ES2226438T3 - Polinucleotidos y polipeptidos basb033 de neisseria meningitidis y sus usos. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID Nº:2, SEC ID Nº:4.

Description

Polinucleótidos y polipéptidos BASB033 de Neisseria meningitidis y sus usos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos, (en esta memoria descriptiva denominado como "polinucleótido(s) BASB033"), los polipéptidos codificados por ellos (denominados en esta memoria descriptiva como "BASB033" o "polipéptido(s) BASB033"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales como polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnósticos para detectar infección de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria Gram - negativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. Ocasionalmente produce enfermedades bacterianas invasivas tales como bacteremia y meningitis. La incidencia de la enfermedad meningocócica muestra diferencias estacionales y anuales geográficas (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18 - S24, 1989). La mayor parte de la enfermedad en países de clima templado se debe a cepas del serogrupo B y varía en incidencia entre 1 - 10/100.000/año de población total algunas veces alcanzando valores más altos (Kaczmarski, E. B. (1977), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55 - 9, 1995; Schloten, R. J. P. M., Bijlmer, H. A., Poolman, J. T. y col. Clin. Infect. Dis. 16: 237 - 246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar., y col. Epidemiol. Infect. 105: 119 - 126, 1990).

Las epidemias dominadas por los meningocococs de serogrupo A, la mayoría en África central, se encuentran, algunas veces que alcanzan niveles de hasta 1000/100.000/año (Schwartz, B., Moore. P. S., Broome, C. V. Clin Microbiol. Rev. 2 (suplemento) S18 - S24, 1989). Casi todos los casos como un conjunto de la enfermedad meningocócica están producidos por meningococos de los serogrupos A, B, C W-135 e Y y está disponible una vacuna de polisacáridos tetravalente A, C, W-135 Y (Armand. J., Arminjon, F., Mynard, M. C., Lafaix, C., J. Biol. Stan. 10: 335 - 339. 1982).

Las vacunas de polisacáridos se están actualmente mejorando mediante la conjugación química de ellos a proteínas de los vehículos (Lieberman, J. M., Chiu, S. S., Wong, V. K. y col., JAMA 275: 1499 - 1503, 1996).

Una vacuna del serogrupo B no está disponible, ya que el polisacárido capsular B se encontró que es no inmunogénica, la mayoría probablemente porque comparte similitud estructural con los componentes de los hospedadores (Wyle, F. A., Artenstein, M. S., Brandt, M. L. y col., J. Infect. Dis. 126: 514 - 522, 1972; Finne, J. M., Leinonen, M., Mäkelä, P. M. Lancet ii.: 355 - 357, 1983).

Se han iniciado y llevado a cabo durante muchos años esfuerzos para desarrollar vacunas a base de membranas externas meningocócicas (de Moraes, J. C., Perkins, B., Camargo, M. C. y col., Lancet 340: 1074 - 1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E. A. Gronnesby, J. K. y col., 338: 1093 - 1096, 1991). Tales vacunas han demostrado eficacias entre 57% - 85% en niños mayores (> 4 años) y adolescentes.

Muchos componentes de las membranas externas bacterianas están presentes en estas vacunas tales como PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB y la contribución de estos componentes a la protección observada necesita todavía definición adicional. Otros componentes de membranas externas bacterianas se han definido usando anticuerpos animales o humanos para que sean potencialmente relevantes a la inducción de inmunidad protectora, tales como TbpB y NspA (Martin, D., Cadieux, N., Hamel, J., Brodeux, B. R., J. Exp. Med. 185: 1173 - 1183, 1997; Lissolo, L., Maître - Wilmotte, C., Dumas. P y col., Inf. Immun. 63: 884 - 890, 1995). El mecanismo de inmunidad protectora implicará actividad bactericida mediada por anticuerpos y opsonofagocitosis.

Un modelo animal de bacteremia se ha usado para combinar todos los mecanismos mediados por anticuerpos (Saukkonen, K., Leinonen, M., Abdillahi, H. Poolman, J. T. Vaccine 7: 325 - 328, 1989). Está generalmente aceptado que el mecanismo bactericida mediada por los componentes complementarios tardíos es crucial para la inmunidad frente a una enfermedad meningocócica (Ross, S. C., Roseenthal P. J., Berberic, H. M., Densen, P. J. Infect. Dis. 155: 1266 - 1275, 1987).

La frecuencia de infecciones de Neisseria meningitidis se ha elevado de manera dramática en las pocas pasadas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de múltiples cepas resistentes a antibióticos y a la población creciente de personas con sistemas inmunes debilitados. Ya no es raro aislar cepas de Neisseria meningitidis que sean resistentes a algunos o todos los antibióticos habituales. Este fenómeno ha credo una necesidad médica no satisfecha y demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos, y ensayos de diagnósticos para este organismo.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a BASB033, en particular a los polipéptidos BASB033 y polinucleótidos BASB033, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, que incluyen prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otros. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos de diagnósticos para detectar enfermedades asociadas a infecciones microbianas y afecciones asociadas a tales infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de los polinucleótidos o polipéptidos BASB033.

Diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención descrita serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica a partir de la lectura y seguimiento de las descripciones siguientes y a partir de la lectura de otras partes de la presente descripción.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB033 como se describen en mayor detalle más adelante. En particular, la invención se refiere a los polipéptidos y polinucleótidos de BASB033 de Neisseria meningitidis, que está relacionada con la homología de la secuencia de aminoácidos a la proteína de la fosfolipasa A de las membranas externas de Klebsiella pneumoniae. La invención se refiere especialmente a BASB033 que tiene las secuencias de nucleótidos y aminoácidos establecidas en la SEC ID Nº: 1, 3 y la SEC ID Nº: 2, 4 respectivamente. Se entiende que las secuencias indicadas en el listado de secuencias más adelante como "DNA" representa una ejemplificación de una realización de la invención, ya que los expertos en la técnica reconocerán que tales secuencias se pueden emplear con utilidad en los polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la presente invención se proporcionan polipéptidos de Neisseria meningitidis denominados en esta memoria descriptiva "BASB033" y "polipéptidos BASB033" así como variantes biológicamente, profilácticamente, clínicamente o terapéuticamente útiles de los mismos, y las composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención además proporciona:

(a)

un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad, todavía más preferiblemente al menos 95% de identidad, lo más preferible al menos 97 - 99% o identidad exacta, a la SEC ID Nº: 2, 4;

(b)

un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad, todavía más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97 - 99% o identidad exacta, a la SEC ID Nº: 1, 3 en la longitud completa de las DEC ID números 1, 3 respectivamente; o

(c)

un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad, todavía más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97 - 99% o identidad exacta, a las SEC ID Nº: 2, 4;

Los polipéptidos BASB033 proporcionados en la SEC ID Nº 2, 4 son polipéptidos BASB033 de las cepas
ATCC13090 y H44/76 de Neisseria meningitidis.

La invención también proporciona un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB033, que es una porción contigua del polipéptido BASB033 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, 4. Es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) es capaz de inducir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido BASB033. Tal fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB033 que carece de la secuencia guía N-terminal, y/o un dominio transmembranas y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido el fragmento inmunogénico de BASB033 según la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido que tiene al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad, todavía más preferiblemente al menos 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos 97 - 99% de identidad, a la SEC ID Nº: 2, 4 en la longitud completa de la SEC ID Nº: 2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma parte pero no toda de cualquier secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB033, los fragmentos pueden estar "aislados" o comprendidos dentro de un polipéptido mayor del cual forman una parte o región, lo más preferiblemente como una región continua individual en un polipéptido mayor individual.

Los fragmentos preferidos, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº 2, 4 o de variantes de la misma, tal como una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoácidos amino- y/o carboxi terminal. También se prefieren las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas por o en una célula hospedadora. Además se prefieren los fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como los fragmentos que comprenden regiones de hélices alfa y formadoras de hélices alfa, regiones de hojas beta y formadoras de hojas beta, regiones de giros y formadoras de giros, regiones de espirales y formadoras de espirales, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficies, región que se une al sustrato, y regiones de alto índice antigénico.

Además los fragmentos preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, 4; o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o suprimidos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, 4.

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención se pueden emplear para producir el correspondiente polipéptido de longitud completa mediante la síntesis de péptidos; por lo tanto estos fragmentos se pueden emplear como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Se prefieren particularmente variantes en los que varios, 5 - 10, 1 - 5, 1 - 3, 1 - 2 ó 1 aminoácidos se sustituyen, suprimen, o añaden en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de la invención pueden estar en la forma de la proteína "madura" o puede ser una parte de una proteína mayor tal como un precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia adicional de aminoácidos que contiene secuencias secretoras o guías, pro - secuencias, secuencias que ayudan en la purificación tales como residuos múltiples de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Además, también se considera la adición de polipéptido exógeno o cola de lípidos o de secuencias de polinucleótidos para incrementar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión soluble modificadas por ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como una inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente la IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc se puede eliminar simplemente mediante la incorporación de una secuencia de escisión que se puede escindir con el factor Xa de coagulación sanguínea.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y al uso las mismas para el uso de selección de fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Los ejemplos de la tecnología de las proteínas de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de patentes internacionales números WO94/29458 y WO94/22914.

Las proteínas pueden estar conjugadas químicamente, o expresadas como proteínas de fusión recombinantes que permiten un incremento de niveles a producirse en un sistema de expresión comparado con la proteína no fusionada. El copartícipe de fusión puede ayudar proporcionando epítopos T auxiliares (copartícipe de fusión inmunológica), preferiblemente epítopos T auxiliares reconocidos por los seres humanos, o ayudan en la expresión de la proteína (potenciador de expresión) con rendimientos más altos que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente el copartícipe de fusión serán tanto un copartícipe de fusión inmunológica como copartícipe de potenciación de la expresión.

Los copartícipes de fusión incluyen la proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus de influenza, NS1 (hemaglutinina). Otro copartícipe de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferiblemente se usa la porción terminal C de la molécula. LytA se deriva de Streptococcus pneumoniae que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa, amidasa LytA, (codificada por el gen LytA {Gene, 43 (1986) páginas 265 - 272}) una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la estructura central de los peptidoglicanos. El dominio terminal C de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de colina tal como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LyaT de E. coli útil para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C- LyaT en su extremo amino {Biotechnology: 10, (1992) páginas 795 - 798}. Es posible usar la porción repetida de la molécula LytA en el extremo terminal C comenzando en el residuo 178, por ejemplo los residuos 188 - 305.

La presente invención también incluye variantes de los polipéptidos anteriormente mencionados, es decir los polipéptidos que varían entre los referentes mediante sustituciones conservadoras de aminoácidos, mediante los cuales un residuo está sustituido por otro con características similares. Tales sustituciones típicas están entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen los polipéptidos de origen natural, polipéptidos producidos recombinantemente, polipéptidos producidos sintéticamente, o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos se comprenden bien en la técnica.

Lo más preferido es que un polipéptido de la invención se derive de Neisseria meningitidis, sin embargo, se puede obtener preferiblemente a partir de otros organismos del mismo género taxonómico. También se puede obtener un polipéptido de la invención, por ejemplo, a partir de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Un objeto de la presente invención es proporcionar polinucleótidos que codifican los polipéptidos BASB033, particularmente los polinucleótidos que codifican el polipéptido denominado en esta memoria descriptiva BASB033.

En una realización particularmente preferida de la invención el polipéptido comprende una región que codifica los polipéptidos BASB033 que comprende una secuencia establecida en la SEC ID Nº: 1, 3 que incluye un gen de longitud completa o una variante del mismo.

Los polinucleótidos BASB033 proporcionados en las SEC ID números 1, 3 son los polinucléotidos BASB033 de las cepas de Neisseria meningitidis ATCC13090 y H44/76.

Como un aspecto adicional de la invención se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aislados que codifican y/o expresan los polipéptidos y polinucleótidos BASB033, particularmente los polipéptidos y polinucleótidos BASB033 de Neisseria meningitidis, incluyendo, por ejemplo, los RNa no procesados, los RNA de ribozimas, los mRNA, los cDNA, los DNA genómicos, los B - y Z-DNA. Las realizaciones adicionales de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos biológicamente, diagnósticamente, profilácticamente, clínicamente o terapéuticamente útiles, y las variantes de los mismos, y las composiciones que comprenden los mismos.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, que incluyen al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB033 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº: 2, 4 y los polinucleótidos estrechamente relacionados a ellas y las variantes de los mismos.

En otra realización particularmente preferida de la invención existe un polinucleótido BASB033 de Neisseria meningitidis que comprende o constituido por una secuencia de aminoácidos de las SEC ID números 2, 4 o una variante de las mismas.

Usando la información proporcionada en esta memoria descriptiva, tal como una secuencia de polinucleótidos establecida en la SEC ID Nº: 1, 3 un polinucleótido de la invención que codifica el polipéptido BASB033 se puede obtener usando procedimientos de clonación y selección habituales, tales como aquellos para clonación y secuenciación de fragmentos de DNA cromosómico de las bacterias que usan células de Neisseria meningitidis como material de partida, seguido de la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótidos de la invención, tal como una secuencia de polinucleótidos proporcionada en la SEC ID Nº: 1, 3, típicamente una genoteca de clones de DNA cromosómico de Neisseria meningitidis en E. coli o algún otro hospedador adecuado se sonda con algún otro oligonucleótido marcado radiactivamente, preferiblemente un 17-mero o más largo, derivado de una secuencia parcial. Los clones que portan DNA idéntico al de la sonda se pueden distinguir después usando condiciones de hibridación restringida. Mediante la secuenciación de los clones individuales así identificados mediante hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia de polipéptidos o polinucleótidos original es posible después extender la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar una secuencia de genes de longitud completa. Convenientemente, tal secuenciación se realiza, por ejemplo, usando DNA de doble hebra preparado a partir de un clon de plásmidos. Las técnicas adecuadas se describen en el documento de Maniatis, T., Fritsch, E. F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, segunda edición; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). (Véase en particular Screening By Hibridization 1.90 y Secuencing Denatured Double-Strnsded DNA Templates 13.70). La secuenciación directa de DNA genómico se puede realizar también para obtener una secuencia de genes de longitud completa. Ilustrativo de la invención, cada polinucleótido establecido en la SEC ID Nº: 1, 3 se descubre en una genoteca de DNA derivada de Neisseria meningitidis.

Además, cada secuencia de DNA establecida en las SEC ID Nº: 1,3 contiene una fase de lectura abierta que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de residuos de aminoácidos establecidos en las SEC ID Nº: 2, 4 con un peso molecular deducido que se puede calcular usando lo valores de los pesos moleculares de los residuos de aminoácidos bien conocidos por los expertos en la técnica.

El polinucleótido de la SEC ID Nº: 1, entre el codón de partida en el nucleótido número 1 y el codón de parada que comienza en el nucleótido número 1126 de la SEC ID Nº: 1, codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 2.

El polinucleótido de la SEC ID Nº: 3, entre el codón de partida en el nucleótido número 1 y el codón de parada que comienza en el nucleótido número 1123 de la SEC ID Nº: 3, codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 4.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o esta constituido por:

(a)

una secuencia de polinucléotidos que tiene al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad, todavía más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97 - 99% o identidad exacta, a las SEC ID Nº: 1, 3 en la longitud completa de la SEC ID números 1, 3 respectivamente; o

(b)

una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad, todavía más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97 - 99% o 100% exacta, a la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2, 4 en la longitud completa de la SEC ID Nº: 2, 4 respectivamente.

Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de las especies diferentes de Neisseria meningitidis, se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de selección de una genoteca apropiada en condiciones de hibridación restringidas (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo entre 45 y 65ºC y una concentración de SDS entre 0,1 - 1%) con una sonda marcada o detectable constituida por o que comprende la secuencia de la SEC ID Nº: 1, 3 o un fragmento de los mismos; y aislamiento de un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos.

La invención proporciona una secuencia de polinucleótidos idéntica en su longitud completa a una secuencia codificadora (fase de lectura abierta) en la SEC ID Nº: 1, 3. La invención también se proporciona una secuencia codificadora de un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por sí misma así como una secuencia codificadora de un polipéptido maduro o un fragmento en la fase de lectura con otra secuencia codificadora, tal como una secuencia que codifica una secuencia guía o secretora, una secuencia de pre-, o pro- o prepro - proteína. El polinucleótido de la invención también puede contener al menos una secuencia no codificadora, que incluye, por ejemplo, pero no se limita a al menos una secuencia no codificadora en 5' y 3', tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como las señales de terminación dependientes de rho ye independientes de rho), sitios de unión a los ribosomas. Las secuencias de Kozak, secuencias que estabilizan mRNA, intrones y señales de poliadenilación.

La secuencia de polinucleótidos también puede comprender una secuencia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, se puede codificar una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido condensado. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa - histidina, como se proporciona en el vector pQE (Quiagen, Inc.) y descrito en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos 86: 821 - 824 (1989), o una marca de péptidos HA (Wilson y col., Cell 37: 767 (1984), ambas pueden ser útiles en la purificación de la secuencia de polipéptidos condensados a ellas. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión génica.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB033 de las SEC ID Nº: 2, 4 puede ser idéntica al polinucleótido que codifica la secuencia contenida en los nucleótidos 1 a 1125 de la SEC ID Nº: 1, o el polipéptido que codifica la secuencia que codifica contenida en los nucleótidos 1 a 1122 de la SEC ID Nº: 3, respectivamente. Como alternativa puede ser una secuencia, que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 2, 4.

La expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" como se usa en esta memoria descriptiva comprende polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido de la Neisseria meningitidis BASB033 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida la SEC ID Nº: 2, 4. El término también comprende polinucleótidos que incluye una región continua individual o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrado, una secuencia de transposón integrado, o debido a la edición de RNA o a la reorganización de DNA genómico) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias codificadoras y/o no codificadoras.

La invención además se relaciona a variantes de los polinucleótidos descritos en esta memoria descriptiva que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia deducida de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2,4.

Los fragmentos de los polinucleótidos de la invención se pueden usar, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la invención.

Además las realizaciones particularmente preferidas son polinucleótidos que codifican variantes de BASB033, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB033 de la SEC ID Nº: 2,4 en las que varias, unas pocas, 5 a 10,1 a 5,1 a 3, 3,1 o ningún residuo de aminoácidos están sustituidos, modificados, suprimidos y/o añadidos, en cualquier combinación. Especialmente preferidos entre éstos son substituciones, adiciones y supresiones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB033.

Además las realizaciones particularmente preferidas de la invención son polinucleótidos que son al menos 85% idénticos en su longitud completa a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB033 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en las SEC ID Nº: 2,4 y polinucleótidos que son complementarios a tales polinucleótidos. A este respecto, los polinucleótidos al menos 90% idénticos en su longitud completa a mismo se prefieren particularmente, y entre estos polinucleótidos particularmente preferidos, aquellos con al menos 95% se prefieren especialmente. Además, aquellos con al menos 97% se prefieren altamente entre aquellos con al menos 95%, y entre estos aquellos con al menos 98% y al menos 99% se prefieren muy particularmente, siendo al menos 99% los más preferidos.

Las realizaciones preferidas son polinucleótidos que codifican polinucleótidos que conservan sustancialmente la misma función o actividad biológica como el polipéptido maduro codificado por un DNA de la SEC ID Nº: 1,3.

De acuerdo a ciertas realizaciones preferidas de esta invención se proporcionan polinucleótidos que hibridizan, particularmente en condiciones restringidas a las secuencias de polinucleótidos en la SEC ID Nº: 1,3.

La invención se refiere adicionalmente a polinucleótidos que se hibridizan a las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en esta memoria descriptiva. A este respecto, la invención especialmente se refiere a polinucleótidos que se hibridizan en condiciones restringidas a los polinucleótidos descritos en esta memoria descriptiva. Como se usan en esta memoria descriptiva, las expresiones "condiciones restringidas" y "condiciones de hibridación restringidas" significan hibridación que se produce solamente si hay al menos 95% y preferiblemente al menos 97% de identidad entre las secuencias. Un ejemplo específico de las condiciones de hibridación restringidas es la incubación durante una noche a 42ºC en una solución que comprende: 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 microgramos/ml de DNA de esperma fraccionado, desnaturalizado de salmón, seguido de lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de lavado e hibridación se conocen bien y se ejemplifican en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), particularmente el capítulo 11 de este documento. La hibridación en solución también se puede utilizar con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención.

La invención también proporciona un polinucleótido constituido por o que comprende una secuencia de polinucleótidos establecida en las SEC ID Nº: 1, 3 en condiciones restringidas de hibridación con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia de polinucleótidos establecida en la SEC ID Nº: 1, 3 o un fragmento de la misma; y aislamiento de dicha secuencia de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener tal polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores descritas en otra parte en esta memoria descriptiva.

Como se describe en esta memoria descriptiva en esta memoria descriptiva con relación a los ensayos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, se pueden usar como una sonda de hibridación para RNA, cDNA y DNA genómico para aislar os cDNA de longitud completa y clones genómicos que codifican BASB033 y para aislar cDNA y clones genómicos de otros genes que tienen una identidad alta, particularmente alta identidad de secuencia al gen de BASB033. Tales sondas generalmente comprenderán al menos 15 residuos de nucleótidos o pares de bases. Preferiblemente, tales sondas tendrán al menos 30 residuos de nucleótidos o pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos de nucleótidos o pares de bases. Particularmente las sondas preferidas tendrán al menos 20 residuos de nucleótidos o bases de pares y tendrán menos de 30 residuos de nucleótidos o pares de bases.

Una región que codifica un gen de BASB033 se puede aislar mediante selección usando una secuencia de DNA proporcionada en las SEC ID números: 1, 3 para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invenciones se usa después para seleccionar una genoteca de cDNA, DNA genómico o mRNA para determinar que miembros de la genoteca se hibridiza a la sonda.

Existen varios procedimientos disponibles y que conocen bien los expertos en la técnica para obtener los DNA de longitud completa, o se extienden a los DNA cortos, por ejemplo los basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de cDNA (abreviadamente en inglés RACE) (véase por ejemplo, Frhoman, y col., PNAS Estados Unidos 85: 8998 - 9002, 1988). Las modificaciones recientes de la técnica, ejemplificadas por ejemplo por la tecnología de Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.), han simplicado significativamente la investigación para los DNA más largos. En la tecnología de Marathon™, los cDNA se han preparado a partir de mRNA extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada en cada extremo. Después la amplificación de ácidos nucleicos (PCR) se lleva a cabo para amplificar la "pérdida" en el extremo 5' del DNA usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos de adaptadores y específicos de los genes. Después la reacción de PCR se repite usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para reasociarse dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico adaptador que se reasocia después en 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico del gen que se reasocia anteriormente en 5' en la secuencia génica seleccionada). Después los productos de esta reacción se pueden analizar mediante la secuenciación de DNA y el DNA de longitud completa construido uniendo el producto directamente al DNA existente para dar una secuencia completa, o llevando a cabo una PCR de longitud completa separada usando la nueva información de secuencias para el diseño del cebador en 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden emplear, por ejemplo, como reactivos de investigación y materiales para el descubrimiento de tratamientos y diagnosis de enfermedades, particularmente enfermedades humanos, como posteriormente se describe en esta memoria descriptiva relativos a ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de las SEC ID números:
1 - 4 se pueden usar en los procedimientos en esta memoria descriptiva como se ha descrito en esta memoria descriptiva, pero preferiblemente para PCR con el fin de determinar si o no los polinucleótidos identificados en esta memoria descriptiva en la totalidad o en parte se transcriben en bacterias en tejidos infectados. Se reconoce que tales secuencias también tendrán utilidad en la diagnosis de la fase de infección y tipo de infección que el patógeno ha alcanzado.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos adicionales amino terminal o carbono terminal, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (por ejemplo, cuando la forma madura tiene más de una cadena de polipéptidos). Tales secuencias pueden jugar un papel en el procesamiento de una proteína del precursor de una forma madura, puede permitir el transporte de las proteínas, puede alargar o acortar la semivida de las proteínas o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo de producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in vivo, los aminoácidos adicionales se pueden procesar fuera de la proteína madura mediante enzimas celulares.

Para cada uno y todo polinucleótido de la invención se proporciona un polinucleótido complementario a él. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios para cada polinucleótido para cada polinucleótido con el que son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polinucleótido condensada a una o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se retiran las prosecuencias tales precursores inactivos generalmente se activan. Alguna o todas las prosecuencias se pueden retirar antes de la activación. Generalmente, tales precursores se llaman proproteínas.

Además de las representaciones habituales A, G, C, T/U para nucleótidos, el término "N" se puede también usar en la descripción de ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de DNA o RNA pueden aparecer en tal posición designada en la secuencia de DNA o RNA, excepto se prefiere que N no sea ácido nucleico cuando se toma en combinación con posiciones de nucleótidos adyacentes, cuando leen en la fase de lectura correcta, tendría el efecto de generar un codón de terminación prematura en tal fase de lectura.

En suma, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia guía (que se puede denominar una preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son las secuencias guías de una preproteína, o una preproteína, que es una precursora de una preproteína, que tiene una secuencia guía y una o más prosecuencias, que generalmente se retiran durante las etapas del procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para propósitos terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética preferiblemente empleará un procedimiento de distribución adecuado tal como una inyección directa de DNA de plásmidos en los músculos (Wolff y col., Hum Mol Genet (1992) 1: 363, Manthorpe y col., HUm Gene Ther (1983) 4: 419), distribución de un DNA complejado con vehículos específicos de proteínas (Wu y col., J Biol Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de DNA con fosfato de calcio (Benvenisty & Reshef. PNAS USA, (1986) 83: 9551), encapsulación de DNA en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12: 791 e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seerger y col., PNAS USA, (1984) 81:5849).

Vectores células hospedadoras, sistemas de expresión

La invención también se refiere a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células hospedadoras que están modificadas por ingeniería genética con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Los sistemas de traducción exentos de células también se pueden emplear para producir tales proteínas usando los RNA derivados de las construcciones de DNA de la invención.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica a partir de células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células hospedadoras que están modificadas por ingeniería genética con tales sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Para la producción de recombinantes de los polipéptidos de la invención, las células hospedadoras se pueden modificar genéticamente para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de polinucleótidos en la célula hospedadora se puede efectuar mediante procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio habituales, tal como Davis y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) Y Sambrook, y col. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) tal como, transfección con fosfato con calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga con desprendimiento, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, estreptomices, cianobacterias, Bacillus subtilis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis; células fúngicas, tales como células de una levadura Kluveromyces, Saccaromyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insectos tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera St9; células de animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células de plantas, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Se puede usar una gran diversidad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores derivados de cromosomas, de epitomas y de virus, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la seudorrabia, picornavirus, retrovirus, y alfavirus y vectores derivados de las combinaciones de los mismos, tales como los derivados de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Las construcciones del sistema de expresión pueden contener regiones control que regulan y dan lugar a la expresión. Generalmente, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polinucleótido en un hospedador se puede usar para expresión a este respecto. La secuencia apropiada de DNA se puede insertar en el sistema de expresión mediante cualquiera de una diversidad de técnicas rutinarias bien conocidas, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (anteriormente).

En los sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para la secreción de una proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el ambiente extracelular, señales de secreción apropiadas se pueden incorporar en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser exógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención se pueden recuperar y purificar de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato amónico o con etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatita, y cromatografía en lecitina. Lo más preferiblemente, cromatografía de afinidad con iones metales (abreviadamente en inglés IMAC) se emplea para purificación. Se pueden emplear técnicas bien conocidas para replegar proteínas con el fin de regenerar la conformación activa cuando se desnaturaliza el polipéptido durante la síntesis intracelular, aislamiento o purificación.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o una bacteria. El gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo conducirá a la expresión in vivo de un antígeno e inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias usados para este propósito son por ejemplo: virus de viruela (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar, viruela de canarios) alfavitus (virus Sindbis, virus del bosque Semliki, virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus asociados a adeno, picornavirus (virus de la polio, rinovirus), herpesvirus (virus zoster de la varicela, etc), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o atenuados de diversas maneras con el fin de obtener vacunas vivas. Tales vacunas vivas también forman parte de la invención.

Ensayos de diagnóstico, de pronóstico, de determinación de serotipos y de mutaciones

Esta invención también se refiere al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB033 de la invención para uso como reactivos de diagnósticos. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB033 en un eucariota, particularmente un mamífero, y especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento de diagnóstico para la diagnosis de una enfermedad, determinar la fase de enfermedad o respuesta de un organismo infeccioso a los fármacos. Los eucariotas, particularmente mamíferos, y especialmente seres humanos, particularmente los infectados o sospechosos de estar infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BAB033, se pueden detectar a nivel de ácidos nucleicos o aminoácidos mediante una diversidad de técnicas bien conocidas así como mediante procedimientos proporcionados en esta memoria descriptiva.

Los polipéptidos y polinucleótidos para prognosis, diagnosis u otros análisis se pueden obtener a partir de materiales supuestamente infectados y/o de cuerpos de individuos infectados. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente DNA o RNA, se pueden usar directamente para la detección o se pueden amplificar enzimáticamente usando PCR o cualquier técnica de amplificación antes de análisis. RNA, particularmente mRNA, cDNA y DNA genómico también se pueden usar de la misma forma. Usando amplificación, caracterización de la especie y cepa de un organismo infeccioso o residente presente en un individuo, se puede obtener mediante análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Se pueden detectar supresiones e inserciones mediante un cambio de tamaño del producto amplificado en comparación a un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada entre un organismo relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o de una cepa diferente de la misma especie. Se pueden identificar mutaciones puntuales hibridizando DNA amplificado a secuencias de polinucleótidos BASB033 marcados. Secuencias perfectamente o significativamente igualadas se pueden distinguir de híbridos apareados imperfectamente o más significativamente por digestión con DNasa o RNAasa, para DNA o RNA respectivamente, o mediante la detección de diferencias de temperaturas de fusión o cinética de renaturalización. Las diferencias de las secuencias de polinucleótidos también se pueden detectar mediante alteraciones en la mobilidad electroforética de los fragmentos de polinucleótidos en geles comparadas con una secuencia de referencia. Esto se puede llevar a cabo con o sin agentes desnaturalizantes. Las diferencias de polinucleótidos también se pueden detectar mediante secuenciación directa de DNA o RNA. Véase, por ejemplo, Myers y col., Science, 230: 1242 (1985). Los cambios de secuencias en localizaciones específicas también se pueden revelar mediante ensayos de protección de nucleasas, tales como ensayo de protección de RNasa, VI y S1 o un agente químico de escisión. Véase, por ejemplo, Cotton y col., Proc Nat. Acad Sci. USA, 85: 4397 - 4401 (1985).

En otra realización, una disposición de sondas de oligonucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos BASB033 o fragmentos de la misma se pueden construir para llevar a cabo rastreo eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación o identificación taxonómica. Los procedimientos de la tecnología de disposiciones se conocen bien y tienen aplicabilidad general y se pueden utilizar para dirigir una diversidad de cuestiones en genética molecular incluyendo expresión génica, unión genética, y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col., Science 274: 610(1996)).

Así pues, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a)

un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1, 3, o un fragmento de la misma;

(b)

una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c)

un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de la SEC ID Nº 2, 4 o un fragmento de la misma; o

(d)

un anticuerpo de un polipéptido de la presente invención, preferiblemente del polipéptido de la SEC ID Nº: 2, 4.

Se apreciará que en cualquiera de ducho kit, (a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Tal kit será útil en la diagnosis de una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, entre otros.

La invención también se refiere al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnósticos. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferiblemente, la SEC ID Nº 1, 3, que está asociada a la enfermedad o patogenicidad proporcionará una herramienta de diagnóstico que se puede añadir a, o definir, una diagnosis de una enfermedad, una prognosis de un curso de una enfermedad, una determinación de una fase de una fase de enfermedad, o una susceptibilidad a una enfermedad, que se produce de una expresión inferior, expresión superior o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, particularmente organismos infecciosos, que llevan mutaciones en tal polinucleótido se pueden detectar a nivel de polinucleótidos mediante una diversidad de técnicas, tales como las descritas en otra parte en esta memoria descriptiva.

Las células de un organismo que llevan mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención también se pueden detectar a nivel de los polinucleótidos o polipéptidos mediante una diversidad de técnicas, que permiten por ejemplo, determinar el serotipo. Por ejemplo, RT - PCR se puede usar para detectar mutaciones en el RNA. Se prefiere particularmente usar RT - PCR junto con sistemas de detección automáticos, tales como, por ejemplo, GeneScan, RNA, cDNA o DNA genómico también se pueden usar para el mismo fin, PCR. Como ejemplo, los cebadores de la PCR complementarios a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASN033 se puede usar para identificar y analizar mutaciones.

La invención además proporciona cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos retirados de el extremo 5' y/o 3'. Los cebadores se pueden usar para, entre otras cosas, amplificar DNA y/o RNA de BASB033 aislado de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores se pueden usar para amplificar un polinucleótido aislado de un individuo infectado, de manera que después el polinucleótido se puede someter a diversas técnicas para esclarecer la secuencia de los polinucleótidos. De esta forma, las mutaciones en la secuencia de polinucleótidos se pueden detectar y usar para diagnosticar y pronosticar la infección o su fase o curso, o determinar el serotipo y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención además proporciona un procedimiento para diagnosticar una enfermedad, preferiblemente infecciones bacterianas, más preferiblemente infecciones producidas por Neisseria meningitidis, que comprende la determinación de una muestra derivada de un individuo, tal como material corporal, un incremento del nivel de expresión del polinucleótido que tiene una secuencia de SEC ID Nº: 1, 3. El aumento o disminución de expresión de un polinucleótido BASB033 se puede medir usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tal como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT - PCR, protección de RNasa, transferencia de Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, un ensayo de diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la expresión superior del polipéptido BASB033 comparado con muestras de tejidos de control normales se pueden usar, por ejemplo, para detectar la presencia de una infección. Se pueden usar técnicas de ensayo para determinar niveles de un polipéptido BASB033, en una muestra derivada se un hospedador, tal como un material corporal, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales procedimientos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de Western, ensayos de sándwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos
ELISA.

Los polinucleótidos de la invención también se pueden usar como componentes de las disposiciones de polinucleótidos, preferiblemente disposiciones o grupos de alta densidad. Estas disposiciones de alta densidad son particularmente útiles para propósitos de diagnóstico y de pronóstico. Por ejemplo, un conjunto de manchas comprendiendo cada una un gen diferente, y además comprendiendo un polinucleótido o plinucleótidos de la invención, se pueden usar para sondar, tal como uso de hibridación o amplificación de ácidos nucleicos, usando una sonda obtenida o derivada de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia particular de polinucleótidos o secuencia relativa en un individuo. Tal presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Neisseria meningitidis, y puede ser útil en la diagnosis y/o prognosis de una enfermedad o un curso de una enfermedad. Se prefiere una retícula que comprenda un número de variantes de la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº: 1, 3. También se prefiere una disposición que comprende un número de variantes de una secuencia de polinucleótidos que codifica que codifica la secuencia de polinucleótidos de la SEC ID Nº: 2, 4.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de los mismos, o células que expresan los mismos se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para tales polipéptidos o polinucleótidos respectivamente.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos BASB033.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención se pueden obtener mediante la administración de los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos que llevan epítopos de cualquier o ambos, análogos de cualquiera o ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un animal, preferiblemente uno no humano, usando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica conocida en la técnica que proporcione anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares continuos. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como las descritas en el documento de Kohler, G y Milstein, C., Nature 256: 495 - 497 (1975); Kozbor y col., Imunology Today 4: 72 (1983); Cole y col., pág. 77 - 96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de una cadena (Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778) se puede adaptar a anticuerpos de una cadena de polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. También, ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, se pueden usar para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos a los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

Como alternativa, se puede utilizar tecnología de exposición de fagos para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un polipéptido de la invención bien de los repertorios de los genes v amplificados por PCR de linfocitos de seres humanos seleccionados por poseer anti- BASN033 o de genotecas naturales (McCafferty, y col., (1990) Nature 348, 552 - 554; Marks, y col., (1992) Biotechnology 10, 779 - 783). La afinidad de estos anticuerpos también se puede mejorar mediante, por ejemplo, mezcla de cadenas (Clackson y col., (1991) Nature 352: 628).

Los anticuerpos descritos anteriormente se pueden emplear para aislar o identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

Así pues, entre otros, los anticuerpos contra el polipéptido BASB033 0 polinucleótido BASB033 se pueden emplear para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes de polipéptidos incluyen variantes equivalentes antigénicamente, epitópicamente o inmunológicamnte forman un aspecto particular de esta invención.

Preferiblemente, el anticuerpo o variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunógeno en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano el anticuerpo más preferiblemente puede "humanizarse", cuando la complementariedad que determina la región o regiones del anticuerpo derivado de hibridoma se ha transplantado en un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo, como describe Jones y col., (1986), Nature 321, 522 - 525 o Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266 - 273.

Ensayos y moléculas de antagonistas y agonistas

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención también se pueden usar para determinar la unión de sustratos y ligandos de pequeñas moléculas en, por ejemplo, células, preparaciones sin células, genotecas químicas, y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales pueden ser o imitadores estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, Coligan y col., Current Protocols in Immunology 1 (2): capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de selección pueden medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que llevan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido por medio de un marcador directa o indirectamente asociado al compuesto candidato. Como alternativa, el procedimiento de selección puede implicar competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de selección pueden probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por activación o inhibición del polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para la célula que comprende el polipéptido o polinucleótido. Los inhibidores de activación generalmente se ensayan en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación mediante el agonista por la presencia del compuesto candidato. El polipéptido constitutivamente activo y/o polipéptidos y polinucleótidos constitutivamente expresados se pueden emplear en los procedimientos de selección de agonistas o inhibidores inversos, en ausencia de un agonista o inhibidor, ensayando si el compuesto candidato da como resultado la inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso. Además, los procedimientos de selección pueden comprender simplemente las etapas de mezcla de un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, midiendo la actividad del polipéptido o polinucleótido BASB033 en la mezcla, y comparando la actividad del polipéptido o polinucleótido BASB033 de la mezcla con un patrón. Las proteínas de fusión, tales como las preparadas a partir de una porción Fc y polipéptido BASB033, como se ha descrito anteriormente, también se pueden usar para ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos relacionados filogenética y/o funcionalmente (véase D. Bennett y col., J Mol Recognition, 8: 52 - 58 (1995); y K. Johanson y col., J Biol Chem, 270 (16): 9459 - 9471 (1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen y/o interactúan con un polipéptido de la presente invención también se pueden usar para configurar procedimientos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de mRNA y/o polipéptido en células. Por ejemplo, se puede construir un ensayo ELISA para medir niveles secretados o asociados a células de polipéptidos usando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos habituales conocidos en la técnica. Esto se puede usar para descubrir agentes que pueden inhibir o aumentar la producción de un polipéptido (también llamado antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados.

La invención también proporciona un procedimiento de selección de compuestos para identificar aquellos que aumentan (agonista) o bloquean (antagonista) la acción de polipéptidos o polinucleótidos BASB033, particularmente aquellos compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de selección puede implicar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para seleccionar agonistas o antagonistas, una mezcla de reacción sintética, un compartimiento celular, tal como una membrana, envuelta de membrana o pared celular, o una preparación de cualquiera de los mismos, que comprende un polipéptido BAAB033 y un sustrato o ligando marcado de tal polipéptido se incuba en ausencia o presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista de BASB033. La capacidad de la molécula candidata para agonizar o antagonizar el polipéptido BASB033 se refleja en la unión disminuida del ligando marcado o disminución de la producción del producto de tal sustrato. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB033 son lo más probable que sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y, como puede ser el caso, incrementan la velocidad de producción del producto a partir del sustrato, incrementan la señal de transducción, o incrementan la actividad de los canales químicos son agonistas. La detección de la velocidad o nivel de, como puede ser el caso, la producción del producto a partir del sustrato, transducción de la señal, o actividad de los canales químicos se puede aumentar usando un sistema indicador. Los sistemas indicadores que pueden ser útiles a este respecto incluyen pero no se limitan a sustrato colorimétrico, marcado convertido en producto, un gen indicador que es sensible a cambios en la actividad de los polinucleótidos o polipéptidos BASB033, y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para los agonistas de BASB033 es un ensayo competitivo que combina BASB033 y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB033, moléculas de unión a BASB recombinantes, sustratos o ligandos naturales, o imitadores de ligandos o sustratos, en condiciones apropiados para un ensayo de inhibición competitiva. BASB033 se puede marcar, tal como mediante radiactividad o un compuesto colorimétrico, de manera que el número de las moléculas de BASB033 unidas a una molécula de unión o convertida en un producto de puede determinar exactamente para determinar la eficacia del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polinucleótido de la invención y por lo tanto inhiben o suprimen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína relacionada estrechamente o anticuerpo que une los mismos sitios sobre una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir las actividades inducidas por BASB033, evitando por lo tanto la acción o expresión de los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB033 mediante la exclusión de la unión de los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB033.

Los antagonistas potenciales incluyen una molécula pequeña que se une y ocupa el sitio de unión del polipéptido por lo tanto evitando la unión a moléculas de unión celular, de manera que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a moléculas pequeñas orgánicas, péptidos o moléculas de tipo péptido. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido (véase Okano, J. Neurochem 56: 560 (1991); OLIGONUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESION, crc Press, Boca Raton, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relativos a y variantes de BASB033.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas por ingeniería genética que comprende un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversa porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). La parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgG1 se prefiere como una inmunoglobulina, cuando la fusión tiene lugar en la región bisagra. En una realización particular, la parte Fc se puede retirar simplemente mediante la incorporación de una secuencia de escisión que se puede escindir con un factor Xa de coagulación de sangre. Además, esta invención se refiere a un procedimiento APRA la preparación de estas proteínas de fusión mediante ingeniería genética, y para el uso de las mismas para la selección de fármacos, diagnosis y terapia. Un aspecto adicional de la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Los ejemplos de la tecnología de proteínas de fusión se pueden encontrar en las solicitudes de las patentes internacionales números WO94/29458 y WO94/22914.

Cada una de las secuencias polinucleótidos proporcionadas en esta memoria descriptiva se pueden usar en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, tras la expresión, se puede usar como una diana para la selección de fármacos antibacterianos. Adicionalmente, las secuencias de polinucleótidos que codifican las regiones amino terminal de la proteína codificada o de Shine - Delgarno u otra traducción que facilita las secuencias del mRNA respectivo se pueden usar para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia codificadora de interés.

La invención también proporciona en uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención que interfiere con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos u un eucariótico, preferiblemente un mamífero, hospedador responsable para la secuela de infección. En particular, las moléculas de la invención se pueden usar: en la prevención de la adhesión de bacterias, en particular bacterias gram positivas y/o gram negativas, a eucarióticos; preferiblemente mamíferos, proteínas de la matriz extracelular o dispositivos internos o a proteínas de la matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre eucarióticos, preferiblemente mamíferos, proteínas de la matriz extracelular y proteínas de BASB033 bacterianas que median la lesión tisular y/o para bloquear la progresión normal de la patogénesis en infecciones iniciadas distintas de la implantación de dispositivos internos o mediante otras técnicas quirúrgicas.

De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporcionan agonistas y antagonistas de BASB033, preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas de la invención se pueden emplear, por ejemplo, para evitar, inhibir y/o tratar enfermedades.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a mimotopos del polipéptido de la invención. Un mimotopo es una secuencia de péptidos, suficientemente similar al péptido nativo (secuencial o estructuralmente), que es capaz de ser reconocido por los anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o es capaz de activar anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando se acopla a un vehículo adecuado.

Los mimotopos de péptidos se pueden diseñar para un propósito adicional mediante la adición, supresión o sustitución de aminoácidos elegidos. Así pues, los péptidos se pueden modificar para los propósitos de fácil conjugación a un vehículo proteico. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química que incluyen una cisteína terminal. Además puede ser deseable para péptidos conjugados a un vehículo proteico que incluye un extremo hidrófobo distal del extremo conjugado del péptido, de manera que el extremo no conjugado libre del péptido permanece asociada a la superficie de la proteína del vehículo. Por lo tanto presentando el péptido en una conformación que se parece muy estrechamente a la del péptido encontrado en el contexto de la molécula nativa completa. Por ejemplo, los péptidos se pueden alterar para que tengan una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba C-terminal. Como alternativa, la adición o sustitución de una forma D-estereoisómera de uno o más de los aminoácidos se puede realizar para crear un derivado beneficioso, por ejemplo para mejorar la estabilidad del péptido.

Como alternativa, los mimotopos de péptidos se pueden identificar usando anticuerpos que son capaces ellos mismos de unirse a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como la tecnología de exposición de fagos (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica, genera un gran número de secuencia de péptidos que imitan la estructura de los péptidos nativos y son, por lo tanto, capaces de unirse a anticuerpos de péptidos anti- nativos, pero no necesariamente ellos mismos comparten la homología significativa de las secuencias al polipéptido nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente seres humanos, que comprende la inoculación del individuo con polinucleótido y/o polipéptido, o un fragmento o variante de los mismos, adecuados para producir respuesta inmune de anticuerpos y/o de células T para proteger dicho individuo de infección, particularmente infección bacteriana y lo más particularmente infección por Neisseria meningitidis. También se proporciona procedimientos en los que dicha respuesta inmunológica retarda la replicación bacteriana. Todavía otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de inducción de respuesta inmunológica en un individuo que comprende la distribución a tal individuo de un vector de ácido nucleico, secuencia o ribozima para dirigir la expresión del polinucleótido y/o polipéptido BASB033, o un fragmento o una variante de los mismos, para expresar el polinucleótido y/o polipéptido BASB033, o un fragmento o una variante de los mismos in vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica, tal como, para producir respuesta inmune de anticuerpos y/o células T, que incluye, por ejemplo, células T productoras de citosina o células T citotóxicas, para proteger dicho individuo, preferiblemente un ser humano, de una enfermedad, si esa enfermedad ya está establecida dentro del individuo o no. Un ejemplo de la administración del gen es mediante la aceleración en las células deseadas como un recubrimiento sobre partículas o de otra manera. Tal vector de ácido nucleico puede comprender DNA, RNA, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de DNA/RNA, un complejo DNA - proteína o un complejo RNA - proteína.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un ser humano, capaz de haber inducido una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en tal individuo a un polinucleótido y/o polipéptido codificado a partir de ellos, donde la composición comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB033 recombinante codificado a partir de ellos y/o comprende DNA y/o RNA que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido BASB033, polipéptido codificado a partir de ellos, u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica se puede usar terapéutica o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad del anticuerpo y/o inmunidad celular, tal como inmunidad celular que surgen de CTL o células T CD4.

Un polipéptido BASB033 o un fragmento del mismo se puede condensar con una co-proteína o resto químico que puede o no puede por él mismo producir anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína condensada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras. Así pues, la proteína recombinante condensada, comprende además preferiblemente una co-proteína antigénica, tal como la lipoproteína D de Haemophilus influenzae, la glutatión S-transferasa (abreviadamente en inglés GST) o beta - galactosidasa, o cualquier otra co-proteína relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Además, la co-proteína puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La co-proteína puede estar unida al extremo amino o carboxi de la primera proteína.

Esta invención proporciona composiciones, particularmente composiciones de vacunas, y procedimientos que comprenden loa polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de DNA inmunoestimuladoras, tales como las descritas en Sato, Y. y col., Science 273: 352 (1996).

También, esta invención proporciona procedimientos que usan el polinucleótido o fragmentos particulares del mismo descritos, que se han mostrado que codifican regiones no variables de proteínas de la superficie celular bacteriana, en construcciones de polinucleótidos usados en tales experimentos de inmunización genéticos en modelos de animales de infección con Neisseria meningitidis. Tales experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopos de proteínas capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que este planteamiento permitirá la preparación posterior de anticuerpos monoclonales de valor particular, derivados del órgano requerido del animal que resiste con éxito o elimina la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, particularmente infección con Neisseria meningitidis, en mamíferos, particularmente seres humanos.

La invención también incluye una formulación de vacunas que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ya que los polipéptidos y polinucleótidos se pueden descomponer en el estómago, cada uno se administra preferiblemente por vía parenteral, incluyendo, por ejemplo, la administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estéril acuosa y no acuosa que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con el fluido corporal, preferiblemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas o no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitarias o multidosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales se pueden almacenar en un estado liofilizado que solamente requiere la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de usar.

La formulación de las vacunas de la invención también pueden incluir sistemas de adyuvantes para mejorar la inminugenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema de adyuvantes alcanza preferentemente un tipo TH1 de respuesta.

Una respuesta inmune se puede distinguir ampliamente en dos categorías extremas, siendo una humoral o respuesta inmune humoral o mediada por células (tradicionalmente caracterizadas por mecanismos efectores de anticuerpos y celulares de protección respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células), y repuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes extremas de tipo TH1 se pueden caracterizar por la generación de un antígeno específico, linfocitos T citotóxicos de calotipo restringido, y respuestas celulares naturales asesinas. En ratones las respuestas de tipo TH1 a menudo se caracterizan por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en el ser humano éstas corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se caracterizan por la generación de un amplio intervalo de isotipos de inmunoglobulinas que incluyen IdG1, IgA, e IgM en ratones.

Se puede considerar que la fuerza directora que está detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmune son citocinas. Altos niveles de citocinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células al antígeno dado, mientras que altos niveles citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales al antígeno.

La distinción de respuestas inmunes de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmune que se describe que es predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citocinas en términos de los descritos en clones de células T CD4 +ve de murinos por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cels: different patterns of lymphokine secretion lead to diffrent funcional properties. Annual Review of Immunology, 7 p 145 - 173). Tradicionalmente las respuestas de tipo de tipo TH1 están asociadas con la producción de las citocinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citocinas a menudo directamente asociadas a la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no están producidas por las T, tal como IL-2. En contraste, las respuestas de tipo TH2 están asociadas a la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes revacunas son particularmente adecuados para la estimulación de repuestas de citocinas de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluye la medición directa de la producción de citocinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro después de la reestipulación con un antígeno y/o la medición de la relación IgG1:IgG2a de las respuestas de anticuerpos específicas de antígenos.

Así pues, un adyuvante de tipo TH1 es una que estimula preferiblemente las poblaciones de células T para producir altos niveles de citocinas de tipo TH1 cuando se reestimulan con un antígeno in vitro, y promueve el desarrollo de tanto linfocitos T citotóxicos CD8+ como de respuestas de inmunoglobulinas específicas de antígenos asociadas a, isotipo de tipo TH1.

Los adyuvantes que son capaces de la estimulación preferencial de la respuesta de las células TH1 se describen en las solicitudes de la patente internacional Nº WO 94/00153 y WO 95/17209.

El lípido A 3 Des-O-acilado monofosforilo (abreviadamente en inglés 3D-MPL) es uno de tales adyuvantes. Éste se conoce a partir del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla del lípido A 3 Des-O-acilado monofosforilo con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y lo fabrica Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida del lípido A 3 Des-O-acilado monofosforilo se describe en la patente europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals S.A).

Preferiblemente, las partículas del 3D-MPL son lo suficientemente pequeñas para esterilizarse cuando se filtran a través de una membrana de 0,22 micras (patente europea nº 0 689 454).

El 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug - 100 \mug preferiblemente 25 - 50 \mug por dosis donde el antígeno típicamente estará presente en un intervalo de 2 - 50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica derivada de Hplc de la corteza de Quillaza Saponaria Molina. Opcionalmente éste se puede administrar con el lípido A 3 Des-O-acilado monofosforilo (3D- MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.057.540.

Las formulaciones de adyuvantes no reactogénicos que contienen QS21 se han descrito previamente (documento WO 96/33739). Tales formulaciones que comprenden el QS21 y colesterol se han mostrado adyuvantes estimulantes de TH1 cuando se formulan junto con un antígeno.

Además los adyuvantes que son estimuladores preferentes de la respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metilado como se describe en el documento WO 96/02555.

Las combinaciones de diferentes adyuvantes estimulantes de TH1, tales como los mencionados en esta memoria descriptiva anteriormente, también se contemplan que proporcionan un adyuvante que es un estimulador preferencial de la respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS 21 se puede formular junto con el 3D-MPL. La relación de QS21 : 3d-MPL típicamente será del orden de 1 : 10 a 10 : 1; preferiblemente 1 : 5 a 5 : 1 y a menudo sustancialmente1 : 1. El intervalo preferido para sinergia óptima es 3D-MPL : QS 2,5 : 1 a 1 : 1.

Preferiblemente un vehículo también está presente en la composición de vacunas según la invención. El vehículo puede ser una emulsión aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión preferida aceite en agua comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfatocoferol y Twenn 80. En un aspecto particularmente preferido los antígenos en la composición de vacunas según la invención se combinan con QS21 y 3d-MPL en tal emulsión. Adicionalmente la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Típicamente para administración humana QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una vacuna en el intervalo de 1 \mug - 200 \mug, tal como 10 \mug - 100 \mug, preferiblemente 10 \mug - 50 \mug por dosis. Típicamente el aceite en agua comprenderá entre 2 y 10% de escuelano, entre 2 y 10% de alfatocoferol y entre 0,3 y 3% de tween 80. Preferiblemente la relación de escualeno: alfatocoferol es igual a o menor que 1 ya que esto proporciona una emulsión más estable. Span 85 también puede estar presente a un nivel de 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizador.

Las emulsiones aceite en agua no tóxicas preferiblemente contienen un aceite no tóxico, por ejemplo, escualeno o escualeno, un emulsionante, por ejemplo, Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato.

Una formulación de adyuvantes particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en un a emulsión aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

La presente invención también proporciona una composición de vacunas polivalentes que comprende una formulación de vacunas de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y afecciones relativas. Tal composición de vacunas polivalentes puede incluir un adyuvante inductor de TH-1 como de ha descrito anteriormente en esta memoria descriptiva.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB033, se debe entender que la misma cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos de origen natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, supresiones o sustituciones que no afectan sustancialmente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

El antígeno también se puede distribuir en la forma de bacterias enteras (vivas o muertas) o como fracciones subcelulares, estas posibilidades incluyen la propia N. meningitidis.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BASB033 y/o un polipéptido BASB033 para administración a una célula o a u organismo multicelular.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido descrito en esta memoria descriptiva o a sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención se pueden emplear en combinación con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para uso con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un individuo. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, un medio aditivo o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos pueden incluir, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y las combinaciones de los mismos. La formulación debe ajustarse al modo de administración. La invención además se refiere a envases y kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones anteriormente mencionadas de la invención.

Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier manera eficaz, conveniente incluyendo, por ejemplo, la administración mediante vías tópica, oral, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica entre otras.

En terapia o como profiláctico, el agente activo se puede administrar a un individuo en forma de una composición inyectable, por ejemplo en forma de una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, péptido agonista o antagonista o un compuesto de moléculas pequeñas, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos incluyen, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, agua, glicerol, etanol y las combinaciones de los mismos. La invención además se refiere a envases y kits que comprenden uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones anteriormente mencionadas de la invención. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptarán a la vía de administración, por ejemplo mediante una vía sistémica o una oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, típicamente mediante inyección intravenosa. Se pueden usar otras vías de de inyección, tales como subcutánea, intramuscular, o intraperitoneal. Medios alternativos para la administración sistémica incluyen la administración transmucosal o transdérmica que usa penetrantes tales como sales biliares de ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otros compuestos de la presente invención se pueden formular en una formulación entérica o una encapsulada, puede también ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada, en forma de ungüentos, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para la administración a mamíferos, y particularmente a seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diario del agente activo estará entre 0,01 mg/kg y 10 mg/kg, típicamente aproximadamente 1 mg/kg. El médico en cualquier caso determinará la dosificación actual que será la más adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares del caso medio. Pueden, por supuesto, ser casos individuales donde intervalos de dosificación más altos o más bajos son necesarios, y tales están dentro del alcance de esta invención.

El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la afección del sujeto, y el juicio del facultativo asistente. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,1 - 100 \mug/kg del sujeto.

Una composición de vacunas está convenientemente en una forma inyectable. Los adyuvantes convencionales se pueden emplear para mejorar la respuesta inmune. Una dosis unitaria para vacunación en 0,5 - 5 microgramos/kg de antígeno, y tal dosis se administra preferiblemente 1 - 3 veces y con un intervalo de 1 - 3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observará ningún efecto toxicológico indicado con los compuestos de la invención que impediría su administración a individuos adecuados.

Sin embargo, se esperan variaciones amplias en la dosificación necesaria, en vista de la diversidad de compuestos disponibles y las eficacias diferentes de diversas vías de administración. Por ejemplo, la administración oral se esperaría que requiera dosificaciones más altas que la administración mediante inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar usando rutinas empíricas habituales para optimización, como se entenderá bien en la técnica.

Bases de datos de las secuencias, secuencias en un medio tangible, y algoritmos

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de una fuente de información valiosa con la que determinar sus estructuras en 2 y 3 dimensiones así como para identificar recuentes adicionales de homología similar. Estos planteamientos se facilitan más fácilmente mediante almacenamiento de la secuencia en medio legible de ordenador y después usando los datos almacenados en un programa de estructura molecular conocido o investigar una base de datos de secuencias usando herramientas de investigación conocidas, tal como el programa GCG.

La invención también proporciona procedimientos para el análisis de secuencias de caracteres o cadenas, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencias incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencias, tales como análisis de identidad y similitud, análisis de estructura de DNA, RNA y proteínas, conjunto de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias, determinación de la fase abierta de lectura, llamada de bases de ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, recortes de ácidos nucleicos, y análisis de picos de cromatogramas de secuenciación.

Un procedimiento basado en ordenadores se proporciona para realizar identificación de hilología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible de ordenador; y comparando dicha primera secuencia de polinucleótidos a al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar homología.

Un procedimiento basado en ordenadores también se proporciona para la realización de identificación de homología, dicho procedimiento comprendiendo las etapas de: proporcionar una primera secuencia de polipéptidos que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible de ordenados; y comparando dicha primera secuencia de polipéptidos a al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar homología.

Todas las publicaciones y referencias, que incluyen, pero sin limitación, las patentes y solicitudes de patentes, citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en este documento como referencia en su totalidad como si cada publicación individual referencia estuvieran específica o individualmente indicadas que se van a incorporar como referencia en esta memoria descriptiva como se exponen totalmente. Cualquier solicitud de patente para la que esta solicitud reivindica prioridad también se incorpora como referencia en esta memoria descriptiva en su totalidad de la manera descrita anteriormente para las publicaciones y referencias.

Definiciones

"Identidad" como se sabe en la técnica, es un relación entre dos o más secuencias de polipéptidos de dos o más secuencias de polipéptidos, como puede ser el caso, como se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relevancia de secuencias entre secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos, como puede ser el caso, como se determina mediante la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" se puede fácilmente calcular mediante procedimientos conocidos, que incluyen pero sin limitación, los descritos en (Computacional Molecular Biology, Lesk, A. M. ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academia Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academia Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carrillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48: 1073 (1988). Se diseñan procedimientos para determinar la identidad para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad se codifican en programas de ordenador disponibles públicamente. Los procedimientos de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el programa GAP en el paquete de programas GCG (Devereux, J. y col., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLAST, BLASTN (Altschul, S. F. y col., J Molec. BIol. 215: 403 - 410 (190), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 2444 - 2448 (1988). La familia BLAST de programas está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. y col., NCBI NLM Bethesda. MD 20894: Altschul, S., y col., J Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). El algoritmo bien conocido de Smith Waterman también se puede usar para determinar la identidad.

Los parámetros para la comparación de secuencias de polipéptidos incluye lo siguiente:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443 - 453 (1970).

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos. 89: 10915 - 10919 (1992)

Penalización de huecos: 8

Penalización de huecos largos: 2

Un programa útil con estos parámetros está públicamente disponible como el programa de "huecos" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de péptidos (junto con no penalización para los huecos extremos).

Los parámetros para la comparación de polinucleótidos incluyen lo siguiente:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443 - 453 (1970).

Matriz de comparación: coincidencias = + 10, no coincidencia = 0 Penalización de huecos: 50

Penalización de huecos largos: 3

Disponible como: El programa de "huecos" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto de las comparaciones de los péptidos para las comparaciones de los ácidos nucleicos.

Un significado preferido de "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se proporcionan en (1) y (2) más adelante.

(1) Las realizaciones de polipéptidos además incluyen un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tienen al menos 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad a la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 1, donde dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEC ID. Nº: 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por la menos una supresión, sustitución de nucleótidos, incluyendo transición y transversión, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones terminales 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, ó

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \bullet y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97%, ó 1,00 para 100%, y \bullet es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótidos que codifican el polinucleótido de la SEC ID. Nº: 2 puede crear mutaciones sin sentido, sentido erróneo, o de desplazamiento de fase en esta secuencia codifcadora y por lo tanto altera el polipéptido codificado por los polinucleótidos después de tales alteraciones.

A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 1, es decir puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es menor que 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de ácidos nucleicos que incluye transición, transversión, o inserción, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las porciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas bien individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en la SEC ID Nº: 1, o

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \bullet y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en la SEC ID. Nº: 1, y es, por ejemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., \bullet es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}.

(2) Las realizaciones de polipéptidos además incluyen un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad a la secuencia de polipéptidos de referencia de la SEC ID. Nº: 2, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEC ID. Nº: 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por la menos una supresión, sustitución de aminoácidos, incluyendo sustitución, o supresión conservadora o y no conservadora, y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones terminales amino- o carboxi de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID. Nº: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº 2, ó

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \bullet y).

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de nucleótidos en la SEC ID. Nº: 1, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97%, ó 1,00 para 100%, y \bullet es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID. Nº: 2, es decir puede ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es menor que 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de aminoácidos que incluye sustitución, o inserción, conservadora y o conservadora y en la que dichas alteraciones se pueden producir en las porciones terminales amino- o carboxi- de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, interespaciadas bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en la SEC ID Nº: 2, o

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \bullet y).

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en la SEC ID. Nº: 2, y es 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85 etc., y \bullet es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

"Individuo (s)" cuando se usa con referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitación a metazoano, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate, y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su ambiente natural, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido de origen natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea el término en esta memoria descriptiva. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo mediante transformación, manipulación genética o mediante cualquier otro procedimiento recombinante se "aísla" incluso si todavía está presente en dicho organismo, este organismo puede ser vivo o no vivo.

"Polinucleótido (s)" generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser RNA o DNA no modificado o RNA o DNA modificado incluyendo regiones de una sola o doble hebra.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que se diferencia de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero conserva las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en una secuencia de nucleótidos de otro, polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante puede o no puede alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se describe más adelante. Una variante típica de un polipéptido se diferencia de la otra en la secuencia de aminoácidos, polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan a la de las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas. Una variante del polipéptido de referencia se puede diferenciar en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácidos sustituido o insertado puede o no puede estar codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de origen natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que sea de origen natural. Las variantes de origen no natural de polinucleótidos y polipéptidos se pueden preparar mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad producida por o relativa a infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, infección del tracto respiratorio superior, enfermedades bacterianas invasivas, tales como bacteremia y meningitis.

Ejemplos

Los ejemplos dados en lo que sigue se llevan a cabo usando técnicas habituales, que son bien conocidas y de rutina para los expertos en la técnica, excepto donde se describe de otra manera en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Descubrimiento y secuenciación de confirmatoria de DNA del gen BASB033 de dos cepas de N. meningitidis A: BASB033 en la cepa ATCC13092 de N. meningitidis serogrupo A

El gen BASB033 de la SEC ID Nº: 1 se descubrió primero en la base de datos Incyte PathoSeq que contiene secuencias de DNA genómico no terminadas de la cepa ATCC13090 de N. meningitidis. La traducción de la secuencia de polinucleótidos BASB033, mostrada en la SEC ID Nº: 2, mostró similitud significativa (35% de identidad en una superposición de 292 aminoácidos) a la proteína de fosfolipasa A de la membrana externa de Klebsiella pneumoniae. La secuencia del gen BASB033 se confirmó además experimentalmente. Con este fin, se extrajo DNA genómico de 10^{10} células de células de N. meningitidis (cepa ATCC 13090) usando el kit de extracción de DNA genómico QIAGEN (Qiagen GMBH), y 1 \mug de este material se sometió a la amplificación de DNA con la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores Pla-01 (5' - GGT CGA CCA TAT GAA TAT ACG GAA TAT GCG CTA - 3') [SEC ID Nº: 5] que contiene un sitio NdeI interno (subrayado) y Pla-02 (5' - CGC CGC TCG AGG ATG CCG TCC AAG TCG TTG - 3') [SEC ID Nº: 6] que contiene un sitio XhoI interno (subrayado). Este producto de PCR se purificó por gel y se sometió a secuenciación de DNA usando el kit de secuenciación Big Dye Cycle (Perkin - Elmer) y un secuenciador de DNA ABI 373A/PRISM. La secuenciación de DNA se realizó sobre ambas hebras con una redundancia de 2 y la secuencia de longitud completa se ensambló usando el programa de SeqMan del paquete de software de DNASTAR Lasergene. La secuencia de DNA resultante volvió a ser 100% idéntica a la SEC ID Nº: 1.

B: BASB033 en la cepa H44/76 de N. meningitidis serogrupo B

La secuencia del gen BASB033 también se determinó en otra cepa de N. meningitidis serogrupo, la cepa H44/76. Con este fin, se extrajo DNA genómico de la cepa H44/76 de N. meningitidis usando las condiciones experimentales presentadas en el ejemplo 1. Este material (1 \mug) se sometió después a la amplificación de DNA con la reacción en cadena de la polimerasa usando celadores Pla-01 y Pla-02 específicos para el gen BASB033. Se obtuvo un fragmento de DNA de aproximadamente 1100 bp, se digirió mediante las endonucleasas de restricción NdeI/XhoI y se insertó en los sitios correspondientes del vector de expresión/clonación (Novagen) usando técnicas de biología molecular habituales (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, edición segunda, Eds: Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989). Después el recombinante pET-24b/BASB033 se sometió a secuenciación de DNA usando el kit Big Dyes (Applied biosystems) y se analizó sobre un secuenciador de DNA ABI 373/A en las condiciones descritas por el proveedor. Como resultado, se obtuvieron las secuencias de polinucleótido y polipéptido deducido, denominadas como la SEC ID Nº: 3 y SEC ID Nº: 4 respectivamente. Usando el programa MegAlign en el paquete DNASTAR Lasergene, se realizaron una alineación de las secuencias de polinucleótidos de la SEC ID Nº: 1 y 3, y se muestra en la figura 1; su nivel de identidad suma hasta 99,3%, según se determina por el programa. Usando el mismo programa MegAlign, se realizó una alineación de las secuencias de polipéptidos de la SEC ID Nº: 2 y 4, y se muestra en la figura 2; su nivel de identidad suma hasta 98,9%, como se determina por el programa.

Tomados juntos, estos datos indican la fuerte conservación de las secuencias del gen BASB033 entre las cepas de N. meningitidis serogrupo B.

Ejemplo 2 Expresión y purificación de la proteína recombinante BASB033 en Escherichia coli

La construcción del vector de clonación/expresión pET-24b/BASB033 se describe en el ejemplo 1B. Este vector contiene el gen BASB033 aislado de la cepa H44/76 en fusión con un alargamiento de 6 residuos de histidina, colocados en el control del promotor fuerte del gen 10 del bacteriófago T7. Para estudio de expresión, este vector se introdujo en la cepa Novablue (DE3) de E. coli (Novagen), en la que el gen para la polimerasa de T7 se coloca en el control del promotor lac isopropil-beta-D-tiogalactósido regulable (abreviadamente en inglés IPTG). Los cultivos en líquido (100 ml) de la cepa recombinante de E. coli Novablue (DE3) [pET-24b/BASB033] se desarrollaron a 37ºC en agitación hasta que la densidad óptica a 600 nm (DO 600) alcanzó 0,6. En ese punto, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM y se desarrolló el cultivo durante 4 horas adicionales. Después el cultivo se centrifugó a 10.000 rpm y el sedimento se congeló a -20ºC durante al menos 10 horas.

Después de descongelar, el sedimento (3 litros de cultivo) se resuspendió en tampón fosfato 20 mM pH 8,0 que contenía 20 unidades de benzonasa por ml y se incubó a 22ºC durante 30 minutos. Las células lisadas se centrifugaron durante 30 minutos a 15.000 rpm (centrífuga Beckman J2-HS, rotor JA-20) a 4ºC. La proteína recombinante BASB033/His6 se solubilizó mediante urea 8M, fosfato 20 mM, pH 8,0 durante una noche a 4ºC. El desecho celular se centrifugó 30 minutos a 15.000 rpm en un rotor JA-20 a 4ºC. La muestra se cargó a un caudal de 1 ml/min sobre una columna de 4 ml de Fractogel EMD SO3 650S (Merck). La columna se equilibró en urea 8 M, fosfato 20 mM, pH 8,0. Después de pasar el flujo a través, la columna se lavó con tampón de equilibrio hasta que se alcanzó la situación inicial. La proteína recombinante se eluyó de la columna mediante NaCl 100 mM en urea 8 M, fosfato 20 mM pH 8,0, a 1 ml/min. La muestra eluida se dializó a 4ºC frente a PBS que contenía arginina 0,5 M. Como se muestra en la figura 3 (banda 6), una proteína BASB033/His6 enriquecida (pureza estimada 50% pura en SDS - PAGE teñida con CBB), migrando a 43 kDA (masa molecular relativa estimada) se eluyó de la columna. Este polipéptido fue reactivo frente a un anticuerpo monoclonal de ratón activado frente al motivo 5-histidina (véase la figura 4, banda 6). Tomados juntos, estos datos indican que el gen BASB033 se puede expresar y purificar en una forma recombinante (BASB033/His6) en E. coli.

Ejemplo 3 Inmunización de ratones con BASB033 recombinante

BASB033 recombinante parcialmente purificado expresado en E. coli se inyectó tres veces en ratones Balb/C los días 0, 14 y 28 (10 animales/grupo). Los animales se inyectaron por vía subcutánea con 5 \mug de antígeno adsorbido sobre 100 \mug de AIPO_{4}. Un grupo de control negativo constituido por ratones inmunizados con el adyuvante SBAS2 solamente también se añadió en el experimento. Se extrajo sangre de los ratones los días 28 (14 días Post II) y 35 (7 días Post III) con el fin de detectar anticuerpos específicos anti - BASB033. Los anticuerpos se midieron mediante Elisa sobre sueros reunidos sobre la proteína BASB033 recombinante así como sobre proteínas de E. coli. La respuesta anti - BASB033 también se ha evaluado mediante transferencia de western usando el antígeno recombinante. Los resultados de Elisa con BASB033 recubierto se presentan en esta memoria descriptiva posteriormente, y muestran que el antígeno BASB033 es claramente inmunogénico en ratones, aunque débilmente, y a pesar de su parcial pureza (figura 5). La diferencia observada entre el BASB033 específico y la respuesta de E. coli se debe a anticuerpos específicos anti - BABS033. No hay respuesta específica de BASB033 en ratones del grupo de control negativo. Esto también se demuestra claramente en la figura 6, en la que hay una banda clara de BASB033 detectada alrededor de 43 kD. Los sueros de las extracciones de sangre de Post II y Post III se usaron para estos ensayos.

Reconocimiento de los epítopos de BASB033 en diferentes cepas NmB mediante transferencia de western.

En este ensayo, sueros de ratones inmunizados (reunido) se ensayaron mediante transferencia de western para el reconocimiento de los epítopos de BASB033 sobre seis cepas diferentes de Neisseria meningitidis B cepas: H44/76 (B:15:P1.7, 16, estirpe ET - 5), M97 250687 (B:4:P1.15). BZ10 (B:2b:P1,2, estirpe A4), BZ198 (B:NT*, estirpe 3), EG328 (B:NT*, estirpe ST-18), y sobre la proteína BASB033 recombinante parcialmente purificada (*: NT : No mecanografiada).

En resumen, 15 \mul (> 10^{8} células/banda) de cada muestra tratada con tampón de muestra (10 minutos a 95ºC) se ponen en un gel de gradiente de SDS - PAGE (tris - glicina 4 - 20%, Novex, nº de código EC6028). La migración electroforética se produce a 35 mA/gel durante 90 minutos. Después, las proteínas se transfieren a una hoja de nitrocelulosa (0,45 \mum, Bio-rad nº de código 162-0114) a 100 voltios durante 1 hora usando un sistema Bio-rad Trans-bolt (nº de código 170-3930). El filtro se bloqueó con PBS - Tween 20 al 0,05% durante una noche a temperatura ambiente, antes de la incubación con los sueros de ratones que contenían los anticuerpos anti - BASB033. Estos sueros se diluyeron 100 veces en PBS - Tween al 0,05%, y se incubaron sobre la hoja de nitrocelulosa durante dos horas a temperatura ambiente con agitación suave, usando un sistema de mini papel secante (Miniprotean, Bio- rad nº de código 170-4017). Después de tres etapas repetidas de lavado en PBS - Tween 20 al 0,05% durante 5 minutos, la hoja de nitrocelulosa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora en agitación suave con el conjugado adecuado (anticuerpos de Ig anti-ratón biotinilados de oveja, Amersham nº de código RPN1001) diluido a 1/500 en el mismo tampón de lavado. La membrana se lavó tres veces como se ha indicado anteriormente, y se incubó durante 30 minutos con agitación usando el complejo estreptavidina - peroxidasa (Amersham nº de código 1051) diluido a 1/1000 en el tampón de lavado. Después de las tres últimas etapas de lavado repetido, el revelado se produce durante los 20 minutos de tiempo de incubación en una solución de 50 ml que contenía 30 mg de 4-cloro- 1-naftol (Sigma), 10 ml de metanol, 40 ml de PBS, y 30 \mul de H_{2}O_{2}. La tinción se detuvo al lavarse las membranas varias veces en agua destilada.

Los resultados ilustrados en esta memoria descriptiva posteriormente en las figuras 7 y 8 muestran que casi todas las cepas ensayadas presentan una banda alrededor de 43 kD, que significaban que los anticuerpos dirigidos contra la proteína BASB033 recombinante reconocen la proteína nativa en la superficie de las células de Neisseria meningitidis B (cepas 6/7 se reconocen en este caso). Después, la proteína BASB033 se expresa probablemente en una mayoría de las cepas de N. meningitidis B. Todas las otras bandas se podrían deber a anticuerpos dirigidos contra los productos de agregación de BASB033 (como el observado alrededor de 95 - 100 kD), productos relativos, o antígenos de reacción cruzada entre las bacterias E. coli y Neisseria meningitidis B, ya que la preparación usada para la inmunización todavía contenía contaminantes de E. coli. No se observa banda de reacción a 43 kD sobre proteínas de E. coli, significando que el antígeno no está presente en E. coli.

Ejemplo 4 Presencia de anticuerpos anti-BASB033 en sueros de pacientes convalecientes

En este ensayo, unos pocos sueros de convalecientes se ensayaron mediante transferencia de western para reconocimientos de la proteína BASB033 recombinante purificada.

En resumen, 24 \mug de proteína BASB parcialmente purificada se ponen en un gel de gradiente de SDS - PAGE (4 - 20%, Novex, nº de código EC6029) para migración electroforética. Las proteínas se transfirieron a una hoja de nitrocelulosa (0,45 \mum, Bio-rad nº de código 162-0114) a 100 voltios durante 1 hora usando un sistema Bio-rad Trans-blot (nº de código 170-3930). Después, el filtro se bloqueó con PBS - Tween 20 al 0,05% durante una noche a temperatura ambiente, antes de la incubación con los sueros humanos. Estos sueros se diluyen a 1/50 en PBS - Tween 20 al 0,05%, y se incubaron sobre la hoja de nitrocelulosa durante dos horas a temperatura ambiente con agitación suave, usando un sistema de mini papel secante (Miniprotean, Bio.rad nº de código 170-4017). Después de tres etapas de lavados repetidos en PBS - Tween 20 al 0,05% durante 5 minutos, la hoja de nitrocelulosa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora en agitación suave con el conjugado apropiado (anticuerpos de Ig anti - humanos biotinilados; de oveja, Amersham nº de código RPN1003) diluido a 1/500 en el mismo tampón de lavado. La membrana se lava tres veces como se ha indicado anteriormente, y se incuban durante 30 minutos con agitación usando el complejo estrepavidina - peroxidasa (Amersham nº de código 1051) diluido a 1/1000 en el mismo tampón de lavado. Después de las tres últimas etapas de lavado repetido, el revelado se produce durante los 20 minutos de tiempo de incubación en una solución de 50 ml que contiene 30 mg de 4-cloro-1-naftol (Sigma), 10 ml de etanol, 40 ml de PBS, y 30 \mul de H_{2}O_{2}. La tinción se detiene al lavar la membrana varias veces en agua destilada.

Los resultados ilustrados en la figura 9 (Parte B) muestran que los 7 sueros de convalecientes ensayados reaccionan contra la proteína recombinante BASB033 a aproximadamente 43 kD, ya que la banda de BASB033 es claramente visible. La respuesta más débil se observa con el suero del convaleciente 260601. Esta respuesta soporta el uso potencial del antígeno BASB033 como componente de vacunas. En la parte A de la transferencia de western, los autores confirman que los sueros de ratones reconocen muy bien la proteína recombinante BASB033 como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 5 Análisis de las regiones flanqueantes no codificadoras del gen BASB033, y su explotación para la expresión modulada del gen BASB033

Las regiones flanqueantes no codificadoras del gen BASB033, contienen elementos reguladores importantes en la expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto a nivel transcripcional como traduccional. La secuencia de estas regiones, bien hacia arriba o hacia debajo de la fase abierta de lectura del gen, se puede obtener mediante secuenciación de DNA. Esta información de secuencias permite la determinación de los motivos reguladores potenciales tales como los elementos promotores diferentes, secuencias exterminadoras, elementos de secuencias inducibles, represores, elementos responsables de la variación de fases, la secuencia brillo - dalgarno, regiones con estructura secundaria potencial implicada en regulación, así como otros tipos de motivos o secuencias reguladoras.

Esta información de secuencias permite la modulación de la expresión natural del gen BASB033. La regulación hacia arriba de la expresión del gen se puede llevar a cabo alterando el promotor, la secuencia de brillo - dalgarno, elemento de los represores u operadores potenciales, o cualquier otro elemento implicado. De manera similar, la regulación hacia debajo de la expresión se puede llevar a cabo mediante tipos similares de modificaciones. Como alternativa, cambiando las secuencias de variación de fase, la expresión del gen se puede poner en control de variación de fase, o se puede desacoplar de esta regulación. En otro planteamiento, la expresión del gen se puede poner bajo el control de una o más elementos inducibles que permite la expresión regulada. Los ejemplos de tal regulación incluyen, pero sin limitación, inducción mediante el desplazamiento de temperaturas, adición de sustratos inductores parecidos a carbohidratos seleccionados de sus derivados, oligoelementos, vitaminas, co-factores, iones metálicos,
etc.

Tales modificaciones como se han descrito anteriormente se pueden introducir mediante diferentes medios. La modificación de las secuencias implicadas en la expresión génica se puede hacer in vivo mediante mutagénesis al azar seguida de selección del fenotipo deseado. Otro planteamiento consiste en el aislamiento de la región de interés y modificarla por mutagénesis al azar, o mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de inserción o supresión. Después la región modificada se puede volver a introducir en el genoma bacteriano mediante recombinación homóloga, y se puede determinar el efecto sobre la expresión génica. En otro planteamiento, el conocimiento de la secuencia de la región de interés se puede usar para reemplazar o suprimir toda o parte de las secuencias reguladoras naturales. En este caso, la región reguladora dirigida se aísla y se modifica de manera que contenga los elementos reguladores de otro gen, una combinación de los elementos reguladores de genes diferentes, una región reguladora sintética, o cualquier otra región reguladora, o para suprimir partes seleccionadas de las secuencias reguladoras de tipo salvaje. Estas secuencias modificadas se pueden después volver a introducir en la bacteria mediante recombinación homóloga en el genoma. Una lista no exhaustiva de promotores preferidos se podrían usar para la regulación hacia arriba de la expresión génica incluye el promotor porA, porB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB de N. meningitidis o N. gonorroheae. En un ejemplo, la expresión del gen se puede modular cambiando su promotor con un promotor más fuerte (mediante el aislamiento de la secuencia hacia arriba del gen, modificación in vitro de esta secuencia, y la reintroducción en el genoma mediante recombinación homóloga). La expresión hacia arriba se puede obtener en ambas bacterias así como en la cubierta de las vesículas de las membranas externas (o hechas) de las bacterias. En otros ejemplos, los planteamientos descritos se pueden usar para generar cepas de bacterias recombinantes con características mejoradas para aplicaciones de vacunas. Éstos pueden ser, pero sin limitación, cepas atenuadas, cepas con expresión incrementada de antígenos seleccionados, cepas con eliminación genética - (o expresión disminuida) de genes que interfieren con la respuesta inmune, cepas con expresión modulada de proteínas inmunodominantes, cepas con recubrimiento modulado de vesículas de las membranas externas.

Una región directamente hacia arriba del gen BASB033 se proporciona en la secuencia de SEC ID Nº: 7. Esta secuencia es un aspecto adicional de la invención.

Leyendas de las figuras Figura 3:

Una fracción de proteínas BASB033 purificadas sustancialmente (estimada en 50%) se separó sobre un gel de poliacrilamida de gradiente 4 - 20% (NOVEX) en condiciones SDS - PAGE en paralelo a un marcador de peso molecular de proteínas (banda 1), después se tiñe con azul Coomassie. La banda 6 aparece claramente enriquecida con BASB033 a aproximadamente 43 kD (las bandas 2 y 3 son extractos de proteínas celulares totales, la banda 4 es el flujo, las bandas 5 a 10 son le perfil de elución.

Figura 4:

Una fracción de proteínas BASB033 purificadas sustancialmente (estimada en 50%) se separó sobre un gel de poliacrilamida de gradiente 4 - 20% (NOVEX) en condiciones SDS - PAGE en paralelo a un marcador de peso molecular de proteínas (banda 1), después analizó mediante transferencia de western usando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-His5. La banda 6 revela claramente el polipéptido BASB033 a aproximadamente 43 kDa (las líneas 2 y 3 son un extracto de proteínas celulares totales, la banda 4 es el flujo, las líneas 5 a 10 son el perfil de elución).

Secuencias de polinucleótidos y polipéptidos BASB033 SEC ID Nº: 1 Secuencia de polinucleótido BASB033 de Neisseria meningitidis

1

SEC ID Nº: 2 Secuencia de polinucleótido BASB033 deducida de la secuencia de polinucleótido de la SEC ID Nº: 1

2

SEC ID Nº: 3 Secuencia de polinucleótido BASB033 de Neisseria meningitidis de la cepa H44/76

3

SEC ID Nº: 4 Secuencia de polinucleótido BASB033 de Neisseria meningitidis deducida de la secuencia de polinucleótido de la SEC ID Nº: 3

4

SEC ID Nº: 4

GGT CGA CCA TAT GAA TAT ACG GAA TAT GCG CTA

SEC ID Nº: 5

CGC CGC TCG AGG ATG CCG TCC AAG TCG TTG

SEC ID Nº: 7

5

Materiales depositados

Un depósito que contiene una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis se ha depositado en la colección americana de cultivos tipo (en esta memoria descriptiva "ATCC") el 22 de junio de 1997 y número de depósito asignado cesión 13090. El depósito se describió como Neisseria meningitidis (Albrecht y Ghon) y se liofiliza, una genoteca insertada de 1,5 - 2,9 kb construida a partir de un aislamiento de N. meningitidis. El depósito se describe en Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 8: 1 - 15 (1958).

El depósito de la cepa de Neisseria meningitidis se denomina en esta memoria descriptiva como "la cepa depositada" o como "el DNA de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene el gen de BASB033 de longitud completa. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la cepa depositada, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado en consecuencia, se controlan en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de la secuencia en esta memoria descriptiva.

El depósito de la cepa depositada se ha hecho en los términos del tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos del procedimiento de patentes. La cepa será irrevocablemente y sin restricción o condición liberadas al público tras la expedición de una patente. La cepa depositada se proporciona meramente como conveniencia para los expertos en la técnica y no es una admisión que un deposito requiere para habilitación tal como la requerida en 35 U.S.C \NAK 112.

<110> SmithKline Beecham Biologicals S.A.

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<120> Compuestos novedosos

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<130> BM45331

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<160> 6

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<170> FastSEQ for Windows Version 3.0

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<210> 1

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<211> 1128

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<212> DNA

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 1

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6

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<210> 2

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<211> 375

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<212> PRT

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<213> Neisseria meningitidis

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\newpage

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<400> 2

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7

8

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<210> 3

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<211> 1125

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<212> DNA

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 3

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9

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<210> 4

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<211> 374

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<212> PRT

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 4

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10

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<210> 5

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia del cebador

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcgaccat atgaatatac ggaatatgcg cta

\hfill

33

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<210> 6

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia del cebador

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgccgctcga ggatgccgtc caagtcgttg

\hfill

30

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<210> 7

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<211> 373

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<212> DNA

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 7

12

Claims (24)

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID Nº:2, SEC ID Nº:4.

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1 en al que la secuencia de aminoácidos tiene al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID Nº:2, SEC ID
Nº:4.

3. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº:4.

4. Un polipéptido aislado de las SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº:4.

5. Un fragmento inmunogénico del polipéptido según una cualquiera de las la reivindicaciones 1 a 4, en el que el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) es capaz de inducir una respuesta inmune que reconoce el polipéptido de las SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, y en el que el fragmento es opcionalmente parte de una proteína mayor tal como una proteína de fusión.

6. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2, 4 en la longitud entera de la SEC ID Nº:2, 4 respectivamente; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

7. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85% de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEC ID Nº: 2, 4 en la región codificadora entera; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

8. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 85% de identidad de la SEC ID Nº: 1, 3 en la longitud entera de la SEC ID Nº: 1,3 respectivamente; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

9. El polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en el que la identidad es al menos 95% con la SEC ID Nº: 1, 3.

10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de las SEC ID Nº: 2; SEC ID Nº: 4.

11. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3.

12. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptidos de las SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 obtenible mediante la selección de una genoteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3 o un fragmento de las mismas.

13. Un vector de expresión o un microorganismo vivo recombinante que comprende un polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 6 - 12.

14. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 13 o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula huésped que expresa un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4.

15. Un procedimiento para producir un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 que comprende el cultivo de una célula huésped de la reivindicación 14 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y la recuperación del polipéptido del medio de cultivo.

16. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 6 - 12 que comprende la transformación de una célula huésped con el vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula huésped en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

17. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. La composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18 en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Neisseria meningitidis.

20. Un anticuerpo inmunoespecífico para el polipéptido o fragmento inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

21. Un procedimiento de diagnosis de una infección por Neisseria meningitidis, que comprende la identificación de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, o un anticuerpo que es inmunoespecífico para dicho polipéptido, presente dentro de una muestra biológica de un animal sospechoso de tener tal infección.

22. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5 en la preparación de un medicamento para uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

23. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 6 - 12 en la preparación de un medicamento para uso en la generación de una respuesta inmune en un animal.

24. Una composición terapéutica útil en el tratamiento de seres humanos con una enfermedad de Neisseria meningitidis que comprende al menos un anticuerpo dirigido contra el polipéptido de las reivindicaciones 1 - 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.