ES2337650T3

ES2337650T3 - Polipeptidos antigenicos de neisseria meningitidis polinucleotidos y anticuerpos protectores correspondientes.

Info

Publication number: ES2337650T3
Application number: ES00909329T
Authority: ES
Inventors: Catherine SmithKline Beecham Biolog. SA DEFRENNE; Christine SmithKline Beecham Biolog. SA DELMELLE; Jean-Louis SmithKline Beecham Biolog. SA RUELLE
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1999-03-12
Filing date: 2000-03-07
Publication date: 2010-04-28
Anticipated expiration: 2020-03-07
Also published as: US8217159B2; US20100184139A1; CA2365102A1; US7666988B1; EP2270169A2; DE60043499D1; WO2000055327A2; EP2163628A2; EP1163343A2; PT1163343E; EP1163343B1; DK1163343T3; WO2000055327A3; AU3164600A; US8580279B2; EP2270169A3; ATE451461T1; US20120328622A1; CY1109812T1; EP2163628A3

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 97% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº:

Description

Polipéptidos antigénicos de Neisseria meningitidis polinucleótidos y anticuerpos protectores correspondientes.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos (en la presente memoria descriptiva denominados "polinucleótido(s) BASB082"), polipéptidos codificados por ellos (referidos en la presente memoria descriptiva como "BASB082" o "polipéptido(s) BASB082"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto más, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar infección de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria Gram-negativa aislada frecuentemente en el tracto respiratorio superior humano. Ocasionalmente causa enfermedades bacterianas invasivas como bacteriemia y meningitis. La incidencia de enfermedad meningocócica muestra diferencias geográficas anuales y estacionales (Schwartz, B., Moore. P.S., Broome, C.V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-S24, 1989). La mayoría de las enfermedades en los países templados se deben a cepas del serogrupo B y varían en incidencia de 1-10/100.000/año en población total, alcanzando a veces valores superiores (Kaczmarski, E.B. (1997). Commun. Dis. Rep. Rev. 7:R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T. y col., Clin. Infect. Dis. 16: 237 - 246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E., y col. Epidemiol. Infect. 105: 119 - 126,1990).

Se encuentran epidemias dominadas por meningococos del serogrupo A, principalmente en África central, que alcanzan a veces niveles de hasta 1.000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-S24, 1989). Casi todos los casos en conjunto de enfermedad meningocócica se deben a meningococos de los serogrupos A, B, C, W-135 e Y y se dispone de una vacuna de polisacáridos A, C, W-135, Y tetravalente (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10: 335 - 339; 1982).

Las vacunas de polisacáridos están siendo mejoradas actualmente por medio de conjugación química con proteínas portadoras (Lieberman, J.M., Chiu, S.S., Wong, V.K., y col. JAMA 275: 1499 - 1503, 1996).

No se dispone de vacuna del serogrupo B, ya que se encontró que el polisacárido capsular B es no inmunogénico, con la máxima probabilidad porque comparte semejanza estructural con los componentes del huésped (Wyle, F.A., Artenstein, M.S., Brandt, M.L, y col., J. Infect. Dis. 126: 514 - 522, 1972; Finne, J.M., Leinonen, M., Mäkelä, P.M. Lancet ii: 355 - 357, 1983).

Durante muchos años se han iniciado y desarrollado esfuerzos para desarrollar vacunas basadas en la membrana externa meningocócica (de Moraes. J.C., Perkins. B., Camargo, M.C. y col., Lancet 340:1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E.A. Gronnesby, J.K. y col. 338:1093-1096, 1991). Dichas vacunas han demostrado ser eficaces del 57% al 85% en niños mayores (> 4 años) y adolescentes.

En estas vacunas están presentes muchos componentes de membrana externa bacteriana, como PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB, y la contribución de estos componentes a la protección observada sigue necesitando mayor definición. Se han definido otros componentes de membrana exterior bacteriana mediante el uso de anticuerpos animales o humanos que son potencialmente relevantes para la inducción de inmunidad protectora, como TbpB y NspA (Martin, D., Cadieux. N., Hamel. J., Brodeux, B.R., J. Exp. Med. 185:1173-1183, 1997; Lissolo, L., Maître-Wilmotte, C., Dumas, P. y col., Inf. Immun. 63:884-890, 1995). Los mecanismos de inmunidad protectora implicarán actividad bactericida mediada por anticuerpos y opsonofagocitosis.

Se ha usado un modelo animal de bacteriemia para combinar todos los mecanismos mediados por anticuerpos (Saukkonen, K., Leinonen, M., Abdillahi, H., Pootman, J.T. Vaccine 7:325-328, 1989). Se acepta generalmente que el último mecanismo bactericida mediado por componentes de complemento es crucial para la inmunidad contra la enfermedad meningocócica (Ross, S.C., Rosenthal, P.J., Berberic, H.M., Densen, P.J., Infect. Dis. 155: 1266 - 1275, 1987).

El documento W099/57280 describe algunas secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos correspondientes derivadas de Neisseria meningitidis.

La frecuencia de infecciones por Neisseria meningitidis ha crecido espectacularmente en las últimas décadas. Ello se ha atribuido a la emergencia de múltiples cepas resistentes a los antibióticos y a una creciente población de personas con sistemas inmunitarios debilitados. Ya no es infrecuente aislar cepas de Neisseria meningitidis resistentes a alguno o a todos los antibióticos estándar. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no satisfecha y una demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de detección selectiva de fármacos y pruebas de diagnóstico para este organismo.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB082, en particular polipéptidos BASB082 y polinucleótidos BASB082, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otros. En un aspecto más, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y dolencias asociadas con dichas infecciones, como ensayos para detectar expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB082.

Varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y el ámbito de la invención desvelada serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia a partir de la lectura de las siguientes descripciones y de la lectura de las otras partes de la presente descripción.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB082 según se describe más adelante en mayor detalle. La invención se refiere especialmente a BASB082, que tienen las secuencias de aminoácidos y nucleótidos establecidas en ID SEC Nº: 1, 3, 5 y ID SEC Nº: 2, respectivamente. Se entiende que las secuencias enumeradas en el Listado de Secuencias más adelante como "ADN" representan una ilustración de una forma de realización de la invención, dado que los expertos en la materia reconocerán que dichas secuencias pueden emplearse con utilidad en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Neisseria meningitidis referidos en la presente memoria descriptiva como "polipéptidos BASB082", así como variantes de los mismos útiles en términos biológicos, diagnósticos, profilácticos, clínicos o terapéuticos, y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención proporciona además:

(a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 97% más preferentemente al menos del 97% al 99%, o identidad exacta, con respecto a la de ID SEC Nº: 2.

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene una identidad de al menos el 97%, más preferentemente de al menos del 97% al 99%, o identidad exacta, con respecto a la ID SEC Nº:1 en toda la longitud de ID SEC Nº:1.

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 97%, más preferentemente de al menos del 97% al 99%, o identidad exacta, con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

El polipéptido BASB082 proporcionado en ID SEC Nº: 2 es el polipéptido BASB082 de las cepas de Neisseria meningitidis ATCC13090.

La invención proporciona también un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos ID SEC Nº: 2, siempre que dicho polipéptido no sea un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528.

La invención proporciona también un fragmento inmunogénico del polipéptido de la invención en el que el fragmento inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 y en el que dicho fragmento inmunogénico carece de dominio de anclaje C-terminal. Dicho fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB082 carente de secuencia delantera N-terminal, y/o un dominio de transmembrana. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico de BASB082 según la invención comprende sustancialmente la totalidad del dominio extracelular de un polipéptido que tiene identidad de al menos el 85%, más preferentemente identidad de al menos el 90%, todavía más preferentemente identidad de al menos el 95%, con la máxima preferencia identidad de al menos el 97-99%, con respecto a la ID SEC Nº: 2 en toda la longitud de ID SEC Nº: 2.

La invención proporciona también un fragmento inmunogénico del polipéptido de la invención en el que el fragmento inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2, siempre que dicho fragmento no sea un fragmento que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento W099/57280 y como se describe en el documento US60/121.528 o un fragmento que tiene 7 o más aminoácidos de 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento W099/57280 y como se describe en el documento US60/121.528.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma que parte pero no la totalidad de cualquier secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. En cuanto a polipéptidos BASB082, los fragmentos pueden estar "exentos" o comprendidos dentro de un polipéptido mayor del cual forman una parte o región, con la máxima preferencia como una región continua única en un único polipéptido mayor.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 o de variantes de la misma, como, por ejemplo, una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoácidos terminal en amino y/o carboxilo. Se prefieren también las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas por o en una célula huésped. Se prefieren fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales como fragmentos que comprenden regiones de hélice alfa y formadoras de hélice alfa, regiones de hojas beta y formadoras de hojas beta, regiones de giros y formadoras de giros, regiones de enrollamientos y formadoras de enrollamientos, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficies, regiones de unión a sustrato y regiones de alto índice antigénico.

Otros fragmentos preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o suprimidos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención pueden emplearse para producir el polipéptido correspondiente de longitud completa para síntesis de péptidos; por tanto, estos fragmentos pueden emplearse como productos intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Se prefieren particularmente variantes en las que varios aminoácidos 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 son sustituidos, suprimidos o añadidos en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de la invención pueden estar en forma de la proteína "madura" o pueden formar parte de una proteína mayor como un precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias delanteras o secretoras, prosecuencias, secuencias que ayudan en la purificación como residuos múltiples de histidina, o una secuencia adicional para estabilidad durante la producción recombinante. Por otra parte, se considera también la adición de polipéptido exógeno o secuencias de polinucleótidos o de cola de lípidos para aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles obtenidas por ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y varias porciones de las regiones constantes de cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina se prefiere la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, en particular IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región de bisagra. En una forma de realización particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente por incorporación de una secuencia de escisión que puede escindirse con factor de coagulación sanguínea Xa.

Por otra parte, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión por ingeniería genética, y al uso de las mismas para detección selectiva de fármacos, diagnóstico y terapia. Un aspecto más de la invención se refiere también a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las Solicitudes de Patente Internacional nº WO94/29.458 y WO94/22.914.

Las proteínas pueden conjugarse químicamente, o expresarse como proteínas de fusión recombinantes permitiendo producir niveles aumentados en un sistema de expresión en comparación con proteína no fundida. El compañero de fusión puede ayudar a proporcionar epítopos T auxiliares (compañero de fusión inmunológica), preferentemente epítopos T auxiliares reconocidos por seres humanos, o ayudar a expresar la proteína (potenciador de expresión) en rendimientos superiores a los de la proteína recombinante nativa. Preferentemente, el compañero de fusión será un compañero de fusión inmunológica y un compañero de potenciación de la expresión.

Los compañeros de fusión incluyen proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus de influenza, NS1 (hemaglutinina). Otro compañero de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferentemente, se usa la parte C-terminal de la molécula. LytA se obtiene de Streptococcus pneumoniae que sintetiza la N-acetil-L-alanina-amidasa, LytA-amidasa (codificada por el gen LytA {Gene, 43 (1986) página 265-272}), una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la columna principal de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de colina como DEAE. Esta propiedad se ha aprovechado para el desarrollo de C-LytA de E. coli que expresa plásmidos útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su término amino {Biotechnology: 10, (1992) página 795-798}. Es posible usar la parte de repetición de la molécula LytA encontrada en el extremo C-terminal que empieza en el residuo 178, por ejemplo, los residuos
188-305.

La presente invención incluye también variantes de los polipéptidos anteriormente mencionados, es decir, polipéptidos que varían con respecto a los referentes por sustituciones de aminoácidos conservadoras, con lo que un residuo se sustituye por otro de características similares. Existen dichas sustituciones típicas entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse en cualquier modo adecuado. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos aislados de ocurrencia natural, polipéptidos producidos por medios recombinantes, polipéptidos producidos sintéticamente o polipéptidos producidos por una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar dichos polipéptidos son bien conocidos en la técnica.

Lo más preferido es que un polipéptido de la invención se obtenga de Neisseria meningitidis, aunque puede obtenerse preferentemente de otros organismos del mismo género taxonómico. Un polipéptido de la invención puede obtenerse también, por ejemplo, de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Un objeto de la invención es proporcionar polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB082, en particular polinucleótidos que codifican el polipéptido designado en la presente memoria descriptiva como BASB082.

En una forma de realización de la invención preferida en particular, el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos BASB082 que comprenden una secuencia establecida en ID SEC Nº: 1, que incluye un gen de longitud completa o una variante del mismo.

El polinucleótido BASB082 proporcionado en ID SEC Nº: 1 es el polinucleótido BASB082 de las cepas de Neisseria meningitidis ATCC13090.

Como un aspecto más de la invención se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aislados que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB082, en particular polipéptidos y polinucleótidos BASB082 de Neisseria meningitidis, incluyendo, por ejemplo, ARN sin procesar, ARN de ribozimas, ARNm, ADNc, ADN genómicos y ADN-Z bandas. Otras formas de realización de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos útiles desde el punto de vista biológico, diagnóstico, profiláctico, clínico o terapéutico, y variantes de los mismos, y composiciones que comprenden los mismos.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, incluyendo al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB082 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de ID SEC Nº: 2 y polinucleótidos relacionados cercanamente y variantes de los mismos.

En otra forma de realización de la invención preferida particularmente existe un polipéptido BASB082 de Neisseria meningitidis que comprende, o está constituido por, una secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 o una variante de la misma.

Usando la información proporcionada en la presente memoria descriptiva, como una secuencia de polinucleótidos establecida en ID SEC Nº: 1 puede obtenerse un polinucleótido de la invención que codifica polipéptido BASB082 usando procedimientos estándar de clonación y detección selectiva, como los de clonación y secuenciación de fragmentos de ADN cromosómicos a partir de bacterias que usan células de Neisseria meningitidis como material de partida, seguido por la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótidos de la invención, como una secuencia de polinucleótidos dada en ID SEC Nº: 1 normalmente se sondea una biblioteca de clones de ADN cromosómico de Neisseria meningitidis en E. coli o algún otro huésped adecuado con un oligonucleótido radiomarcado, preferentemente de 17 mer o más, obtenido de una secuencia parcial. Entonces pueden distinguirse los clones que llevan ADN idéntico al de la sonda usando condiciones estrictas de hibridación. Al secuenciar los clones individuales así identificados por hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia original de polipéptidos o polinucleótidos es posible extender las secuencias de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar una secuencia génica de longitud completa. Convenientemente, dicha secuenciación se realiza, por ejemplo, usando ADN bicatenario desnaturalizado preparado a partir de clon de plásmido. Se describen técnicas adecuadas en Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL, 2^{a} Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) (véase en particular Screening By Hybridization 1.90 y Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). Puede realizarse también secuenciación directa de ADN genómico para obtener una secuencia génica de longitud completa. Ilustrativo de la invención, cada polinucleótido establecido en ID SEC Nº: 1 se descubrió en una biblioteca de ADN obtenida de Neisseria meningitidis.

Además, cada secuencia de ADN establecida en ID SEC Nº: 1 contiene un marco de lectura abierta que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de residuos de aminoácidos establecidos en ID SEC Nº: 2 con un peso molecular deducido que puede calcularse usando valores de pesos moleculares de residuos de aminoácidos bien conocidos por los expertos en la materia.

El polinucleótido de ID SEC Nº: 1, entre el codón de iniciación en el número de nucleótido 1 y el codón de parada que empieza en el número de nucleótido 2275 de ID SEC Nº: 1, codifica el polipéptido de ID SEC Nº: 2.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o está constituido por:

(a) una secuencia de polinucleótidos que tiene identidad de al menos el 97%, más preferentemente identidad de al menos el 97-99% o exacta con respecto a ID SEC Nº: 1, en toda la longitud de ID SEC Nº: 1; o

(b) una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene identidad de al menos el 97%, más preferentemente identidad de al menos el 97-99% o exacta al 100%, con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 en toda la longitud de ID SEC Nº: 2.

Puede obtenerse un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de especies distintas de Neisseria meningitidis, mediante un procedimiento que comprende las etapas de detección selectiva de una biblioteca apropiada según condiciones estrictas de hibridación (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45 a 65ºC y una concentración de SDS del 0,1 al 1%) con una sonda marcada o detectable constituida por o que comprende la secuencia de ID SEC Nº: 1 o un fragmento de la misma; y aislamiento de clones génicos y/o genómicos de longitud completa que contienen dicha secuencias de polinucleótidos.

La invención proporciona una secuencia de polinucleótidos idéntica en toda su longitud a una secuencia de codificación (marco de lectura abierta) en ID SEC Nº: 1. También se proporciona mediante la invención una secuencia de codificación para un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por sí mismo así como una secuencia de codificación para un polipéptido maduro o un fragmento en marco de lectura con otra secuencia de codificación, como una secuencia que codifica una secuencia delantera o secretora, una secuencia pre- o pro- o prepro-proteína. El polinucleótido de la invención puede contener también al menos una secuencia de no codificación, incluyendo por ejemplo, pero sin limitarse a, al menos una secuencia de no codificación en 5' y 3', como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (como señales de terminación dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión a ribosomas, secuencias de Kozak, secuencias que estabilizan ARNm, intrones y señales de poliadenilación. La secuencias de polinucleótidos pueden comprender también secuencia de codificación adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia de marcador que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas formas de realización de la invención, la secuencia de marcador es un péptido de hexahistidina, como el proporcionado en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y descrito en Gentz y col. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:821-824 (1989), o una etiqueta de péptido HA (Wilson y col., Cell 37:767 (1984), siendo ambos útiles para purificar la secuencia de polipéptidos fundida con ellos. Los polinucleótidos de la invención incluyen también, pero sin limitarse a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión génica.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB082 de ID SEC Nº: 2 puede ser idéntica al polipéptido que codifica la secuencia contenida en los nucleótidos 1 a 2.274 de ID SEC Nº: 1. Alternativamente, puede ser una secuencia que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de ID SEC Nº: 2.

El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" según se usa en la presente memoria descriptiva comprende polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, en particular un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido de BASB082 de Neisseria meningitidis que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en ID SEC Nº: 2. El término comprende también polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vectores integrada, una secuencia de trasposones integrada, o debido a edición de ARN o reorganización de ADN genómico) junto con regiones adicionales, que pueden contener también secuencias de codificación y/o no codificación.

La invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de ID SEC Nº: 2. Pueden usarse fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de la invención de longitud completa.

Otras formas de realización particularmente preferidas son polinucleótidos que codifican variantes BASB082, que tienen la secuencia de aminoácidos de polipéptido BASB082 de ID SEC Nº: 2, en los que varios, algunos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácidos están sustituidos, modificados, suprimidos y/o añadidos en cualquier combinación. Entre éstos se prefieren especialmente sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB082.

Otras formas de realización preferidas de la invención son polinucleótidos que son idénticos en al menos el 97% en toda su longitud a un polinucleótido que codifica polipéptido BASB082 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en ID SEC Nº: 2 y polinucleótidos que son complementarios a dichos polinucleótidos. Por otra parte, entre éstos los que tienen al menos el 98% y al menos el 99% son en particular altamente preferidos, siendo los más preferidos los de al menos el 99%.

Son formas de realización preferidas los polinucleótidos que codifican polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un ADN de ID SEC Nº: 1.

De acuerdo con ciertas formas de realización preferidas de esta invención se proporcionan polinucleótidos que hibridan, en particular en condiciones estrictas, a secuencias de polinucleótidos BASB082, tales como aquellos polinucleótidos en ID SEC Nº: 1.

La invención se refiere además a polinucleótidos que hibridan a las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la presente memoria descriptiva. A este respecto, la invención se refiere especialmente a polinucleótidos que hibridan en condiciones estrictas a los polinucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva. Según se usa en la presente memoria descriptiva, los términos "condiciones estrictas" y "condiciones de hibridación estrictas" significan que la hibridación se produce sólo si existe identidad de al menos el 95% y preferentemente de al menos el 97% entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación estrictas es incubación durante toda la noche 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón triturado desnaturalizado, seguido de lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a 65ºC aproximadamente. Las condiciones de hibridación y de lavado son bien conocidas y están ilustradas en Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), en particular el Capítulo 11 del mismo. La hibridación de solución puede usarse también con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención.

La invención proporciona también un polinucleótido que está constituido por o que comprende secuencias de polinucleótidos obtenidas por detección selectiva de una biblioteca apropiada que contiene el gen completo para secuencias de polinucleótidos establecidas en ID SEC Nº: 1 en condiciones de hibridación estrictas con una sonda que tiene la secuencia de dichas secuencias de polinucleótidos establecidas en ID SEC Nº: 1 o un fragmento de las mismas; y aislamiento de dicha secuencia de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener un polinucleótido semejante incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores descritos completamente en otra parte de la presente memoria descriptiva.

Según se expone en otra parte de la presente memoria descriptiva con respecto a ensayos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, pueden usarse como sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNc y clones genómicos de longitud completa que codifican BASB082 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tienen una alta identidad, en particular alta identidad de secuencia, con respecto al gen BASB082. Dichas sondas comprenderán generalmente al menos 15 residuos de nucleótidos o pares de bases. Preferentemente, dichas sondas tendrán al menos 30 residuos de nucleótidos o pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos de nucleótidos o pares de bases. Las sondas preferidas particularmente tendrán al menos 20 residuos de nucleótidos o pares de bases y tendrán menos de 30 residuos de nucleótidos o pares de bases.

Una región de codificación de un gen BASB082 puede aislarse por detección selectiva usando una secuencia de ADN proporcionada en ID SEC Nº: 1 para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Se usa entonces un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención para detectar selectivamente una biblioteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar a qué miembros de la biblioteca hibrida la sonda.

Existen varios procedimientos disponibles y bien conocidos por los expertos en la materia para obtener ADN de longitud completa, o extender ADN cortos, por ejemplo los basados en el procedimiento de Amplificación Rápida de extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85: 8998 - 9002, 1988). Recientes modificaciones de la técnica, ilustradas por la tecnología Marathon^{TM} (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología MarathonTM, los ADNc se han preparado a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada en ambos extremos. A continuación se efectúa amplificación de ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5' "desaparecido" del ADN usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos específicos del gen y específicos del adaptador. A continuación se repite la reacción PCR usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para apareamiento con el producto amplificado (normalmente un cebador específico de adaptador que aparea más 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico de gen que aparea más 5' en la secuencia de gen seleccionada). A continuación pueden analizarse los productos de esta reacción mediante secuenciación de ADN y un ADN de longitud completa construido por unión del producto directamente al ADN existente para dar una secuencia completa, o efectuar una PCR de longitud completa independiente usando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden emplearse, por ejemplo, como reactivos de investigación y materiales para el descubrimiento de tratamientos y diagnóstico de enfermedades, en particular enfermedades humanas, como se expone más adelante en la presente memoria descriptiva con relación a ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos obtenidos de una secuencia de ID SEC Nº: 1 pueden usarse en los procedimientos de la presente memoria descriptiva según se describe, pero preferentemente para PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados en la presente memoria descriptiva se transcriben o no, en parte o en la totalidad, en bacterias en tejido infectado. Se reconoce que dichas secuencias tendrán también utilidad en el diagnóstico de la fase de infección y el tipo de infección que ha alcanzado el patógeno.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos adicionales con terminal amino o carboxilo, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena de polipéptidos, por ejemplo). Dichas secuencias pueden desempeñar una función en el tratamiento de una proteína a partir de precursor a una forma madura, pueden permitir transporte de proteínas, pueden alargar o acortar la semivida de las proteínas o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in vivo, los aminoácidos adicionales pueden tratarse a partir de la proteína madura por enzimas celulares.

Para todos y cada uno de los polinucleótidos de la invención se proporciona un polinucleótido complementario a él. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios a cada polinucleótido del que son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido fusionado con una o más prosecuencias, puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se eliminan las prosecuencias, en general dichos precursores inactivos se activan. Parte o la totalidad de las prosecuencias puede eliminarse antes de la activación. En general, dichos precursores se denominan proproteínas.

Además de las representaciones estándar A, G, C, T/U de nucleótidos, el término "N" puede usarse también para describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en dicha posición designada en la secuencia de ADN o ARN, con la salvedad de que se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en combinación con posiciones de nucleótido adyacentes, cuando se lee en el marco de lectura correcto, tendría el efecto de generar un codón de terminación prematuro en dicho marco de lectura.

En suma, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia delantera (que puede referirse como preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son secuencias delanteras de una preproteína o una preproproteína, que es un precursor a una proproteína, que tiene una secuencia delantera y una o más prosecuencias, que generalmente se eliminan durante el tratamiento de etapas que producen formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para fines terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética empleará preferentemente un procedimiento de suministro adecuado como inyección directa de ADN de plásmido en los músculos (Wolff y col., Hum Mol Genet (1992) 1:363, Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4:419), suministro de ADN con formación de complejo con vehículos específicos de proteínas (Wu y col., J. Biol., Chem. (1989) 264:16985), coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenisty y Reshef, PNAS USA, (1986) 83:9551), encapsulado de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243:375), bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12:791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col., PNAS USA (1984) 81:5849).

Vectores, células huésped, sistemas de expresión

La invención se refiere también a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células huésped que son sometidas a ingeniería genética con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir dichas proteínas usando ARN obtenidos de los constructos de ADN de la invención.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia a partir de células huésped sometidas a ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. En consecuencia, en un aspecto más, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células huésped que son sometidos a ingeniería genética con dichos sistemas de expresión y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes.

Para producción recombinante de los polipéptidos de la invención, pueden someterse a ingeniería genética células huésped para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en la célula huésped puede efectuarse mediante procedimientos descritos en numerosos manuales de laboratorio estándar, como Davis, y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) y Sambrook, y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), como transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAEdextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga de raspaduras, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, Streptomyces, cianobacterias, Bacillus subtilis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis; células fúngicas, como células de levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto como célula de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células vegetales, como células de una gimnosperma o una angiosperma.

La invención proporciona también una célula hospedadora de Neisseria meningitidis que comprende un vector de expresión, en la que dicho vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico; o una fracción subcelular o membrana de dicha célula hospedadora que expresa dicho polipéptido o fragmento inmunogénico.

La invención proporciona también un procedimiento para producir un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, que comprende el cultivo de la célula hospedadora de Neisseria meningitidis definida anteriormente en condiciones suficientes para producir dicho polipéptido o fragmento inmunogénico y recuperar el polipéptido o fragmento inmunogénico del medio de cultivo.

La invención proporciona también un procedimiento para producir una vacuna, que comprende i) un procedimiento para producir un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, que comprende el cultivo de la célula hospedadora de Neisseria meningitidis definida anteriormente en condiciones suficientes para producir dicho polipéptido o fragmento inmunogénico y recuperar el polipéptido o fragmento inmunogénico del medio de cultivo; y además comprende ii) la etapa de formular dicho polipéptido o fragmento inmunogénico con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Puede usarse una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Dichos vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus como, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de trasposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus como baculovirus, virus papova, como SV40, virus vaccinia, adenovirus, poxvirus de viruela aviar, virus de pseudorrabia, picornavirus, retrovirus y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, como los derivados de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, como cósmidos y fagémidos. Los constructos del sistema de expresión pueden contener regiones de control que regulan y engendran expresión. En general, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un huésped puede usarse para expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresión mediante cualquier variedad de técnicas rutinarias y bien conocidas, como, por ejemplo, las establecidas en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (más arriba).

En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para secreción de una proteína traducida en la luz del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, pueden incorporarse señales e secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante procedimientos bien conocidos, incluyendo precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lecitina. Con la máxima preferencia, se emplea cromatografía de afinidad por ion metálico (IMAC) para purificación. Pueden emplearse técnicas bien conocidas para replegar proteínas al objeto de regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis, aislamiento o purificación intracelular.

La invención proporciona también un procedimiento de purificación de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, en el que dicho procedimiento se selecciona del grupo que está constituido por precipitación de sulfato de amonio, precipitación de etanol, extracción ácida, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lecitina.

La invención proporciona también un procedimiento para producir una composición de vacuna que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, en el que dicho procedimiento comprende el procedimiento anterior de purificación y además comprende la etapa de formular dicho polipéptido o fragmento inmunogénico con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

El sistema de expresión puede ser también un microorganismo vivo recombinante, como un virus o una bacteria. El gen de interés puede insertarse en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo llevará a expresión in vivo del antígeno e inducción de respuestas inmunitarias. Los virus y bacterias usados para este fin son, por ejemplo: poxvirus (por ejemplo, vaccinia, de viruela aviar, de viruela del canario), alfavirus (virus de Sindbis, virus del bosque de Semliki, virus de encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adenoasociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus), herpesvirus (virus de varicela-zóster, etc), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos o atenuados de diversas formas para obtener vacunas vivas. Dichas vacunas vivas forman también parte de la invención.

Ensayos de diagnóstico, pronóstico, serotipado y mutación

Esta invención está relacionada también con el uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB082 de la invención para uso como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB082 en un eucariota, en particular un mamífero, y especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento de diagnóstico para el diagnóstico de la enfermedad, el estadiaje de la enfermedad o la respuesta a los fármacos de un organismo infeccioso. Los eucariotas, en particular los mamíferos, y especialmente los seres humanos, en particular los infectados o sospechosos de infección con un organismo que comprende el gen o proteína BASB082, pueden detectarse en el nivel de ácidos nucleicos o aminoácidos mediante una diversidad de técnicas bien conocidas, así como por procedimientos proporcionados en la presente memoria descriptiva.

Los polipéptidos y polinucleótidos para pronóstico, diagnóstico u otro análisis pueden obtenerse de materiales corporales de individuos infectados y/o posiblemente infectados. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, en particular ADN o ARN, pueden usarse directamente para detección o pueden amplificarse enzimáticamente usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación antes del análisis. También pueden usarse de la misma forma ARN, en particular ARNm, ADNc y ADN genómico. Usando amplificación, la caracterización de la especie y la cepa de organismos infecciosos o residentes presentes en un individuo puede hacerse mediante un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las deleciones e inserciones pueden detectarse mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada de un organismo relacionado, preferentemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales pueden identificarse hibridando ADN amplificado a secuencias de polinucleótidos BASB082 marcadas. Las secuencias con correspondencia perfecta o significativa pueden distinguirse de las parejas con correspondencia imperfecta o menos significativa por digestión de ADNasa o ARNasa, por ADN o ARN respectivamente, o por detección de las diferencias en las temperaturas de fusión o la cinética de renaturalización. Las diferencias de secuencias de polinucleótidos pueden detectarse también mediante alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de polinucleótidos en geles en comparación con una secuencia de referencia. Esto puede realizarse con o sin agentes de desnaturalización. Las diferencias de polinucleótido pueden detectarse también mediante secuenciación directa de ADN o ARN. Véase por ejemplo, Myers y col., Science, 230:1242 (1985). Los cambios de secuencia en lugares específicos pueden revelarse también por ensayos de protección de nucleasa, como ensayos de protección de ARNasa, V1 y S1 o un procedimiento de escisión química. Véase por ejemplo, Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4397-4401 (1985).

En otra forma de realización, puede construirse una matriz de sondas de oligonucleótidos que comprende secuencia de nucleótidos BASB082 o fragmentos de la misma para realizar una detección selectiva eficaz de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipo, clasificación o identificación taxonómica. Los procedimientos de tecnologías de matrices son bien conocidos y tienen una aplicabilidad general y pueden usarse para responder a una diversidad de preguntas en genética molecular incluyendo expresión génica, unión genética y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y col., Science, 274:610 (1996)).

Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido de la presente invención, preferentemente la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº: 1 o un fragmento de la misma;

(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c) un polipéptido de la presente invención, preferentemente el polipéptido de ID SEC Nº: 2, o un fragmento del mismo; o

(d) un anticuerpo para un polipéptido de la presente invención, preferentemente para el polipéptido de ID SEC Nº: 2.

Se apreciará que en cualquier kit de este tipo, (a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Dicho kit tendrá uso en el diagnóstico de una enfermedad o en la susceptibilidad a una enfermedad, entre otros.

Esta invención se refiere también al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferentemente ID SEC Nº: 1 que se asocia a una enfermedad o patogenicidad proporcionará un instrumento de diagnóstico que puede añadirse a, o definir un diagnóstico de una enfermedad, un pronóstico de un curso de enfermedad, una determinación de una fase de la enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad, que tiene como resultado la subexpresión, sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, en particular los organismos infecciosos, que llevan mutaciones en dicho polinucleótido pueden detectarse en el nivel de polinucleótido mediante una variedad de técnicas, como las descritas en otras partes de la presente memoria descriptiva.

Las células de un organismo que porta mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención pueden detectarse también en el nivel del polinucleótido o polipéptido mediante una variedad de técnicas, para permitir, por ejemplo, el serotipado. Por ejemplo, puede usarse RT-PCR para detectar mutaciones en el ARN. En particular, se prefiere usar RT-PCR en conjunción con sistemas de detección automatizados, como, por ejemplo, GeneScan. También pueden usarse para el mismo propósito ARN, ADNc o ADN genómico, PCR. Por ejemplo, pueden usarse cebadores PCR complementarios a un polinucleótido que codifica polipéptido BASB082 para identificar y analizar mutaciones.

La invención proporciona además cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3'. Estos cebadores pueden usarse para, entre otras cosas, ADN y/o ARN de BASB082 aislados a partir de una muestra obtenida de un individuo, como un material corporal.

Los cebadores pueden usarse para amplificar un polinucleótido aislado de un individuo infectado, de manera que el polinucleótido pueda someterse entonces a diversas técnicas para elucidación de la secuencia de polinucleótidos. De esta forma, pueden detectarse y usarse mutaciones en las secuencias de polinucleótidos para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su fase o curso, o para serotipar y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención proporciona además un procedimiento para diagnosticar enfermedad, preferentemente infecciones bacterianas, más preferentemente infecciones causadas por Neisseria meningitidis, que comprende la determinación a partir de una muestra obtenida de un individuo, como un material corporal, un nivel aumentado de expresión de polinucleótido que tiene una secuencia de ID SEC Nº: 1. La expresión aumentada o reducida de un polinucleótido BASB082 puede medirse usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de ARNasa, transferencia Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, puede usarse un ensayo de diagnóstico según la invención para detectar sobreexpresión de polipéptido BASB082 en comparación con muestras de tejido de control normal para detectar la presencia de una infección, por ejemplo. Las técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar niveles de un polipéptido BASB082, en una muestra obtenida de un huésped, como un material corporal, son bien conocidos para los expertos en la técnica. Dichos procedimientos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia Western, ensayos de sándwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos ELISA.

Los polinucleótidos de la invención pueden usarse como componentes de matrices de polinucleótido, preferentemente matrices o retículas de alta densidad. Estas matrices de alta densidad son particularmente útiles con fines de diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, puede usarse un conjunto de puntos que comprenden cada uno un gen diferente, y que comprenden además un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, como sondas, usando por ejemplo hibridación o amplificación de ácidos nucleicos, usando una sonda obtenida o derivada de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia de polinucleótidos particular o de una secuencia relacionada en un individuo.

Dicha presencia puede indicar la presencia de un patógeno, en particular Neisseria meningitidis, y puede ser útil en el diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad o del curso de una enfermedad. Se prefiere una retícula que comprenda una serie de variantes de las secuencias de polinucleótidos de ID SEC Nº: 1. También se prefiere una retícula que comprenda una serie de variantes de secuencias de polinucleótidos que codifican la secuencia de polipéptidos de ID SEC Nº: 2.

Anticuerpos

Pueden usarse polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de los mismos, o células que expresan los mismos como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para dichos polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente.

En ciertas formas de realización preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos BASB082.

Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención por administración de los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos vehículos de epítopos de uno o ambos, análogos de uno o ambos, o células que expresan uno o ambos, a un animal, preferentemente no humano, usando protocolos de rutina. Para preparar anticuerpos monoclonales puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica que proporciona anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, como las de Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495 - 497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole y col., pág. 77 - 96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de EE.UU. nº 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios a polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. Además, pueden usarse ratones transgénicos, u otros organismos o animales, como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos de los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

Alternativamente, puede utilizarse tecnología de exhibición de fagos para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un polipéptido de la invención ya sea a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos de seres humanos detectados selectivamente por poseer anti-BASB082 o a partir de bibliotecas nuevas (McCafferty, y col., (1990), Nature 348, 552 - 554; Marks, y col., (1992) Biotechnology 10, 779 - 783). La afinidad de estos anticuerpos puede mejorarse también, por ejemplo, mediante purgado de cadena (Clackson y col., (1991) Nature 352: 628).

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden emplearse para aislar o identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.

Así, entre otros, pueden emplearse anticuerpos contra BASB082-polipéptido o BASB082-polinucleótido para tratar infecciones, en particular infecciones bacterianas.

Las variantes de polipéptido incluyen variante antigénica, epitópica o inmunológicamente equivalente que forman un aspecto particular de esta invención.

Preferentemente, el anticuerpo o variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano, el anticuerpo puede "humanizarse" con la máxima preferencia, en el que la región o regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma se han trasplantado a un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo, según se describe en Jones y col. (1986), Nature 321: 522 - 525 o Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266 - 273.

Antagonistas y agonistas: ensayos y moléculas

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden usarse también para evaluar la unión de sustratos y ligandos de moléculas pequeñas como, por ejemplo, células, preparados libres de células, bibliotecas químicas y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase por ejemplo, Coligan y col., Current Protocols in Immunology 1 (2): capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de detección selectiva pueden medir simplemente la unión de un compuesto candidato para el polipéptido o polinucleótido, o para células o membranas que llevan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido por medio de una etiqueta directa o indirectamente asociada con el compuesto candidato. Alternativamente, el procedimiento de detección selectiva puede implicar competencia con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de detección selectiva pueden probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprende el polipéptido o polinucleótido. En general se someten a ensayo inhibidores de activación en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto en la activación por el agonista por la presencia del compuesto candidato. Pueden emplearse polipéptido constitutivamente activo y/o polipéptidos y polinucleótidos expresados constitutivamente en los procedimientos de detección selectiva para agonistas inversos o inhibidores, en ausencia de un agonista o inhibidor, probando si el compuesto candidato da como resultado la inhibición de activación del polipéptido o polinucleótido, según el caso. Además, los procedimientos de detección selectiva pueden comprender simplemente las etapas de mezclado de un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, midiendo la actividad de polipéptido y/o polinucleótido BASB082 en la mezcla, y comparando la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB082 de la mezcla con un patrón. También pueden usarse proteínas de fusión, como las formadas en la porción Fc y el polipéptido BASB082, según se ha descrito anteriormente en la presente memoria descriptiva, para ensayos de detección selectiva de alto rendimiento para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos relacionados filogenética y/o funcionalmente (véase D. Bennett y col., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); y K. Johanson y col., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a y/o interaccionan con un polipéptido de la presente invención pueden usarse también para configurar procedimientos de detección selectiva para detectar el efecto de compuestos añadidos en la producción de ARNm y/o polipéptido en células. Por ejemplo, puede construirse un ensayo ELISA para medir niveles secretados o asociados a células de polipéptido usando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica. Esto puede usarse para descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también denominado antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células y tejidos manipulados de forma adecuada.

La invención también proporciona un procedimiento de detección selectiva de compuestos para identificar los que potencian (agonistas) o bloquean (antagonistas) la acción de polipéptidos o polinucleótidos BASB082, en particular aquellos compuestos que son bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de detección selectiva puede implicar técnicas de alto rendimiento. Por ejemplo, para detectar agonistas o antagonistas, se incuba una mezcla de reacción sintética, un compartimiento celular, como una membrana, envoltura celular o pared celular, o un preparado de cualquiera de los mismos, que comprende polipéptido BASB082 y un sustrato o ligando marcado de dicho polipéptido se incuba en la ausencia o la presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista BASB082. La capacidad de la molécula candidata para agonizar o antagonizar el polipéptido BASB082 se refleja en una unión disminuida de ligando marcado o una producción disminuida de producto de dicho sustrato. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos de polipéptido BASB082 son más probablemente buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien y, según el caso, aumentan la velocidad de producción del producto a partir del sustrato, aumentan la transducción de señal o aumentan la actividad de canal químico son agonistas. La detección de la velocidad o el nivel, según el caso, de producción de producto a partir del sustrato, transducción de señales o actividad de canal químico puede potenciarse usando un sistema indicador. Los sistemas indicadores que pueden ser útiles a este respecto incluyen, pero no se limitan a, sustrato marcado colorimétrico convertido en producto, un gen indicador que responde a cambios en la actividad de polinucleótido o polipéptido BASB082, y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para agonistas BASB082 es un ensayo competitivo que combina BASB082 y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB082, moléculas de unión a BASB082 recombinante, sustratos o ligandos naturales o miméticos de sustratos o ligandos, en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. BASB082 puede marcarse, por ejemplo, por radioactividad o un compuesto colorimétrico, de manera que el número de moléculas BASB082 ligadas a una molécula de unión o convertidas en producto puede determinarse con precisión para evaluar la efectividad del antagonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención y, por tanto, inhiben o extinguen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales pueden ser también pequeñas moléculas orgánicas, un péptido, un polipéptido como una proteína o anticuerpo estrechamente relacionados que se unen a los mismos sitios en una molécula de unión, como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB082, evitando por tanto la acción o expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos BASB082 excluyendo polipéptidos y/o polinucleótidos BASB082 de la
unión.

Los antagonistas potenciales incluyen una pequeña molécula que se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido, evitando por tanto la unión a moléculas de unión celular, de manera que se evite la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, pequeñas moléculas orgánicas, péptidos o moléculas de tipo péptido. Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido (véase Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GEN EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados y variantes de BASB082.

En un aspecto más, la presente invención se refiere a proteínas de fusión solubles sometidas a ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y varias porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, en particular IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región de bisagra. En una forma particular de realización, la parte Fc puede retirarse simplemente incorporando una secuencia de escisión que puede escindirse con factor de coagulación sanguínea Xa. Por otra parte, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión por ingeniería genética, y al uso de las mismas para detección selectiva de fármacos, diagnóstico y terapia. Un aspecto más de la invención se refiere también a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las Solicitudes de Patente Internacional nº. WO94/29.458 y WO94/22.914.

Cada una de las secuencias de polinucleótidos proporcionada en la presente memoria descriptiva puede usarse en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, bajo expresión, puede usarse como diana de la detección selectiva de fármacos antibacterianos. Además, pueden usarse las secuencias de polinucleótidos que codifican las regiones terminales amino de la proteína codificada o secuencias de facilitación de Shine-Delgarno u otra traducción del ARNm respectivo para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia de codificación de interés.

La invención proporciona también el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un huésped eucariota, preferentemente mamífero, responsable de secuelas de infección. En particular, pueden usarse las moléculas de la invención: en la prevención de adhesión de bacterias, en particular bacterias gram-positivas y/o gram-negativas, a proteínas eucariotas, preferentemente de mamíferos, de matriz extracelular en dispositivos integrados o en proteínas de matriz extracelular en heridas; para bloquear adhesión bacteriana entre proteínas eucariotas, preferentemente de mamíferos, de matriz extracelular y proteínas BASB082 bacterianas que median daño tisular y/o para bloquear la progresión normal de patogénesis en infecciones iniciadas no por la implantación de dispositivos integrados o por otras técnicas quirúrgicas.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporcionan agonistas y antagonistas BASB082, preferentemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas de la invención pueden emplearse, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar enfermedades.

En un aspecto más, la presente invención se refiere a mimótopos del polipéptido de la invención. Un mimótopo es una secuencia de péptidos, suficientemente similar al péptido nativo (secuencial o estructuralmente), que es susceptible de ser reconocido por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o es susceptible de provocar anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando se acopla a un vehículo adecuado.

Los mimótopos de péptidos pueden diseñarse para un fin particular por adición, deleción o sustitución de aminoácidos elegidos. Así, los péptidos pueden modificarse con fines de facilitar la conjugación a un vehículo de proteína. Por ejemplo, puede ser deseable en algunos procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además, pueden ser deseables péptidos conjugados con un vehículo de una proteína para incluir un término hidrófobo distal con respecto al término conjugado del péptido, de manera que el extremo libre no conjugado del péptido permanezca asociado con la superficie de la proteína portadora. Por tanto, se presenta el péptido en una conformación que se asemeja más estrechamente a la del péptido según se encuentra en el contexto de la molécula nativa completa. Por ejemplo, los péptidos pueden alterarse para que tengan una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrófoba Cterminal. Alternativamente, puede efectuarse la adición o sustitución de una forma de D-estereoisómero de uno o más de los aminoácidos para crear un derivado beneficioso, por ejemplo, para potenciar la estabilidad del péptido.

Alternativamente, pueden identificarse mimótopos de péptidos usando anticuerpos que sean capaces de unirse en sí mismos a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas como tecnología de exhibición de fagos (documento EP-0.552.267-B1). Esta técnica genera un gran número de secuencias de péptidos que emulan la estructura de los péptidos nativos y son, por tanto, capaces de unión a anticuerpos de péptidos antinativos, pero pueden no compartir necesariamente una homología de secuencia significativa con el polipéptido nativo.

Vacunas

La invención proporciona una composición de vacuna que comprende:

(i): Una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico;

(ii): Un vehículo farmacéuticamente aceptable; y

(iii): Un adyuvante seleccionado del grupo que está constituido por lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado, QS21, QS21 y colesterol, un oligonucleótido inmunomodulatorio y combinaciones de los mismos.

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La invención también proporciona una composición de vacuna que comprende:

(i): Una cantidad eficaz de un polinucleótido que tiene una identidad al menos el 85% con respecto a la de ID SEC Nº: 1;

(ii): Un vehículo farmacéuticamente aceptable; y

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, en particular un mamífero, preferentemente un ser humano, que comprende la inoculación en el individuo de polinucleótido y/o polipéptido BASB082, o un fragmento o variante de los mismos, adecuada para producir anticuerpo y/o respuesta inmunitaria a células T para proteger a dicho individuo de la infección, en particular infección bacteriana y más en particular infección por Neisseria meningitidis. También se proporcionan procedimientos en los que dicha respuesta inmunológica ralentiza la replicación bacteriana. Otro aspecto más de la invención se refiere a un procedimiento para inducir respuesta inmunológica en un individuo que comprende el suministro a dicho individuo de un vector de ácidos nucleicos, secuencia o ribozima para dirigir la expresión de polinucleótido y/o polipéptido BASB082, o un fragmento o una variante de los mismos, para expresar polinucleótido y/o polipéptido BASB082, o un fragmento o una variante de los mismos in vivo para inducir una respuesta inmunológica, como, por ejemplo, para producir anticuerpo y/o respuesta inmunitaria a células T, incluyendo, por ejemplo, células T productoras de citosina o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo, preferentemente un ser humano, de la enfermedad, ya se haya esa enfermedad establecido en el individuo o no. Un ejemplo de administración del gen consiste en acelerarlo en las células deseadas como un revestimiento en partículas u otros. Dicho vector de ácidos nucleicos puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo de ADN-proteína o un complejo de ARN-proteína.

Un aspecto más de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferentemente un ser humano, susceptible de haber inducido en él una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en dicho individuo a un polinucleótido y/o polipéptido BASB082 codificado a partir de los mismos, en el que la composición comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB082 recombinante codificado a partir de los mismos y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido BASB082, polipéptido codificado a partir del mismo u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica puede usarse terapéutica o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpo y/o inmunidad celular, como inmunidad celular surgida de células T CTL o CD4+.

Un polipéptido BASB082 o un fragmento del mismo puede fusionarse con una coproteína o una fracción química que puede o no producir anticuerpos por sí misma, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y de producir una proteína fusionada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferentemente propiedades protectoras. Así, la proteína recombinante fusionada, que preferentemente comprende además una coproteína antigénica, como lipoproteína D de Haemophilus influenzae, glutationa-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmunitario del organismo que recibe la proteína. La coproteína puede unirse al término amino- o carboxi- de la primera proteína.

En una composición de vacuna de acuerdo con la invención, un polipéptido y/o polinucleótido BASB082, o un fragmento, o un mimotopo, o una variante de los mismos pueden estar presentes en un vector, tal como los vectores recombinantes vivos descritos anteriormente, como por ejemplo vectores bacterianos vivos.

También son adecuados los vectores no vivos para el polipéptido BASB082, por ejemplo vesículas o "ampollas" de la membrana exterior bacteriana. Las ampollas de la membrana exterior se derivan de la membrana exterior de la membrana de dos capas de la bacteria Gram-negativa y se han documentado en muchas bacterias Gram-negativas (Zhou, L y col. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163: 223 - 228) incluyendo C. trachomatis y C. psittaci. Una lista no exhaustiva de patógenos bacterianos que producen ampollas también incluye: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Esherichia coli, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica.

La invención también proporciona una vesícula de la membrana exterior bacteriana que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2, o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, obtenible a partir de una célula hospedadora que comprende un vector de expresión, comprendiendo el vector de expresión un polinucleótido que codifica dicho polipéptido o fragmento inmunogénico, y teniendo el polinucleótido una región cadena arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo.

Las ampollas tienen la ventaja de proporcionar proteínas de la membrana exterior en su conformación nativa y son por lo tanto particularmente útiles para las vacunas. Las ampollas también se pueden mejorar para el uso en vacunas por medio de la modificación por ingeniería genética de la bacteria de tal forma que modifica la expresión de una o más moléculas en la membrana exterior. Así pues, por ejemplo, se puede introducir o regular hacia arriba (por ejemplo, alterando el promotor) la expresión de una proteína inmunogénica deseada en la membrana exterior, tal como el polipéptido BASB082. En su lugar o además, la expresión de moléculas de la membrana exterior que no son relevantes (por ejemplo, antígenos no protectores o proteínas inmunodominantes pero variables) o perjudiciales (por ejemplo moléculas tóxicas tales como LPS o inductores potenciales de una respuesta auntoinmune) se puede regular cadena abajo. Estos enfoques se discuten en más detalle a continuación.

Las regiones flanqueantes no codificadoras del gen BASB082, contienen elementos reguladores importantes en la expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto a nivel transcripcional como traduccional. La secuencia de estas regiones, bien hacia arriba o hacia debajo de la fase abierta de lectura del gen, se puede obtener mediante secuenciación de DNA. Esta información de secuencias permite la determinación de los motivos reguladores potenciales tales como los elementos promotores diferentes, secuencias exterminadoras, elementos de secuencias inducibles, represores, elementos responsables de la variación de fases, la secuencia brillo - dalgamo, regiones con estructura secundaria potencial implicada en regulación, así como otros tipos de motivos o secuencias reguladoras.

Esta información de secuencias permite la modulación de la expresión natural del gen BASB082. La regulación hacia arriba de la expresión del gen se puede llevar a cabo alterando el promotor, la secuencia de brillo - dalgamo, elemento de los represores u operadores potenciales, o cualquier otro elemento implicado. De manera similar, la regulación hacia abajo de la expresión se puede llevar a cabo mediante tipos similares de modificaciones. Como alternativa, cambiando las secuencias de variación de fase, la expresión del gen se puede poner en control de variación de fase, o se puede desacoplar de esta regulación. En otro planteamiento, la expresión del gen se puede poner bajo el control de uno o más elementos inducibles que permite la expresión regulada. Los ejemplos de tal regulación incluyen, pero sin limitación, la inducción mediante el desplazamiento de temperaturas, la adición de sustratos inductores parecidos a carbohidratos seleccionados de sus derivados, oligoelementos, vitaminas, co-factores, iones metálicos, etc.

Tales modificaciones como se han descrito anteriormente se pueden introducir mediante diferentes medios. La modificación de las secuencias implicadas en la expresión génica se puede hacer in vivo mediante mutagénesis aleatoria seguida de selección del fenotipo deseado. Otro planteamiento consiste en el aislamiento de la región de interés y modificarla por mutagénesis aleatoria, o mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de inserción o supresión. Después la región modificada se puede volver a introducir en el genoma bacteriano mediante recombinación homóloga, y se puede determinar el efecto sobre la expresión génica. En otro planteamiento, el conocimiento de la secuencia de la región de interés se puede usar para reemplazar o suprimir toda o parte de las secuencias reguladoras naturales. En este caso, la región reguladora dirigida se aísla y se modifica de manera que contenga los elementos reguladores de otro gen, una combinación de los elementos reguladores de genes diferentes, una región reguladora sintética, o cualquier otra región reguladora, o para suprimir partes seleccionadas de las secuencias reguladoras de tipo salvaje. Estas secuencias modificadas se pueden después volver a introducir en la bacteria mediante recombinación homóloga en el genoma. Una lista no exhaustiva de promotores preferidos se podrían usar para la regulación hacia arriba de la expresión génica incluye el promotor porA, porB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB de N. meningitidis o N. gonorroheae; ompCD, copB, lbpB, ompE, UspA1; UspA2; TbpB de M Catarrhalis; pl, p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia, Hmwl, Hmw2 de H. influenzae.

En un ejemplo, la expresión del gen se puede modular cambiando su promotor con un promotor más fuerte (mediante el aislamiento de la secuencia hacia arriba del gen, modificación in vitro de esta secuencia, y la reintroducción en el genoma mediante recombinación homóloga). La expresión de regulación hacia arriba se puede obtener en ambas bacterias así como en la cubierta de las vesículas de las membranas externas (o hechas) de las bacterias.

En otros ejemplos, los planteamientos descritos se pueden usar para generar cepas de bacterias recombinantes con características mejoradas para aplicaciones de vacunas. Éstos pueden ser, pero sin limitación, cepas atenuadas, cepas con expresión incrementada de antígenos seleccionados, cepas con eliminación genética (o expresión disminuida) de genes que interfieren con la respuesta inmune, cepas con expresión modulada de proteínas inmunodominantes, cepas con recubrimiento modulado de vesículas de las membranas externas.

Asimismo, también se proporciona por medio de la invención una región hacia arriba modificada del gen BASB082, conteniendo dicha región hacia arriba modificada un elemento regulador heterólogo que altera el nivel de expresión de la proteína BASB082 situada en la membrana exterior. La región hacia arriba de acuerdo con este aspecto de la invención incluye la secuencia hacia arriba del gen BASB082. La región hacia arriba comienza inmediatamente hacia arriba del gen BASB082 y normalmente continúa hasta una posición no más de aproximadamente 1.000 pb hacia arriba del gen a partir del codón de partida ATG. En el caso de un gen situado en una secuencia policistrónica (operón) la región hacia arriba comienza inmediatamente antes del gen de interés, o antes del primer gen en el operón. Preferentemente, una región hacia arriba modificada de acuerdo con este aspecto de la invención contiene un promotor heterólogo en una posición entre 500 y 700 pb hacia arriba del ATG.

Asimismo, la invención proporciona un polipéptido BASB082 en una ampolla bacteriana modificada. La invención además proporciona células hospedadoras modificadas capaces de producir los vectores no vivos de la ampolla basada en la membrana. La invención proporciona además vectores de ácidos nucleicos que comprenden el gen BASB082 que tiene una región hacia arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo.

Además, la invención proporciona procedimientos para preparar células hospedadoras y ampollas bacterianas de acuerdo con la invención.

Mediante esta invención se proporcionan composiciones, en particular composiciones de vacunas, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, como las descritas en Sato, Y. y col. Science 273: 352 (1996).

Asimismo, por esta invención se proporcionan procedimientos que usan el polinucleótido descrito o fragmentos particulares del mismo, para los que se ha demostrado que codifican regiones no variables de proteínas bacterianas de superficie celular, en constructos de polinucleótidos usados en dichos experimentos de inmunización genética en modelos de animales de infección con Neisseria meningitidis. Dichos experimentos serán útiles particularmente para identificar epítopos de proteínas capaces de provocar una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica. Se cree que este planteamiento permitirá la preparación subsiguiente de anticuerpos monoclonales de valor particular, obtenidos del órgano requerido del animal que resiste con éxito o aclara la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, en particular infección con Neisseria meningitidis, en mamíferos, en particular seres humanos.

La invención incluye también una formulación de vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dado que los polipéptidos y polinucleótidos pueden descomponerse en el estómago, cada uno de ellos se administra preferentemente parenteralmente, incluyendo, por ejemplo, administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que reproducen la formulación isotónica con el fluido corporal, preferentemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases monodosis o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado de congelación seca que sólo requiere la adición del vehículo de líquido estéril inmediatamente antes de usarlo.

La formulación de vacuna de la invención puede incluir también sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferentemente, el sistema adyuvante eleva preferentemente un tipo de respuesta TH1.

Una respuesta inmunitaria puede distinguirse ampliamente en dos categorías extremas, que son respuestas inmunitarias humorales o mediadas por células (caracterizadas tradicionalmente por mecanismos de protección de anticuerpos y de efectores celulares, respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células) y respuestas inmunitarias de tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunitarias de tipo TH1 extremas pueden caracterizarse por la generación de antígeno específico, linfocitos T citotóxico restringidos por haplotipo, y respuestas de células asesinas naturales. En ratones, las respuestas de tipo TH1 se caracterizan a menudo por la generación de anticuerpos del subtipo Ig2a, mientras que en el ser humano corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunitarias de tipo TH2 se caracterizan por la generación de una amplia gama de isotipos de inmunoglobulina que se incluyen en IgG1, IgA e IgM de ratones.

Puede considerarse que la fuerza impulsora del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunitarias son citocinas. Los altos niveles de citocinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células para el antígeno dado, mientras que niveles altos de citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales al antígeno.

La distinción de respuestas inmunitarias de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad, un individuo admitirá una respuesta inmunitaria que se describe como predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citocinas de lo que han descrito en clones celulares en células T CD4 +ve murinas Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of linfokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pág. 145 - 173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH 1 se asocian a la producción de las citocinas de INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citocinas a menudo asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunitarias de tipo TH1 no son producidas por células T, como IL- 12. En contraste, las respuestas de tipo TH2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citocinas de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmunitaria después de una vacunación o infección incluye la medida directa de la producción de citocinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro después de reestimulación con antígeno, y/o la medida de la relación IgG1:IgG2a de respuestas de anticuerpos específicas de antígenos.

Así, un adyuvante de tipo TH1 es aquél que estimula preferentemente poblaciones aisladas de células T para producir altos niveles de citocinas de tipo TH1 cuando se reestimulan con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo de linfocitos T citotóxicos CD8+ y respuestas de inmunoglobinas específicas de antígenos asociadas con isotipo de tipo TH1.

Los adyuvantes que son capaces de estimulación preferente de la respuesta celular TH1 se describen en la Solicitud de Patente Internacional nº WO 94/00.153 y WO 95/17.209.

Uno de dichos adyuvantes es lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado (3D-MPL). Esto se sabe por el documento GB 2.220.211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y está fabricado por Ribi Immunochem, Montana. En la Patente Europea 0.689.454-B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA) se desvela una forma preferida de lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado.

Preferentemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para filtrarse de forma estéril a través de una membrana de 0,22 micras (Patente Europea número 0.689.454).

3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug a 100 \mug, preferentemente de 25 a 50 \mug por dosis en que el antígeno estará presente normalmente en un intervalo de 2 a 50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada de Hplc obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente, ésta puede mezclarse con lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se desvela en la patente de EE.UU. nº 5.057.540.

Se han descrito anteriormente formulaciones de adyuvantes no reactógenos que contienen QS21 (documento WO 96/33.739). Dichas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han demostrado éxito como adyuvantes de estimulación de TH1 cuando se formulan con un antígeno.

Otros adyuvantes que son estimuladores preferenciales de respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas como se desvela en el documento WO 96/02.555.

También se contemplan combinaciones de diferentes adyuvantes estimulados de TH1, como los mencionados anteriormente, como el suministro de un adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21 puede formularse junto con 3D-MPL. La relación de QS21:3D-MPL estará normalmente en el orden de 1:10 a 10:1; preferentemente de 1:5 a 5:1 y a menudo sustancialmente de 1:1. El intervalo preferido para una sinergia óptima es de 2,5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21.

Preferentemente en la composición de vacuna según la invención está presente también un vehículo. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio, como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, como escualeno, alfa-tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido, los antígenos en la composición de vacuna según la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en dicha emulsión. Además, la emulsión de aceite en agua puede contener Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Normalmente, para administración humana en una vacuna QS21 y 3D-MPL estarán presentes en el intervalo de 1 \mug a 200 \mug, como, por ejemplo, de 10 a 100 \mug, preferentemente de 10 a 50 \mug por dosis. Normalmente, el aceite en agua comprenderá del 2% al 10% de escualeno, del 2% al 10% de alfa-tocoferol y del 0,3% al 3% de Tween 80. Preferentemente, la relación de escualeno:alfa-tocoferol es igual o menor que 1, con lo que se proporciona una emulsión más estable. Span 85 puede estar presente también en un nivel del 1%. En algunos casos, puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizador.

Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas contienen preferentemente un aceite no tóxico como, por ejemplo, escualano o escualeno, un emulsionante como, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. Los vehículos acuosos pueden ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

En el documento WO 95/17.210 se describe una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua.

La presente invención proporciona también una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y dolencias relacionadas. Dicha composición de vacuna polivalente puede incluir un adyuvante inductor de TH-1 como se ha descrito anteriormente.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB082, se entiende que cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos de ocurrencia natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, deleciones o sustituciones que no afectan sustancialmente a las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

El antígeno se puede suministrar también en forma de una bacteria entera (muerta o viva) o como fracciones subcelulares, incluyendo estas posibilidades la N. meningitidis en sí.

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Composiciones, kits y administración

En un aspecto más de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido BASB082 y/o un polipéptido BASB082 para administración a una célula o un organismo multicelular.

La invención se refiere también a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido expuestos en la presente memoria descriptiva o sus agonistas y antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden emplearse en combinación con un vehículo o vehículos estériles o no estériles para su uso con células, tejidos u organismos, como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un individuo. Dichas composiciones comprenden, por ejemplo, un medio aditivo o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de administración. La invención se refiere además a paquetes y kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más envases rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente.

Pueden emplearse polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención en solitario o en conjunción con otros compuestos, como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en cualquier modo conveniente eficaz incluyendo, por ejemplo, administración por vías tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica, entre otras.

En terapia o como profiláctico, el agente activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril, preferentemente isotónica.

En un aspecto más, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, péptido agonista o antagonista o compuesto de moléculas pequeñas, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La invención se refiere además a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más envases rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención anteriormente mencionadas. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención pueden emplearse en solitario o en conjunción con otros compuestos, como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo, mediante una vía sistémica u oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, normalmente por inyección intravenosa. Pueden usarse otras vías de inyección como, por ejemplo, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Los medios alternativos para administración sistémica incluyen administración transmucosa y transdérmica usando agentes de penetración como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si el polipéptido u otros compuestos de la presente invención pueden formularse en una formulación entérica o encapsulada, también es posible la administración oral. La administración de estos compuestos puede ser también tópica y/o localizada en forma de pomadas, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para administración a mamíferos, y particularmente seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del agente activo será de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, normalmente de 1 mg/kg aproximadamente. En cualquier caso, el médico determinará la dosificación real que será más adecuada para un individuo y que variará con la edad, el peso y la respuesta del individuo en concreto. Las dosificaciones anteriores son ilustrativas del caso promedio. Naturalmente, pueden darse casos individuales en que se requieran intervalos de dosificación superiores o inferiores, y éstos están dentro del ámbito de la presente invención.

El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la ruta de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la dolencia del sujeto y el criterio del facultativo. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,1 a 100 \mug/kg del sujeto.

Una composición de vacuna está convenientemente en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmunitaria. Una dosis unitaria adecuada para vacunación es de 0,5 a 5 microgramos/kg de antígeno, y dicha dosis se administra preferentemente de 1 a 3 veces y con un intervalo de 1 a 3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado no se observarán efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención que excluirían su administración a individuos adecuados.

Sin embargo, son de esperar amplias variaciones en la dosificación necesaria, a la vista de la variedad de compuestos disponibles y de las diferentes eficacias de las diversas rutas de administración. Por ejemplo, se esperará que la administración oral requiera dosificaciones más altas que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas estándar para optimización, como es bien conocido en la técnica.

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Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible y algoritmos

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos forman un valioso recurso de información con el que determinar sus estructuras en 2 y 3 dimensiones, así como para identificar secuencias adicionales de homología similar. Estos planteamientos se facilitan más por el almacenamiento de la secuencia en un medio legible por ordenador y usando a continuación los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido o para búsqueda en una base de datos usando herramientas de búsqueda bien conocidas, como la aplicación informática GCG.

También se proporcionan en la invención procedimientos para el análisis de secuencias o cadenas de caracteres, en particular secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencias incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencias como análisis de identidad y semejanza, análisis de estructura de ADN, ARN y proteínas, ensamblaje de secuencia, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias, determinación de marco de lectura abierta, búsqueda de bases de ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, recorte de bases de ácidos nucleicos y análisis de picos de cromatografías de secuenciación.

Se proporciona un procedimiento de base informática para realizar identificación de homología. Este procedimiento comprende las etapas de proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un soporte legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia de polinucleótidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar la homología.

Se proporciona también un procedimiento de base informática para realizar identificación de homología, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de proporcionar una primera secuencia de polipéptidos que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un soporte legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia de polipéptidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar la
homología.

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Definiciones

"Identidad", según se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, si fuera el caso, determinada por comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el grado de relación de secuencia entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, si fuera el caso, determinadas por la correspondencia entre cadenas de dichas secuencias. La "identidad" puede calcularse fácilmente por procedimientos conocidos, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York. 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos para determinar la identidad están diseñados para dar la mayor correspondencia entre las secuencias probadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos disponibles públicamente. Los procedimientos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el programa GAP en el paquete informático GCG (Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12(1) 387: (1984)). BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. y col, J. Mol. Biol., 215: 403 - 410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444 - 2448 (1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). Para determinar la identidad puede usarse también el bien conocido algoritmo Smith Waterman.

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Los parámetros para comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 - 453 (1970)

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915 - 10919 (1992)

Penalización por hueco: 8

Penalización por longitud de hueco: 2

Un programa útil con estos parámetros está disponible públicamente como programa "hueco" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por omisión para comparaciones de péptidos (con ausencia de penalizaciones para huecos terminales).

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Los parámetros para comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443 - 453 (1970)

Matriz de comparación: correspondencias = +10, no correspondencias = 0

Penalización por hueco: 50

Penalización por longitud de hueco: 3

Disponible como: programa "hueco" de Genetics Computer Group, Madison Wl. Éstos son los parámetros por omisión para comparaciones de ácidos nucleicos.

En (1) y (2) más adelante se proporciona un significado preferido para "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, si fuera el caso.

(1) Las formas de realización de polinucleótidos incluyen además un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con respecto a la secuencia de referencia de ID SEC Nº: 1, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de ID SEC Nº: 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótido en comparación con la secuencia de referencia en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción, de nucleótidos, y en la que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre dichas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en ID SEC Nº: 1 por el número entero que define la identidad porcentual dividida por 100 y a continuación restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en ID SEC Nº: 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en ID SEC Nº: 1, y es de 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo el operador de multiplicación, y en el que cualquier número no entero producto de x_{n} por y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de ID SEC Nº: 2 pueden crear mutaciones sin sentido, de sentido equívoco o de marco de lectura esta secuencia de codificación y, por tanto, alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido después de dichas alteraciones.

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A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de ID SEC Nº: 1, que puede ser idéntica al 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos en comparación con la secuencia de referencia de forma que la identidad porcentual es de identidad menor que el 100%. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción, de ácidos nucleidos y en las que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para una identidad porcentual dada se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en ID SEC Nº: 1 por el número entero que define la identidad porcentual dividida por 100 y restando a continuación ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en ID SEC Nº: 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y)

en la que n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en ID SEC Nº: 1, y es, por ejemplo, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc., \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier número no entero producto de x_{n} e y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}.

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(2) Las formas de realización de polipéptidos incluyen además un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con respecto a la secuencia de polipéptidos de referencia de ID SEC Nº: 2, en la que dicha secuencia de polipéptidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de ID SEC Nº: 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, en las que dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservadora y no conservadora, o inserción, de aminoácidos y en las que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los aminoácidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en las que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en ID SEC Nº: 2 por el número entero que define la identidad porcentual dividido por 100 y a continuación restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en ID SEC Nº: 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y)

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en ID SEC Nº: 2 y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0.80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%: y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier número no entero producto de x_{a} e y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

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A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de ID SEC Nº: 2, que puede ser idéntica al 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de manera que la identidad porcentual tiene identidad menor que el 100%. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservadora y no conservadora, o inserción, de aminoácidos y en la que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de referencia de polipéptidos o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para una identidad porcentual dada se determina multiplicando el número total de aminoácidos en ID SEC Nº: 2 por el número entero que define la identidad porcentual dividido por 100 y restando a continuación ese producto de dicho número total de aminoácidos en ID SEC Nº: 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y)

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en ID SEC Nº: 2, y es, por ejemplo, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc., y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier número no entero producto de x_{a} e y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

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"Individuo(s)", cuando se usa en la presente memoria descriptiva con referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitarse a, un metazoo, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" con respecto a su estado natural, es decir, si ocurre en la naturaleza, ha sido cambiado o extraído de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente naturalmente en un organismo vivo no está "aislado". Pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de sus materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", en el sentido del término que se emplea en la presente memoria descriptiva. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" aun cuando siga estando presente en dicho organismo, que puede estar vivo o no.

"Polinucleótido(s)" se refiere generalmente a cualquier polinucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado, incluyendo regiones monocatenarias y bicatenarias.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero conserva sus propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante puede o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios en los nucleótidos pueden dar como resultado, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, según se expone más adelante. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares en total y, en muchas regiones, la variante idéntica y el polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no ser codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de ocurrencia natural como una variante alélica, o puede ser una variante para la que no se conoce ocurrencia natural. Variantes de polinucleótidos y polipéptidos que no ocurren naturalmente pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o por síntesis directa.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad causada por o relacionada con infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, infección del tracto respiratorio superior, enfermedades bacterianas invasivas, como bacteriemia y meningitis.

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Ejemplos

Los ejemplos que se muestran a continuación se realizan usando técnicas convencionales, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, salvo que se describa lo contrario en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

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Ejemplo 1

El gen BASB082 en cepa ATCC 13090 de N. meningitidis

El gen BASB082 de la cepa ATCC13090 de N. meningitidis se muestra en ID SEC Nº: 1. La traducción de la secuencia de polinucleótidos BASB082, mostrada en ID SEC Nº: 2, muestra una semejanza importante a Pseudomonas aeruginosa PhuR, un receptor de hemina de la membrana exterior. El polipéptido BASB082 contiene una secuencia de señal delantera, como predice el programa Spscan del paquete informático GCG. La secuencia de señal delantera predicha se escindiría después del residuo 24. Se predice que BASB082 es una proteína de la membrana exterior implicada en la captación de hierro.

Secuencias de polipéptidos y polinucleótidos

ID SEC Nº: 1

Secuencia de polinucleótidos BASB082 de Neisseria meningitidis de la cepa ATCC13090

1

ID SEC Nº: 2

Secuencia de polipéptidos BASB082 de Neisseria meningitidis deducida de la secuencia de polinucleótidos de ID SEC Nº: 1.

2

Materiales depositados

Se ha depositado un depósito que contiene una cepa de serogrupo B de Neisseria meningitidis en la American Type Culture Collection (en la presente memoria descriptiva, "ATCC") el 22 de junio de 1997 y se le ha asignado el número de depósito 13.090. El depósito se describió como Neisseria meningitidis (Albrecht y Ghon) y es una biblioteca de inserciones de 1,5 a 2,9 kb secadas por congelación construida a partir de aislados de N. meningitidis. El depósito se describe en Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 8:1-13 (1958).

El depósito de cepa de Neisseria meningitidis se refiere en la presente memoria descriptiva como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen BASB082 de longitud completa. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la cepa depositada, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado en consecuencia, se están controlando por si hubiera algún conflicto con cualquier descripción de secuencias en la presente memoria descriptiva.

El depósito de la cepa depositada se ha hecho según los términos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con Fines de Procedimientos de Patente. La cepa se liberará irrevocablemente y sin restricción o condición al público en el momento de concesión de una patente. La cepa depositada se proporciona meramente por comodidad para los expertos en la materia y no se supone que se requiere un depósito para su habilitación, según se requiere según 35 U.S.C. \NAK 112.

<110> SmithKline Beecham Biologicals S.A.

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<120> Nuevos compuestos

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<130> BM45379

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<160> 10

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 2277

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<212> ADN

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 1

3

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<210> 2

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<211> 758

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<212> PRT

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 2

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4

5

6

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<210> 3

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<211> 2112

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<212> ADN

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 3

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7

8

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<210> 4

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<211> 703

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<212> PRT

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 4

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9

10

11

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<210> 5

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<211> 378

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<212> ADN

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 5

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12

\newpage

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<210> 6

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<211> 125

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<212> PRT

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 6

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13

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<210> 7

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<211> 864

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<212> ADN

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 7

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14

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<210> 8

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<211> 287

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<212> PRT

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 8

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15

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<210> 9

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<211> 966

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<212> ADN

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 9

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16

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<210> 10

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<211> 321

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<212> PRT

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<213> Neisseria meningitidis

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<400> 10

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17

18

Claims

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 97% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

2. Un polipéptido aislado como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

3. El polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2.

4. Un polipéptido aislado de ID SEC Nº: 2.

5. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, siempre que dicho polipéptido no sea un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528.

6. Un fragmento inmunogénico del polipéptido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el fragmento inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 y en el que dicho fragmento inmunogénico carece de un dominio de anclaje C-terminal.

7. El fragmento inmunogénico de la reivindicación 6 en el que dicho fragmento inmunogénico además carece de una secuencia delantera N-terminal.

8. Un fragmento inmunogénico del polipéptido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fragmento inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 y que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2, siempre que dicho fragmento no sea un fragmento que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528 o un fragmento que tiene 7 o más aminoácidos de 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528.

9. Un polipéptido que comprende un polipéptido o un fragmento inmunogénico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Un polipéptido que comprende un fragmento inmunogénico se reivindica en la reivindicación 8 con la condición de que dicho polipéptido no sea un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528, o un o un fragmento que tiene 7 o más aminoácidos de 588, 586, 596, 598, 600 ó 584 del documento WO99/57280 y como se describe en el documento US60/121.528.

11. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido o fragmento inmunogénico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 97% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2 en toda la longitud de ID SEC Nº: 2, o una secuencia de nucleótidos complementaria en toda su longitud a dicho polinucleótido aislado.

13. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos identidad del 97% con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de ID SEC Nº: 2 en toda la región de codificación; o una secuencia de nucleótidos complementaria en toda su longitud a dicho polinucleótido
aislado.

14. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene identidad de al menos el 97% con respecto a ID SEC Nº: 1, en toda la longitud de ID SEC Nº: 1; o una secuencia de nucleótidos complementaria en toda su longitud a dicho polinucleótido aislado.

15. El polinucleótido aislado según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en el que la identidad es de al menos el 99% con respecto a ID SEC Nº: 1.

16. Un polinucleótido aislado según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de ID SEC Nº: 2.

17. Un polinucleótido aislado según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 que comprende el polinucleótido de ID SEC Nº: 1.

18. Un polinucleótido aislado según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de ID SEC Nº: 2, obtenible por detección selectiva de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación estrictas con una sonda marcada que tiene la secuencia de ID SEC Nº: 1 o un fragmento de la misma.

19. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18.

20. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 19 en el que el polinucleótido comprende una región hacia arriba recombinante que contiene un elemento regulador heterólogo.

21. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 20 en el que el elemento regulador heterólogo es un promotor fuerte.

22. Un microorganismo vivo recombinante que comprende un vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.

23. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 o una fracción subcelular o una membrana de dicha célula hospedadora que expresa un polipéptido asilado recombinante o un fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

24. Una célula hospedadora de Neisseria meningitidis que comprende un vector de expresión, en el que dicho vector de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico; o una fracción subcelular o membrana de dicha célula hospedadora que expresa dicho polipéptido o fragmento inmunogénico.

25. Una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 24 en la que dicha secuencia de nucleótidos tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la de ID SEC Nº: 1.

26. Un procedimiento para producir un polipéptido recombinante o un fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación 23 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido o fragmento inmunogénico y la recuperación del polipéptido del medio de cultivo.

27. Un procedimiento para producir un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, que comprende el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación 24 ó 25 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido o fragmento inmunogénico y la recuperación del polipéptido del medio de cultivo.

28. Un procedimiento para producir una vacuna, que comprende el procedimiento de la reivindicación 26 ó 27 y que además comprende la etapa de formular dicho polipéptido o fragmento inmunogénico con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

29. Un procedimiento para la expresión recombinante de un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 que comprende la transformación de una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y el cultivo de dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

30. Un procedimiento para la expresión recombinante de un polinucleótido que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la de ID SEC Nº: 1, que comprende el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación 24 ó 25 en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

31. Una vesícula de la membrana exterior bacteriana que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2, o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, obtenible a partir de una célula hospedadora que comprende un vector de expresión, comprendiendo el vector de expresión un polinucleótido que codifica dicho polipéptido o fragmento inmunogénico, y teniendo el polinucleótido una región cadena arriba modificada que contiene un elemento regulador heterólogo.

32. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido o del fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la vesícula de la membrana exterior bacteriana de la reivindicación 31, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

33. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

34. La composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 32 ó 33 en la que dicha composición comprende al menos un antígeno de Neisseria meningitidis.

35. Una composición de vacuna que comprende:

(ii): Un vehículo farmacéuticamente aceptable; y

36. Una composición de vacuna que comprende:

(ii): Un vehículo farmacéuticamente aceptable; y

37. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 35 ó 36 en la que dicho oligonucleótido inmunomodulatorio comprende CpG no metilado.

38. Una composición de vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 35 ó 36 en la que el vehículo comprende una emulsión aceite en agua que comprende un aceite metabolizable.

39. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 38 en la que el aceite metabolizable comprende escualeno, alfa-tocoferol y Tween 80.

40. Un procedimiento de diagnóstico de infección por Neisseria meningitidis que comprende la identificación de un polipéptido o un fragmento inmunogénico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un anticuerpo generado contra el polipéptido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, presente en una muestra biológica de un animal sospechoso de tener dicha infección.

41. Un procedimiento de purificación de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, en el que dicho procedimiento se selecciona del grupo que está constituido por precipitación de sulfato de amonio, precipitación de etanol, extracción ácida, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lecitina.

42. Un procedimiento para producir una composición de vacuna que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 2, o un fragmento inmunogénico del mismo que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario, cuando está acoplado a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº: 2 o un polipéptido que comprende dicho fragmento inmunogénico, en el que el procedimiento comprende el procedimiento de la reivindicación 41 y además comprende la etapa de formular dicho polipéptido o fragmento inmunogénico con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

43. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o un fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la vesícula de la membrana exterior bacteriana de la reivindicación 31 en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

44. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o un fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la vesícula de la membrana exterior bacteriana de la reivindicación 31, en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedad por Neisseria meningitidis.

45. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

46. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18 en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedad por Neisseria meningitidis.

47. Un polipéptido o un fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la vesícula de la membrana exterior bacteriana de la reivindicación 31, para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

48. Un polipéptido o un fragmento inmunogénico según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o la vesícula de la membrana exterior bacteriana de la reivindicación 31, para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedad por Neisseria meningitidis.

49. Un polinucleótido según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

50. Un polinucleótido según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedad por Neisseria meningitidis.