ES2253911T3

ES2253911T3 - Polipeptidos basb034 de moraxella catarrhalis y uso de los mismos.

Info

Publication number: ES2253911T3
Application number: ES99946171T
Authority: ES
Inventors: Jean-Louis SmithKline Beecham Biol. S.A. RUELLE
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2019-09-14
Also published as: EP1114160A1; GB9820002D0; US20030180317A1; PL347943A1; IL141996A0; CZ2001927A3; NO20011263D0; JP2002525057A; AU5863299A; NZ510512A; EP1114160B1; ATE312923T1; US7432366B2; AU752667B2; US6600013B1; ZA200102108B; CA2342398A1; DE69928947T2; WO2000015802A1; CN1198931C

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 e ID SEC Nº 8.

Description

Polipéptidos BASB034 de Moraxella catarrhalis y uso de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polinucleótidos (en la presente memoria descriptiva denominados "polinucleótido(s) BASB034"), polipéptidos codificados por ellos (en la presente memoria descriptiva denominados "BASB034" o "polipéptido(s) BASB034"), materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto más, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar infección de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Moraxella catarrhalis (también llamada Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram-negativa aislada frecuentemente en las vías respiratorias superiores humanas. Es responsable de varias patologías, las principales de las cuales son otitis media en lactantes y niños y neumonía en ancianos. También es responsable de sinusitis, infecciones hospitalarias y, menos frecuentemente, enfermedades invasivas.

La otitis media es una importante enfermedad infantil tanto por el número de casos como por sus secuelas potenciales. En los Estados Unidos se registran más de 3,5 millones de casos cada año, y se estima que el 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de llegar a la edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis. 19:823). Si no se trata, o si se cronifica, esta enfermedad puede llevar a pérdidas de audición que podrían ser temporales (en el caso de acumulación de líquido en el oído medio) o permanentes (si resulta dañado el nervio auditivo). En lactantes, estas pérdidas de audición pueden ser responsables de un retardo en el aprendizaje del habla.

En el oído medio de niños con otitis media se aíslan principalmente tres especies bacterianas: Streptoccocus pneumoniae, Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) y M. catarrhalis. Están presentes en entre el 60 y el 90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NTHi representan el 30% aproximadamente, y M. catarrhalis el 15% aproximadamente de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). Podrían aislarse otras bacterias del oído medio (H. influenzae tipo B, S. pyogenes, etc.) pero a una frecuencia mucho menor (el 2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización de las vías respiratorias superiores es un prerrequisito absoluto para el desarrollo de una otitis; sin embargo, se requieren otros también para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP y col. (1988) J. lnfect. Dis. 158:205, Faden, HL y col. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612). Estos son importantes para activar la migración de las bacterias hacia el oído medio a través de las trompas de Eustaquio, seguido del inicio de un proceso inflamatorio. Estos factores se desconocen hasta la fecha. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema inmunitario después de una infección vírica, por ejemplo, podría causar una incapacidad de controlar la colonización de las vías respiratorias (Faden, HL y col. (1994) J. Infect. Dis. 169:1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales permite una colonización más importante de algunos niños, que posteriormente se vuelven susceptibles al desarrollo de otitis media debido a la presencia sostenida de patógenos del oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267).

La respuesta inmunitaria a M. catarrhalis se ha caracterizado deficientemente. El análisis de cepas aisladas secuencialmente de la nasofaringe de bebés de 0 a 2 años de edad indica que contraen y eliminan frecuentemente nuevas cepas. Esto indica que en los niños colonizados se monta una respuesta inmunitaria eficaz frente a estas bacterias (Faden, HL y col. (1994) J. Infect. Dis. 169:1312).

En la mayoría de los adultos sometidos a prueba se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ y col. (1985) J. Infect. Dis. 151:878). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para resistir la actividad bactericida sérica: en general, los aislados de individuos enfermos son más resistentes que los que están simplemente colonizados (Hol, C y col. (1993) Lancet 341:1281, Jordan, KL y col. (1990) Am. J. Med. 88 (supl. 5A):28S). La resistencia sérica podría considerarse, por tanto, un factor de virulencia de las bacterias. Se ha observado una actividad opsonizante en los sueros de niños que se recuperan de otitis media.

Los antígenos diana para estas diferentes respuestas inmunitarias en seres humanos no se han identificado, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión está regulada por hierro, y que es reconocida por los sueros de pacientes con neumonía (Sethi, S, y col. (1995) Infect. Immun. 63:1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y col. (1999), Infect. Imnun. 67:1310).

Algunas otras proteínas de membrana presentes en la superficie de M. catarrhalis se han caracterizado usando un procedimiento bioquímico, o por su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (para revisión, ver Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de neumonía en ratones, la presencia de anticuerpos suscitados contra algunos de ellos (UspA, CopB) favorece un aclaramiento más rápido de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) se conserva altamente entre cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que ha demostrado eficacia contra esta bacteria en modelos animales.

La frecuencia de infecciones por Moraxella catarrhalis ha aumentado espectacularmente en las últimas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de múltiples cepas resistentes a los antibióticos y al aumento de población con sistemas inmunitarios debilitados. Ya no es infrecuente aislar cepas de Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o a todos los antibióticos estándar. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no satisfecha y una demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de detección selectiva de fármacos y pruebas de diagnóstico para este organismo.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a BASB034, en particular polipéptidos BASB034 y polinucleótidos BASB034, materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otros. En un aspecto más, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y dolencias asociadas con dichas infecciones, como ensayos para detectar expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB034.

Varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y el alcance de la invención desvelada serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia a partir de la lectura de las siguientes descripciones y de la lectura de las otras partes de la presente descripción.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB034 según se describe más adelante en mayor detalle. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB034 de Moraxella catarrhalis, que están relacionados por homología de secuencias de aminoácidos con proteína de fosfolipasa A de membrana exterior de Klebsiella pneumoniae. La invención se refiere especialmente a BASB034 que tienen las secuencias de aminoácidos y nucleótidos establecidas en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 y ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8, respectivamente. Se entiende que las secuencias enumeradas en el Listado de Secuencias más adelante como "ADN" representan una ilustración de una forma de realización de la invención, dado que los expertos en la materia reconocerán que dichas secuencias pueden emplearse con utilidad en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Según un aspecto de la presente invención se proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 e ID SEC Nº 8.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos de la invención.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un vector de expresión o un microorganismo vivo recombinante que comprende un polinucleótido aislado según la invención.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un microorganismo vivo recombinante que comprende un vector de expresión según la invención.

Según un aspecto más de la presente invención se proporciona una célula hospedadora que comprende un vector de expresión según la invención.

Según un aspecto más de la presente invención se proporciona una célula hospedadora de Moraxella catarrhalis que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento del mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a una célula hospedadora de Moraxella catarrhalis que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 e ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento del mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a un vehículo)) de suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente.

Según un aspecto más de la presente invención se proporciona una membrana exterior de un microorganismo recombinante de la invención que expresa un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8.

Según un aspecto más de la presente invención se proporciona una membrana exterior de un microorganismo recombinante que tiene expresión regulada por aumento de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento del mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) de suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para producir un polipéptido según se define en la invención, que comprende cultivo de una célula hospedadora de la invención en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperación del polipéptido del medio de cultivo.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para producir un fragmento inmunogénico del polipéptido según se reivindica en la invención en el que el fragmento inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 y que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, que comprende cultivo de una célula hospedadora de la invención en condiciones suficientes para la producción de dicho fragmento inmunogénico y recuperación del fragmento inmunogénico del medio de cultivo.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para expresar un polinucleótido de la invención que comprende la transformación de una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dicho polinucleótido y el cultivo de dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para expresar un polinucleótido que codifica un fragmento inmunogénico del polipéptido según se reivindica en la invención en el que el fragmento inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 y que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, que comprende la transformación de una célula hospedadora de Moraxella catarrhalis con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos, y cultivo de dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento del mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) de suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7 en toda la longitud de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7, respectivamente, o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición de vacuna según la invención en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

Según otro aspecto más de la presente invención se proporciona una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 respectivamente o un fragmento de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 respectivamente, en la que el fragmento se acopla a un vehículo y es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 respectivamente.

Según un aspecto más de la presente invención se proporciona una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7 en toda la longitud de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7, respectivamente, o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Moraxella catarrhalis referidos en la presente memoria descriptiva como "BASB034" y "polipéptidos BASB034", así como variantes de los mismos útiles en términos biológicos, diagnósticos, profilácticos, clínicos o terapéuticos, y composiciones que comprenden los mismos.

La presente invención proporciona además:

(a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8;

(b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótido del mismo; o

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una secuencia de polipéptidos seleccionada entre ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8.

Los polipéptidos BASB034 proporcionados en ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 son los polipéptidos BASB034 de las cepas de Moraxella catarrhalis Mc2931 (ATCC 43617), Mc2908, Mc2913 y Mc2969.

En formas de realización, la invención emplea un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB034, es decir, una porción contigua del polipéptido BASB034 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8; es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido BASB034. Dicho fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB034 carente de una secuencia delantera terminal en N, y/o un dominio de transmembrana, y/o un dominio de anclaje terminal en C. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico de BASB034 empleado por la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido que tiene identidad de al menos el 85%, preferentemente identidad de al menos el 90%, más preferentemente identidad de al menos el 95%, con la máxima preferencia identidad de al menos del 97 al 99%, con respecto a la ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma que parte pero no la totalidad de cualquier secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. En cuanto a polipéptidos BASB0344, los fragmentos pueden estar "exentos" o comprendidos dentro de un polipéptido mayor del cual forman una parte o región, con la máxima preferencia como una región continua única en un único polipéptido mayor.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 o de variantes de la misma, como, por ejemplo, una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoácidos terminal en amino y/o carboxilo. Se prefieren también las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidas por o en una célula hospedadora. Se prefieren además fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales como fragmentos que comprenden regiones de hélice alfa y formadoras de hélice alfa, regiones de hojas beta y formadoras de hojas beta, regiones de giros y formadoras de giros, regiones de enrollamientos y formadoras de enrollamientos, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones formadoras de superficies, regiones de unión a sustrato y regiones de alto índice antigénico.

Los fragmentos más preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos a la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o suprimidos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8.

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención pueden emplearse para producir el polipéptido correspondiente de longitud completa para síntesis de péptidos; por tanto, estos fragmentos pueden emplearse como productos intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Se prefieren particularmente variantes en las que varios aminoácidos 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 son sustituidos, suprimidos o añadidos en cualquier combinación.

Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de o usados en la invención pueden estar en forma de la proteína "madura" o pueden formar parte de una proteína mayor como un precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias delanteras o secretoras, prosecuencias, secuencias que ayudan en la purificación como residuos múltiples de histidina, o una secuencia adicional para estabilidad durante la producción recombinante. Por otra parte, se considera también la adición de polipéptido exógeno o secuencias de polinucleótidos o de cola de lípidos para aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles obtenidas por ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, y varias porciones de las regiones constantes de cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como inmunoglobulina se prefiere la parte constante de una cadena pesada de Ig humana, en particular IgG1, en la que la fusión tiene lugar en la región de bisagra. En una forma de realización particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente por incorporación de una secuencia de escisión que puede escindirse con factor de coagulación sanguínea Xa.

Por otra parte, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión por ingeniería genética, y al uso de las mismas para detección selectiva de fármacos, diagnóstico y terapia. Un aspecto más de la invención se refiere también a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las Solicitudes de Patente Internacional nº WO94/29.458 y WO94/22.914.

Las proteínas pueden conjugarse químicamente, o expresarse como proteínas de fusión recombinantes permitiendo producir niveles aumentados en un sistema de expresión en comparación con proteína no fundida. El compañero de fusión puede ayudar a proporcionar epítopos T colaboradores (compañero de fusión inmunológica), preferentemente epítopos T colaboradores reconocidos por seres humanos, o ayudar a expresar la proteína (potenciador de expresión) en rendimientos superiores a los de la proteína recombinante nativa. Preferentemente, el compañero de fusión será un compañero de fusión inmunológica y un compañero de potenciación de la expresión.

Los compañeros de fusión incluyen proteína D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus de influenza, NS1 (hemaglutinina). Otro compañero de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferentemente, se usa la parte C-terminal de la molécula. LytA se obtiene de Streptococcus pneumoniae que sintetiza la N-acetil-L-alanina-amidasa, LytA-amidasa (codificada por el gen LytA {Gene, 43 (1986) página 265-272}), una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la columna principal de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a algunos análogos de colina como DEAE. Esta propiedad se ha aprovechado para el desarrollo de C-LytA de E. coli que expresa plásmidos útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su término amino {Biotechnology: 10, (1992) página 795-798}. Es posible usar la parte de repetición de la molécula LytA encontrada en el extremo C-terminal que empieza en el residuo 178, por ejemplo, los residuos 188-305.

Los autores de la solicitud describen también variantes de los polipéptidos anteriormente mencionados, es decir, polipéptidos que varían con respecto a los referentes por sustituciones de aminoácidos conservadoras, con lo que un residuo se sustituye por otro de características similares. Dichas sustituciones típicas se dan entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse en cualquier modo adecuado. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos aislados de ocurrencia natural, polipéptidos producidos por medios recombinantes, polipéptidos producidos sintéticamente o polipéptidos producidos por una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar dichos polipéptidos son bien conocidos en la técnica.

Lo más preferido es que un polipéptido de la invención se obtenga de Moraxella catarrhalis, aunque puede obtenerse preferentemente de otros organismos del mismo género taxonómico. Un polipéptido de la invención puede obtenerse también, por ejemplo, de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Un objeto de la invención es proporcionar polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB034, en particular polinucleótidos que codifican el polipéptido designado en la presente memoria descriptiva como BASB034.

En una forma de realización de la invención preferida en particular, el polinucleótido comprende una región que codifica BASB034 que comprende una secuencia establecida en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 que incluye un gen de longitud completa.

Los polinucleótidos BASB034 proporcionados en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 son los polinucleótidos BASB034 de las cepas de Moraxella catarrhalis Mc2931 (ATCC 43617), Mc2908, Mc2913 y Mc2969.

Como un aspecto más de la invención se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aislados que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB034, en particular polipéptidos y polinucleótidos BASB034 de Moraxella catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, ARN sin procesar, ARN de ribozimas, ARNm, ADNc, ADN genómicos, ADN-B y ADN-Z. Otras formas de realización de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos útiles desde el punto de vista biológico, diagnóstico, profiláctico, clínico o terapéutico, y variantes de los mismos, y composiciones que comprenden los mismos.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, incluyendo al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB034 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8.

En otra forma de realización de la invención preferida particularmente existe un polipéptido BASB034 de Moraxella catarrhalis que comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 o una variante de la misma.

Usando la información proporcionada en la presente memoria descriptiva, como una secuencia de polinucleótidos establecida en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7, puede obtenerse un polinucleótido de la invención que codifica polipéptido BASB034 usando procedimientos estándar de clonación y detección selectiva, como los de clonación y secuenciación de fragmentos de ADN cromosómicos a partir de bacterias que usan células de Moraxella catarrhalis como material de partida, seguido por la obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótidos de la invención, como una secuencia de polinucleótidos dada en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7, normalmente se sondea una biblioteca de clones de ADN cromosómico de Moraxella catarrhalis en E. coli o algún otro hospedador adecuado con un oligonucleótido radiomarcado, preferentemente de 17 mer o más, obtenido de una secuencia parcial. Entonces pueden distinguirse los clones que llevan ADN idéntico al de la sonda usando condiciones estrictas de hibridación. Al secuenciar los clones individuales así identificados por hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia original de polipéptidos o polinucleótidos es posible extender la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar una secuencia génica de longitud completa. Convenientemente, dicha secuenciación se realiza, por ejemplo, usando ADN bicatenario desnaturalizado preparado a partir de clon de plásmido. Se describen técnicas adecuadas en Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) (ver en particular Screening By Hybridization 1.90 y Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). Puede realizarse también secuenciación directa de ADN genómico para obtener una secuencia génica de longitud completa. Ilustrativo de la invención, cada polinucleótido establecido en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 se descubrió en una biblioteca de ADN obtenida de Moraxella catarrhalis.

Además, cada secuencia de ADN establecida en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 contiene un marco de lectura abierta que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de residuos de aminoácidos establecidos en ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 con un peso molecular deducido que puede calcularse usando valores de pesos moleculares de residuos de aminoácidos bien conocidos por los expertos en la materia.

El polinucleótido de ID SEC Nº 1, entre el codón de iniciación en el número de nucleótido 1 y el codón de parada que empieza en el número de nucleótido 1.327 de ID SEC Nº 1, codifica el polipéptido de ID SEC Nº 2.

El polinucleótido de ID SEC Nº 3, entre el codón de iniciación en el número de nucleótido 1 y el codón de parada que empieza en el número de nucleótido 1.327 de ID SEC Nº 3, codifica el polipéptido de ID SEC Nº 4.

El polinucleótido de ID SEC Nº 5, entre el codón de iniciación en el número de nucleótido 1 y el codón de parada que empieza en el número de nucleótido 1.327 de ID SEC Nº 5, codifica el polipéptido de ID SEC Nº 6.

El polinucleótido de ID SEC Nº 7, entre el codón de iniciación en el número de nucleótido 1 y el codón de parada que empieza en el número de nucleótido 1.327 de ID SEC Nº 7, codifica el polipéptido de ID SEC Nº 8.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o consiste en:

(a) una secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de ID SEC Nº 1. 3, 5 ó 7; o

(b) una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8.

Puede obtenerse un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de especies distintas de Moraxella catarrhalis , mediante un procedimiento que comprende las etapas de detección selectiva de una biblioteca apropiada según condiciones estrictas de hibridación (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45 a 65°C y una concentración de SDS del 0,1 al 1%) con una sonda marcada o detectable constituida por o que comprende la secuencia de ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 o un fragmento de la misma; y aislamiento de clones génicos y/o genómicos de longitud completa que contienen dicha secuencias de polinucleótidos.

La invención proporciona una secuencia de polinucleótidos idéntica en toda su longitud a una secuencia de codificación (marco de lectura abierta) en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7. También se proporciona mediante la invención una secuencia de codificación para un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por sí mismo así como una secuencia de codificación para un polipéptido maduro o un fragmento en marco de lectura con otra secuencia de codificación, como una secuencia que codifica una secuencia delantera o secretora, una secuencia pre- o pro- o prepro-proteína. El polinucleótido de la invención puede contener también al menos una secuencia de no codificación, incluyendo por ejemplo, pero sin limitarse a, al menos una secuencia de no codificación en 5' y 3', como secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (como señales de terminación dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión a ribosomas, secuencias de Kozak, secuencias que estabilizan ARNm, intrones y señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótidos puede comprender también secuencia de codificación adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia de marcador que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas formas de realización de la invención, la secuencia de marcador es un péptido de hexahistidina, como el proporcionado en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y descrito en Gentz y col. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:821-824 (1989), o una etiqueta de péptido HA (Wilson y col., Cell 37:767 (1984), siendo ambos útiles para purificar la secuencia de polipéptidos fusionada con ellos. Los polinucleótidos de la invención incluyen también, pero sin limitarse a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión génica.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB034 de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 puede ser idéntica al polipéptido que codifica la secuencia contenida en los nucleótidos 1 a 1.326 de ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7, respectivamente. Alternativamente, puede ser una secuencia que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8.

El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" según se usa en la presente memoria descriptiva comprende polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica unpolipéptido de la invención, en particular un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido BASB034 de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8. El término abarca también polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vectores integrada, una secuencia de transposones integrada, o debido a edición de ARN o reorganización de ADN genómico) junto con regiones adicionales, que pueden contener también secuencias de codificación y/o no codificación.

La invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva que codifican variantes de un polipéptido que tiene un secuencia de aminoácidos deducida de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8. Pueden usarse fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de la invención de longitud completa.

Formas de realización particularmente preferidas son polinucleótidos que codifican variantes BASB034, que tienen la secuencia de aminoácidos de polipéptido BASB034 de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 en la que varios, algunos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácidos están sustituidos, modificados, suprimidos y/o añadidos en cualquier combinación. Entre éstos se prefieren especialmente sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB034.

Los aspectos de la invención emplean polinucleótidos que son idénticos en al menos el 85% en toda su longitud a un polinucleótido que codifica polipéptido BASB034 que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8, y polinucleótidos que son complementarios a dichos polinucleótidos. Alternativamente, se prefieren de forma predominante los polinucleótidos que comprenden una región que es idéntica en al menos el 90% en toda su longitud a un polinucleótido que codifica polipéptido BASB034 y polinucleótidos complementarios al mismo. A este respecto, se prefieren en particular polinucleótidos idénticos en al menos el 95% en toda su longitud. Por otra parte, los que tienen al menos el 97% son altamente preferidos entre los que tienen al menos el 95%, y entre éstos los que tienen al menos el 98% y al menos el 99% son en particular altamente preferidos, siendo los más preferidos los de al menos el 99%.

Son formas de realización preferidas los polinucleótidos que codifican polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por un ADN de ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7.

Según ciertas formas de realización preferidas de esta invención se proporcionan polinucleótidos que hibridan, en particular en condiciones estrictas, a secuencias de polinucleótidos BASB034, como los polinucleótidos en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7.

La invención emplea además polinucleótidos que hibridan a las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la presente memoria descriptiva. A este respecto, la invención emplea especialmente polinucleótidos que hibridan en condiciones estrictas a los polinucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva. Según se usa en la presente memoria descriptiva, los términos "condiciones estrictas" y "condiciones de hibridación estrictas" significan que la hibridación se produce sólo si existe identidad de al menos el 95% y preferentemente de al menos el 97% entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación estrictas es incubación durante toda la noche a 42°C en una solución que comprende: formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón triturado desnaturalizado, seguido de lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a 65°C aproximadamente. Las condiciones de hibridación y de lavado son bien conocidas y están ilustradas en Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), en particular el Capítulo 11 del mismo. La hibridación de solución puede usarse también con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención.

Los aspectos de la invención emplean también un polinucleótido que consiste en o que comprende secuencias de polinucleótidos obtenidas por detección selectiva de una biblioteca apropiada que contiene el gen completo para secuencias de polinucleótidos establecidas en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 en condiciones de hibridación estrictas con una sonda que tiene la secuencia de dichas secuencias de polinucleótidos establecidas en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 o un fragmento de las mismas; y aislamiento de dicha secuencia de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener un polinucleótido semejante incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores descritos completamente en otra parte de la presente memoria descriptiva.

Según se expone en otra parte de la presente memoria descriptiva con respecto a ensayos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, pueden usarse como sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNc y clones genómicos de longitud completa que codifican BASB034 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tienen una alta identidad, en particular alta identidad de secuencia, con respecto al gen BASB034. Dichas sondas comprenderán generalmente al menos 15 residuos de nucleótidos o pares de bases. Preferentemente, dichas sondas tendrán al menos 30 residuos de nucleótidos o pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos de nucleótidos o pares de bases. Las sondas preferidas particularmente tendrán al menos 20 residuos de nucleótidos o pares de bases y tendrán menos de 30 residuos de nucleótidos o pares de bases.

Una región de codificación de un gen BASB034 puede aislarse por detección selectiva usando una secuencia de ADN proporcionada en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Se usa entonces un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención para detectar selectivamente una biblioteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar a qué miembros de la biblioteca hibrida la sonda.

Existen varios procedimientos disponibles y bien conocidos por los expertos en la materia para obtener ADN de longitud completa, o extender ADN cortos, por ejemplo los basados en el procedimiento de Amplificación Rápida de extremos de ADNc (RACE) (ver, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85:8998-9002, 1988). Recientes modificaciones de la técnica, ilustradas por la tecnología Marathon^{TM} (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología Marathon^{TM}, los ADNc se han preparado a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada en ambos extremos. A continuación se efectúa amplificación de ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5' "desaparecido" del ADN usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos específicos del gen y específicos del adaptador. A continuación se repite la reacción PCR usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para apareamiento con el producto amplificado (normalmente, un cebador específico de adaptador que aparea más 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico de gen que aparea más 5' en la secuencia de gen seleccionada). A continuación pueden analizarse los productos de esta reacción mediante secuenciación de ADN y un ADN de longitud completa construido por unión del producto directamente al ADN existente para dar una secuencia completa, o efectuar una PCR de longitud completa independiente usando la nueva información de secuencia para el diseño del
cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden emplearse, por ejemplo, como reactivos de investigación y materiales para el descubrimiento de tratamientos y diagnóstico de enfermedades, en particular enfermedades humanas, como se expone más adelante en la presente memoria descriptiva en relación con ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos obtenidos de una secuencia de ID SEC Nº 1 a 8 pueden usarse en los procedimientos de la presente memoria descriptiva según se describe, pero preferentemente para PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados en la presente memoria descriptiva se transcriben o no, en parte o en la totalidad, en bacterias en tejido infectado. Se reconoce que dichas secuencias tendrán también utilidad en el diagnóstico de la fase de infección y el tipo de infección que ha alcanzado el patógeno.

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos adicionales con terminal amino o carboxilo, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena de polipéptidos, por ejemplo). Dichas secuencias pueden jugar un rol en el tratamiento de una proteína a partir de precursor a una forma madura, pueden permitir transporte de proteínas, pueden alargar o acortar la semivida de las proteínas o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in vivo, los aminoácidos adicionales pueden tratarse a partir de la proteína madura por enzimas celulares.

Para todos y cada uno de los polinucleótidos de la invención se proporciona un polinucleótido complementario a él. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean totalmente complementarios a cada polinucleótido del que son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido fusionado con una o más prosecuencias, puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se eliminan las prosecuencias, en general dichos precursores inactivos se activan. Parte o la totalidad de las prosecuencias puede eliminarse antes de la activación. En general, dichos precursores se denominan proproteínas.

Además de las representaciones estándar A, G, C, T/U para nucleótidos, el término "N" puede usarse también para describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN puede aparecer en dicha posición designada en la secuencia de ADN o ARN, con la excepción de que se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en combinación con posiciones de nucleótido adyacentes, cuando se lee en el marco de lectura correcto, tendría el efecto de generar un codón de terminación prematuro en dicho marco de lectura.

En suma, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia delantera (que puede referirse como preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son secuencias delanteras de una preproteína o una preproproteína, que es un precursor a una proproteína, que tiene una secuencia delantera y una o más prosecuencias, que generalmente se eliminan durante el etapas de tratamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

Según un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para fines terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética empleará preferentemente un procedimiento de suministro adecuado como inyección directa de ADN de plásmido en los músculos (Wolff y col., Hum. Mol. Genet. (1992) 1:363, Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4:419), suministro de ADN con formación de complejo con vehículos específicos de proteínas (Wu y col., J. Biol., Chem. (1989) 264:16985), coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenisty y Reshef, PNAS USA, (1986) 83:9551), encapsulado de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243:375), bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12:791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col., PNAS USA (1984) 81:5849).

Vectores, células hospedadoras, sistemas de expresión

La invención se refiere también a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células hospedadoras que son sometidas a ingeniería genética con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir dichas proteínas usando ARN obtenidos de los constructos de ADN de la invención.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia a partir de células hospedadoras sometidas a ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. En consecuencia, en un aspecto más, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células hospedadoras que son sometidas a ingeniería genética con dichos sistemas de expresión y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes.

Para producción recombinante de los polipéptidos de la invención, pueden someterse a ingeniería genética células hospedadoras para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en la célula hospedadora puede efectuarse mediante procedimientos descritos en numerosos manuales de laboratorio estándar, como Davis, y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) y Sambrook, y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), como transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga de raspaduras, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen células bacterianas, como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, Streptomyces, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas, como células de levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto como célula de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 ycélulas de melanoma de Bowes; y células vegetales, como células de una gimnosperma o una angiosperma.

Puede usarse una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Dichos vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus como, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus como baculovirus, virus papova, como SV40, virus vaccinia, adenovirus, poxvirus de viruela aviar, virus de pseudorrabia, picornavirus, retrovirus y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, como los derivados de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, como cósmidos y fagémidos. Los constructos del sistema de expresión pueden contener regiones de control que regulan y engendran expresión. En general, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un huésped puede usarse para expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el sistema de expresión mediante cualquier variedad de técnicas rutinarias y bien conocidas, como, por ejemplo, las establecidas en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (más arriba).

En sistemas de expresión recombinantes en eucariotas, para secreción de una proteína traducida en la luz del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante procedimientos bien conocidos, incluyendo precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lecitina. Con la máxima preferencia, se emplea cromatografía de afinidad por ion metálico (IMAC) para purificación. Pueden emplearse técnicas bien conocidas para replegar proteínas al objeto de regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis, aislamiento o purificación intracelular.

El sistema de expresión puede ser también un microorganismo vivo recombinante, como un virus o una bacteria. El gen de interés puede insertarse en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo llevará a expresión in vivo del antígeno e inducción de respuestas inmunitarias. Los virus y bacterias usados para este fin son, por ejemplo: poxvirus (por ejemplo, vaccinia, de viruela aviar, de viruela del canario), alfavirus (virus de Sindbis, virus del bosque de Semliki, virus de encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adenoasociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus), herpesvirus (virus de varicela-zóster, etc), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos o atenuados de diversas formas para obtener vacunas vivas. Dichas vacunas vivas forman también parte de la invención.

Anticuerpos

Pueden usarse polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de los mismos, o células que expresan los mismos como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para dichos polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente.

En ciertas formas de realización preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos
BASB034.

Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención por administración de los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos portadores de epítopos de uno o ambos, análogos de uno o ambos, o células que expresan uno o ambos, a un animal, preferentemente no humano, usando protocolos de rutina. Para preparar anticuerpos monoclonales puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica que proporciona anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, como las de Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256:495-497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today 4:72 (1983); Cole y col.,pág. 72-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc.
(1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de EE.UU. nº 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios a polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. Además, pueden usarse ratones transgénicos, u otros organismos o animales, como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos para los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

Alternativamente, puede utilizarse tecnología de exhibición de fagos para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión hacia un polipéptido de la invención ya sea a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos de seres humanos detectados selectivamente por poseer anti-BASB034 o a partir de bibliotecas nuevas (McCafferty, y col., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, y col., (1992) Biotechnology 10,779-783). La afinidad de estos anticuerpos puede mejorarse también, por ejemplo, mediante purgado de cadena (Clackson y col., (1991) Nature 352:628).

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden emplearse para aislar o identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.

Así, entre otros, pueden emplearse anticuerpos contra polipéptido BASB034 o polinucleótido BASB034 para tratar infecciones, en particular infecciones bacterianas.

Las variantes de polipéptido incluyen variantes equivalentes antigénica, epitópica o inmunológicamente que forman un aspecto particular de esta invención.

Preferentemente, el anticuerpo o variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano, el anticuerpo puede "humanizarse" con la máxima preferencia, en el que la región o regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma se han trasplantado a un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo, según se describe en Jones y col. (1986), Nature 321:522-525 o Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, en particular un mamífero, preferentemente un ser humano, que comprende la inoculación en el individuo de polinucleótido y/o polipéptido BASB034, o un fragmento o variante de los mismos, adecuada para producir anticuerpo y/o respuesta inmunitaria a células T para proteger a dicho individuo de la infección, en particular infección bacteriana y más en particular infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan procedimientos en los que dicha respuesta inmunológica ralentiza la replicación bacteriana. Otro aspecto más de la invención se refiere a un procedimiento para inducir respuesta inmunológica en un individuo que comprende el suministro a dicho individuo de un vector de ácidos nucleicos, secuencia o ribozima para dirigir la expresión de polinucleótido y/o polipéptido BASB034, o un fragmento o una variante de los mismos, para expresar polinucleótido y/o polipéptido BASB034, o un fragmento o una variante de los mismos in vivo para inducir una respuesta inmunológica, como, por ejemplo, para producir anticuerpo y/o respuesta inmunitaria a células T, incluyendo, por ejemplo, células T productoras de citoquina o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo, preferentemente un ser humano, de la enfermedad, ya se haya esa enfermedad establecido en el individuo o no. Un ejemplo de administración del gen consiste en acelerarlo en las células deseadas como un revestimiento en partículas u otros. Dicho vector de ácidos nucleicos puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo de ADN-proteína o un complejo de ARN-proteína.

Un aspecto más de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferentemente un ser humano, susceptible de haber inducido en él una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en dicho individuo a un polinucleótido y/o polipéptido BASB034 codificado a partir de los mismos, en el que la composición comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB034 recombinante codificado a partir de los mismos y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido BASB034, polipéptido codificado a partir del mismo u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica puede usarse terapéutica o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpo y/o inmunidad celular, como inmunidad celular surgida de células T CTL o CD4+.

Un polipéptido BASB034 o un fragmento del mismo puede fusionarse con una coproteína o una fracción química que puede o no producir anticuerpos por sí misma, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y de producir una proteína fusionada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferentemente propiedades protectoras. Así, la proteína recombinante fusionada, que comprende preferentemente además una coproteína antigénica, como lipoproteína D de Haemophilus influenzae, glutationa-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmunitario del organismo que recibe la proteína. La coproteína puede unirse al término amino- o carboxi- de la primera proteína.

Mediante esta invención se proporcionan composiciones, en particular composiciones de vacunas, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, como las descritas en Sato, Y. y col. Science 273:352 (1996).

Asimismo, por esta invención se proporcionan procedimientos que usan el polinucleótido descrito o fragmentos particulares del mismo, para los que se ha demostrado que codifican regiones no variables de proteínas bacterianas de superficie celular, en constructos de polinucleótidos usados en dichos experimentos de inmunización genética en modelos de animales de infección con Moraxella catarrhalis. Dichos experimentos serán útiles particularmente para identificar epítopos de proteínas capaces de provocar una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica. Se cree que este planteamiento permitirá la preparación subsiguiente de anticuerpos monoclonales de valor particular, obtenidos del órgano requerido del animal que resiste con éxito o aclara la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, en particular infeccióncon Moraxella catarrhalis, en mamíferos, en particular seres humanos.

La invención incluye también una formulación de vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dado que los polipéptidos y polinucleótidos pueden descomponerse en el estómago, cada uno de ellos se administra preferentemente parenteralmente, incluyendo, por ejemplo, administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que reproducen la formulación isotónica con el fluido corporal, preferentemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases monodosis o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado de congelación seca que sólo requiere la adición del vehículo de líquido estéril inmediatamente antes de usarlo.

La formulación de vacuna de la invención puede incluir también sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferentemente, el sistema adyuvante eleva preferentemente un tipo de respuesta TH1.

Una respuesta inmunitaria puede distinguirse ampliamente en dos categorías extremas, que son respuestas inmunitarias humorales o mediadas por células (caracterizadas tradicionalmente por mecanismos de protección de anticuerpos y de efectores celulares, respectivamente). Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células) y respuestas inmunitarias de tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunitarias de tipo TH1 extremas pueden caracterizarse por la generación de antígeno específico, linfocitos T citotóxicos restringidos por haplotipo y respuestas de células asesinas naturales. En ratones, las respuestas de tipo TH1 se caracterizan a menudo por la generación de anticuerpos del subtipo Ig2a, mientras que en el ser humano corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunitarias de tipo TH2 se caracterizan por la generación de una amplia gama de isotipos de inmunoglobulina que se incluyen en IgG1, IgA e IgM de ratones.

Puede considerarse que la fuerza impulsora del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunitarias son citoquinas. Los altos niveles de citoquinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por células para el antígeno dado, mientras que niveles altos de citoquinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales al antígeno.

La distinción de respuestas inmunitarias de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad, un individuo admitirá una respuesta inmunitaria que se describe como predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente considerar las familias de citoquinas de lo que han descrito en clones celulares en células T CD4 +ve murinas Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pág. 145-173).Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 se asocian a la producción de las citoquinas de INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas a menudo asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunitarias de tipo TH1 no son producidas por células T, como IL-12. En contraste, las respuestas de tipo TH2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citoquinas de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmunitaria después de una vacunación o infección incluyen la medida directa de la producción de citoquinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro después de reestimulación con antígeno, y/o la medida de la proporción Ig1:Ig2a de respuestas de anticuerpos específicas de antígenos.

Así, un adyuvante de tipo TH1 es aquél que estimula preferentemente poblaciones aisladas de células T para producir altos niveles de citoquinas de tipo TH1 cuando se reestimulan con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo de linfocitos T citotóxicos CD8+ y respuestas de inmunoglobinas específicas de antígenos asociadas con isotipo de tipo TH1.

Los adyuvantes que son capaces de estimulación preferente de la respuesta celular TH1 se describen en la Solicitud de Patente Internacional nº WO 94/00.153 y WO 95/17.209.

Uno de dichos adyuvantes es lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado (3D-MPL). Esto se sabe por el documento GB 2.220.211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y es fabricado por Ribi Immunochem, Montana. En la Patente Europea 0.689.454-B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA) se desvela una forma preferida de lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado.

Preferentemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para filtrarse de forma estéril a través de una membrana de 0,22 micrómetros (Patente Europea número 0.689.454). 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug a 100 \mug, preferentemente de 25 a 50 \mug por dosis, en el que el antígeno estará presente normalmente en un intervalo de 2 a 50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada de HpIc obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente, ésta puede mezclarse con lípido A de monofosforilo 3-des-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se desvela en la patente de EE.UU. nº 5.057.540.

Se han descrito anteriormente formulaciones de adyuvantes no reactógenos que contienen QS21 (documento WO 96/33.739). Dichas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han demostrado éxito como adyuvantes de estimulación de TH1 cuando se formulan con un antígeno.

Otros adyuvantes que son estimuladores preferenciales de respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas como se desvela en el documento WO 96/02.555.

También se contemplan combinaciones de diferentes adyuvantes estimulados de TH1, como los mencionados anteriormente, como el suministro de un adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21 puede formularse junto con 3D-MPL. La proporción de QS21:3D-MPL estará normalmente en el orden de 1:10 a 10:1; preferentemente de 1:5 a 5:1 y a menudo sustancialmente de 1:1. El intervalo preferido para una sinergia óptima es de 2,5:1 a 1:13 de D-MPL:QS21.

Preferentemente en la composición de vacuna según la invención está presente también un vehículo. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio, como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, como escualeno, alfa-tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido, los antígenos en la composición de vacuna según la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en dicha emulsión. Además, la emulsión de aceite en agua puede contener Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Normalmente, para administración humana en una vacuna QS21 y 3D-MPL estarán presentes en el intervalo de 1 \mug a 200 \mug, como, por ejemplo, de 10 a 100 \mug, preferentemente de 10 a 50 \mug por dosis. Normalmente, el aceite en agua comprenderá del 2 al 10% de escualeno, del 2 al 10% de alfa-tocoferol y del 0,3 al 3% de Tween 80. Preferentemente, la proporción de escualeno:alfa-tocoferol es igual o menor que 1, con lo que se proporciona una emulsión más estable. Span 85 puede estar presente también en un nivel del 1%. En algunos casos, puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizador.

Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas contienen preferentemente un aceite no tóxico como, por ejemplo, escualano o escualeno, un emulsionante como, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. Los vehículos acuosos pueden ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

En el documento WO 95/17.210 se describe una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua.

La presente invención proporciona también una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y dolencias relacionadas. Dicha composición de vacuna polivalente puede incluir un adyuvante inductor de TH-1 como se ha descrito anteriormente.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB034, se entiende que cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos de ocurrencia natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, deleciones o sustituciones que no afectan sustancialmente a las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto más de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido BASB034 y/o un polipéptido BASB034 para administración a una célula o un organismo multicelular.

La invención se refiere también a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido expuestos en la presente memoria descriptiva. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden emplearse en combinación con un vehículo o vehículos estériles o no estériles para su uso con células, tejidos u organismos, como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un individuo. Dichas composiciones comprenden, por ejemplo, un medio aditivo o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de administración. La invención se refiere además a paquetes y kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más envases rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente.

Pueden emplearse polipéptidos y polinucleótidos de la invención en solitario o en conjunción con otros compuestos, como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en cualquier modo conveniente eficaz incluyendo, por ejemplo, administración por vías tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica, entre otras.

En terapia o como profiláctico, el agente activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril, preferentemente isotónica.

En un aspecto más, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La invención se refiere además a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más envases rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención anteriormente mencionadas. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención pueden emplearse en solitario o en conjunción con otros compuestos, como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la ruta de administración, por ejemplo, mediante una ruta sistémica u oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, normalmente por inyección intravenosa. Pueden usarse otras rutas de inyección como, por ejemplo, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Los medios alternativos para administración sistémica incluyen administración transmucosa y transdérmica usando agentes de penetración como sales biliares o ácidos fusídicos u otros detergentes. Además, si el polipéptido u otros compuestos de la presente invención pueden formularse en una formulación entérica o encapsulada, también es posible la administración oral. La administración de estos compuestos puede ser también tópica y/o localizada en forma de pomadas, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para administración a mamíferos, y particularmente seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del agente activo será de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, normalmente de 1 mg/kg aproximadamente. En cualquier caso, el médico determinará la dosificación real que será más adecuada para un individuo y que variará con la edad, el peso y la respuesta del individuo en concreto. Las dosificaciones anteriores son ilustrativas del caso promedio. Naturalmente, pueden darse casos individuales en que se requieran intervalos de dosificación superiores o inferiores, y éstos están dentro del alcance de la presente invención.

El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la ruta de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la dolencia del sujeto y el criterio del facultativo. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,1 a 100 \mug/kg del sujeto.

Una composición de vacuna está convenientemente en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmunitaria. Una dosis unitaria adecuada para vacunación es de 0,5 a 5 microgramos/kg de antígeno, y dicha dosis se administra preferentemente de 1 a 3 veces y con un intervalo de 1 a 3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado no se observarán efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención que excluirían su administración a individuos adecuados.

Sin embargo, son de esperar amplias variaciones en la dosificación necesaria, a la vista de la variedad de compuestos disponibles y de las diferentes eficacias de las diversas rutas de administración. Por ejemplo, se esperará que la administración oral requiera dosificaciones más altas que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas estándar para optimización, como es bien conocido en la técnica.

Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible y algoritmos

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos forman un valioso recurso de información con el que determinar sus estructuras en 2 y 3 dimensiones, así como para identificar secuencias adicionales de homología similar. Estos planteamientos se facilitan más por el almacenamiento de la secuencia en un medio legible por ordenador y usando a continuación los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido o para búsqueda en una base de datos usando herramientas de búsqueda bien conocidas, como la aplicación informática GCG.

También se proporcionan en la invención procedimientos para el análisis de secuencias o cadenas de caracteres, en particular secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencias incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencias como análisis de identidad y semejanza, análisis de estructura de ADN, ARN y proteínas, ensamblaje de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias, determinación de marco de lectura abierta, búsqueda de bases de ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, recorte de bases de ácidos nucleicos y análisis de picos de cromatografías de secuenciación.

Se proporciona un procedimiento de base informática para realizar identificación de homología. Este procedimiento comprende las etapas de proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un soporte legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia de polinucleótidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar la
homología.

Se proporciona también un procedimiento de base informática para realizar identificación de homología, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de proporcionar una primera secuencia de polipéptidos que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un soporte legible por ordenador; y comparar dicha primera secuencia de polipéptidos con al menos una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar la
homología.

Todas las publicaciones y referencias, que incluyen, pero no se limitan a, patentes y solicitudes de patentes, citadas en esta especificación se incorporan en la presente memoria descriptiva como referencia en su totalidad, como si cada publicación o referencia individual se incorporara específica e individualmente como referencia en la presente memoria descriptiva. Cualquier solicitud de patente sobre la que esta solicitud reivindique prioridad se incorpora también como referencia en la presente memoria descriptiva en su totalidad de la forma descrita anteriormente para publicaciones y referencias.

Definiciones

"Identidad", según se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según sea el caso, determinada por comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el grado de relación de secuencia entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, determinadas por la correspondencia entre cadenas de dichas secuencias. La "identidad" puede calcularse fácilmente por procedimientos conocidos, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en (Computacional Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I,Griffin, A.M., y Griffin, H.G.,eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York. 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Los procedimientos para determinar la identidad están diseñados para dar la mayor correspondencia entre las secuencias probadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad están codificados en programas informáticos disponibles públicamente. Los procedimientos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el programa GAP en el paquete informático GCG (Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12(1)387:(1984)). BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. y col, J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Para determinar la identidad puede usarse también el bien conocido algoritmo Smith Waterman.

Los parámetros para comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)

Penalización por hueco: 8

Penalización por longitud de hueco: 2

Un programa útil con estos parámetros está disponible públicamente como programa "hueco" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros por omisión para comparaciones de péptidos (con ausencia de penalizaciones para huecos terminales).

Los parámetros para comparación de polinucleótidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970)

Matriz de comparación: correspondencias = +10, no correspondencias = 0

Penalización por hueco: 50

Penalización por longitud de hueco: 3

Disponible como: programa "hueco" de Genetics Computer Group, Madison Wl. Éstos son los parámetros por omisión para comparaciones de ácidos nucleicos.

En (1) y (2) más adelante se proporciona un significado preferido para "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, según sea el caso.

(1) Las formas de realización de polinucleótidos incluyen además un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con respecto a la secuencia de referencia de ID SEC Nº 1, en la que dicha secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de ID SEC Nº 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótido en comparación con la secuencia de referencia en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción, de nucleótidos, y en la que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre dichas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en ID SEC Nº 1 por el número entero que define la identidad porcentual dividida por 100 y a continuación restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en ID SEC Nº 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en ID SEC Nº 1, y es de 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%, y \cdot es el símbolo el operador de multiplicación, y en el que cualquier número no entero producto de x_{n} por y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de ID SEC Nº 2 pueden crear mutaciones sin sentido, de sentido equívoco o de marco de lectura esta secuencia de codificación y, por tanto, alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido después de dichas alteraciones.

A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de ID SEC Nº 1, que puede ser idéntica al 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos en comparación con la secuencia de referencia de forma que la identidad porcentual es de identidad menor que el 100%. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción, de ácidos nucleicos y en las que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para una identidad porcentual dada se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en ID SEC Nº 1 por el número entero que define la identidad porcentual dividida por 100 y restando a continuación ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en ID SEC Nº 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y)

en la que n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en ID SEC Nº 1, y es, por ejemplo, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc., \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier número no entero producto de x_{n} e y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{n}.

(2) Las formas de realización de polipéptidos incluyen además un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con respecto a la secuencia de polipéptidos de referencia de ID SEC Nº 2, en la que dicha secuencia de polipéptidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de ID SEC Nº 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, en las que dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservadora y no conservadora, o inserción, de aminoácidos y en las que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los aminoácidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en las que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en ID SEC Nº 2 por el número entero que define la identidad porcentual dividido por 100 y a continuación restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en ID SEC Nº 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y)

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en ID SEC Nº 2 y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%: y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier número no entero producto de X_{a} e y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptidos de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de ID SEC Nº 2, que puede ser idéntica al 100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de manera que la identidad porcentual tiene identidad menor que el 100%. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservadora y no conservadora, o inserción, de aminoácidos y en la que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de referencia de polipéptidos o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para una identidad porcentual dada se determina multiplicando el número total de aminoácidos en ID SEC Nº 2 por el número entero que define la identidad porcentual dividido por 100 y restando a continuación ese producto de dicho número total de aminoácidos en ID SEC Nº 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y)

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en ID SEC Nº 2, y es, por ejemplo, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc, y \cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier número no entero producto de x_{a} e y se redondea hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de x_{a}.

"Individuo(s)", cuando se usa en la presente memoria descriptiva con referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitarse a, un metazoo, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" con respecto a su estado natural, es decir, si ocurre en la naturaleza, ha sido cambiado o extraído de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente naturalmente en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de sus materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", en el sentido del término que se emplea en la presente memoria descriptiva. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" aun cuando siga estando presente en dicho organismo, que puede estar vivo o no.

"Polinucleótido(s)" se refiere generalmente a cualquier polinucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado, incluyendo regiones monocatenarias y bicatenarias.

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero conserva sus propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante puede o no alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios en los nucleótidos pueden dar como resultado adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, según se expone más adelante. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares en total y, en muchas regiones, la variante idéntica y el polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no ser codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser de ocurrencia natural como una variante alélica, o puede ser una variante para la que no se conoce ocurrencia natural. Variantes de polinucleótidos y polipéptidos que no ocurren naturalmente pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis o por síntesis directa.

"Enfermedad(es)" significa cualquier enfermedad causada por o relacionada con infección por una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en lactantes y niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones hospitalarias y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de líquido en el oído medio, lesión del nervio auditivo, retardo en el aprendizaje del habla, infección de las vías respiratorias superiores e inflamación del oído medio.

Ejemplos

Los ejemplos que se muestran a continuación se realizan usando técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, salvo que se describa lo contrario en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Descubrimiento y secuenciación de ADN confirmatoria del gen BASB034 de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis

El gen BASB034 se descubrió por primera vez en la base de datos de Incyte PathoSeq que contiene secuencias de ADN genómico sin terminar de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis (también denominada Mc2931). La traducción de la secuencia de polinucleótidos BASB034 mostró una semejanza importante (identidad del 42% en un solapamiento de 214 aminoácidos) con la proteína de fosfolipasa A de membrana exterior de Klebsiella pneumoniae.

La secuencia del gen BASB034 se confirmó además experimentalmente. Para este fin, se extrajo ADN genómico de 10^{10} células de M. catarrhalis (cepa ATCC 43617) usando el kit de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen Gmbh), y 1 \mug de este material se sometió a amplificación de ADN por Reacción en Cadena de la polimerasa usando cebadores E481124 (5'- GAT TTA AGA GTA TGT TAT GAT G -3') [ID SEC Nº 9] y E481125 (5'- GTA TGG GTT GAT CAA ATA CAG -3') [ID SEC Nº 10]. Este producto de PCR se purificó en un aparato Biorobot 9600 (Qiagen Gmbh) y se sometió a secuenciación de ADN usando el kit de secuenciación Big Dye Cycle (Perkin-Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 377/PRISM. La secuenciación de ADN se realizó en ambas cadenas con una redundancia de 2 y se ensambló la secuencia de longitud completa usando el programa Sequencher^{TM} (Applied Biosystems). La secuencia de ADN resultante demostró ser idéntica al 100% con ID SEC Nº 1.

Ejemplo 2 Análisis de variabilidad del gen BASB034 entre varias cepas de Moraxella catarrhalis 2A: Análisis de longitud de fragmento de restricción (RFLP)

Se extrajo ADN genómico a partir de 16 cepas de M. catarrhalis (presentadas en la Tabla 1) según se describe a continuación.Se dividió M. catarrhalis en colonias únicas sobre placas de agar BHI y se cultivó durante toda la noche a 37°C. Se tomaron tres o cuatro colonias únicas y se usaron para inocular un cultivo de siembras de caldo BHI (infusión cerebro-corazón) de \sim1,5 ml que se cultivó durante toda la noche en una incubadora de agitación, \sim300 rpm, a 37°C. Se inoculó caldo BHI en un matraz erlenmeyer de 500 ml que contenía \sim150 ml de caldo BHI con el cultivo de siembras y se cultivó durante \sim12-16 horas a 37°C en una incubadora de agitación, \sim175 rpm, para generar masa celular para aislamiento de ADN. Se recogieron las células por centrifugado en un rotor GSA de Sorvall a \sim2.000 X g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y se suspendió el sedimento celular en \sim5,0 ml de agua estéril. Se añadió un volumen igual de tampón de lisis (NaCl 200 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, 0,5% (p/v) SDS, 2-mercaptoetanol al 0,5% (v/v) y 250 \mug/ml de proteinasa K) y se suspendieron las células por agitación suave y trituración. A continuación se incubó la suspensión celular durante \sim12 horas a 50°C para lisar las bacterias y liberar ADN cromosómico. Se precipitó el material proteináceo mediante la adición de 5,0 ml de NaCl saturado (\sim6,0 M, en agua estéril) y centrifugado a \sim5.500 x g en un rotor SS34 Sorvall a temperatura ambiente. Se precipitó ADN cromosómico a partir del sobrenadante aclarado por adición de dos volúmenes de etanol al 100%. Se recogió ADN agregado y se lavó usando agitación suave en un pequeño volumen de solución de etanol al 70%. Se suspendió ADN cromosómico purificado en agua estéril y se dejó que se disolviera/desembolsara durante toda la noche a 4°C por balanceo suave. Se determinó la concentración de ADN disuelto espectrofotométricamente a 260 nm usando un coeficiente de extinción de 1,0 unidades D.O. \sim50 \mug/ml.

Este material se sometió después a amplificación PCR usando los oligonucleótidos MC-Pla-BamF (5'- AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC CAA GCT GTA CCA AAT CCT GTG GCA TTT GTT G -3') [ID SEC Nº 11 ] y MC-PIa-SaIRC (5'- AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TAG ACC CAT CCA GTC GTT AAG CAT AAG -3') [ID SEC Nº 12]. A continuación se sometieron independientemente los amplicones de gen BASB034 correspondientes a hidrólisis usando enzimas de restricción (HphI, AluI, RsaI, EcoRV, Sau3AI) y se separaron los productos de restricción por electroforesis de gel de poliacrilamida o agarosa usando procedimientos estándar de biología molecular según se describe en "Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Segunda Edición, Eds: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Press 1989". The fotografías de los geles de electroforesis resultantes se muestran en la Figura 1. Para cada cepa, se valoraron y combinaron los patrones de RFLP correspondientes a las 6 enzimas de restricción. A continuación se definieron los grupos de cepas que compartían idéntica combinación de patrones de RFLP. Usando esta metodología, las cepas sometidas a ensayo en este estudio se encuadraron en 3 grupos genómicos (Grupo 1: Mc2931, Mc2904, Mc2905, Mc2907, Mc2909, Mc2910, Mc2911, Mc2912, Mc2926, Mc2931, Mc2956, Mc2969, Mc2975; Grupo 2: Mc2906, Mc2913; Grupo 3: Mc2908. (Mc2960 no pudo ser amplificado y, en consecuencia, no se clasificó). Estos datos apoyan que la población de Moraxella catarrhalis usada en este estudio muestra una diversidad limitada de secuencias de nucleótidos para el gen BASB034.

2B: Secuenciación de ADN en otras cepas

Usando el procedimiento experimental descrito en el Ejemplo 1, se determinó también la secuencia del gen BASB034 para tres cepas adicionales de Moraxella catarrhalis. Las secuencias de nucleótidos del gen BASB034 de las cepas Mc2908, Mc2913 y Mc2969, representativas de los tres grupos genómicos identificados previamente, se muestran en ID SEC Nº 3, 5 y 7, respectivamente. Estas secuencias de nucleótidos se tradujeron a secuencias de aminoácidos, que se muestran en ID SEC Nº 4, 6 y 8, respectivamente. Usando el programa MegAlign del paquete DNASTAR, se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias de nucleótidos de ID SEC Nº 1, 3, 5 y 7, que se muestra en la Figura 2. En la Tabla 2 se resume una comparación por pares de las identidades, que muestra que las cuatro secuencias génicas de nucleótidos BASB034 son todas similares a un nivel de identidad mayor que el 98%. Usando el mismo programa, se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias de proteínas de ID SEC Nº 2, 4, 6 y 8, que se muestra en la Figura 3. En la Tabla 3 se resume una comparación por pares de las identidades, mostrando que las cuatro secuencias génicas de nucleótidos BASB034 son todas similares a un nivel de identidad mayor que el 98%. Tomados en conjunto, estos datos indican una conservación muy intensa de secuencias del gen BASB034 entre cepas de Moraxella catarrhalis.

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TABLA 1 Características de las cepas de Moraxella catarrhalis usadas en este estudio

Cepa	Aislada en:	de:
Mc2904	EE.UU.	Timpanocentesis
Mc2905	EE.UU.	Timpanocentesis
Mc2906	EE.UU.	Timpanocentesis
Mc2907	EE.UU.	Timpanocentesis
Mc2908	EE.UU.	Otitis aguda, Timpanocentesis
Mc2909	EE.UU.	Timpanocentesis
Mc2910	EE.UU.	Timpanocentesis
Mc2911	EE.UU.	Otitis aguda, Timpanocentesis
Mc2912	EE.UU.	Otitis aguda, Timpanocentesis
Mc2913	EE.UU.	Otitis aguda, Timpanocentesis
Mc2926	EE.UU.	Timpanocentesis
Mc2931/ATCC 43617	EE.UU.	Aspirado transtraqueal
Mc2956	Finlandia	Líquido en el oído medio

TABLA 1 (continuación)

Cepa	Aislada en:	de:
Mc2960	Finlandia	Líquido en el oído medio
Mc2969	Noruega	Nasofaringe (faringitis-rinitis)
Mc2975	Noruega	Nasofaringe (rinitis)

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TABLA 2 Identidades por pares de las secuencias de polinucleótidos BASB034 (en %)

	ID SEC Nº 3	ID SEC Nº 5	ID SEC Nº 7
ID SEC Nº 1	98,7	99,2	99,7
ID SEC Nº 3		99,3	98,7
ID SEC Nº 5			99,1

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TABLA 3 Identidades por pares de las secuencias de polipéptidos BASB034 (en %)

	ID SEC Nº 4	ID SEC Nº 6	ID SEC Nº 8
ID SEC Nº 2	98,6	99,3	99,5
ID SEC Nº 4		98,9	99,1
ID SEC Nº 6			99,3

Ejemplo 3 Construcción de plásmido para expresar BASB034 recombinante A: Clonación de BASB034

Los sitios de restricción BamHI y SalI sometidos a ingeniería en los cebadores de amplificación directo ([ID SEC Nº 11]) e inverso ([ID SEC Nº 12]), respectivamente, permitieron la clonación direccional de un producto de PCR de BASB034 en el plásmido de expresión de E. coli disponible comercialmente pQE30 (QiaGen, resistente a ampicilina) de manera que pudo expresarse una proteína BASB034 madura en una proteína de fusión que contenía una etiqueta de cromatografía de afinidad (His)6 en el término N. Se purificó el producto de PCR de BASB034 de la reacción de amplificación usando columnas de giro basadas en gel de sílice (QiaGen) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Para producir los términos BamHI y SalI necesarios para la clonación, se digirió secuencialmente el producto de PCR purificado hasta terminación con enzimas de restricción BamHI y SalI según recomendaba el fabricante (Life Technologies). Después de la primera digestión de restricción, se purificó el producto de PCR mediante una columna de giro como antes para eliminar las sales y el eluido en agua estéril antes de la segunda digestión enzimática. Se purificó de nuevo el fragmento de ADN digerido usando columnas de giro basadas en gel de sílice antes de ligadura con el plásmido pQE30.

B: Producción de vector de expresión

Para preparar el plásmido de expresión pQE30 para ligadura, se digirió análogamente hasta terminación con BamHI y SalI y a continuación se trató con fosfatasa intestinal de ternero (CIP, \sim0,02 unidades/pmol de extremo 5', Life Technologies) según instrucciones del fabricante para evitar la autoligadura. Se usó aproximadamente un exceso molar de 5 veces del fragmento digerido para el vector preparado para programar la reacción de ligadura. Se realizó una reacción de ligadura estándar de \sim20 \mul (\sim16°C, \sim16 horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica usando ADN-ligasa T4 (\sim2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Se usó una parte alícuota de la ligadura (\sim5 \mul) para transformar células M15 (pREP4) electro-competentes según procedimientos bien conocidos en la técnica. Después de un período de crecimiento de \sim2 a 3 horas a 37°C en \sim1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se sometieron a electrodeposición en placas de agar LB que contenían kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml). Ambos antibióticos se incluyeron en los medios de selección para asegurar que todas las células transformadas llevaban tanto el plásmido pREP4 plásmido (KnR), que transporta el gen lacIq necesario para la represión de expresión para expresión de proteínas inducible por IPTG en pQE30, y el plásmido pQE30-BASB034 (ApR). Se incubaron las placas durante toda la noche a 37°C durante \sim16 horas. Se recogieron colonias KnR/ApR individuales con palillos estériles y se usaron para "parchear" placas nuevas de inoculación LB KnR/ApR, así como \sim1,0 ml de un cultivo de caldo LB KnR/ApR. Se incubaron las placas de parcheo y el cultivo de caldo durante toda la noche a 37°C en incubadora estándar (placas) o en un baño de agua de agitación.

Se empleó un análisis de PCR basado en células enteras para verificar que los transformantes contenían el inserto de ADN de BASB034. Aquí, se transfirió \sim1,0 ml de cultivo de caldo LB Kn/Ap de toda la noche a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y se recogieron las células por centrifugado en una microcentrífuga Beckman (\sim3 min, temperatura ambiente, \sim12.000 x g). Se suspendió el sedimento celular en \sim200 \mul de agua estéril y se usaron \sim10 \mul de parte alícuota para programar una reacción de PCR de \sim50 \mul de volumen final que contenía cebadores de amplificación directa e inversa de BASB034. Las concentraciones finales de los componentes de la reacción de PCR fueron esencialmente las mismas que las especificadas en el ejemplo 2, con la excepción de que se usaron \sim5,0 unidades de polimerasa Taq. Se aumentó la etapa de desnaturalización inicial de 95°C a 3 minutos para garantizar la interrupción térmica de las células bacterianas y la liberación de ADN de plásmido. Se usaron un ciclador térmico ABI Modelo 9700 y un perfil de amplificación térmica en tres etapas de 32 ciclos, es decir, 95°C, 45 seg; 55-58°C, 45 seg, 72°C, 1 min., para amplificar el fragmento de PCR de BASB034 a partir de las muestras transformantes lisadas. Después de amplificación térmica, se analizaron \sim20 \mul de parte alícuota de la reacción mediante electroforesis de gel de agarosa (0,8% agarosa en un tampón de Tris-acetato-EDTA (TAE)). Se visualizaron los fragmentos de ADN por iluminación UV después de electroforesis de gel y tinción con bromuro de etidio. Se sometió a electroforesis un ADN molecular de tamaño estándar (escalera de 1 Kb, Life Technologies) en paralelo con las muestras de prueba y se usó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Se identificaron los transformantes que produjeron el producto de PCR esperado como cepas que contenían un constructo de expresión de BASB034. A continuación se analizó la expresión del plásmido de expresión que contenía cepas para la expresión inducible de BASB034 recombinante.

C: Análisis de expresión de transformantes positivos en PCR

Por cada transformante positivo en PCR identificado anteriormente se inocularon \sim5,0 ml de caldo LB que contenía kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml) con células de la placa de parcheo y se cultivó durante toda la noche a 37°C con agitación (\sim250 rpm). Se inoculó una parte alícuota del cultivo de siembras de toda la noche (\sim 1,0 ml) en un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía \sim25 ml de caldo LB Kn/Ap y se cultivó a 37°C con agitación (\sim250 rpm) hasta que se alcanzó turbidez de cultivo D.O. 600 de \sim0,5, es decir, fase semilogarítmica (normalmente de 1,5 a 2,0 horas aproximadamente). En este momento se transfirió aproximadamente la mitad del cultivo (\sim12,5 ml) a un segundo matraz de 125 ml y se indujo expresión de proteína BASB034 recombinante por la adición de IPTG (reserva 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una concentración final de 1,0 mM. Se continuó con la incubación de los cultivos inducidos y no inducidos por IPTG durante \sim4 horas adicionales a 37°C con agitación. Se eliminaron las muestras (\sim1,0 ml) de cultivos inducidos y no inducidos después del período de inducción y se recogieron las células por centrifugado en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante \sim3 minutos. Se suspendieron sedimentos celulares individuales en \sim50 \mul de agua estéril, a continuación se mezcló con un volumen igual de tampón de muestra 2X Laemelli SDS-PAGE que contenía 2-mercaptoetanol, y se colocó en baño de agua en ebullición durante \sim3 min para desnaturalizar la proteína. Se cargaron volúmenes iguales (\sim15 \mul) de lisatos celulares inducidos y no inducidos por IPTG en gel duplicado de Tris al 12%/glicina poliacrilamida (Minigeles de 1 mm de espesor, Novex). Se sometieron a electroforesis muestras de lisados inducidas y no inducidas junto con marcadores preteñidos de peso molecular (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de carrera de SDS/Tris/glicina (BioRad). Después de electroforesis, se tiñó un gel con azul brillante de coomassie R250 (BioRad) y se destiñó para visualizar nueva o nuevas proteínas BASB034 inducibles por IPTG. Se electrotransfirió el segundo gel en una membrana PVDF (tamaño de poro de 0,45 micrómetros, Novex) durante \sim2 h a 4°C usando un aparato de transferencia BioRad Mini-Protean II y tampón de transferencia de metanol de Towbin (20%). El bloqueo de la membrana y las incubaciones de anticuerpos se realizaron según procedimientos bien conocidos en la técnica. Se usó un anticuerpo monoclonal anti-RGS (His)3, seguido de un segundo anticuerpo antirratón de conejo conjugado a HRP (QiaGen), para confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante BASB034. Se logró la visualización del patrón reactivo de anticuerpo anti-His usando un sustrato insoluble en ABT o usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de Amersham.

D: Confirmación de secuencias

Para verificar adicionalmente que la proteína BASB034 recombinante inducible por IPTG se está expresando en el marco de lectura abierta correcto y no en una molécula espuria que surge de un artefacto de la clonación (es decir, una mutación del marco de lectura), se determinó la secuencia de ADN del inserto clonado. Se obtuvo la secuencia de ADN del gen BASB034 de M. catarrhalis a partir de una cadena usando metodologías de secuenciación de ciclos de PCR asimétricas convencionales (ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer). Se programaron las reacciones de secuenciación con ADN de plásmido de expresión sin digerir (\sim0,5 \mug/rxn) como una plantilla y cebadores apropiados específicos del vector pQE30 y específicos de marco de lectura abierta (\sim3,5 pmol/rxn). Además de la plantilla y el cebador de secuenciación, cada reacción de secuenciación (\sim20 \mul) contenía las cuatro dNTP diferentes (es decir, A, G, C y T) y los cuatro nucleótidos terminadores de ddNTP correspondientes (es decir, ddA, ddG, ddC y ddT); con cada terminador conjugado con uno de los cuatro tintes fluorescentes, Joe, Tam, Rox o Fam. Se terminaron los productos de elongación de secuenciación monocatenarios en posiciones aleatorias a lo largo de la plantilla mediante la incorporación de los terminadores de ddNTP marcados por tinte. Se purificaron los productos de terminación fluorescentes marcados por tinte usando columnas de cromatografía de exclusión de tamaño de microcentrífuga (Princeton Genetics), se secaron al vacío, se suspendieron en un tampón de resuspensión de plantilla (Perkin-Elmer) para electroforesis capilar o en formamida desionizada para PAGE, de desnaturalizaron a 95°C durante \sim5 min, y se analizaron por electroforesis capilar de alta resolución (ABl 310 Automated ADN Sequenator, Perkin-Elmer) o PAGE de alta resolución (ABI 377 Automated ADN Sequenator), según recomienda el fabricante. Se recogieron los datos de secuencias de ADN producidos a partir de reacciones individuales y se analizaron automáticamente las intensidades máximas fluorescentes relativas en un ordenador PowerMAC usando el programa de análisis de secuencias ABI (Perkin-Elmer). Se editaron manualmente la secuencias de ADN autoanalizadas para ver su precisión antes de fundirlas en una "cadena" de secuencia monocatenaria de consenso usando el programa AutoAssembler (Perkin-Elmer). La secuenciación determinó que el plásmido de expresión contenía la secuencia correcta en el marco de lectura abierta correcto.

Ejemplo 4 Producción de BASB034 recombinante Cepa bacteriana

Se usó una cepa de expresión recombinante de E. coli M15 (pREP4) que contenía un plásmido (pQE30) que codifica BASB034 a partir de M. catarrhalis para producir masa celular para purificación de proteína recombinante. Se cultivó la cepa de expresión en placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de kanamicina ("Kn") y 100 \mug/ml de ampicilina ("Ap") para asegurar que se mantenían el plásmido de control IacIq de pREP4 y el constructo de expresión pQE30-BASB034. Para crioconservación a -80°C, se propagó la cepa en caldo LB que contenía la misma concentración de antibióticos y a continuación se mezcló con un volumen igual de caldo LB que contenía glicerol al 30% (p/v).

Medios

El medio de fermentación usado para la producción de proteína recombinante consistió en caldo 2X YT (Difco) que contenía 50 \mug/ml de Kn y 100 \mug/ml de Ap. Se añadió antiespumante al medio para el fermentador a 0,25 ml/l (Antifoam 204, Sigma). Para inducir expresión de la proteína recombinante BASB034 se añadió IPTG (Isopropil B-D-Tiogalactopiranosida) al fermentador (1 mM, final).

Fermentación

Se inoculó un matraz de siembra erlenmeyer de 500 ml, que contenía un volumen de trabajo de 50 ml, con 0,3 ml de cultivo congelado descongelado rápidamente, o varias colonias de un cultivo de placa agar selectivo, y se incubó durante aproximadamente 12 horas a 37 \pm 1°C en una plataforma de agitación a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Este cultivo de siembra se usó a continuación para inocular un fermentador de volumen de trabajo de 5 l que contenía caldo 2X YT y antibióticos Kn y Ap. Se activó el fermentador (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) a 37 \pm1°C, roción de aire de 0,2 a 0,4 VVM, 250 rpm en impulsores Rushton. El pH no se controló ni en el cultivo de siembra del matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación, el pH osciló entre 6,5 y 7,3 en el fermentador. Se añadió IPTG (reserva 1,0 M, preparada en agua estéril) al fermentador cuando el cultivo alcanzó un crecimiento semilogarítmico (\sim0,7 D.O. 600 unidades). Se indujeron células durante 2 a 4 horas y a continuación se recogieron por centrifugado usando una centrífuga de supervelocidad 28RS Heracus (Sepatech) o RC5C (Sorvall Instruments). La pasta celular se almacenó a -20°C hasta el tratamiento.

Purificación Productos químicos y materiales

El imidazol, clorhidrato de guanidina, Tris (hidroximetilo) y EDTA (ácido etilendiamintetraacético) de calidad de biotecnología o superior se obtuvieron de Ameresco Chemical, Solon, Ohio. Triton X-100 (t-octilfenoxipolietoxi-etanol), fosfato de sodio, monobásico, y urea fueron de calidad de reactivos o superior y se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. El ácido acético glacial y el ácido clorhídrico se obtuvieron de Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, Nueva Jersey. El metanol se obtuvo de Fisher Scientific, Fairlawn, Nueva Jersey. Pefabloc®SC (4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilfluoruro). Los comprimidos de cócteles inhibidores de proteasa completos y PMSF (fenilmetilsulfonilfluoruro) se obtuvieron de Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, Indiana. Bestatina, Pepstatina A y el inhibidor de proteasa E-64 se obtuvieron de Calbiochem, LaJolla, California. El tampón salino de fosfato de Dulbecco (1 x PBS) se obtuvo de Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland. El tampón salino de fosfato de Dulbecco (10 x PBS) se obtuvo de BioWhittaker, Walkersville, Maryland. El anticuerpo penta-His, sin BSA, se obtuvo de QiaGen, Valencia, California. La IgG antirratón de cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa se obtuvo de Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. La solución simple AEC se obtuvo de Zymed, South San Francisco, California. Todos los demás productos químicos fueron de calidad de reactivo o superior.

La resina Ni-NTA Superflow se obtuvo de QiaGen Inc., Valencia, California. Los geles de poliacrilamida Precast Tris-Glicina al 4-20% y al 10-20%, todos los tampones de carrera y las soluciones, los estándares preteñidos SeeBlue, los estándares multicolor MultiMark y las membranas de transferencia PVDF se obtuvieron de Novex, San Diego, California. Los kits de tinción de plata SDS-PAGE se obtuvieron de Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokio, Japón. La solución de tinción de coomassie se obtuvo de Bio-Rad Laboratories, Hercules, California. Los filtros de jeringuillas de 0,2 m Acrodisc® PF se obtuvieron de Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Los filtros de jeringuillas desechables de 25 mm GD/X se obtuvieron de Whatman Inc., Clifton, Nueva Jersey. Los tubos de diálisis de 8.000 MWCO se obtuvieron de BioDesign Inc. Od New York, Carmal, Nueva York. Los reactivos de ensayos de proteínas BCA y los tubos de diálisis Snake Skin de 3.500 MWCO se obtuvieron de Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois.

Protocolo de extracción

Se descongeló la pasta celular a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Se pesaron de 5 a 6 gramos de material en un tubo de centrífuga desechable de 50 ml. A éstos se añadieron 5 ml/g de tampón de clorhidrato de guanidina (Gu-HCl) se añadió tampón (clorhidrato de guanidina 6 M, fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 8,0). Se resuspendió la pasta celular usando un homogeneizador procientífico PRO300D, a 3/4 de potencia durante un minuto. A continuación se colocó la mezcla de extracción a temperatura ambiente con agitación suave durante 60 a 90 minutos. Después de 60 a 90 minutos se centrifugó la mezcla de extracción a 15.800 x g durante 15 minutos (centrífuga Sorvall RCSC, 11.500 rpm). Se decantó el sobrenadante (S1) y se guardó para purificación adicional. Se guardó el sedimento (P1) para análisis.

Unión de BASB034 a resina de níquel-NTA

A los 3 ó 4 ml de S1 de Ni-NTA se añadió resina. A continuación, se puso a temperatura ambiente con agitación suave durante una hora. Después de una hora se empaquetó el S1/Ni-NTA en una columna XK16 Pharmacia. A continuación se lavó la columna con tampón de Gu-HCl 1 M (clorhidrato de guanidina 1 M, fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 8,0). A continuación, esto se siguió de un lavado con tampón de fosfato (fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 6,3). A continuación se eluyó la proteína de la columna con un tampón de imidazol 250 mM (imidazol 250 mM, fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 5,9).

Formulación final

Se formuló BASB034 por diálisis durante toda la noche frente a tres cambios de Triton X-100 al 0,1% y 1 x PBS, pH 7,4, para eliminar Gu-HCl e imidazol residuales. Se caracterizó la proteína purificada y se usó para producir anticuerpos según se describe a continuación.

Caracterizaciones bioquímicas Análisis por SDS-PAGE e inmunotransferencia

Se resolvió la proteína purificada recombinante en geles de poliacrilamida al 4-20% y se transfirió electroforéticamente a membranas de PVDF a 100 V durante 1 hora según se ha descrito anteriormente (Thebaine y col. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). A continuación se pretrataron las membranas de PVDF con 25 ml de tampón salino de fosfato de Dulbecco que contenía leche en polvo desgrasada al 5%. Todas las incubaciones posteriores se realizaron usando este tampón de pretratamiento.

Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:500 de suero preinmune o suero inmune anti-His de conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las membranas de PVDF dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía cloruro de sodio 150 mM y Tween-20 al 0,05%). Se incubaron las membranas de PVDF con 25 ml de una dilución 1:5.000 de IgG anticonejo de cabra marcada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las membranas de PVDF 4 veces con tampón de lavado, y se desarrollaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea suministrado por Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada uno.

Los resultados de SDS-PAGE (Figura 4) muestran una proteína de 60 kDa aproximadamente que es reactiva a un anticuerpo anti-RGS(His) por transferencias Western (Figura 5) de SDS-PAGE.

Secuenciación de proteínas

Se realizó secuenciación de aminoácidos terminales en amino de la proteína purificada para confirmar la producción de la proteína recombinante correcta usando protocolos químicos bien definidos en un secuenciador de modelo G1000A de Hewlett-Packard con un modelo 1090 LC y un secuenciador de modelo 241 de Hewlett-Packard con un modelo 1100 LC.

Ejemplo 5 Producción de antisueros para BASB034 recombinante

Se generaron antisueros polivalentes dirigidos contra la proteína BASB034 mediante vacunación de dos conejos con la proteína recombinante purificada BASB034. Se dio a cada animal un total de tres inmunizaciones por vía intramuscular (i.m.) de 20 \mug aproximadamente de proteína BASB034 por inyección (empezando con adyuvante de Freund completo y seguido por adyuvante de Freund incompleto) en intervalos de 21 días aproximadamente. Se sangraron los animales antes de la primera inmunización ("presangrado") y en los días 35 y 57.

Se midieron valoraciones de proteína anti-BASB034 mediante ELISA usando proteína recombinante BASB034 purificada (0,5 \mug/pocillo). La valoración título se define como la más alta dilución igual o mayor que 0,1, calculada con la siguiente ecuación: DO promedio de dos muestras de prueba de antisueros - DO promedio de dos muestras de prueba de tampón. Las valoraciones después de tres inmunizaciones fueron de 1.000.000 aproximadamente.

Los antisueros se usaron como primer anticuerpo para identificar la proteína en una inmunotransferencia según se describe en el ejemplo 4 anterior. La inmunotransferencia muestra la presencia de anticuerpo anti-BASB034 en los sueros de animales inmunizados (Figura 6).

Ejemplo 6 Análisis de las regiones flanqueantes de no codificación del gen BASB034, y su aprovechamiento para expresión de gen BASB034 modulado

Las regiones flanqueantes de no codificación del gen BASB034 contienen elementos reguladores importantes en la expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto en el nivel de transcripción como en el de traducción. La secuencia de estas regiones, ya sean en secuencia ascendente o en secuencia descendente desde el marco de lectura abierta del gen, puede obtenerse por secuenciación de ADN. Esta información de secuencias permite la determinación de motivos reguladores potenciales como los diferentes elementos promotores, secuencias terminadoras, elementos de secuencias inducibles, represores, elementos responsables de la variación de fase, la secuencia Shine-Dalgarno, regiones con estructura secundaria potencial implicadas en la regulación, así como otros tipos de secuencias o motivos reguladores.

Esta información de secuencias permite la modulación de la expresión natural del gen BASB034. La regulación por incremento de la expresión génica puede lograrse alterando el promotor, la secuencia Shine-Dalgarno, el represor potencial o elementos operadores, o cualquier otro elemento implicado. Análogamente, la regulación por decremento de la expresión puede conseguirse mediante tipos de modificaciones similares. Alternativamente, cambiando las secuencias de variación de fase, la expresión del gen puede ponerse bajo control de variación de fase, o puede desacoplarse a partir de esta regulación. En otro planteamiento, la expresión del gen puede ponerse bajo el control de uno o más elementos inducibles que permiten la expresión regulada. Los ejemplos de dicha regulación incluyen, pero no se limitan a, inducción por cambios de temperatura, adición de sustratos de inductores como carbohidratos seleccionados o sus derivados, elementos traza, vitaminas, co-factores, iones metálicos, etc.

Dichas modificaciones según se describe anteriormente pueden introducirse mediante varios medios diferentes. La modificación de secuencias implicadas en la expresión génica puede realizarse in vivo por mutagénesis aleatoria seguida de selección para el fenotipo deseado. Otro planteamiento consiste en aislar la región de interés y modificarla por mutagénesis aleatoria, o mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de deleción o inserción. La región modificada puede reintroducirse a continuación en el genoma bacteriano por recombinación homóloga, y puede evaluarse el efecto en la expresión génica. En otro planteamiento, puede usarse el conocimiento de la secuencia de la región de interés para sustituir o suprimir la totalidad o parte de las secuencias reguladoras naturales. En este caso, la región reguladora diana se aísla y se modifica de manera que contenga los elementos reguladores de otro gen, una combinación de elementos reguladores de diferentes genes, una región reguladora sintética o cualquier otra región reguladora, o que suprima partes seleccionadas de las secuencias reguladoras silvestres. Estas secuencias modificadas pueden reintroducirse entonces en la bacteria a través de recombinación homóloga en el genoma. Una lista no exhaustiva de promotores preferidos que podrían usarse para regulación por incremento incluye el promotor porA, porB, lpbB, tbpB, p110, Ist, hpuAB de N. meningitidis o N. gonorroheae.

En un ejemplo, la expresión del gen puede modularse por cambio de su promotor por un promotor más fuerte (a través del aislamiento de la secuencia ascendente del gen, modificación in vitro de esta secuencia y reintroducción en el genoma mediante recombinación homóloga). La expresión regulada por incremento puede obtenerse tanto en la bacteria como en la envoltura de las vesículas de la membrana exterior (o prepararse) a partir de la bacteria. En otros ejemplos, los planteamientos descritos pueden usarse para generar cepas bacterianas recombinantes con características mejoradas para las aplicaciones de vacunas. Éstas pueden ser, pero no se limitan a, cepas atenuadas, cepas con expresión aumentada de antígenos seleccionados, cepas con noqueados (o expresión disminuida) de genes que interfieren en la respuesta inmunitaria, cepas con expresión modulada de proteínas inmunodominantes, cepas con envoltura modulada de vesículas de membrana exterior.

En la secuencia de ID SEC Nº 13 se proporciona una región directamente en secuencia ascendente del gen BASB034. Esta secuencia es un aspecto más de la invención.

Información de secuencias

Secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de BASB034

ID SEC Nº 1

Secuencia de polinucleótidos de BASB034 de Moraxella catarrhalis de cepa ATCC 43617

1

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ID SEC Nº 2

Secuencia de polipéptidos de BASB034 de Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de ID SEC Nº 1

2

\newpage

ID SEC Nº 3

Secuencia de polinucleótidos de BASB034 de Moraxella catarrhalis de cepa Mc2908

3

4

ID SEC Nº 4

Secuencia de polipéptidos de BASB034 de Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de ID SEC Nº 3

5

ID SEC Nº 5

Secuencia de polinucleótidos de BASB034 de Moraxella catarrhalis de cepa Mc2913

6

7

ID SEC Nº 6

Secuencia de polipéptidos de BASB034 de Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de ID SEC Nº 5

8

ID SEC Nº 7

Secuencia de polinucleótidos de BASB034 de Moraxella catarrhalis de cepa Mc2969

9

ID SEC Nº 8

Secuencia de polipéptidos de BASB034 de Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de ID SEC Nº 7

10

ID SEC Nº 9

11

ID SEC Nº 10

12

ID SEC Nº 11

13

ID SEC Nº 12

14

ID SEC Nº 13

15

Materiales depositados

Se ha depositado un depósito que contiene una cepa Catlin de Moraxella catarrhalis en la American Type Culture Collection (en la presente memoria descriptiva, "ATCC") el 21 de junio de 1997 y se le ha asignado el número de depósito 43.617. El depósito se describió como Branhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es una biblioteca de inserciones de 1,5 a 2,9 kb secadas por congelación construida a partir de aislado de M. catarrhalis a partir de un aspirado transtraqueal de un minero del carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents Chemother. 21:506-508 (1982).

El depósito de cepa de Moraxella catarrhalisse refiere en la presente memoria descriptiva como "la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen BASB034 de longitud completa.

Se ha depositado un depósito del vector pMC-PLA1 que consiste en ADN de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 en la American Type Culture Collection (ATCC) el 12 de febrero de 1999 y número de depósito asignado 207.099.

La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la cepa depositada, o en el clon depositado, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado en consecuencia, se están controlando por si hubiera algún conflicto con cualquier descripción de secuencias en la presente memoria descriptiva.

Los depósitos de la cepa/clon depositados se han hecho según los términos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con Fines de Procedimientos de Patente. Las cepas depositadas se liberarán irrevocablemente y sin restricción o condición al público en el momento de concesión de una patente. Las cepas depositadas se proporcionan meramente por comodidad para los expertos en la materia y no se supone que se requiere un depósito para su habilitación, según se requiere según 35 U.S.C. § 112.

<110> SmithKline Beecham Biologicals S.A.

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<120> Nuevos compuestos

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<130> BM45332

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<160> 13

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211>1329

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 1

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16

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211>442

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

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<400> 2

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17

18

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<210> 3

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<211>1329

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 3

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19

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211>442

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 4

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21

22

23

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<210> 5

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<211>1329

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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24

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<210> 6

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<211>442

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

\newpage

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<400> 6

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25

26

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<210> 7

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<211>1329

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 7

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27

28

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<210> 8

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<211>442

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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29

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de cebador

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatttaagag tatgttatga tg

\hfill

22

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<210> 10

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de cebador

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtatgggttg atcaaataca g

\hfill

21

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<210> 11

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<211> 58

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagggcccaa ttacgcagag gggatcccaa gctgtaccaa atcctgtggc atttgttg

\hfill

58

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<210> 12

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<211> 60

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagggcccaa ttacgcagag ggtcgactta ttatagaccc atccagtcgt taagcataag

\hfill

60

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 1000

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 13

31

Claims

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 e ID SEC Nº 8.

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1 que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 e ID SEC Nº 8.

3. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

4. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7.

5. Un vector de expresión o un microorganismo vivo recombinante que comprende un polinucleótido aislado según la reivindicación 3 ó 4.

6. Un microorganismo vivo recombinante que comprende un vector de expresión según la reivindicación 5.

7. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 5.

8. Una célula hospedadora de Moraxella catarrhalis que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento del mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) de suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente.

9. Una membrana exterior de un microorganismo recombinante de la reivindicación 6 que expresa un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8.

10. Una membrana exterior de un microorganismo recombinante que tiene una expresión regulada por incremento de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento del mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) de suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente.

11. Un procedimiento para producir un polipéptido según se define en las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación 7 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y la recuperación del polipéptido del medio de cultivo.

12. Un procedimiento para producir un fragmento inmunogénico del polipéptido según la reivindicación 1 ó 2 en el que el fragmento inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos desde la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 y que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, que comprende el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación 8 en condiciones suficientes para la producción de dicho fragmento inmunogénico y la recuperación del fragmento inmunogénico del medio de cultivo.

13. Un procedimiento para expresar un polinucleótido de la reivindicación 3 ó 4 que comprende la transformación de una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y el cultivo de dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

14. Un procedimiento para expresar un polinucleótido que codifica un fragmento inmunogénico del polipéptido según la reivindicación 1 ó 2 en el que el fragmento inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 y que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, que comprende la transformación de una célula hospedadora de Moraxella catarrhalis con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos, y el cultivo de dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

15. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento del mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) de suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7 en toda la longitud de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7, respectivamente, o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. La composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

18. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con respecto a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, en la que el fragmento se acopla a un vehículo y es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

19. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 85% con respecto a la de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7 en toda la longitud de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7, respectivamente; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado en la preparación de un medicamento para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

20. Un anticuerpo inmunoespecífico para el polipéptido de la reivindicación 1 ó 2.