JP2001500004A - ヒト型結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のデサチュレーション抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 タンパク質とアルカリ性ホスファターゼの融合に基づく遺伝学的方法の使用(Limetal.，1995)はヒト型結核菌の新たな輸出タンパク質の単離を可能にした。本願は、まず、DESと呼ばれるこの輸出タンパク質をコードする遺伝子の単離を開示し、同時にその同定および種々のマイコバクテリア種間での分布も開示する。特に、該タンパク質は唯一、第II類の二鉄-オキソタンパク質ファミリーの酵素活性部位のレベルで見出されたその一次配列アミノ酸に存在することを示す。このファミリーのタンパク質の中で、ヒト型結核菌のDESタンパク質はステアロイルACPデサチュラーゼと有意な一致は示さない。次にこのタンパク質の抗原特性を研究した。ヒト型結核菌のDESタンパク質を組換えにより大腸菌で過剰発現させ、次いでこの細菌由来のタンパク質型を精製した。ヒト型結核菌またはウシ型結核菌に感染した結核患者の血清のDESタンパク質に対する反応性をウエスタンブロットで試験した。試験した患者の100%がこのタンパク質を認識した。他の病状を患う患者の血清とある関連をもって比較した、結核患者の血清のELISAにより測定されたDESタンパク質に対する抗体応答の強度は、これら２つのカテゴリーの患者の抗体応答の強度の間に有意な差があることを示す。従って、DESタンパク質は結核の血清診断用の興味深い手段である可能性がある。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト型結核菌(MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS)のデサチュレーション抗原 発明の背景 それぞれヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)複合体およびらい菌(M． leprae)由来のバチルス属によって引き起こされる結核病およびらい病は、二大 マイコバクテリア疾病である。病原性マイコバクテリアは宿主の食細胞内で働く 能力を有している。宿主と細菌との間の相互作用から、宿主の免疫応答の損傷を 介して結核感染の病状が組織上で起こるという結果となる(Andersen & Brennan ，1994)。また、宿主の防御もマイコバクテリアとのその相互作用に依存してい る。 マイコバクテリアの病理学的メカニズムならびに疾病の進行に関する宿主の免 疫応答について理解するには、これらの免疫系との相互作用に関与する細菌抗原 の同定が不可欠である。それはまた、予防接種および免疫診断によるマイコバク テリア疾病の制御のための戦略の改良に極めて重要である。 何年もかけて、マイコバクテリア抗原を同定するため種々の戦略が追求されて きた。細菌タンパク質を分画し、分析する生化学手段がそれらのBまたはT細胞応 答を惹起する能力に関して選択された抗原タンパク質の単離を可能にした(Romai n et al.，1993;Sorensen et al.，1995)。最近のマイコバクテリアに関する分 子遺伝学的方法の発達(Jacobs et al.，1991;Snapper et al.，1990;Hatful，19 93;Young et al.，1989)は、λgt11ベクター中でのヒト型結核菌およびらい菌双 方のＤＮＡ発現ライブラリーの構築、ならびに大腸菌(E．coli)でのそれらの発 現を可能にした。ネズミポリクローナルまたはモノクローナル抗体および患者の 血清を用いるこれらのこれらの組換えライブラリーのスクリーニングは、多くの 抗原の同定へとつながった(Braibant et al.，1994;Hemans et al.，1995; Thole & van der Zee，1990)。しかしながら、それらの大部分は高度に保存され た熱ショックタンパク質の群に属することがわかった(Thole & van der Zee，19 90;Young et al.，1990)。 結核に特異的な防御が生きたBCGワクチンの投与によってのみ付与されたとい う動物モデルでの観察は、マイコバクテリアにより分泌されたタンパク質が防御 免疫の誘導に主要な役割を果たし得ることが示唆するものであった。これらのタ ンパク質は、結核のモルモットまたはマウスモデルにおいて細胞介在性の免疫応 答および防御免疫を誘導することが示された(Pal & Horwitz，1992;Andersen，1 994;Haslow et al.，1995)。最近、Lim et al.(1995)によって、PhoA遺伝子融合 体に基づく輸出タンパク質の同定のための遺伝子的方法論がマイコバクテリアに 適用された。それは輸出タンパク質をコードするヒト型結核菌ＤＮＡ断片の単離 を可能にした。そのうち、すでに公知の19kDaリポタンパク質(Lee et al.，1992 )およびERPタンパク質がらい菌28kDa抗原と類似している。 発明の概要 発明者らは、PhoA遺伝子融合法を用いることにより確認されたDESと呼ばれる 新たなヒト型結核菌輸出タンパク質を同定した。このdes遺伝子はマイコバクテ リア種の間で保存されていると考えられ、結核ウシ由来の血清によっては認識さ れないが、結核およびらい病患者由来のヒト血清によっては強く認識される抗原 タンパク質をコードしている。DESタンパク質のアミノ酸配列は第II類の二鉄-オ キソタンパク質ファミリー由来の酵素の活性部位に特有の２セットのモチーフを 含んでいる。このファミリーの中でDESタンパク質は、可溶性ステアロイル-ACP デサチュラーゼ(desaturase)と有意な一致を示す。 前記の概説ならびに以下の詳説の双方は例示および説明のためのものであり、 請求の範囲に記載されている本発明を限定するものでないことが理解されるべき である。 本明細書に組み込まれかつその一部を構成する添付の図面は記述とともに本発 明のいくつかの具体例を示し、本発明の原理を説明するのに役立つ。 好ましい具体例の説明 以下、実施例により本発明をさらに明らかにするが、実施例は本発明を単に例 示するためのものである。 細菌、培地および増殖条件 本研究で用いる細菌系統およびプラスミドは図8に一覧化されている。大腸菌D H5αのBL21(DE3)pLysS培養物は慣例的にLuria B培地(Difco)で37℃にて増殖させ た。マイコバクテリウム培養物は、Tween0.05%、グリセロール(0.2%)およびADC （グルコース0.2%、BSA画分V0.5%およびNaCl0.085%）を補足したMiddlebrook 7H 9培地(Difco)で37℃にて増殖させた。必要であれ場合は、抗生物質を以下の濃度 で加えた：アンピシリン(100μｇ/ml)、カナマイシン(20μｇ/ml)。 ヒトおよびウシ血清 （ヒト型結核菌に感染した）肺結核または肺外結核を患う20人由来の血清標本 はBlignyサナトリウム(France)から入手した。ウシ型結核菌(M．bovis)に感染し たヒト結核患者由来の6血清および他の病状を患うBCG予防接種患者由来の24血清 はそれぞれ、Institut Pasteul(Madagascar)およびCentre de Biologie Medical e specialisee(CBMS)(Institut Pasteur，Paris)から入手した。（ウシ型結核菌 に感染した）結核ウシ由来の血清はCNEVA(Maison Alfort)から入手した。 サブクーニング法 制限酵素およびT4ＤＮＡリガーゼはGibco/BRL，Boehringer Mannheim and New England Biolabsから購入した。酵素は総て製造業者の推奨に従って用いた。１ -kbラダーのＤＮＡ分子量マーカーはGibco/BRL製であった。クローニング法に用 いたＤＮＡ断片はGeneclean IIキット(BI0 101Inc.，La Jolla，Calif.)を用い てゲル精製した。コスミドおよびプラスミドはアルカリ分解により単離した(Sam brook et al.，1989)。Gene Pulserユニット(Bio-Rad Laboratories，Richmond ，Calif.)を用いるエレクトロポレーションによって形質転換した。 図面の簡単な説明 図1は、ヒト型結核菌des遺伝子をコードする4.5kb EcoRV断片の制限地図であ る。 図2は、ヒト型結核菌des遺伝子のヌクレオチドおよび誘導アミノ酸配列を示す 。 図3は、第II類の二鉄-オキソタンパク質とヒト型結核菌desタンパク質の比較 配列解析を示す。網掛けした残基はヒト型結核菌desタンパク質におけるクラス ターリガンドおよび有望な鉄リガンドを示す。網掛けしていない枠で囲んだ太字 は、クラスターに結合する水素のネットワークに関与する可能性のある残基であ る。その他の太字はO₂結合部位に関与すると確信される保存された残基を示す。 Desの配列に導入されているギャップはドットで示されている。受託番号は以下 の通り：VO1555，エプスタイン・バーウイルス・リボヌクレオチドレダクターゼ ；M58499，メチロコッカス・カプスラータス(Methylococcus capsulatus)メタン モノオキシゲナーゼヒドロキシラーゼ；M60276，シュードモナス種系統CF600フ ェノールヒドロキシラーゼdmpNポリペプチド；M59857，リシナス・コミュニス(R icinus communis)ステアロイル-ACPデサチュラーゼ；およびD38753，イネ(O．sa tiva)ステアロイル-ACPデサチュラーゼ。 図4は、他のマイコバクテリア種におけるdes遺伝子の分布に関するサザンブロ ット解析である。種々のマイコバクテリア系統由来のＤＮＡをPstIで消化し、電 気泳動にかけ、サザンブロッティングによりナイロン膜上へ転移させ、次いで図 1に示されているプローブBとハイブリダイズした。 図5は、プラスミドpETdes(I-1718)でDESタンパク質を発現する大腸菌由来の可 溶性および不溶性抽出物についてのSDS-PAGEゲルを示す。 図6は、ヒト結核患者および非結核患者のDES抗原に対する抗体応答の感受性に 関するELISAの結果を示す。 図7は、マイコプラズマ・ツベルクロシス(Mycoplasmatuberculosis)des遺伝子 のヌクレオチドおよび誘導アミノ酸配列を示す。下線の配列はそれぞれ推定リボ ソーム結合部位に相当するプロモーターおよびシャイン・ダルガルノ配列の-35 および-10ボックスに相当する。アデノシンで標識された「+1」は転写開始部位 に相当する。 図8は、本願に用いられる細菌系統およびプラスミドの表である。 図9は、ウシ型結核菌およびヒト型結核菌に感染したヒトおよびウシ由来抗体 による精製DESタンパク質の認識を示すウエスタンブロットである。 サザンブロット解析およびコロニーハイブリダイゼーション 放射性標識用のＤＮＡ断片をTris-ホウ酸-EDTA緩衝系(Sambrook et al.，1989 )中の0.7%アガロースゲル(Gibco BRL)上で分離し、Geneclean II(BI0 101)を用 いてゲルから単離した。5μＣｉの(α-³²P)dCTPを有するランダムプライムド標 識キットMegaprime(Amersham)を用いて放射性標識行い、導入されなかった標識 をNick Column(Pharmacia)を通すことによって除去した。サザンブロッティング はサザン法(Southem，1975)に従い、ナイロン膜(Hybond-N+，Amersham)を用いて 0.4M NaOH中で行い、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーショ ンはRHB緩衝液(Amersham)を用い、製造業者に推奨されように行った。65℃での 洗浄を次の通りに行った：それぞれ15分間の2XSSPE(150mM NaCl，8.8mM NaH₂PO₄ ，1mM EDTA pH7.4)-SDS0.1%を用いた2回の洗浄、10分間の1XSSPE-SDS0.1%を用い た1回の洗浄、それぞれ15分間の0.7XSSPE-SDS0.1%を用いた2回の洗浄。−80℃に て一晩、X線フィルム(Kodak X-Omat AR)を用いて感光させることによってオート ラジオグラムを作製した。コロニーハイブリダイゼーションはナイロン膜ディス ク(Hybond-N+0.45μｍ，Amersham)を用いて行った。ＤＮＡを固定するためにマ イクロ波オーブン中に1分間入れる前に、膜上に吸着された大腸菌コロニーを (0.5M NaOH，1.5M NaCl)溶液中で溶菌させた。ハイブリダイゼーションおよび洗 浄は、サザンブロッティング解析に関して記載した通りであった。 ＤＮＡ配列決定および解析 二本鎖プラスミドＤＮＡの配列を、GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer) でのTaq Dye Deoxy Terminator Cyclese quencing Kit(Applied Biosystems)を 用いるジデオキシ鎖ターミネーション法(Sanger et al.，1977)およびＤＮＡAna lysis System-Model373stretch(Applied Biosystems)での実施により決定した。 この配列を集め、ＤＮAstrider（商標）(CEA，France)およびthe University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)パッケージを用いてプロセッシン グした。BLAST演算法(Altschul et al.，1990)を用いて類似性に関してタンパク 質データベースを探索した。 大腸菌におけるDESタンパク質の発現および精製 des遺伝子の1043bpのNdeI-BamHI断片を、ヌクレオチドJD8(5'-CGGCATATGTCAGC CAAGCTGACCGACCTGCAG-3')およびJD9(5'-CCGGGATCCCGCGCTCGCCGCTCTGCATCGTCG-3' )を用いるPCRによって増幅し、pETI4b(Novagen)のNdeI-BamHI部位にクローン化 してpET-desを作製した。製造業者の推奨に従い、Taqポリメラーゼ(Cerus)を用 いてＤＮＡサーマルサイクラー(Perkin Elmer)でPCR増幅を行った。PCRは、1サ イクルの変性(95℃、6分)それに続く変性(95℃、1分)、アニーリング(57℃、1分 )、およびプライマー伸長(72℃、1分)からなる25サイクルの増幅からなる。pET- desベクターにおいて、des遺伝子の発現はT7バクテリオファージプロモーターの 制御下にあり、DES抗原は6個のヒスチジン残基を含有する融合タンパク質として 発現する。des遺伝子の発現は、培地中に0.4mM IPTGを添加することにより誘導 された。供給者(Qiagen，Charsworth，Calif.)の推奨に従い、ニッケル−キレー トアフィニティー樹脂を用いてDESタンパク質を精製した。細胞質の包接小体中 のDESタンパク質の局在化と関連して、この精製は塩酸グアニジン緩衝液中の変 性条 件下で行った。100mM EDTAを含有する緩衝液A(6M塩酸グアニジン，0.1M NaH₂PO₄ ，0.01M Tris，pH8)でタンパク質を溶出させた。精製タンパク質を保存し、他の 緩衝液にそれを可溶化させることができなかった場合にはすべて緩衝液A中で使 用した。 SDS-PAGE およびイムノブロッティング ドデジル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)をLaem mli(1970)の記載通りに行った。ウエスタンブロッティング実験（イムノブロッ ティング）として、およそ10μｇのDES精製タンパク質をSDS-ポリアクリルアミ ドゲル上で流し、製造業者(Bio-Rad Laboratories，Richmond，Calif.)の推奨に 従い、Bio-Radミニトランスブロット装置を用いてニトロセルロース膜(Hybond C extra，Amersham)上に転移させた。転移量はPonceau Rougeを用いた一時的な染 色によって視認化した。この膜を1/200^cに希釈したヒト患者またはウシの血清と ともに37℃で1時間インキュベートし、次いで、1/2500^cに希釈したヤギ抗ヒト(P romega)またはウサギ抗ウシ(Biosys)IgGアルカリ性ホスファターゼに結合させた 二次抗体とともに37℃で30分間インキュベートした。基質としての5-ブロモ-4- クロロ-3-インドリルホスフェート(0.165mg/ml)およびトルイジナムニトロブル ックテトラゾリウム(0.33mg/ml)の添加により呈色反応を行った。ELISA 酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)によって、ヒトまたはウシ血清をD ESに対する抗体に関して試験した。96ウェルのマイクロタイタートレー(Nunc)を 塩酸グアニジン緩衝液A(6M塩酸グアニジン，0.1M NaH₂PO₄，0.01M Tris，pH8)中 の0.1μｇ（ウェル当たり）の精製DESタンパク質で被覆した（37℃で１時間次い で4℃で16時間）。3回洗浄した後に、室温で30分間ウェルをリン酸緩衝塩水(PBS )中のウシ血清アルブミン3％で満たした。3回洗浄した後に、37℃で2時間緩衝液 (PBS，0.1% Tween20，1%ウシ血清アルブミン)中で1/50^c〜1/3200^cに希釈した 血清をこれらのウェルに加えた。3回洗浄した後に、37℃で1時間、これらのウェ ルを1/4000^cに希釈したヤギ抗ヒトIgGアルカリ性ホスファターゼ複合体(Promega )で処理した。次いで、ml当たり4mgのp-ニトロフェニルホスフェートを基質とし て加えた。37℃で20分間インキュベーションした後に、micro-ELISA Autoreader (Dynatech，Mames la Coquette，France)で405nmの吸光度にてこのプレートの吸 光度を読み取った。 統計学 試験した種々の血清の抗体応答をスチューデントのt検定を用いて比較した。P ≧0.05は有意差がないとみなした。 ヌクレオチド配列および受託番号 desのヌクレオチド配列を、受託番号U49839としてGenome Sequence Data Base (GSDB)に寄託した。 Des 遺伝子のクローン化 ヒト型結核菌ゲノムＤＮＡのphoA遺伝子との融合体のライブラリーの構築およ びLim et al.(1993)によって記載されたスメグマ菌(M.smegmatis)でのその発現 は、数種のPhoA⁺クローンの単離へとつながった。pExp421は、このライブラリー から選択されるPhoA⁺クローンの1つによって担持されたプラスミドである。酵素 活性のあるアルカリ性ホスファターゼの検出によって、pExp421挿入断片は機能 発現および輸出シグナルを含むことが示された。制限解析では、pExp421が1.1kb の挿入断片を有することが示された。その配列の部分決定によって、フレーム内 でphoA遺伝子と融合したdesと命名された577bpのORFが同定され、可溶性ステア ロイル−アシル−担体タンパク質デサチュラーゼとともに保存された9個および1 4個のアミノ酸からなる2つのモチーフが提示された(Limら，1995)。 全長des遺伝子を単離するために、ヒト型結核菌H37Rv pYUB18ゲノムコスミド ライブラリー(Jacobs et al.，1991)を1.1kbのプローブ(プローブA、図1参照)と のコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。C₃およびC₄と命 名された2つのハイブリダイジングコスミドを遺伝子のさらなる単離のために選 択した。C₃およびC₄を数種の制限酵素を用いて切断し、プローブとして1.1kbの 断片を用いるサザンブロット解析に付した。 EcoRV制限プロフィールによつて、pBluescript KS(Stratagene)中にサブクロ ーニングしてプラスミドpBS-desを生ずる4.5kbの単一ハイブリダイジング断片が 明らかになった。 des 遺伝子の同定 全des ORFのＤＮＡ配列を決定した(図2)。des遺伝子は、計算分子量が37kDaで ある339個のアミノ酸タンパク質をコードする1017bpの領域にわたることが示さ れた。このORFは、549位の可能性あるATG開始コドンから始まり、1565位のTAG停 止コドンで終わる。ATGの上流−8位に可能性あるシャイン・ダルガルノモチーフ (GGAGG)が存在する。ORFのG+C含量(62%)はマイコバクテリアゲノム中で認められ た全GC含量と一致する。des遺伝子のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、 データベースの配列と比較した。それらは、らい菌ゲノム配列決定プロジェクト の一環としてGenBankに寄託した(GenBank受託番号U15182)コスミドB2266上に位 置するらい菌aadX遺伝子と極めて高い一致を示した。このコーディング領域内に おいて、ＤＮＡ配列は79％一致しており、一方、コードされたタンパク質では80 ％（保存された残基を含むと88％）一致していた。des遺伝子はまた可溶性ステ アロイル−ACPデサチュラーゼに対して非常に高い値：イネ(Oryza sativa)ステ アロイル−ACPデサチュラーゼ(受託番号D38753)に対してヌクレオチドレベルで4 4％、アミノ酸レベルで30％の一致（保存された残基を含むと51％）を示した。 pExp421を担持するスメグマ菌クローンにおけるphoA酵素活性の検出によってD ESタンパク質が輸出されることが示唆されるが、DESタンパク質のN末端アミノ酸 と細菌の輸出タンパク質のシグナル配列との間に構造上の類似性は見出せなかっ た(Izard & Kendall，1994)。 らい菌ゲノムと同様、らい菌の推定NtrB遺伝子(コスミドB2266)と高い一致が 示される第2のORFは、図2のヒト型結核菌のdes遺伝子の下流に位置している。興 味深いことには、この2つのORF、desおよび「NtrB」は、9個のヌクレオチドで重 複する66個のヌクレオチドの2つの直接反復によってヒト型結核菌で単離されて いる(図2)。らい菌およびヒト型結核菌は、染色体のこの部分に同じゲノム編成 を共有していると思われるが、これらの反復はらい菌ゲノムには存在しない。 des タンパク質は第II類の二鉄−オキソタンパク質の保存されたアミノ酸モチ ーフを表す DESタンパク質のアミノ酸配列のさらなる解析によって、第II類の二鉄−オキ ソタンパク質にのみ見出される保存されたモチーフの存在が明らかとなった(Fox et al.，1994)(図3)。これらのタンパク質は、タンパク質を含有するオキソ架 橋二鉄クラスター(Fe-O-Fe)である。それらは、二次構造としてタンパク質誘導 クラスターリガンドに関与する4本のαヘリックスを有している。X線構造研究に よって明らかにされたように、これらのタンパク質では、二鉄の軸は4本の相接 しないヘリックスB、C、EおよびFに由来するリガンドを有する4本のヘリックス の束の長軸に対して平行に配置されている。ヒト型結核菌DESタンパク質は、第I I類の二鉄−オキソ酵素と同一の活性部位残基を有しているようである。これに は、鉄原子に対するリガンドであるGluおよびHis残基(ヘリックスCではE₁₀₇およ びH₁₁₀、ヘリックスEではE₁₆₇、またヘリックスFではE₁₉₇およびH₂₆₀)、該クラ スターとの水素結合ネットワークに関与しているAsp、GluおよびArg残基(ヘリッ クスCではE₁₀₆およびR₁₀₉、ヘリックスFではD₁₉₆)、ならびにO₂結合部位の一部 である可能性のあるIIeおよびThr残基(ヘリックスEではT₁₇₀、ヘリックスFではI₁₉₃ )が含まれる。このように、ヒト型結核菌DESタンパク質は、一次配列として8 5個のアミノ酸より分離した2つの保存されたD/E(ENXH)モチーフを含有する。 今日までのところ、第II類の二鉄−オキソタンパク質ファミリーは、リボヌク レオチドレダクターゼ、炭化水素ヒドロキシラーゼ（メタンモノオキシゲナーゼ 、トルエン-4-モノオキシゲナーゼおよびフェノールヒドロキシラーゼ）および 可溶性ACPデサチュラーゼを含有する。全配列においてDESタンパク質は、リボヌ クレオチドレダクターゼまたは細菌性ヒドロキシラーゼに対するよりも可溶性ス テアロイル-ACPデサチュラーゼに対してより高い類似性を示す。DESタンパク質 のアミノ酸レベルでの一致パーセンテージは、イネ・ステアロイル-ACPデサチュ ラーゼとは30％であるといわれているが、メチロコッカス・カプスラータス(Met hylococcus capsulatus）メタンモノオキシゲナーゼ（受託番号M58499）とは17 ％にすぎず、シュードモナス(Pseudomonas)種CF600フェノールヒドロキシラーゼ （受託番号M60276)とは17.5％、またエプステイン・バー(Epstein Barr)リボヌ クレオチドレダクターゼ(受託番号V01555)とは17.7％である。可溶性Δ9デサチ ュラーゼとの一致は、アミノ酸がヘリックスC、EおよびFの活性部位内に位置し ていることと概ね関係している(図3)。 他のマイコバクテリア種におけるdes遺伝子の分布 種々のマイコバクテリア系統由来のPstIで消化した染色体ＤＮＡにおけるdes 遺伝子の存在をサザンブロッティングによって解析した(図4)。用いたプローブ （プローブＢ）は、ヌクレオチド572〜1589に相当するPCR増幅産物である（図1 参照）。このプローブを、試験したすべてのマイコバクテリアゲノムＤＮＡに対 してハイブリダイズした。強力なシグナルがヒト型結核菌、ウシ型結核菌、ウシ 型結核菌BCG、M.アフリカナム（M.Africanum）および鳥型結核菌(M．avium)で検 出された。より弱いシグナルが、M.ミクロティ(M.microti)、M.キセノピ(M.xeno pi)、M.フォルツイツム(M.fortuitum)およびスメグマ菌で見られた。このように 、des遺伝子は、少なくとも増殖の遅いヒト型結核菌、ウシ型結核菌、ウシ型結 核菌BCG、M.アフリカナム、鳥型結核菌およびM.キセノピに、ならびに増殖の速 いス メグマ菌に単一のコピーとして存在しているものと思われる。 大腸菌におけるdes遺伝子の発現 DESタンパク質を過剰発現させるために、des遺伝子をバクテリオファージT7プ ロモーターに基づく発現ベクターpET14b(Novagen)中にサブクローニングした。d es遺伝子のPCR増幅産物（材料および方法を参照）をこのベクターのNde1-BamHI 部位にクローン化してプラスミドpET-desとした。このプラスミドpET-desを担持 する大腸菌BL21 DE3 pLysS細胞のIPTG誘導において、約40kDaのタンパク質が過 剰生成した。過剰生成したタンパク質の大きさは、推定ポリペプチドから算出し た分子量と一致している。図5に示すように、過剰生成したDESタンパク質の大部 分は、大腸菌細胞の不溶性物質中に存在している。これはおそらく大腸菌細胞質 中の過剰濃縮タンパク質の沈殿から生じ、それゆえ包接小体を形成する。このタ ンパク質の溶解を可能とするために、塩酸グアニジン緩衝液中における変性条件 下でニッケルキレートアフィニティー樹脂を用いて精製を行った。試験した総て の条件（pH、洗浄剤等）の中で、カラム内で沈殿することなく可溶なままでタン パク質が溶出可能な唯一の条件は、6M塩酸グアニジンを含有する緩衝液であるこ とであった。 感染後のDESタンパク質の免疫原性 ヒト型結核菌に感染したヒト患者由来の20種の血清サンプル（4種は肺外結核 、15種は肺結核菌、1種は病気であれば両方の型）、ウシ型結核菌に感染したヒ ト患者由来の6種の血清およびウシ型結核菌に感染したウシ由来の4種の血清をプ ールするかまたは個々に採取するかのいずれかでイムノブロット実験で試験し、 感染したヒトまたはウシ由来の抗体による精製DESタンパク質の認識頻度を求め た。ヒト型結核菌に感染したヒト患者由来の20種の血清のうち20種およびウシ型 結核菌に感染したヒト患者由来の6種の血清のうち6種が、37kDaのバンドを有す る反応により示されたように、組換え抗原を認識した（図9）。さらに、ヒトら い腫 らい患者由来の血清のプールもまた、DES抗原に対して反応した。 これに対し、ウシ型結核菌に感染したウシ由来の血清標本のプールはDESタン パク質を認識しなかった。これらの結果はDESタンパク質がヒト結核患者におい て高い免疫原性があることを示すものである。ヒト患者の抗体応答の大きさ 酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)を用いて20人の結核患者（15人は ヒト型結核菌に感染、5人はウシ型結核菌に感染）由来の種々の血清サンプルのD ES抗原に対する感受性を比較した。この方法はまた、20人の結核患者のDESに対 する抗体応答の感受性を、他の病状を患う24人の患者（BCG接種）の1人と比較す るためにも行われた。図6で示したように、結核以外の他の病状を患う患者はDES 抗原に対して低レベルで反応する（1/100^c希釈血清について平均OD₄₀₅=1.07）。 ヒト型結核菌またはウシ型結核菌に感染した結核患者に由来する同じ抗原に対す る平均抗体応答はずっと感受性が強い（1/100^c希釈血清についてそれぞれOD₄₀₅= 0.32およびOD₄₀₅=0.36）。この免疫学的応答の感受性における差は、スチューデ ントのt₉₅検定（1/50^c，1/100^c，1/200^c，1/400^c，1/800^c，1/1600^cおよび1/320 0^c希釈血清でそれぞれ、t₉₅=5.18，6.57，6.16，5.79，4.43，2.53および1.95） によって示されたように、1/50^c〜1/3200^cのあらゆる希釈で統計上高い優位性を 示す。 肺結核または肺外結核を患う患者間で、抗体応答の感受性における差は認めら れなかった。 PhoA遺伝子融合法は新たなヒト型結核菌輸出抗原タンパク質の同定を可能にし た。 この37kDaのタンパク質は、第II類の二鉄-オキソタンパク質の特徴である保存 されたアミノ酸残基を含む。そのファミリー由来のタンパク質は活性に鉄イオン を要するあらゆる酵素である。それらにはリボヌクレオチドレダクターゼ、炭化 水素ヒドロキシラーゼおよびステアロイル-ACPデサチュラーゼが含まれる。ヒト 型結核菌DESタンパク質だけが、それらが葉緑体膜をわたって転流するような輸 出酵素でもある(Keegstra & Olsen，1989)植物のステアロイル-ACPデサチュラー ゼと有意な一致を示す（ヌクレオチドレベルでは44%一致、アミノ酸レベルでは3 0%一致）。この結果はDESタンパク質マイコバクテリアの脂肪酸の生合成に関与 している可能性があることを示唆するものである。さらには、脂質が細胞壁構成 要素の60%を示し、かつ、60〜90個の炭素原子を含有する多量のミコール酸の生 合成の一部が細胞室外で起こるので、細胞室外のこのタンパク質の局在化は脂質 代謝におけるその役割と一致すると考えられる。脂質代謝の種々の段階の総ての 中で、脱飽和反応が特に注目され、なぜなら第一には、それは非常にしばしば脂 質代謝の初期段階で起こるからであり、第二には、膜の不飽和率についてそれら が有する制御を通じて、それらがそれらの環境に対するマイコバクテリアの適応 に寄与するからである(Wheeler & Ratledge，1994)。ステアリン酸およびパルミ チン酸のCoA誘導体のこれに対応する△9−飽和脂肪酸への酸化脱飽和を触媒する ステアロイル-補酵素Aデサチュラーゼ（植物のステアロイル-ACPデサチュラーゼ の類似体）を含む酵素系がマイコバクテリウム・フレイ(Mycobacterium phlei) で生化学的に同定された(Fulco & Bloch，1962;Fulco & Bloch，1964;Kashiwaba ra & ai.，Kashiwabara & Sato，1964)。この系は膜構造にしっかりと結びつい ていることが示された(Fulco & Bloch，1973)。このように、ヒト型結核菌ステ アロイル−補酵素Aデサチュラーゼ（△9デサチュラーゼ）は輸出タンパク質であ ると考えられる。DESタンパク質を発現する大腸菌の超音波抽出物を、基質とし て（ステアロイル-CoA）¹⁴Cを用い、Legrand and Besadoun(1991)により記載さ れた方法に従い、△9脱飽和活性に関して検定した。しかしながら△9脱飽和活性 は検出されなかった。この結果はおそらく、電子伝達鎖および脱飽和系がin vit roで機能させることがしばしば困難である多くの補因子を含む複数の酵素複合 体であるという事実に結びついている。大腸菌とマイコバクテリアは脂質代謝の 点で非常に異なっており、ヒト型結核菌組換え△9デサチュラーゼは総ての補因 子および活性のために必要な関連酵素からなる大腸菌に配置されているとは限ら ず、また、それらと適切に相互作用するとは限らない。さらには、マイコバクテ リアの△9脱飽和過程に関与する総ての補因子が知られているわけではなく、そ れらはインキュベーション培地で見逃されているかも知れない。 しかしながら、もしDESタンパク質が△9デサチュラーゼをコードしているとす れば、驚くべき位置はその一次配列に関係している。実際に、これまでに下位列 決定されたあるゆる動物、真菌類および２例だけであるが細菌の△9デサチュラ ーゼ(Sakamoto et al.，1994)は、ヒスチジン保存残基を含むそれらの一次配列 に基づき第III類の二鉄-オキソタンパク質に分類されてきた(Shankil et al.，1 994)。植物の可溶性△9デサチュラーゼは、唯一、第II類の二鉄-オキソタンパク 質型の一次配列を有するデサチュラーゼである(Shanklin & Somerville，1991) 。植物型の△9デサチュラーゼを有する細菌はまだ見出されていない。 イムノブロッティングおよびELISA実験によって示されたように、DESタンパク 質は、疾病の形態（肺外結核または肺結核）によらず、試験したウシ型結核菌ま たはヒト型結核菌に感染したヒト患者の100%でB細胞応答を惹起する高い免疫抗 原である。それはまた、らい腫らい患者において抗体応答を惹起する。興味深い ことに、試験するためにはさらに多くの血清が必要であると考えられるが、結核 ウシはDES抗原を認識するとは思えない。さらに、ELISA実験では、DES抗原に対 するそれらの抗体応答の感受性に基づき、他の病状を患う患者と結核患者を識別 することが可能であることが示された。従って、DES抗原はヒト患者における結 核の血清診断に用いるための良好な候補である。試験された非結核患者がなぜDE Sタンパク質を低レベルで認識するのかという理由は、それらが総てBCG接種個体 （タンパク質を発現するBCG）であること、あるいは他の細菌性抗原によるそれ らの抗体応答の交差反応によるものである可能性がある。今興味深いことは、DE S抗原がそのB細胞エピトープ(epitotes)の他に有するかどうかを知ることである 。T細胞エピトープ(epitotes)は病原性マイコバクテリアに対する宿主の免疫応 答において唯一防御的なものである。もし、DESタンパク質も大部分の結核患者 におけるT細胞応答の良好な刺激剤であるなら、それを単独で、または抗原の「 カクテル」の一部として、結核に対するサブユニットワクチンの設計に用いるこ とができよう。 本明細書で引用された参考文献は下記頁に一覧化され、本明細書の開示の一部 とみなされる。 本発明の他の具体例も、明細書およびそこに開示された発明の実施を考慮すれ ば当業者には明らかであろう。明細書および実施例は単に例示のためのものであ り、本発明の真の範囲および精神は以下の請求の範囲により示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 第II類の二鉄-オキソタンパク質ファミリー由来の酵素をコードする精 製ＤＮＡであって、以下の核酸配列： を含んでなるＤＮＡ。 ２． ストリンジェントな条件下で請求項1記載の精製ＤＮＡとハイブリダイ ズする精製核酸。 ３． 8〜40ヌクレオチドの長さを有する、請求項2記載の精製核酸。 ４． 以下の配列： を有する請求項2記載の精製核酸。 ５． 以下の配列： を有する請求項2記載の精製核酸。 ６． 請求項1記載の精製ＤＮＡの総てまたは一部を含む組換えベクター。 ７． プラスミドpExp421である、請求項6記載の組換えベクター。 ８． 受託番号I-1718としてCNCMに寄託したプラスミドpET-desである、請求 項6記載の組換えベクター。 ９． 受託番号I-1719としてCNCMに寄託したプラスミドpBS-desである、請求 項6記載の組換えベクター。 １０． 請求項7〜9のいずれか1項に記載の組換えベクターで形質転換した組 換え原核生物または真核生物宿主。 １１． 大腸菌である請求項10記載の組換え宿主。 １２． 請求項1記載のＤＮＡによってコードされているポリペプチド。 １３． 以下の配列：を有する請求項12記載のポリペプチド。 １４． ペプチドがマイコバクテリウム種の細菌に感染した患者の血清中に存 在する抗体によって認識される、請求項13のポリペプチドのアミノ酸配列の一部 を有するペプチド。 １５． ヒト型結核菌に感染した患者の血清中に存在する抗体によって認識さ れる、請求項14記載のペプチド。 １６． マイコバクテリウム・ボビスに感染した患者の血清中に存在する抗体 によって認識される請求項14に記載のペプチド。 １７． 請求項12〜16のいすれか1項に記載のポリペプチドまたはペプチドを 認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体。 １８． 生物サンプル中のマイコバクテリウム種の細菌の存在の検出方法であ って、 a)溶媒に対して利用可能な生物サンプルの細菌ＤＮＡを作製し； b)請求項2〜5のいずれか1項に記載の精製核酸をストリンジェントな条件下で 工程a)の処理した生物サンプルとハイブリダイズさせ； c)精製核酸と生物サンプル中に存在する細菌ＤＮＡとの間で形成したハイブリ ッドを検出する工程を含んでなる方法。 １９． ハイブリダイゼーション工程b)の前に請求項2〜5のいずれか1項に記 載の精製核酸を用いるＤＮＡ増幅の工程をさらに含んでなる、請求項18記載の方 法。 ２０． 生物サンプル中のマイコバクテリウム種の細菌の存在の検出方法であ って、 a)請求項12〜16のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはペプチド患者の血 清と接触させ； b)ポリペプチドまたはペプチドと血清中に存在する抗体との間で形成した複合 体を検出する工程を含んでなる方法。 ２１． 請求項12〜16のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはペプチドを 含んでなる免疫組成物。 ２２． 以下の配列：を含有するプロモーターを含んでなる精製ＤＮＡ。