależności od rasy świń. Vogeli i wsp. (1997) zaprezentował częstotliwości występowania alleli M307 w 5 rasach
PL 195 890 B1 świń, które pochodziły ze stad niespokrewnionych ze sobą. Dostępność oznaczenia diagnozującego występowaniu tu opisanego polimorfizmu dostarcza hodowcom możliwość efektywnego eliminowania alleli wrażliwości ECF18R ze swoich stad świń, a zatem eliminowania wstępnych uwarunkowań sprzyjających adhezji E. coli F18 powodującej chorobę obrzękową i biegunki występujące po odsadzeniu.
W celu otrzymania genów z lokus receptora E. coli F18 (ECF18R) wyizolowano ze świńskiej biblioteki genomowej 5 kosmidów i jeden zawierający gen klon genomowy, które zawierały geny alfa(1,2)fukozylotransferazy, FUT1 i FUT2 (Meijerink i wsp., 1997). Mapowanie poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ ulokowało wszystkie te klony w prążku q11 ze świńskiego chromosomu 6 (SSC6q11). Analiza sekwencji kosmidów pozwoliła scharakteryzować (a) otwartą ramkę odczytu (ORF), długości 1098 par zasad, identyczną w 82,3% z ludzką sekwencją FUT1, oraz (b) drugą ORF, o długości 1023 par zasad identyczną w 85% z ludzką sekwencją FUT2. Loci FUT1 i FUT2 wydają się być na podstawie tych wyników świńskimi ekwiwalentami ludzkich loci grupy krwi H i wydzielania w ślinie rozpuszczalnych w wodzie antygenów grup krwi ABO. Bezpośrednie sekwencjonowanie ORF u świń wrażliwych i odpornych na adhezję i kolonizację przez posiadające fimbrie F18 szczepy E. coli (ECF18R) wykazało istnienie dwóch polimorfizmów dla pary zasad 307 (M307) i pary zasad 857 (M857) w ORF FUT1. Pozycje nukleotydowe są ponumerowane począwszy od ATG (kodującego metioninę). Otwarta ramka odczytu (ORF) rozciąga się od tego kodonu do kodonu terminacji, to znaczy ma 1098 nukleotydów długości. Nukleotydy przed i za ORF mogą się różnić, np. jak na fig. 1. Analizy tych mutacji w 34 krzyżowaniach rodziny Landrace z 221 potomkami pokazało ścisłe sprzężenie z lokus kontrolującym odporność i wrażliwość na adhezję i kolonizację jelita cienkiego przez E. coli F18 (ECF18R) oraz z lokus inhibitora S grupy krwi. Dlatego też mutacja M307 jest dobrym markerem nadającym się do selekcji z użyciem markerów zwierząt odpornych na adhezję E.coli F18. Inna odkryta mutacja w pozycji 229 prowadzi do polimorfizmu, w którym kodon kodujący leucynę (CTT) został zamieniony na TTT (kodujący fenyloalaninę). Mutacja w pozycji 714 (GAT®GAC) (kodujące kwas asparaginowy) nie powoduje substytucji aminokwasowej. Nie odkryto polimorfizmów w FUT2, które różnicowałyby świnie wrażliwe i odporne.
P r z y k ł a d y
Poniższe przykłady prezentują realizacje wynalazku.
P r z y k ł a d 1. Oznaczenie służące do wykrywania świń odpornych
Opisane tu polimorfizmy są łatwe do zidentyfikowania testami PCR-RFLP. Jedna z realizacji wynalazku wykorzystuje 160 pz fragment genu świńskiej alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 amplifikowany techniką PCR z użyciem następujących starterów: 5'CCAACGCCTCCGATTCCTGT3' oraz 5'GTGCATGGCAGGCTGGATGA3'. Zalecanymi dla tej realizacji wynalazku warunkami PCR jest 25 cykli przy następujących czasach trwania i temperaturach: 94°C, 30 sek., 60°C, 45 sek., 72°C, 90 sek. Zamplifikowane DNA ze świń odpornych było trawione enzymem restrykcyjnym HgaI, lecz nie było trawione enzymem restrykcyjnym HinPI. Amplifikowane DNA z homozygotycznych świń wrażliwych ulegało trawieniu enzymem restrykcyjnym HinPI. Zamplifikowane DNA z heterozygotycznych świń wrażliwych ulegało częściowo trawieniu obydwoma enzymami.
Alternatywnie, DNA izolowano ze świńskich komórek jądrzastych zgodnie ze standardowymi procedurami. Bezpośrednie sekwencjonowanie świńskich sekwencji FUT1 i FUT2 i ich regionów flankujących pochodzących od zwierząt o różnym genotypie ECF18R (BB, bb) pozwoliło zidentyfikować dwie tranzycje G®A w pozycji 307 i 857 (określone odpowiednio jako M307 i M807) z ORF FUT1. Tranzycja M307 likwiduje miejsce restrykcyjne CfoI. Amplifikacja DNA izolowanego z jądrzastych komórek świńskich była prowadzona zgodnie ze standardowymi procedurami z użyciem starterów P6 iP11 (3 min. w 95°C, 30 cykli 30 sek. w 95°C, 30 sek. w 56°C i 30 sek. w 72°C, następnie 7 min. końcowej elongacji w 72°C), a następnie trawienie CfoI i rozdział na 3% żelu agarozowym, co skutkowało wykazaniem polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Homozygotyczne zwierzęta M307AA dawały 2 prążki. Homozygotyczne zwierzęta M307GG dawały fragmenty 93-, 241- i 87 pz. Zwierzęta heterozygotyczne dawały wszystkie cztery fragmenty.
P r z y k ł a d 2. Czułość i specyficzność oznaczenia z użyciem alfa(1,2)fukozylotransferazy do wykrywania świń odpornych na E. coli F18
Badania prowadzono w celu określenia związku pomiędzy odpornością na choroby i polimorfizmem w pozycji 307 genu FUT1. 183 świń po odsadzeniu (w wieku od 2 do 6 miesięcy) otrzymano z sześciu różnych stad hodowlanych. W tylko jednym z tych stad stwierdzono przed rozpoczęciem badania, że zawiera zwierzęta odporne i wysoką częstotliwość występowania zespołu stresu prosiąt. Pozostałe 5 stad nie wykazywało zespołu stresu prosiąt, a częstotliwość występowania odporności na
PL 195 890 B1 chorobę była nieznana. Dokonywano przypadkowego wyboru osobników z poszczególnych stad, zabijano je humanitarnie i pobierano próbki śledziony i jelita cienkiego. Ekstrahowano DNA z tkanki śledziony i stosowano je w teście PCR-RFLP opisanym w przykładzie 1. Komórki jelitowe izolowano poprzez pobieranie wycinków z powierzchni śluzówki jelit, poddawanie lizie komórek w hipotonicznym roztworze EDTA oraz przemywanie przez odwirowywanie. Komórki z jelitowych rąbków szczoteczkowych inkubowano z E. coli F18. Taka mieszanina była następnie poddawana badaniom mikroskopowym z kontrastem fazowym. Oznaczenie to służyło określaniu czy świnie są wrażliwe (próbki jelitowe zawierały przyłączone bakterie) czy odporne (próbki jelitowe nie zawierały przyłączonych bakterii). Wyniki oznaczenia PCR-RFLP polimorfizmu był skorelowane z wynikami oznaczenia badającego przyłączanie się bakterii do komórek jelitowych u 53 z 53 świń odpornych oraz u 128 ze 130 świń wrażliwych. Dwie świnie uznane za wrażliwe w teście badającym przyłączanie się bakterii do komórek jelitowych zostały niewłaściwie uznane za odporne w oznaczeniu PCR-RFLP. Dwa z sześciu badanych stad zawierały świnie odporne, a w tylko jednym stadzie występował zespół stresu prosiąt, co dowodzi, że oznaczenie PCR-RFLP może identyfikować zwierzęta odporne na chorobę wśród zwierząt, u których objawia się zespół stresu prosiąt.
P r z y k ł a d 3. Lokalizacja FUT1 na chromosomie 6 (SSC6)
W wyniku testu przesiewowego biblioteki kosmidowej prowadzonego z użyciem sondy nukleotydowej FUT1 uzyskanej ze świńskiego genomowego DNA za pomocą starterów P7 i P10 zidentyfikowano kosmidy ETHs1, -s2, -s3, -s4, i -s6 i technikami F18H i DISC-PCR zmapowano na chromosomie 6 w prążku q11.
P r z y k ł a d 4. Identyfikacja ORF FUT1 świni
Hybrydyzacje danego kosmidu trawionego Kspl, EcoRI i KspI/EcoRI ze znakowanymi radioaktywnie fragmentami P6-P11 i P7-P10 świńskiego FUT1 dawały w analizie Southern identyczne sygnały autoradiograficzne w przypadku ETHs2, -s4, i -s6, natomiast różne sygnały uzyskano dla kosmidów ETHs1 i -s3. Z kosmidu ETHs2 Kspl, izolowano subklony o długości 940 pz i 6,2 kpz, odpowiadające przybliżonej długości fragmentów Kspl hybrydyzujących w teście Southern. Sekwencje uzyskane dla obydwu subklonów połączono uzyskując sekwencję o długości 1501 pz, co było zgodne z wynikami bezpośredniego sekwencjonowania produktów z genomowego PCR. Sekwencja 1501 pz zawiera otwartą ramkę odczytu (ORF) o długości 1098 pz odpowiadającą ludzkiej ORF FUT1 z 82,3% identycznością nukleotydową i 80,8% identycznością aminokwasową. ORF koduje polipeptyd.
P r z y k ł a d 5. Identyfikacja świńskiego genu FUT2 i pseudogenu FUTP
ETHs1 posiada jeden fragment DNA (2,7 kpz) hybrydyzujący z sekwencjami FUT1, natomiast ETHs3 posiada dwa fragmenty (2,7 kpz, i 8,2 kpz). Subklonowanie i częściowe sekwencjonowanie fragmentu EcoRI 2,7 kpz z ETHs1 i -s3 potwierdziło, że te dwa fragmenty są identyczne. Sekwencja jest bardzo podobna do ludzkiego FUT2 jednak wykazuje kilka zmian na w regionach leżących na końcach NH2- i -COOH. Zmiany te prowadzą do przesunięć ramki odczytu, niezgodnych z konserwowaną ORF, dlatego przypuszcza się, że sekwencja ta otrzymywana z fragmentu 2,7 kpz jest pseudogenem (FUT2P). Po subklonowaniu ETHs3 trawionego BamHI, zidentyfikowano sekwencje hybrydyzujące zawierające fragment EcoRI 8,2 kpz. Ta sekwencja pochodząca z otrzymanych subklonów posiada 1023 pz ORF i wykazuje 85% identyczność nukleotydową i 83% identyczność aminokwasową z sekwencją ludzkiej FUT2. Zaobserwowano wiele różnic w regionach leżących na końcach NH2i -COOH sekwencji świńskiej FUT2 i sekwencji FUT2P otrzymanej z fragmentu 2,7 kpz. Przewidywana sekwencja aminokwasowa odpowiada częściowo określonej sekwencji aminokwasowej świńskiego enzymu osobników wydzielających (Thurin i Blaszczyk-Thurin, 1995). Sekwencje świńskiej FUT1, FUT2 i FUTP zostały przekazane do GenBank i otrzymały numery dostępu U70883, U70881 i U70882, odpowiednio. Geny FUT1 i FUT2 posiadają wysoce homologiczne sekwencje. Było to brane pod uwagę, na przykład, podczas projektowania starterów. Ponadto, aktywność enzymatyczna FUT1 i FUT2 wymaga zróżnicowania w przyszłych badaniach.
P r z y k ł a d 6. Identyfikacja mutacji M307 i M857 oraz scharakteryzowanie M307
Wyizolowano DNA z komórek jądrzastych świni zgodnie ze standardowymi procedurami. Bezpośrednie sekwencjonowanie sekwencji świńskich FUT1 i FUT2 oraz ich regionów flankujących ze zwierząt o różnych genotypach ECF18R (Bb, bb) pozwoliło zidentyfikować dwie tranzycje G®A w pozycji 307 i 857 (określone jako M307 i M857, odpowiednio) w ORF FUT1. Tranzycja M307 likwiduje miejsce restrykcyjne CfoI. Amplifikacja DNA izolowanego z jądrzastych komórek świńskich była prowadzona zgodnie ze standardowymi procedurami z starterami P6 i P11 (3 min. w 95°C, 30 cykli 30 sek. w 95°C, 30 sek. w 56°C i 30 sek. w 72°C, następnie 7 min. końcowej elongacji w 72°C), a naPL 195 890 B1 stępnie trawienie CfoI i rozdział na 3% żelu agarozowym, co skutkowało wykazaniem polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Homozygotyczne zwierzęta M307AA dawały 2 prążki (fragmenty 93- i 328-pz). Homozygotyczne zwierzęta M307GG dawały fragmenty 87-, 93- i 241-pz. Zwierzęta heterozygotyczne dawały wszystkie cztery fragmenty.
P r z y k ł a d 7. Scharakteryzowanie mutacji M857
Tranzycja M857 likwiduje miejsce restrykcyjne Acil. Starter PBEST został zaprojektowany jako niepasujący do dwóch dodatkowych miejsc AciI w pozycji 866 i 872. Prowadzono PCR z użyciem starterów P7 i PBEST (3 min. w 95°C, 30 cykli 30 sek. w 95°C, 30 sek. w 56°C i 30 sek. w 72°C, następnie 7 min. końcowej elongacji w 72°C) następnie trawienie AciI umożliwiało analizę PCR-RFLP na 3% żelu agarozowym. Homozygotyczne zwierzęta M857AA dawały prążek o długości, natomiast produkty amplifikacji otrzymywane ze zwierząt M857GG dawały fragmenty 136-i 38-pz.
P r z y k ł a d 8. Genetyczne zmapowanie genu FUT1
W rodzinach świń Landrace, przypadki rekombinacji pomiędzy M307 i loci z grupy sprzężenia HAL (S, ECF18R, RYR1, GPL, PGD) wykazywały udział rekombinacji <0,04 (tabela 2). Udział Z wśród wszystkich rekombinacji wynosił pomiędzy 24,5 a 50,6, dostarczając silnego dowodu na sprzężenie pomiędzy tymi loci. Dane te pozwalają na zmapowanie genetyczne genu FUT1 w grupie sprzężenia HAL w bezpośrednim sąsiedztwie S i ECF18R, z których oba są pod wpływem FUT1. W eksperymentalnych rodzinach Landrace, wykryto związek alleliczny pomiędzy ECF18R i RYR1. U świń odpornych na chorobę obrzękową i biegunkę po odsadzeniu zaobserwowano przewagę genotypów RYR1TT w pozycji 1843 w RYR1 (genotyp wrażliwy na halotan) (genotyp ECF18Rb/b) (tabela 3). Ten związek alleliczny jest wynikiem niezrównoważenia sprzężenia, to jest odchylenia obserwowanej częstotliwości haplotypu od oczekiwanych częstotliwości haplotypów w niezależnym zbiorze alleli. Zatem niezrównoważenie sprzężenia oznacza nieprzypadkowy związek pomiędzy allelami należącymi do loci sprzężonych. Jednakże ze względu na niski poziom rekombinacji nie może zostać określone uporządkowanie lokus, które jest znacząco lepsze niż inne.
P r z y k ł a d 9. Związek M307A z ECF18b i M307G z ECF18RB
Wśród rodziców świń rasy Landrace (SL) oraz Large White (LW), ECF18Rb (allel odporności na chorobę obrzękową i biegunkę występującą po odsadzeniu) jest w 100% związany z M307A, a ECF18RB (allel wrażliwości na chorobę obrzękową i biegunkę występującą po odsadzeniu) jest w100% związany z M307G (gdzie A=adenina, G=guanina). U świń SL 88% (30/34) z Ss stanowiły wszystkie haplotypy ECF18Rb oraz M307A, odpowiednio. Odpowiednie wartości dla obydwu haplotypów Ss-ECF18Rb oraz Ss-M307A wynosiły 82% (9/11) u świń rasy Large White. W eksperymentalnych rodzinach SL, występowanie allelu M307A w lokus FUT1 było niskie, a nawet nieobecne u świń LW. Dlatego nie było obserwowane znaczące sprzężenie gamet pomiędzy allelami M857 i allelami genów flankujących. Tranzycja G®A w pozycjach FUT1 307 i FUT1 857 została stwierdzona ze zmienną częstotliwością także u świń Duroc, Hampshire oraz Pietrain, czyniąc prawdopodobnym, że te tranzycje występują także u innych ras świń.
P r z y k ł a d 10. Dystrybucja genotypów FUT1
Tabela 4 pokazuje, że dystrybucja genotypów FUT1 w pozycji 307 wśród typów ECF18R jest znacząco różna od wartości oczekiwanej przy założeniu, że są one niezależne. Spośród 119 zwierząt ECF18Rb/b odpornych na chorobę obrzękową i biegunkę występującą po odsadzeniu, u 118 wykryto genotyp M307AA w teście opartym na DNA. Jedno zwierzę odporne posiadało genotyp M307A/G. Spośród 131 zwierząt wrażliwych, 130 było M307A/G lub M307G/G. Jedno zwierzę, wrażliwe na adhezję E.coli, w teście DNA okazało się być homozygotą M307A/A. Dane z tego przykładu i przykładu 2, wraz z przeprowadzonymi później badaniami sugerują, że gen FUT1 jest genem obecnym w lokus S świń i w lokus ECF18. Ponieważ 4 zwierzęta w tym przykładzie i przykładzie 2 zaprzeczały tej hipotezie, jest prawdopodobne, że zwierzęta te były niepoprawnie fenotypowane w odniesieniu do odporności/wrażliwości na chorobę.
P r z y k ł a d 11. Wymiany aminokwasowe w alfa(1,2)fukozylotransferazie
Zamiana G®A w pozycji +307 pz i +857 pz genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 skutkowały przewidywaną substytucją aminokwasową treoniny (obojętna, polarna) w miejsce alaniny (obojętna, niepolarna) i glutaminy (obojętna, polarna) w miejsce argininy (zasadowa), odpowiednio, co może mieć funkcjonalne konsekwencje w odniesieniu do kodowanego produktu. Wymiana C®T w pozycji +229 pz dawała substytucję aminokwasową leucyny (niepolarna, obojętna) zamiast fenyloalaniny (obojętna, niepolarna).
PL 195 890 B1
T a b e l a 1
Sekwencje starterów zgodnego (F) i odwrotnego (R) oraz ich względna pozycja w stosunku do kodonów2 startu FUT1 i FUT2 świni nazwa startera_sekwencja startera_pozycja
| FUT1 P6 (R) | 5'-CTTCAGCCAGGGCTCCTTTAAG- | + 489 |
| FUT1 P7 (F) | 5'-TTACCTCCAGCAGGCTATGGAC- | + 720 |
| FUT1 PIO (R) | 5'-TCCAGAGTGGAGACAAGTCTGC- | + 1082 |
| FUT1 Pil (F) | 5'-CTGCCTGAACGTCTATCAAGATC- | + 69 |
| FUT1 P16 (F) | 5'-AGAGTTTCCTCATGCCCACAGG- | -90 |
| FUT1 P18 (R) | 5’-CTGCTACAGGACCACCAGCATC- | + 1203 |
| 'UTl PBEST (R) | 5'-ACCAGCAGCGCAAAGTCCCTGAC | |
| GGGCACGGCCTC-3’ | + 893 | |
| FUT2 P16 (R) | 5'-CTCCCTGTGCCTTGGAAGTGAT- | + 1094 |
| FUT2PI 7 (F) | S’-AACTGCACTGCCAGCTTCATGC- | -83 |
| 3' |
2 Startery FUT1 P10 i FUT1 P11 pochodzą z genu ludzkiej FUT1.
T a b e l a 2
Ogólny udział rekombinacji (Q), udział wśród wszystkich rekombinacji (Z), liczba badanych zwierząt (N) dla M307 oraz loci grupy sprzężenia HAL w eksperymentalnej populacji rasy Landrace
| lokus pary | N | Θ | Z |
| S-ECF18R | 183 | 0,01 | 50, 6 |
| M307-S | 183 | 0,01 | 50,6 |
| M307-ECF18R | 216 | 0, 01 | 57,1 |
| M307-RYR1 | 198 | 0,02 | 47,2 |
| M307-GPI | 147 | 0,03 | 34,2 |
| M307-PGD | 147 | 0, 04 | 24,5 |
PL 195 890 B1
T a b e l a 3
Częstotliwość występowania haplotypów dla czterech loci (S-FUT-1 (M307, M857)-ECF18R-RYR1) w eksperymentalnej populacji świń rasy Landrace (SL) i przypadkowo dobranych świń rasy Large White (LW)
| rasa | haplotypy3 dla S FUT1 {M307, | Częstotliwość4 |
| M85 7) , ECF18R, RYR1 | (liczba) | |
| SL | sAGbT | 70 (28) |
| sAGbC | 5 (2) | |
| SGGBC | 15 (6) | |
| SGABC | 10 (4) | |
| LW | sAGbC | 56 (9) |
| SGGBC | 31 (5) | |
| SGGBC | 13 (2) |
3 S: Lokus supresora dla grup krwi A i O (S i s)
FUT1 (M307): zamiana adeniny (A) na guaninę (G) w pozycji nukleotydowej 307 genu alfa (1/2) fukozylotransferazy (FUT1). FUT1 (M857): zamiana adeniny (A) na guaninę (G) w pozycji nukleotydowej 857 genu alfa(1,2)fukozylotransferazy (FUT1). ECF18R: receptor E. coli F18. Allel dominujący jest przedstawiony jako B a allel odporności jako b. RYR1: receptor rianodynowy mięśni szkieletowych. C (cytozyna) jest dominującym odporności, aT (tymina) jest allelem wrażliwości złośliwej hipertermii.
4 Częstotliwość występowania haplotypów w % oraz całkowita liczba haplotypów podana w nawiasach.
T a b e l a 4
Dystrybucja genotypów, korelacja tetrachoryczna (R) i istotność związku (c2 oraz w X c2) dla związanych loci polimorficznych FUT1 (M307) i ECF18R u świń z eksperymentalnej populacji rasy Landrace (SL) oraz przypadkowo dobranych świń rasy Large White (LW)
FUT1/M307
Rasa Lokus Genotyp A/G A/A r χ2 w(5 X χ2
SL ECF18R5 6 b/b 1 113 0, 98 213, 1 42,6***
B/b 106 1
A/G
Genotyp G/G A/A (A/G)
LW ECF18R6 b/b 0 5 1,00 29,0 11,6***
B/b, B/B 24 0 5 Współczynnik ważony w=0,2 (SL) oraz 0,4 (LW) został zastosowany w celu skorygowania niedokładności będącej wynikiem wpływu pokrewieństwa zwierząt w danych, według Cotterman (1947). *** p<0,001.
6 Zwierzęta o genotypie b/b w lokus ECF18R są odporne, natomiast o genotypie B/b i B/B są wrażliwe na adhezję bakterii F18ab E.coli.
PL 195 890 B1
Metody
1. Startery
Startery otrzymane w oparciu o ludzki gen FUT1 posłużyły do amplifikacji DNA genomowego jego świńskiego odpowiednika. Na podstawie uzyskanej sekwencji świńskiej zaprojektowano specyficzne startery, które zastosowano w późniejszej reakcji amplifikacji i sekwencjonowania (tabela 1).
2. Przeszukiwanie świńskiej biblioteki genomowej
Świńska biblioteka genomowa była przeszukiwana zarówno za pomocą sondy FUT1 uzyskanej przy użyciu starterów P7 i P10, jak i z zastosowaniem świńskiego cDNA FUT1. Świńska biblioteka genomowa otrzymana w SuperCos 1 (Stratagene, La Jolla, CA, USA), była przeszukiwana za pomocą sondy FUT1 znakowanej a32P dATP, uzyskanej z genomowego DNA świni za pomocą starterów P7 i P10. Po hybrydyzacji filtrów replikacyjnych w 42°C przez 15 godz. (50% formamid, 6 x SSC, 5 x r-r Dernhardta, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml preparatu ze spermy łososia) oraz dwukrotnym przemywaniu w65°C przez 30 min. (1 x SSC, 0,1% SDS) identyfikowano kolonie pozytywne poprzez naświetlanie (15 godz., -80°C) światłoczułej błony rentgenowskiej.
3. Hybrydyzacja in situ chromosomów metafazowych świni
Klony kosmidowe ETHs1, ETHs2, ETHs3, ETHs4 oraz ETHs6 poddawano fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (F18H) (Solinas Toldo i wsp. 1993) lub bezpośredniej in situ chromosomalnej PCT (DISC PCR) w świńskich metafazach. Chromosomy metafazowe Q-grupowano i fotografowano przed hybrydyzacją. Sondy znakowano metodą losowego przyłączania starterów (ang. random priming) stosując biotyno-16-dUTP. Wykrywanie sygnału i amplifikacja były prowadzone za pomocą awidyno-FITC i biotynylowanej anty-awidyny. Chromosomy były wybarwiane 4,6-diamidyno-2-fenyloindolem, a względne umiejscowienie kosmidów było określane zgodnie z metodą opisaną przez Solinas Toldo, 1993.
4. Subklonowanie
Produkty trawienia enzymatycznego kolonii genomowych dających pozytywny sygnał z sondą były rozdzielane na żelu agarozowym, przenoszone na błonę nylonową, a prążki dające pozytywny sygnał z sondą subklonowane do plazmidów służących następnie do sekwencjonowania FUT1. Sekwencja FUT1 otrzymana tą metodą została pokazana na fig. 1.
Produkty trawienia enzymami Kspl-, EcoRI- i Kspl/EcoRI wszystkich kosmidów były rozdzielane na 0,8% żelu agarozowym i przenoszone na membranę nylonową Hybond N. (Meijerink i wsp., 1997). Blot ten był poddawany hybrydyzacji ze znakowanymi a32P dATP produktami PCR na FUT1 (startery P6-P11 i P7-P10). W oparciu o sygnały autoradiograficzne ETHs1, -s2 oraz -s3 były poddawane dalszemu subklonowaniu w pBluescript SK- (Stratagene), a sekwencje FUT zostały określone na podstawie tych subklonów. Sekwencje dwóch FUT-podobnych otwartych ramek odczytu (ORF) (FUT1 oraz FUT2) otrzymanych z kosmidów ETHs2 oraz -s3 były porównywane z ECF18R pozytywnymi (BB/Bb) oraz negatywnymi (bb) zwierzętami na drodze bezpośredniego sekwencjonowania produktów PCR.
5. Łańcuchowa reakcja polimerazy oraz bezpośrednie sekwencjonowanie
Stosując zestaw Perkin Elmer Ready Reaction Dye Terminator Kit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) oraz 10 pmol startera, prowadzono sekwencjonowanie cykliczne stosując program temperatur obejmujący denaturację inicjującą przez 5 min. w 95°C, po której następowało 25 cykli po 30 sek. w 95°C, 15 sek. w 50°C oraz 4 min. w 60°C. Startery zastosowane do amplifikacji i sekwencjonowania świńskiego genu alfa(1,2)fukozylotransferazy zostały przedstawione w tabeli 1. Dodatkowe startery zostały zaprojektowane z uwzględnieniem krzyżowego łączenia się starterów wynikającego z wysokiego podobieństwa FUT1, FUT2 i pseudogenu FUT2. Próby były analizowane z użyciem aparatu do automatycznego sekwencjonowania 373A ABI Sequencer (Applied Biosystems Inc.) a analizę sekwencji prowadzono korzystając z pakietu GCG (Devereux, 1984).
6. Uzyskiwanie analizowanego potomstwa
Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów analizowano u 221 świń rasy Landrace uzyskanych od 4 knurów i 16 macior, oraz 29 świń rasy uzyskanych w wyniku 9 parzeń pomiędzy nie spokrewnionymi świniami. W celu uzyskania dużej liczby analizowanego potomstwa służącego do badań sprzężeń pomiędzy świńskim genem kodującym receptory ECF18 i wybranymi loci polimorficznym, uzyskiwano tylko analizowane parzenia rasy Landrace typu B/b x b/b.
7. Test kolonizacyjny
W badaniach prowadzonych przez Bertschinger i wsp., 1993, testowano również wspomniane powyżej świnie rasy Landrace pod względem ich wrażliwości ECF18 w teście kolonizacyjnym. W tym
PL 195 890 B1 celu świnie zaszczepiano wkrótce po odstawieniu od matek szczepem 124/76 bakterii E. coli serotypu 0139:K12(B):Hl:F18. (Rippinger, i wsp., 1995). Badano codziennie zawartość bakterii w odchodach. Rozmiar kolonizacji obliczano jako średnią dwóch najwyższych wyników odchodowych. Świnie o średniej odchodowej wynoszącej 3,5, odpowiadającej 6,7 log jednostek tworzących kolonię (CFU/g) lub więcej, były uznawane za wrażliwe na kolonizację. Ten limit opierał się na braku umieralności poniżej tej wartości i wartościach uzyskanych dla całkiem odpornych miotów.
8. Analiza sprzężeń polimorfizmów nukleotydowych
Wyniki dla polimorfizmów pojedynczych nukleotydów były porównywane z danymi uzyskanymi dla ECF18R, które zostały otrzymane w teście adhezji in vitro opisanym przez Vogeli i wsp. (1996), oraz z danymi uzyskanymi dla GPI; PGD-, a-1-B-glikoproteiny-(AlBG), receptora rianodynowego (RYRJ), EAH-i 5-loci opublikowanych przez Vogeli i wsp. (1996). Przesiewowa analiza sprzężeń i obliczenia udziału rekombinantów były przeprowadzone za pomocą programu CRI-MAP wersja 2.4 (Green i wsp., 1990). Wielopunktowa analiza sprzężeń została przeprowadzona poprzez kolejne insercje powyższych loci do mapy. Częstotliwość haplotypów była wyliczona na podstawie zwierząt rodzicielskich, w rodzinach rasy Landrace oraz z 8 zwierząt rodzicielskich rasy Large White, które były haplotypowe na podstawie informacji o potomstwie. Korelacja tetrachoryczna ECF18R i mutacji w FUT1 (FUT1/M307)(polimorfizmy) została wyliczona dla całego potomstwa rasy Landrace i Large White.
9. Analiza Southern Blot
Analiza Southern Blot była prowadzona z wykorzystaniem kosmidów ETHs1 (1-3), ETHs2 (4-6) oraz ETHs3 (7-9) po trawieniu enzymami Kspl (1,4,7), EcoRI (2,5,8) i Kspl/EcoRI (3,6,9) oraz rozdziale na 0,8% żelu agarozowym. Hybrydyzacja ze znakowanym a32PdATP fragmentem 5' FUT1 (startery P6-P11) dawała taki sam prążek 940 pz w obydwu trawieniach Kspl (linia 4) i trawieniach KpsI/EcoRI (linia 6). Jednakże hybrydyzacja z fragmentem 3' FUT1 (startery P7-P10) (tabela 1) ujawnia prążek 6,2 kpz Kspl w linii 4 oraz 1,1 kpz Kspl/EcoRI prążek w linii 6. Obydwa fragmenty FUT1 5' i 3' hybrydyzują z tym samym 4,6 kpz fragmentem EcoRI w linii 5. Sugeruje to istnienie miejsca Kspl w genie FUT1 zawartym w kosmidzie ETHs2. Hybrydyzacja krzyżowa fragmentu 3' FUT1 ujawniła prążki fragmentu 2,7 kpz (linie 2, 3, 8 i 9) oraz 8,2 kpz (linie 8 i 9), identyfikując odpowiednio sekwencję pseudogenu FUT2 (niekompletna ORF) oraz sekwencję genu FUT2.
10. Polimorfizmy fragmentów restrykcyjnych
Wykrycie mutacji:
(A) M307 G na A oraz (B) M857 G na A w genie świńskiej FUT1 uzyskano drogą analizy długości fragmentów restrykcyjnych, prowadzonej z użyciem różnych enzymów. Trawienie amplifikowanych fragmentów FUT1 za pomocą CfoI (A) i Acil (B) dawała polimorfizm fragmentów restrykcyjnych. W pierwszej linii przedstawiono marker 100 pz. Długości fragmentów podano w parach zasad.
(A) Genotyp Genotyp M307A/A (linia 2) daje fragmenty restrykcyjne 328 i 93 pz natomiast genotyp M307A/G (linia 4) daje fragmenty 93, 241 i 87 pz a genotyp heterozygoty M307A/G (linia 3) daje wszystkie cztery fragmenty.
(B) Trawienie genotypu M857A/A (linia 2) daje fragment 174 pz, natomiast w przypadku genotypu M857G/G (linia 4) daje fragmenty 136 i 38 pz, a dla genotypu M857A/G (linia 3) daje wszystkie trzy fragmenty.
11. Źródło świń
Dane dotyczące eksperymentalnej populacji świń rasy Swiss Landrace pochodzą z trzech linii rodowodowych, które zostały uzyskane w Instytucie Bakteriologii Weterynaryjnej, Uniwersytetu w Zurychu. Wszystkie pozostałe świnie ras Large White, Swiss Landrace, Duroc, Hampshire i Pietrain pochodzą z różnych szwajcarskich stad hodowlanych. Inne świnie zostały wybrane przypadkowo z gospodarstw ze Środkowego Zachodu Stanów Zjednoczonych.
Cytowane dokumenty:
Bertschinger i wsp. (1993) Veterinary Microbiology 35:79-89.
Cohney i wsp. (1996) Lmmunogenetics 44:16-79.
Devereux i wsp., (1984) Nucleic Acids Res. 1: 387-395.
Fujii i wsp. (1991) Science 253:448-451.
Green, i wsp., (1990) Documentation for CRI-MAP, Version 2.4, St. Louis: Washington University School of Medicine.
Kelly i wsp. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 91:5843-5847
PL 195 890 B1
Meijerink, E. i wsp. (1997), 25th Int. Conf. on Animal Genetics, p. 44. Rippinger, i wsp. (1995) Vet. Microbial. 45:281-295.
Solinas Toldo i wsp. (1993) Mamm. Genome 4:720-727.
Thurin i Blaszczyk-Thurin, (1995) J. Biol. Chem. 270 (44):26577-26580.
Vogeli i wsp. (1996) Animal Genetics 27:321-328.
Vogeli i wsp. (1997) Schweiz. Arch. Tierheilk. 139:479-484.
Patent U.S. nr 5,358,649, Maclennon i wsp.
Patent U.S. nr 5,552,144, Valery i wsp.
WO8604604 987P, Twórca: Peterson.
WO9628967. Twórca: Koike, C.
WO9413811, Twórcy: Imberechts i Lintermans.
TW 266264, Twórcy: Jeng i Liou.
Claims (10)
1. Sposób identyfikowania świni odpornejna kolonizację jelit przez E.coli F18 lub zaburzenia jelitowe związane z E. coli F18, znamienny tym, że:
a. określa się w próbce biologicznej od świni czy jedyną zasadą azotową w pozycji 307 genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 jest adenina; i
b. identyfikuje się świnię jako odporną wtedy gdy jedyną zasadą azotową w pozycji 307 jest adenina.
2. Izolowana cząsteczka DNA, znamienna tym, że jest polimorficzna dla genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 świni.
3. Polipeptyd, znamienny tym, że jest kodowany przez cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 2, przy czym wspomniana cząsteczka wykazuje aktywność alfa(1,2)fukozylotransferazy.
4. Izolowana cząsteczka DNA o sekwencji nukleotydowej:
PL 195 890 B1
H
W
V
P
s
R
R
II
L
C
L
T
F
L
L
V
C
17
CT
CGA GCC ATG TGG GTC CCC AGC CGC CGC CAC CTC TGT CTG ACC TTC CTG CTA GTC TGT
5 1
V
L
A
A
I
F
F
L
Ił
V
Y
0
D
L
F
Y
S
G
L
D
37
GTT TTA GCA GCA ATT TTC TTC CTG AAC GTC TAT CAA GAC CTC TTT TAC AGT GGC TTA GAC
1 1 1
L
I,
A
L
C
P
υ
II
tl
V
V
s
S
P
V
A
I
F
C
L
57
CTG
i CTG
i GCC
' CTG
; TGT
CCA
. GAC
: cat
' AAC GTG GTA TCA TCT CCC GTG GCC ATA TTC
: TGC CTG
171
Λ
G
T
P
V
łl
P
u
_A_
_s_
_ D
s
C
P
K
II
P
A
s
F
n
GCG
GCC
ACG
CCC
GTA
CAC
CCC
AAC
GCC
TCC
: GAT
TCC
TGT
CCC
AAG
: cat
CCT
’ GCC
TCC
: ttt
23 1
S
G
T
w
T
I
y
P
D
G
R
F
G
II
Q
M
G
Q
Y
A
97
TCC
GGC,
ACC
TGG
ACT
ATT
TAC
CCG
GAT
GGC
CGG
TTT
GGG
AAC
CAG
ATG
GGA
CAG
TAT
' GCC
29 1
T
L
b
Λ
L
A
Q
U
łl
G
R
0
A
F
I
0
P
A
M
II
117
ACG
CTG
CTG
GCC
CTG (3cg
CAG
CTC
AAC
GGC
CGC
CAG
GCC
TTC
ATC
CAG
CCT
GCC
ATG
CAC
35 1
A
V
I.
A
P
V
r
R
I
T
L
P
V
L
A
P
E
V
0
R
137
GCC
GTC
CTG
GCC
ccc
GTG
TTC
CGC
ATC
ACG
CTG
CCT
GTC
CTG
GCG
CCC
GAG
GTA
GAC
AGG
41 1
fi
A
P
W
R
E
[,
E
L
II
0
H
H
S
E
D
Y
A
II
L
157
CAC
GCT
CCT
TGG
CGG
GAG
CTG
GAG
CTT
CAC
GAC
TGG
ATG
TCC
GAG
GAT
TAT
GCC
CAC
TTA
47 1
K
E
P
W
b
K
L
T
G
F
P
C
S
W
T
r
F
II
II
L
177
AAG
GAG
ccc
TGG
CTG
AAG
CTC
ACC
GGC
TTC
CCC
TGC
TCC
TGG
ACC
TTC
TTC
CAC
CAC
CTC
53 1
R
E
0
I
R
S
E
F
T
b
II
D
It
L
R
Q
E
A
Q
G
197
CGG
GAG
CAG
ATC
CGC
AGC
GAG
TTC
ACC
CTG
CAC
GAC
CAC
CTT
CGG
CAA
GAG
GCC
CAG
GGG
59 1
V
L
S
0
F
R
I,
P
R
T
G
D
R
P
S
Τ
F
V
G
V
217
GTA
CTG
AGT
CAG
TTC
CGT
CTA
CCC
CGC
ACA
GGG
GAC
CGC
CCC
AGC
ACC
TTC
GTG
GGG
GTC
esi
H
V
R
R
G
0
Y
L
n
V
H
P
K
R
W
K
G
V
V
G
237
CAC
GTG
CGC
CGC
GGG
GAC
ΤΛΤ
CTG
CGT
GTG
ATG
CCC
AAG
CGC
TGG
AAG
GGG
GTG
GTG
GGT
71 1
D
G
A
γ
b
0
0
A
M
D
W
F
R
A
R
Y
E
A
P
V
257
GAC
GGC
GCT
TAC
CTC
CAG
CAG
GCT
ATG
GAC
TGG
TTC
CGG
GCC
CGA
TAC
CAA
GCC
CCC
GTC
77 1
f
V
V
T
S
łl
G
M
E
W
C
R
i;
U
I
D
T
S
R
G
277
TTT
GTG
GTC
ACC
AGC
AAC
GGC
ATG
GAG
TGG
TGC
CGG
AAG
AAC
ATC
GAC
ACC
TCC
CGG
GGG
63 1
l>
V
I
t
A
G
υ
G
R
F.
A
A
P
A
R
υ
r
A
I.
L
29 7
GAC
CTG
ATC
TTT
GCT
GGC
GAT
GGG
cEK
GAG
GCC
GCG
ccc
GCC
AGG
GAC
TTT
GCG
CTG
CTG
69 1
V
0
C
11
II
T
1
M
T
I
G
T
F
G
F
W
A
A
y
I.
3)7
GTG
CAG
TGC
AAC
CAC
ACC
ATC
ATG
ACC
ATT
GGC
ACC
TTC
GGC
TTC
TGG
GCC
GCC
TAC
CTG
95 1
A
G
G
o
T
I
y
L
A
(ł
Γ
T
1.
P
T
S
s
F
u
K
33 7
GCT
GGT
gg;*
GAT
ACC
ATC
TAC
TTG
GCT
AAC
TTC
ACC
CTG
CCC
ACT
TCC
AGC
TTC
CTG
AAG
10 1 1
l
F
i;
P
E
A
A
F
1,
P
E
W
V
G
I
Ił
A
0
b
S
357
ATC
TTT
AA/>
ccc
GAG
GCT
GCC
TTC
CTG
CCC
GAG
TGG
GTG
GGC
ATT
ΑΛΤ
GCA
GAC
TTG
TCT
107 1
P
1.
0
M
1.
A
G
P
•
365
CCA
CTC
CAG
ATG
TTG
GCT
CGG
CCT
TGA
ACC
AGC
CAG
GAG
CCT
TTC
TGG
AAT
AGC
CTC
GGT
1131
CAA
ccc
AGG
GCC
AGC
GTT
ATG
GGT
CTC
CGG
AAG
CCC
GAG
ΤΑΛ
CTT
CCG
CAG
ATG
CTG
GTG
119 1
GTC
CTG
TAG
CAG
GCT
GCA
CAC
TTA
TTT
CAA
GAG
TGA
TTC
ΤΛΑ
TTG
GCT
GGA
CTC
AGA
GGA
1251
AAC
GCT
GCA
C,
12 6 1 w której w pozycji nukleotydowej 307 zamiast guaniny występuje adenina.
5. Izolowana cząsteczka DNA, znamienna tym, że jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej określonej w zastrz. 4.
6. Oligonukleotyd, znamienny tym, że jest komplementarny do sekwencji DNA genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 świni i zawiera sekwencję nukleotydową rozróżniającą świnię odporną na kolonizację jelit przez E. coli F18 od świni wrażliwej, przy czym sekwencja ta obejmuje pozycję nukleotydową 307 na fig. 1, w której adenina jest podstawiona za guaninę, i przy czym wspomniany oligonukleotyd ma zdolność do rozróżnienia świni odpornej na kolonizację jelit przez E. coli F18 od świni wrażliwej.
7. Oznaczenie molekularne do wykrywania receptorów dla E. coli F18, znamienne tym, że obejmuje izolowanie DNA z komórek jądrzastych świni, amplifikowanie tego DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych, które są komplementarne do sekwencji DNA genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 świni, przeprowadzanie trawienia enzymem restrykcyjnym z użyciem co najmniej jednego enzymu restrykcyjnego, rozdział otrzymanych fragmentów na żelu elektroforetycznym, określanie liczby i długości fragmentów, określanie w oparciu o liczbę i długość fragmentów, który z receptorów jest obecny.
8. Oznaczenie molekularne według zastrz. 7, znamienne tym, że enzymem restrykcyjnym jest CfoI.
PL 195 890 B1
9. Zestaw do wykrywania receptorów dla E. coli F18, znamienny tym, że zawiera w oddzielnych pojemnikach oligonukleotydy komplementarnego do sekwencji DNA polimorfizmów genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 świni.
10. Zastosowanie zmutowanej postaci genu alfa(1,2)fukozylotransferazy 1 świni do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia świń, które chorują na choroby związane z E. coli F18.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4718197P | 1997-05-20 | 1997-05-20 | |
| PCT/US1998/010318 WO1998053102A1 (en) | 1997-05-20 | 1998-05-20 | Methods and compositions to identify swine genetically resistant to f18 e. coli associated diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL364701A1 PL364701A1 (pl) | 2004-12-13 |
| PL195890B1 true PL195890B1 (pl) | 2007-11-30 |
Family
ID=21947500
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL98364701A PL195890B1 (pl) | 1997-05-20 | 1998-05-20 | Sposoby identyfikacji świni odpornej na kolonizację jelit przez E. coli F18 lub zaburzenia jelitowezwiązane z E. coli F18, izolowane cząsteczki DNA,polipeptyd, polinukleotyd, oznaczenie molekularnedo wykrywania receptorów E. coli F18, zestaw do wykrywania receptorów E. coli F18 i zastosowanie zmutowanej postaci genu alfa (1,2)fukozylotransferazy 1 świni |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6596923B1 (pl) |
| EP (1) | EP0985052B1 (pl) |
| JP (2) | JP3637420B2 (pl) |
| CN (1) | CN1314953A (pl) |
| AT (2) | ATE246731T1 (pl) |
| AU (2) | AU737862B2 (pl) |
| BR (1) | BR9809137A (pl) |
| CA (1) | CA2290768C (pl) |
| CZ (1) | CZ298021B6 (pl) |
| DE (3) | DE985052T1 (pl) |
| DK (2) | DK0985052T3 (pl) |
| ES (2) | ES2203958T3 (pl) |
| HK (1) | HK1040097A1 (pl) |
| HU (1) | HUP0103587A3 (pl) |
| MX (1) | MXPA99011988A (pl) |
| NO (1) | NO996373L (pl) |
| NZ (1) | NZ501886A (pl) |
| PL (1) | PL195890B1 (pl) |
| PT (1) | PT985052E (pl) |
| RU (1) | RU2204609C2 (pl) |
| WO (2) | WO1998053102A1 (pl) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6355859B1 (en) * | 1997-05-20 | 2002-03-12 | Biotechnology Research And Development Corporation | Interactions between genotype and diet in swine that prevent E. coli associated intestinal disease |
| DK0985052T3 (da) * | 1997-05-20 | 2003-10-27 | Us Agriculture | Fremgangsmåder og præparater til identifikation af svin, der er genetisk resistente for F18-E. coli-associerede sygdomme |
| HU221664B1 (hu) * | 1999-03-31 | 2002-12-28 | MTA Állatorvostudományi Kutatóintézete | Élő, szájon át adható Escherichia coli vakcina készítésére alkalmas törzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére és a törzs előállítására alkalmas eljárás |
| GB0118549D0 (en) * | 2001-07-30 | 2001-09-19 | Pig Improvement Uk Ltd | Methods |
| US7785778B2 (en) | 2002-11-25 | 2010-08-31 | University Of Copenhagen | Porcine polymorphisms and methods for detecting them |
| WO2004061125A2 (en) | 2002-12-31 | 2004-07-22 | Mmi Genomics, Inc. | Compositions, methods and systems for inferring bovine traits |
| CN104982387B (zh) * | 2015-05-25 | 2018-01-23 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 一种muc13和fut1基因的分子标记辅助选择方法 |
| EP3711773A1 (en) * | 2015-09-02 | 2020-09-23 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Glycoside hydrolases and their use in preventing and/or treating a pathogenic infection in an animal |
| CN106480174B (zh) * | 2016-09-14 | 2019-04-16 | 扬州大学 | 一种用于猪抗病育种的遗传分子标记方法和应用 |
| CN108384865A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-08-10 | 扬州大学 | Alpha菌毛基因在仔猪腹泻致病性大肠杆菌监测、鉴别中的应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK41885A (da) | 1985-01-31 | 1986-11-13 | Slagteriernes Forskningsinst | 987p-fimbrie-producerende mikroorganisme, vaccine til immunisering af grise samt fremgangsmaade til fremstilling af vaccinen |
| ATE120488T1 (de) | 1990-12-21 | 1995-04-15 | Univ Toronto | Diagnose für bösartige hyperthermia im schwein. |
| US5474796A (en) * | 1991-09-04 | 1995-12-12 | Protogene Laboratories, Inc. | Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface |
| US5552144A (en) | 1992-01-22 | 1996-09-03 | Microcarb, Inc. | Immunogenic shiga-like toxin II variant mutants |
| AU5715194A (en) | 1992-12-04 | 1994-07-04 | N.V. Innogenetics S.A. | New polypeptides, nucleic acid sequences encoding them, and their use to prevent the adhesion of f107-fimbriated bacteria |
| US5625124A (en) * | 1994-07-11 | 1997-04-29 | Washington University | Animal model for helicobacter pylori infection |
| WO1996028967A1 (fr) | 1995-03-17 | 1996-09-26 | Chihiro Koike | Mammiferes transgeniques autres que des primates, ou des serotypes de primates superieurs ont ete exprimes par un transfert de genes etrangers et procede pour creer ceux-ci |
| US6355859B1 (en) * | 1997-05-20 | 2002-03-12 | Biotechnology Research And Development Corporation | Interactions between genotype and diet in swine that prevent E. coli associated intestinal disease |
| DK0985052T3 (da) * | 1997-05-20 | 2003-10-27 | Us Agriculture | Fremgangsmåder og præparater til identifikation af svin, der er genetisk resistente for F18-E. coli-associerede sygdomme |
| US6569923B1 (en) * | 1999-03-19 | 2003-05-27 | John T. Slagter | Polymer-cement composites and methods of making same |
-
1998
- 1998-05-20 DK DK98923570T patent/DK0985052T3/da active
- 1998-05-20 JP JP55057998A patent/JP3637420B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-20 DE DE0985052T patent/DE985052T1/de active Pending
- 1998-05-20 DE DE69816987T patent/DE69816987T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-20 PT PT98923570T patent/PT985052E/pt unknown
- 1998-05-20 DE DE69832306T patent/DE69832306T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-20 WO PCT/US1998/010318 patent/WO1998053102A1/en active IP Right Grant
- 1998-05-20 ES ES98923570T patent/ES2203958T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-20 EP EP98923570A patent/EP0985052B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-20 BR BR9809137-9A patent/BR9809137A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-05-20 CA CA002290768A patent/CA2290768C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-20 AU AU75832/98A patent/AU737862B2/en not_active Ceased
- 1998-05-20 NZ NZ501886A patent/NZ501886A/en unknown
- 1998-05-20 AT AT98923570T patent/ATE246731T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-05-20 CN CN98807387A patent/CN1314953A/zh active Pending
- 1998-05-20 MX MXPA99011988A patent/MXPA99011988A/es active IP Right Grant
- 1998-05-20 AU AU75807/98A patent/AU7580798A/en not_active Withdrawn
- 1998-05-20 PL PL98364701A patent/PL195890B1/pl unknown
- 1998-05-20 DK DK03001366T patent/DK1310570T3/da active
- 1998-05-20 WO PCT/US1998/010259 patent/WO1998053101A2/en active Application Filing
- 1998-05-20 HU HU0103587A patent/HUP0103587A3/hu unknown
- 1998-05-20 AT AT03001366T patent/ATE309392T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-05-20 CZ CZ0460799A patent/CZ298021B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-05-20 RU RU99127287/13A patent/RU2204609C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-05-20 ES ES03001366T patent/ES2248647T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-11-19 US US09/443,766 patent/US6596923B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-21 NO NO996373A patent/NO996373L/no unknown
-
2001
- 2001-04-27 US US09/844,705 patent/US6965022B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-25 US US09/844,268 patent/US7193072B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-03-05 HK HK02101688.3A patent/HK1040097A1/zh unknown
-
2004
- 2004-10-13 JP JP2004299458A patent/JP3941956B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Meijerink et al. | Two α (1, 2) fucosyltransferase genes on porcine chromosome 6q11 are closely linked to the blood group inhibitor (S) and Escherichia coli F18 receptor (ECF18R) loci | |
| AU2003281988B2 (en) | Porcine polymorphisms and methods for detecting them | |
| Li et al. | Adhesive patterns of Escherichia coli F4 in piglets of three breeds | |
| RU2204609C2 (ru) | СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СВИНЕЙ, РЕЗИСТЕНТНЫХ К КИШЕЧНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С Е.Сoli, СПОСОБ РАЗВЕДЕНИЯ СВИНЕЙ, РЕЗИСТЕНТНЫХ К КИШЕЧНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С E.Coli, ВЫДЕЛЕННАЯ ДНК-МОЛЕКУЛА (ВАРИАНТЫ), МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РЕЦЕПТОРОВ Е.Сoli F-18 У СВИНЕЙ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РЕЦЕПТОРОВ Е.Сoli F-18 | |
| US6355859B1 (en) | Interactions between genotype and diet in swine that prevent E. coli associated intestinal disease | |
| JP2012508564A (ja) | ブラキスピラ・ヒオディセンテリアのワクチン株 | |
| EP1310570B1 (en) | Methods and compositions to identify swine genetically resistant to F18 E. Coli associated diseases | |
| Ridpath et al. | HOSvyOrth et al. | |
| Cohney | HOSvyOrth et al. | |
| Bosworth et al. | Interactions between genotype and diet in swine that prevent E. coli associated intestinal disease | |
| CN104878113B (zh) | 影响断奶仔猪的产肠毒素大肠杆菌f41性腹泻病抗性的主效snp标记及应用 | |
| Li | Identification of DNA markers which are associated with egg production traits and Marek's disease resistance in chickens | |
| Malek et al. | POSITIONAL CANDIDATE GENE ANALYSIS OF QUANTITATIVE TRAIT LOCI FOR MEAT QUALITY ON PORCINE CHROMOSOME 5. |