CZ2001927A3

CZ2001927A3 - Polypeptidy BASBO34 mikroorganizmu Moraxella catarrhalis a jejich použití

Info

Publication number: CZ2001927A3
Application number: CZ2001927A
Authority: CZ
Inventors: Jean-Louis Ruelle
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2001-08-15
Also published as: IL141996A0; NO20011263D0; TR200100741T2; AU5863299A; WO2000015802A1; EP1114160B1; ATE312923T1; KR20010085794A; HUP0103945A2; BR9914492A; GB9820002D0; US7432366B2; PL347943A1; EP1114160A1; HUP0103945A3; DE69928947D1; JP2002525057A; CN1326509A; NZ510512A; US20030180317A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká polynukleotidů (zde uvedených jako polynukleotidy BASB034) a jimi kódovaných polypeptidu (zde uvedených jako BASB034 nebo rekombinantnich materiálů a metod dále popisuje způsoby použiti polypeptidy BASB034), jejich produkce. Vynález takových polypeptidu a polynukleotidů, které zahrnuji vakciny proti bakteriálním infekcím. Vynález dále popisuje diagnostické testy vhodné pro detekci infekce jistých patogenů.

Dosavadní stav techniky

Mikroorganizmus Moraxella catarrhalis (také nazvaný Branhamella catarrhalis) je gram negativní bakterie, která se často izoluje z horních cest dýchacích u člověka. Tato bakterie odpovídá za několik patologických stavů, kdy hlavním je zánět středního ucha u kojenců a dětí a zápal plic u starých lidí. Tato bakterie také odpovídá za zánět paranazálních dutin, nosokomiální infekce a méně často za invazivní onemocnění.

Zánět středního ucha je dětské onemocnění podstatné jak počtem případů tak možnými následky. V USA se každoročně zaznamená více jak 3,5 miliónů případů a odhaduje se, že více jak 80 % dětí prodělá nejméně jedenkrát zánět středního ucha dříve než dosáhne tří let věku (popisuje se v publikaci Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis. 19: 823). Jestliže se onemocnění neléčí nebo se stává chronické, může to vést ke ztrátě sluchu, která je dočasná (v případě akumulace tekutiny ve středním uchu) nebo permanentní (jestliže dojde k poškození sluchového nervu). U děti taková ztráta sluchu může způsobit oddáleni schopnosti naučit se mluvit.

Ze středního ucha děti se primárně izolovaly tři bakteriální druhy spojené se zánětem středního ucha. Jsou to Streotococcus pneumoniae, netypovatelný Haemophilus influenza (NTHi) a M. catarrhalis. Jsou přítomny v 60 až 90 % případů. Jisté studie ukazují, že mikroorganizmus S. pneumoniae a NTHi reprezentují přibližně 30 % a M. catarrhalis přibližně 15 % případů zánětu středního ucha (popisuje se v publikaci Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). Jiné bakterie se mohou také izolovat ze středního ucha (jsou to například H. influenza typ B a S. pyogenes) , ale daleko méně často (2% všech případů nebo méně).

Epidemiologická data indikují, že v případě patogenů nalezených ve středním uchu je kolonizace horních cest dýchacích absolutně nutná pro vývoj otitidy. Existují i další faktory, které jsou nutné pro vznik uvedeného onemocnění (popisuje se v publikaci

Dickinson,

DP et al., (1988) J.

Infect.

Dis. 158: 205,

Faden, HL et al. , (1991) Ann.

Otorhinol.

Laryngol.

100:

612) .

Tyto faktory jsou nutné pro dosažení migrace bakterie do oblasti středního ucha

Eustachovou trubicí a následující iniciací zánětlivého procesu, nejsou však do dnešní doby známy. Uvádí se například, že dočasná anomálie v imunitním systému, která následuje po v publikaci Murphy, TF (1996) Microbial. Rev. 60: 267).

virové infekci, může způsobit neschopnost řídit kolonizaci dýchacích cest (popisuje se v publikaci Faden, HL et al (1994)

J. Infect. Dis. 169: 1312). Jiné vysvětlení je, že vystavení faktorům prostředí umožňuje kolonizaci některých dětí, které se následně stávají náchylné k zánětu středního ucha, protože v jejich středním uchu je stále přítomen patogen (popisuje se

Imunitní odpověď vůči mikroorganizmu M. catarrhalis je velmi špatně charakterizována. Analýza kmenů postupně izolováných z nosofaryngu dětí ve věku 0 až 2 let indikuje, že často získaly a eliminovaly nové kmeny. To indikuje, že u kolonizovaných dětí se vytvoří účinná imunitní odpověď na přítomnou bakterii (popisuje se v publikaci Faden, HL et al., (1994) J. Infect. Dis. 169: 1312).

U většiny testovaných dospělých jedinců se identifikovaly baktericidní protilátky (popisuje se v publikaci Chapman, AJ et al., (1985) J. Infect. Dis. 151: 878). Kmeny mikrorganizmu

M.catarrhalis vykazují variace v jejich kapacitě odolat sérové baktericidní aktivitě. V obecném případě izoláty z nemocných jedinců jsou více rezistentní než- izoláty z jedinců, kteří jsou jednoduše kolonizováni (popisuje se v publikaci Hol, C et al., (1993) Lancet 341: 1281, Jordán KL, et al.,' (1990) Am. J. Med. 88 (suppl. 5A) : 28S) . Sérová rezistence, se může proto zvažovat, jako faktor virulence bakterie. Sérum dětí, které prodělaly zánět středního ucha, vykazují opsonizační aktivitu.

Neidentifikovaly se žádné antigeny, které jsou cílem těchto různých imunitních odpovědí u lidí. Výjimku tvoři OMP Bl, což je protein o molekulové hmotnosti 84 000, jehož exprese se reguluje železem a je rozeznáván sérem pacientů trpících zápalem plic (popisuje se v publikaci Sethi, S. et al. (1995) Infect. Immun. 63: 1516) a UspAl a UspA2 (popisuje se v publikaci Chen D. et al., (1999), Infct. Immun. 67: 1310).

Za použití biochemických metod se charakterizovalo několik dalších membránových proteinů, které jsou přítomny na povrchu mikroorganizmů M. catarrhalis, nebo jejich potencionální implikace při vyvolání ochranné imunity (popisuje se v publikaci Murphy , TF (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). V modelu zápalu plic u myší přítomnost protilátek vzniklých proti některým z uvedených proteinů (UspA, CopA) urychluje zánik infekce plic. Mezi kmeny M. catarrhalis je vysoce konzervativní polypeptid (OMP CD) a vykazuje homologii s porinem mikroorganizmu Pseudomonas aeruginosa, který je účinný proti uvedené bakterii ve zvířecích modelech.

Frekvence infekcí mikroorganizmem Moraxella catarrhalis během posledních několika dekád dramaticky roste. Tím se stává aktuální nebezpečí vzniku kmenů rezistentních na antibiotika, a zvýšení počtu lidí v populaci, kteří mají oslabený imunitní systém. Nyní už je běžné izolovat kmeny mikroorganizmu Moraxella catarrhalis, které jsou rezistentní na některá nebo na všechny standardní antibiotika. Tento jev podporuje nutnost získat nová anti-mikrobiální činidla, vakciny, metody pro testování léků a diagnostické testy, které je možné použít v případě uvedeného mikroorganizmu.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje BASB034, zvláště pak polypeptidy a polynukleotidy BASB034, rekombinantni materiály a způsoby jejich produkce. Vynález dále popisuje způsoby použití takových polypeptidů a polynukleotidů, které zahrnují prevenci a léčbu mikrobiálního onemocnění. Dále vynález popisuje diagnostické testy vhodné pro detekci onemocnění spojených s mikrobiální infekcí a stavem spojeným s takovými infekcemi. Tyto testy zahrnují testy vhodné pro detekci exprese nebo aktivity polynukleotidů nebo polypeptidů BASB034.

Vynález popisuje polypeptidy a polynukleotidy BASB034, jak se popisuje detailněji dále v textu. Vynález zvláště popisuje polypeptidy a polynukleotidy BASB034 mikroorganizmu Moraxella catarrhalis, který je příbuzný homologii aminokyselinové sekvence proteinu vnější membrány mikroorganizmu Klebsiebella pneumoniae fosfolipázy A. Vynález zvláště popisuje BASB034,

který vykazuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 a SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8. Je zřejmé, že sekvence uvedené v seznamu sekvenci dále v textu jako „DNA reprezentuji příklady jednoho provedení vynálezu, protože i odborníkovi je zřejmé, že takové sekvence se mohou obvykle použít v polynukleotidech, které zahrnují ribopolynukleotidy.

Polypeptidy

Vynález popisuje polypeptidy mikroorganizmu Moraxella catarrhalis, které se zde označuji jako „BASB034 a „polypeptidy

BASB034, stejně jako jejich biologicky, diagnosticky, profylakticky, klinicky nebo terapeuticky použitelné varianty a prostředky, které je obsahuji.

Vynález dále popisuje:

a) izolovaný polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, jenž vykazuje alespoň 85 % shodu, upřednostňuje se alespoň 90 % shoda, více se upřednostňuje alespoň 95 % shoda, nejvíce se upřednostňuje alespoň 97 až 99 % shoda s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2, 4,6 nebo 8,

b) polypeptid kódovaný izolovaným polypeptidem, který obsahuje polynukleotidovou sekvenci, která vykazuje alespoň 85 % shodu, upřednostňuje se alespoň 90 % shoda, více se upřednostňuje alespoň 95 % shoda, nejvíce se upřednostňuje alespoň 97 až 99 % shoda s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 po celé délce sekvence SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 nebo

c) polypeptid kódovaný izolovaným polynukleotidem, který obsahuje polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který vykazuje alespoň 85 % shodu, upřednostňuje se alespoň 90 % shoda, více se upřednostňuje alespoň 95 % shoda, nejvíce se upřednostňuje alespoň 97 až 99 % shoda s aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8.

Polypeptidy BASB034 uvedené v SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 jsou polypeptidy BASB034 z kmenů MC2932 (ATCC 43617), Mc2908, Mc2913 a Mc2969 mikroorganizmu Moraxella catarrhalis.

Vynález také popisuje imunogenni

BASB034, který je nepřerušenou částí vykazuje stejnou nebo v podstatě stejnou jako polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8. Je nutné říci, že fragment fragment polypeptidu polypeptidu BASB034 a imunogenni aktivitu (je-li to odpověď, nutné, spojený s nosičem) je schopný zesílit imunitní která rozeznává polypeptid BASB034. Takový imunogenni fragment může zahrnovat například polypeptid BASB034, kterému terminální vedoucí sekvence chybí Na/nebo transmembránovou oblast a/nebo C-terminální kotvící oblast. Vynález dále popisuje imunogenni fragment

BASB034 v podstatě celou vykazuje alespoň 85 % shodu, shoda, více se upřednostňuje podle vynálezu, který obsahuje extrabuněčnou oblast polypeptidu, jenž se alespoň 90 % % shoda, nejvíce se upřednostňuj e alespoň upřednostňuje alespoň 97 až sekvencí uvedenou %

shoda s v SEQ ID NO: 2, 4, nebo aminokyselinovou po celé délce

SEQ ID NO: 2.

Fragment je sekvenci, která je polypeptid, který má aminokyselinovou v podstatě stejná jako část aminokyselinové sekvence, nikoli jako celá aminokyselinová sekvence, libovolného podle vynálezu. Stejně jako polypeptidu mohou fragmenty vyskytovat volně nebo větším polypeptidu, kde mohou tvořit Upřednostňuje se,

BASB034 se polypeptidy mohou být obsaženy ve jeho část nebo oblast.

jedinou kontinuální oblast v jednom větším když fragment tvoří polypeptidu.

Preferované fragmenty zahrnují například zkrácený polypeptid, který vykazuje oblast aminokyselinové sekvence SEQ

ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 nebo její variantu, • ♦ · · · · ·· • · · * .

série zbytků, které zahrnují N-terminální jako je kontinuální a/nebo C-terminálni aminokyselinovou sekvenci. Preferují se polypeptidů podle buňkách. Dále degradované formy vynálezu produkované v hostitelských strukturálními preferují fragmenty charakterizované funkčními charakteristickými znaky, jako obsahující alfa-helix a oblasti tvořící alfase nebo jsou fragmenty helix, beta-list a oblasti tvořící beta-list, smyčku a oblasti tvořící smyčku, šroubovici a oblasti tvořící šroubovici, hydrofilní oblasti, hydrofobní oblasti, beta-amfipatické oblasti, tvořící povrch, oblast vázající oblasti, alfa-amfipatické flexibilní oblasti, oblasti se na substrát a vysoce antigenní oblasti.

Další preferované fragmenty zahrnují izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje alespoň 15, 20, 30, 40, 50 nebo 100 kontinuálních aminokyselin z aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 nebo izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje alespoň 15, 20, 30, 40, 50 nebo 100 kontinuálních aminokyselin zkrácených nebo deletovaných z aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8.

Fragmenty polypeptidů podle vynálezu se mohou použít při produkci odpovídajícího polypeptidu v plné délce za použití peptidové syntézy. Tyto fragmenty se mohou použít jako meziprodukty při produkci polypeptidů plné délky podle vynálezu.

Zvláště se preferují varianty, kde několik aminokyselin 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 1 až 2 nebo 1 se substituují, deletují nebo aduji v libovolné kombinaci.

Polypeptidy nebo imunogenní fragmenty se mohou vyskytovat ve formě „zralého proteinu nebo mohou být částí většího proteinu, jako je prekurzor nebo fúzní protein. Často je

výhodné, aby zahrnovaly další aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekreční a vedoucí sekvence, pro-sekvence, sekvence, které se získaly čištěním, jako je více histidinových zbytků nebo další sekvence zaručující stabilitu během rekombinantní produkce. Dále se také zvažuje adice exogehního polypeptidů nebo lipidového konce nebo polynukleotidových sekvencí, což zvyšuje imunogenní potenciál konečné molekuly.

Vynález popisuje geneticky manipulované rozpustné fúzní proteiny obsahující polypeptid podle vynálezu nebo jeho fragment a různé části konstantních oblastí těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM, IgA, IgE) . Jako imunoglobulin se preferuje konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zvláště pak IgGl, kde fúze nachází místo v oblasti spojení. V určitém provedení vynálezu část Fc se může odstranit jednoduše začleněním štěpené sekvence, která se štěpí faktorem srážení krve Xa.

Vynález dále popisuje způsob přípravy uvedených fúzních proteinů metodami genetického inženýrství a jejich použití při testování léků, diagnostice a terapii. Vynález dále popisuje polynukleotidy kódující takové fúzní proteiny. Příklady technologie fúzních proteinů se může najít v mezinárodní patentové přihlášce č. WO 94/29458 a WO 94/22914.

Tyto proteiny se mohou chemicky konjugovat nebo exprimovat jako rekombinantní fúzní proteiny, což umožňuje zvýšit množství, které se produkuje v expresívním systému, ve srovnání s nefúzním proteinem. Fúzní partner poskytuje epitopy pomocných buněk T (imunologický fúzní partner), přičemž se upřednostňují epitopy T pomocných buněk rozeznávané člověkem nebo napomáhají expresi proteinu (zesilovač exprese) ve srovnání s přirozeným rekombinantním proteinem. Upřednostňuje se, aby fúzní partner byl imunologický fúzní partner a zesilovač exprese.

· < · ·····9 • 9 · < 99· • · · · · · ·* • · · 9 9·· • · 9 ··

9 · · 9 9 ·· mikroorganizmu protein z viru

Fúzní partneři zahrnují protein D

Haemophilus influenzae a nestrukturální influenzae NS1 (hemaglutinin). Jiný fúzní partner je protein, který je znám jako LytA. Přednostně se používá C-terminální oblast molekuly. LytA se získal z mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae, který syntetizuje N-acetyl-L-alaninamidázu (amidáza LytA, kódovaný genem LytA (popisuje se v publikaci (1986) pp. 265-272)), což je autolyzin, který degraduje jisté vazby v peptidoglykanové oblast proteinu LytA je

Gene, 43 specificky terminální kostře. Cafinitu k cholinu nebo k některým využila

Tato vlastnost se

LytA organizmu E. fúzních coli, cholinovým při vývoji je které

795-798 proteinů. V j se popisuje fragment obsahuj 1 opakovanou oblast konci termínálním až 305.

Vynález polypeptidu. referenčních aminokyselin, odpovědná za analogům/ . jako expresívních plazmidů Cmožné použít při expresi j e DEAE.

Biotechnology: 10, (1992) p.

hybridních

C-LytA na jejich N-konci.

molekuly LytA, která zbytku 178. Jsou to proteinů,

Je možné které použít se nachází na Cna dále zahrnuje například zbytky 188 shora zmiňovaných se liší od varianty polypeptidy, které například polypeptidů přičemž zbytek se substituuje s podobnou charakteristikou. Typické probíhají mezi aminokyselinami Ala, Val, Leu Thr a mezi kyselými zbytky Asp a Glu

Jsou to substitucemi konzervativních aminokyselinou susbtituce j inou takové

Asn a Gin zbytky Phe

Ser a a mezi a Tyr.

a mezi bazickými zbytky Lys a Arg nebo aromatickými

Polypeptidy podle vynálezu se mohou připravit libovolným vhodným způsobem. Takové polypeptidy zahrnují izolavené přirozeně se vyskytující polypeptidy, rekombinantně produkované polypeptidy, synteticky produkované polypeptidy • Φφφ • ·φ •φφφφ φφ φφ φ φ φφφ φ φ φ φ

nebo polypeptidy produkované kombinaci uvedených metod. Způsoby vhodné pro přípravu takových polypeptidů jsou dobře známy v oboru.

Nejvíce se preferuje, že polypeptid podle vynálezu se získal z mikroorganizmu Moraxella catrrhalis, ale mohou se přednostně získat z jiného organizmu stejného taxonomického rodu. Polypeptid podle vynálezu se může také získat například z organizmů stejné taxonomické čeledi nebo řádu.

Polynukleotidy

Vynález dále popisuje polynukleotidy, které kódují polypeptidy BASB034, zvláště pak polynukleotidy kódující polypeptid označený BASB034.

Ve zvláště preferovaném provedení vynálezu polynukleotid obsahuje oblast kódující polypeptidy BASB034 obsahující sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7, která zahrnuje gen plné délky nebo jeho variantu.

Polynukleotidy BASB034 uvedené v sekvenci SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 jsou polynukleotidy BASB034 z kmenů Mc293 (ATCC 43617), Mc2908, Mc2913 a Mc2969 mikroorganizmu Moraxella catarrhalis.

Vynález dále popisuje izolované molekuly nukleových kyselin, které kódují a/nebo exprimují polypeptidy a polynukleotidy BASB034, zvláště pak polypeptidy a polynukleotidy BASB034 z mikroorganizmu Moraxella catarrhalis. Tyto molekuly zahrnují například nezpracované RNA, ribozymovou RNA, mRNA, cDNA, genomovou DNA, B- a Z-DNA. Další provedení vynálezu zahrnují biologicky, diagnosticky, profylakticky, klinicky nebo terapeuticky použitelné varianty a prostředky, které je obsahují.

• ·

Vynález popisuje izolované polynukleotidy zahrnující alespoň gen v plné délce, který kóduje polypeptid BASB034, který vykazuje redukovanou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID

NO: 2, 4, 6 nebo 8 a polynukleotidy, které jsou s nimi příbuzné a jejich varianty.

····

V jiném preferovaném provedení vynálezu existuje polypeptid BASB034 z mikrorganizmu Moraxella catarrhalis, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 nebo jeho variantu.

Na základě zde uvedených informací, jako je polynukleotidová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7, což je polynukleotid kódující polypeptid BASBO34, je možné získat za použití standardních metod klonování a testování, jako jsou například metody pro klonování a testování fragmentů chromozomální DNA z bakterií za použití buněk Moraxella catarrhalis Catlin jako počátečního materiálu, klony v plné délce.

Aby se například získala polynukleotidová sekvence podle v SEQ vynálezu, jako je polynukleotidová sekvence

ID NO: 1, 3, 5 nebo uvedená případě knihovna klonů chromozomální catarrhalisi Catlin v buňkách

7, pak se v typickém

DNA mikrorganizmu Moraxella coli nebo v některém jiném

E.

vhodném hostiteli testuj e radioaktivně značeným oligonukleotidem. Upřednostňuje oligonukleotid, který se získal nesoucí DNA, která je shodná s hybridizací za přísných podmínek, ze použití sekvenačních primerů polypeptidové nebo polynukleotidové přičemž se stanoví genová sekvence v aby se takové sekvenování provedlo například za použití se 17-mérový nebo z částečné sekvence.

DNA

Tyto delší

Klony sondy, klony se mohou se pak vytvořených sekvence v obou určit sekvenuj i z původní směrech, plné délce. Vhodnější je, denaturované dvouřetězcové DNA připravené z plazmidového klonu. Vhodná metoda se popisuje v publikaci Maniatis, T.,

Fritsch, E.F. and Sambrook et al., Molecular Cloning, A

Laboratory Manual, 2^nd Ed. , Cold Spring Harbor, New York (1989) (Screening by hybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). Aby se získala sekvence genu v plné délce může se také uskutečnit přímé sekvenování genomové DNA. V knihovně DNA získané z mikroorganizmu Moraxella catarrhalis se objevil každý polynukleotid uvedený v SEQ ID NO: 1, 3, 5.

Každá sekvence DNA uvedená v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 obsahuje otevřený čtecí rámec kódující protein, který obsahuje přibližný počet aminokyselin uvedených v SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 s dedukovanou molekulovou hmotností, která se může vypočítat za použití hodnot molekulových hmotností aminokyselinových zbytků, které jsou dobře známy v oboru.

Polynukleotid se sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1 ležící mezi počátečním nukleotidem číslo 1 a stop kodonem, který začíná nukleotidem č1327 sekvence SEQ ID NO: 1, kóduje polypeptid SEQ ID NO: 2.

Polynukleotid se sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 5 ležící mezi počátečním kodonem nukleotidu č. 1 a stop kodonem, který začíná nukleotidem č. 1327 sekvence SEQ ID NO: 5, kóduje polypeptid se sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 6.

Polynukleotid se sekvencí uvedenou v SEQ ID NO; 7 ležící mezi počátečním kodonem nukleotidu č. 1 a stop kodonem, který začíná nukleotidem č. 1327 sekvence SEQ ID NO: 7, kóduje polypeptid se sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 8.

Vynález dále popisuje izolovaný polynukleotid obsahující

a) polynukleotidovou sekvenci, jenž vykazuje alespoň 85 %

Shodu, upřednostňuje se alespoň 90 % shoda, více se upřednostňuje alespoň 95 % shoda, nejvíce se upřednostňuje alespoň 97 až 99 % shoda s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 nebo

b) polynukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který vykazuje alespoň 85 % shodu, upřednostňuje se alespoň 90 % shoda, více se upřednostňuje alespoň 95 % shoda, nejvíce se upřednostňuje alespoň 97 až 99 % shoda nebo 100 % shodu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 po celé délce sekvence SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8.

Polynukleotid kódující polypeptid podle vynálezu, který zahrnuje homology a ortology z druhů, který jsou jiní než Moraxella catarrhalis, se mohou získat postupem, který obsahuje kroky testováni vhodné knihovny za přísných hybridizačních podmínek (například za použití teploty v rozmezí 45 až 65 °C a koncentrace SDS 0,1 až 1%) se značenou nebo detekovatelnou sondou, která obsahuje sekvenci SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 nebo její fragment a izolaci genu v plné délce a/nebo genomové klony obsahující uvedenou polynukleotidovou sekvenci.

Vynález popisuje polynukleotidovou sekvenci shodnou po celé délce s kódující sekvencí (otevřený čtecí rámec) v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7. Vynález dále popisuje kódující sekvenci zralého polypeptidů nebo jeho fragmentu, stejně jako kódující sekvenci zralého polypeptidů nebo fragmentu čtecího rámce s jinou kódující sekvencí, jako je sekvence kódující vedoucí nebo sekreční sekvenci, pre- nebo pro- nebo prepro-proteinovou sekvenci. Polynukleotid podle vynálezu může také obsahovat alespoň jednu nekódující sekvenci, která například zahrnuje jednu nekódující 5'a 3'sekvenci, jako je například přepisovaná nikoliv však překládaná sekvence, terminační signály (jako jsou terminační signály závislé a nezávislé na rho), místa vázající ribozom, Kozákovi sekvence, sekvence, které stabilizují mRNA, intriny, polyadenylační signály. Polynukleotidová sekvence může také obsahovat další kódující sekvenci, která kóduje další aminokyseliny. Například může kódovat markerovou sekvenci, která umožňuje čištění fúzovaného

		•	···· •	.··.:·*· .··
	14	•	• • • • ·	• ···· . • · Σ · · · • · · · .......
polypeptidu. V jistém	provedení	vynálezu	je	markerovou
sekvencí hexahistidinový	peptid,	jak poskytuje	vektor pQE
(Qiagen lne.) a jak se	popisuje	v publikaci	Gent z et al. ,
Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 821	-824 (1989)	nebo	peptid tag

HA (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984), přičemž obě sekvence se mohou použít při čištění polypeptidové sekvence, které s nim tvoří fúzi. Polynukleotidy podle vynálezu také zahrnují polynukleotidy obsahující strukturní gen a jeho přirozeně asociované sekvence, které řídi expresi genu.

Nukleotidová sekvence kódující polypeptid BASB034 SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 může být shodná s polypeptidem kódujícím sekvenci obsaženou v nukleotidech 1 až 1326 sekvence SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7. V jiném případě to může být sekvence, která je výsledkem redundance (degenerace) genetického kódu, který kóduje polypeptid SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8.

Termín „polynukleotid kódující polypeptid popisuje polynukleotidy, které zahrnují sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu, zvláště pak bakteriální polypeptid a specificky polypeptid mikroorganizmu Moraxella catrrhalis

BASB034, který v SEQ ID NO:

polynukleotidy přerušované vykazuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou 2, 4, 6 nebo 8 obsahující jedinou

Termín také zahrnuje kontinuální oblast nebo oblasti kóduj ící polynukleotidy polypeptid přerušené začleněným fágem, (například integrovanou začleněnou sekvenci, integrovanou vektorovou sekvenci, integrovanou transpozonovou sekvenci nebo přerušení způsobené editováním RNA nebo rozeznáváním genomové DNA) spolu s dalšími oblastmi, které také obsahují kódující a/nebo nekódující sekvence.

Vynález dále popisuje zde popsané varianty polynukleotidů, které kódují varianty polypeptidu vykazující dedukovanou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8. Fragmenty ···· ·· ·«·« ·· • · · · · · • · ···· 9 · polynukleotidů podle vynálezu se mohou použit například při syntéze polynukleotidů podle vynálezu v plné délce.

Dále zvláště preferované provedení vynálezu zahrnuje polynukleotidy kódující varianty BASB034, které mají aminokyselinovou sekvenci polypeptidu BASB034 SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8, kde se nahradilo, upravilo, deletovalo a/nebo přidalo několik, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 2, 1 nebo žádný aminokyselinový zbytek v libovolné kombinaci. Zvláště se preferují tiché substituce, adice a delece, které nemění vlastnosti nebo aktivity polypeptidu BASB034.

Dalším preferovaným provedením vynálezu jesou polynukleotidy, které vykazují alespoň 85 % shodu po celé délce polynukleotidů, který kóduje polypeptid BASB034, který vykazuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2, 4? 6 nebo 8 a polynukleotidy, které jsou komplementární s takovými polynukleotidy. V jiném případě se velmi preferují polynukleotidy, které obsahují oblast, která vykazuje alespoň 90 % shodu s celou délkou polynukleotidů kódujícího polypeptid BASB034 a polynukleotidy s ní komplementární. Zvláště se také preferují polynukleotidy vykazující 95 % shodu po celé délce. Mezi těmi polynukleotidy, které vykazují 95 % shodu se zvláště preferují ty vykazující 97 % shodu. Mezi těmi polynukleotidy, které vykazují 98 a 99% shodu se zvláště preferují ty vykazující 99 % shodu.

Preferovaná provedení jsou polynukleotidy kódující polypeptidy, které si uchovávají v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu jako zralý polypeptid kódovaný DNA SEQ ID NO: 1, 3, .5 nebo 7.

V souladu s jistým preferovaným provedením vynálezu existují polynukleotidy, které hybridizují za zvláště přísných podmínek s polynukleotidovými sekvencemi, jako jsou polynukleotidy v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7.

Vynález se dále vztahuje na polynukleotidy, které hybridizují se zde uvedenými polynukleotidovými sekvencemi. S tímto ohledem se vynález dále vztahuje na polynukleotidy, které hybridizují za přísných podmínek se zde popsanými polynukleotidy. Termín „přísné podmínky a „přísné hybridizační podmínky znamená hybridizaci, ke které dochází pouze v případě, že existuje alespoň 95 % a upřednostňuje se alespoň 97 % shoda mezi sekvencemi. Specifický přiklad přísných hybridizačnich podmínek je celonoční inkubace při teplotě 42 °C v roztoku, který obsahuje 50 % formamid, 5x SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodiumcitrát) , 50 mM fosforečnan sodný (pH7,6), 5x Denhardtův roztok, 10 % síran dextranu a 20 μς/ml denaturovan, štěpené DNA spermatu lososa, pak následuje promytí hybridizačního podkladu 0,lx koncentrovaného SSC při přibližné teplotě 65 °C. Hybridizační a promývací podmínky jsou dobře známy v oboru a popisuji se v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), zvláště kapitola 11.

Vynález dále popisuje polynukleotid, který se skládá nebo obsahuje polynukleotídovou sekvenci získanou při testování vhodné knihovny, která obsahuje úplný gen polynukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 za přísných hybridizačnich podmínek se sondou, která vykazuje sekvenci uvedené polynukleotidové sekvence SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 nebo jejího fragmentu a izolaci uvedené polynukleotidové sekvence. Fragmenty, které je možné použít pro získání takového polynukelotidu zahrnují například plně popsané sondy a primery.

Jak se uvádí v textu, polynukleotidy se mohou podle vynálezu použít jako hybridizační sonda pro RNA, cDNA a genomovou DNA, při izolaci cDNA v plné délce a genomových klonů kódujících BASB034 a při izolaci cDNA a genomových klonů

jiných genů, které vykazuji vysokou identitu a zvláště pak vysokou shodu sekvenci s genem BASB034. Takové sondy budou v obecném případě obsahovat alespoň 15 nukleotidových zbytků nebo párů baží. Upřednostňuje, aby takové sondy obsahovaly alespoň 30 nukleotidových zbytků nebo párů baží a měly alespoň 50 nukleotidových zbytků nebo párů baží. Zvláště preferované sondy vykazují alespoň 20 nukleotidových zbytků nebo párů baží a budou mít méně než 30 nukleotidových zbytků nebo párů baží.

Kódující oblast genu BASB034 se může izolovat testováním za použití sekvence DNA poskytované v SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 za účelem syntézy oligonukleotidové sondy. Značený oligonukleotid vykazuje sekvenci, která je komplementární se sekvencí genu podle vynálezu, a může se . použít k testování knihovny cDNA, genomové DNA nebo mRNA za účelem stanovení, který ze členů knihovny se sondou hybridizuje.

Existuje několik dobře známých metod, které jsou vhodné pro získání DNA plné délky nebo pro prodloužení krátkých DNA na příklad na základě metody rychlé amplifikace konců cDNA (RACE) (popisuj se v publikaci Frohman et al. , PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Jisté úpravy metod, jejichž příkladem je Marathon™ technology (Clontech Laboratories lne.), například, vykazují zjednodušené vyhledávání kratších cDNA. V případě Marathon™ technologies se cDNA připraví z mRNA extrahované z vybrané tkáně a adaptorové sekvence ligované na každém konci. PCR se zde provádí za účelem amplifikace chybějícího 5'konce DNA za použití kombinace oligonukleotidových primerů, které jsou specifické pro gen a pro adaptor. Reakce PCR se pak opakuje za použití vložených primerů, což znamená, že to jsou primery navržené pro navázání s amplifikovaným produktem (v typickém případě jde o adaptorový specifický primer, který se naváže na 3' konec adaptorové sekvence a genově specifický primer, který se váže na 5'konec vybrané genové sekvence). Produkty této reakce se pak mohou analyzovat sekvenovánim DNA • · a DNA plné délky, která se zkonstruovala buď připojením vzniku celé sekvence nebo

r.

produktu přímo oddělenou PCR účelem navržení k existující za použití primeru pro

DNA za nových polypeptidy činidla sekvenčních informaci za

Polynukleotidy a použit například jako léčby a diagnostických metod podle a materiály onemocnění, lidí.

podle vynálezu, vynálezu vhodná se mohou zvláště pro výzkum onemocnění kterými jsou

NO: 1 až 8 se mohou

Polynukleotidy oligonukleotidy získané ze sekvence SEQ ID použít při zde popsaných postupech, ale přednostně při PCR za účelem stanovení, přepisovaly jako bakterii. Takové zda zde identifikované polynukleotidy se jako část v tkáni infikované celek nebo sekvence se budou také při diagnostikování stádia a typu infekce patogenu.

polynukleotidy, kterým je zralý protein plus další

Vynález dále popisuje polypeptid, na N- a C-konci nebo aminokyseliny nacházející více které kódují aminokyseliny uprostřed se polypeptidu (v případě, že zralá forma obsahuje polypeptidový řetězec) . Takové sekvence mohou úlohu při zpracování proteinu z prekurzoru na mohou umožňovat transport proteinu, mohou délu poločasu rozpadu proteinu a proteinu za účelem testu nebo in vivo se mohou buněčnými enzymy zkracovat manipulací v případě aminokyseliny.

V případě komplementární komplementární každého polynukleotidu podle polynukleotid. Preferuje mít jak jeden důležitou zralou formu, prodlužovat nebo mohou umožňovat produkce. Obecně zpracovávat další vynálezu existuje se, aby tyto polynukleoitdy byly zcela komplementární s každým polynukleotidem, se kterým jsou komplementární.

Prekurzorový protein, který vykazuje zralé formy polypeptidů fúzovaného s jedním nebo více prosekvencemi může být deaktivovaná forma prosekvence tak se

Před aktivací se takové mohou polypeptidů. Když se deaktivované prekurzory odstranit některé nebo prosekvence. V obecném případě se takové prekurzory proproteiny.

odstraní aktivuj í.

všechny nazývaj i

Vedle standardních nukleotidů A, G, C, T/U se může použít termín „N, který může také popisovat jisté polynukelotidy podle vynálezu. Symbol „N znamená, že libovolný ze čtyř nukleotidů DNA nebo RNA se může objevit v takto označené poloze v sekvenci DNA nebo RNA. Preferuje se, aby N neznačila nukleovou kyselinu, která, když se bere v kombinaci s přilehlými polohami nukleotidů, bude ovlivňovat tvorbu prematuračního terminačního kodonu v takové čtecím rámci.

Polynukleotid podle vynálezu může kódovat zralý protein, zralý protein plus vedoucí sekvenci (která se může nazývat preprotein), prekurzor zralého proteinu, který má jednu nebo více prosekvencí, které nejsou vedoucí sekvence preproteinu, nebo preprotein, který je prekurzor proproteinu, který má vedoucí sekvenci a jednu nebo více prosekvencí, které se v obecném případě odstraní během postupu zpracováni, přičemž vzniká aktivní a zralá forma polypeptidů.

Vynález dále popisuje použití polynukleotidu podle vynálezu pro terapeutické nebo profylaktické účely, zvláště při genetické imunizaci.

Použití polynukelotidu podle vynálezu při genetické imunizaci může přednostně použít vhodné metody zavedení, jako je přímá injekce plazmidové DNA do svalů (popisuje se v publikaci Wolff et al. , Hum. Mol. Genet. (1992) 1: 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), zavedeni DNA v komplexu se specifickým proteinovým nosičem (popisuje se ···· ·· ·· · · ·· · · · · · · <· • · » ··· · · v publikaci Wu et al., J. Biol. Chem. (1989) 264, 16985), společná precipitace DNA s fosforečnanem draselným (Benvenisty and Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551), kapsulalizace DNA v různých formách lipozomů (popisuje se v publikaci Kaneda et al., Science (1989) 243: 375), bombardováni částicemi (popisuje se v publikaci Tang et al. , Nátuře (1992) 356: 152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol. (1993) 12: 791) a in vivo infekci za použiti klonovaných retrovirových vektorů (popisuje se v publikaci Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849).

Vektory, hostitelské buňky, expresivni systémy

Vynález popisuje vektory, které obsahuji polynukleotid nebo polypeptidy podle vynálezu, hostitelské buňky, které jsou geneticky manipulovány vektory podle vynálezu a produkci polypeptidů podle vynálezu metodami rekombinace. Bezbuněčné translačni systémy se mohou také použiti při produkci takových proteinů za použiti RNA získané z konstrukci vynálezu.

Rekombinantní polypeptidy podle vynálezu

DNA podle se mohou připravit způsoby, které jsou dobře známy v oboru, z geneticky manipulovaných hostitelských buněk, které obsahují expresivni systémy. Vynález dále popisuje expresivni systémy, které obsahují polynukleotid nebo polynukleotidy podle vynálezu, hostitelské buňky, které jsou geneticky upraveny takovými expresivnimy systémy a produkci polypeptidů podle vynálezu metodami rekombinace.

V případě rekombinantní produkce polypeptidů podle vynálezu se mohou hostitelské buňky geneticky upravit začleněním expresivních systémů nebo jeho části nebo polynukleotidů podle vynálezu. Zavedení polynukleotidu do hostitelské buňky se může provést metodami popsanými v řadě standardních manuálů, jako je například Davis et al., Basic methods in molecular biology, (1986) and Sambrook, et al.,

Molecular Clonning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989),jako je transekce fosforečnanem sodným, transfekce zprostředkovaná DEAE, transfekce, mikroinjekce, transfekce zprostředkovaná kationtovým lipidem, elektroporace, transdukce, naneseni škrábnutím, infekcí a balistické zavedení.

Reprezentativní příklady vhodných hostitelů zahrnují bakteriální buňky, jako jsou buňky streptokoků, stafylokoků, enterokoků, mikroorganizmu E. coli, streptomyces, cyanobakterií, bakterie Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis, Moraxella catrrhalis, buňky hub, jako jsou buňky kvasinek, Kluveromyces, Saccharomyces, basisiomycete, Candida albicans a Aspergillus, hmyzí buňky, jako jsou buňky Drosophila S2 a Spodoptera Sf90, zvířecí buňky, jako jsou CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 a buňky Bowesova melanomu a rostlinné buňky, jako jsou buňky gymnosperm a amniosperm.

Za účelem produkce polypeptidu podle vynálezu se mohou použít různé expresívní systémy, zahrnují chromozomální, epizomální vektory získané z bakteriálních z transpozonů, kvasinkových epizomů, z kvasinkových chromozomálních elementů, z virů, bakuloviry,

Takové vektory mezi jinými a virové vektory, například plazmidů, z bakteriofága, inzerčních elementů, jako jsou vakcinie, adenoviry, alfaviry a odvozené z papovaviry, jako je SV40, z virů viry planých neštovic, pikronaviey, retroviry a vektory získané z jejich kombinací, jako jsou ty plazmidu a bakteriofágových genetických elementů, jako jsou kosmidy a fágemidy. Konstrukce expresivních systémů mohou obsahovat řídící oblastí, které regulují obecném udržení, případě libovolný systém nebo vektor pomnožení nebo expresi polypeptidu v hostiteli se expresi

Vhodná sekvence DNA se může začlenit libovolnou známou metodou, jako polynukleotidů může použít k do expresívního se například expresi. vhodný a/nebo expresi. systému popisuj e • · « · ·♦ · · • · · · · · ···· ·· 9 9 9 * v publikaci Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory

Manual 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York (1989)).

V rekombinantních expresívních systémech u eukaryontů za účelem sekrece překládaného proteinu do lumenu endoplazmatického retikula, do periplazmatického prostoru nebo do extrabuněčného prostředí, se mohou začlenit do expresívního polypeptidu vhodné sekrečni signály. Tyto signály mohou být vůči polypeptidu endogenní nebo jsou heterogenní.

Rekombinatních buněčných kultur je možné izolovat a čistit polypeptidy podle vynálezu pomocí známých metod, které zahrnuji srážení síranem amonným nebo etanolem, kyselou extrakci, chromatografii s výměnou aniontů a kationtů, chromatografii na fosfocelulóze, chromatografii na základě hydrofóbní interakce, afinitní chromatografii, chromatografii na hydroxylapatitu a lektinovou chromatografii. . Nejvíce se upřednostňuje použití afinitní chromatografie za použití kovových iontů (IMAC). Při regeneraci aktivní konformace, kdy se denaturuje polypeptid během vnitrobuněčné syntézy, izolace a/nebo čištění, se mohou použít dobře známé metody opětného balení proteinů.

Expresívním systémem může být rekombinantni živý organizmus, jako je virus nebo bakterie. Gen je možné začlenit do genomu živého rekombinantního viru nebo bakterie. Inokulace a infekce in vivo živým vektorem povede k expresi in. vivo antigenu a k indukci imunitních odpovědí. Viry a bakterie používané pro tyto účely jsou například poxviry (například vakcinie, spalničky), alfaviry (virus Sindbis, virus Semliki Forest, virus venezuelské koňské encefalitidy, adenoviry, adenoasociované viry, pikornavirus (poliovirus, rhinovirus) , herpesvirus (vieus varicella zoster, atd.), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Tyto viry a bakterie mohou být virulentní, různými způsoby utlumené, přičemž je možné získat různé vakciny. Takové živé vakciny mohou tvořit část vynálezu.

··

Diagnostické, prognostické testy, testy typování séra a mutaci

Vynález také popisuje použití polynukleotidů BASB034 a polypeptidů podle vynálezu vhodných pro diagnostická činidla. Detekce polynukelotidů BASB034 a/nebo polypeptidů u eukaryontů, zvláště u savců a zvláště u člověka poskytuje diagnostické metody pro stanovení diagnózy onemocnění, stádia onemocnění nebo odezvy infikovaného organizmu na léky.

Eukaryonti, zvláště pak organizmem, který obsahuje savci a speciálně ti infikováni gen nebo protein BASB034, se mohou detekovat na úrovni nukleové kyseliny nebo aminokyseliny různými dobře známými metodami.

Polypeptidy a polynukleotidy vhodné pro prognózu, diagnózu a jinou analýzu se mohou získat z tělesného materiálů putativně infikovaných a/nebo infikovaných jedinců. Polynukleotidy z libovolných takových zdrojů, zvláště z DNA nebo RNA se mohou použít přímo při deleci nebo se mohou amplifikovat enzymaticky použitím PCR nebo jinou libovolnou amplifikační metodou, dříve než se provede analýza. RNA, zvláště pak mRNA, cDNA a genomová DNA se mohou také použit stejným způsobem. Za použití amplifikace se charakterizace druhů a kmen infekčních nebo rezidentního organizmu přítomného v jedinci se může provést analýzou genotypu vybraného polynukleotidu organizmu. Delece a inzerce se mohou detekovat změnou velikosti amplifikovaného produktu v porovnání s genotypem referenční sekvence vybrané z příbuzného organizmu. Upřednostňuje se organizmus odlišného druhu stejného rodu nebo odlišný kmen stejného druhu.

Bodová mutace se může identifikovat hybridizací amplif ikované DNA se značenými polynukleotidovými sekvencemi BASB034. Perfektně nebo podstatně spárované sekvence se mohou odlišit od nesprávně nebo nepodstatně spárovaných duplexů pomocí trávení DNázou nebo RNázou nebo detekcí rozdílů ···· φ φ v teplotách tání nebo kinetikách renaturace. Rozdíly polynukleotidové sekvence se mohou detekovat změnami v elektroforetické mobilitě polynukleotidových fragmentů na gelech ve srovnání s referenční sekvencí. To se může provést za přítomnosti nebo nepřítomnosti denaturačních činidel. Polynukleotidové rozdíly se mohou také detekovat přímým sekvenováním DNA nebo RNA (popisuje se například v publikaci Myers et al., Science, 230, 1242 (1985). Změny v sekvenci ve specifické poloze se mohou projevit testy nukleázové ochrany, jako jsou testy ochrany proti RNáze, VI a V2, nebo metodami chemického štěpení (popisuje se v publikaci Cotton et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 4397-4401 (1985).

V jiném provedení podle vynálezu se skounstruovalo uspořádání oligonukleotidových sond obsahujících nukleotidovou sekvenci BASB034 nebo její fragmenty, za účelem stanovení účinného testováni například genetických mutací, sérotypu, taxonomické klasifikace nebo identifikace. Technologie použití těchto souborů sond jsou dobře známy v oboru a je možné je obecně použít a mohou vyřešit řadu otázek molekulární biologie, jako je exprese genu, spojení genů a genetická variabilnost (popisuje se například v publikaci

Chee et al. ,

Science, 274: 610

Vynález dále popisuje diagnostický kit, který obsahuje:

a) polynukleotid podle vynálezu, přednostně nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 nebo její fragment,

b) nukleotidovou sekvenci komplementární se sekvencí popsanou v odstavci a),

c) polypeptid podle vynálezu, upřednostňuje se polypeptid se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 nebo její fragment nebo

d) protilátky proti polypeptidu podle vynálezu, upřednostňuje se polypeptid se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8.

« ·

Je vhodné, aby libovolný takový kit popsaný v odstavci a) ,

b)., a) nebo d) obsahoval podstatný komponent. Takový kit je možné použít mezi jinými při diagnostice onemocnění nebo náchylnosti k onemocnění.

Vynález dále popisuje použití polynukleotidů podle vynálezu jako diagnostických činidel. Detekce mutované formy polynukleotidů podle vynálezu, přednostně pak sekvence SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7, který je spojen s onemocněním nebo patogenitou bude poskytovat diagnostický nástroj, který se může použít při definici, diagnóze onemocnění, prognóze průběhu onemocnění, stanovení stádia onemocněni nebo náchylnosti k onemocnění, které vzniká z nadměrné exprese, z nízké exprese nebo změněné exprese polynukleotidů. Organizmy, zvláště pak infekční organizmy nesoucí mutace v takovém polynukleotidů se mohou detekovat na úrovni polynukleotidů řadou zde popsaných metod.

Buňky z organizmu, který nese mutace nebo polymorfizmus (alelové variace) v polynukleotidů a/nebo polypeptidu podle vynálezu se mohou také detekovat na úrovni polynukleotidů a polypeptidu různými metodami, což umožňuje serotypování. RTPCR se například může použít při detekci preferuje použití RT-PCR ve spojení systémy, jako se mohou mutantů v RNA.

Zvláště se detekčními

DNA genomová

K identifikaci a analýze i které jsou primery PCR, kódujícím polypeptid BASB034.

například GeneScan. také použit pro mutantů je možné i komplementární s automatickými

RNA, cDNA nebo stejné účely, například použít s polynukleotidem

Vynález dále popisuje primery, kde se a/nebo 3' konce 1, 2, 3 nebo 4 nukleotidy, možné použít při amplifikaci DNa a/nebo RNA ze vzorku získaného z jednotlivce, jako je

Tyto primery je možné použít při amplifikaci polynukleotidů odstranily z 5'

Tyto primery je

BASB034 izolované tělesný materiál.

• t» 99 9 9 f • · · · · · • · · · Φ « · · • · · ·9··· • · · · ·· ··♦ ♦ «· ···99 izolovaného z infikovaného jedince tak, že polynukleotid může být subjektem pro různé techniky vhodné pro objasnění polynukleotidové sekvence. Tímto způsobem se mohou zjistit mutace v polynukleotidové sekvenci a je možné je použít při diagnóze a/nebo prognóze infekce nebo jeho stádia nebo průběhu nebo při sérotypování a/nebo klasifikaci infekčního činidla.

Vynález dále popisuje způsob diagnostikování onemocnění, přičemž se upřednostňují bakteriální infekce, zvláště pak infekce způsobené mikroorganizmem Moraxella catarrhalis, které zahrnuje stanovení zesílené exprese polynukleotidu se sekvencí SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 ve vzorku tělesného materiálu.

Zesílená nebo zeslabená exprese polynukleotidu BASB034 se může měřit použitím libovolné z metod, které jsou dobře známy v oboru, při kvantifikaci polynukleotidů. Touto metodou může být například amplifikace, PCR, RT-PCR, RNázová ochrana, Northernův přenos a jiné metody hybridizace.

Diagnostický test podle vynálezu vhodný při detekci, nadměrné exprese polypeptidy BASB034 ve srovnání s kontrolními vzorky tkáně se může použít při detekci přítomnosti infekce. Testovací postupy se mohou použít ke stanovení polypeptidů BASB034 ve vzorku získaného od hostitele, jako je tělesný materiál. Takové testovací postupy zahrnují radioimunologické testy, testy kompetitivního navázání, analýza westernovým přenosem, sendvičové testy s protilátkami, detekci protilátek a test ELISA.

Polynukleotidy podle vynálezu se mohou použít jako komponenty uspořádání polynukleotidů, přičemž se upřednostňují uspořádání s vysokou hustotou. Tyto uspořádáni s vysokou hustotou je možné zvláště použít pro účely diagnózy a prognózy. Sada bodů, kdy každý obsahuje různý gen a dále obsahuje polynukleotid nebo polynukleotidy podle vynálezu se může použít při testování jako je hybridizace nebo amplifikace ·· nukleové kyseliny za použití sond získaných nebo odvozených z tělesného vzorku za účelem stanovení přítomnosti určité sekvence nebo příbuzné sekvence u přítomnost může indikovat přítomnost mikroorganizmu Moraxella catarrhalis, a diagnostikování a prognóze a se rastr obsahující řadu průběhu variant polynukleotidové jednotlivce. Uvedená patogenu, zvláště pak může se použít při onemocnění. Preferuje polynukleotidové sekvence SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7.

preferuje, když rastr obsahuje polynukleotidovou

Také se sekvenci kódující polypeptidovou sekvenci SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8.

Protilátky

Polypeptidy nebo polynukleotidy podle vynálezu nebo jejich varianty nebo buňky exprimující uvedené polynukleotidy se mohou- použít jako imunogeny při produkci protilátek, které jsou imunospecifické pro takové polypeptidy nebo polynukleotidy.

V jistých preferovaných provedeních podle vynálezu se popisují protilátky proti polypeptidům nebo polynukleotidům BASB034.

Protilátky vytvořené proti polypeptidům nebo polynukleotidům podle vynálezu se mohou získat aplikací polypeptidu a/nebo polynukleotidů podle vynálezu nebo fragmentů nesoucích epitop, analogů nebo buněk exprimujících uvedené látky. Při přípravě monoklonálních protilátek se může použit libovolná metoda známá v oboru, která poskytuje protilátky produkované kontinuálními kulturami buněčné linie. Příklady zahrnují různé metody, jako jsou ty popsané v publikaci Kohler, G. and Milstein , C., Nátuře 256: 495-497 (1975), Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983), Cole et al., pg. 77-96 Monoclonal antibodies and cancer therapy, Alan R. Liss, lne. (1985).

Metody produkce jednořetězcových protilátek může se v publikaci patent USA produkci jednořetězcových polynukleotidům podle humanizovaných protilátek protilátek proti vynálezu. Za imunospecifických (popisuj e upravit polypeptidům nebo účelem exprese vůči polypeptidům na nebo polynukleotidům podle vynálezu se mohou použit také transgenni myši a/nebo jiné organizmy nebo zvířata, jako jsou jiní savci.

V jiném případě technologie, při které dochází k vyjevení fága se může využít k výběru protilátkových genů s vazebnou aktivitou vůči polypeptidu podle vynálezu z repertoáru V-genů lymfocytů amplifikovaných PCR z lidí, kde se testuje schopnost zpracovat anti-BASB034 nebo knihoven (popisuje se v publikaci McCffartery, et al., (1990), Nátuře 348, 552-554, Marks et al., (1992) Biotechnologies 10, 779-783). Afinita protilátek se může také zlepšit například přeskupením řetězce (Clackson et al., (1991) Nátuře 352: 628).

Shora popsané protilátky se mohou použít k izolaci nebo k identifikaci klonů, které exprimují polypeptidy nebo polynukleotidy podle vynálezu za účelem čištění polypeptidu nebo polynukleotidů například afinitní chromatografií.

Tak se mezi jinými při léčbě infekcí, zvláště pak bakteriálních infekcí mohou použít protilátky proti polypeptidu BASB034 nebo polynukleotidu BASB034.

Vynález popisuje varianty polypeptidu, které zahrnují varianty ekvivalentní antigenem, epitopem nebo imunologicky.

Upřednostňuje se, aby se protilátky nebo jejich varianta upravila, přičemž se stávají pro jednotlivce méně imunogenni. V případě, že jedinec je člověk, preferuje se, aby se protilátky humanizovaly, přičemž se oblast definující komplementaritu nebo oblasti protilátek získaných z hybridomu • ♦ transplantovaly do lidských monoklonálních protilátek způsobem, který se například popisuje v publikaci Jones et al., (1986), Nátuře 321, 522-525 nebo Tempest et al., (1991)

Biotechnology 9, 266-273.

··*·

Antagonisti a agonisti - testy a molekuly

Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu se mohou také použít ke stanovení navázání substrátů s malými molekulami. Dále se mohou použít ke stanovení ligand, buněk, bezbunščných přípravků, chemických knihoven a směsí přirozených produktů. Tyto substráty a ligandy mohou být přirozené substráty a ligandy nebo to mohou být strukturální nebo funkční napodobeniny (popisuje se v publikaci Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991).

Testovací metody se mohou jednoduše měřit navázáním kandidáta sloučeniny na polypeptid nebo polynukleotid nebo na buňky nebo membrány nesoucí polypeptid nebo polynukleotid nebo na fúzní protein polypeptidu na základě přímého nebo nepřímého značení kandidáta sloučeniny. V jiném případě testovací metoda může zahrnovat kompetici se značeným kompetitorem. Tyto testovací metody mohou testovat, zda kandidát sloučeniny generuje signál, který vzniká na základě aktivace nebo inhibice polypeptidu nebo polynukleotidu za použití detekčních systémů vhodných pro. buňky obsahující polypeptid nebo polynukleotid. Inhibitory aktivace se v obecném případě testují za přítomnosti známého agonisty a působí na aktivaci pomocí agonisty v přítomnosti kandidáta sloučeniny. Konstitutivně aktivní polypeptid a/nebo konstitutivně exprimované polypeptidy a polynukleotidy se mohou použít při testování inverzních agonistů nebo inhibitorů v nepřítomnosti agonisty nebo inhibitoru. Testuje se, zda kandidát sloučeniny způsobuje inhibici aktivace polypeptidu nebo polynukleotidu. Testovací metody mohou jednoduše obsahovat kroky: smíchání kandidáta sloučeniny s roztokem obsahujícím polypeptid nebo ·· · · · · polynukleotid podle vynálezu za vzniku směsi, měření aktivity polypeptidu BASB034 a/nebo polynukleotidu ve směsi a srovnáni aktivitu polypeptidu BASB034 a/nebo polynukleotidu směsi se standardem. Fúzni proteiny, jako jsou ty připravené z části Fc a polypeptidu BASB034, jak se zde popisuje, se mohou použít při testech s vysokou prostupností za účelem identifikovat antagonisty polypeptidu podle vynálezu, stejně jako fylogeneticky a/nebo funkčně příbuzné polypeptidy (popisuje se v publikaci D. Bennett et al., J. Mol. Recognition, 8: 52-58 (1995) a K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270 (16): 94599471 (1995) ) .

Polynukleotidy, polypeptidy a protilátky, které se vážou a/nebo interagují s polypeptidem podle vynálezu se mohou také použít při metodách testujících konfiguraci, přičemž se detekuje účinek přidaných sloučenin na produkci mRNA a/nebo polypeptidu v buňkách. Test ELISA se může například zkonstruovat za účelem měření množství vylučovaného polypeptidu nebo množství polypeptidu asociovaného s buňkou za použití monoklonálnich nebo polyklonálních protilátek pomocí standardních metod, které jsou dobře známy v oboru. To je možné použít při zkoumání činidel, které mohou inhibovat nebo zesilovat produkci polypeptidu (také se tento polypeptid nazývá antagonista nebo agonista) z vhodně upravených buněk nebo tkání.

Vynález dále popisuje způsob testování sloučenin vhodných pro identifikaci látek, které zesilují (agonista) nebo blokují (antagonista) působení polypeptidu BASB034 nebo polynukleotidů, zvláště těch sloučenin, které působí bakteriostaticky a/nebo bakteriocidně. Metoda testování může zahrnovat techniky s vysokou prostupností. Za účelem testování agonistů nebo antagonistů se syntetická reakční směs, buněčný kompartment, jako je například membrána, buněčný obal nebo buněčná stěna nebo libovolný jejich prostředek obsahující ·· • · · * · * · ·· · ·· · •9 •9

9· «•4· ♦ · ··· · • · • ···* ♦ ·· • ·· ·· * ·« polypeptid a značený substrát nebo v nepřítomnosti nebo která může být agonistou molekuly kandidáta inkuboval molekuly,

Schopnost polypeptid BASB034 se odráží ve značený ligand nebo snížením substrátu. Molekuly, polypeptidu ligand takového v přítomnosti

BASB034 nebo antagonistou.

agonizovat nebo snížené schopnosti kandidáta antagonizovat vázat se na produkce produktu které se vážou bezdůvodně, z takového to znamená, že nevyvolávají žádné účinky polypeptidu BASB034 jsou pravděpodobně dobrými antagonisty. Molekuly, které se vážou dobře a zvyšují rychlost produkce produktu ze substrátu, zesilují transdukci signálu nebo zesiluji aktivitu chemického kanálu jsou agonisty. Detekce rychlosti nebo množství produkce produktu ze substrátu, transdukce signálu nebo aktivity chemického kanálu se může zvýšit za použití reportního systému. Reportní systémy, které se mohou použít s tímto ohledem, nejsou omezeny na kolorimetrické, značené substráty přeměněné na produkt, reportní gen, který je odpovědný za změny v aktivitě polynukleotidů BASB034 nebo polypeptidu a vazebné testy, které jsou dobře známy v oboru.

Jiným příkladem testu vhodného pro stanovení agonistů BASB034 je kompetitivní test, který kombinuje BASB034 a potencionálního agonistu s molekulami, které se vážou na BASB034, rekombinantní molekuly vázající BASB034, přirozené substráty nebo ligandy nebo napodobeniny substrátů nebo ligandů za vhodných podmínek pro kompetitivní inhibiční testy. Polypeptid BASB034 se může značit radioaktivně nebo kolorimetricky tak, že počet molekul BASB034 vázaných na vazebnou molekulu se může stanovit přesně, aby se stanovila účinnost potencionálního antagonisty.

Potencionální antagonisté mezi jinými zahrnují malé organické molekuly, peptidy, polypeptidy a protilátky, které mohou vázat polynukleotid a/nebo polypeptid podle vynálezu a tím inhibují nebo hasí aktivitu nebo expresi. Potencionálními antagonisty také mohou být malé organické molekuly, peptid, • 9 « · · · • ·

9 9 9

9 9 • ♦Μ polýpeptid, jako je například příbuzný protein nebo protilátka, která se váže na stejná místa na vazebné molekule, jako je vazebná molekula, aniž se indukují aktivity indukované BASB034, čímž se předchází působení nebo expresi polypeptidu BASB034 a/nebo polynukleotidů tím, že se zabrání, aby se navázaly polypeptidy a/nebo polynukleotidy BASB034.

Potencionální antagonisté zahrnují malou molekulu, která se váže a obsadí vazebné místo polypeptidu, přičemž brání navázání molekul vázajících se na buňku tak, že se zabrání normální biologické aktivitě. Příklady malých molekul zahrnují, ale nejsou omezeny na malé organické molekuly, peptidy nebo antagonisté molekuly zahrnuj i

Okano, v publikaci

Oligodeoxynucleotides expression, CRC press, potencionální antagonisté zahrnují podobné peptidům. Jiní antisense molekuly

J.

Neurochem.

as antisense

Boča Raton, FL

56:

potencionální (popisuje se (1991,

560 inhibitors of gene (1988)). Preferované sloučeniny příbuzné s BASB034 nebo jejich varianty.

Vynález popisuje genticky manipulované rozpustné fúzní proteiny, které obsahují polýpeptid podle vynálezu nebo jeho fragmenty a různé části konstantních oblastí těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinů různých podtříd (IgG, IgM, IgA, IgE) . Jako imunoglobulin se preferuje konstantní část těžkého řetězce lidského IgG, zvláště IgGl, kde dochází ke vzniku fúze v kloubní oblasti. V určitém provedení vynálezu část Fc se může odstranit jednoduše začleněním štěpících sekvencí, která se může štěpit faktorem srážení krve Xa. Tento vynález popisuje způsob přípravy těchto fúzních proteinů pomocí metod genetického inženýrství a jejich použití při testování léků, diagnostice a terapii. Vynález dále popisuje polynukleotidy kódující takové fúzní proteiny. Příklady technologie fúzních proteinů se popisuje v dokumentu mezinárodní patentová přihláška č. WO 94/29456 a WO 94/22914.

«««·

Každá z polynukleotidových sekvenci se může použit ke zkoumání a vývoji antibakteriálních sloučenin. Kódovaný protein po expresi se může využít jako cíl testování antibakteriálních léků. Polynukleotidové sekvence kódující aminoterminální oblasti kódovaného proteinu nebo ShíneDelgarno nebo jiné sekvence umožňující translaci mRNA se mohou použít ke konstrukci antisense sekvencí, přičemž se kontroluje exprese kódující sekvence.

Vynález dále popisuje použití polypeptidů, polynukleotidu, agonisty nebo antagonisty podle vynálezu při interferenci s počáteční fyzikální interakcí mezi patogenem nebo patogeny a eukaryontním přednostně savčím hostitelem odpovědným za infekci. Molekuly podle vynálezu se mohou zvláště použít při prevenci adheze bakterií, zvláště gram-pozitivních a/nebo gram-negativních bakterií na eukaryontní, přednostně savčí, extrabuněčné matricové proteiny na zavedených zařízeních nebo na extracelulární matricové proteiny v ranách, nebo při blokování bakteriální adheze mezi eukaryontními přednostně savčími extrabuněčnými matricovými proteiny a bakteriálními proteiny BASB034, které zprostředkovávají poškození tkáně a/nebo blokují normální vývoj patogenů při infekcích vyvolaných jinak než implementací zavedených přístrojů nebo jinými chirurgickými technikami.

Vynález dále popisuje agonisty a antagonisty BASB034, přičemž se upřednostňují bakteriostatické nebo bakteriocidní agonisté a antagonisté.

Anatagonisté a agonosté podle vynálezu se mohou použít například při prevenci, inhibici a/nebo léčbě onemocnění.

Vynález popisuje mimotopy polypeptidů podle vynálezu. Mimotop se definuje jako peptidová sekvence podstatně podobná přirozenému peptidu (sekvencí nebo strukturou), která je schopna být rozeznána protilátkami, které rozeznávají přirozený peptid, nebo je schopna vytvořit protilátky, které rozeznávají přirozený peptid, když se spojí s vhodným nosičem.

Peptidové mimotopy se mohou navrhnout pro určité účely adicí, delecí nebo substitucí vybrané aminokyseliny. Peptidy se mohou modifikovat pro účely jednoduché konjugace s proteinovým nosičem. V případě některých chemických konjugačních metod je nutné zahrnout terminální cystein. Navíc může být nutné peptidy konjugovat s proteinovým nosičem, aby se zahrnul hydrofobní konec vzdálený od konjugovaného konce peptidů tak, že volný konjugovaný konec peptidů zůstává spojen s povrchem nosičového proteinu. Peptid je v konformaci, která připomíná konformaci celé přirozené molekuly. Peptidy se například mohou pozměnit, přičemž mají N-terminální cystein a C-terminálni hydrofobní amidovaný konec. V jiném případě může dojít k adici nebo substituci D-stereoisomérové formy jedné nebo více aminokyselin za vzniku derivátu například se může zvýšit stabilita peptidů.

V jiném případě peptidové mimotopy se mohou identifikovat za použití protilátek, které jsou schopny samy vázat polypeptidy podle vynálezu za použití metod, jako je technologie vyjevení fága (popisuje se v dokumentu EP 0 552 267 Bl). Tato metoda generuje velké množství peptidových sekvencí, které napodobují strukturu přirozených peptidů a jsou proto schopny vázat se na protilátky vytvořené proti přirozenému peptidů, ale nemusí nezbytně sdílet podstatnou sekvenční homologii s přirozeným polypeptidem.

Vakciny

Vynález dále popisuje způsob zavedení imunologické odpovědi u jednotlivce, zvláště u savce, přičemž se upřednostňuje člověk, který obsahuje inokulaci jednotlivce s polynukleotidem BASB034 a/nebo polypeptidu nebo jeho • Φ « · · • ·

Φ ·

Φ •

• ΦΦ

Φ· tΦ •·

Φ· • · ·Φ·Φ • ♦ φ >

Φ • 9» fragmentu nebo varianty, adekvátní imunitní odpovědi T buněk za . před infekcí, zvláště mikroorganizmem a nebo produkci protilátek účelem chránit uvedeného j ednotlivec zvláště pak Popisují se infekci také pak bakteriální infekcí a

Moraxella catarrhalis.

metody, dále které bakteriální zpomaluj i popisuje způsob která zahrnuje

Vynález odpověď u jedince, vektoru, sekvence nukleové kyseliny nebo ribozomu účelem řídit expresi polynukleotidu BASB034 nebo fragment nebo jeho variantu vyvolat imunologickou odezvu tak, že protilátky a/nebo imunitní odezva T buněk zahrnující například T buňky produkující cytokin nebo cytotoxické T buňky. Účelem chránit jedince, preferuje onemocnění vzniklo nebo ne.

replikaci. imunologickou indukuj icí zavedení takovému jedinci za polypeptidů za účelem a/nebo in vivo vznikáj í je už zavedení genu do požadované jiným způsobem. Takové je se člověk, před onemocněním, ať Jedním příkladem aplikace genu buňky jako je potah částic nebo vektory nukleových kyselin mohou obsahovat DNA, RNA, ribozym, modifikovanou nukleovou kyselinu, hybrid DNA/RNA, komplex protein-DNA nebo komplex RNA-protein.

Vynález dále popisuje imunologický prostředek, který po zavedení do jednotlivce, upřednostňuje se člověk, je schopný v něm vyvolat imunologickou odpověď proti polypeptidů a/nebo polynukleotidu BASB034, přičemž prostředek obsahuje rekombinantní polynukleotid BASB034 a/nebo polypeptid a/nebo DNA a/nebo RNA, která kóduje a exprimuje antigen uvedeného polynukleotidu BASB034 a jimi kódovaný polypeptid nebo jiný polypeptid podle vynálezu. Imunologická odpověď se může použít terapeuticky nebo profylaktický a má formu protilátkové imunity a/nebo buněčné imunity vzniklé v T buňkách CTL nebo CD4+.

Polypeptid BASB034 nebo jeho fragment může fúzovat s koproteinem nebo chemickou sloučeninou, která může nebo nemusí sama produkovat protilátky, ale je schopna stabilizovat první

I

•	• 44»	• 4		• 4	•
« 4	•	•	*	•	• ·	• 4
β	•	•	•	• 4 4	•	•	4
•	•	• ·	•	4	* ·	β	•
a	•	«	•	•	•	♦	4
444	•	• ·	4 4 4	4 4	444

protein a produkovat fúzovaný nebo modifikovaný protein, který bude mít antigenní a/nebo imunogenní vlastnosti a upřednostňuji se protektivni vlastnosti. Takové fúzované rekombinantní proteiny přednostně dále obsahují antigenní koprotein, jako je lipoprotein D z mikroorganizmu Haemophilis influenzae, glutathion-S-transferáza (GST) nebo betagalaktozidáza nebo libovolný jiný relativně velký ko-protein, který rozpouští protein a umožňuje ho produkovat a čistit. Koprotein může působit jako adjuvans ve smyslu poskytování generalizovaného stimulu imunitního systému organizmu, kterému se aplikuje protein. Ko-protein se může vázat na N- nebo Ckonec fúzniho proteinu.

Vynález dále popisuje prostředky zvláště vakcinační prostředky a metody obsahující polypeptidy a/nebo polynukleotidy podle vynálezu a imunostimulačni sekvence DNA, jak se popisují v publikaci Sáto, Y. et al., Science 273: 352 (1996).

Vynález dále popisuje metody použití popsaného polynukleotidu nebo jeho fragmentů, o kterých se ví, že kódují nevariabilní oblasti proteinů na povrchu bakteriálních buněk v polynukleotidových konstrukcích užívaných při takových genetických imunizačních experimentech ve zvířecích modelech infekce mikroorganizmu

Moraxella catarrhalis.

Takové experimenty se mohou zvláště použít pří identifikaci proteinových epitopu, které jsou schopny vyvolat profylaktickou nebo terapeutickou imunitní odpověď.

Věří se, že tento přístup umožní následnou přípravu monoklonálních protilátek určité hodnoty, získané z požadovaného orgánu zvířete, které je rezistentní vůči infekci nebo jeho infekce zmizela. Tyto protilátky se pak mohou použít při vývoji profylaktických činidel nebo terapeutických léků vhodnývh pro léčbu bakteriální infekce, zvláště pak infekce organizmem

Moraxella catarrhalis u savců, zvláště pak u člověka.

Vynález dále popisuje vakcinační prostředky, které obsahují imunogenní rekombinantní polypeptid a/nebo polynukleotid podle vynálezu spolu s vhodným nosičem, jako je «··· ·· ···* ·· • · · · * · • · · ··· · · • · · · · · · · • · · · · · • ·♦ ··· ·· ·· ··· farmaceuticky přijatelný nosič.

Protože polypeptidy a polynukleotidy se mohou v žaludku porušit, musí se aplikovat parenterálně, což zahrnuje například podkožní aplikaci, aplikaci do svalu, intravenózni nebo intradermálni aplikaci.

Formulace vhodné pro parenterálni aplikaci zahrnuji vodné a nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatické sloučeniny a rozpouštědla, která tvoří formulace izotonické s tělesnými tekutinami, přičemž se upřednostňuje krev, jednotlivce, vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou zahrnovat suspendační nebo zahušťující činidla. Prostředky mohou být přítomny v kontejnerech s jednou dávkou nebo s více dávkami, jako jsou například zatavené ampule a zkumavky, a mohou se skladovat v lyofilizované formě a těsně před použitím se pouze přidá sterilní kapalný nosič.

Vakcinační prostředek podle vynálezu může zahrnovat systémy adjuvans vhodné pro zvýšení imunogenicity formulace. Upřednostňuje se, když systém adjuvans vyvolá odpověď typu TH1.

Imunitní odpověď se může rozdělit do dvou extrémních kategorií, což znamená humorální a buněčná imunitní odpověď (tradičně charakterizovaná protilátkou a buněčným efektorovým mechanizmem ochrany). Tyto kategorie odpovědi se nazývají odpovědí typu TH1 (buněčná odpověď) a imunitní odpověď typu TH2 (humorální odpověď).

Extrémní imunitní odpovědi typu TH1 se mohou charakterizovat vytvořením antigen specifických cytotoxických T lymfocytů rozdělených podle haplotypů a přirozené odpovědi buněk K. U myší se často odpovědi typu TH1 charakterizují • · · · · · · · ·

QQ ········♦ o o · · ·· ··· ··· · ·· ··· ·· vytvořením protilátek subtypu IgG2, zatímco u člověka tyto odpovídají protilátkám typu IgGl. Imunitní odpovědi typu TH2 se charakterizuji vytvořením širokého rozmezí izotypů imunoglobulinu, které zahrnují u myší IgGl, IgA § IgM.

Je možné uvažovat, že sila řídící vývoj těchto dvou typů imunitních odpovědí jsou cytokiny. Velké množství cytokinů typu TH1 má tendenci vyvolat buněčnou imunitní odpověď proti danému antigenu, zatímco velké množství cytokinů typu TH2 má tendenci vyvolat humorální imunitní odpověď na antigen.

Rozlišení imunitní odpovědi typu TH1 a TH2 není absolutní. Jedinec bude podporovat imunitní odezvu, která se popisuje jako dominantně TH1 nebo dominantně TH2. Často je vhodné zvažovat rodiny cytokinů v souladu s klony T buněk CD4+ve (popisuje se v publikaci Mosmann, T. R. and Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymfokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p. 145-173). Odezvy typu TH1 jsou tradičně spojeny s produkcí cytokinů INF-γ a IL-2 T-lymfocyty. Další cytokiny, které jsou často přímo spojeny s vyvoláním imunitní odpovědi typu TH1, nevznikají v T-buňkách. Jsou to například IL-12. Naopak odpovědi typu TH2 jsou spojeny s vylučováním 11-4, IL-5, IL-6 a IL-13.

Je známo, že jisté vakcinační adjuvans jsou zvláště vhodná ke stimulaci cytokinové odpovědi typu TH1 nebo TH2. Tradičně nej lepší indikátory rovnováhy TH1:TH2 imunitní odpovědi po vakcinaci nebo infekci zahrnují přímé měření produkce cytokinů TH1 nebo TH2 lymfocyty T in vitro po opětné stimulaci antigenem a/nebo měření poměry IgGl:IgG2a protilátkové odezvy specifické pro antigen.

Adjuvans typ TH1, který preferenčně stimuluje izolovanou populaci T-buněk, aby produkovaly velké množství cytokinů typu • · · · • · · · • ·

THI, když se opětně stimulují s antigenem in vitro a podporují vývoj cytotoxických T lymfocytů CD8+ a imunoglobulinové odpovědi spojené s izotypem TH-1, která je specifická pro antigen.

Adjuvans, které je schopné přednostně stimulovat odpověď buněk THI se popisují v mezinárodní patentové přihlášce č. WO 94/00153 a WO 95/17209.

Látka 3-de-O-acylovaný monofosforylovaný lipid A (3D-MPL) je jedno takové adjuvans. Popisuje se v dokumentu GB 2220211 (Ribi). Chemicky to je směs 3-de-0-acylovaného monofosforylovaného lipidu A s 4,5, nebo 6 acylovaným řetězcem a vyrábí se firmou Ribi Immunochem, Montana. Preferovaná forma 3-de-O-acetylovaného monofosforylovaného lipidu A se popisuje v publikaci Evropský patent č. 0 689 454 Bl (SmithKline Beecham Biologicals SA) .

Upřednostňuje se, aby částice 3D-MPL byly dostatečně malé, aby se daly sterilizovat filtrací přes membránu o velikosti pórů 0,22 mikronů (popisuje se v dokumentu Evropský patent č. 0 689 454) . 3D-MPL je přítomen v rozmezí 10 μς až 100 μς, přičemž se upřednostňuje rozmezí dávky 25 až 50 μς, kde antigen bude v typickém případě přítomen v rozmezí 2 až 50 μρ.

Jiné preferované adjuvans obsahuje QS21 a netoxickou frakci čištěnou HPLC získanou z kůry Quillaja Saponaria Molina. Tuto látku je možné smísit s 3-de-O-acylovaným monofosforylovaným lipidem A (3D-MPL) společně s nosičem.

Způsob produkce QS21 se popisuje v americkém patentu č. 5,057,540.

Nereaktogenní adjuvantní formulace obsahující QS21 se popisuje už dříve (WO 96/33739). Takové formulace obsahující

QS21 a cholesterol se ukázaly být vhodná stimulující adjuvans

TH1, v případě, že se připravují dohromady s antigenem.

Další adjuvans, které jsou přednostně stimulátory odpovědi buněk TH1 zahrnují imunomodulační oligonukleotidy, což jsou například nemetylované sekvence CpG, jak se popisuje v dokumentu WO 96/02555.

Kombinace různých TH1 stimulačních adjuvans, jako jsou ty uvedené shora v textu, poskytují také adjuvans, které je preferenční stimulátor odpovědi buněk TH1. QS21 se může vytvořit spolu s 3D-MPL. Poměr QS21:3D-MPL bude v typickém případě 1:10 až 10:1, upřednostňuje se poměr 1:5 až 5:1 a často 1:1. Preferované rozmezí při optimální sinergii je 2,5:1 až 1:1 3D-MPL:QS21.

Upřednostňuje se, aby ve vakcinačním prostředku podle vynálezu byl také přítomen nosič. Nosičem může být olej ve vodní emulzi nebo hlinitá sůl, jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

Preferovaná emulze olej ve vodě obsahuje metabolizovatelný olej, jako je squalen, alfa-tokoferol a Tween 80. Zvláště preferované provedení vynálezu popisuje antigeny ve vakcinační kompozici podle vynálezu kombinované s QS21 a 3D-MPL, které jsou přítomny v uvedené emulzy. Navíc olej ve vodné emulzi může obsahovat spán 85 a/nebo lecitin a/nebo trikaprylin.

V typickém případě při aplikaci QS21 a 3-MPL člověku, je nutné, aby byly přítomny ve vakcinačním prostředku v rozmezí 1 až 200 μρ, jako například 10 až 100 μς, upřednostňuje se 10. až 50 μg v jedné dávce.

V typickém případě olej ve vodě bude obsahovat 2 až 10 % skvalenu, 2 až 10 % alfatokoferolu a 0,3 až 3 % tweenu 80. Upřednostňuje se, aby poměr skvalen:alfatokoferolu byl stejný

nebo nižší než 1 a tak vzniká stabilnější emulze. Spán 85 může být také přítomen v množství tvořící 1 %. V některých případech může být výhodné, že vakciny přítomné podle vynálezu budou dále obsahovat stabilizátor.

Netoxické emulze olej ve vodě přednostně obsahují ve vodném nosiči netoxický olej, jako je například skvalen nebo skvalen a emulgačni činidlo, například Tween 80. Vodným nosičem může například být fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok.

Zvláště účinný adjuvanční přípravek zahrnující QS21, 3DMPL a tokoferol v emulzi olej ve vodě se popisuje v dokumentu WO 95/17210.

Vynález dále popisuje polyvalentní vakcinační prostředek obsahující vakcinační prostředek podle vynálezu v kombinaci s jinými činidly, zvláště pak antigeny, které je možné použít při léčbě rakoviny, autoimunitního onemocnění a příbuzných stavů. Takové polyvalentní vakcinační kompozice může zahrnovat adjuvans indukující TH-1, jak se popisuje dále v textu.

Zatímco vynález popisuje jisté polypeptidy BASB034 a polynukleotidy, rozumí se, že také popisuje fragmenty přirozeně se vyskytujících polypeptidů a polynukleotidů a podobné polypeptidy a polynukleotidy s adicí, delecí nebo substitucí, které v podstatě neovlivňují imunogenní vlastnosti rekombinantních polypeptidů nebo polynukleotidů.

Kompozice, sady a aplikace

Vynález dále popisuje prostředky obsahující polynukleotid BASB034 a/nebo polypeptid BASB034 za účelem aplikace buňkám nebo multibuněčnému organizmu.

Vynález dále popisuje kompozice obsahující zde uvedené polypeptidy a polynukleotidy a jejich agonisty a antagonisty.

• · · ·

Polypeptidy a polynukleotidy v kombinaci s nesterilnim a v případě použití dohromady s jako jsou farmaceutický nosič podle vynálezu se mohou použít sterilním nosičem nebo nosiči buňkami, tkáněmi nebo organizmy, vhodný při aplikaci jednotlivci.

Takové prostředky obsahují například takové množství polypeptidu a/nebo polynukleotidu podle vynálezu, které je terapeuticky účinné nebo aditivní v případě kultivačního média, a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ekcípient. Takové nosiče mohou zahrnovat, ale neomezují se na fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, dextrózu, vodu, glycerol, etanol a jejich kombinaci. Formulace musí vyhovovat módu aplikace. Vynález dále popisuje diagnostické a farmaceutické balíčky a kity obsahující jeden nebo více kontejnerů, které jsou naplněny jednou nebo více složkami shora uvedených kompozic podle vynálezu.

Polypeptidy, polynukleotidy a jiné kompozice podle vynálezu se mohou použít samotné nebo ve spojení s jinými sloučeninami, jako jsou terapeutické sloučeniny.

Farmaceutické kompozice se mohou aplikovat libovolným účinným a vhodným způsobem, který například zahrnuje povrchovou, orální, anální, vaginální, intravenózní, intraperitoneální, intramuskulární, podkožní, intranasální nebo intradermální aplikaci.

V případě terapie nebo jako profylakce se může aktivní činidlo aplikovat jednotlivci jako prostředek, který je možný zavést injekcí, jako sterilní vodná disperze, přičemž se upřednostňuje izotonický roztok.

Vynález popisuje farmaceutické kompozice, které obsahuji terapeuticky účinné množství polypeptidu a/nebo polynukleotidu, jako je rozpustná forma polypeptidu a/nebo polynukleotidu podle vynálezu, agonistický nebo antagonistický peptid nebo sloučeninu s malými molekulami v kombinaci • · ····· · ·

Δ Q »»······* “ ······* ···· · · · · · · · s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ekcipientem. Takové nosiče zahrnují, ale nejsou omezeny na fyziologický roztok pufrovaný fyziologický roztok, vodu, glycerol, etanol nebo jejich kombinaci. Vynález dále popisuje farmaceutický balíček a kity, které obsahují jeden nebo více kontejnerů naplněných jednou nebo více složkami shora popsaných kompozic podle vynálezu. Polypeptidy, polynukleotidy a jiné sloučeniny podle vynálezu se mohou použít samotné nebo ve spojení s jinými sloučeninami, jako jsou terapeutické sloučeniny.

Prostředky se upraví tak, aby se mohly aplikovat například systematicky nebo orální cestou. Preferované formy systémové aplikace zahrnují injekce, v typickém případě intravenózní injekce. Dále se může použít jiný způsob zavedení injekcí, jako je například podkožní, do svalu nebo intraperitonální. Alternativní způsoby systémové aplikace zahrnují transmukozální a transdermální aplikaci za použití penetrantů, jako jsou žlučové sole nebo kyselina fusidová nebo jiné detergenty. V případě, že polypeptid nebo jiné sloučeniny se mohou vytvořit jako enterické nebo kapsulizované prostředky, je možné je použít při orálním způsobu aplikace. Aplikace těchto sloučenin může být také povrchová nebo lokalizovaná ve formě slin, past, gelů, roztoků, prášků nebo podobně.

V případě aplikace savci a zvláště pak člověku se očekává, že denní dávka aktivního činidla je od 0,01 mg/kg do 10 mg/kg. V typickém případě okolo 1 mg/kg. Lékař stanoví aktuální dávku, která bude nej vhodnější pro jednotlivce a bude kolísat v závislosti na věku, hmotnosti člověka a odpovědi určitého jedince. Shora uvedené dávky jsou příkladem průměrného příkladu. Mohou samozřejmě existovat jednotlivé případy, kde jsou výhodná vyšší nebo nižší rozmezí dávky podle vynálezu.

Rozmezí dávky nutně závisí na volbě peptidu, na způsobu aplikace, na podstatě formulace a na stavu subjektu a na • «· · · 0 0 0 0 0 000 «· · · · 0 00 0 • · · · · · · 00 • · 0 0 0 0 0 00 • · · · 0 00 • 0 · · 00Φ0 0 0·· zvážení praktického lékaře. Vhodné dávky se pohybují v rozmezí

0,1 až 100 pg/kg tělesné hmotnosti subjektu.

Je vhodné, aby se vakcinační prostředek vyskytoval » v injekční formě. Aby se zesílila imunitní odpověď, je vhodné použít adjuvans. Vhodná jednotková dávka pro vakcinaci je 0,5 až 5 mikrogramů na kilogram antigenu a taková dávka se přednostně aplikuje 1 až 3 krát v intervalu 1 až 3 týdny. V uvedeném rozmezí dávky se neprojevují žádné toxické účinky, které by bránily jejich aplikaci vhodným jedincům.

»

Vzhledem k tomu, že existuje velké množství různých dostupných sloučenin, jejichž účinnost se liší účinností různých způsobů aplikace, aplikují se v různých dávkách. Například u orální aplikace se očekává, že jsou nutné vyšší dávky, než v případě aplikace intravenózní injekcí. Variace tohoto množství se může upravit za použití standardních empirických cest vhodných pro optimalizaci.

Sekvenční databáze, sekvence na médiu a algoritmy

Polynukleotidové a polypeptidové sekvence tvoří dostupný informační zdroj, se kterým je možné stanovit jejich dvou až tří dimenziální struktury, stejně jako identifikovat další sekvence podobné homologie. Tyto přístupy jsou jednoduše umožněny uložením sekvence v počítači na čtěcím médiu a pak se tyto data mohou použít v programu makromolekulám! struktury nebo při vyhledávání v sekvenční databázi za použití dobře známých vyhledávacích nástrojů, jako je program GCG.

Vynález dále popisuje metody analýzy charakteristických sekvencí nebo řetězců, zvláště genetických sekvencí nebo kódovaných proteinových sekvencí. Preferované metody sekvenční analýzy zahrnují například metody analýzy sekvenční homologie, jako je analýza identity a podobnosti, . analýza struktury DNA, RNA a proteinu, uspořádání sekvence,“ kladistická analýza, • 999 analýza sekvenčního motivu, stanovení otevřeného čtecího rámce, kodonu, vyvolání baží nukleových nastavení baží nukleové kyselin, kyseliny analýza použití a analýza píku sekvenačního chromatogramu.

Metoda založená na použití počítače se používá pro zjištění homologie. Tato metoda zahrnuj e získání první polynukleotidové sekvence, která obsahuje sekvenci polynukleotidu podle vynálezu na počítačovém čtecím médiu a porovnání uvedené první nukleotidové sekvence alespoň s jednou polovinou polynukleotidové nebo polypeptidové sekvence za účelem identifikace homologie.

Metoda založená na použití počítače se také používá při identifikaci homologie, přičemž uvedená metoda zahrnuje kroky získání první polypeptidové sekvence, která obsahuje sekvenci polypeptidu podle vynálezu na počítačovém čtecím médiu a porovnání uvedené první polypeptidové sekvence alespoň s jednou polovinou polynukleotidové nebo polypeptidové sekvence za účelem identifikace homologie.

Definice

Termín „shoda znamená vztah mezi dvěmi nebo více polypeptidovými sekvencemi nebo dvěmi nebo více polynukleotidovými sekvencemi, což se stanoví porovnáním sekvencí. Termín „shoda také znamená stupeň sekvenční příbuznosti mezi polypeptidovou a polynukleotidovou sekvencí, jak se stanoví párováním mezi pruhy sekvencí. Termín „shoda se může jednoduše vypočítat použitím známých metod, které se popisují v publikacích Computational Molecular Biology, Lesk A. M., ed., Oxford University Press, New York , 1988,

Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. , ed., Academie Press, New York, Sequence Data, Part I, Griffin, eds., Humana Press, New Jersey,

1993, Computer Analysis of

A. Μ. , and Griffin, H. G.,

1994, Sequence Analyssís in • ·

Molecular Biology, von Heine, G., Academie Press, 1987, a

Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , ads., M. Stockton Press, New .York, 1991, a Carillo, H., and

Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Metody ke stanovení identity se navrhly tak, aby vzniklo co nejvíce párů mezi testovanými sekvencemi. Metody vhodné pro stanovení shody se kodifikují pomocí veřejně dostupného počítačového programu. Počítačové metody vhodné pro stanovení shody mezi dvěmi sekvencemi zahrnují, ale nejsou omezeny na program GAP v programovém balíčku GCG (popisuje se v publikaci Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387(1984)), BLASTP, BLASTIN (Altschul, S. F. , et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) a FASTA (Pearson and Lipman Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988). Programy rodiny BLAST jsou veřejně dostupné u firmy NBCI a z jiných zdrojů (popisuje se v publikaci BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Petehsda, MD 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215; 403-410 (1990). Ke stanovení shody sekvencí je také možné použít dobře známý Smith Watermanův algoritmus.

Parametry pro porovnání sekvencí polypeptidu zahrnují: algoritmus popsaný v publikaci Needleman an Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970), srovnávací matrice: BLOSSUM62 (popisuje se v publikaci

Henikoff and Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 89: 1091510919 (1992), hodnota „Gap Penalty: 8, hodnota „Gap Lenth Penalty: 2.

Program, který používá těchto parametrů je veřejně dostupný jako program „gap od firmy Genetics Computer Group, Madison

WI. Shora uvedené parametry jsou základní parametry porovnání peptidů.

Parametry pro porovnání polynukleotidu zahrnují:

♦ · algoritmus popsaný v publikaci Needleman and Wunsh, J. Mol.

Biol. 48: 443-453 (1970), porovnávací matrice: párování = +10, počet nesprávných párů rovná se 0, hodnota „Gap Penalty: 50, hodnota „Gap Lenth Penalty: 3

Program, který používá těchto parametrů je veřejně dostupný jako program „gap od firmy Genetics Computer Group, Madison WI. Shora uvedené parametry jsou základní parametry porovnání nukleových kyselin.

Termín „shoda v případě polynukleotidů a polypeptidu se vysvětluje dále v textu.

1) Polynukleotidové provedení dále zahrnuje izolovaný polynukleotid obsahující polynukleotidovou sekvenci, která vykazuje alespoň 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 nebo 100 % shodu s referenční sekvencí SEQ ID NO: 1, kde uvedená polynukleotidová sekvence může být shodná s referenční sekvencí SEQ ID NO: 1 nebo může zahrnovat až určité celé číslo nukleotidových změn ve srovnání s referenční sekvencí, kde uvedené změny se vybraly ze skupiny zahrnující alespoň jednu nukleotidovou deleci, substituci, transici a transverzi nebo inzerci a kde uvedené změny se mohou objevit v polohách na 5' nebo 3' konci referenční nukleotidové sekvence nebo libovolně jinde mezi těmito terminálními polohami. Mohou být jednotlivě promýchány mezi nukleotidy v referenční sekvenci nebo v jedné nebo více spojených skupinách, přičemž uvedený počet nukleotidových změn se stanoví násobením celkového počtu nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 1 celým číslem, které definuje procento shody, děleno 100 a pak se tato hodnota odečte od uvedeného celkového počtu nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo n_n < x_n - (x_n · y) ,

• »»·» ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ

ΦΦ ΦΦΦΦ Φ·Φ

Φ Φ · Φ ΦΦΦ Φ · φφ ΦΦ ΦΦΦΦ

ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦ ΦΦ Φ·Φ kde symbol η_η je počet změn nukleotidů, symbol x_n znamená celkový počet nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 1 a symbol y je 0,5 v případě 50 %, 0,60 v případě 60 %, 0,7 v případě 70 %, 0,80 v případě 80 %, 0,85 v případě 85 % a 0,9 v případě 90 % a 0,95 v případě 95 %, 0,97 v případě 97 % nebo 1 v případě 100 % a symbol · znamená operátor násobení a hodnota symbolu x_a, pokud není celé číslo, se před odečtením od hodnoty x_n zaokrouhlý směrem dolů na celé číslo. Změny polynukleotidové sekvence kódující polypeptid SEQ ID NO: 2 mohou dát vzniku nesmyslné mutaci kódující sekvenci, mutaci kódující sekvence se změněným smyslem a mutaci s posunem rámce, čímž se také změní polypeptid kódovaný polynukleotidem po vzniku takových mutací.

Polynukleotidová sekvence podle vynálezu může být shodná s referenční sekvencí SEQ ID NO: 1. Tyto sekvence mohou vykazovat až 100 % shodu nebo mohou zahrnovat až jisté celé číslo změn v nukleové kyselině ve srovnání s referenční sekvencí tak, že procento shody je menší než 100 %. Takové změny se vybraly ze skupiny zahrnující alespoň jednu deleci nukleové kyseliny, substituci, tranzici a transverzi nebo inzerci a kde uvedené změny se mohou vyskytnout v polohách 5' a 3'konce referenční polynukleotidové sekvence nebo libovolně mezi těmito terminálními polohami, rozsetými buď jednotlivě mezi nukleovými kyselinami v referenční sekvenci nebo v jedné nebo více skupinách. Počet změn nukleových kyselin pro danou shodu vyjádřenou v procentech se stanoví násobením celkového počtu nukleových kyselin v sekvenci SEQ ID NO: 1 celým číslem, které definuje procento shody, děleno 100 a tato hodnota se odečte od uvedeného celkového počtu nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo n_n < x_n - (x_n · y) , kde symbol n_n je počet změn nukleotidů, symbol x_n znamená celkový počet nukleotidů v SEQ ID NO: 1 a symbol y je 0,5 • ·· · v případě 50 %, 0,60 v případě 60 %, 0,7 v případě 70 %, 0,80 v případě 80 %, 0,85 v případě 85 % a 0,9 v případě 90 % a

0,95 v případě 95 %, 0,97 v případě 97 % nebo 1 v případě 100 % a symbol · znamená operátor násobení a hodnota symbolu x_a, pokud není celé číslo se před odečtením od hodnoty x_nzaokrouhlý směrem dolů na celé číslo.

2) Polypeptidové provedení dále zahrnuje izolovaný polypeptid obsahující polypeptid, který vykazuje alespoň 50, 60, 70,

80, 85, 90, 95, 97 nebo 100 % shodu s polypeptidovou referenční sekvencí SEQ ID NO: 2, kde uvedená polypeptidová sekvence může být shodná se referenční sekvencí SEQ ID NO: 2 nebo může zahrnovat až určité celé číslo změn aminokyselin ve srovnání s referenční sekvencí, kde uvedené změny se vybraly ze skupiny zahrnující alespoň jednu deleci aminokyseliny, substituci zahrnující konzervativní a nekonzervativní substituci nebo inzerci a kde uvedené změny se mohou objevit v polohách na N-nebo C-konci referenční polypeptidové sekvence nebo libovolně jinde mezi těmito terminálními polohami. Mohou být jednotlivě promíchány mezi aminokyselinami v referenční sekvenci nebo v jedné nebo více spojených skupinách, přičemž uvedený počet aminokyselinových změn se stanoví násobením celkového počtu aminokyselin v sekvenci SEQ ID NO: 2 celým číslem, které definuje procento shody, děleno 100 a pak se tato hodnota odečte od uvedeného celkového počtu nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo n_a < x_a - (x_a · y) , kde symbol n_a je počet změn aminokyselin, symbol x_a znamená celkový počet aminokyselin v SEQ ID NO: 2 a symbol y je 0,5 v případě 50 %, 0,60 v případě 60 %, 0,7 v případě 70 %, 0,80 v případě 80 %, 0,85 v případě 85 % a 0,9 v případě 90 % a 0,95 v případě 95 %, 0,97 v případě 97 % nebo 1 v případě 100 % a symbol · znamená operátor násobení a hodnota symbolu x_a,

9999 ♦

pokud není celé číslo se před odečtením od hodnoty x_a zaokrouhlý směrem dolů na celé číslo.

Polypeptidová sekvence podle vynálezu může být shodná s referenční sekvencí SEQ ID NO: 2. Tyto sekvence mohou vykazovat až 100 % shodu nebo mohou zahrnovat až jisté celé číslo změn aminokyselin ve srovnáni s referenční sekvencí tak, že procento shody je menší než 100 %. Takové změny se vybraly ze skupiny zahrnující alespoň jednu deleci aminokyseliny, substituci zahrnující konzervativní a nekonzervativní substituci nebo inzerci a kde uvedené změny se mohou vyskytnout v polohách N- a C-konce referenční polypeptidové sekvence nebo libovolně mezi těmito terminálními polohami, rozsetými buď jednotlivě mezi aminokyselinami v referenční sekvenci nebo v jedné nebo více skupinách. Počet změn aminokyselin pro danou shodu vyjádřenou v procentech se stanoví násobením celkového počtu aminokyselin v sekvenci SEQ ID NO: 2 celým číslem, které definuje procento shody, děleno 100 a tato hodnota se odečte od uvedeného celkového počtu nukleotidů v sekvenci SEQ ID NO: 2 nebo n_a < x_a - (x_a · y) , kde symbol n_a je počet změn nukleotidů, symbol x_a znamená celkový počet aminokyselin v SEQ ID NO: 2 a symbol y je 0,7 v případě 70 %, 0,80 v případě 80 %, 0,85 v případě 85 % a symbol · znamená operátor násobení a hodnota symbolu x_a, pokud není celé číslo se před odečtením od hodnoty x_azaokrouhlý směrem dolů na celé číslo.

Termín „jednotlivec znamená organizmus, kterým může být více buněčný eukaryont zahrnující například metazoa, savce, ptáky, dobytek, opice, primáty a člověka.

Termín „izolovaný znamená změněný člověkem ze svého přirozeného stádia. To znamená, že když se objevuje v přírodě,

9 ♦ * změní se jeho přirozené prostředí nebo se obojí. Polynukleotid nebo polypeptid, vyskytuje přirozené v živém organizmu, se ···· ·· • * *99 z něho odstraní nebo se například který nenazývá izolovaný, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid oddělený existujícího materiálu, se kterým se vyskytuje stádiu se nazývá „izolovaný. Polynukleotid nebo zavede do organizmu transformací, nebo jiným způsobem rekombinace od společně který se manipulací „izolovaný v uvedeném dokonce tehdy, organizmu, přičemž v přirozeném polypeptid, genetickou nazývá přítomen být živý se jestliže je stále uvedený organizmus může nebo usmrcený.

Termín „polynukleotidy v obecném případě znamená libovolný polyribonukleotid nebo polydeoxyribonukleotid, kterým může být neupravená RNA nebo DNA nebo upravená RNA nebo DNA zahrnující jednořetězcovou nebo dvouřetězcovou oblast.

Termín „varianta znamená polynukleotid nebo polypeptid, který se liší od referenčního polynukleotidu nebo polypeptidů, ale uchovává si podstatné vlastnosti. Typická varianta polynukleotidu se liší svou nukleotidovou sekvencí od jiné sekvence referenčního polynukleotidu. Změny v nukleotidové sekvenci varianty mohou nebo nemusí změnit aminokyselinovou sekvenci polypeptidů kódovaného referenčním polynukleotidem. Nukleotidové změny mohou vést k substituci, adici, deleci, fúzi a zkrácení aminokyselin v polypeptidů kódovaném referenční sekvencí, jak se popisuje dále v textu. Typická varianta polypeptidů se liší aminokyselinovou sekvencí od jiné sekvence referenčního polypeptidů. V obecném případě jsou rozdíly limitovány tak, že sekvence referenčního polypeptidů a varianta jsou velmi podobné a v mnoha oblastech jsou shodné. Varianta a referenční polypeptid se mohou lišit aminokyselinovou sekvencí jednou nebo více substitucí, adicí, deleci v libovolné kombinaci. Substituované nebo začleněné aminokyselinové zbytky mohou nebo nemusí kódovat genetický ···♦ ··♦· kód. Varianta polynukleotidu nebo polypeptidu se může přirozeně vyskytovat, jako alela nebo to může být varianta, která se v přírodě přirozeně nevyskytuje. Nepřirozeně se vyskytující varianty polynukleotidů a polypeptidu mohou vzniknout metodami mutageneze nebo přímou syntézou.

Termín „onemocnění znamená libovolné onemocnění způsobené nebo příbuzné infekci bakterii, které například zahrnuje zánět středního ucha u kojenců a dětí, zápal plic u starých lidí, sinusitidu, nozokomiální infekce a invazivní onemocnění, chronické záněty středního ucha se ztrátou sluchu, hromadění tekutiny ve středním uchu, poškození sluchového nervu, oddálení schopnosti dítěte naučit se mluvit, infekce horních cest dýchacích.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Sekvenace DNA genu BASB034 z mikroorganizmu

Moraxella catarrhalis kmen ATCC 43617 za účelem objevení a potvrzení uvedené sekvence

Gen BASB034 se poprvé objevil popsaný v databázi Incyte PathoSeq, která obsahuje sekvence genomové DNA mikroorganizmu Moraxella catarrhalis kmen ATCC 43617 (také se nazývá kmen MC2931) . Translace polynukleotidové sekvence BASB034 ukázala podstatnou podobnost (42 % shodu v přesahu 214 aminokyselin) s proteinem vnější membrány mikroorganizmu Klebsiella pneumoniaei fosfolipázy A.

Sekvence genu BASB034 se dále potvrdila experimentem. Z tohoto důvodu se genomová DNA extrahovala z množství 1O¹⁰buněk mikroorganizmu M. catarrhalis (kmen ATCC 43617) za použití extrakčního kitu pro genomovou DNA QIAGEN (Qiagen Gmbh) . 1 μς tohoto materiálu se podrobil amplifikaci PCR za použití primerů E481124 (5 '-GAT TTA AGA GTA TGT TAT GAT G-3') (SEQ ID NO: 9) a E481125 (5'-GTA TGG GTT GAT CAA ATA CAG-3') • ···· ·· ···· ·· · ·· · · · · ♦ ♦ · ·· • « · · ♦·♦ · 9· • · 9 9 9 9 99

999 9 99 999 99999 (SEQ ID NO: 10). Tento produkt PCR se čistil na zařízeni Biorobot 9600 (Qiagen Gmbh) a podrobil se sekvenování DNA za použiti sekvenačního kitu „Big Dye Cycle Sequencing kit (od firmy Perkin Elmer) a sekvenace se provedla na sekvenátoru DNA ABI 377/PRISM. Sekvenace DNA se uskutečnila na obou řetězcích s hodnotou redundance 2 a uspořádala se celá sekvence za použití software Sequencher™ (Applied Biosystems). Ukázalo se, že výsledná sekvence vykazuje 100 % shodu se sekvencí SEQ ID NO: 1.

Příklad 2: Analýza variability genu BASB034 mezi různými kmeny mikrooganizmu Moraxella catarrhalís

2A: Analýza délky restrikčních fragmentů (RFLP)

Ze 16 kmenů mikroorganizmu Moraxella catarrhalís (uvádí se v tabulce č. 1) se extrahovala genomová DNA, jak se popisuje dále v textu. Jediná kolonie mikrorganizmu Moraxella catarrhalís se nanesla na agarové plotny BHI a nechaly se růst při teplotě 37 °C. Izolovaly se tři nebo čtyři jednotlivé kolonie a použily se pro inokulaci přibližně 1,5 ml půdy BHI (infúze ze srdce a mozku) a kultura se nechala kultivovat přes noc, za stálého míchání při přibližně 300 ot./min. při teplotě 37 °C. Erlenmayerovy lahve o objemu 500 ml obsahující přibližně 150 ml půdy BHI se inokulovaly kulturou a nechaly se růst po dobu přibližně 12 až 16 hodin při teplotě 37 °C v inkubátoru za stálého míchání při přibližně 175 ot./min., přičemž vzniká buněčná hmota vhodná pro izolaci DNA. Buňky se shromáždily centrifugací za použití rotoru Sorvall GSA při 2 OOOxg po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Odstranil se supernatant a buněčný pelet se suspendoval ve sterilní vodě o objemu 5 ml. Přidal se stejný objem lyzačního pufru (200 mM NaCl, 20 mM EDTA, 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 % (hmotnost/objem) SDS, 0,5 % (objem) 2-merkaptoetanolu a 250 μg/ml proteinázy K) a buňky se suspendovaly jemným mícháním a ···· ·· ···· • 9

99 9 ♦ · 999 triturací. Buněčná suspenze se pak inkubovala po dobu přibližně 12 hodin při teplotě 50 °C, přičemž se lyžovaly bakterie a uvolnila se chromozomální. DNA. Proteinový materiál se vysrážel přidáním 5 ml saturovaného NaCl (přibližně 6 M, ve sterilní vodě) a centrifugoval se při 5 500x g za použití rotoru Sorvall SS34 při teplotě místnosti. Chromozomální DNA se srážela z čirého supernatantu přidáním dvou objemů 100 % etanolu. Sebrala se vysrážená DNA a promyla se za slabého míchání v malém objemu 70 % etanolu. Čištěná chromozomální DNA se suspendovala ve sterilní vodě a nechala se rozpustit přes noc při 4 °C za slabého míchání kolíbáním. Koncentrace rozpuštěné DNA se stanovila spektrofotometricky při vlnové délce 260 nm za použití extenkčního koeficientu 1,0 O.D. jednotky přibližně 50 μς/πιΐ. Tento materiál se amplifikoval PCR za použití oligonukleotidů MC-Pla-BamF (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC CAA GCT GTA CCA AAT CCT GTG GCA TTT GTT G-3') (SEQ ID NO: 11) a MC-Pla-SalRC (5'-AAG GGC CCA ATTACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TAG ACC CAT CCA GTC GTT AAG CAT AAG-3') (SEQ ID NO: 12). Odpovídající amplikony genu BASB034 se nezávisle hydrolyzovaly za použití restrikčních enzymů (Hphl, Alul, Rsa, EcoRV, Sau3Al) a restrikční produkty se separovaly elektroforézou na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu za použití postupu standardní molekulové biologie, jak se popisuje v publikaci Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Eds: Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold

Spring Harbor elektroforetických press gelů (1989). Fotografie výsledných na obrázku č. 1.

jsou zobrazeny

V případě každého RFLP odpovídající kmene se hodnotily a restrikčním enzymům.

kombinovaly paterny

Pak se definovaly skupiny kmenů sdílící identickou kombinaci paternů RFLP. Za použití uvedené metodologie kmeny testované v této studii spadají do tří genomových skupin (Skupina 1: Mc2931, Mc2904, Mc2905, Mc2907, Mc2909, Mc2910, Mc2911, Mc2912, Mc2926,

Mc2931, Mc2956, Mc2969, Mc2975;· Skupina 2: Mc2906, Mc2913;

Skupina 3: Mc2908.

(Mc2960 se neamplifikoval a následně se neklasifikoval).

Tato data podporují myšlenku, že populace mikroorganizmu Moraxella catarrhalis užívaná v této studii vykazuje omezenou diversitu nukleotidové sekvence v případě genu BASB034.

2B: Sekvenování DNA u jiných kmenů

Za použití experimentálního postupu popsaného v příkladu 1 se také stanovila sekvence genu BASB034 v případě tří dalších kmenů Moraxella catarrhalis. Nukleotidové sekvence genu BASB034 kmene Mc2908, Mc2913 a Mc 2969, což jsou zástupci tří genomových skupin identifikovaných dříve, jsou uvedeny v SEQ ID NO: 3, 5 a 7. Tyto nukleotidové sekvence se přeložily na aminokyselinové sekvence, které jsou uvedeny v SEQ ID NO: 4, 6 a 8. Za použití programu MegAlign z balíčku DNASTAR Lasergene se uskutečnilo vícenásobné uspořádání nukleotidových sekvencí SEQ ID NO: 1, 3, 5 a 7 a je zobrazeno na obrázku č. 2. Porovnání identity párováním se shrnulo do tabulky č. 2, což ukazuje, že nukleotidové sekvence genů BASB034 jsou všechny podobné při hodnotě identity vyšší než 98 %. Za použití stejného programu se uskutečnilo více uspořádání proteinových sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6 a 8 a je zobrazeno na obrázku č. 3. Porovnáni identity párováním se shrnulo v tabulce č. 3, což naznačuje, že 4 proteinové sekvence BASB034 jsou všechny podobné při stupni shody vyšší než 98%. Tato data indikují mezi kmeny mikroorganizmu Moraxella catarrhalis velmi silnou sekvenční konzervaci genu BASB034.

Tabulka č. 1: Rysy kmenů mikroorganizmu Moraxella catarrhalis používaných při této studii

kmen	izolováno v	z
Mc2904	USA	tympanocentéza
Mc2905	USA	tympanocentéza
Mc2906	USA	tympanocentéza

»· ···· • · • ···

Mc2907	USA	tympanocentéza
Mc2908	USA	akutní otitída, tympanocentéza
Mc2909	USA	tympanocentéza
Mc2910	USA	tympanocentéza
Mc2911	USA	akutní otitída, tympanocentéza
Mc2912	USA	akutní otitída, tympanocentéza
Mc2913	USA	akutní otitída, tympanocentéza
Mc2926	USA	tympanocentéza
Mc2931 (ATCC 43617)	USA	transtracheální aspirát
Mc2956	Finsko	tekutina ve středním uchu
Mc2960	Finsko	tekutina ve středním uchu
Mc2969	Norsko	nazofaryng (faryngitidarinitida)
Mc2 97 5	Norsko	nazofaryng (rinitida)

Tabulka č. 2: Shoda párů polynukleotidových sekvencí BASB034 (vyjádřeno v %)

	SEQ ID NO: 3	SEQ ID NO: 5	SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 1	98,7	99,2	99,7
SEQ ID NO: 3		99, 3	98,7
SEQ ID NO: 5			99,1

Tabulka č. 3: Shoda párů polypeptidových sekvencí BASB034 (vyjádřeno v %)

	SEQ ID NO: 4	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO: 8
SEQ ID NO: 2	98,6	99,3	99, 5
SEQ ID NO: 4		98,9	99,1
SEQ ID NO: 6			99, 3

	57	• · · t » ♦ * · • · · · · ♦ • · · · · · ♦ · · • · · · · * •«· · ·· · * » »·	• · • • ♦ ···
Příklad	3:	Konstrukce	plazmidu	vhodného pro expresi

rekombinantní BASB034

A: Klonování BASB034

Místa rozeznávaná restrikčním enzymem BamHI a Sáli se vnesla do přímého (SEQ ID NO: 11) a reverzního (SEQ ID NO: 12) amplifikačního primerů, což umožnilo přímé klonování produktu PCR BASB034 do komerčně dostupného expresívního plazmidu mikroorganizmu E. coli pQE30 (QiaGen, nese resistenci na ampicilin) tak, že zralý protein BASB034 se může exprimovat jako fúzni protein, který obsahuje na N-konci značku (His)6 vhodnou pro afinitní chromatografií. Produkt PCR BASB034 se čistil z amplifikační reakce za použití kolon založených na silikagelu (QiaGen), které je možné centrifugovat. Použiti uvedených kolon se popisuje v manuálu od výrobce. Aby vznikly požadované konce BamHI a Sáli nezbytné pro klonování, čištěný produkt PCR se postupně štěpil restrikčními enzymy BamHI a Sáli, jak doporučuje výrobce (Life Technologies). Po Prvním štěpení restrikčními enzymy se produkt PCR čistil na koloně, kterou je možné centrifugovat, jak se popisuje shora v textu, aby se odstranily sole a eluoval se do sterilní vody dříve než dojde ke štěpení druhým enzymem. Fragment štěpené DNA se opět čistil za použití centrifugační kolony založené na silikagelu a pak došlo k ligaci s plazmidem pQE30.

B: Produkce

Aby se štěpil se ošetřil telecí expresívního vektoru připravil expresívní plazmid vhodný pro podobně restrikčními enzymy BamHI a intestinální fosfatázou (CIP, j ednotek/pmol k samoligaci. pětinásobný s připraveným

5'konce, Life Technologies), aby

Při ligační reakci se použil přebytek štěpeného fragmentu ve vektorem. Uskutečnila se ligační ligaci,

Sal I a pak se přibližně 0,02 nedošlo přibližně srovnání reakce o standardním objemu přibližně 20 μΐ (při teplotě přibližně 16 °C ···

• · · · · ·· ··· ·· · po dobu 16 hodin) za použiti metod, které jsou známy v oboru a za použití T4 DNA ligázy (v koncentraci přibližně 2,0 jednotek/reakci, Life Technologies) . Alikvót ligační reakce (o objemu 5 μΐ) se použil pro transformaci elektrokompetentních buněk M15(pREP4) za použití metod, které jsou dobře známy v oboru. Pak následují přibližně 2 až 3 hodiny růstu při teplotě 37 °C v přibližně 1 ml půdy LB, přičemž transformované buňky se nanesly na LB agarové plotny, které obsahují kanamycin (50 μς/ιηΐ) a ampicilin (100 μρ/ιηΐ) . Oba druhy antibiotik byly obsaženy v selekčním médiu, aby se zaručilo, že všechny transformované buňky nesou oba plazmidy pREP4 (KnR), které nesou gen laclq nezbytný pro represi exprese proteinů indukované IPTG na plazmidu pQE30 a pQE30-BASB034 (ApR) . Plotny se inkubovaly přes noc při teplotě 37 °C po dobu 16 hodin. Sterilním párátkem se izolovaly jednotlivé kolonie a použily se při inokulaci ploten s čerstvou půdou LB KnR/ApR, stejně jako přibližně 1 ml kultivační půdy LB KnR/ApR. Plotny i tekutá půda se nechaly inkubovat přes noc při teplotě 37 °C buď ve standardním inkubátoru (plotny) nebo za stálého míchání ve vodní lázni.

Za účelem ověřit skutečnost, že transformanti obsahují inzert DNA BASB034, se použila .PCR analýza založená na celých buňkách. Přibližně 1 ml kultury v LB Kn/Ap kultivované přes noc se přenesl do propylenové zkumavky o objemu 1,5 ml a buňky se shromáždily centrifugací na Beckmanově centrifuze (po dobu 3 min., při teplotě místnosti, při 12 000 x G) . Buněčný pelet se suspendoval ve 200 μΐ sterilní vody a alikvot o objemu 10 μΐ se použil při PCR reakci o celkovém objemu 50 μΐ, která obsahuje oba amplifikační primery. Konečná koncentrace komponentů rekce PCR je v podstatě stejná, jako se uvádí v příkladu 2 s výjimkou použití. 5,0 jednotek Taq polymerázy. Počáteční krok při teplotě 95 °C se prodloužil na 3 minuty, aby se zajistila teplotní otevření bakteriálních buněk a • · · · • · • · · · uvolněni plazmidové DNA. Při amplifikaci PCR fragmentu BASB034 z lyžovaných transformantů se použil termální cyklovač ABI Model 9700 a 32 cyklů, třístupňový termální amplifikační profil. To znamená 95 °C po dobu 45 vteřin, 55 až 58 °C po dobu 45 vteřin, 72 °C po dobu 1 minuty. Po teplotní amplifikaci se. alikvot reakce o objemu 20 μΐ analyzoval elektroforézou na agarózovém gelu (0,8 % v pufru Tris-acetátEDTA (TAE)) . Fragmenty DNA se po elektroforéze na' agarózovém gelu a po obarvení ethidiumbromidem vizualizovaly UV zářením. Paralelně s testovanými vzorky se elektroforezovaly standardy molekulové velikosti DNA (žebříček 1 Kb, Life Technologies) a použily se k odhadnutí velikosti produktů PCR. Transformanti, kteří produkují očekávaný produkt PCR, se pak identifikovali jako kmen obsahující expresivni konstrukci BASB034. Kmeny, který obsahují expresivni plazmid, se pak analyzovaly za účelem zjištění exprese rekombinantního BASB034.

C: Expresní analýza PCR-pozitivních transformantů

V případě každého PCR pozitivního transformanta identifikovaného způsobem popsaným shora v textu se přibližně ml půdy LB obsahující kanamycin (50 pg/ml) a ampicilinem (100 pg/ml) inokulovalo buňkami izolovanými z plotny a kultura se nechala růst přes noc při teplotě 37 °C za stálého míchání (přibližně 250 ot./min). Alikvót celonoční kultury (přibližně baňky o objemu 125 LB Kn/Ap, a nechala míchání která růst se inokuloval do erlenmayerovy obsahuje přibližně 25 ml půdy při ot./min) až ml, se teplotě 37 turbidita °C za stálého

250 délce 600 nm 0,5, kultury dosáhla to znamená, hodnoty že se (přibližně

O.D. při vlnové dosálo střední fáze (délka kultivace logaritmická hodiny). V této době přibližně je přibližně

1,5 až 2 polovina kultury (přibližně a exprese o objemu 125 ml se indukovala přidáním IPTG

12,5 ml) se přenesla do nádoby rekombinantního proteinu BASB034 (1,0 M zásobní roztok připravený ve sterilní vodě, Sigma), aby

• ΦΦΦ φ φ konečná koncentrace byla 1,0 mM. Inkubace kultur indukovaných IPTG a neindukovaných kultur pokračovala po dobu 4 hodiny při teplotě 37 °C za stálého míchání. Po indukci se odebraly vzorky indukovaných i neindukovaných kultur (o objemu 1 ml) a centrifugací v mikrocentrifuze se při teplotě 37 °C a době 3 minut shromáždily buňky. Jednotlivé buněčné pelety se suspendovaly ve sterilní vodě o objemu 50 μΐ a pak se míchaly ve stejném objemu 2x koncentrovaném vzorkovém Laemelli pufru pro SDS-PAGE, který obsahuje 2-merkaptoetanol a umístily se do vroucí vody po dobu 3 minut, aby se denaturoval protein. Buněčné surové lyzáty indukované IPTG a neindukované o stejném objemu (přibližně 15 μΐ) se nanesly ve dvou provedeních na 12% Tris/glycin polyakrylamidový gel (použily se minigely o tloušťce 1 mm, Novex). Vzorky indukovaných a neindukovaných lyzátů se elektroforezovaly spolu s předem obarveným markérem molekulové hmotnosti (SeeBlue, Novex) za běžných podmínek za použití standardního pufru SDS/Tris/glycin (BioRad). Po elektroforéze se gel obarvil briliantovou modří podle Commassie R250 (BioRad) a pak se odbarvil, aby se vizualizovaly nové proteiny BASB034 indukované IPTG. Druhý gel se přenesl elektroblotací na membránu PVDF (velikost pórů 0,45 mikronů, Novex) po dobu 2 hodin při teplotě 4 °C za použití blotačního přístroje BioRad Mini-Protean II a Towbinova metanolového (20 %) transferového pufru. Blokování membrány a inkubace protilátek se uskutečnila podle metod dobře známých v oboru. Monoklonální protilátky proti RGS(His)3 následovány druhými králičími anti-myššími protilátkami konjugovanými s HRP (QiaGen) se použily pro potvrzení exprese a identity rekombinantního proteinu BASB034. Vizualizace reaktivního paternu protilátek proti His se dosáhlo za použití buď nerozpustného substrátu ABT nebo použitím chemoluminiscenčního systému Hyperfilm s Amersham ECL.

D: Potvrzení sekvence

Aby se dále potvrdilo, že exprimovaný rekombinantní protein BASB034 indukovaný IPTG je ve správném čtecím rámci a nikoli ve falešné molekule, která vznikla z klónovacího artefaktu (to je posun rámce), se stanovila sekvence DNA klonovaného inzertu. Sekvence DNA genu BASB034 mikroorganizmu M. catarrhalis se získala z jednoho řetězce za použití sekvenační metodologie běžného asymetrického cyklu PCR (ABI Prism Dye- Terminátor Cycle Sequencing, Perkin-Elmer). Sekvenační reakce se programovaly tak, že se jako templát použila neštěpená expresívní plazmidová DNA (koncentrace je přibližně 0,5 μς/rxn) a vhodné sekvenační primery specifické pro vektor pQE30 a ORF (v koncentraci přibližně 3,5 pmol/rxn). Vedle templátu a sekvenačních primerů se, každá sekvenační reakce (přibližný objem 20 μΐ) obsahovala čtyři různé dNTP (to znaemená A, G, C a T) a čtyři odpovídající ddNTP (to je ddA, ddG, ddC a ddT) terminační nukleotidy. Každý terminátor se konjuguje s jedním ze čtyř fluorescenčních barviv Joe, Tam, Rox nebo Fam. Jednořetězcové sekvenační elongační produkty se v náhodných polohách podél templátu

Fluorescenční zakončily terminátorů ddNTP značených barvivém, produkty značené mikrocentrifugační molekuly podle velikosti barvivém se chromatografické (Princeton čistily kolony,

Genetics), za začleněním terminační která použití dělí sušily se ve vakuu, suspendovaly se (Perkin-Elmer) a použily při PAGE v deionizovaném pufru v templátovém suspendačním se při kapilární elektroforéze nebo formamidu. Produkt se denaturoval při teplotě 95 °C po dobu minut a analyzoval se kapilární elektroforézou s vysokým rozlišením (automatický sekvenátor

DNA ABI 310,

Perkin-Elmer) nebo PAGE s vysokým rozlišením (automatický sekvenátor DNA ABI 377). data sekvence produkované na základě

Sbíraly se sekvenační relativní intenzity fluorescenčních automaticky na počítači PowerMAC za Sequence Analysis Software j ednotlivých plků se použití (Perkin-Elmer).

reakcí a analyzovaly softwaru ABI

Jednotlivě analyzované sekvence DNA se manuálně editovaly, aby byly přesné, a pak se sestavily do jednořetězcové sekvence za použití softwaru AutoAssembler (Perkin-Elmer) . Sekvenování stanovilo, že expresívní plazmid obsahoval správnou sekvencí ve správném otevřeném čtecím rámci.

Příklad 4: Produkce rekombinantního proteinu BASB034

Bakteriální kmen

Rekombinantni expresívní kmen mikroorganizmu E. coli M15 (pREP4) obsahující plazmid (pQE30) kódující BASB034 z mikroorganizmu M. catarrhalis se použil při produkci buněčné hmoty při čištění rekombinantního proteinu. Expresívní kmen se kultivoval na plotnách s LB agarem, které obsahují kanamycin v koncentraci 50 μg/ml (Kn) a ampicilin v koncentraci 100 μg/ml (Ap), aby se zjistilo, že kontrolní plazmid pREP4 laclq a expresívní konstrukce pQE30-BASB034 se udržely v buňce. Aby se mohla provést hluboké zamrazení při teplotě -80 °C,. kmen se pomnožil na půdě LB, která obsahuje stejnou koncentraci antibiotik a pak se smíchá se stejným objemem půdy LB, která obsahuje 30 % (hmotn./objem) glycerolu.

Kultivační média

Fermentační médium užívané při produkci rekombinantního proteinu se skládá z dvakrát koncentrované půdy YT (Difco), která obsahuje 50 μg/ml Kn a 100 gg/ml Ap. Do média ve fermentoru se přidalo činidlo proti pěnění v koncentraci 0,25 ml/1 (Antifoam 204, Sigma). Aby se indukovala exprese rekombinantního proteinu BASB034, tak se do fermentoru přidal IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalaktopyranozid) (konečná koncentrace je 1 mM).

Fermentace • · ·

Erlenmayerovy baňka o objemu 500 ml s pracovním objemem 50 ml se inokulovala 0,3 ml rychle rozmražené kultury nebo několika koloniemi, které se izolovaly ze selektivních agarových ploten, a inkubovaly se přibližně 12 hodin při teplotě 37 °C + 1°C za stálého míchání kolébáním při 150 ot./min. (Innova 2100, New Brunswick Scientiifc). Tato kultura se pak používala při inokulaci pracovního objemu fermentoru o objemu 5 1, který obsahoval 2x koncentrovanou půdu YT a antibiotika Kn a Ap. Eermentační tank (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) pracoval při teplotě 37 °C ± 1°C, 0,2 až 0,4 VVM vzduchu, za stálého míchání pomocí Rusthtonova oběžného kola při 250 ot./min.. Hodnota pH se nesledovala ani v nádobách s kulturou ani ve fermentačním tanku. Během fermentace se hodnota pH pohybovala v rozmezí 6,5 až 7,3. Do fermentačního tanku se přidalo IPTG (v koncentraci 1,0 M zásobní roztok připravený ve sterilní vodě), když kultura dosáhla střední logaritmické fáze růstu (hodnota OD při vlnové délce 600 nm je přibližně 0,7). Buňky se indukovaly po dobu 2 až 4 hodin a pak se sklidily centrifugací za použití centrifugy 28RS Heraeus (Sepatech) nebo super rychlé centrifugy RC5C (Sorvall Instruments). Buněčná pasta se uchovávala při teplotě -20°C až do dalšího použití.

Čištění

Chemikálie a materiály

Imidazol, guanidinhydrochlorid, Tris (hydroxymethyl) a EDTA (etylendiamidtetraoctová kyselina) ve stupni čistoty vhodné pro použití v biochemii a vyšší se získaly od firmy Ameresco Chemical, Solon, Ohio. Triton X-100 (toktylfenoxypolyetoxyetanol), monabazický fosforečnan sodný a močovina ve stupni čistoty vhodném pro použití jako činidla nebo vyšší se získaly od firmy Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Ledová kyselina octová a chlorovodíková se získaly od firmy Mallincrodt Baker lne., Phillipsburg,

New

Jersey. Metanol se získal od firmy Fisher ···· ·· ···· ·· • · · · · · • · ···· · · • · · · · · · · • · · · · · ♦ ·

Scientific, Farlawn,

New

Jersey.

PefablocOSC (4-(2-aminoetyl)benzensulfonylfluorid, úplný inhibitor proteáz a PMSF (fenylmetylsulfony1fluorid) Corporation, se získaly od firmy Roche

Diagnostics

Indianapolis,

Indiana. Bestatin, pepstatin A a proteázový inhibitor E-64 se získal od firmy

Calbiochem,

LaJolla, California. Dulbecco fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem (lx koncentrovaný firmy Quality Biological, lne., Gaithersburg, Maryland.

Dulbecco fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem (lOx

PBS) se získal od koncentrovaný PBS) se získal od firmy Bio Whittaker,

Walkersville, Maryland.

Penta-His protilátky bez BSA se získaly od firmy QiaGen,

Valencia, California. Kozí anti-myšší

IgG čištěné na základě afinity konjugované s peroxidázou se získaly od firmy Jackson

Immuno

Research, West Grove, Penn.

Roztok AEC se získal od firmy

Zymed, South San Francisco, california.

Všechny jiné chemikálie splňovaly stupeň čistoty vhodný pro použití jako činidlo nebo vyšší.

Pryskyřice Ni-NTA Superflow se získala od firmy QiaGen lne., Valencia, California. Tris-glycin v koncentraci 4 až 20 % a 10 až 20 % polyakrylamidové gely, všechny pufry a roztoky, předem obarvené standardy pomocí SeeBlue, MultiMark Multikolorované standardy a transferové membrány PVDF se získaly od firmy Novex, San Diego, California. Sady Silver Stain vhodné pro SDS PAGE se získaly od firmy Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokyo, Japan. Barvící roztok podle Comassie se získal od firmy Bio-Rad Laboratories, Hercules, California. Stříkačkové filtry o velikosti pórů 0,2 mikrony Acrodisc® PF se získaly od firmy Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. GD/X 25 mm stříkačkové filtry na jedno použití se získaly od firmy Whatman lne., Clifton, New Jersey. Dialyzační trubice 8 000 MWCO se získaly od firmy BioDesign lne. Od New York, Carmal New York. Proteinová testovací činidla BCA a dialyzační trubice z hadí kůže 3 500 MWCO se získaly od firmy Pierce

Chemical Co., Rockford, Illinois.

Extrakční protokol

Buněčná pasta se nechala roztát při teplotě místnosti po dobu 30 až 60 minut. 5 až 6 gramů materiálu se odvážilo do centrifugační zkumavky na jedno použití o objemu 50 ml. Do této zkumavky se dále přidalo 5 mililitrů na gram pufru guanidinhydrochloridu (Gu-HCl) (6 M guanidinhydrochlorid, 100 mM monobazický fosforečnan sodný, 10 mM Tris a 0,05 % Triton X-100, pH8,0). Buněčná pasta se resuspendovala za použití homogenizéru PRO300D při nastavení 3/4 síly po dobu 1 minuty. Extrakční směs se pak uchovávala při teplotě místnosti za slabého míchání po dobu 60 až 90 minut. Po 60 až 90 minutách se extrakční směs centrifugovala při 15 800 x g po dobu 15 minut (na centrifuze Sorvall RC5C, při 11 500 ot./min.). Slil se supernatant (Sl) a uchoval se pro další čištění. Pelet (Pl) se uchoval pro další analýzu.

Navázání BASP034 na pryskyřici nikl-NTA

K frakci Sl se přidaly 3 až 4 ml pryskyřice Ni-NTA. Tato směs se pak uchovávala při teplotě místnosti za stálého slabého míchání po dobu jedné hodiny. Po uplynutí jedné hodiny se Sl/Ni-NTA zabalila do kolony XK16 Pharmacia. Kolona se pak promyla 1 M pufrem Gu-HCl (1 M guanidinhydrochlorid, 100 mM monobazický fosorečnan sodný, 10 mM Tris a 0,05 % Triton X100, pH 8,0). Pak následuje promyt! fosforečnanovým pufrem (100 mM monobazický fosforečnan sodný, 10 mM Tris a 0,05 %

Triron X-100, pH 6,3) . Protien se pak eluoval z kolony pomocí 250 mM imidazolového pufru (250 mM imidazol, 100 mM monobazický fosforečnan sodný, 10 mM Tris a 0,05 % Triton X100, pH 5,9).

Konečná příprava « ···· ·· ♦··· ·· ♦ · » ♦ · 9 · · ·

Protein BASB034 se připravil dialýzou přes noc proti třem objemům 0,1 % Triton X-100 a lx PBS pH 7,4, aby se odstranil zbytek Gu-HCl a imidazolu. Čištěný protein se charakterizoval a použil se při produkci protilátek, jak se popisuje dále v textu.

Biochemická charakterizace

Analýza SDS-PAGE a westernův přenos

Rekombinantní čištěný protein se rozpustil na 4 až 20 % polyakrylamidových gelech a elektroforeticky se přenesl na membrány PVDF při napětí 100 V po dobu 1 hodiny, jak už bylo popsáno v publikaci Thebaine et al·., 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354. Membrány PVDF se pak předem ošetřily fyziologickým roztokem pufrovaným Dulbeccovým fosforečnanem obsahujícím 5% netučné suché mléko. Všechny následné inkubace se provedly za použití uvedeného pufru.

Membrány PVDF se inkubovaly s 25 ml preimunního séra ředěného 1:500 nebo s králičím anti-His imunitním sérem po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Membrány PVDF se pak dvakrát promyly promývacím pufrem (obsahuje 20 mM pufr Tris s hodnotou pH 7,5, který obsahuje 150 mM chlorid sodný a 0,05 % Tween-20) . Membrány PVDF se pak inkubovaly s 25 ml kozího anti-králičího IgG značeného peroxidázou (protilátky se získaly od firmy Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Membrány PVDF se pak čtyřikrát promyly promývacím pufrem a zviditelnily se 3-amino-9-etylkarbazolem a peroxidem močoviny od firmy Zymed (San Francisco, CA) . V každém případě se směs inkubovala po dobu 10 minut.

Výsledky SDS-PAGE (obrázek č. 4) ukazují protein o molekulové hmotnosti 60 000, který je reaktivní s antiRGS(His) protilátkami za použití westernová přenosu (obrázek č. 5) SDS-PAGE.

Sekvenováni proteinu

Uskutečnilo se sekvenováni aminokyselin na N-konci čištěného proteinu, aby se potvrdila produkce správného rekombinantního proteinu za použití dobře definovaného chemického protokolu na sekvenátoru. Hewlett-Packard G1000A s LC model 1090 a sekvenátoru Hewlett-Packard model 241s LC model 1100.

Přiklad 5: Produkce antiséra proti rekombinanntímu proteinu

BASB034

Polyvalentni antiséra vytvořily vakcinací dvou proteinem BASB034. Každé určená proti proteinu BASB034 se králíků s čištěným rekombinantnim zvíře se podrobilo celkově třem imunizacím do svalu (im.), kdy jedna injekce obsahuje přibližně 20 μς proteinu BASB034 (začíná se s úplným Freundovým adjuvans a pokračuje se s neúplným Freundovým adjuvans) v intervalech přibližně 21 dní. Zvířatům se odebrala krev před první imunizací a pak v den 35 a 57.

Titry protilátek proti proteinu BASB034 se měřily testem ELISA za použití čištěného rekombinantního proteinu BASB034 (0,5 μρ/prohlubeň). Titr se definoval jako nejvyšší ředění rovné nebo vyšší než 0,1, jak se vypočítá s následující rovnice: průměrná hodnota OD dvou testovaných vzorků antiséra mínus průměrná honota OD dvou testovaných vzorků pufru. Hodnoty titrů po třech imunizacích se pohybovaly okolo 1 000 000.

Antisérum se použilo jako první protilátka za účelem identifikovat protein pomoci westernová přenosu,jak se popisuje v příkladu 4 shora v textu. Westernův přenos ukazuje přítomnost protilátek proti BASB034 v séru imunizovaných zvířat (obrázek č. 6).

• · · · ♦	• ♦	♦ · · ·
»· ·	•	•	•	•	• «
• ♦	•	•	···	•	•
Φ · • · · ·	• • ·	•	• • ♦ ·	•	♦ • · ·

Příklad 6: Analýza nekódujících lemujících oblastí genu BASB034 a jejich využívání při úpravě exprese genu BASB034

Nekódující lemující oblasti genu BASB034 obsahují regulační elementy, které jsou důležité při expresi genu. Tato regulace probíhá na úrovni transkripce a translace. Sekvence těchto oblastí proti směru nebo po směru exprese od otevřeného čtecího rámce genu se mohou získat sekvenováním DNA. Tyto informace o sekvenci umožňují stanovit potencionální regulační motiv, jako jsou různé promotorové elementy, terminační sekvence, indukovatelné sekvenační elementy, represory, elementy odpovědné za variace fází, Shine-Dalgarnovu sekvenci, oblasti s potencionální sekundární strukturou, která se podílí na regulaci, stejně jako jiné typy regulačních motivů nebo sekvencí.

Tyto informace o sekvenci umožňují úpravu přirozené exprese genu BASB034. Pozitivní regulace exprese genu se může uskutečnit změnou promotoru, Shine-Dalgarnovy sekvence, potencionálního represoru nebo elementů operátoru nebo libovolnými jinými elementy, které se na expresi podílejí. Negativní exprese se může dosáhnout podobnými typy úprav. V jiném případě změnou fázové variace sekvencí se může exprese řídit variací fáze nebo se může z této regulace vyjmout. Exprese genu se může řídit jedním nebo více indukovatelnými elementy, které umožňují regulovanou expresi. Příklady takové regulace zahrnují, ale nejsou omezeny na indukci teplotního posunu, adici induktorového substrátu, jako jsou vybrané cukry nebo jejich deriváty, stopové prvky, vitamíny, ko-faktory, kovové ionty atd..

Takové úpravy, jak se popisuje shora v textu, se mohou zavést několika různými způsoby. Úprava sekvencí, které se podílejí na expresi genu se může uskutečnit in vivo náhodnou mutagenezí, po které následuje selekce požadovaného fenotypu.

♦ ♦ ··· ··«··· ·· * • · · 9 · · 9 ·· · • · · · ··· · ··

9 9 9 9 9 99

999 · ·· 999 99999

Jiný přístup zahrnuje izolaci zajímavé oblasti a její úpravu náhodnou mutagenezí nebo místně řízenou mutagenezí, inzerčni nebo delečni mutagenezí. Upravená oblast se pak může znovu zavést do bakteriálního genomu homologní rekombinací a stanoví se účinek na expresi genu. V jiném provedení vynálezu se znalosti o sekvenci oblasti mohou použít k nahrazeni nebo deleci všech nebo části přirozených regulačních sekvencí. V tomto případě se cílová regulační oblast izoluje a upravuje tak, aby obsahovala regulační elementy z jiného genu, kombinaci regulačních elementů z jiných genů, syntetickou regulační oblast nebo libovolnou jinou regulační oblast nebo se deletují vybrané části regulačních sekvencí divokého typu. Tyto upravené sekvence se pak mohou znovu začlenit do bakterie pomocí homologní rekombinace do genomu. Seznam promotorů, které se mohou použít pro pozitivní regulaci exprese genu zahrnují promotory porA, porB, lbpB, tbpB, pllO, lst, hpuAB z mikroorganizmu N. meningitidis nebo N. gonorroheae.

V jednom provedení vynálezu se exprese genu může upravit záměnou svého promotoru za promotér silnější (pomocí izolace upstream sekvence genu, in vitro modifikací této sekvence a opětným zavedením do genomu homologní rekombiancí). Pozitivně regulované exprese je možné dosáhnout u bakterií nebo ve vnější .membráně připravené z bakterie. V jiných provedeních vynálezu se mohou vytvořit rekombinantní bakteriální kmeny se zlepšenými chrakteristikami v případě aplikace vakcín. Jako vakciny mohou sloužit utlumené kmeny, kemny se zvýšenou expresí vybraných antigenů, kmeny s umlčenými geny (nebo se seslabenou expresí), které interferují s imunitní odpovědí, kmeny s upravenou expresí imunodominantních proteinů. Oblast přímo proti směru exprese genu BASB034 je dána v sekvenci SEQ ID NO: 13. Tato sekvence je dalším předmětem vynálezu

sekvence BASB034

• ♦···	• ♦		·· ·
• · ·	• ·	•		•	♦ 9
• ·	• ·	• · ·	•	•	•
• ·	♦ · ·	•	• ·	•	•
• ·	♦ ·	•	•	•	•
• ♦ * ·	• ·	• · ·		• ·	• · ♦

Informace o sekvencích

Polynukleotidové a polypeptidové

SEQ ID NO: 1

Polynukleotidové sekvence BASB034 mikroorganizmu Moraxella catarrhalis z kmene ATCC 43617

ATGAAAGTTTCACTGTCTACATTGACTTTATCTATTTTGTCATGTTTTGCrATCCTAGCCATTCAGCAAGCACAAGCTGT ACCAAATCCTGTGGCATTrGTTGACGAAGTACGCAGTGAAAATGATCTTGGGCSAGACAATGAATTACCCATTGATGTCC AAAGTGCGACACAATCAGCGTCrACTGATACGGCTAATCCTTTAGACGAACATGAACCAGAGCrrrATACGACAGCTTTA GAAAATAAAACCATGCTGATTAACTGCrCAGCACTTAATCAAGATATCATGCGTTTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCA TGGTGAGACGCCAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCrrGATGAAACAATTTGGCAGACCATCAAAGGCAAAC CCCAGGTTATCTATCAAGAAACGACAGATCCGATTTTTTTAATGGGTAATGAAAAAGGaATGCTGACCAAAAAAGATGCC AAACAGCTTGAATATGCAGCCAAACAGTTTACACCACTGAGCTTATCATTrGArrTAGACCGAAATAATACACCACTTxG GTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGTATTGCCCATATTTATGCACGGTAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCA GTCATGAAGCAAAACAATTTACCCCAAATGAATTTCGTGCTCCCGAGCTMAATTrCAGGTTTCTGTTAAGGTTAAAGCT GCTGAGGATTTATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGATATACACAGCAATCGCACTGGCAGATmTAATGGAAA AAACTCTCGTCCTTTTAGAGTACATGACTACCAGCCAGAGATTTTCTraACTCAACCTGTATACTCAGACTTACCATGGG ATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATrCCAATGGTGAAAGTGCCAAACTGTCTCGCTCATGGAAT CGTGCTTATTrGATGGCAGGCATGGAATGGAAAÁACCTGACTGTCATGCCACGCATrrGGGGGCGTATCTTrAAAGAGGG TAGTGGCAGCCAGCaAGATGATAATCCTGATATCTTGGACTATTATGGTEATGGTGATGTGCGTTmTATATCAACTAG AAAATAAAAGTAATATTTCAGGTACGGTACGCTATAATCCACGCTCAGGCAAÁGGTGCGXTGCAACrrGACrATGTCTAT CCGCrrGGTAAGGGAATTAGTGGCTATTTTCAAATATTTCAAGGCTATGGGCSGTCTrTGATTGATTATAATCATGAGGC GACAAGCTTTGGCGTCGGACTTATGCTTAACGACTGGATGGGTCTATAA

SEQ ID NO: 2

Polypeptidova sekvence BASB034 mikroorganizmu Moraxella catarrhalis dedukovaná ze polynukleotidové sekvence SEQ ID NO:

MKVSLSTLTLSILSCFAIIAIQQAQAVPŇPVAFVDEVRSENDLGQDNELPlDVQSATQSASTDTANPLDEHEPELYTTAI.

ENKTMLINCSALNQDIMHLACYDTLVHGETPAVIKTKRSiaLDETIWQTXXGKPqV-vQETTDPIFLMGNEKGMLTKKDA KQLEYAAKQFT?LSLSFDLDRNNTPLWSSRPHNPMYVLPIFMHGKPNRSFNT?SHEAKQFTPNEFRAPEI.KFQVSVKVKA AEDLWGTDSDLWFGYTQQSHWQIFNGXNSRPFRVHDYQPEIFLTQPVYSDLPWDGKVRMIGMGAVHHSNGESAKLSRSWN RAYLMAGMEWKNLTVMPRIWGRIFKEGSGSQPDDNP DILOYYGYGDVRFL’ÍQLENKSNISGTVRYNPRSGKGAI.QLDYVY PLGKGISGYFQIFQGYGQSLIDYNHEATSFGVGLMI.NDWMGL

SEQ ID NO: 3

Polynukleotidové sekvence mikroorganizmu Moraxella catarrhalis BASB034 z kmene Mc2908

ATGAAAGTTTCACTGTCrACATTGACrTTATCTATTrTGCCATGTTTTGCTATCCTAGCCATTCAGCAAGCACAAGCTGT ·♦·

ACCAAATCCTGTGGCATTTGTTGACGAAGTACGCAGTAAAAATGATCTTGGGCAAGACAATGAATTACTCATTGGTGTAC AAAGTGCGACACAATCAGCGTCTACTGATACGGCTAATCCTTTAGACGAACATGAACCAGAGCTTTATACGACAGCTrrA GAAAATAAAACCATGCTGATTAACTGCrCAGCACTTAATCAAGATATCATGCGTTTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCA TGGTGAGACGCGAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCTTGATGAAACAATTrGGCAGACCATCAAAGGCAAAC CCCAGGTTGTCTATCAAGAAACGACAGATCCGATTTTTTTAATGGGTAAYGAAAAAGGCATGCTGACCAAAAAAGATGCC AAACAGCTTGAATATGCAGCCAAACAGTTTACACCACTGAGCTTATCATTTGATTTAGACCGAAATAATACACCGCTTTG GTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGTATTGCCCATATTTATGCACGGTAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCA GTCATGAAGCAAGACAATTTACCCCAAATGAATTTCGTGCCCCTGAATTAAAATTTCAAGTTTCTGTTAAGGTTAAAGCT GCTGAGGATTTATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGGTATACACAGCAATCGCACTGGCAGATTTTrAATGGAAA AAACTCTCGTCCTTTTAGAGTACATGATTACCAGCCAGAGATTTTCTTAACTCAACCTGTGTACTCAGACTTACCATGGG ATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATTCCAATGGTGAAAGTGCCAAACTGTCTCGCTCATGGAAT CGTGCTTATTTGATGGCAGGCATGGAATGGAAAAACCTGACTGTCATGCCACGCATTTGGGGGCGTATCTTTAAAGAGGG

TAGTGGCAGCCAGCCAGATGACAATCCTGATATCTTGGACTATTATGGTTATGGTGATGTGCGTTTTTTATATCAACTAG AAAATAAAAGTAATATTTCAGGTACGGTACGCTATAATCCACGCTCAGGCAAAGGTGCGTTGCAACTTGACTATGTCTAT CCGCTTGGTAAGGGAATTAGTGGCTATTTTCAAATATTTCAAGGCTATGGGCAGTCTTTGATTGATTATAATCATGAGGC GACAAGCrrTGGCGTCGGACTTATGCTTAACGACTGGATGGGTCTATAA

SEQ ID NO: 4

sekvence BASB034 mikroorganizmu Moraxella catarrhalis dedukovaná ze polynukleotidové sekvence SEQ ID NO:

MKVSLSTLTLSILPCFAILAIQQAQAVPNPVAFVDEVRSKNDLGQDNELLIGVQSATQSASTDTANPLDEHEPELYTTAL ENXTMLINCSAMQDIMRIACTDTLVHGETPAVICTKRSIHLDETIWQTIKGKPQVVYQErroPlFLMGN^GM

KQLEYAAKQFTPLSLSFDLDRNNTPLWSSRPHNPMYVLPXFMHGKPNRSPNTPSHEAEQFTPNEFRAPEI.KFQ

AEDLWGTDSDLWFGYTQQSHWQIFNGKNSRPFRVHDYQPEIFLTQPVYSDLPWDGKVRMIGMGAVHHS ηγνγ

RAYLMAGMEWKNLTVMPRIWGRIFKEGSGSQPDDNPDILDYYGYGDVRFLYQLENKSHISGTVRYNPRSGXGALQ ρΐΛΚΒΙΕσΥΕα^ΟΟΥσαδΙ.ΐηΥΝΗΕΆΤΕΡΟναΐΛωϊΟΜΚΜ,

SEQ ID NO: 5

Polynukleotidové sekvence BASB034 mikroorganizmu Moraxella catarrhalis z kmene Mc2913

ATGAAAGTTTCACTGTCTACAXTGACTTTATCTATTTTGTCATGTTTTGCTATCCTAGCCATTCAGCAAGCAAAAGCTGT

ACCAAATCCTGTGGCATTTGTTGACGAAGTACGCAGTGAAAATGATCTTGGGCAAGACAATGAATTACCCATTGATGTCC

AAAGTGCGACACAATCAGCGTCTACTGATACGGCTAATCCTTrAGACGAACATGAACCAGAGCTTTATACGACAGCTrTA

GAAAATAAAACCATGCrGATTAACrGCTCAGCACrrAATCAAGATATCATGCGTrTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCA

TGGTGAGACGCCAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCTTGATGAAACAATrrGGCAGACCATCAAAGGCAAAC

CCCAGGTTGTCTATCAAGAAACGACAGATCCGATTrmTAATGGGTAATGAAAAAGGCATGCTGACCAAAAAAGATGCC

AAACAGCTrGAATATGCAGCCAAACAGTTrACACCACTGAGCTTATCATTTGATTTAGACCGAAATAATACACCACTrTG

GTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGYATTGCCCATATTTATGCACGGYAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCA

GTCATGAAGCAAGACAATTTACCCCAAATGAATTrCGTGCCCCTGAATTAAAATTTCAAGTTrCTGTrAAGGTTAAAGCr

GCTGAGGATTrATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGATATACACAGCAATCGCACTGGCAGATTTTTAATGGAAA

AAACTCTCGTCCTmAGAGTACATGATTACCAGCCAGAGATTTTCTTAACTCAACCTGTATACTCAGACTTACCATGGG ATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATTCCAATGGTGAAAGTGCCAAACrGTCTCGCTCATGGAAT CGTGCTTATTTGATGGCAGGCATGGAATGGAAAAACCTGACTGTCATGCCACGCATTTGGGGGCGTATCTTTAAAGAGGG TAGTGGCAGCCAGCCAGATGACAATGCTGATATCTTGGACTATTATGGTTATGGTGATGTGGGTTrTTTATATaAACTAG AAAATAAAAGTAATATTrCAGGTACGGTACGCrATAATCCACGCTCÁGGCAAAGGTGCGTTGCAACTTGACTATGTCTAT CCGCTTGGTAAGGGAATTAGTGGCTATTTTCAAATATTTCAAGGCTATGGGCAGTCrTTGATTGATTATAATCATGAGGC GACAAGCTTTGGCGTCGGACTTATGCTTAACGACTGGATGGGTCTATAA

SEQ ID NO: 6

Polypeptidová sekvence BASB034 mikroorganizmu Moraxella catarrhalis dedukovaná ze polynukleotidové sekvence SEQ ID

NO: 5

MK’/SLSTLTL3II^SCFAILAJ:QQAKAVPNPVAFVDEVR.SENDLGQDNELPZDVQSATQSA3TDTANPLDEHEPEÍ.YTT.AL ENKTMLINCSAI2rQDIMRIAC7DTr.VHGETPAVIKTKRSIRLDETIWQTIKGKPQVVYQETTDPIFLMGNEKGMLTKKDA ΚΟΙ^ΎΑΑΚΟΕΤΡΙ^ϋΕΓΟΙ.ΟΗΝΙΓΓΡΙ.ΗβΞΚΡΗΝΡΜΥνί,ΡΙΓΜΗΟΚΡΝΗΗΡΝΤΡΞΗΕΑΧΟΕΤΡΝΕΕΗΑΡΕΙίΚΕΌνΕνκνΚΑ AEDLWGTDSDLWFGrrQQSHWQIFNGKNSRPFRVHDYQPEIFLTQPVYSDLPWDGKVRMIGMGAVHHSNGESAKLSRSWN RAyLMAGMEWKNLTVMPRXWGRIFKEGSGSQPODNPDILDYYGYGDVRELYQLENKSIÍISGTVRYNPRSGKGALQLDYVY PLGKGISGYFQÍEQGTCQSLIDYNHEATSFGVGLMLNDWMGL

SEQ ID NO: 7

Polynukleotidové sekvence BASB034 mikroorganizmu Moraxella catarrhalis z kmene Mc2969

ATGAAAGTTTCACTGTCTACATTGACTTTATCIATTTTGCCATGTTTTGCCATCCTAGCCATTCAGCAAGCACAAGCTGT ACCAAATCCTGTGGCATTTGTTGACGAAGTACGCAGTGAAAATGATCITGGGCAAGACAATGAATTACCCATTGATGTCC AAAGTGCGACACAATCGGCGTCTACTGATACGGCTAATCCTTTAGACGAACATGAACCAGAGCTTTATACGACAGCTTTA GAAAATAAAACCATGCTGATTAACTGCTCAGCACTTAATCAAGATATCATGCGTTTGGCGTGCTATGACACTTTGGTGCA TGGTGAGACGCCAGCGGTAATTAAAACCAAGCGTTCCATTCGCCTTGATGAAACAATTTGGCAGACCATCAAAGGCAAAC CCCAGGTTGTCTATCAAGAAACGACAGATCCGATTTTTTTAATGGGTAATGAAAAAGGCATGCTGACCAAAAAAGATGCC AAACAGCTTGAATATGCAGCCAAACAGTTTACACCACTGAGCTTATCATTiGAmAGACCGAAATAATAGACCACTTTG GTCATCACGACCACACAATCCGATGTATGTATTGCCCATATTTATGCACGGTAAGCCTAATCGAAGCCCAAATACGCCCA GTCATGAAGCAAAACAATTTACCCCAAATGAATTTCGTGCTCCCGAGCTAAAATTrCAGGTTTCTGrrAAGGTTAAAGCT GCTGAGGATTTATGGGGGACGGATTCAGATTTATGGTTTGGATATACACAGCAATCGCACTGGCAGATTTTTAATGGAAA AAACTCTCGTCCTTTTAGAGTACATGACTACCAGCCAGAGATTTTCTrAACTCAACCrGTATACTCAGACTTACCATGGG ATGGCAAAGTCCGCATGATTGGCATGGGTGCGGTACATCATTCCAATGGTGAAAGTGCCAAACTGTCTCGCTCATGGAAT CGTGCTTATrTGATGGCAGGCATGGAAXGGAAAAACCTGACTGTCATGCCACGCATTrGGGGGCGTATCTTTAAAGAGGG TAGTGGCAGCCAGCCAGATGATAATCCTGATATCTTGGACTATTATGGTTATGGTGATGTGCGTTTTrTATATCAACTAG aaaataaaagtaatatttcaggtacggtacgctataatccacgctcaggcaaaggtgcgttgcaacttgactatgtctat ccgcttggtaagggaattagtggctattttcaaatatttcaaggctatgggcagtctttgattgattataatcatgaggc gacaagctttggcgtcggacttatgcttaacgactggatgggtctataa

·♦· ·	*4		····	• ·
•	♦	*	•	• ·	•
•	•	•	• · ·	• ·
•	•	Φ	•	• ·
Φ ·	• ·		···	• ·	•

SEQ ID NO: 8

NO: 7

MKVSIiSTLTLSIX<PCFAIIAIQQAQAVPNPVAFVDEVRSENÓI<GQDlfELPIDVQSATQSASTĎTAHPI<DEHEPEI.YrTAL enktmlincsalnqdimrlactotlvhgetpaviktkrsirldetiwqtikgkpqwyqettdpiflmgnekgmltkkda

AEDrWGTDSDLWFGYTQQSHWQIFNGKNSRPFRVHDYQPEIFI.TQPVYSDLPWDGKVRMIGMGAVHHSřrGESAKLSRSWN

RAYLMAGMEWKNLTVMPRIWGRIFKEGSGSQPDDNPDILDYYGYGDVRFŮYQLENKSNISGTVRYNPRSGKGALQLDYVY

PLGKGISGYFQIFQGYGCSLIDYNHEATSFGVGIíMLNDWMGL

SEQ ID NO: 9

GAT TTA AGA GTA TGT TAT GAT G

SEQ ID NO: 10

GTA TGG GTT GAT CAA ATA CAG

SEQ ID NO: 11

AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC CAA GCT GTA CCA AAT CCT

GTG GCA TTT GTT G

SEQ ID NO:12

AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TAG ACC CAT CCA

GTC GTT AAG CAT AAG

SEQ ID NO: 13

ACTTGGCGAAAATACCATTTATATCGATTGTGATGTTATACAGGCAGATGGCGGTACACGCACAGCCAGTATCAGTGGTG ctgcggtggcacttattgatgctttagaacacttgcagcgtcgtaaaaagcttacccaagatccgcttttgggcttggtg GCAGCGGTrrCTGTGGGTGTTAATCAAGGCCGTGTATTGCTTCATrrGGATTATGCTGAAGATTCAACrrGTGATACCGA TTTAAATGTGGTCATGACGCAGGCAGGTGGGTXTATTGAGATTCAAGGCACAGCAGAAGAAAAGCCArTTACTCGTGCTG AAGCTAATGCGATGCTTGATTTGGCAGAGCTGGGAATTGGGCAGATTATCGAAGCCaAAAAGCAAGTATTAGGCTGGTGA TATGCTAATCGTTGAAGATAATGGCGTGATCATCACATrAAATGGACAAGTAAAAGACCCATTATTTTGGTGGTCGATGA TATTGCTGCTGCTGGGTGTCTTGGTGGCAATCATTTGTTrGATTGCACCCGTrrTTrATGCAATCGGTGCGTTGGCrTTA TTTGCAGTTGTGGTATTTGYGTTTAATATTCAAAGGCAAAAAGCCAAAACTTGTCATATGTTrrCACAAGGTCGCTTGAA GATTACGTCCAAACGCTrTGAGATTCATAACAAATCACTAACCTTATCAGCATCGGCAACAATATCTGCTAAAGATAACA AAATGACAATTGTTGATCGGGGCATTGAATATCATTTTACAGGXTrrGCTGATGACCGTGAAATTAATATAGCCAAACAG GTACTTTTGGGAAAGTCAATCAAAACCAATGCGGTGGCGGTAACATrGGCrAAGTAGTTGTTGTGATACAGACAGGTTGG ATGGTCXTTAACTCCACC»CCTAACTTTTTCTTTGTrTGGATTrAAGAGTATGTTATGATGGGCAGGAriTrAXTTrAA GTCATCATTTAATGCAATCAGTTGTCCAGAGTAGCCGTTC • ·

Uložené materiály

Mikroorganizmus Moraxella catarrhalis kmen Catlin se uložil ve sbírce „Američan Type Culture Collection (ATCC) 21. června 1997 a toto uložení se označilo číslem 43617. Uložení se popisuje jako Branhamella catarrhalis (Frosh and Kolle) a materiál je lyofilizovaný. Jedná se o knihovnu inzertu o velikosti 1,5 až 2,9 kb, která se zkonstruovala z izolátu M. catarrhalis získaného z transtracheálního aspirátu horníka, který trpí chronickou bronchitidou. Uložený preparát se popisuje v publikaci Antimicrob. Agents Chemother. 21: 506-508 (1982) .

Uložení kmene mikroorganizmu Moraxella catarrhalis je zde označen jak „uložený kmen nebo jako „DNA uloženého kmene.

Uložený kmen obsahuje gen BASB034 plné délky.

Uložení vektoru pMC-PLAl obsahující DNA mikroorganizmu Moraxella catarrhalis začleněnou do pQE30 se uložil ve sbírce „Američan Type Culture Collection (ATCC) 12. února 1999 a označil se číslem uložení 207099.

Sekvence polynukleotidů obsahovala uložený kmen nebo uložený klon, stejně jako aminokyselinovou sekvenci libovolného polypeptidu jím kódovaného.

Uložení uloženého kmene/klonu se provedlo podle dohody „Budapest Treaty on the International Recognition of the deposit of Microorganisms for Purposes of Patent Proceduře. Uložené kmeny jsou přístupné veřejnosti.

····

Seznam sekvenci (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1329 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Moraxella catarrhalis

(xi)	Popis	sekvence: SEQ	ID NO:	1:
aCgaaagCCE	cacegtceac	accgacteta	Ectateecge	caegetcegc	caccctagcc	50
aeecagcaag	cacaagctge	accaaaccct	gtggcaEEEg	tcgacgaage	acgcagegaa	120
aaEgaCctcg	ggcaagacaa	egaaeeaccc	attgaegccc	aaagegcgac	acaatcagcg	íao
cccacegaca	cggccaatcc	CCCagacgaa	catgaaccag	agctxtaeac	gacagcteea	240
gaaaataaaa	ccacgctgac	taactgccca	gcacetaaec	aagacaccac	gcgcceggcg	300
cgctaEgaca	ctctxggegca	eggegagacg	ccagcggcaa	ccaaaaccaa	gcgecccact	360
cgccccgacg	aaacaaeecg	gcagaccaec	aaaggcaaac	cccaggccac	ccaecaagaa	’ 420
acgacagaCc	cgaectcccc	aaegggcaae	gaaaaaggca	tgctgaccaa	aaaagacgcc	430
aaacagctcg	aacacgcagc	caaacagccc	acaccactga	cfctxaecatt	tgaEEEagac	540
cgaaacaaea	caccacteeg	gecaecacga	ccacacaacc	cgaegcaege	aeegcccaCa	600
eeeaegcacg	geaagcceaa	Ccgaagccca	aaCacgccca	gccacgaagc	aaaacaaccc	660
accccaaacg	aaccccgegc	CcccgagcEa.	aaatcccagg	ttcccgccaa	ggtcaaagcc	720
gccgaggaee	eatgggggac	ggatccagac	tcacggcccg	gacacacaca	gcaaccgcac	780
eggcagatcc	ecaaeggaaa	aaactcccge	cceeccagag	cacatgacca	ccagccagag	340
acccccctaa	cccaacccge	acactcagac	tcaccaeggg	aeggcaaagc	ccgcacgacc	900
ggcaegggcg	cggcacacca	tcccaacgge	gaaagcgcca	aaccgtcccg	cccacggaae	960
cgegcccace	cgacggcagg	cacggaacgg	aaaaacccga	ctgccacgcc	acgcaeccgg	1020
gggcgcaccc	ecaaagaggg	cageggcagc	cagccagaeg	acaaccctga	eatcceggac	1030
caccacggcc	acggcgacgc	gcgctcccea	taccaaccag	aaaataaaag	caaeacccca	1140
ggeacggcac	gctacaaccc	acgcccaggc	aaaggtgcge	Cgcaacttga	ccacgcccae	1200
ccgceeggea	agggaateag	tggccacect	caaaeaceec	aaggctaCgg	gcagtccctg	1260
accgaceaca	accaegaggc	gacaagctcc	ggcgccggac	tcacgcttaa	cgactggacg	1320

ggeceaeaa

1329 ···· ·· •· •9 • 99 ·· · • 9· •·

999

(2) Informace o	SEQ ID NO: 2:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 442 aminokyselin.
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH MOLEKULY: protein
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Moraxella catarrhalís
(xi)	Popi	s sekvence: SEQ ID NO: 2:

MeC

Lys

Val

Ser

Leu

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Ile

Leu

Ser

Cys

Phe

1

S

10

15

Ala

Ile

Leu

Ala

Ile

Gin

Ala

Gin

Ala

Val

Pro

Asn

Pro

Val

Ala

20

25

30

Phe

Val

Asp

Glu

Val

Arg

Ser

Glu

Asn

Asp

Leu

Gly

Gin

Asp

Asn

Glu

35

40

45

Leu

Pro

Ile

Asp

Val

Gin

Ser

Ala

Thr

Gin

Ser

Ala

Ser

Thr

Asp

Thr

50

55

60

Ala

Asn

Pro

Leu

Asp

Glu

His

Glu

Pro

Glu

Leu

Tyr

Thr

Ala

Leu

65

70

75

30

Glu

Asn

Lys

Thr

MeC

Leu

Ile

Asn

Cys

Ser

Ala

Leu

Asn

Gin

Asp

Tle

as

90

95

MeC

Arg

Leu

Ala

Cys

Tyr

Asp

Thr

Leu

Val

His

Gly

Glu

Thr

Pro

Ala

100

105

110

Val

Ile

Lys

Thr

Lys

Arg

Ser

Ile

Arg

Leu

Asp

Glu

Thr

Ile

Trp

Gin

lis

120

12S

Thr

Ile

Lys

Gly

Lys

Pro

Gin

Val

Ile

Tyr

Gin

Glu

Thr

Asp

Pro

130

135

140

Ile

Phe

Leu

MeC

Gly

Asn

Glu

Lys

Gly

MeC

Leu

Thr

Lys

Asp

Ala

145

150

155

160

Lys

Gin

Leu

Glu

Tyr

Ala

Lys

Gin

Phe

Thr

Pro

Leu

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Phe

Asp

Leu

Asp

Arg

Asn

Thr

Pro

Leu

Trp

Ser

Arg

Pro

His

130

135

190

Asn

Pro

MeC

Tyr

Val

Leu

Pro

Ile

Phe

Mec

His

Gly

Lys

Pro

Asn

Arg

19S

200

205

Ser

Pro

Asn

Thr

Pro

Ser

His

Glu

Ala

Lys

Gin

Phe

Thr

Pro

Asn

Glu

210

215

220 (

φφφφ • Φ φφφφ

Phe

Arg

Ala

Pro

Glu

Leu

Lye

Phe

Gin

Val

Ser

Val

Lys

Val

Lys

Ala

225

230

235

240

Ala

Glu

Asp

Leu

Trp

Gly

Thr

Asp

Ser

Asp

Leu

Trp

Phe

Gly

Tyr

Thr

24S

250

255

Gin

Ser

His

Trp

Gin

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asn

Ser

Arg

Pro

Phe

250

265

270

Arg

Val

His

Asp

Tyr

Gin

Pro

Glu

Ile

Phe

Leu

Thr

Gin

Pro

Val

Tyr

275

280

28S

Ser

Asp

Leu

Pro

Trp

Asp

Gly

Lys

Val

Arg

MeE

Ile

Gly

MeE

Gly

Ala

290

295

300

Val

His

Ser

Asn

Gly

Glu

Ser

Ala

Lys

Leu

Ser

Arg

Ser

Trp

Asn

305

310

315

320

Arg

Ala

Tyr

Leu

MeE

Ala

Gly

MeC

Glu

Trp

Lys

Asn

Leu

Thr

Val

MeE

32S

330

335

Pro

Arg

Ile

Trp

Gly Arg

Ile

Phe

Lys

Glu

Gly

Ser

Gly

Ser

Gin

Pro

340

345

3S0

Asp

Asn

Pra

Asp

Ile

Leu

Asp

Tyr Tyr

Gly

Tyr

Gly

Asp

Val

Arg

355

360

365

Phe

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Lys

Ser

Asn

Ile

Ser

Glý.

Thr

Val

Arg

370

375

380

Tyr

Asn

Pro

Arg

Ser

Gly

Lys

Gly

Ala

Leu

Gin

Leu

Asp

Tyr

Val

Tyr

385

390

395

400

Pro

Leu

Gly

Lys

Gly

Ile

Ser

Gly Tyr

Phe

Gin

Ile

Phe

Gin

Gly Tyr

405

410

415

Gly

Gin

Ser

Leu

Ile

Asp

Tyr

Asn

His

Glu

Ala

Thr

Ser

Phe

Gly Val

420

425

430

Gly

Leu

MeE

Leu

Asn

Asp

Trp

Met

Gly

Leu

435

440

(2) Informace ο SEQ ID ΝΟ: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1329 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Moraxella catarrhalis (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3 • ··· • 4 · · · 4 · ·♦·

4 Φ · ··· 4· Φ

4 4 4 4 * 4 · «· «4 444444

4·4 4 »4 ·4Φ 44444

gaaaacaaaa	ccatgctgat	taactgccca	gcaceeaacc	aagatatcat	gcgtttggcg	300
cgctatgaca	ctttggegca	tggtgagacg	ccagcggtaa	ttaaaaccaa	gcgtEccatt	360
cgccttgatg	aaacaatttg	gcagaccacc	aaaggcaaac	cccaggttgt	ccatcaagaa	420
acgacagatc	cgatttttttt	aaegggtaat gaaaaaggca	tgctgaccaa	aaaagatgcc	430
aaacagctcg	aatatgcagc	caaacagttt	acaccactga	gcctaecaee	tgatttagac	540
cgaaataaea	caccgccctg	gtcatcacga	ccacacaatc	cgacgtatgt	attgcccaca	600
tttaegcacg	gtaagcctaa	tzcgaagccca	aatacgccca	gtcatgaagc	aagacaactt	660
accccaaatg	aatttcgtgc	ccctgaatta	aaacttcaag	tetctgttaa	ggtcaaagct	720
gctgaggacc	eatgggggac	ggattcagat	tcacggtttg	ggtatacaca	gcaatcgcac	730
tggcagaect	tcaatggaaa	aaactctcgc	ccttttagag	tacatgatta	ccagceagag	340
aetetcteaa	cccaacctgt	gtactcagac	ttaccatggg	atggcaaagt	ccgcatgact	900
ggcatgggtg	cggttacatca	ttccaacggc	gaaagcgcca	aaccgccccg	cccaeggaae	960
cgtgcttatt	egatggcagg	cacggaacgg	aaaaacccga	ctgtcaegcc	acgcatctgg	1020
gggcgtatce	ccaaagaggg	tagtggcagc	cagccagacg	acaaccccga	eaccttggac	íoao
eaecaeggcc	aeggcgatgt	gcgtttecta	tatcaactag	aaaataaaag	taacatttca	114 0
ggcacggcac	gccacaatco	acgctcaggc	aaaggcgcgt	tgcaacttga	ccatgcccac	1200
ccgcttggta	agggaattag	tggctatctt	caaatatttc	aaggctaegg	gcagtctttg	1260
actgattata	atcatgaggc	gacaagcttt	ggcgtcggac	ccacgceeaa	cgactggatg	13 20
ggtctataa						1329

(2) Informace ο SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 442 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Moraxella catarrhalis (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

	Met 1	Lys	Val Ser	Leu 5	Ser Thr Leu
*	Ala	Ile	Leu	Ala	Ile	Gin	Gin	Ala
				20
•	Phe	Val	Asp	Glu	Val	Arg	Ser	Lys
			35					40
	Leu	Leu	Ile	Gly	Val	Gin	Ser	Ala
		SO					5S
	Ala	Asn	Pro	Leu	Asp	Glu	His	Glu
	65					70
	Glu	Asn	Lys	Thr	Met	Leu	Ile	Asn
					85
	Mec	Arg	Leu	Ala	Cys	Tyr	Asp	Thr

Thr Leu Ser Ile Leu Pro Cys	Phe
10	15
Gin	Ala	Val	Pro	Asn	Pro	Val	Ala
25					30
Asn	Asp	Leu	Gly	Gin	Asp	Asn	Glu
				45
Thr	Gin	Ser	Ala	Ser	Thr	Asp	Thr
			60
Pro	Glu	Leu	Tyr	Thr	Thr	Ala	Leu
		75					30
Cys	Ser	Ala	Leu	Asn	Gin	Asp	Ile
	90					95
Leu	Val	His	Gly	Glu	Thr	Pro	Ala

	• φ · φ	φφφφ • φ	• «< φ φ φ φ	«φφφ φφ φ φ φ φφφ φ ·	φ • φ φ
79	φ φ	φ φ	Φί φ φ φ	φφφ φ φφφ	φ φ
	φφφ	φ	φφ	φφφ ··	φφφ

100

105

110

Val

Ile

Lys

Thr Lys Arg

Ser

Ile

Arg Leu Asp

Glu

Thr

Ile

Trp

Gin

115

120

125

Thr

Ile

Lys

Gly Lys

Pro

Gin

Val

Tyr Gin

Glu

Thr

Asp

Pro

130

135

140

Ile

Phe

Leu

Met

Gly

Asn

Glu

Lys

Gly

Met

Leu

Thr

Lys

Asp

Ala

145

150

155

160

Lys

Gin

Leu

Glu

Tyr

Ala

Lys

Gin

Phe

Thr

Pro

Lau

Ser

Leu

Ser

155

170

175

Phe

Asp

Leu

Asp

Arg

Asn

Thr

Pro

Leu

Trp

Ser

Arg

Pro

His

180

185

190

Asn

Pro

Met

Tyr

Val

Leu

Pro

Ile

Phe

Met

His

Gly

Lys

Pro

Asn

Arg

19S

20Q

205

Ser

Pro

Asn

Thr

Pro

Ser

His

Glu

Ala

Arg

Gin

Phe

Thr

Pro

Asn

Glu

210

215

220

Phe

Arg

Ala

Pro

Glu

Leu

Lys

Phe

Gin

Val

Ser

Val

Lys

Val

Lys

Ala

22S

230

235

240

Ala

Glu

Asp

Leu

Trp

Gly

Thr

Aso

Ser

Asp

Leu

Trp

Phe

Gly

Tyr

Thr

245

2S0

255

Gin

Ser

His

Trp

Gin

Ile

Phe

Asn

Gly Lys

Asn

Ser

Arg

Pro

Phe

250

265

270

Arg

Val

His

Asp

Tyr

Gin.

Pro

Glu

Ile

Phe

Leu

Thr

Gin

Pro

Val

Tyr

275

280

285

Ser

Asp

Leu

Pro

Trp

Asp

Gly

Lys

Val

Arg

Met

Ile

Gly

Met

Gly

Ala

290

295

300

Val

His

Ser

Asn

Gly

Glu

Ser

Ala

Lys

Leu

Ser

Arg

Ser

Trp

Asn

305

310

315

320

Arg

Ala

Tyr

Leu

Met

Ala

Gly

Met

Glu

Trp

Lys

Asn

Leu

Thr

Val

Met

325

330

335

Pro

Arg

Ile

Trp

Gly

Arg

Ile

Phe

Lys

Glu

Gly

Ser

Gly

Ser

Gin

Pro

340

345

350

Asp

Asn

Pro

Asp

Ile

Leu

Asp

Tyr Tyr Gly

Tyr

Gly

Asp

Val

Arg

355

360

365

Phe

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Lys

Ser

Asn

Ile

Ser

Gly

Thr

Val

Arg

370

375

380

Tyr

Asn

Pro

Arg

Ser

Gly

Lys

Gly

Ala

Leu

Gin

Leu

Asp

Tyr

Val

Tyr

335

390

395

400

Pro

Leu

Gly

Lys

Gly

Ile

Ser

Gly

Tyr

Phe

Gin

Ile

Phe

Gin

Gly

Tyr

40S

410

415

Gly

Gin

Ser

Leu

Ile Asp

Tyr Asn

His

Glu

Ala

Thr

Ser

phe

Gly Val

420

425

430

Gly

Leu

Met

• Leu

Asn Asp

Trp

Met

Gly

Leu

435 44° ··«· • v ··«·

2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 1329 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:.
(ii)	DRUH MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Moraxella catarrhalis
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

aEgaaagEEE	cactgtceac	aecgacetca	eccatctege	cacgttcegc	caccccagcc	60
actcagcaag	čaáaagcegt	accaaaecct	gtggcattEg	tcgacgaage	acgcagEgaa	120
aacgacaccg	ggcaagacaa	tgaaccaccc	accgaegccc aaagcgcgac	acaaecagcg	180
Eceacegaea	cggctaatcc	Ettagacgaa	cacgaaccag	agctteaEac	gacagcEeta	240
gaaaaEaaaa	ccacgccgae	Eaacegctca	gcacztaaec	aagataccae	gcgcEEggcg	300
egctatgaca	ceeeggegca	tggegagacg	ccagcggtaa	EEaaaaccaa	gccfetccacE	360
cgcctegatg	aaacaactcg	gcagaccacc	aaaggcaaac	cccaggcegt	cEascaagaa	420
acgacagatc	cgaeecetcc	aatgggtaac	gaaaaaggca	Egctgaccaa	aaaagacgcc	480
aaacagcCtg	aaeacgcagc	caaacagect	acaccaccga	gcetaecaec	tgaeeeagac	540
cgaaataaEa	caccacEEEg	gtcaccacga	ccacacaaCc	cgaEgcacge	aEEgcccaca	600
eccacgcacg	gCaagcctaa	Ccgaagccca	aatacgccca	gEcaegaagc	aagacaaccc	660
accccaaaeg	aaeetcgegc	ccctgaacca	aaatttcaag	ECEctgecaa	gg-ceaaagct	720
gcegaggact	EaEgggggac	ggacccagat	ttatggtttg	gaEacacaca	gcaaEcgcac	780
EggcagaCtt	EEaaEggaaa	aaacccccgc	ccectcagag	EacacgaEEa	ccagccagag	840
acccccccaa	cecaaccCgt	acacEcagac	Ctaccaeggcf	aEggcaaagt	ccgcacgace	900
ggcacgggcg	cggcacaEca	ttccaaeggc	gaaagcgcca	aacEgtcccg	cecaEggaas	960
cgegcttate	cgacggcagg	catggaatgg	aaaaacctga	ccgtaacgcc	acgcacccgg	1020
gggcgeacct	EEaaagaggg	tagcggcagc	cagccagaCgr	acaaecccga	eaccecggac	1080
caccaeggee	aCggtgaege	gcgeccttta	taecaactag	aaaacaaaag	EaaEaEEEca	1140
ggeacggtac	gccasaaEcc	acgcccaggc	aaaggcgcgt	tgcaaceega	ccaegcceac	1200
ccgctEggea	agggaacEag	tggcEaEEEE	caaaeaeecc	aaggceacgg	gcagccctcg	1260
accgaccaca	aEcacgaggc	gacaagcttt	ggcgccggac	tEacgcctaa	cgaccggacg	1320
ggcccataa						1329

(2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 442 minokyselin ·»*· ·· ···«

(B)	TYP:	aminokyselina
(C)	DRUH	ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Moraxella catarrhalis (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Mec Lys Val Ser Leu Ser

Thr Leu

Thr

Leu Ser Ile 10

Leu

Ser

Cys 15

Phe

1

5

Ala

Ile

Leu

Ala

Ile

Gin

Ala

Lys

Ala

Val

Pro

Asn

Pro

Val

Ala

20

25

30

Phe

Val

Asp

Glu

Val

Arg

Ser

Glu

Asn

Asp

Leu

Gly

Gin

Asp

Asn

Glu

35

40

4S

Leu

Pro

Ile

Asp

Val

Gin

Ser

Ala

Thr

Gin

Ser

Ala

Ser

Thr

Asp

Thr

50

55

60

Ala

Asn

Pro

Leu

Asp

Glu

His

Glu

Pro

Glu

Leu

Tyr

Thr

Ala

Leu

65

70

75

80

Glu

Asn

Lys

Thr

Met

Leu

Ile

Asn

Cys

Ser

Ala

Leu

Asn

Gin

Asp

Ile

85

90

95

Met

Arg

Leu

Ala

Cys

Tyr

Asp

Thr

Leu

Val

His

Gly

Glu

Thr

Pro

Ala

100

105

110

Val

Ile

Lys

Thr

Lys. Arg

Ser

Ile

Arg

Leu

Asp

Glu

Thr

Ile

Trp

Gin

115

120

125

Thr

Ile

Lys

Gly

Lys

Pro

Gin

Val

Tyr

Gin

Glu

Thr

Asp

Pro

130

13 5

140

Ile

Phe

Leu

Met

Gly

Asn

Glu

Lys

Gly

Met

Leu

Thr

Lys

Asp

Ala

145

150

1SS

160

Lys

Gin

Leu

Glu

Tyr

Ala

Lys

Gin.

Phe

Thr

Pro

Leu.

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Phe

Asp

Leu

Asp

Arg

Asn

Thr

Pro

Leu

Trp

Ser

Arg

Pro

His

130

185

190

Asn

Pro

Met

Tyr

Val

Leu

Pro

ile

Phe

Met

His

Gly

Lys

Pro

Asn

Arg

195

200

205

Ser

Pro

Asn

Thr

Pro

Ser

His

Glu

Ala

Arg

Gin

Phe

Thr

Pro

Asn

Glu

210

215

220

Phe

Arg

Ala

Pro

Glu

Leu

Lys

Phe

Gin

Val

Ser

Val

Lys

Val

Lys

Ala

225

230

23S

240

Ala

Glu

Asp

Leu

Trp

Gly

Thr

Asp

Ser

Asp

Leu

Trp

Phe

Gly

Tyr

Thr

245

250

255

Gin

Ser

His

Trp

Gin

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asn

Ser

Arg

Pro

Phe

260

265

270

Arg

Val

His

Asp

Tyr

Gin

Pro

Glu

Ile

Phe

Leu

Thr

Gin

Pro

Val

Tyr

275

280

235

Ser

Asp

Leu

Pro

Trp

Asp

Gly Lys

Val

Arg

Met

Ile

Gly

Met

Gly

Ala

9	··*·	··	9999	99	9
• ·	•	« ·	9	9	9	9 9
•	•	• ·	999	9 ·	9
9	•	9 9 9	9	9 9	9	•
Λ	•	• ·	9	9 9	•
···	•	··	999	99	···

290

295

300

Val

His

Ser

Asn

Gly

Glu

Ser

Ala

Lys

Leu

Ser

Arg

Ser

Trp

Asn

305

310

315

320

Árg

Ala

Tyr

Leu

Met

Ala

Gly

Met

Glu

Trp

Lys

Asn

Leu

Thr

Val

Met

325

330

335

Pro

Arg

Ile

Trp

Gly Arg

Ile

Phe

Lys

Glu

Gly

Ser

Gly

Ser

Gin

Pro

340

345

350

Asp

Asn

Pro

Asp

Ile

Leu

Asp

Tyr

Gly

Tyr

Gly

Asp

Val

Arg

355

350

355

Phe

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Lys

Ser

Asn

Ile

Ser

Gly

Thr

Val

Arg

370

375

380

Tyr

Asn

Pro

Arg

Ser

Gly Lys

Gly

Ala

Leu

Gin

Leu

Asp

Tyr

Val

Tyr

33S

3 90

39S

400

Pro

Leu

Gly

Lys

Gly

Ile

Ser

Gly

Tyr

Phe

Gin

Ile

Phe

Gin

Gly Tyr

405

410

415

Gly

Gin

Ser

Leu

Ile

Asp

Tyr

Asn

His

Glu

Ala

Thr

Ser

Phe

Gly Val

420

425

430

Gly

Leu

Met

Leu

Asn

Asp

Trp

Met

Gly

Leu

435

440

(2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1329 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Moraxella catarrhalis

(xi)	Popis	sekvence: SEQ	ID NO:	7:
atgaaagttt	cactgcctac	attgacttta	tctattttgc	catgttttgc	catcctagcc	50
attcagoaag	cacaagctgc	accaaatcct	gtggcatttg	ttgacgaagt	acgcagtgaa	120
aatgattcttg	ggcaagacaa	tgaattaccc	actgatgtcc	aaagtgcgac	acaatcggcg	180
Cctactgata	cggctaatcc	tttagacgaa	catgaaccag	agctttatac	gacagcttta	240
gaaaataaaa	ccaegccgac	taacttgctca	gcacttaatc	aagatatcat	gcgetttggcg	300
tgctattgaca	ccttggegca	tggtgagacg	ccagcggcaa	ttaaaaccaa	gcgttccatt	360
cgccctgatg	aaacaacccg	gcagaccatc	aaaggcaaac	cccaggttgt	ctatcaagaa	420
acgacagatc	cgatzcceeet	aatgggtaat	gaaaaaggca	tgctgaccaa	aaaagatgcc	480
aaacagcttg	aacacgcagc	caaacagttt	acaccactga	gcttatcatt	ttgattttagac	540
cgaaataata	caccaccccg	gtcatcacga	ccacacaatc	cgacgtatgt	actgcccata	600
tttttatgcacg	gcaagcccaa	tcgaagccca	aatacgccca	gtcacgaagc	aaaacaattt	660
accccaaatg- aatttcgcgc	tcccgagcta	aaatttcagg	ctectgtcaa	ggttaaagct	720
gccgaggatt	tatgggggac	ggattcagat	ttatggtctg	gatatacaca	gcaatcgcac	780

CggcagaCCC	ccaacggaaa	aaacccccgc	ccceccagag	cacacgaota	ocagccagag	840
accccctcaa	ccoaacccgc	acacccagac	CCaceacggg	acggcaaagt	ccgcacgaee	900
ggcacgggcg	cggcacacca	CCccaaCggc	gaaagcgcca	aaccgccccg	ctcatggaat'	960
cgcgcccacc	Cgacggcagg	cacggaacgg	aaaaacccga	ccgecacgcc	acgcacctgg	1020
gggcgcaCcC	ccaaagaggg	Cagtggcagc	cagccagacg	acaaccctga	Caececggac	1080
caccacggcc	acggegacgc	gogccctcca	Cacaaaccag	aaaacaaaag	taaCacccca	1140
ggeacggcac	gccaeaaccc	acgoccaggc	aaaggcgcgc	cgcaactcga	cnatgtctac	1200
ccgcccggca	agggaaccag	cggocacccc	caaacacecc	aaggoeaCgg	gcageccccg	1260
accgaccaca	aCcacgaggc	gacaagcccc	ggcgCcggac	ccacgcccaa	cgaccggacg	1320
ggccCacaa						1329

(2)	Informace o SEQ ID NO: 8:
	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
		(A)	DÉLKA: 442 aminokyselin
		(B)	TYP: aminokyselina
		(C)	DRUH ŘETĚZCE:
		(D)	TOPOLOGIE:
	(ii)	DRUH MOLEKULY: protein
	(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
		(A)	ORGANIZMUS: Moraxella catarrhalis
	(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Mec Lys Val Ser Leu

Ser Thr Leu Thr

Leu Ser 10

Ile Leu Pro

Cys 15

Phe

1

5

Ala

Ile

Leu

Ala

Ile

Gin

Ala

Gin

Ala

Val

Pro

Asn.

Pro

Val

Ala

20

25

30

Phe

Val

Asp

Glu

Val

Arg

Ser

Glu

Asn_;

Asp

Leu

Gly.Gin

Asp

Asn

Glu

35

40

45

Leu

Pro

Ile

Asp

Val

Gin

Ser

Ala

Thr

Gin

Ser

Ala

Ser

Thr

Asp

Thr

SO

SS

60

Ala

Asn

Pro

Leu

Asp

Glu

His

Glu

Pro

Glu

Leu

Tyr

Thr

Ala

Leu

6S

70

75

80

Glu

Asn

Lys

Thr

Mec

Leu

Ile

Asn

Cys

Ser

Ala

Leu

Asn

Gin

Asp

Ile

85

90

95

Mec

Arg

Leu

Ala

Cys

Tyr Asp

Thr

Leu

Val

His

Gly

Glu

Thr

Pro

Ala

100

105

110

Val

Ile

Lys

Thr

Lys

Arg

Ser

Ile

Arg

Leu

Asp

Glu

Thr

Ile

Trp

Gin

113

120

125

Thr

Ile

Lys

Gly

Lys

Pro

Gin

Val

Tyr

Gin

Glu

Thr

Asp

Pro

130

135

140

Ile

Phe

Leu

Mee

Gly

Asn

Glu

Lys

Gly

MeC

Leu

Thr

Lys

Asp

Ala

14S

1S0

15S

160

Lys

Gin

Leu

Glu

Tyr

Ala

Lys

Gin

Phe

Thr

Pro

Leu

Ser

Leu

Ser

163

170

175

Phe Asp Leu Asp Arg Asn Asn Thr Pro Leu Trp Ser Ser Arg· Pro His

190

135

190 ·

Asn

Pro

MeC

Tyr

Val

Leu

Pro

Ile

Phe

MeC

His

Gly

Lys

Pro

Asn

Arg

13 S

200

205

Ser

Pro

Asn

Thr

Pra

Ser

His

Glu

Ala

Lys

Gin

Phe

Thr

Pro

Asn

Glu

210

215

220

Phe

Arg

Ala

Pro

Glu

Leu

Lys

Phe

Gin

Val

Ser

Val

Lys

Val

Lys

Ala

22S

230

23 5

240

Ala

Glu

Asp

Leu

Trp

Gly

Thr

Asp

Ser

Asp

Leu

Trp

Phe

Gly

Tyr

Thr

245

250

255

Gin

Ser

His

Trp

Gin

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asn

Ser

Arg

Pro

Phe

260

265

270

Arg

Val

His

Asp

Tyr

Gin

Pro

Glu

Ile

Phe

Leu

Thr

Gin

Pro

Val

Tyr

275

290

295

Ser

Asp

Leu

Pro

Trp

Asp

Gly

Lys

Val

Arg

MeC

Ile

Gly

MeC

Gly

Ala

290

295

300

Val

His

Ser

Asn

Gly

Glu

Ser

Ala

Lys' Leu

Ser

Arg

Ser

Trp

Asn

305

310

315

320

Arg

Ala

Tyr

Leu

Meč

Ala

Gly

MeC

Glu

Trp

Lys

Asn

Leu

Thr

Val

Mec

325

330

335

Pro

Arg

Ile

Trp

Gly Arg

Ile

Phe

Lys

Glu

Gly

Ser

Gly

Ser

Gin

Pro

340

345

350

Asp

Asn

Pro

Asp

Ile

Leu

Asp

Tyr

Tyr Gly

Tyr

Gly Asp

Val

Arg.

355

360

365

Phe

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Lys

Ser

Asn

Ile

Ser

Gly

Thr

Val

Arg

370

375

390

Tyr

Asn

Pro

Arg

Ser

Gly

Lys

Gly

Ala

Leu

Gin

Leu

Asp

Tyr

Val

Tyr

395

390

39S

400

Pro

Leu

Gly

Lys

Gly

Ile

Ser

Gly

Tyr

Phe

Gin

Ile

Phe

Gin

Gly Tyr

405

410

415

Gly

Gin

Ser

Leu

Ile

Asp

Tyr

Asn

His

Glu

Ala

Thr

Ser

Phe

Gly Val

420

425

430

Gly

Leu

Met:

Leu

Asn

Asp

Trp

MeC

Gly Leu

435 440 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 22 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: umělá sekvence
(ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klič:

/poznámka=primer sekvence/ (xii) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

GATTTAAGAG TATGTTATGA TG

Informace o	SEQ ID NO: 10:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 21 párů	baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D) '	TOPOLOGIE:
(ii)	. DRUH	MOLEKULY: umělá	sekvence
ix)	ZNAKY:
	(A)	Název/klíč:
	(D)	Jiné informace

/poznámka=oligonukleotid/

Popis sekvence: SEQ ID NO: 11

AAGGGCCCAA

TTACGCAGAG GGGATCCCAA GCTGTACCAA

ATCCTGTGGC

ATTTGTTG (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 12 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
(ii) DRUH	MOLEKULY: umělá sekvence
ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč:

(D) Jiné informace: /poznámka=oligonukleotid/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

AAGGGCCCAA TTACGCAGAG GGTCGACTTA TTATAGACCC ATCCAGTCGT 50

TAAGCATAAG 60 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 1 000 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: DNA

(ví) PŮVODNÍ ZDROJ:

	(A) ORGANIZMUS:	: Moraxella	catarrhalis
xi)	Popis sekvence:	SEQ ID NO:	13:

acCEggcgaa	aacaccattt	atatcgatcg	Egacgctaca	caggcagaeg	gcggcacacg	60
cacagccagc	aecagcggcg	ctgcggtggc	acctaccgae	gccctagaac	acetgcagcg	120
ccgcaaaaag	cccacccaag	aeccgcetet	gggcceggtg	gcagcggttt	ctgcgggtgc	íao
taatcaaggc	cgegeaccgc	ttgattegga	ttacgcEgaa	gaeecaacne	gtgaeaccga	240
eecaaaegtg	gecaegacgc	aggcaggtgg	gcccaecgag	attcaaggca	cagcagaaga	300
aaagccaetc	acecgcgctg	aagceaatgc	gatgctegac	ttggcagagc	cgggaatcgg	360
gcagaCCaCc	gaagcccaaa	agcaagtaet	aggctggtga	tatgctaacc	gccgaagata	420
aeggcgegae	caccacacta	aatggacaag	Eaaaagaccc	atcaecetgg	Cggccgaega	430
tatugcegcC	gccgggtgcc	ecggeggcaa	tcaecegcte	gattgcaccc	gtccteeacg	540
caatcggegc	gteggcetta	etcgcagttg	eggcaeeegc	gtttaatatc	caaaggcaaa	600
aagccaaaac	ecgecacatg	EEtecacaag	gCcgcEEgaa	gattacgtcc	aaacgctccg	660
agacecacaa	caaaccacea	accteaCcag	caecggcaac	aaeatcegct	aaagacaaca	720
aaacgacaat	tgtegatcgg	ggcattgaaE	atcaEttcac	aggttetgcn	gaegaccgtg	7aa
aaaecaaeac	agccaaacag	geacttetgg	gaaagtcaat	caaaaccaac	gcggeggcgg	840
caacaccggc	eaageagCEg	tcgtgacaca	gacaggcegg	atggtcteta	aceccaccca	900
cctaacECCE	ectttgtceg	gatetaagag	eacgecacga	tgggcaggat	ttcaetetaa	960
gtcaccacct	aatgcaaeca	gcegeccaga	gtagccgeec			1000

·· ···· · · • · · · · • · · · · · ·

Claims

NÁROKY

1. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje alespoň 85 % shodu s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 8.
2. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde aminokyselinová sekvence vykazuje alespoň 95 % shodu s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 8.
3. Polypeptid podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6. a SEQ ID NO: 8.
4. Izolovaný polypeptid se sekvencí SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 8.
5. Imunogenní fragment polypeptidu podle libovolného z nároků

1 až 4, který je schopen zesílit imunitní odpověď (jestliže je to nezbytné, spojuje se s nosičem), kterou rozeznává polypeptid SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 nebo SEQ ID NO: 8.
6. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid, který vykazuje alespoň 85 % shodu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 po celé délce sekvence SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8, nebo nukleotidovou sekvenci komplementární s izolovaným polynukleotidem.
7. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která vykazuje alespoň 85 % shodu s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6 nebo 8 po celé délce kódující oblasti, nebo nukleotidovou sekvenci komplementární s uvedeným izolovaným polynukleotidem.

• · · · · · · • ····· ··
8. Izolovaný polynukleotid, který obsahuje nukleotidovou sekvenci, která vykazuje alespoň 85 % shodu se sekvencí SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7 po celé délce SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7, nebo nukleotidová sekvence komplementární s uvedeným izolovaným polynukleotidem.
9. Izolovaný polynukleotid podle libovolného z nároků 6 až 8, který vykazuje shodu alespoň 95 % se sekvencí SEQ ID NO: 1, 3, 5 nebo 7.
10. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid se sekvencí SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 nebo SEQ ID NO: 8.
11. Izolovaný polynukleotid obsahující polynukleotid se sekvencí SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 nebo SEQ ID NO: 7.
12. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid se sekvenci SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:. 4, SEQ ID NO: 6 nebo SEQ ID NO: 8, který je možno získat testováním vhodné knihovny za přísných podmínek hybridizace se značenou sondou, která má sekvenci SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 nebo SEQ ID NO: 7, nebo s jejím fragmentem.
13. Expresívní vektor obsahující izolovaný polynukleotid podle libovolného z nároků 6 až 12.
14. Rekombinantní živý mikroorganizmus obsahující expresívní vektor podle nároku 13.
15. Hostitelská buňka obsahující expresívní vektor podle nároku

13.
16. Rekombinantní membrána mikroorganizmu podle nároku 14, vyznačující se tím, že exprimuje izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje alespoň 85 % shodu s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující sekvenci SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 nebo SEQ ID NO: 8.
17. Způsob produkce polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou

19.

která vykazuje alespoň s aminokyselinovou sekvencí

ID NO: 4, sekvenci, vybranou ze

85 % shodu

SEQ ID NO: 2, SEQ vyznač hostitelské dostatečné polypeptidu

SEQ

ID

NO:

skupiny zahrnující nebo SEQ ID NO: 8, cl se podle nároku m, buňky pro produkci uvedeného z kultivačního média.

Způsob exprese až 12, vy transformaci obsahuj ícím kultivaci za polynukleotidu podle n a č u j i c hostitelské í se buňky alespoň uvedené dostatečných polynukelotidů.

Vakcinační se tím, libovolného pro jeden zahrnuje kultivaci podmínek, polypeptidu libovolného tím, ž které jsou získání nároků 6 zahrnuj e vektorem expresivním z uvedených polynukelotidů a podmínek uvedených hostitelské buňky expresi libovolného za prostředek, e zahrnuje účinné nároků 1 až 5 a v y z n množství polypeptidu podle farmaceuticky přijatelný nosič.

20 .

Vakcinační se t i m, prostředek, e zahrnuje účinné vyznačuj ící množství polynukleotidu podle libovolného z nároků 6 až 12 a farmaceuticky účinný nosič.
21. Vakcinační prostředek podle nároku 19 nebo 20, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jeden jiný antigen mikroorganizmu Moraxella catarrhalis.
22. Protilátka imunospecifická pro polypeptid nebo imunologický fragment podle libovolného z nároků 1 až 5.
23. Způsob diagnostikování infekce mikroorganizmem Moraxella, vyznačující setím, že zahrnuje identifikaci polypeptidu podle libovolného z nároků 1 až 5 nebo protilátku, která je imunospecifická pro uvedený polypeptid přítomný v biologickém vzorku získaném ze zvířete, u kterého se očekává taková infekce.

• · • · · · · · • · · · ♦ · · · • · · · · · · 4 ·

90 · * · · · · .

···· ····· .·
24. Použiti prostředku obsahujícího imunologicky účinné množství polypeptidů podle libovolného z nároků 1 až 5 při přípravě léku vhodného pro vytvoření imunitní odpovědi u zvířete.
25. Použití prostředku zahrnujícího imunologikcy účinné množství polynukleotidu podle libovolného z nároků 6 až 12 při přípravě léku vhodného pro tvoření imunitní odpovědi u zvířete.
26. Terapeutický prostředek, vyznačuj ící se tím, ž e se používá při léčbě lidí s onemocněním způsobeným mikroorganizmem Moraxella catarrhalis a obsahuje alespoň jednu protilátku směrovanou proti polypeptidů podle nároků 1 až 5 a vhodný farmaceutický nosič.