ES2253911T3 - Polipeptidos basb034 de moraxella catarrhalis y uso de los mismos. - Google Patents
Polipeptidos basb034 de moraxella catarrhalis y uso de los mismos.Info
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Abstract
Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 e ID SEC Nº 8.
Description
Polipéptidos BASB034 de Moraxella
catarrhalis y uso de los mismos.
La presente invención se refiere a
polinucleótidos (en la presente memoria descriptiva denominados
"polinucleótido(s) BASB034"), polipéptidos codificados
por ellos (en la presente memoria descriptiva denominados
"BASB034" o "polipéptido(s) BASB034"), materiales
recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto,
la invención se refiere a procedimientos para usar dichos
polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra
infecciones bacterianas. En un aspecto más, la invención se refiere
a ensayos de diagnóstico para detectar infección de ciertos
patógenos.
Moraxella catarrhalis (también
llamada Branhamella catarrhalis) es una bacteria
Gram-negativa aislada frecuentemente en las vías
respiratorias superiores humanas. Es responsable de varias
patologías, las principales de las cuales son otitis media en
lactantes y niños y neumonía en ancianos. También es responsable de
sinusitis, infecciones hospitalarias y, menos frecuentemente,
enfermedades invasivas.
La otitis media es una importante enfermedad
infantil tanto por el número de casos como por sus secuelas
potenciales. En los Estados Unidos se registran más de 3,5 millones
de casos cada año, y se estima que el 80% de los niños han
experimentado al menos un episodio de otitis antes de llegar a la
edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis. 19:823). Si
no se trata, o si se cronifica, esta enfermedad puede llevar a
pérdidas de audición que podrían ser temporales (en el caso de
acumulación de líquido en el oído medio) o permanentes (si resulta
dañado el nervio auditivo). En lactantes, estas pérdidas de audición
pueden ser responsables de un retardo en el aprendizaje del
habla.
En el oído medio de niños con otitis media se
aíslan principalmente tres especies bacterianas: Streptoccocus
pneumoniae, Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi)
y M. catarrhalis. Están presentes en entre el 60 y el
90% de los casos. Una revisión de estudios recientes muestra que
S. pneumoniae y NTHi representan el 30% aproximadamente,
y M. catarrhalis el 15% aproximadamente de los casos
de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267).
Podrían aislarse otras bacterias del oído medio (H.
influenzae tipo B, S. pyogenes, etc.) pero a una
frecuencia mucho menor (el 2% de los casos o menos).
Los datos epidemiológicos indican que, para los
patógenos encontrados en el oído medio, la colonización de las vías
respiratorias superiores es un prerrequisito absoluto para el
desarrollo de una otitis; sin embargo, se requieren otros también
para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP y col. (1988) J.
lnfect. Dis. 158:205, Faden, HL y col. (1991) Ann.
Otorhinol. Laryngol. 100:612). Estos son importantes para
activar la migración de las bacterias hacia el oído medio a través
de las trompas de Eustaquio, seguido del inicio de un proceso
inflamatorio. Estos factores se desconocen hasta la fecha. Se ha
postulado que una anomalía transitoria del sistema inmunitario
después de una infección vírica, por ejemplo, podría causar una
incapacidad de controlar la colonización de las vías respiratorias
(Faden, HL y col. (1994) J. Infect. Dis. 169:1312). Una
explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales
permite una colonización más importante de algunos niños, que
posteriormente se vuelven susceptibles al desarrollo de otitis media
debido a la presencia sostenida de patógenos del oído medio
(Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267).
La respuesta inmunitaria a M.
catarrhalis se ha caracterizado deficientemente. El análisis de
cepas aisladas secuencialmente de la nasofaringe de bebés de 0 a 2
años de edad indica que contraen y eliminan frecuentemente nuevas
cepas. Esto indica que en los niños colonizados se monta una
respuesta inmunitaria eficaz frente a estas bacterias (Faden, HL y
col. (1994) J. Infect. Dis. 169:1312).
En la mayoría de los adultos sometidos a prueba
se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ y col.
(1985) J. Infect. Dis. 151:878). Las cepas de M.
catarrhalis presentan variaciones en su capacidad para
resistir la actividad bactericida sérica: en general, los aislados
de individuos enfermos son más resistentes que los que están
simplemente colonizados (Hol, C y col. (1993) Lancet
341:1281, Jordan, KL y col. (1990) Am. J. Med. 88 (supl.
5A):28S). La resistencia sérica podría considerarse, por tanto, un
factor de virulencia de las bacterias. Se ha observado una actividad
opsonizante en los sueros de niños que se recuperan de otitis
media.
Los antígenos diana para estas diferentes
respuestas inmunitarias en seres humanos no se han identificado,
con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión
está regulada por hierro, y que es reconocida por los sueros de
pacientes con neumonía (Sethi, S, y col. (1995) Infect.
Immun. 63:1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y col. (1999),
Infect. Imnun. 67:1310).
Algunas otras proteínas de membrana presentes en
la superficie de M. catarrhalis se han caracterizado
usando un procedimiento bioquímico, o por su implicación potencial
en la inducción de una inmunidad protectora (para revisión, ver
Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de
neumonía en ratones, la presencia de anticuerpos suscitados contra
algunos de ellos (UspA, CopB) favorece un aclaramiento más rápido
de la infección pulmonar. Otro polipéptido (OMP CD) se conserva
altamente entre cepas de M. catarrhalis, y presenta
homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que ha
demostrado eficacia contra esta bacteria en modelos animales.
La frecuencia de infecciones por Moraxella
catarrhalis ha aumentado espectacularmente en las últimas
décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de múltiples cepas
resistentes a los antibióticos y al aumento de población con
sistemas inmunitarios debilitados. Ya no es infrecuente aislar cepas
de Moraxella catarrhalis que son resistentes a algunos o a
todos los antibióticos estándar. Este fenómeno ha creado una
necesidad médica no satisfecha y una demanda de nuevos agentes
antimicrobianos, vacunas, procedimientos de detección selectiva de
fármacos y pruebas de diagnóstico para este organismo.
La presente invención se refiere a BASB034, en
particular polipéptidos BASB034 y polinucleótidos BASB034,
materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En
otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar
dichos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo prevención y
tratamiento de enfermedades microbianas, entre otros. En un aspecto
más, la invención se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar
enfermedades asociadas con infecciones microbianas y dolencias
asociadas con dichas infecciones, como ensayos para detectar
expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB034.
Varios cambios y modificaciones dentro del
espíritu y el alcance de la invención desvelada serán fácilmente
evidentes para los expertos en la materia a partir de la lectura de
las siguientes descripciones y de la lectura de las otras partes de
la presente descripción.
La invención se refiere a polipéptidos y
polinucleótidos BASB034 según se describe más adelante en mayor
detalle. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y
polinucleótidos BASB034 de Moraxella catarrhalis, que
están relacionados por homología de secuencias de aminoácidos con
proteína de fosfolipasa A de membrana exterior de Klebsiella
pneumoniae. La invención se refiere especialmente a BASB034 que
tienen las secuencias de aminoácidos y nucleótidos establecidas en
ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 y ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8, respectivamente. Se
entiende que las secuencias enumeradas en el Listado de Secuencias
más adelante como "ADN" representan una ilustración de una
forma de realización de la invención, dado que los expertos en la
materia reconocerán que dichas secuencias pueden emplearse con
utilidad en polinucleótidos en general, incluyendo
ribopolinucleótidos.
Según un aspecto de la presente invención se
proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID
SEC Nº 6 e ID SEC Nº 8.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica los polipéptidos de la invención.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un polinucleótido aislado que comprende el
polinucleótido de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un vector de expresión o un microorganismo vivo
recombinante que comprende un polinucleótido aislado según la
invención.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un microorganismo vivo recombinante que comprende un
vector de expresión según la invención.
Según un aspecto más de la presente invención se
proporciona una célula hospedadora que comprende un vector de
expresión según la invención.
Según un aspecto más de la presente invención se
proporciona una célula hospedadora de Moraxella catarrhalis
que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido
aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID
SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC
Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento del
mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a una célula
hospedadora de Moraxella catarrhalis que comprende un vector
de expresión que comprende un polinucleótido aislado que codifica
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene
identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID
SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº
6 e ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento del mismo capaz
(si es necesario cuando se acopla a un vehículo)) de suscitar una
respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID
SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente.
Según un aspecto más de la presente invención se
proporciona una membrana exterior de un microorganismo recombinante
de la invención que expresa un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID
SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8.
Según un aspecto más de la presente invención se
proporciona una membrana exterior de un microorganismo recombinante
que tiene expresión regulada por aumento de un polipéptido aislado
que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de
al menos el 85% con respecto a la secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en: ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o
ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC
Nº 8, respectivamente, o un fragmento del mismo capaz (si es
necesario cuando se acopla a un vehículo) de suscitar una respuesta
inmunitaria que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6
o ID SEC Nº 8, respectivamente.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un procedimiento para producir un polipéptido según se
define en la invención, que comprende cultivo de una célula
hospedadora de la invención en condiciones suficientes para la
producción de dicho polipéptido y recuperación del polipéptido del
medio de cultivo.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un procedimiento para producir un fragmento inmunogénico
del polipéptido según se reivindica en la invención en el que el
fragmento inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de
aminoácidos de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 y que es
capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario cuando
se acopla a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº
4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, que comprende
cultivo de una célula hospedadora de la invención en condiciones
suficientes para la producción de dicho fragmento inmunogénico y
recuperación del fragmento inmunogénico del medio de cultivo.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un procedimiento para expresar un polinucleótido de la
invención que comprende la transformación de una célula hospedadora
con un vector de expresión que comprende al menos uno de dicho
polinucleótido y el cultivo de dicha célula hospedadora en
condiciones suficientes para expresión de uno cualquiera de dichos
polinucleótidos.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un procedimiento para expresar un polinucleótido que
codifica un fragmento inmunogénico del polipéptido según se
reivindica en la invención en el que el fragmento inmunogénico
comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15
aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº
4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 y que es capaz de suscitar una
respuesta inmunitaria (si es necesario cuando se acopla a un
vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o
ID SEC Nº 8, respectivamente, que comprende la transformación de una
célula hospedadora de Moraxella catarrhalis con un vector de
expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos, y
cultivo de dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para
uno cualquiera de dichos polinucleótidos.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad
eficaz de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a
la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en
ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID
SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento
del mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) de
suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de
ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona una composición de vacuna que comprende una cantidad
eficaz de un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de
nucleótidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a
la de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7 en toda la longitud de
ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7, respectivamente, o una
secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido, y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona una composición de vacuna según la invención en la que
dicha composición comprende al menos otro antígeno de
Moraxella catarrhalis.
Según otro aspecto más de la presente invención
se proporciona una composición que comprende una cantidad
inmunológicamente eficaz de un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID
SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº
4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 respectivamente o un fragmento de un
polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene identidad de al menos el 85% con respecto a la secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID
SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC
Nº 6 o ID SEC Nº 8 respectivamente, en la que el fragmento se acopla
a un vehículo y es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria que
reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8
respectivamente.
Según un aspecto más de la presente invención se
proporciona una composición que comprende una cantidad
inmunológicamente eficaz de un polinucleótido aislado que comprende
una secuencia de nucleótidos que tiene identidad de al menos el 85%
con respecto a la de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7 en toda
la longitud de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7,
respectivamente, o una secuencia de nucleótidos complementaria a
dicho polinucleótido aislado en la preparación de un medicamento
para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un
animal.
En un aspecto de la invención se proporcionan
polipéptidos de Moraxella catarrhalis referidos en la
presente memoria descriptiva como "BASB034" y "polipéptidos
BASB034", así como variantes de los mismos útiles en términos
biológicos, diagnósticos, profilácticos, clínicos o terapéuticos, y
composiciones que comprenden los mismos.
La presente invención proporciona además:
(a) un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre ID SEC Nº 2, 4, 6 u
8;
(b) un polipéptido codificado por un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótido
del mismo; o
(c) un polipéptido codificado por un
polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótido
que codifica una secuencia de polipéptidos seleccionada entre ID
SEC Nº 2, 4, 6 u 8.
Los polipéptidos BASB034 proporcionados en ID SEC
Nº 2, 4, 6 u 8 son los polipéptidos BASB034 de las cepas de
Moraxella catarrhalis Mc2931 (ATCC 43617), Mc2908,
Mc2913 y Mc2969.
En formas de realización, la invención emplea un
fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB034, es decir, una
porción contigua del polipéptido BASB034 que tiene la misma o
sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido
que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8;
es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un
vehículo) es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria que
reconoce el polipéptido BASB034. Dicho fragmento inmunogénico puede
incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB034 carente de una
secuencia delantera terminal en N, y/o un dominio de transmembrana,
y/o un dominio de anclaje terminal en C. En un aspecto preferido,
el fragmento inmunogénico de BASB034 empleado por la invención
comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un
polipéptido que tiene identidad de al menos el 85%, preferentemente
identidad de al menos el 90%, más preferentemente identidad de al
menos el 95%, con la máxima preferencia identidad de al menos del
97 al 99%, con respecto a la ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 en toda la
longitud de ID SEC Nº 2.
Un fragmento es un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos que es completamente la misma que parte
pero no la totalidad de cualquier secuencia de aminoácidos de
cualquier polipéptido de la invención. En cuanto a polipéptidos
BASB0344, los fragmentos pueden estar "exentos" o comprendidos
dentro de un polipéptido mayor del cual forman una parte o región,
con la máxima preferencia como una región continua única en un único
polipéptido mayor.
Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo,
polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una
secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 o de variantes de
la misma, como, por ejemplo, una serie continua de residuos que
incluye una secuencia de aminoácidos terminal en amino y/o
carboxilo. Se prefieren también las formas de degradación de los
polipéptidos de la invención producidas por o en una célula
hospedadora. Se prefieren además fragmentos caracterizados por
atributos estructurales o funcionales como fragmentos que
comprenden regiones de hélice alfa y formadoras de hélice alfa,
regiones de hojas beta y formadoras de hojas beta, regiones de
giros y formadoras de giros, regiones de enrollamientos y formadoras
de enrollamientos, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas,
regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones
flexibles, regiones formadoras de superficies, regiones de unión a
sustrato y regiones de alto índice antigénico.
Los fragmentos más preferidos incluyen un
polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos a la
secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8, o un polipéptido
aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o
suprimidos de la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2, 4, 6 u
8.
Los fragmentos de los polipéptidos de la
invención pueden emplearse para producir el polipéptido
correspondiente de longitud completa para síntesis de péptidos; por
tanto, estos fragmentos pueden emplearse como productos intermedios
para producir los polipéptidos de longitud completa de la
invención.
Se prefieren particularmente variantes en las que
varios aminoácidos 5-10, 1-5,
1-3, 1-2 ó 1 son sustituidos,
suprimidos o añadidos en cualquier combinación.
Los polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos, de
o usados en la invención pueden estar en forma de la proteína
"madura" o pueden formar parte de una proteína mayor como un
precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir
una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias
delanteras o secretoras, prosecuencias, secuencias que ayudan en la
purificación como residuos múltiples de histidina, o una secuencia
adicional para estabilidad durante la producción recombinante. Por
otra parte, se considera también la adición de polipéptido exógeno
o secuencias de polinucleótidos o de cola de lípidos para aumentar
el potencial inmunogénico de la molécula final.
En un aspecto, la invención se refiere a
proteínas de fusión solubles obtenidas por ingeniería genética que
comprenden un polipéptido de la presente invención, y varias
porciones de las regiones constantes de cadenas ligeras o pesadas
de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Como
inmunoglobulina se prefiere la parte constante de una cadena pesada
de Ig humana, en particular IgG1, en la que la fusión tiene lugar
en la región de bisagra. En una forma de realización particular, la
parte Fc puede eliminarse simplemente por incorporación de una
secuencia de escisión que puede escindirse con factor de coagulación
sanguínea Xa.
Por otra parte, esta invención se refiere a
procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión por
ingeniería genética, y al uso de las mismas para detección selectiva
de fármacos, diagnóstico y terapia. Un aspecto más de la invención
se refiere también a polinucleótidos que codifican dichas proteínas
de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas
de fusión en las Solicitudes de Patente Internacional nº
WO94/29.458 y WO94/22.914.
Las proteínas pueden conjugarse químicamente, o
expresarse como proteínas de fusión recombinantes permitiendo
producir niveles aumentados en un sistema de expresión en
comparación con proteína no fundida. El compañero de fusión puede
ayudar a proporcionar epítopos T colaboradores (compañero de fusión
inmunológica), preferentemente epítopos T colaboradores reconocidos
por seres humanos, o ayudar a expresar la proteína (potenciador de
expresión) en rendimientos superiores a los de la proteína
recombinante nativa. Preferentemente, el compañero de fusión será
un compañero de fusión inmunológica y un compañero de potenciación
de la expresión.
Los compañeros de fusión incluyen proteína D
de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del
virus de influenza, NS1 (hemaglutinina). Otro compañero de fusión es
la proteína conocida como LytA. Preferentemente, se usa la parte
C-terminal de la molécula. LytA se obtiene de
Streptococcus pneumoniae que sintetiza la
N-acetil-L-alanina-amidasa,
LytA-amidasa (codificada por el gen LytA
{Gene, 43 (1986) página 265-272}), una
autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la columna
principal de peptidoglicano. El dominio C-terminal
de la proteína LytA es responsable de la afinidad a la colina o a
algunos análogos de colina como DEAE. Esta propiedad se ha
aprovechado para el desarrollo de C-LytA de E.
coli que expresa plásmidos útiles para la expresión de
proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas
híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su
término amino {Biotechnology: 10, (1992) página
795-798}. Es posible usar la parte de repetición de
la molécula LytA encontrada en el extremo C-terminal
que empieza en el residuo 178, por ejemplo, los residuos
188-305.
Los autores de la solicitud describen también
variantes de los polipéptidos anteriormente mencionados, es decir,
polipéptidos que varían con respecto a los referentes por
sustituciones de aminoácidos conservadoras, con lo que un residuo
se sustituye por otro de características similares. Dichas
sustituciones típicas se dan entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y
Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre
los residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
prepararse en cualquier modo adecuado. Dichos polipéptidos incluyen
polipéptidos aislados de ocurrencia natural, polipéptidos producidos
por medios recombinantes, polipéptidos producidos sintéticamente o
polipéptidos producidos por una combinación de estos procedimientos.
Los medios para preparar dichos polipéptidos son bien conocidos en
la técnica.
Lo más preferido es que un polipéptido de la
invención se obtenga de Moraxella catarrhalis, aunque puede
obtenerse preferentemente de otros organismos del mismo género
taxonómico. Un polipéptido de la invención puede obtenerse también,
por ejemplo, de organismos de la misma familia u orden
taxonómico.
Un objeto de la invención es proporcionar
polinucleótidos que codifican polipéptidos BASB034, en particular
polinucleótidos que codifican el polipéptido designado en la
presente memoria descriptiva como BASB034.
En una forma de realización de la invención
preferida en particular, el polinucleótido comprende una región que
codifica BASB034 que comprende una secuencia establecida en ID SEC
Nº 1, 3, 5 ó 7 que incluye un gen de longitud completa.
Los polinucleótidos BASB034 proporcionados en ID
SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 son los polinucleótidos BASB034 de las cepas de
Moraxella catarrhalis Mc2931 (ATCC 43617), Mc2908, Mc2913 y
Mc2969.
Como un aspecto más de la invención se
proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aislados que codifican
y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB034, en particular
polipéptidos y polinucleótidos BASB034 de Moraxella
catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, ARN sin procesar, ARN de
ribozimas, ARNm, ADNc, ADN genómicos, ADN-B y
ADN-Z. Otras formas de realización de la invención
incluyen polinucleótidos y polipéptidos útiles desde el punto de
vista biológico, diagnóstico, profiláctico, clínico o terapéutico, y
variantes de los mismos, y composiciones que comprenden los
mismos.
Otro aspecto de la invención se refiere a
polinucleótidos aislados, incluyendo al menos un gen de longitud
completa, que codifica un polipéptido BASB034 que tiene una
secuencia de aminoácidos deducida de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8.
En otra forma de realización de la invención
preferida particularmente existe un polipéptido BASB034 de
Moraxella catarrhalis que comprende, o consiste en, una
secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 o una variante de
la misma.
Usando la información proporcionada en la
presente memoria descriptiva, como una secuencia de polinucleótidos
establecida en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7, puede obtenerse un
polinucleótido de la invención que codifica polipéptido BASB034
usando procedimientos estándar de clonación y detección selectiva,
como los de clonación y secuenciación de fragmentos de ADN
cromosómicos a partir de bacterias que usan células de Moraxella
catarrhalis como material de partida, seguido por la obtención
de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una
secuencia de polinucleótidos de la invención, como una secuencia de
polinucleótidos dada en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7, normalmente se
sondea una biblioteca de clones de ADN cromosómico de Moraxella
catarrhalis en E. coli o algún otro hospedador adecuado
con un oligonucleótido radiomarcado, preferentemente de 17 mer o
más, obtenido de una secuencia parcial. Entonces pueden distinguirse
los clones que llevan ADN idéntico al de la sonda usando
condiciones estrictas de hibridación. Al secuenciar los clones
individuales así identificados por hibridación con cebadores de
secuenciación diseñados a partir de la secuencia original de
polipéptidos o polinucleótidos es posible extender la secuencia de
polinucleótidos en ambas direcciones para determinar una secuencia
génica de longitud completa. Convenientemente, dicha secuenciación
se realiza, por ejemplo, usando ADN bicatenario desnaturalizado
preparado a partir de clon de plásmido. Se describen técnicas
adecuadas en Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook y col.,
MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed.; Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) (ver
en particular Screening By Hybridization 1.90 y Sequencing
Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70).
Puede realizarse también secuenciación directa de ADN genómico para
obtener una secuencia génica de longitud completa. Ilustrativo de la
invención, cada polinucleótido establecido en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7
se descubrió en una biblioteca de ADN obtenida de Moraxella
catarrhalis.
Además, cada secuencia de ADN establecida en ID
SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 contiene un marco de lectura abierta que
codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de
residuos de aminoácidos establecidos en ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 con
un peso molecular deducido que puede calcularse usando valores de
pesos moleculares de residuos de aminoácidos bien conocidos por los
expertos en la materia.
El polinucleótido de ID SEC Nº 1, entre el codón
de iniciación en el número de nucleótido 1 y el codón de parada que
empieza en el número de nucleótido 1.327 de ID SEC Nº 1, codifica el
polipéptido de ID SEC Nº 2.
El polinucleótido de ID SEC Nº 3, entre el codón
de iniciación en el número de nucleótido 1 y el codón de parada que
empieza en el número de nucleótido 1.327 de ID SEC Nº 3, codifica el
polipéptido de ID SEC Nº 4.
El polinucleótido de ID SEC Nº 5, entre el codón
de iniciación en el número de nucleótido 1 y el codón de parada que
empieza en el número de nucleótido 1.327 de ID SEC Nº 5, codifica el
polipéptido de ID SEC Nº 6.
El polinucleótido de ID SEC Nº 7, entre el codón
de iniciación en el número de nucleótido 1 y el codón de parada que
empieza en el número de nucleótido 1.327 de ID SEC Nº 7, codifica el
polipéptido de ID SEC Nº 8.
En un aspecto más, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que comprende o consiste
en:
(a) una secuencia de polinucleótidos que
comprende la secuencia de ID SEC Nº 1. 3, 5 ó 7; o
(b) una secuencia de polinucleótidos que codifica
un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC
Nº 2, 4, 6 u 8.
Puede obtenerse un polinucleótido que codifica un
polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y
ortólogos de especies distintas de Moraxella
catarrhalis , mediante un procedimiento que comprende las
etapas de detección selectiva de una biblioteca apropiada según
condiciones estrictas de hibridación (por ejemplo, usando una
temperatura en el intervalo de 45 a 65°C y una concentración de SDS
del 0,1 al 1%) con una sonda marcada o detectable constituida por o
que comprende la secuencia de ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 o un fragmento
de la misma; y aislamiento de clones génicos y/o genómicos de
longitud completa que contienen dicha secuencias de
polinucleótidos.
La invención proporciona una secuencia de
polinucleótidos idéntica en toda su longitud a una secuencia de
codificación (marco de lectura abierta) en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7.
También se proporciona mediante la invención una secuencia de
codificación para un polipéptido maduro o un fragmento del mismo,
por sí mismo así como una secuencia de codificación para un
polipéptido maduro o un fragmento en marco de lectura con otra
secuencia de codificación, como una secuencia que codifica una
secuencia delantera o secretora, una secuencia pre- o pro- o
prepro-proteína. El polinucleótido de la invención
puede contener también al menos una secuencia de no codificación,
incluyendo por ejemplo, pero sin limitarse a, al menos una secuencia
de no codificación en 5' y 3', como secuencias transcritas pero no
traducidas, señales de terminación (como señales de terminación
dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión a
ribosomas, secuencias de Kozak, secuencias que estabilizan ARNm,
intrones y señales de poliadenilación. La secuencia de
polinucleótidos puede comprender también secuencia de codificación
adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, puede
codificarse una secuencia de marcador que facilita la purificación
del polipéptido fusionado. En ciertas formas de realización de la
invención, la secuencia de marcador es un péptido de hexahistidina,
como el proporcionado en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y descrito en
Gentz y col. Proc. Natl. Acad. Sci., USA
86:821-824 (1989), o una etiqueta de péptido HA
(Wilson y col., Cell 37:767 (1984), siendo ambos útiles para
purificar la secuencia de polipéptidos fusionada con ellos. Los
polinucleótidos de la invención incluyen también, pero sin limitarse
a, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus
secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión
génica.
La secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido BASB034 de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8 puede ser idéntica al
polipéptido que codifica la secuencia contenida en los nucleótidos 1
a 1.326 de ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7, respectivamente.
Alternativamente, puede ser una secuencia que, como resultado de la
redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el
polipéptido de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8.
El término "polinucleótido que codifica un
polipéptido" según se usa en la presente memoria descriptiva
comprende polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica
unpolipéptido de la invención, en particular un polipéptido
bacteriano y más particularmente un polipéptido BASB034 de
Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos
establecida en ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8. El término abarca también
polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones
discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo,
polinucleótidos interrumpidos por fago integrado, una secuencia de
inserción integrada, una secuencia de vectores integrada, una
secuencia de transposones integrada, o debido a edición de ARN o
reorganización de ADN genómico) junto con regiones adicionales, que
pueden contener también secuencias de codificación y/o no
codificación.
La invención se refiere además a variantes de los
polinucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva que
codifican variantes de un polipéptido que tiene un secuencia de
aminoácidos deducida de ID SEC Nº 2, 4, 6 u 8. Pueden usarse
fragmentos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, para
sintetizar polinucleótidos de la invención de longitud
completa.
Formas de realización particularmente preferidas
son polinucleótidos que codifican variantes BASB034, que tienen la
secuencia de aminoácidos de polipéptido BASB034 de ID SEC Nº 2, 4, 6
u 8 en la que varios, algunos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1
o ningún residuo de aminoácidos están sustituidos, modificados,
suprimidos y/o añadidos en cualquier combinación. Entre éstos se
prefieren especialmente sustituciones, adiciones y deleciones
silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del
polipéptido BASB034.
Los aspectos de la invención emplean
polinucleótidos que son idénticos en al menos el 85% en toda su
longitud a un polinucleótido que codifica polipéptido BASB034 que
tiene una secuencia de aminoácidos establecida en ID SEC Nº 2, 4, 6
u 8, y polinucleótidos que son complementarios a dichos
polinucleótidos. Alternativamente, se prefieren de forma
predominante los polinucleótidos que comprenden una región que es
idéntica en al menos el 90% en toda su longitud a un polinucleótido
que codifica polipéptido BASB034 y polinucleótidos complementarios
al mismo. A este respecto, se prefieren en particular
polinucleótidos idénticos en al menos el 95% en toda su longitud.
Por otra parte, los que tienen al menos el 97% son altamente
preferidos entre los que tienen al menos el 95%, y entre éstos los
que tienen al menos el 98% y al menos el 99% son en particular
altamente preferidos, siendo los más preferidos los de al menos el
99%.
Son formas de realización preferidas los
polinucleótidos que codifican polipéptidos que conservan
sustancialmente la misma función o actividad biológica que el
polipéptido maduro codificado por un ADN de ID SEC Nº 1, 3, 5 ó
7.
Según ciertas formas de realización preferidas de
esta invención se proporcionan polinucleótidos que hibridan, en
particular en condiciones estrictas, a secuencias de polinucleótidos
BASB034, como los polinucleótidos en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7.
La invención emplea además polinucleótidos que
hibridan a las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la
presente memoria descriptiva. A este respecto, la invención emplea
especialmente polinucleótidos que hibridan en condiciones estrictas
a los polinucleótidos descritos en la presente memoria descriptiva.
Según se usa en la presente memoria descriptiva, los términos
"condiciones estrictas" y "condiciones de hibridación
estrictas" significan que la hibridación se produce sólo si
existe identidad de al menos el 95% y preferentemente de al menos
el 97% entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de
hibridación estrictas es incubación durante toda la noche a 42°C en
una solución que comprende: formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 150 mM,
citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x
solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20
microgramos/ml de ADN de esperma de salmón triturado
desnaturalizado, seguido de lavado del soporte de hibridación en
0,1 x SSC a 65°C aproximadamente. Las condiciones de hibridación y
de lavado son bien conocidas y están ilustradas en Sambrook, y
col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda
Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), en particular el
Capítulo 11 del mismo. La hibridación de solución puede usarse
también con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la
invención.
Los aspectos de la invención emplean también un
polinucleótido que consiste en o que comprende secuencias de
polinucleótidos obtenidas por detección selectiva de una biblioteca
apropiada que contiene el gen completo para secuencias de
polinucleótidos establecidas en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 en condiciones
de hibridación estrictas con una sonda que tiene la secuencia de
dichas secuencias de polinucleótidos establecidas en ID SEC Nº 1,
3, 5 ó 7 o un fragmento de las mismas; y aislamiento de dicha
secuencia de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener un
polinucleótido semejante incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores
descritos completamente en otra parte de la presente memoria
descriptiva.
Según se expone en otra parte de la presente
memoria descriptiva con respecto a ensayos de polinucleótidos de la
invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, pueden
usarse como sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para
aislar ADNc y clones genómicos de longitud completa que codifican
BASB034 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que
tienen una alta identidad, en particular alta identidad de
secuencia, con respecto al gen BASB034. Dichas sondas comprenderán
generalmente al menos 15 residuos de nucleótidos o pares de bases.
Preferentemente, dichas sondas tendrán al menos 30 residuos de
nucleótidos o pares de bases y pueden tener al menos 50 residuos de
nucleótidos o pares de bases. Las sondas preferidas particularmente
tendrán al menos 20 residuos de nucleótidos o pares de bases y
tendrán menos de 30 residuos de nucleótidos o pares de bases.
Una región de codificación de un gen BASB034
puede aislarse por detección selectiva usando una secuencia de ADN
proporcionada en ID SEC Nº 1, 3, 5 ó 7 para sintetizar una sonda de
oligonucleótido. Se usa entonces un oligonucleótido marcado que
tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención
para detectar selectivamente una biblioteca de ADNc, ADN genómico o
ARNm para determinar a qué miembros de la biblioteca hibrida la
sonda.
Existen varios procedimientos disponibles y bien
conocidos por los expertos en la materia para obtener ADN de
longitud completa, o extender ADN cortos, por ejemplo los basados en
el procedimiento de Amplificación Rápida de extremos de ADNc (RACE)
(ver, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA
85:8998-9002, 1988). Recientes modificaciones de la
técnica, ilustradas por la tecnología Marathon^{TM} (Clontech
Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado
significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología
Marathon^{TM}, los ADNc se han preparado a partir de ARNm
extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora"
ligada en ambos extremos. A continuación se efectúa amplificación
de ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5'
"desaparecido" del ADN usando una combinación de cebadores de
oligonucleótidos específicos del gen y específicos del adaptador. A
continuación se repite la reacción PCR usando cebadores
"anidados", es decir, cebadores diseñados para apareamiento
con el producto amplificado (normalmente, un cebador específico de
adaptador que aparea más 3' en la secuencia adaptadora y un cebador
específico de gen que aparea más 5' en la secuencia de gen
seleccionada). A continuación pueden analizarse los productos de
esta reacción mediante secuenciación de ADN y un ADN de longitud
completa construido por unión del producto directamente al ADN
existente para dar una secuencia completa, o efectuar una PCR de
longitud completa independiente usando la nueva información de
secuencia para el diseño del
cebador 5'.
cebador 5'.
Los polinucleótidos y polipéptidos de la
invención pueden emplearse, por ejemplo, como reactivos de
investigación y materiales para el descubrimiento de tratamientos y
diagnóstico de enfermedades, en particular enfermedades humanas,
como se expone más adelante en la presente memoria descriptiva en
relación con ensayos de polinucleótidos.
Los polinucleótidos de la invención que son
oligonucleótidos obtenidos de una secuencia de ID SEC Nº 1 a 8
pueden usarse en los procedimientos de la presente memoria
descriptiva según se describe, pero preferentemente para PCR, para
determinar si los polinucleótidos identificados en la presente
memoria descriptiva se transcriben o no, en parte o en la
totalidad, en bacterias en tejido infectado. Se reconoce que dichas
secuencias tendrán también utilidad en el diagnóstico de la fase de
infección y el tipo de infección que ha alcanzado el patógeno.
La invención también proporciona polinucleótidos
que codifican un polipéptido que es la proteína madura más
aminoácidos adicionales con terminal amino o carboxilo, o
aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma
madura tiene más de una cadena de polipéptidos, por ejemplo). Dichas
secuencias pueden jugar un rol en el tratamiento de una proteína a
partir de precursor a una forma madura, pueden permitir transporte
de proteínas, pueden alargar o acortar la semivida de las proteínas
o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o
producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in
vivo, los aminoácidos adicionales pueden tratarse a partir de
la proteína madura por enzimas celulares.
Para todos y cada uno de los polinucleótidos de
la invención se proporciona un polinucleótido complementario a él.
Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean
totalmente complementarios a cada polinucleótido del que son
complementarios.
Una proteína precursora, que tiene una forma
madura del polipéptido fusionado con una o más prosecuencias, puede
ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se eliminan las
prosecuencias, en general dichos precursores inactivos se activan.
Parte o la totalidad de las prosecuencias puede eliminarse antes de
la activación. En general, dichos precursores se denominan
proproteínas.
Además de las representaciones estándar A, G, C,
T/U para nucleótidos, el término "N" puede usarse también para
describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N"
significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN
puede aparecer en dicha posición designada en la secuencia de ADN o
ARN, con la excepción de que se prefiere que N no sea un ácido
nucleico que cuando se toma en combinación con posiciones de
nucleótido adyacentes, cuando se lee en el marco de lectura
correcto, tendría el efecto de generar un codón de terminación
prematuro en dicho marco de lectura.
En suma, un polinucleótido de la invención puede
codificar una proteína madura, una proteína madura más una
secuencia delantera (que puede referirse como preproteína), un
precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias
que no son secuencias delanteras de una preproteína o una
preproproteína, que es un precursor a una proproteína, que tiene
una secuencia delantera y una o más prosecuencias, que generalmente
se eliminan durante el etapas de tratamiento que producen formas
activas y maduras del polipéptido.
Según un aspecto de la invención, se proporciona
el uso de un polinucleótido de la invención para fines terapéuticos
o profilácticos, en particular inmunización genética.
El uso de un polinucleótido de la invención en
inmunización genética empleará preferentemente un procedimiento de
suministro adecuado como inyección directa de ADN de plásmido en los
músculos (Wolff y col., Hum. Mol. Genet. (1992) 1:363,
Manthorpe y col., Hum. Gene Ther. (1983) 4:419), suministro
de ADN con formación de complejo con vehículos específicos de
proteínas (Wu y col., J. Biol., Chem. (1989) 264:16985),
coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenisty y Reshef,
PNAS USA, (1986) 83:9551), encapsulado de ADN en diversas
formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243:375),
bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356:152,
Eisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12:791) e infección
in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y
col., PNAS USA (1984) 81:5849).
La invención se refiere también a vectores que
comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención,
células hospedadoras que son sometidas a ingeniería genética con
vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la
invención por técnicas recombinantes. También pueden emplearse
sistemas de traducción libres de células para producir dichas
proteínas usando ARN obtenidos de los constructos de ADN de la
invención.
Los polipéptidos recombinantes de la presente
invención pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos
por los expertos en la materia a partir de células hospedadoras
sometidas a ingeniería genética que comprenden sistemas de
expresión. En consecuencia, en un aspecto más, la presente invención
se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido
o polinucleótidos de la presente invención, a células hospedadoras
que son sometidas a ingeniería genética con dichos sistemas de
expresión y a la producción de polipéptidos de la invención por
técnicas recombinantes.
Para producción recombinante de los polipéptidos
de la invención, pueden someterse a ingeniería genética células
hospedadoras para incorporar sistemas de expresión o porciones de
los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un
polinucleótido en la célula hospedadora puede efectuarse mediante
procedimientos descritos en numerosos manuales de laboratorio
estándar, como Davis, y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
(1986) y Sambrook, y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y. (1989), como transfección de fosfato de calcio,
transfección mediada por DEAE-dextrano,
transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos
catiónicos, electroporación, transducción, carga de raspaduras,
introducción balística e infección.
Los ejemplos representativos de hospedadores
apropiados incluyen células bacterianas, como células de
estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli,
Streptomyces, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria
meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas,
como células de levadura, Kluveromyces, Saccharomyces,
basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de
insecto como célula de Drosophila S2 y Spodoptera
Sf9; células animales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3,
BHK, 293, CV-1 ycélulas de melanoma de Bowes; y
células vegetales, como células de una gimnosperma o una
angiosperma.
Puede usarse una gran variedad de sistemas de
expresión para producir los polipéptidos de la invención. Dichos
vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episómicos y
derivados de virus como, por ejemplo, vectores derivados de
plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de
episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos
cromosómicos de levadura, de virus como baculovirus, virus papova,
como SV40, virus vaccinia, adenovirus, poxvirus de viruela aviar,
virus de pseudorrabia, picornavirus, retrovirus y alfavirus y
vectores derivados de combinaciones de los mismos, como los
derivados de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, como
cósmidos y fagémidos. Los constructos del sistema de expresión
pueden contener regiones de control que regulan y engendran
expresión. En general, cualquier sistema o vector adecuado para
mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un
polipéptido en un huésped puede usarse para expresión a este
respecto. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el
sistema de expresión mediante cualquier variedad de técnicas
rutinarias y bien conocidas, como, por ejemplo, las establecidas en
Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (más
arriba).
En sistemas de expresión recombinantes en
eucariotas, para secreción de una proteína traducida en la luz del
retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno
extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas
en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al
polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares
recombinantes mediante procedimientos bien conocidos, incluyendo
precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción ácida,
cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de
fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba,
cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatito y
cromatografía de lecitina. Con la máxima preferencia, se emplea
cromatografía de afinidad por ion metálico (IMAC) para purificación.
Pueden emplearse técnicas bien conocidas para replegar proteínas al
objeto de regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se
desnaturaliza durante la síntesis, aislamiento o purificación
intracelular.
El sistema de expresión puede ser también un
microorganismo vivo recombinante, como un virus o una bacteria. El
gen de interés puede insertarse en el genoma de un virus o bacteria
recombinante vivo. La inoculación y la infección in
vivo con este vector vivo llevará a expresión in vivo
del antígeno e inducción de respuestas inmunitarias. Los virus
y bacterias usados para este fin son, por ejemplo: poxvirus (por
ejemplo, vaccinia, de viruela aviar, de viruela del canario),
alfavirus (virus de Sindbis, virus del bosque de Semliki, virus de
encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adenoasociados,
picornavirus (poliovirus, rinovirus), herpesvirus (virus de
varicela-zóster, etc), Listeria,
Salmonella, Shigella, BCG. Estos virus y bacterias
pueden ser virulentos o atenuados de diversas formas para obtener
vacunas vivas. Dichas vacunas vivas forman también parte de la
invención.
Pueden usarse polipéptidos y polinucleótidos de
la invención o variantes de los mismos, o células que expresan los
mismos como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos
para dichos polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente.
En ciertas formas de realización preferidas de la
invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos
BASB034.
BASB034.
Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los
polipéptidos o polinucleótidos de la invención por administración
de los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o
fragmentos portadores de epítopos de uno o ambos, análogos de uno o
ambos, o células que expresan uno o ambos, a un animal,
preferentemente no humano, usando protocolos de rutina. Para
preparar anticuerpos monoclonales puede usarse cualquier técnica
conocida en la técnica que proporciona anticuerpos producidos por
cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen
diversas técnicas, como las de Kohler, G. y Milstein, C.,
Nature 256:495-497 (1975); Kozbor y col.,
Immunology Today 4:72 (1983); Cole y col.,pág.
72-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER
THERAPY, Alan R. Liss, Inc.
(1985).
(1985).
Las técnicas para la producción de anticuerpos
monocatenarios (patente de EE.UU. nº 4.946.778) pueden adaptarse
para producir anticuerpos monocatenarios a polipéptidos o
polinucleótidos de esta invención. Además, pueden usarse ratones
transgénicos, u otros organismos o animales, como otros mamíferos,
para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos para los
polipéptidos o polinucleótidos de la invención.
Alternativamente, puede utilizarse tecnología de
exhibición de fagos para seleccionar genes de anticuerpos con
actividades de unión hacia un polipéptido de la invención ya sea a
partir de repertorios de genes v amplificados por PCR de linfocitos
de seres humanos detectados selectivamente por poseer
anti-BASB034 o a partir de bibliotecas nuevas
(McCafferty, y col., (1990), Nature 348,
552-554; Marks, y col., (1992) Biotechnology
10,779-783). La afinidad de estos anticuerpos
puede mejorarse también, por ejemplo, mediante purgado de cadena
(Clackson y col., (1991) Nature 352:628).
Los anticuerpos descritos anteriormente pueden
emplearse para aislar o identificar clones que expresan los
polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los
polipéptidos o polinucleótidos, por ejemplo, mediante cromatografía
de afinidad.
Así, entre otros, pueden emplearse anticuerpos
contra polipéptido BASB034 o polinucleótido BASB034 para tratar
infecciones, en particular infecciones bacterianas.
Las variantes de polipéptido incluyen variantes
equivalentes antigénica, epitópica o inmunológicamente que forman
un aspecto particular de esta invención.
Preferentemente, el anticuerpo o variante del
mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo.
Por ejemplo, si el individuo es humano, el anticuerpo puede
"humanizarse" con la máxima preferencia, en el que la región o
regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado
de hibridoma se han trasplantado a un anticuerpo monoclonal humano,
por ejemplo, según se describe en Jones y col. (1986), Nature
321:522-525 o Tempest y col., (1991)
Biotechnology 9, 266-273.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un
individuo, en particular un mamífero, preferentemente un ser
humano, que comprende la inoculación en el individuo de
polinucleótido y/o polipéptido BASB034, o un fragmento o variante de
los mismos, adecuada para producir anticuerpo y/o respuesta
inmunitaria a células T para proteger a dicho individuo de la
infección, en particular infección bacteriana y más en particular
infección por Moraxella catarrhalis. También se proporcionan
procedimientos en los que dicha respuesta inmunológica ralentiza la
replicación bacteriana. Otro aspecto más de la invención se refiere
a un procedimiento para inducir respuesta inmunológica en un
individuo que comprende el suministro a dicho individuo de un
vector de ácidos nucleicos, secuencia o ribozima para dirigir la
expresión de polinucleótido y/o polipéptido BASB034, o un fragmento
o una variante de los mismos, para expresar polinucleótido y/o
polipéptido BASB034, o un fragmento o una variante de los mismos
in vivo para inducir una respuesta inmunológica, como, por
ejemplo, para producir anticuerpo y/o respuesta inmunitaria a
células T, incluyendo, por ejemplo, células T productoras de
citoquina o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo,
preferentemente un ser humano, de la enfermedad, ya se haya esa
enfermedad establecido en el individuo o no. Un ejemplo de
administración del gen consiste en acelerarlo en las células
deseadas como un revestimiento en partículas u otros. Dicho vector
de ácidos nucleicos puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un
ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo de
ADN-proteína o un complejo de
ARN-proteína.
Un aspecto más de la invención se refiere a una
composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo,
preferentemente un ser humano, susceptible de haber inducido en él
una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en
dicho individuo a un polinucleótido y/o polipéptido BASB034
codificado a partir de los mismos, en el que la composición
comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB034 recombinante
codificado a partir de los mismos y/o comprende ADN y/o ARN que
codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido BASB034,
polipéptido codificado a partir del mismo u otro polipéptido de la
invención. La respuesta inmunológica puede usarse terapéutica o
profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpo
y/o inmunidad celular, como inmunidad celular surgida de células T
CTL o CD4+.
Un polipéptido BASB034 o un fragmento del mismo
puede fusionarse con una coproteína o una fracción química que
puede o no producir anticuerpos por sí misma, pero que es capaz de
estabilizar la primera proteína y de producir una proteína
fusionada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o
inmunogénicas, y preferentemente propiedades protectoras. Así, la
proteína recombinante fusionada, que comprende preferentemente
además una coproteína antigénica, como lipoproteína D de
Haemophilus influenzae,
glutationa-S-transferasa (GST) o
beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína
relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la
producción y purificación de la misma. Además, la coproteína puede
actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una
estimulación generalizada del sistema inmunitario del organismo que
recibe la proteína. La coproteína puede unirse al término amino- o
carboxi- de la primera proteína.
Mediante esta invención se proporcionan
composiciones, en particular composiciones de vacunas, y
procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos
de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, como las
descritas en Sato, Y. y col. Science 273:352 (1996).
Asimismo, por esta invención se proporcionan
procedimientos que usan el polinucleótido descrito o fragmentos
particulares del mismo, para los que se ha demostrado que codifican
regiones no variables de proteínas bacterianas de superficie
celular, en constructos de polinucleótidos usados en dichos
experimentos de inmunización genética en modelos de animales de
infección con Moraxella catarrhalis. Dichos experimentos
serán útiles particularmente para identificar epítopos de proteínas
capaces de provocar una respuesta inmunitaria profiláctica o
terapéutica. Se cree que este planteamiento permitirá la
preparación subsiguiente de anticuerpos monoclonales de valor
particular, obtenidos del órgano requerido del animal que resiste
con éxito o aclara la infección, para el desarrollo de agentes
profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana,
en particular infeccióncon Moraxella catarrhalis, en
mamíferos, en particular seres humanos.
La invención incluye también una formulación de
vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante
inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, como un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Dado que los polipéptidos y
polinucleótidos pueden descomponerse en el estómago, cada uno de
ellos se administra preferentemente parenteralmente, incluyendo,
por ejemplo, administración que es subcutánea, intramuscular,
intravenosa o intradérmica. Las formulaciones adecuadas para
administración parenteral incluyen soluciones de inyección acuosas
y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, compuestos
bacteriostáticos y solutos que reproducen la formulación isotónica
con el fluido corporal, preferentemente la sangre, del individuo; y
suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir
agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones
pueden presentarse en envases monodosis o multidosis, por ejemplo,
ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado de
congelación seca que sólo requiere la adición del vehículo de
líquido estéril inmediatamente antes de usarlo.
La formulación de vacuna de la invención puede
incluir también sistemas adyuvantes para potenciar la
inmunogenicidad de la formulación. Preferentemente, el sistema
adyuvante eleva preferentemente un tipo de respuesta TH1.
Una respuesta inmunitaria puede distinguirse
ampliamente en dos categorías extremas, que son respuestas
inmunitarias humorales o mediadas por células (caracterizadas
tradicionalmente por mecanismos de protección de anticuerpos y de
efectores celulares, respectivamente). Estas categorías de respuesta
se han denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por
células) y respuestas inmunitarias de tipo TH2 (respuesta
humoral).
Las respuestas inmunitarias de tipo TH1 extremas
pueden caracterizarse por la generación de antígeno específico,
linfocitos T citotóxicos restringidos por haplotipo y respuestas de
células asesinas naturales. En ratones, las respuestas de tipo TH1
se caracterizan a menudo por la generación de anticuerpos del
subtipo Ig2a, mientras que en el ser humano corresponden a
anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunitarias de tipo TH2 se
caracterizan por la generación de una amplia gama de isotipos de
inmunoglobulina que se incluyen en IgG1, IgA e IgM de ratones.
Puede considerarse que la fuerza impulsora del
desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunitarias son
citoquinas. Los altos niveles de citoquinas de tipo TH1 tienden a
favorecer la inducción de respuestas inmunitarias mediadas por
células para el antígeno dado, mientras que niveles altos de
citoquinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de
respuestas inmunitarias humorales al antígeno.
La distinción de respuestas inmunitarias de tipo
TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad, un individuo admitirá una
respuesta inmunitaria que se describe como predominantemente TH1 o
predominantemente TH2. Sin embargo, a menudo es conveniente
considerar las familias de citoquinas de lo que han descrito en
clones celulares en células T CD4 +ve murinas Mosmann y Coffman
(Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells:
different patterns of lymphokine secretion lead to different
functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pág.
145-173).Tradicionalmente, las respuestas de tipo
TH1 se asocian a la producción de las citoquinas de
INF-\gamma e IL-2 por linfocitos
T. Otras citoquinas a menudo asociadas directamente con la inducción
de respuestas inmunitarias de tipo TH1 no son producidas por
células T, como IL-12. En contraste, las respuestas
de tipo TH2 se asocian con la secreción de IL-4,
IL-5, IL-6 e
IL-13.
Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son
particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de
citoquinas de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente, los mejores
indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmunitaria
después de una vacunación o infección incluyen la medida directa de
la producción de citoquinas TH1 o TH2 por linfocitos T in
vitro después de reestimulación con antígeno, y/o la medida de
la proporción Ig1:Ig2a de respuestas de anticuerpos específicas de
antígenos.
Así, un adyuvante de tipo TH1 es aquél que
estimula preferentemente poblaciones aisladas de células T para
producir altos niveles de citoquinas de tipo TH1 cuando se
reestimulan con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo
de linfocitos T citotóxicos CD8+ y respuestas de inmunoglobinas
específicas de antígenos asociadas con isotipo de tipo TH1.
Los adyuvantes que son capaces de estimulación
preferente de la respuesta celular TH1 se describen en la Solicitud
de Patente Internacional nº WO 94/00.153 y WO 95/17.209.
Uno de dichos adyuvantes es lípido A de
monofosforilo
3-des-O-acilado
(3D-MPL). Esto se sabe por el documento GB
2.220.211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de lípido A de
monofosforilo
3-des-O-acilado con
4, 5 ó 6 cadenas aciladas y es fabricado por Ribi Immunochem,
Montana. En la Patente Europea 0.689.454-B1
(SmithKline Beecham Biologicals SA) se desvela una forma preferida
de lípido A de monofosforilo
3-des-O-acilado.
Preferentemente, las partículas de
3D-MPL son suficientemente pequeñas para filtrarse
de forma estéril a través de una membrana de 0,22 micrómetros
(Patente Europea número 0.689.454). 3D-MPL estará
presente en el intervalo de 10 \mug a 100 \mug, preferentemente
de 25 a 50 \mug por dosis, en el que el antígeno estará presente
normalmente en un intervalo de 2 a 50 \mug por dosis.
Otro adyuvante preferido comprende QS21, una
fracción no tóxica purificada de HpIc obtenida de la corteza de
Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente, ésta puede
mezclarse con lípido A de monofosforilo
3-des-O-acilado
(3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.
El procedimiento de producción de QS21 se desvela
en la patente de EE.UU. nº 5.057.540.
Se han descrito anteriormente formulaciones de
adyuvantes no reactógenos que contienen QS21 (documento WO
96/33.739). Dichas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol
han demostrado éxito como adyuvantes de estimulación de TH1 cuando
se formulan con un antígeno.
Otros adyuvantes que son estimuladores
preferenciales de respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos
inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas como se
desvela en el documento WO 96/02.555.
También se contemplan combinaciones de diferentes
adyuvantes estimulados de TH1, como los mencionados anteriormente,
como el suministro de un adyuvante que es un estimulador
preferencial de respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21 puede
formularse junto con 3D-MPL. La proporción de
QS21:3D-MPL estará normalmente en el orden de 1:10
a 10:1; preferentemente de 1:5 a 5:1 y a menudo sustancialmente de
1:1. El intervalo preferido para una sinergia óptima es de 2,5:1 a
1:13 de D-MPL:QS21.
Preferentemente en la composición de vacuna según
la invención está presente también un vehículo. El vehículo puede
ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio, como
fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.
Una emulsión de aceite en agua preferida
comprende un aceite metabolizable, como escualeno,
alfa-tocoferol y Tween 80. En un aspecto
particularmente preferido, los antígenos en la composición de vacuna
según la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en
dicha emulsión. Además, la emulsión de aceite en agua puede contener
Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.
Normalmente, para administración humana en una
vacuna QS21 y 3D-MPL estarán presentes en el
intervalo de 1 \mug a 200 \mug, como, por ejemplo, de 10 a 100
\mug, preferentemente de 10 a 50 \mug por dosis. Normalmente, el
aceite en agua comprenderá del 2 al 10% de escualeno, del 2 al 10%
de alfa-tocoferol y del 0,3 al 3% de Tween 80.
Preferentemente, la proporción de
escualeno:alfa-tocoferol es igual o menor que 1, con
lo que se proporciona una emulsión más estable. Span 85 puede estar
presente también en un nivel del 1%. En algunos casos, puede ser
ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además
un estabilizador.
Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas
contienen preferentemente un aceite no tóxico como, por ejemplo,
escualano o escualeno, un emulsionante como, por ejemplo Tween 80,
en un vehículo acuoso. Los vehículos acuosos pueden ser, por
ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.
En el documento WO 95/17.210 se describe una
formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21,
3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en
agua.
La presente invención proporciona también una
composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de
vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en
particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades
autoinmunes y dolencias relacionadas. Dicha composición de vacuna
polivalente puede incluir un adyuvante inductor de
TH-1 como se ha descrito anteriormente.
Aunque la invención se ha descrito con referencia
a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB034, se entiende que
cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos de ocurrencia
natural, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones,
deleciones o sustituciones que no afectan sustancialmente a las
propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos
recombinantes.
En un aspecto más de la invención se proporcionan
composiciones que comprenden un polinucleótido BASB034 y/o un
polipéptido BASB034 para administración a una célula o un organismo
multicelular.
La invención se refiere también a composiciones
que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido expuestos en la
presente memoria descriptiva. Los polipéptidos y polinucleótidos de
la invención pueden emplearse en combinación con un vehículo o
vehículos estériles o no estériles para su uso con células, tejidos
u organismos, como un vehículo farmacéutico adecuado para la
administración a un individuo. Dichas composiciones comprenden, por
ejemplo, un medio aditivo o una cantidad terapéuticamente eficaz de
un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o
excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos pueden
incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina
tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los
mismos. La formulación debe adecuarse al modo de administración. La
invención se refiere además a paquetes y kits de diagnóstico y
farmacéuticos que comprenden uno o más envases rellenos con uno o
más de los ingredientes de las composiciones de la invención
mencionadas anteriormente.
Pueden emplearse polipéptidos y polinucleótidos
de la invención en solitario o en conjunción con otros compuestos,
como compuestos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas pueden
administrarse en cualquier modo conveniente eficaz incluyendo, por
ejemplo, administración por vías tópica, oral, anal, vaginal,
intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal
o intradérmica, entre otras.
En terapia o como profiláctico, el agente activo
puede administrarse a un individuo como una composición inyectable,
por ejemplo como una dispersión acuosa estéril, preferentemente
isotónica.
En un aspecto más, la presente invención
proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, como
la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la
presente invención, en combinación con un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos incluyen, pero no se
limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa,
agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La invención
se refiere además a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden
uno o más envases rellenos con uno o más de los ingredientes de las
composiciones de la invención anteriormente mencionadas. Los
polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente
invención pueden emplearse en solitario o en conjunción con otros
compuestos, como compuestos terapéuticos.
La composición se adaptará a la ruta de
administración, por ejemplo, mediante una ruta sistémica u oral. Las
formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección,
normalmente por inyección intravenosa. Pueden usarse otras rutas de
inyección como, por ejemplo, subcutánea, intramuscular o
intraperitoneal. Los medios alternativos para administración
sistémica incluyen administración transmucosa y transdérmica usando
agentes de penetración como sales biliares o ácidos fusídicos u
otros detergentes. Además, si el polipéptido u otros compuestos de
la presente invención pueden formularse en una formulación entérica
o encapsulada, también es posible la administración oral. La
administración de estos compuestos puede ser también tópica y/o
localizada en forma de pomadas, pastas, geles, soluciones, polvos y
similares.
Para administración a mamíferos, y
particularmente seres humanos, se espera que el nivel de
dosificación diaria del agente activo será de 0,01 mg/kg a 10
mg/kg, normalmente de 1 mg/kg aproximadamente. En cualquier caso,
el médico determinará la dosificación real que será más adecuada
para un individuo y que variará con la edad, el peso y la respuesta
del individuo en concreto. Las dosificaciones anteriores son
ilustrativas del caso promedio. Naturalmente, pueden darse casos
individuales en que se requieran intervalos de dosificación
superiores o inferiores, y éstos están dentro del alcance de la
presente invención.
El intervalo de dosificación requerido depende de
la elección del péptido, la ruta de administración, la naturaleza
de la formulación, la naturaleza de la dolencia del sujeto y el
criterio del facultativo. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas
están en el intervalo de 0,1 a 100 \mug/kg del sujeto.
Una composición de vacuna está convenientemente
en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales
para potenciar la respuesta inmunitaria. Una dosis unitaria adecuada
para vacunación es de 0,5 a 5 microgramos/kg de antígeno, y dicha
dosis se administra preferentemente de 1 a 3 veces y con un
intervalo de 1 a 3 semanas. Con el intervalo de dosis
indicado no se observarán efectos toxicológicos adversos con los
compuestos de la invención que excluirían su administración a
individuos adecuados.
Sin embargo, son de esperar amplias variaciones
en la dosificación necesaria, a la vista de la variedad de
compuestos disponibles y de las diferentes eficacias de las diversas
rutas de administración. Por ejemplo, se esperará que la
administración oral requiera dosificaciones más altas que la
administración por inyección intravenosa. Las variaciones en estos
niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas
estándar para optimización, como es bien conocido en la
técnica.
Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos
forman un valioso recurso de información con el que determinar sus
estructuras en 2 y 3 dimensiones, así como para identificar
secuencias adicionales de homología similar. Estos planteamientos
se facilitan más por el almacenamiento de la secuencia en un medio
legible por ordenador y usando a continuación los datos almacenados
en un programa de estructura macromolecular conocido o para
búsqueda en una base de datos usando herramientas de búsqueda bien
conocidas, como la aplicación informática GCG.
También se proporcionan en la invención
procedimientos para el análisis de secuencias o cadenas de
caracteres, en particular secuencias genéticas o secuencias de
proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de
secuencias incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de
homología de secuencias como análisis de identidad y semejanza,
análisis de estructura de ADN, ARN y proteínas, ensamblaje de
secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias,
determinación de marco de lectura abierta, búsqueda de bases de
ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, recorte de bases de
ácidos nucleicos y análisis de picos de cromatografías de
secuenciación.
Se proporciona un procedimiento de base
informática para realizar identificación de homología. Este
procedimiento comprende las etapas de proporcionar una primera
secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un
polinucleótido de la invención en un soporte legible por ordenador;
y comparar dicha primera secuencia de polinucleótidos con al menos
una segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para
identificar la
homología.
homología.
Se proporciona también un procedimiento de base
informática para realizar identificación de homología, comprendiendo
dicho procedimiento las etapas de proporcionar una primera
secuencia de polipéptidos que comprende la secuencia de un
polipéptido de la invención en un soporte legible por ordenador; y
comparar dicha primera secuencia de polipéptidos con al menos una
segunda secuencia de polinucleótidos o polipéptidos para identificar
la
homología.
homología.
Todas las publicaciones y referencias, que
incluyen, pero no se limitan a, patentes y solicitudes de patentes,
citadas en esta especificación se incorporan en la presente memoria
descriptiva como referencia en su totalidad, como si cada
publicación o referencia individual se incorporara específica e
individualmente como referencia en la presente memoria descriptiva.
Cualquier solicitud de patente sobre la que esta solicitud
reivindique prioridad se incorpora también como referencia en la
presente memoria descriptiva en su totalidad de la forma descrita
anteriormente para publicaciones y referencias.
"Identidad", según se conoce en la técnica,
es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o
más secuencias de polinucleótidos, según sea el caso, determinada
por comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad"
significa también el grado de relación de secuencia entre secuencias
de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, determinadas
por la correspondencia entre cadenas de dichas secuencias. La
"identidad" puede calcularse fácilmente por procedimientos
conocidos, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en
(Computacional Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford
University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing Informatics and
Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva
York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte
I,Griffin, A.M., y Griffin, H.G.,eds., Humana Press, Nueva Jersey,
1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von
Heine, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis
Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press,
Nueva York. 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J.
Applied Math., 48:1073 (1988). Los procedimientos para
determinar la identidad están diseñados para dar la mayor
correspondencia entre las secuencias probadas. Además, los
procedimientos para determinar la identidad están codificados en
programas informáticos disponibles públicamente. Los procedimientos
de programas informáticos para determinar la identidad entre dos
secuencias incluyen, pero no se limitan a, el programa GAP en el
paquete informático GCG (Devereux, J., y col., Nucleic Acids
Research 12(1)387:(1984)). BLASTP, BLASTN
(Altschul, S.F. y col, J. Molec. Biol.,
215:403-410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448
(1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente
en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S.,
y col., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., y col.,
J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Para
determinar la identidad puede usarse también el bien conocido
algoritmo Smith Waterman.
Los parámetros para comparación de secuencias de
polipéptidos incluyen los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol.
48:443-453 (1970)
Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y
Henikoff,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
89:10915-10919 (1992)
Penalización por hueco: 8
Penalización por longitud de hueco: 2
Un programa útil con estos parámetros está
disponible públicamente como programa "hueco" de Genetics
Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente
mencionados son los parámetros por omisión para comparaciones de
péptidos (con ausencia de penalizaciones para huecos
terminales).
Los parámetros para comparación de
polinucleótidos incluyen los siguientes:
Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol.
48:443-453 (1970)
Matriz de comparación: correspondencias = +10, no
correspondencias = 0
Penalización por hueco: 50
Penalización por longitud de hueco: 3
Disponible como: programa "hueco" de
Genetics Computer Group, Madison Wl. Éstos son los parámetros por
omisión para comparaciones de ácidos nucleicos.
En (1) y (2) más adelante se proporciona un
significado preferido para "identidad" para polinucleótidos y
polipéptidos, según sea el caso.
(1) Las formas de realización de polinucleótidos
incluyen además un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de polinucleótidos que tiene al menos una identidad del
50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% con respecto a la secuencia
de referencia de ID SEC Nº 1, en la que dicha secuencia de
polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de
ID SEC Nº 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de
alteraciones de nucleótido en comparación con la secuencia de
referencia en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo
que consiste en al menos una deleción, sustitución, incluyendo
transición y transversión, o inserción, de nucleótidos, y en la que
dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o
3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier
lugar entre dichas posiciones terminales, intercaladas
individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia
o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de
referencia, y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos
se determina multiplicando el número total de nucleótidos en ID SEC
Nº 1 por el número entero que define la identidad porcentual
dividida por 100 y a continuación restando ese producto de dicho
número total de nucleótidos en ID SEC Nº 1, o:
n_{n} \leq
x_{n} - (x_{n} \cdot
y),
en la que n_{n} es el número de
alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de
nucleótidos en ID SEC Nº 1, y es de 0,50 para el 50%, 0,60 para el
60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90
para el 90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%,
y \cdot es el símbolo el operador de multiplicación, y en el que
cualquier número no entero producto de x_{n} por y se redondea
hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de
x_{n}. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótidos que
codifica el polipéptido de ID SEC Nº 2 pueden crear mutaciones sin
sentido, de sentido equívoco o de marco de lectura esta secuencia
de codificación y, por tanto, alterar el polipéptido codificado por
el polinucleótido después de dichas
alteraciones.
A modo de ejemplo, una secuencia de
polinucleótidos de la presente invención puede ser idéntica a la
secuencia de referencia de ID SEC Nº 1, que puede ser idéntica al
100%, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones
de ácidos nucleicos en comparación con la secuencia de referencia de
forma que la identidad porcentual es de identidad menor que el
100%. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en
al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y
transversión, o inserción, de ácidos nucleicos y en las que dichas
alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de
la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier lugar
entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea
individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de
referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia
de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para
una identidad porcentual dada se determina multiplicando el número
total de ácidos nucleicos en ID SEC Nº 1 por el número entero que
define la identidad porcentual dividida por 100 y restando a
continuación ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos
en ID SEC Nº 1, o:
n_{n} \leq
x_{n} - (x_{n} \cdot
y)
en la que n_{n} es el número de
alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de
ácidos nucleicos en ID SEC Nº 1, y es, por ejemplo, 0,70 para el
70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc., \cdot es el
símbolo para el operador de multiplicación, y en la que cualquier
número no entero producto de x_{n} e y se redondea hacia abajo al
número entero más próximo antes de restarlo de
x_{n}.
(2) Las formas de realización de polipéptidos
incluyen además un polipéptido aislado que comprende un polipéptido
que tiene al menos una identidad del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97
ó 100% con respecto a la secuencia de polipéptidos de referencia de
ID SEC Nº 2, en la que dicha secuencia de polipéptidos puede ser
idéntica a la secuencia de referencia de ID SEC Nº 2 o puede
incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de
aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, en las
que dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en al
menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservadora
y no conservadora, o inserción, de aminoácidos y en las que dichas
alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales amino o
carboxi de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier
lugar entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea
individualmente entre los aminoácidos de la secuencia de referencia
o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de
referencia, y en las que dicho número de alteraciones de aminoácidos
se determina multiplicando el número total de aminoácidos en ID SEC
Nº 2 por el número entero que define la identidad porcentual
dividido por 100 y a continuación restando ese producto de dicho
número total de aminoácidos en ID SEC Nº 2, o:
n_{a} \leq
x_{a} - (x_{a} \cdot
y)
en la que n_{a} es el número de
alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de
aminoácidos en ID SEC Nº 2 y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%,
0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el
90%, 0,95 para el 95%, 0,97 para el 97% o 1,00 para el 100%: y
\cdot es el símbolo para el operador de multiplicación, y en la
que cualquier número no entero producto de X_{a} e y se redondea
hacia abajo al número entero más próximo antes de restarlo de
x_{a}.
A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptidos
de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de
referencia de ID SEC Nº 2, que puede ser idéntica al 100%, o puede
incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de
aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de manera
que la identidad porcentual tiene identidad menor que el 100%.
Dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en al
menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución
conservadora y no conservadora, o inserción, de aminoácidos y en la
que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales
amino o carboxi de la secuencia de referencia de polipéptidos o en
cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas ya
sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de
referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia
de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para una
identidad porcentual dada se determina multiplicando el número
total de aminoácidos en ID SEC Nº 2 por el número entero que define
la identidad porcentual dividido por 100 y restando a continuación
ese producto de dicho número total de aminoácidos en ID SEC Nº 2,
o:
n_{a} \leq
x_{a} - (x_{a} \cdot
y)
en la que n_{a} es el número de
alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de
aminoácidos en ID SEC Nº 2, y es, por ejemplo, 0,70 para el 70%,
0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc, y \cdot es el símbolo
para el operador de multiplicación, y en la que cualquier número no
entero producto de x_{a} e y se redondea hacia abajo al número
entero más próximo antes de restarlo de
x_{a}.
"Individuo(s)", cuando se usa en la
presente memoria descriptiva con referencia a un organismo,
significa un eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitarse
a, un metazoo, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un
primate y un ser humano.
"Aislado" significa alterado "por la mano
del hombre" con respecto a su estado natural, es decir, si ocurre
en la naturaleza, ha sido cambiado o extraído de su entorno
original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido
presente naturalmente en un organismo vivo no está "aislado",
pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de sus
materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", en
el sentido del término que se emplea en la presente memoria
descriptiva. Además, un polinucleótido o polipéptido que se
introduce en un organismo por transformación, manipulación genética
o cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" aun
cuando siga estando presente en dicho organismo, que puede estar
vivo o no.
"Polinucleótido(s)" se refiere
generalmente a cualquier polinucleótido o polidesoxirribonucleótido,
que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado,
incluyendo regiones monocatenarias y bicatenarias.
"Variante" se refiere a un polinucleótido o
polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de
referencia, pero conserva sus propiedades esenciales. Una variante
típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos
de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de
nucleótidos de la variante puede o no alterar la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de
referencia. Los cambios en los nucleótidos pueden dar como resultado
adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en
el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, según se
expone más adelante. Una variante típica de un polipéptido difiere
en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia.
Generalmente, las diferencias se limitan de manera que las
secuencias del polipéptido de referencia y la variante son
estrechamente similares en total y, en muchas regiones, la variante
idéntica y el polipéptido de referencia pueden diferir en la
secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones,
deleciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido
sustituido o insertado puede o no ser codificado por el código
genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser
de ocurrencia natural como una variante alélica, o puede ser una
variante para la que no se conoce ocurrencia natural. Variantes de
polinucleótidos y polipéptidos que no ocurren naturalmente pueden
prepararse mediante técnicas de mutagénesis o por síntesis
directa.
"Enfermedad(es)" significa cualquier
enfermedad causada por o relacionada con infección por una bacteria,
incluyendo, por ejemplo, otitis media en lactantes y niños,
neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones hospitalarias y
enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de
audición, acumulación de líquido en el oído medio, lesión del
nervio auditivo, retardo en el aprendizaje del habla, infección de
las vías respiratorias superiores e inflamación del oído medio.
Los ejemplos que se muestran a continuación se
realizan usando técnicas estándar, que son bien conocidas y
rutinarias para los expertos en la técnica, salvo que se describa lo
contrario en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no
limitan la invención.
El gen BASB034 se descubrió por primera vez en la
base de datos de Incyte PathoSeq que contiene secuencias de ADN
genómico sin terminar de la cepa ATCC 43617 de Moraxella
catarrhalis (también denominada Mc2931). La traducción de la
secuencia de polinucleótidos BASB034 mostró una semejanza importante
(identidad del 42% en un solapamiento de 214 aminoácidos) con la
proteína de fosfolipasa A de membrana exterior de Klebsiella
pneumoniae.
La secuencia del gen BASB034 se confirmó además
experimentalmente. Para este fin, se extrajo ADN genómico de
10^{10} células de M. catarrhalis (cepa ATCC 43617) usando
el kit de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen Gmbh), y 1
\mug de este material se sometió a amplificación de ADN por
Reacción en Cadena de la polimerasa usando cebadores E481124 (5'-
GAT TTA AGA GTA TGT TAT GAT G -3') [ID SEC Nº 9] y E481125 (5'- GTA
TGG GTT GAT CAA ATA CAG -3') [ID SEC Nº 10]. Este producto de PCR
se purificó en un aparato Biorobot 9600 (Qiagen Gmbh) y se sometió
a secuenciación de ADN usando el kit de secuenciación Big Dye Cycle
(Perkin-Elmer) y un secuenciador de ADN ABI
377/PRISM. La secuenciación de ADN se realizó en ambas cadenas con
una redundancia de 2 y se ensambló la secuencia de longitud
completa usando el programa Sequencher^{TM} (Applied Biosystems).
La secuencia de ADN resultante demostró ser idéntica al 100% con ID
SEC Nº 1.
Se extrajo ADN genómico a partir de 16 cepas de
M. catarrhalis (presentadas en la Tabla 1) según se describe
a continuación.Se dividió M. catarrhalis en colonias únicas
sobre placas de agar BHI y se cultivó durante toda la noche a 37°C.
Se tomaron tres o cuatro colonias únicas y se usaron para inocular
un cultivo de siembras de caldo BHI (infusión
cerebro-corazón) de \sim1,5 ml que se cultivó
durante toda la noche en una incubadora de agitación, \sim300
rpm, a 37°C. Se inoculó caldo BHI en un matraz erlenmeyer de 500 ml
que contenía \sim150 ml de caldo BHI con el cultivo de siembras y
se cultivó durante \sim12-16 horas a 37°C en una
incubadora de agitación, \sim175 rpm, para generar masa celular
para aislamiento de ADN. Se recogieron las células por centrifugado
en un rotor GSA de Sorvall a \sim2.000 X g durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante y se suspendió el
sedimento celular en \sim5,0 ml de agua estéril. Se añadió un
volumen igual de tampón de lisis (NaCl 200 mM, EDTA 20 mM,
Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, 0,5% (p/v) SDS,
2-mercaptoetanol al 0,5% (v/v) y 250 \mug/ml de
proteinasa K) y se suspendieron las células por agitación suave y
trituración. A continuación se incubó la suspensión celular durante
\sim12 horas a 50°C para lisar las bacterias y liberar ADN
cromosómico. Se precipitó el material proteináceo mediante la
adición de 5,0 ml de NaCl saturado (\sim6,0 M, en agua estéril) y
centrifugado a \sim5.500 x g en un rotor SS34 Sorvall a
temperatura ambiente. Se precipitó ADN cromosómico a partir del
sobrenadante aclarado por adición de dos volúmenes de etanol al
100%. Se recogió ADN agregado y se lavó usando agitación suave en
un pequeño volumen de solución de etanol al 70%. Se suspendió ADN
cromosómico purificado en agua estéril y se dejó que se
disolviera/desembolsara durante toda la noche a 4°C por balanceo
suave. Se determinó la concentración de ADN disuelto
espectrofotométricamente a 260 nm usando un coeficiente de extinción
de 1,0 unidades D.O. \sim50 \mug/ml.
Este material se sometió después a amplificación
PCR usando los oligonucleótidos
MC-Pla-BamF (5'- AAG GGC CCA ATT
ACG CAG AGG GGA TCC CAA GCT GTA CCA AAT CCT GTG GCA TTT GTT G -3')
[ID SEC Nº 11 ] y MC-PIa-SaIRC (5'-
AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TAG ACC CAT CCA GTC GTT
AAG CAT AAG -3') [ID SEC Nº 12]. A continuación se sometieron
independientemente los amplicones de gen BASB034 correspondientes a
hidrólisis usando enzimas de restricción (HphI, AluI, RsaI,
EcoRV, Sau3AI) y se separaron los productos de restricción por
electroforesis de gel de poliacrilamida o agarosa usando
procedimientos estándar de biología molecular según se describe en
"Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Segunda Edición, Eds:
Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Press
1989". The fotografías de los geles de electroforesis resultantes
se muestran en la Figura 1. Para cada cepa, se valoraron y
combinaron los patrones de RFLP correspondientes a las 6 enzimas de
restricción. A continuación se definieron los grupos de cepas que
compartían idéntica combinación de patrones de RFLP. Usando esta
metodología, las cepas sometidas a ensayo en este estudio se
encuadraron en 3 grupos genómicos (Grupo 1: Mc2931, Mc2904, Mc2905,
Mc2907, Mc2909, Mc2910, Mc2911, Mc2912, Mc2926, Mc2931, Mc2956,
Mc2969, Mc2975; Grupo 2: Mc2906, Mc2913; Grupo 3: Mc2908. (Mc2960 no
pudo ser amplificado y, en consecuencia, no se clasificó). Estos
datos apoyan que la población de Moraxella catarrhalis usada
en este estudio muestra una diversidad limitada de secuencias de
nucleótidos para el gen BASB034.
Usando el procedimiento experimental descrito en
el Ejemplo 1, se determinó también la secuencia del gen BASB034
para tres cepas adicionales de Moraxella catarrhalis. Las
secuencias de nucleótidos del gen BASB034 de las cepas Mc2908,
Mc2913 y Mc2969, representativas de los tres grupos genómicos
identificados previamente, se muestran en ID SEC Nº 3, 5 y 7,
respectivamente. Estas secuencias de nucleótidos se tradujeron a
secuencias de aminoácidos, que se muestran en ID SEC Nº 4, 6 y 8,
respectivamente. Usando el programa MegAlign del paquete DNASTAR,
se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias de nucleótidos
de ID SEC Nº 1, 3, 5 y 7, que se muestra en la Figura 2. En la
Tabla 2 se resume una comparación por pares de las identidades, que
muestra que las cuatro secuencias génicas de nucleótidos BASB034
son todas similares a un nivel de identidad mayor que el 98%.
Usando el mismo programa, se realizó un alineamiento múltiple de las
secuencias de proteínas de ID SEC Nº 2, 4, 6 y 8, que se muestra en
la Figura 3. En la Tabla 3 se resume una comparación por pares de
las identidades, mostrando que las cuatro secuencias génicas de
nucleótidos BASB034 son todas similares a un nivel de identidad
mayor que el 98%. Tomados en conjunto, estos datos indican una
conservación muy intensa de secuencias del gen BASB034 entre cepas
de Moraxella catarrhalis.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepa | Aislada en: | de: |
Mc2904 | EE.UU. | Timpanocentesis |
Mc2905 | EE.UU. | Timpanocentesis |
Mc2906 | EE.UU. | Timpanocentesis |
Mc2907 | EE.UU. | Timpanocentesis |
Mc2908 | EE.UU. | Otitis aguda, Timpanocentesis |
Mc2909 | EE.UU. | Timpanocentesis |
Mc2910 | EE.UU. | Timpanocentesis |
Mc2911 | EE.UU. | Otitis aguda, Timpanocentesis |
Mc2912 | EE.UU. | Otitis aguda, Timpanocentesis |
Mc2913 | EE.UU. | Otitis aguda, Timpanocentesis |
Mc2926 | EE.UU. | Timpanocentesis |
Mc2931/ATCC 43617 | EE.UU. | Aspirado transtraqueal |
Mc2956 | Finlandia | Líquido en el oído medio |
Cepa | Aislada en: | de: |
Mc2960 | Finlandia | Líquido en el oído medio |
Mc2969 | Noruega | Nasofaringe (faringitis-rinitis) |
Mc2975 | Noruega | Nasofaringe (rinitis) |
\vskip1.000000\baselineskip
ID SEC Nº 3 | ID SEC Nº 5 | ID SEC Nº 7 | |
ID SEC Nº 1 | 98,7 | 99,2 | 99,7 |
ID SEC Nº 3 | 99,3 | 98,7 | |
ID SEC Nº 5 | 99,1 |
\vskip1.000000\baselineskip
ID SEC Nº 4 | ID SEC Nº 6 | ID SEC Nº 8 | |
ID SEC Nº 2 | 98,6 | 99,3 | 99,5 |
ID SEC Nº 4 | 98,9 | 99,1 | |
ID SEC Nº 6 | 99,3 |
Los sitios de restricción BamHI y
SalI sometidos a ingeniería en los cebadores de amplificación
directo ([ID SEC Nº 11]) e inverso ([ID SEC Nº 12]),
respectivamente, permitieron la clonación direccional de un producto
de PCR de BASB034 en el plásmido de expresión de E. coli
disponible comercialmente pQE30 (QiaGen, resistente a ampicilina)
de manera que pudo expresarse una proteína BASB034 madura en una
proteína de fusión que contenía una etiqueta de cromatografía de
afinidad (His)6 en el término N. Se purificó el producto de
PCR de BASB034 de la reacción de amplificación usando columnas de
giro basadas en gel de sílice (QiaGen) siguiendo las instrucciones
de los fabricantes. Para producir los términos BamHI y
SalI necesarios para la clonación, se digirió
secuencialmente el producto de PCR purificado hasta terminación con
enzimas de restricción BamHI y SalI según recomendaba
el fabricante (Life Technologies). Después de la primera digestión
de restricción, se purificó el producto de PCR mediante una columna
de giro como antes para eliminar las sales y el eluido en agua
estéril antes de la segunda digestión enzimática. Se purificó de
nuevo el fragmento de ADN digerido usando columnas de giro basadas
en gel de sílice antes de ligadura con el plásmido pQE30.
Para preparar el plásmido de expresión pQE30 para
ligadura, se digirió análogamente hasta terminación con
BamHI y SalI y a continuación se trató con fosfatasa
intestinal de ternero (CIP, \sim0,02 unidades/pmol de extremo 5',
Life Technologies) según instrucciones del fabricante para evitar la
autoligadura. Se usó aproximadamente un exceso molar de 5 veces del
fragmento digerido para el vector preparado para programar la
reacción de ligadura. Se realizó una reacción de ligadura estándar
de \sim20 \mul (\sim16°C, \sim16 horas), usando
procedimientos bien conocidos en la técnica usando
ADN-ligasa T4 (\sim2,0 unidades/reacción, Life
Technologies). Se usó una parte alícuota de la ligadura (\sim5
\mul) para transformar células M15 (pREP4)
electro-competentes según procedimientos bien
conocidos en la técnica. Después de un período de crecimiento de
\sim2 a 3 horas a 37°C en \sim1,0 ml de caldo LB, las células
transformadas se sometieron a electrodeposición en placas de agar LB
que contenían kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100
\mug/ml). Ambos antibióticos se incluyeron en los medios de
selección para asegurar que todas las células transformadas
llevaban tanto el plásmido pREP4 plásmido (KnR), que transporta el
gen lacIq necesario para la represión de expresión para expresión
de proteínas inducible por IPTG en pQE30, y el plásmido
pQE30-BASB034 (ApR). Se incubaron las placas durante
toda la noche a 37°C durante \sim16 horas. Se recogieron colonias
KnR/ApR individuales con palillos estériles y se usaron para
"parchear" placas nuevas de inoculación LB KnR/ApR, así como
\sim1,0 ml de un cultivo de caldo LB KnR/ApR. Se incubaron las
placas de parcheo y el cultivo de caldo durante toda la noche a
37°C en incubadora estándar (placas) o en un baño de agua de
agitación.
Se empleó un análisis de PCR basado en células
enteras para verificar que los transformantes contenían el inserto
de ADN de BASB034. Aquí, se transfirió \sim1,0 ml de cultivo de
caldo LB Kn/Ap de toda la noche a un tubo de polipropileno de 1,5
ml y se recogieron las células por centrifugado en una
microcentrífuga Beckman (\sim3 min, temperatura ambiente,
\sim12.000 x g). Se suspendió el sedimento celular en \sim200
\mul de agua estéril y se usaron \sim10 \mul de parte
alícuota para programar una reacción de PCR de \sim50 \mul de
volumen final que contenía cebadores de amplificación directa e
inversa de BASB034. Las concentraciones finales de los componentes
de la reacción de PCR fueron esencialmente las mismas que las
especificadas en el ejemplo 2, con la excepción de que se usaron
\sim5,0 unidades de polimerasa Taq. Se aumentó la etapa de
desnaturalización inicial de 95°C a 3 minutos para garantizar la
interrupción térmica de las células bacterianas y la liberación de
ADN de plásmido. Se usaron un ciclador térmico ABI Modelo 9700 y un
perfil de amplificación térmica en tres etapas de 32 ciclos, es
decir, 95°C, 45 seg; 55-58°C, 45 seg, 72°C, 1 min.,
para amplificar el fragmento de PCR de BASB034 a partir de las
muestras transformantes lisadas. Después de amplificación térmica,
se analizaron \sim20 \mul de parte alícuota de la reacción
mediante electroforesis de gel de agarosa (0,8% agarosa en un tampón
de Tris-acetato-EDTA (TAE)). Se
visualizaron los fragmentos de ADN por iluminación UV después de
electroforesis de gel y tinción con bromuro de etidio. Se sometió a
electroforesis un ADN molecular de tamaño estándar (escalera de 1
Kb, Life Technologies) en paralelo con las muestras de prueba y se
usó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Se
identificaron los transformantes que produjeron el producto de PCR
esperado como cepas que contenían un constructo de expresión de
BASB034. A continuación se analizó la expresión del plásmido de
expresión que contenía cepas para la expresión inducible de BASB034
recombinante.
Por cada transformante positivo en PCR
identificado anteriormente se inocularon \sim5,0 ml de caldo LB
que contenía kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml)
con células de la placa de parcheo y se cultivó durante toda la
noche a 37°C con agitación (\sim250 rpm). Se inoculó una parte
alícuota del cultivo de siembras de toda la noche (\sim 1,0 ml)
en un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía \sim25 ml de caldo
LB Kn/Ap y se cultivó a 37°C con agitación (\sim250 rpm) hasta
que se alcanzó turbidez de cultivo D.O. 600 de \sim0,5, es decir,
fase semilogarítmica (normalmente de 1,5 a 2,0 horas
aproximadamente). En este momento se transfirió aproximadamente la
mitad del cultivo (\sim12,5 ml) a un segundo matraz de 125 ml y
se indujo expresión de proteína BASB034 recombinante por la adición
de IPTG (reserva 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una
concentración final de 1,0 mM. Se continuó con la incubación de los
cultivos inducidos y no inducidos por IPTG durante \sim4 horas
adicionales a 37°C con agitación. Se eliminaron las muestras
(\sim1,0 ml) de cultivos inducidos y no inducidos después del
período de inducción y se recogieron las células por centrifugado en
una microcentrífuga a temperatura ambiente durante \sim3 minutos.
Se suspendieron sedimentos celulares individuales en \sim50 \mul
de agua estéril, a continuación se mezcló con un volumen igual de
tampón de muestra 2X Laemelli SDS-PAGE que contenía
2-mercaptoetanol, y se colocó en baño de agua en
ebullición durante \sim3 min para desnaturalizar la proteína. Se
cargaron volúmenes iguales (\sim15 \mul) de lisatos celulares
inducidos y no inducidos por IPTG en gel duplicado de Tris al
12%/glicina poliacrilamida (Minigeles de 1 mm de espesor, Novex).
Se sometieron a electroforesis muestras de lisados inducidas y no
inducidas junto con marcadores preteñidos de peso molecular
(SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de
carrera de SDS/Tris/glicina (BioRad). Después de electroforesis, se
tiñó un gel con azul brillante de coomassie R250 (BioRad) y se
destiñó para visualizar nueva o nuevas proteínas BASB034 inducibles
por IPTG. Se electrotransfirió el segundo gel en una membrana PVDF
(tamaño de poro de 0,45 micrómetros, Novex) durante \sim2 h a 4°C
usando un aparato de transferencia BioRad
Mini-Protean II y tampón de transferencia de
metanol de Towbin (20%). El bloqueo de la membrana y las
incubaciones de anticuerpos se realizaron según procedimientos bien
conocidos en la técnica. Se usó un anticuerpo monoclonal
anti-RGS (His)3, seguido de un segundo
anticuerpo antirratón de conejo conjugado a HRP (QiaGen), para
confirmar la expresión e identidad de la proteína recombinante
BASB034. Se logró la visualización del patrón reactivo de anticuerpo
anti-His usando un sustrato insoluble en ABT o
usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de
Amersham.
Para verificar adicionalmente que la proteína
BASB034 recombinante inducible por IPTG se está expresando en el
marco de lectura abierta correcto y no en una molécula espuria que
surge de un artefacto de la clonación (es decir, una mutación del
marco de lectura), se determinó la secuencia de ADN del inserto
clonado. Se obtuvo la secuencia de ADN del gen BASB034 de M.
catarrhalis a partir de una cadena usando metodologías de
secuenciación de ciclos de PCR asimétricas convencionales (ABI
Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing,
Perkin-Elmer). Se programaron las reacciones de
secuenciación con ADN de plásmido de expresión sin digerir
(\sim0,5 \mug/rxn) como una plantilla y cebadores apropiados
específicos del vector pQE30 y específicos de marco de lectura
abierta (\sim3,5 pmol/rxn). Además de la plantilla y el cebador
de secuenciación, cada reacción de secuenciación (\sim20 \mul)
contenía las cuatro dNTP diferentes (es decir, A, G, C y T) y los
cuatro nucleótidos terminadores de ddNTP correspondientes (es
decir, ddA, ddG, ddC y ddT); con cada terminador conjugado con uno
de los cuatro tintes fluorescentes, Joe, Tam, Rox o Fam. Se
terminaron los productos de elongación de secuenciación
monocatenarios en posiciones aleatorias a lo largo de la plantilla
mediante la incorporación de los terminadores de ddNTP marcados por
tinte. Se purificaron los productos de terminación fluorescentes
marcados por tinte usando columnas de cromatografía de exclusión de
tamaño de microcentrífuga (Princeton Genetics), se secaron al vacío,
se suspendieron en un tampón de resuspensión de plantilla
(Perkin-Elmer) para electroforesis capilar o en
formamida desionizada para PAGE, de desnaturalizaron a 95°C durante
\sim5 min, y se analizaron por electroforesis capilar de alta
resolución (ABl 310 Automated ADN Sequenator,
Perkin-Elmer) o PAGE de alta resolución (ABI 377
Automated ADN Sequenator), según recomienda el fabricante. Se
recogieron los datos de secuencias de ADN producidos a partir de
reacciones individuales y se analizaron automáticamente las
intensidades máximas fluorescentes relativas en un ordenador
PowerMAC usando el programa de análisis de secuencias ABI
(Perkin-Elmer). Se editaron manualmente la
secuencias de ADN autoanalizadas para ver su precisión antes de
fundirlas en una "cadena" de secuencia monocatenaria de
consenso usando el programa AutoAssembler
(Perkin-Elmer). La secuenciación determinó que el
plásmido de expresión contenía la secuencia correcta en el marco de
lectura abierta correcto.
Se usó una cepa de expresión recombinante de
E. coli M15 (pREP4) que contenía un plásmido (pQE30) que
codifica BASB034 a partir de M. catarrhalis para
producir masa celular para purificación de proteína recombinante.
Se cultivó la cepa de expresión en placas de agar LB que contenían
50 \mug/ml de kanamicina ("Kn") y 100 \mug/ml de
ampicilina ("Ap") para asegurar que se mantenían el plásmido de
control IacIq de pREP4 y el constructo de expresión
pQE30-BASB034. Para crioconservación a -80°C, se
propagó la cepa en caldo LB que contenía la misma concentración de
antibióticos y a continuación se mezcló con un volumen igual de
caldo LB que contenía glicerol al 30% (p/v).
El medio de fermentación usado para la producción
de proteína recombinante consistió en caldo 2X YT (Difco) que
contenía 50 \mug/ml de Kn y 100 \mug/ml de Ap. Se añadió
antiespumante al medio para el fermentador a 0,25 ml/l (Antifoam
204, Sigma). Para inducir expresión de la proteína recombinante
BASB034 se añadió IPTG (Isopropil
B-D-Tiogalactopiranosida) al
fermentador (1 mM, final).
Se inoculó un matraz de siembra erlenmeyer de 500
ml, que contenía un volumen de trabajo de 50 ml, con 0,3 ml de
cultivo congelado descongelado rápidamente, o varias colonias de un
cultivo de placa agar selectivo, y se incubó durante
aproximadamente 12 horas a 37 \pm 1°C en una plataforma de
agitación a 150 rpm (Innova 2100, New Brunswick Scientific). Este
cultivo de siembra se usó a continuación para inocular un
fermentador de volumen de trabajo de 5 l que contenía caldo 2X YT y
antibióticos Kn y Ap. Se activó el fermentador (Bioflo 3000, New
Brunswick Scientific) a 37 \pm1°C, roción de aire de 0,2 a 0,4
VVM, 250 rpm en impulsores Rushton. El pH no se controló ni en el
cultivo de siembra del matraz ni en el fermentador. Durante la
fermentación, el pH osciló entre 6,5 y 7,3 en el fermentador. Se
añadió IPTG (reserva 1,0 M, preparada en agua estéril) al
fermentador cuando el cultivo alcanzó un crecimiento
semilogarítmico (\sim0,7 D.O. 600 unidades). Se indujeron células
durante 2 a 4 horas y a continuación se recogieron por centrifugado
usando una centrífuga de supervelocidad 28RS Heracus (Sepatech) o
RC5C (Sorvall Instruments). La pasta celular se almacenó a -20°C
hasta el tratamiento.
El imidazol, clorhidrato de guanidina, Tris
(hidroximetilo) y EDTA (ácido etilendiamintetraacético) de calidad
de biotecnología o superior se obtuvieron de Ameresco Chemical,
Solon, Ohio. Triton X-100
(t-octilfenoxipolietoxi-etanol),
fosfato de sodio, monobásico, y urea fueron de calidad de reactivos
o superior y se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis,
Missouri. El ácido acético glacial y el ácido clorhídrico se
obtuvieron de Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, Nueva Jersey.
El metanol se obtuvo de Fisher Scientific, Fairlawn, Nueva Jersey.
Pefabloc®SC
(4-(2-aminoetil)-bencenosulfonilfluoruro).
Los comprimidos de cócteles inhibidores de proteasa completos y
PMSF (fenilmetilsulfonilfluoruro) se obtuvieron de Roche Diagnostics
Corporation, Indianápolis, Indiana. Bestatina, Pepstatina A y el
inhibidor de proteasa E-64 se obtuvieron de
Calbiochem, LaJolla, California. El tampón salino de fosfato de
Dulbecco (1 x PBS) se obtuvo de Quality Biological, Inc.,
Gaithersburg, Maryland. El tampón salino de fosfato de Dulbecco (10
x PBS) se obtuvo de BioWhittaker, Walkersville, Maryland. El
anticuerpo penta-His, sin BSA, se obtuvo de QiaGen,
Valencia, California. La IgG antirratón de cabra AffiniPure
conjugada con peroxidasa se obtuvo de Jackson Immuno Research, West
Grove, Penn. La solución simple AEC se obtuvo de Zymed, South San
Francisco, California. Todos los demás productos químicos fueron de
calidad de reactivo o superior.
La resina Ni-NTA Superflow se
obtuvo de QiaGen Inc., Valencia, California. Los geles de
poliacrilamida Precast Tris-Glicina al
4-20% y al 10-20%, todos los
tampones de carrera y las soluciones, los estándares preteñidos
SeeBlue, los estándares multicolor MultiMark y las membranas de
transferencia PVDF se obtuvieron de Novex, San Diego, California.
Los kits de tinción de plata SDS-PAGE se obtuvieron
de Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokio, Japón. La
solución de tinción de coomassie se obtuvo de
Bio-Rad Laboratories, Hercules, California. Los
filtros de jeringuillas de 0,2 m Acrodisc® PF se obtuvieron de Pall
Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Los filtros de jeringuillas
desechables de 25 mm GD/X se obtuvieron de Whatman Inc., Clifton,
Nueva Jersey. Los tubos de diálisis de 8.000 MWCO se obtuvieron de
BioDesign Inc. Od New York, Carmal, Nueva York. Los reactivos de
ensayos de proteínas BCA y los tubos de diálisis Snake Skin de 3.500
MWCO se obtuvieron de Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois.
Se descongeló la pasta celular a temperatura
ambiente durante 30 a 60 minutos. Se pesaron de 5 a 6 gramos de
material en un tubo de centrífuga desechable de 50 ml. A éstos se
añadieron 5 ml/g de tampón de clorhidrato de guanidina
(Gu-HCl) se añadió tampón (clorhidrato de guanidina
6 M, fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton
X-100 al 0,05%, pH 8,0). Se resuspendió la pasta
celular usando un homogeneizador procientífico PRO300D, a 3/4 de
potencia durante un minuto. A continuación se colocó la mezcla de
extracción a temperatura ambiente con agitación suave durante 60 a
90 minutos. Después de 60 a 90 minutos se centrifugó la mezcla de
extracción a 15.800 x g durante 15 minutos (centrífuga Sorvall RCSC,
11.500 rpm). Se decantó el sobrenadante (S1) y se guardó para
purificación adicional. Se guardó el sedimento (P1) para
análisis.
A los 3 ó 4 ml de S1 de Ni-NTA se
añadió resina. A continuación, se puso a temperatura ambiente con
agitación suave durante una hora. Después de una hora se empaquetó
el S1/Ni-NTA en una columna XK16 Pharmacia. A
continuación se lavó la columna con tampón de
Gu-HCl 1 M (clorhidrato de guanidina 1 M, fosfato de
sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100
al 0,05%, pH 8,0). A continuación, esto se siguió de un lavado con
tampón de fosfato (fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM
y Triton X-100 al 0,05%, pH 6,3). A continuación se
eluyó la proteína de la columna con un tampón de imidazol 250 mM
(imidazol 250 mM, fosfato de sodio 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y
Triton X-100 al 0,05%, pH 5,9).
Se formuló BASB034 por diálisis durante toda la
noche frente a tres cambios de Triton X-100 al 0,1%
y 1 x PBS, pH 7,4, para eliminar Gu-HCl e imidazol
residuales. Se caracterizó la proteína purificada y se usó para
producir anticuerpos según se describe a continuación.
Se resolvió la proteína purificada recombinante
en geles de poliacrilamida al 4-20% y se transfirió
electroforéticamente a membranas de PVDF a 100 V durante 1 hora
según se ha descrito anteriormente (Thebaine y col. 1979, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). A
continuación se pretrataron las membranas de PVDF con 25 ml de
tampón salino de fosfato de Dulbecco que contenía leche en polvo
desgrasada al 5%. Todas las incubaciones posteriores se realizaron
usando este tampón de pretratamiento.
Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de
una dilución 1:500 de suero preinmune o suero inmune
anti-His de conejo durante 1 hora a temperatura
ambiente. A continuación se lavaron las membranas de PVDF dos veces
con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía
cloruro de sodio 150 mM y Tween-20 al 0,05%). Se
incubaron las membranas de PVDF con 25 ml de una dilución 1:5.000 de
IgG anticonejo de cabra marcada con peroxidasa (Jackson
ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a
temperatura ambiente. A continuación se lavaron las membranas de
PVDF 4 veces con tampón de lavado, y se desarrollaron con
3-amino-9-etilcarbazol
y peróxido de urea suministrado por Zymed (San Francisco, CA)
durante 10 minutos cada uno.
Los resultados de SDS-PAGE
(Figura 4) muestran una proteína de 60 kDa aproximadamente que es
reactiva a un anticuerpo anti-RGS(His) por
transferencias Western (Figura 5) de SDS-PAGE.
Se realizó secuenciación de aminoácidos
terminales en amino de la proteína purificada para confirmar la
producción de la proteína recombinante correcta usando protocolos
químicos bien definidos en un secuenciador de modelo G1000A de
Hewlett-Packard con un modelo 1090 LC y un
secuenciador de modelo 241 de Hewlett-Packard con un
modelo 1100 LC.
Se generaron antisueros polivalentes dirigidos
contra la proteína BASB034 mediante vacunación de dos conejos con
la proteína recombinante purificada BASB034. Se dio a cada animal un
total de tres inmunizaciones por vía intramuscular (i.m.) de 20
\mug aproximadamente de proteína BASB034 por inyección (empezando
con adyuvante de Freund completo y seguido por adyuvante de Freund
incompleto) en intervalos de 21 días aproximadamente. Se sangraron
los animales antes de la primera inmunización ("presangrado") y
en los días 35 y 57.
Se midieron valoraciones de proteína
anti-BASB034 mediante ELISA usando proteína
recombinante BASB034 purificada (0,5 \mug/pocillo). La valoración
título se define como la más alta dilución igual o mayor que 0,1,
calculada con la siguiente ecuación: DO promedio de dos muestras de
prueba de antisueros - DO promedio de dos muestras de prueba de
tampón. Las valoraciones después de tres inmunizaciones fueron de
1.000.000 aproximadamente.
Los antisueros se usaron como primer anticuerpo
para identificar la proteína en una inmunotransferencia según se
describe en el ejemplo 4 anterior. La inmunotransferencia muestra la
presencia de anticuerpo anti-BASB034 en los sueros
de animales inmunizados (Figura 6).
Las regiones flanqueantes de no codificación del
gen BASB034 contienen elementos reguladores importantes en la
expresión del gen. Esta regulación tiene lugar tanto en el nivel de
transcripción como en el de traducción. La secuencia de estas
regiones, ya sean en secuencia ascendente o en secuencia descendente
desde el marco de lectura abierta del gen, puede obtenerse por
secuenciación de ADN. Esta información de secuencias permite la
determinación de motivos reguladores potenciales como los diferentes
elementos promotores, secuencias terminadoras, elementos de
secuencias inducibles, represores, elementos responsables de la
variación de fase, la secuencia Shine-Dalgarno,
regiones con estructura secundaria potencial implicadas en la
regulación, así como otros tipos de secuencias o motivos
reguladores.
Esta información de secuencias permite la
modulación de la expresión natural del gen BASB034. La regulación
por incremento de la expresión génica puede lograrse alterando el
promotor, la secuencia Shine-Dalgarno, el represor
potencial o elementos operadores, o cualquier otro elemento
implicado. Análogamente, la regulación por decremento de la
expresión puede conseguirse mediante tipos de modificaciones
similares. Alternativamente, cambiando las secuencias de variación
de fase, la expresión del gen puede ponerse bajo control de
variación de fase, o puede desacoplarse a partir de esta
regulación. En otro planteamiento, la expresión del gen puede
ponerse bajo el control de uno o más elementos inducibles que
permiten la expresión regulada. Los ejemplos de dicha regulación
incluyen, pero no se limitan a, inducción por cambios de
temperatura, adición de sustratos de inductores como carbohidratos
seleccionados o sus derivados, elementos traza, vitaminas,
co-factores, iones metálicos, etc.
Dichas modificaciones según se describe
anteriormente pueden introducirse mediante varios medios diferentes.
La modificación de secuencias implicadas en la expresión génica
puede realizarse in vivo por mutagénesis aleatoria seguida
de selección para el fenotipo deseado. Otro planteamiento consiste
en aislar la región de interés y modificarla por mutagénesis
aleatoria, o mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de deleción
o inserción. La región modificada puede reintroducirse a
continuación en el genoma bacteriano por recombinación homóloga, y
puede evaluarse el efecto en la expresión génica. En otro
planteamiento, puede usarse el conocimiento de la secuencia de la
región de interés para sustituir o suprimir la totalidad o parte de
las secuencias reguladoras naturales. En este caso, la región
reguladora diana se aísla y se modifica de manera que contenga los
elementos reguladores de otro gen, una combinación de elementos
reguladores de diferentes genes, una región reguladora sintética o
cualquier otra región reguladora, o que suprima partes seleccionadas
de las secuencias reguladoras silvestres. Estas secuencias
modificadas pueden reintroducirse entonces en la bacteria a través
de recombinación homóloga en el genoma. Una lista no exhaustiva de
promotores preferidos que podrían usarse para regulación por
incremento incluye el promotor porA, porB,
lpbB, tbpB, p110, Ist, hpuAB de
N. meningitidis o N. gonorroheae.
En un ejemplo, la expresión del gen puede
modularse por cambio de su promotor por un promotor más fuerte (a
través del aislamiento de la secuencia ascendente del gen,
modificación in vitro de esta secuencia y reintroducción en
el genoma mediante recombinación homóloga). La expresión regulada
por incremento puede obtenerse tanto en la bacteria como en la
envoltura de las vesículas de la membrana exterior (o prepararse) a
partir de la bacteria. En otros ejemplos, los planteamientos
descritos pueden usarse para generar cepas bacterianas recombinantes
con características mejoradas para las aplicaciones de vacunas.
Éstas pueden ser, pero no se limitan a, cepas atenuadas, cepas con
expresión aumentada de antígenos seleccionados, cepas con noqueados
(o expresión disminuida) de genes que interfieren en la respuesta
inmunitaria, cepas con expresión modulada de proteínas
inmunodominantes, cepas con envoltura modulada de vesículas de
membrana exterior.
En la secuencia de ID SEC Nº 13 se proporciona
una región directamente en secuencia ascendente del gen BASB034.
Esta secuencia es un aspecto más de la invención.
Secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de
BASB034
ID SEC Nº
1
Secuencia de polinucleótidos de BASB034 de
Moraxella catarrhalis de cepa ATCC 43617
\vskip1.000000\baselineskip
ID SEC Nº
2
Secuencia de polipéptidos de BASB034 de
Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de ID SEC
Nº 1
\newpage
ID SEC Nº
3
Secuencia de polinucleótidos de BASB034 de
Moraxella catarrhalis de cepa Mc2908
ID SEC Nº
4
Secuencia de polipéptidos de BASB034 de
Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de ID SEC
Nº 3
ID SEC Nº
5
Secuencia de polinucleótidos de BASB034 de
Moraxella catarrhalis de cepa Mc2913
ID SEC Nº
6
Secuencia de polipéptidos de BASB034 de
Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de ID SEC
Nº 5
ID SEC Nº
7
Secuencia de polinucleótidos de BASB034 de
Moraxella catarrhalis de cepa Mc2969
ID SEC Nº
8
Secuencia de polipéptidos de BASB034 de
Moraxella catarrhalis deducida del polinucleótido de ID SEC
Nº 7
ID SEC Nº
9
ID SEC Nº
10
ID SEC Nº
11
ID SEC Nº
12
ID SEC Nº
13
Se ha depositado un depósito que contiene una
cepa Catlin de Moraxella catarrhalis en la American Type
Culture Collection (en la presente memoria descriptiva, "ATCC")
el 21 de junio de 1997 y se le ha asignado el número de depósito
43.617. El depósito se describió como Branhamella catarrhalis
(Frosch y Kolle) y es una biblioteca de inserciones de 1,5 a
2,9 kb secadas por congelación construida a partir de aislado de
M. catarrhalis a partir de un aspirado transtraqueal de un
minero del carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe
en Antimicrob. Agents Chemother. 21:506-508
(1982).
El depósito de cepa de Moraxella
catarrhalisse refiere en la presente memoria descriptiva como
"la cepa depositada" o como "el ADN de la cepa
depositada".
La cepa depositada contiene un gen BASB034 de
longitud completa.
Se ha depositado un depósito del vector
pMC-PLA1 que consiste en ADN de Moraxella
catarrhalis insertado en pQE30 en la American Type Culture
Collection (ATCC) el 12 de febrero de 1999 y número de depósito
asignado 207.099.
La secuencia de los polinucleótidos contenidos en
la cepa depositada, o en el clon depositado, así como la secuencia
de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado en consecuencia,
se están controlando por si hubiera algún conflicto con cualquier
descripción de secuencias en la presente memoria descriptiva.
Los depósitos de la cepa/clon depositados se han
hecho según los términos del Tratado de Budapest en el
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con
Fines de Procedimientos de Patente. Las cepas depositadas se
liberarán irrevocablemente y sin restricción o condición al público
en el momento de concesión de una patente. Las cepas depositadas se
proporcionan meramente por comodidad para los expertos en la materia
y no se supone que se requiere un depósito para su habilitación,
según se requiere según 35 U.S.C. § 112.
<110> SmithKline Beecham Biologicals
S.A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevos compuestos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BM45332
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211>1329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211>442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211>1329
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211>442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Moraxella catarrhalis
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211>1329
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<212> ADN
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<213> Moraxella catarrhalis
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<211>442
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<212> PRT
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de cebador
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<213> Secuencia artificial
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<223> Secuencia de cebador
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<213> Moraxella catarrhalis
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<400> 13
Claims (20)
1. Un polipéptido aislado que comprende
una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en
ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 e ID SEC Nº 8.
2. Un polipéptido aislado según la
reivindicación 1 que consiste en una secuencia seleccionada del
grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 e ID SEC Nº 8.
3. Un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido
de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
4. Un polinucleótido aislado que
comprende el polinucleótido de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº
7.
5. Un vector de expresión o un
microorganismo vivo recombinante que comprende un polinucleótido
aislado según la reivindicación 3 ó 4.
6. Un microorganismo vivo recombinante
que comprende un vector de expresión según la reivindicación 5.
7. Una célula hospedadora que comprende
el vector de expresión de la reivindicación 5.
8. Una célula hospedadora de Moraxella
catarrhalis que comprende un vector de expresión que comprende
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende
una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85%
con respecto a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la
longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente,
o un fragmento del mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a
un vehículo) de suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el
polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8,
respectivamente.
9. Una membrana exterior de un
microorganismo recombinante de la reivindicación 6 que expresa un
polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o
ID SEC Nº 8.
10. Una membrana exterior de un
microorganismo recombinante que tiene una expresión regulada por
incremento de un polipéptido aislado que comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con respecto a
la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID
SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento
del mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) de
suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de
ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente.
11. Un procedimiento para producir un
polipéptido según se define en las reivindicaciones 1 ó 2, que
comprende el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación
7 en condiciones suficientes para la producción de dicho
polipéptido y la recuperación del polipéptido del medio de
cultivo.
12. Un procedimiento para producir un
fragmento inmunogénico del polipéptido según la reivindicación 1 ó
2 en el que el fragmento inmunogénico comprende una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos 15 aminoácidos contiguos desde la
secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 y
que es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria (si es necesario
cuando se acopla a un vehículo) que reconoce el polipéptido de ID
SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, que comprende
el cultivo de una célula hospedadora de la reivindicación 8 en
condiciones suficientes para la producción de dicho fragmento
inmunogénico y la recuperación del fragmento inmunogénico del medio
de cultivo.
13. Un procedimiento para expresar un
polinucleótido de la reivindicación 3 ó 4 que comprende la
transformación de una célula hospedadora con un vector de expresión
que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y el cultivo
de dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la
expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.
14. Un procedimiento para expresar un
polinucleótido que codifica un fragmento inmunogénico del
polipéptido según la reivindicación 1 ó 2 en el que el fragmento
inmunogénico comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al
menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de ID
SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 y que es capaz de suscitar una
respuesta inmunitaria (si es necesario cuando se acopla a un
vehículo) que reconoce el polipéptido de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o
ID SEC Nº 8, respectivamente, que comprende la transformación de
una célula hospedadora de Moraxella catarrhalis con un vector
de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos,
y el cultivo de dicha célula hospedadora en condiciones suficientes
para uno cualquiera de dichos polinucleótidos.
15. Una composición de vacuna que comprende
una cantidad eficaz de un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos que tiene identidad de al menos el 85% con
la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en
ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la longitud de ID SEC
Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, o un fragmento
del mismo capaz (si es necesario cuando se acopla a un vehículo) de
suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de ID
SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
16. Una composición de vacuna que comprende
una cantidad eficaz de un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que tiene identidad de al menos el 85% con
respecto a la de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7 en toda la
longitud de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7, respectivamente,
o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho
polinucleótido aislado, y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
17. La composición de vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 en la que dicha
composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella
catarrhalis.
18. Uso de una composición que comprende una
cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido aislado que
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que
consiste en ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la
longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente,
o un fragmento de un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85%
con respecto a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo
que consiste en: ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8 en toda la
longitud de ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente,
en la que el fragmento se acopla a un vehículo y es capaz de
suscitar una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido de
ID SEC Nº 4, ID SEC Nº 6 o ID SEC Nº 8, respectivamente, en la
preparación de un medicamento para su uso en la generación de una
respuesta inmunitaria en un animal.
19. Uso de una composición que comprende una
cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al
menos el 85% con respecto a la de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC
Nº 7 en toda la longitud de ID SEC Nº 3, ID SEC Nº 5 o ID SEC Nº 7,
respectivamente; o una secuencia de nucleótidos complementaria a
dicho polinucleótido aislado en la preparación de un medicamento
para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un
animal.
20. Un anticuerpo inmunoespecífico para el
polipéptido de la reivindicación 1 ó 2.
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