MXPA00011764A - Polipeptidos antigenos de neisseria meningitidis polinucleotidos correspondientes y anticuerpos protectores. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona polipeptidos de BASB030 de Neisseria meningitidis y polinucleotidos que codifican polipeptidos BASB030 y metodos para producir estos polipeptidos mediante tecnicas recombinantes. Tambien se proporcionan anticuerpos, usos diagnosticos, profilacticos y terapeuticos de los mismos.

Description

POLIPEPTIDOS ANTIGENOS DE NEISSERIA MENINGITIDIS, POLINUCLEOTIDOS CORRESPONDIENTES Y ANTICUERPOS PROTECTORES • 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con polinucleótidos (denominados en la presente "polinucleótido (s) BASB030"), polipéptidos codificados por ellos (denominados en la presente "BASB030" o "polipéptido (s) BASB030"), materiales recombinantes 10 y métodos para su producción. En otro aspecto, la invención se átk relaciona con métodos para usar estos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En otro aspecto, la invención se relaciona con ensayos de diagnóstico para detectar la infección de ciertos 15 patógenos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria gram negativa frecuentemente aislada de las vías respiratorias ^ superiores humanas. Ocasionalmente causa enfermedades 20 bacterianas invasivas tales como bacteremia y meningitis. La incidencia de enfermedad por meningococos muestra diferencias de estaciones geográficas y anuales (Schwartz, B., Moore, P.S., Broo e, C.V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement) , S18-S24, 1989) . Muchas enfermedades en países templados se deben a 25 cepas del Serogrupo B y varían en incidencia desde 1- 10/100, 000/año de población total alcanzando algunas veces valores más altos (Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7:R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijilmer, H.A., Poolman, J.T. y colaboradores, Clin. Infect . Dis. 16:237-246, 1993; Cruz C, Pavez, G. , Aguilar, E., y colaboradores, Epidemiol. Infect . 105:119-126, 1990). Las epidemias dominadas por los meningococos de serogrupo A, la mayoría en África Central, algunas veces se encuentran alcanzando niveles hasta de 1000/100, 000/año (Scwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement) , S18-S24, 1989). Casi todos los casos como un todo de enfermedad por meningococos son causados por los serogrupos A, B, C, -135 y meningococos Y y está disponible una vacuna de polisacárido tetravalente A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C, J. Biol. Stand. 10:335-339, 1982) . Las vacunas de polisacáridos actualmente se están mejorando por medio de conjugarlas químicamente con proteínas portadoras (Lieberman, J.M., Chiu, S.S., Wong, V.K., y colaboradores, JAMA 275:1499-1503,1996). Una vacuna del serogrupo B no está disponible, ya que el polisacárido capsular B se encuentra no inmunogénico, más probablemente debido a que comparte similaridad estructural con componentes de la hospedera (Wyle, F.A., Artenstein, M.S., Brandt, M.L. y colaboradores, J. Infect . Dis. 126:514-522, 1972; Finne, J.M., Leinonen, M., Mákelá, P. M. Lancet ii: 355- 357, 1983) . Durante muchos años se han iniciado y se han llevado a cabo esfuerzos para desarrollar vacunas basadas en membrana externa del meningococo (de Moraes, J.C., Perkins, B., Camargo, M.C., y colaboradores, Lancet 340:1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E.A. Gronnesby, J.K. y colaboradores, 338:1093-1096, 1991) . Estas vacunas han demostrado eficacias del 57 por ciento - 85 por ciento en niños mayores (>4 años) y adolescentes. Muchos componentes de membranas externas bacterianas están presentes en estas vacunas, tales como PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB y la contribución de estos componentes a la protección observada todavía necesita otra definición. Los componentes de la membrana externa bacteriana han sido definidos usando anticuerpos animales o humanos para ser potencialmente relevantes a la inducción de inmunidad protectora, tales como TbpB y NspA (Martin, D., Cadieus, N. , Hamel, J., Brodeux, B.R., J. Exp. Med. 185:1173-1183, 1997; Lissolo, L., Maitre-Wilmotte, C, Dumas, p. y colaboradores, Inf . , Immun. 63:884-890, 1995). Los mecanismos de inmunidad protectora implicarán actividad bactericida mediada por anticuerpos y opsonofagocitosis. Un modelo animal de bacteremia se ha usado para combinar todos los mecanismos mediados por anticuerpos (Saukkonen, K. , Leinonen, M., Abdillahi, H. Poolman, J.T.

Vaccine 7:325-328, 1989) . Generalmente se acepta que el último mecanismo bactericida mediado por componentes de complemento es crucial para la inmunidad contra la enfermedad por meningococos (Ross, S.C., Rosenthal P.J., Berberic, H.M. , Densen, P.J. 5 Infect. Dis. 155:1266-1275, 1987). La frecuencia de las infecciones por Neisseria meningi tidis ha crecido impresionantemente en las últimas décadas. Esto ha sido atribuido al surgimiento de múltiples cepas resistentes a los antibióticos y a una población {^k 10 creciente de gente con sistemas inmunológicos debilitados. Ya no es poco común aislar cepas de Neisseria meningi tidis que son resistentes a algunos o a todos los antibióticos estándares. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no satisfecha y una demanda para nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, 15 métodos de análisis de fármacos, y pruebas de diagnóstico para este organismo. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con BASB030, en particular polipéptidos BASB030 y polinucleótidos BASB030, 20 materiales recopíbinantes y métodos para su producción. En otro aspecto, la invención se relaciona con métodos para usar estos polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y el tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En otro aspecto, la invención se relaciona con ensayos de diagnóstico 25 para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y condiciones asociadas con estas infecciones, tales como pruebas para detectar la expresión o la actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB030. Varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención descrita serán fácilmente aparentes a los expertos en la técnica a partir de leer las siguientes descripciones y a partir de leer las otras partes de la presente descripción. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con polipéptidos y polinucleótidos BASB030 como se describe en mayor detalle más adelante. En particular, la invención se relaciona con polipéptidos y polinucleótidos de BASB030 de Neisseria meningitidis, la cuale está relacionada por la homología de secuencia de aminoácidos con la proteína de la membrana externa PilQ de Neisseria gonorrhoeae . La invención se relaciona especialmente con BASB030 que tiene las secuencias de nucleótidos y aminoácidos presentadas en SEQ ID NO: 1,3,5 y SEQ ID NO: 2,4,6 respectivamente. Se entiende que la secuencia nombrada en el listado de secuencias más adelante como "ADN" representa una ejemplificación de una modalidad de la invención, ya que los expertos en la técnica reconocerán que estas secuencias se pueden emplear útilmente en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos .

Polipéptidos En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Neisseria meningi tidis conocidos en la presente como "BASB030" y polipéptidos BASB030" así como variantes útiles biológicamente, diagnósticamente, profilácticamente, clínicamente o terapéuticamente de los mismos, y composiciones que comprenden los mismos. La presente invención además proporciona: (a) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos una identidad del 85 por ciento, más preferiblemente cuando menos una identidad de 90 por ciento, todavía más preferiblemente cuando menos una identidad de 95 por ciento, más preferiblemente cuando menos 97-99 por ciento de identidad exacta, a la de SEQ ID NO: 2,4,6; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene cuando menos una identidad de 85 por ciento, más preferiblemente cuando menos una identidad de 90 por ciento, todavía más preferiblemente cuando menos una identidad de 95 por ciento, aún más preferiblemente cuando menos una identidad de 97-99 por ciento o exacta con SEQ ID NO: 1,3,5 sobre la longitud entera de SEQ ID NO: 1,3,5 respectivamente; o (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido el cual tiene cuando menos una identidad del 85 por ciento, más preferiblemente cuando menos una identidad del 90 por ciento, todavía más preferiblemente • cuando menos una identidad del 95 por ciento, aún más 5 preferiblemente cuando menos una identidad del 97-99 por ciento o exacta, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,4,6. Los polipéptidos BASB030 proporcionados en SEQ ID NO: 2,4,6 son polipéptidos BASB030 de las cepas de Neisseria meningi tidis ATCC13090 y H44/76. fc 10 La invención también proporciona un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB030, que es una porción contigua del polipéptido BASB030 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,4,6. 15 Esto es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla con un portador) es capaz de presentar una respuesta inmune cuando reconoce al polipéptido BASB030. Este fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB030 que carece de una secuencia delantera N-terminal, y/o dominio 20 de transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido el fragmento inmunogénico de BASB030 de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido que tiene cuando menos una identidad del 85 por ciento, más preferiblemente cuando 25 menos una identidad del 90 por ciento, todavía más preferiblemente cuando menos una identidad del 95 por ciento, más preferiblemente cuando menos una identidad del 97-99 por ciento, a la de SEQ ID NO: 2,4,6 sobre la longitud entera de SEQ ID NO : 2. Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma en parte pero no toda de una secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Como con los polipéptidos BASB030 los fragmentos pueden ser "libres", o estar contenidos en un polipéptido más grande del cual forman una parte o región, más preferiblemente como una sola región continua en un solo polipéptido más grande. Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, los polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,4,6 o de variantes de las mismas, tales como una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoácidos amino- y/o carboxilo - terminal . Las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidos por o en una célula huésped, también se prefieren. Además se prefieren fragmentos característicos por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden regiones alfa-hélice y regiones que forman alfa-hélice, regiones de beta-lámina y regiones que forman beta-lámina, regiones de vuelta y regiones que forman vuelta; regiones de espiral y regiones que forman espiral, regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicas, regiones alfa antipáticas, regiones beta antipáticas, regiones flexibles, regiones que forman superficie, región de enlace de sustrato y regiones de índice antigénico alto. Otros fragmentos preferidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,4,6, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos truncados o borrados de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 2,4,6. Se pueden emplear fragmentos de polipéptidos de la invención para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, estos fragmentos se pueden emplear como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención. Particularmente preferidos son variantes en los cuales varios aminoácidos 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ó 1 aminoácido se sustituyen, suprimen o añaden en cualquier combinación. Los polipéptido o fragmentos inmunogénicos de la invención pueden estar en forma de la proteína "madura" o pueden ser parte de una proteína mayor tal como una proteína precursora o una proteína de - fusión. Frecuentemente es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o delanteras, prosecuencias, secuencias que ayudan en la purificación tales como residuos de histidina múltiples, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante. Además, también se considera la adición de polipéptido exógeno o cola de lípidos de secuencia de polinucleótidos para aumentar el potencial inmunogénico de a molécula final . En un aspecto, la invención se relaciona con proteínas de fusión solubles, genéticamente diseñadas que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y varias porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE) . Preferida como una inmunoglobulina es la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgGl, en donde la fusión se lleva a cabo en la región de articulación. En una modalidad particular, la parte Fc se puede remover simplemente mediante la incorporación de una secuencia de disociación que se puede disociar con factor de coagulación de sangre Xa. Además, esta invención se relaciona con procesos para la preparación • de estas proteínas de fusión diseñando técnicamente mediante genética, y el uso de las mismas para análisis de fármacos, diagnóstico y terapia. Otro aspecto de la invención también se relaciona con polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión. Ejemplos de la tecnología de proteínas de fusión se puede encontrar en la Solicitudes de Patentes Internacionales números W094/29458 y W094/22914. Las proteínas se pueden conjugar químicamente, o expresar como proteínas de fusión recombinante permitiendo que se produzcan niveles aumentados en un sistema de expresión en comparación con la proteína no fusionada. El socio de fusión puede ayudar a proporcionar epítopes ayudantes T (socio de fusión inmunológico) , preferiblemente epítopes ayudantes T reconocidos por humanos, o que ayudan a expresar la proteína (realzador de expresión) en rendimientos mayores que la proteína recombinante natural. El socio de fusión preferiblemente será tanto un socio de fusión inmunológico como un socio de realce de expresión. Los socios de fusión incluyen la proteína D Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus de la influenza, NSl (hemaglutinina) . Otro socio de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferiblemente la porción de terminal C de la molécula se usa. El LytA se deriva de Streptococcus pneumoniae la cual estabilice una N-acetil-L-alanina amidasa, amidasa LytA, (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) página 265-272}) una autolisina que específicamente degrada ciertos enlaces en la estructura central del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad con la colina o con algunos análogos de colina tales como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C- LytA de E. Coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. La purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA como su término amino han sido descritos {Biotechnology: 10, (1992) páginas 795-798}. Es posible usar la porción de repetición de la molécula LytA encontrada en el extremo terminal C comenzando en el residuo 178, por ejemplo los residuos 188-305. La presente invención también incluye variantes de los polipéptidos antes mencionados, esto es polipéptidos que varían de los referentes por sustituciones conservadoras de aminoácidos, mediante lo cual un residuo se sustituye por otro con características similares. Típicas de estas sustituciones están entre Ala, Val, Leu e lie; entre Ser y Thr; entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los residuos básicos Lys y Arg; o residuos aromáticos Phe y Tyr. Los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar de cualquier manera conveniente. Esos polipéptidos incluyen polipéptidos que se presentan naturalmente aislados, polipéptidos producidos recombinantemente, polipéptidos producidos sintéticamente, o polipéptidos producidos por una combinación de estos métodos. Los medios para preparar estos polipéptidos son muy conocidos en la técnica. Se prefiere más que un polipéptido de la invención se derive de Neisseria meningi tidis, sin embargo, puede obtenerse preferiblemente de otros organismos del mismo género taxonómico. Un polipéptido de la invención también se puede obtener, por ejemplo, de organismos de la misma familia taxonómica u orden. Polinucleótidos Es un objeto de la invención proporcionar polinucleótidos que codifiquen polipéptidos BASB030, particularmente polinucleótidos que codifican el polipéptido designado en la presente BASB030. En una modalidad particularmente preferida de la invención el polinucleótido comprende una región que codifica polipéptidos BASB030 que comprende una secuencia presentada en SEQ ID NO: 1,3,5 que incluye un gen de longitud entera, o una variante del mismo. Los polinucleótidos BASB030 proporcionados en SEQ ID NO: 1,3,5 son los polinucleótidos BASB030 de Neisseria meningi tidis cepas ATCC13090 y H44/76. Como otro aspecto de la invención se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislado que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB030, particularmente polipéptidos BASB030 de Neisseria meningi tidis, incluyendo, por ejemplo, ARN no procesado, ARN de ribozima, ARNm, ADNc, ADN genómico, ADN B y Z. Otras modalidades de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos útiles biológicamente, diagnósticamente, profilácticamente, clínicamente o terapéuticamente, y variantes de los mismos y composiciones que comprenden los mismos . Otro aspecto de la invención se relaciona con polinucleótidos aislados, que incluyen cuando menos un gen de • longitud completa, que codifica un polipéptido BASB030 que 5 tiene una secuencia de aminoácidos deducida de SEQ ID NO: 2,4,6 y polinucleótidos cercanamente relacionados a los mismos y variantes de los mismos. En otra modalidad particularmente preferida de la invención hay un polipéptido BASB030 de Neisseria meningi tidis w? 10 que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,4,6 o una variante de las mismas. Usando la información proporcionada en la presente, tal como una secuencia de polinucleótidos presentada en SEQ ID NO: 1,3,5 un polinucleótido de la invención que codifica el 15 polipéptido BASB030 se puede obtener usando métodos de clonación y de análisis estándares, tales como para clonar y secuenciar fragmentos de ADN cromosomal de bacterias usando células de Neisseria meningi tidis como material inicial, seguido por la obtención de una clona de longitud completa. 20 Por ejemplo, para obtener una secuencia de polinucleótidos de la invención, tal como una secuencia de polinucleótidos dada en SEQ ID NO: 1,3,5, típicamente una biblioteca de clonas de ADN cromosomal de Neisseria meningi tidis en E. Coli o alguna otra hospedera conveniente se sondea con un oligonucleótido 25 radioetiquetado, preferiblemente uno de 17-mer o más largo, derivado de una secuencia parcial. Las clonas que llevan ADN idéntico al de la sonda se pueden distinguir usando condiciones de hibridización estricta. Secuenciando las clonas individuales así identificadas por hibridización con cebadores de secuenciamiento diseñados para el polipéptido original o la secuencia de polinucleótidos entonces es posible extender la secuencia de polinucleótidos en ambas direcciones para determinar una secuencia de genes de longitud completa. De manera conveniente, este secuenciamiento se realiza, por ejemplo, usando ADN de doble cadena desnaturalizado preparado de una clona de plásmido. Técnicas convenientes se describen por Sambrook, y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), (véase en particular Screening by Hybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA te plates 10.70) el secuenciamiento de ADN genómico directo también se puede realizar para obtener una secuencia de genes de longitud completa. Ilustra la invención cada polinucleótido presentado en SEQ ID NO: 1,3, 5 fue descubierta en una biblioteca de ADN derivada de Neisseria meningi tidis . Más aún cada secuencia de ADN presentada en SEQ ID NO: 1,3,5 contiene un cuadro de lectura abierto que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de residuos de aminoácidos presentado en SEQ ID NO: 2,4,6 con un peso molecular deducido que se puede calcular usando valores de pesos moleculares de residuos de aminoácidos muy conocidos para los expertos en la técnica.

El polinucleótido de SEQ ID NO: 1, entre el codón inicial en el número de nucleótido 1 y el codón de detención que comienza en el número de nucleótido 2308 de SEQ ID NO: 1, codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2. El polinucleótido de SEQ ID NO: 3, entre el primer codón en el número de nucleótido 1 y el último codón que comienza en el número de nucleótido 2308 de SEQ ID NO: 3, codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4. El polinucleótido de SEQ ID NO : 5 entre el codón inicial y el número de nucleótido 1 y el codón de detención que comience en el nucleótido número 2308 de SEQ ID NO: 5, codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 6. En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o consiste en: (a) una secuencia de polinucleótidos que tiene cuando menos una identidad del 85 por ciento, más preferiblemente cuando menos una identidad de 90 por ciento, todavía más preferiblemente cuando menos una identidad de 95 por ciento, aún más preferiblemente cuando menos una identidad de 97-99 por ciento o identidad exacta con SEQ ID NO: 1,3,5 en la longitud entera de SEQ ID NO: 1,3,5, respectivamente; (b) una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene cuando menos una identidad de 85 por ciento, más preferiblemente cuando menos una identidad de 90 por ciento, todavía más preferiblemente cuando menos una identidad de 95 por ciento, aún más preferiblemente cuando menos una identidad de 97-99 por ciento o 100 por ciento exacta con la secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 2,4,6 en la longitud entera de SEQ ID NO: 2,4,6, respectivamente. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, que incluye homólogos y ortólogos de especies distintas de Neisseria meningi tidis, se puede obtener mediante un producto que comprende los pasos de analizar una biblioteca adecuada bajo condiciones de hibridización estrictas (por ejemplo, usando una temperatura en el rango de 45-65°C y una concentración de SDS de 0.1-1 por ciento) con una sonda etiquetada o detectable que consiste en o que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1,3,5 o un fragmento de la misma; y aislar un gen de longitud completa y/o clonas genómicas que contienen dicha secuencia de polinucleótidos. La invención proporciona una secuencia de polinucleótidos idéntica sobre su longitud entera a una secuencia de codificación (de cuadro de lectura abierto) en SEQ ID NO: 1,3,5. También se proporciona por la invención una secuencia de codificación para el polipéptido madura o un fragmento del mismo, por sí mismo así como una secuencia de codificación para un polipéptido maduro o un fragmento en el cuadro de lectura. Con otra secuencia de codificación, tal como una secuencia que codifica una secuencia delantera o secretora, una secuencia pre-, o pro-, o prepro-proteína . El polinucleótido de la invención también puede contener cuando menos una secuencia de no codificación, que incluye por ejemplo, pero no se limita a cuando menos una secuencia de no componente 5 ' y 3 ' , tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, las señales de terminación (tales como ro- dependientes y señales de terminación ro-independientes) , sitios de enlace de ribosoma, secuencias de Kosak, secuencias que estabilizan en ARNm, intrones, y señales de poliadenilación. La secuencia de polinucleótidos también puede comprender secuencia de codificación adicional que codifican aminoácidos adicionales. Por ejemplo, una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado se puede codificar. Estas modalidades de la invención, la secuencia marcadora es un péptido hexa-histidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y descrito en Gentz y colaboradores, Proc. Natl . Acad. Sci . USA 86 : 821-824 (1989), o una etiqueta de péptido HA (Wilson y colaboradores, Cell 37 : 767 (1984) , ambos de los cuales pueden ser útiles para purificar la secuencia de polipéptidos fusionada a ellos. Los polinucleótidos de la invención también incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos que comprende un gen estructural y sus secuencias asociadas naturalmente que controlan la expresión del gen. La secuencia de nucleótidos que codifican al polipéptido BASB030 de SEQ ID NO : 2,4,6 puede ser idéntico al polipéptido que codifica la secuencia contenida en los nucleótidos 1 al 2307 de SEQ ID NO: 1, o al polipéptido que codifica la secuencia contenida en los nucleótidos 1 a 2307 de SEQ ID NO: 3, o el polipéptido que codifica la secuencia contenida en los nucleótidos 1 a 2307 de SEQ ID NO: 5, respectivamente. Alternativamente, puede ser una secuencia, que es resultado de una redundancia (degeneración) del código genético, también codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2,4,6. El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" como se usa en la presente abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido del BASB030 de Neisseria meningi tidis que tiene una secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 2,4,6. El término también abarca polinucleótidos que incluyen una sola región continua o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrado, una secuencia de transposón integrado, o debido a la edición de ARN o de reorganización de ADN genómico) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias de codificación y/o no codificación. La invención además se relaciona con variantes de los polinucleótidos descritos en la presente que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de SEQ ID NO: 2,4,6. Fragmentos de polinucleótidos de la invención se pueden usar, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la invención. Otras modalidades particularmente preferidas son los polinucleótidos que codifican variantes de BASB030, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB030 de SEQ ID NO: 2,4,6 en el cual varios, algunos, 5 a 10, l a 5, 1 a 3,2,1 ó ningún residuo de aminoácidos se sustituye, modifica, borra y/o añade, en cualquier combinación. Especialmente se prefieren entre estos las sustituciones silenciosas, adiciones y supresiones, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB030. Otras modalidades preferidas de la invención son polinucleótidos que son cuando menos 85 por ciento idénticos sobre su longitud entera a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB030 que tiene una secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 2,4,6, y polinucleótidos que son complementarios a estos polinucleótidos. Respecto a esto, los polinucleótidos cuando menos 90 por ciento idénticos sobre su longitud entera al mismo se prefieren particularmente, y entre estos los polinucleótidos particularmente preferidos, aquellos con cuando menos 95 por ciento se prefieren especialmente. Además, aquellos con cuando menos 97 por ciento se prefieren mucho entre aquellos con cuando menos 95 por ciento, y entre aquellos con cuando menos 98 por ciento y cuando menos 99 por ciento son particularmente muy preferidos, siendo los más preferidos los que tienen cuando menos 99 por ciento. Las modalidades preferidas son polinucleótidos que codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función biológica o actividad que el polipéptido madura codificado por ADN de SEQ ID NO: 1,3,5. De acuerdo con ciertas modalidades preferidas de la invención se proporcionan polinucleótidos que hibridizan, particularmente bajo condiciones estrictas, a secuencias de polinucleótidos BASB030, tales como los polinucleótidos en SEQ ID NO: 1,3,5. La invención además se relaciona con polinucleótidos que hibridizan a las secuencias de polinucleótidos proporcionados en la presente. Con respecto a esto, la invención especialmente se relaciona con polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones estrictas a los polinucleótidos descritos en la presente. Como se usa en la presente, los términos "condiciones estrictas" y "condiciones de hibridización estrictas" significa que la hibridización ocurre solamente si hay cuando menos 95 por ciento y preferiblemente cuando menos 97 por ciento de identidad entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridización estricto es la incubación durante la noche a 42 °C en una solución que comprende: 50 por ciento de formamida, 5x SSC (150 mM NaCl , 15 mM de citrato de trisodio) , 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6) , 5x solución de Denhardt, 10 por ciento de sulfato de dextrano, y 20 microgramos/mililitro de ADN de esperma de salmón cizallado, seguido por lavar el soporte de hibridización en O.lx SSC a aproximadamente 65°C. Las condiciones de hibridización y lavado son muy conocidas y se ejemplifican en Sambrook, y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente Capítulo 11 en el mismo. La hibridización de solución se puede usar con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención. La invención también proporciona un polinucleótido que consiste en o comprende una secuencia de polinucleótidos obtenida seleccionando una biblioteca adecuada que contiene el gen completo para una secuencia de polinucleótidos presentada en SEQ ID NO: 1,3,5 bajo condiciones de hibridización estrictas con una sonda que tiene la secuencia de la secuencia de polinucleótidos presentada en SEQ ID NO: 1,3,5 o un fragmento de la misma; y aislando la secuencia de polinucleótidos. Los fragmentos útiles para obtener este polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores completamente descritos en cualquier otra parte en la presente. Como se describe en otra parte en la presente con respecto a ensayos de polinucleótido de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención, se pueden usar como sonda de hibridización para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNc de longitud completa y clonas genómicas que codifican BASB030 y para aislar ADNc y clonas genómicas de otros genes que tienen una alta identidad, particularmente alta identidad de secuencia, con el gen BASB030. Estas sondas generalmente comprenderán cuando menos 15 residuos de nucleótidos o pares de bases. Preferiblemente, estas sondas tendrán cuando menos 30 residuos de nucleótidos o pares de bases y pueden tener cuando menos 50 residuos de nucleótidos o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán cuando menos 20 residuos de nucleótidos o pares de bases y tendrán cuando menos 30 residuos de nucleótidos o pares de bases . Una región de codificación de un gen BASB030 se puede aislar seleccionando usando una secuencia de ADN proporcionada en SEQ ID NO: 1,3,5 para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Un oligonucleótido etiquetado que tiene una secuencia complementaria a la de un gen de la invención se usa entonces para seleccionar una biblioteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar cuáles miembros de la biblioteca la sonda hibridiza. Hay varios métodos disponibles y muy conocidos para los expertos en la técnica para obtener ADN de longitud completa, o extender ADN corto, por ejemplo, los basados en el método de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (ver, por ejemplo, Frohman, y colaboradores, PNAS USA 85 : 8998-9002, 1988) . Recientes modificaciones de la técnica, ejemplificados por la tecnología de Marathón® (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado de manera significativa la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología de Marathón®, los ADNc se han preparado a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada sobre cada extremo. La amplificación de ácido nucleótido (reacción de cadena de polimerasa) se lleva a cabo para amplificar el extremo 5' "faltante" del ADN usando una combinación de cebadores de oligonucleótidos específicos del gen y específicos del adaptador. La reacción de cadena de polimerasa se repite entonces usando cebadores "anidados", esto es, cebadores designados para calcinar dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico adaptador que calcina además 3 ' en la secuencia adaptadora y un cebador específico del gen que calcina además 5' en la secuencia de gen seleccionada) .

Los productos de esta reacción se pueden analizar entonces mediante secuenciamiento de ADN y un ADN de longitud completa construida ya sea uniendo el producto directamente al ADN existente para dar una secuencia completa, o llevando a cabo una reacción de cadena de polimerasa de longitud entera por separado usando la información de la secuencia nueva para el diseño del cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden emplear, por ejemplo, como reactivos de investigación y materiales para descubrimiento de tratamiento y de diagnósticos para enfermedades, particularmente enfermedades humanas como se discute adicionalmente en la presente relacionándose con ensayos de polinucleótidos. Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de SEQ ID NO: 1-6 se pueden usar en los procesos en la presente como se describe, pero preferiblemente para reacción de cadena de polimerasa, para determinar si los polinucleótidos identificados en la presente en todo o en parte se transcriben o no en bacterias en tejido infectado. Se reconoce que estas secuencias también tendrá utilidad en el diagnóstico de la etapa de infección y tipo de infección que el patógeno alcanzado. La invención también proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos adicionales amino o carboxilo terminales, o aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena de polipéptido, por ejemplo) . Estas secuencias pueden representar un papel para procesar una proteína a partir del precursor a una forma madura, pueden permitir el tratamiento de proteína, pueden alargar o acortar la vida media de la proteína o pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas.

Como generalmente es el caso en vivo, los aminoácidos adicionales se pueden procesar lejos de la proteína madura mediante enzimas celulares. • Para todos y cada uno de los polinucleótidos de la 5 invención se proporciona un polinucleótido complementario a él. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean completamente complementarios a cada polinucleótido con el cual son complementarios . Una proteína precursora, que tiene una forma madura 10 del polipéptido fusionado a una o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se remueven las prosecuencias estos precursores inactivos generalmente se activan. Algunas o todas las prosecuencias se pueden remover antes de la activación. Generalmente, estos precursores se 15 llaman proproteínas. Además de las representaciones estándares A, G, C T/U para los nucleótidos, el término "N" también se puede usar para describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que cualquiera de los cuatro nucleótidos de ADN o ARN 20 puede aparecer como una posición designada en la secuencia de ADN o ARN, excepto si se prefiere que N no sea un ácido nucleico cuando se toma en combinación con posiciones de nucleótidos adyacentes, cuando se lee en el cuadro de lectura correcto, tendría el efecto de generar un codón de terminación 25 prematuro en este marco de lectura.

En suma, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia delantera (la que se puede hacer referencia como una preproteína) , un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son las secuencias delanteras de la preproteína, o una preproteína, la cual es un precursor a una proproteína, que tiene una secuencia delantera y una o más prosecuencias, las cuales generalmente se remueven durante los pasos de procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido. De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para propósitos terapéuticos o profilácticos, en particular inmunización genética. El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética preferiblemente empleará un método de administración conveniente tal como la inyección directa del ADN plásmido en músculos (Wolff y colaboradores, Hum. Mol . Genet . (1992) 1: 363, Manthorpe y colaboradores, Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), la administración de ADN acomplejado con portadores de proteínas específicos (Wu y colaboradores, J Biol Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Benvenisty & Reshef, PNAS USA, (1986) 83: 9551) encapsulación de ADN en varias formas de liposomas (Kaneda y colaboradores, Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang y colaboradores, Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun y colaboradores, DNA Cell Biol (1993) 12: 791) y la infección en vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y colaboradores, PNAS USA (1984) 81: 5849) . Vectores, células hospederas, sistemas de expresión La invención también se relaciona con vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, células hospederas que generalmente están diseñadas técnicamente con vectores de la invención y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes . Los sistemas de traducción libres de células también se pueden emplear para producir proteínas usando AR? derivado de construcciones de AD? de la invención. Los polipéptidos reco binantes de la presente invención se pueden preparar mediante procesos muy conocidos para los expertos en la técnica a partir de células hospederas diseñadas técnicamente genéticamente que comprenden sistemas de expresión. De conformidad con lo anterior, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con los sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, con células huéspedes que están genéticamente diseñadas técnicamente con estos sistemas de expresión, y con la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes . Por la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células huéspedes se pueden diseñar técnicamente genéticamente para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. La introducción de un polinucleótido en una célula huésped se puede efectuar mediante métodos descritos en manuales de laboratorio estándares, tales como Davis, y colaboradores, BASIC METHODS JN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, y colaboradores, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, ?.Y. (1989) , tales como, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípido catiónico, electroincorporación, transducción, carga por raspado, introducción de balística e infección. Ejemplos representativos de hospederas adecuadas incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. Coli , estreptomices , cianobacterias , Bacillus subtilis, Moraxella ca tarar rhalis , Haemophilus influenzae y Neisseria meningi tidis ; células de hongos, tales como células de una levadura, Kluveromyces , Saccharomyces, una basidiomicete, Candida albicans y Aspergillus ; células de insectos tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma Bowes ; y células vegetales, tales como células de una gimnosperma o angiosperma . Una variedad de sistemas de expresión se pueden usar para producir los polipéptidos de la invención. Estos vectores incluyen, entre otros, vectores cromosomales, episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosomales de levadura, de virus tales como baculovirus, papova virus, tales como SV40, virus de vacuna, adenovirus, virus de viruela de aves, virus seudorrabia, picornavirus, retrovirus, y alfavirus y vectores derivados de la combinación de los mismos, tales como los derivados de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Las construcciones de sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulan así como generan expresión. Generalmente, cualquier sistema o vector conveniente para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido huésped puede ser usado para la expresión respecto a esto. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en un sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas muy conocidas y de rutina, tales como, por ejemplo, los presentados en Sambrook y colaboradores, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (supra) . En sistemas de expresión recombinantes en eucariotes, para la secreción de una proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el ambiente extracelular, las señales de secreción adecuadas se pueden incorporar en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas. Los polipéptidos de la presente invención se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos muy conocidos que incluyen precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción acida, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad, cromatografía por hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Más preferiblemente, se emplea la cromatografía por afinidad de metal ion (IMAC) para la purificación. Técnicas muy conocidas para redoblar proteínas se pueden emplear para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, el aislamiento y/o purificación. El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o bacteria. El gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus o bacteria recombinante vivo. La inoculación y la infección en vivo con este vector vivo conducirá a una expresión en vivo del antígeno y la inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias usados para este fin son por ejemplo: virus de viruela (por ejemplo; vacuna, viruela de aves, viruela de canarios) , alfavirus (Sindbis virus, Semliki Forest Virus, Virus de encefalitis equina de Venezuela) , adenovirus, virus adenoasociados, picornavirus (poliovirus, rinovirus) , virus de herpes (virus zóster de varicela, etcétera) , Listeria, Salmonela, Shigela, Neiseria, GCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos, o atenuarse en varias maneras con el fin de obtener vacunas vivas. Estas vacunas vivas también forman parte de la invención. Diagnóstico, pronóstico, serotipificación v ensayos de mutación Esta invención también se relaciona con el uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB030 de la invención para su uso como reactivo de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB030 en un eucariote, particularmente un mamífero, y especialmente un humano, proporcionará un método de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad, la etapa de la enfermedad o respuesta de un organismo infeccioso a fármacos. Los eucariotes, particularmente mamíferos, y especialmente humanos, particularmente los infectados o sospechosos de estar infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BASB030, se pueden detectar en el ácido nucleótido o nivel de aminoácidos mediante una variedad de técnicas bien conocidas así como por métodos proporcionados en la presente.

Los polipéptidos y polinucleótidos para el pronóstico, diagnóstico u otros análisis se pueden obtener de una pluralidad de materiales corporales del individuo putativamente infectado y/o infectado. Los polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, se pueden usar directamente para la detección o se pueden amplificar enzimáticamente usando reacción de cadena de polimerasa o cualquier otra técnica de amplificación antes del análisis. El ARN, particularmente ARNm, .ADNc y ADN genómico se pueden usar de las mismas maneras. Usando la amplificación, la caracterización de las especies y cepa de organismo infeccioso o residente presente en un individuo, se puede hacer mediante un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Las supresiones o las inserciones ee pueden detectar mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada a partir de un organismo relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Las mutaciones puntuales se pueden identificar hibridizando ADN amplificado a secuencias de polinucleótidos BASB030 etiquetadas. Las secuencias perfectamente o significativamente coincidentes se pueden distinguir de las duplicaciones en perfectamente o más significativamente coincidentes mediante DNasa o digestión de RNasa, para ADN o ARN respectivamente, o detectando diferencias en temperaturas de fusión o cinética de desnaturalización. Las diferencias de secuencias de polinucleótidos también se puede detectar mediante alteración en la movilidad electroforética de • los fragmentos de polinucleótidos en gels en comparación con 5 una secuencia de referencia. Esto se puede llevar a cabo con o sin agentes desnaturalizados. Las diferencias de polinucleótidos también se pueden detectar por secuenciamiento de ADN directo o ARN. Ver, por ejemplo, Myers y colaboradores, Science, 230 : 1242 (1985) . Los cambios de secuencias en k 10 lugares específicos también se pueden revelar mediante medios de protección de nucleasa, tales como RNasa, ensayo de protección VI y SI o un método de disociación química. Ver, por ejemplo, Cotton y colaboradores, Proc. Natl . Acad. Sci . , USA, 85:4397-4401 (1985) . 15 En otra modalidad, un arreglo de sondas de oligonucleótidos que comprenden secuencia de nucleótidos BASB030 o fragmentos de los mismos se pueden construir para conducir selección eficiente de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipos, clasificación o identificación 20 taxonómica. Los métodos de tecnología de arreglos son muy conocidos y tienen aplicabilidad general y se pueden usar para enfrentar una variedad de cuestiones en genética molecular incluyendo la expresión del gen, enlaces genéticos, y variabilidad genética (véase, por ejemplo, Chee y 25 colaboradores, Science, 274 : 610 (1996)).

De este modo en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un juego diagnóstico que comprende: (a) un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1,3,5, ó un fragmento del mismo; (b) una secuencia de nucleótido complementaria con la de (a) ; (c) un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de SEQ ID NO: 2,4,6 ó un fragmento del mismo; o (d) un anticuerpo a un polipéptido de la presente invención, preferiblemente al polipéptido de SEQ ID NO: 2,4,6. Se apreciará que en cualquiera de estos juegos, (a) , (b) , (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Este juego tendrá uso para diagnosticar una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, entre otras. Esta invención también se relaciona con el uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferible, SEQ ID NO: 1,3,5, que se asocia con una enfermedad o patogenicidad que proporciona una herramienta de diagnóstico que puede añadir a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, un pronóstico de un curso de enfermedad, una determinación de un estado de enfermedad, o una susceptibilidad a una enfermedad, lo cual es resultado de la subexpresión, sobre-expresión o expresión alterada del polinucleótido. Los organismos, particularmente organismos infecciosos, que llevan mutaciones en este polinucleótido, se pueden detectar al nivel de polinucleótido mediante una variedad de técnicas, tales como las descritas en otras partes en la presente. Las células de un organismo que lleva mutaciones de polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención también se pueden detectar en el nivel de polinucleótido o polipéptido mediante una variedad de técnicas, para permitir la serotipificación, por ejemplo. Por ejemplo, se puede usar RT-PCR para detectar mutaciones en el ARN. Se prefiere particularmente usar RT-PCR junto con sistemas de detección automatizadas, tales como, por ejemplo, GeneScan, ARN, ADNc o ADN genómico también se puede usar para el mismo propósito, reacción de cadena de polimerasa. Como un ejemplo, cebadores de reacción de cadena de polimerasa complementarios a un polinucleótido que codifica el polipéptido BASB030 se puede usar para identificar y analizar mutaciones. La invención además proporciona cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos removidos del extremo 5' y/o el 3'. Estos cebadores se pueden usar para, entre otras cosas, amplificar BASB030 de ADN y/o ARN aislado de una muestra derivada de un individuo, tal como material corporal. Los cebadores se pueden usar para amplificar un polinucleótido aislado de un individuo infectado, de manera que el polinucleótido se puede someter entonces a varias técnicas para la elucidación de la secuencia de polinucleótidos. De esta manera, las mutaciones en la secuencia de polinucleótidos se pueden detectar y usar para diagnosticar y/o pronosticar las infecciones o su estado o curso, o para serotipificar y/o clasificar el agente infeccioso. La invención además proporciona un proceso para diagnosticar enfermedad, preferiblemente informaciones bacterianas, más preferiblemente infecciones causadas por Neisseria meningitidis, que comprende determinar a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como material corporal, un nivel aumentado de expresión de polinucleótido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1,3,5. La expresión aumentada o disminuida de un polinucleótido BASB030 se puede medir usando cualquiera de los métodos muy conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación, reacción de cadena de polimerasa, RT-PCR, protección RNasa, manchado Northern, espectrometría y otros métodos de hibridización. Además, un ensayo de diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar sobre-expresión de polipéptido BASB030 comparado con muestras de tejido de control normales se puede usar para detectar la presencia de una infección, por ejemplo. Las técnicas de prueba también se pueden usar para determinar niveles de un polipéptido BASB030, en una muestra derivada de un hospedero, tal como un material corporal, son muy conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos de prueba incluyen radioinmunoensayos, ensayos de enlace competitivo, análisis de manchado Western, ensayos de emparedado anticuerpo, detección de anticuerpo y ensayos de ELISA. Los polinucleótidos de la invención se pueden usar como componentes de arreglos de polinucleótidos, preferiblemente arreglos de alta densidad o rejilla. Estos arreglos de alta densidad son particularmente útiles para propósitos de diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, un conjunto de manchas comprendiendo cada una un gen diferente, y además comprendiendo un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, se puede usar para sondear, tal como usando hibridización o amplificación de ácido nucleico, usando una sonda obtenida o derivada de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia de polinucleótidos particular o secuencia relacionada con un individuo. Esta presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Neisseria meningi tidis, y puede ser útil en diagnosticar y/o pronosticar la enfermedad o un curso de enfermedad. Una rejilla que comprende varias variantes de la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1,3,5 se prefiere. También se prefiere una rejilla que comprende varias variantes de una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 2,4,6. Anticuerpos Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención o variantes de la misma, o células que expresan la misma se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para estos polipéptidos o polinucleótidos respectivamente . En ciertas modalidades preferidas de la invención se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos BASB030. Los anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención se pueden obtener administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos que llevan epítope de alguno de los dos o de ambos, análogos de alguno de los dos o de ambos, células que expresan alguno de los dos o ambos, a un animal, preferiblemente a un no humano, usando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, cualquier técnica conocida en el campo que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de línea celular continua se puede usar. Los ejemplos incluyen varias técnicas, tales como aquellas en Kohler, G. y Milstein, C, Nature 256 : 495-497 (1975); Kozbor y colaboradores, Immunology Today 4 : 72 (1983); Colé y colaboradores, páginas 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CÁNCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985) .

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena única (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena simple a polipéptidos o polinucleótidos de esta 5 invención. También, los ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, se pueden usar para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos a los polipéptidos o polinucleótidos de la invención. Alternativamente, la tecnología de despliegue de fago dfe 10 se puede utilizar para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de enlace hacia un polipéptido de la invención ya sea de repertorios de PCR amplificado genes v o de linfocitos de humanos seleccionados por poseer bibliotecas anti-BASB030 o de bibliotecas naturales (McCafferty, y colaboradores, (1990) , 15 Nature 348, 552-554; Marks, y colaboradores, (1992) Biotechnology 10, 779-783) . La afinidad de estos anticuerpos también se pueden mejorar mediante, por ejemplo, redistribución de cadena (Clackson y colaboradores, (1991) Nature 352 : 628) . Los anticuerpos antes descritos se pueden emplear 20 para aislar o para identificar , clonas que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad. De este modo, entre otros, los anticuerpos contra el 25 polipéptido BASB030 o el polinucleótido BASB030 se pueden emplear para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas. Variantes de polipéptidos incluyen variantes equivalentes ant igénicamente , epi tópicamente o inmunológicamente forman un aspecto particular de esta invención. Preferiblemente, el anticuerpo o variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es humano el anticuerpo puede más preferiblemente ser "humanizado", en donde la región o regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado de hibridoma ha sido transplantado en un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo, como se describe en Jones y colaboradores, (1986), Nature 321, 522-525 o Tempest y colaboradores, (1991) Biotechnology 9 , 266-273. Antagonistas y agonistas - ensayos y moléculas Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención también se pueden usar para valorar el enlace de sustratos de moléculas pequeñas y ligandos en, por ejemplo, células, preparaciones de células libres, bibliotecas químicas, y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos naturales y ligandos o pueden ser imitaciones estructurales o funcionales. Ver, por ejemplo, Coligan y colaboradores, Current Protocols in Inmmunology 1(2) : Chapter 5 (1991) .

Los métodos de selección simplemente pueden medir el enlace de un compuesto candidato con el polipéptido o polinucleótido, o con células o membranas que llevan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido por medio de una etiqueta directamente o indirectamente asociada con el compuesto candidato. Alternativamente, el método de selección puede involucrar la competición con un competidor etiquetado. Además, estos métodos de selección pueden probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por la activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección adecuados a las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Inhibidores de activación generalmente se prueban en presencia de un agonista conocido y el efecto sobre la activación mediante el agonista por la presencia del compuesto candidato se observa. Constitutivamente el polipéptido activo y/o los polipéptidos y polinucleótidoe expresados constitutivamente se pueden emplear en métodos de selección para agonistas o inhibidores inversos, en la ausencia de un agonista o inhibidor, probando si el compuesto candidato da como resultado inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso. Además, los métodos de selección simplemente pueden comprender los pasos de mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, midiendo la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB030 en la mezcla, y comparando la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB030 de la mezcla con un estándar. Las proteínas de fusión, tales como las hechas de la porción Fc y del polipéptido BASB030, como se describió anteriormente en la presente, también se pueden usar para ensayos de selección de alta producción para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como filogenéticamente y/o polipéptidos relacionados funcionalmente (ver D. Bennett y colaboradores, J Mol Recognition, 8: 52-58 (1995); y K. Johanson y colaboradores, J Biol Chem, 270 (16): 9459-9471 (1995) ) . Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se enlazan a y/o interactúan con un polipéptido de la presente invención también se pueden usar para configurar métodos de selección para detectar el efecto de compuestos añadidos en la producción de ARNm y/o polipéptidos en células. Por ejemplo, un ensayo ELISA se puede construir para medir niveles secretados o asociados con células del polipéptido usando anticuerpos monoclonales y policlonales mediante métodos estándares conocidos en el campo. Esto se puede usar para descubrir agentes que pueden inhibir o aumentar la producción del polipéptido (también llamados antagonistas o agonistas, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados convenientemente.

La invención también proporciona un método para seleccionar compuestos para identificar aquellos que aumentan (agonistas) o bloquean (antagonistas) la acción de los polipéptidos BASB030 o polinucleótidos, particularmente 5 aquellos compuestos que son bacterioestáticos y/o bactericidas. El método para seleccionar puede involucrar técnicas de alta producción. Por ejemplo, para seleccionar agonistas o antagonistas, se incuba una mezcla de reacción sintética, un compartimiento celular, tal como una membrana, envoltura áfc 10 celular o pared celular, o una preparación de cualquiera de los mismos, que comprenda polipéptido BASB030 y un sustrato etiquetado o ligando de este polipéptido en la ausencia o presencia de una molécula candidata que puede ser agonista o antagonista de BASB030. La capacidad de la molécula candidata 15 para agonizar o antagonizar con el polipéptido BASB030 se refleja en el enlace disminuido del ligando etiquetado o producción disminuida de producto a partir de este sustrato. ^- Las moléculas que se enlazan gratuitamente, es decir, sin 9 inducir los efectos del polipéptido BASB030 es más probable que 20 sean buenos antagonistas. Las moléculas que se enlazan bien y, como puede ser el caso, aumenta la velocidad de la producción del producto a partir del sustrato, aumentan la transacción de la señal, o aumentan la actividad del canal químico son agonistas. La detección de la velocidad o nivel de, como el 25 caso puede ser, la producción del producto a partir del sustrato, la señal de transducción, o la actividad del canal químico se puede aumentar "usando un sistema reportero. Los sistemas reporteros que pueden ser útiles en este respecto incluyen pero no se limitan a sustrato etiquetado, colorimétrico convertido en producto, un gen reportero que responde a cambios en la actividad de polinucleótido o polipéptido BASB030, y los ensayos de enlace conocidos en la técnica . Otro ejemplo de un ensayo para agonistas BASB030 es un ensayo competitivo que combina el BASB030 y un agonista potencial con moléculas enlazadas BASB030, moléculas enlazadas BASB030 recombinantes, sustratos o ligandos naturales, o miméticos de sustratos o ligandos, bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El BASB030 se puede etiquetar, tal como con radioactividad o un compuesto colorimétrico, de manera que el número de moléculas BASB030 enlazadas a una molécula de enlace o convertidas en producto se puede determinar con precisión para valorar la efectividad del antagonista potencial . Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se enlazan con un polinucleótido y/o polipéptido de la invención y mediante esto inhiben o extinguen su actividad de expresión. Los antagonistas potenciales también pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína relacionada cercanamente o anticuerpo que enlaza los mismos sitios en una molécula de enlace, tales como una molécula de enlace, sin inducir actividades inducidas por BASB030, mediante lo cual se evita la acción o expresión de los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB030 excluyendo a los polipéptido BASB030 y/o los polinucleótidos de enlazarse. Los antagonistas potenciales incluyen una pequeña molécula que se enlaza y ocupa el sitio de enlace del polipéptido mediante lo cual se evita que se enlace a moléculas de enlace celular, de manera que la actividad biológica normal se evita. Ejemplos de pequeñas moléculas incluyen, pero no se limitan a, pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, o moléculas parecidas a péptidos . Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas antisentido (véase Okano, J. Neurochem, 56 : 560 (1991) ; OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTI SENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESIÓN, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988) , para una descripción de estas moléculas) . Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados con y variantes de BASB030. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con proteínas de fusión solubles genéticamente diseñadas que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y varias porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de varias subclases (IgG, IgM, IgA, IgE) . Se prefiere como una inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente IgGl, en donde la fusión se lleva a cabo en la región de la articulación. En una modalidad particular, la parte Fc se puede remover simplemente mediante la incorporación de una secuencia de disociación que se puede disociar con el factor de coagulación de sangre Xa. Además, esta invención se relaciona con procesos para la preparación de estas proteínas de fusión mediante diseño técnico genético, y con el uso del mismo para la selección de fármacos, diagnóstico y terapia. Otro aspecto de la invención también se relaciona con polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión. Ejemplos de la tecnología de proteínas de fusión se puede encontrar en las Solicitudes de Patentes Internacionales números W094/29458 y W094/22914. Cada una de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la presente se puede usar en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos . La proteína codificada, después de la expresión, se puede usar como un objetivo para la selección de fármacos antibacterianos. Adicionalmente, las secuencias de polinucleótidos que codifican las regiones terminales amino de la proteína codificada o Shine-Delgarno o de otras secuencias que facilitan la traducción del ARNm respectivos se pueden usar para construir secuencias antisentido para controlar la expresión de la secuencia de codificación de interés. La invención también proporciona el uso del polipéptido, polinucleótido, agonista o antagonista de la invención para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un hospedero eucariótico, preferiblemente mamífero, para las secuelas de infección. En particular, las moléculas de la invención se pueden usar: en la prevención de adhesión de bacterias, en particular gram positivas y/o gram negativas, a proteínas de matriz extracelular eucarióticas, preferiblemente mamíferos, o dispositivos internos a proteínas de matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de matriz extracelular eucarióticas, preferiblemente de mamíferos, y proteínas de BASB030 bacterianas que median el daño al tejido y/o; bloquear la progresión normal de la patogénesis en infecciones iniciadas distintas que por el implante de dispositivos internos o por otras técnicas quirúrgicas . De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporcionan agonistas y antagonistas BASB030, preferiblemente agonistas y antagonistas bacterioestáticos o bactericidas . Los antagonistas y agonistas de la invención se pueden emplear, por ejemplo, para evitar inhibir y/o tratar enfermedades.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con mimotopos del polipéptido de la invención. Un mimotopo es una secuencia de péptidos, suficientemente similar al péptido original (secuencialmente o estructuralmente) , el cual es capaz de ser reconocido por anticuerpos que reconocen al péptido nativo; o es capaz de criar anticuerpos que reconocen al péptido original cuando se acopla con un portador conveniente. Los péptidos mimotopos se pueden diseñar para un propósito particular mediante la adición, supresión o sustitución de los aminoácidos elegidos. De este modo, los péptidos se pueden modificar para los propósitos de facilidad de conjugación con un vehículo de proteína. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos métodos de conjugación química incluir cisteína terminal . Además puede ser deseable para los péptidos conjugados a un portador de proteína incluir un término hidrofóbico distal del término conjugado del péptido, de manera que el extremo no conjugado libre del péptido sigue estando asociado con la superficie de la proteína portadora. Mediante esto se presenta el péptido en una conformación que se parece más cercanamente a la del péptido que se encuentra en el contexto de la molécula original entera. Por ejemplo, los péptidos se pueden alterar para tener una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrofóbica C-terminal. Alternativamente, la adición o sustitución de una forma D-estereoisómero de uno o más de los aminoácidos se puede realizar para crear un derivado benéfico, por ejemplo, para aumentar la estabilidad del péptido. De manera alternativa, los mimotopos del péptido se pueden identificar usando anticuerpos que son capaces ellos mismos de enlazarse con los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como una tecnología de despliegue de fagos (EP 0552 267 Bl) . Esta técnica, genera un gran número de secuencias de péptidos que imitan la estructura de los péptidos nativos y, por lo tanto, son capaces de enlazarse con anticuerpos de péptidos antinativos, pero no necesariamente comparten ellos mismos homología de secuencia significativa con el polipéptido original. Vacunas Otro aspecto de la invención se relaciona con un método para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente humanos, que comprende inocular al individuo con polinucleótido y/o polipéptido BASB030, o un fragmento o variante del mismo, adecuado para producir anticuerpos y/o respuesta inmune de célula T para proteger al individuo de la infección, particularmente la infección bacteriana y más particularmente la infección por Neisseria meningi tidis . También se proporcionan métodos mediante los cuales esta respuesta inmunológica hace más lenta la réplica bacteriana. Todavía otro aspecto de la invención se relaciona con un método para inducir respuesta inmunológica en un individuo que comprende administrar a este individuo un vector de ácido nucleico, secuencia o ribozima para dirigir la expresión del polinucleótido y/o polipéptido BASB030, o un fragmento o un variante del mismo, para expresar el polinucleótido y/o polipéptido BASB030, o un fragmento o un variante del mismo en vivo con el fin de inducir una respuesta inmunológica, de manera que, produzca anticuerpos y/o respuesta inmune de célula T, incluyendo, por ejemplo, células T que producen citocina o células T citotóxicas, para proteger al individuo, preferiblemente un humano, de la enfermedad si esa enfermedad ya está establecida dentro del individuo o no. Un ejemplo de administrar el gen es acelerándolo en las células deseadas como un recubrimiento sobre partículas o de otro modo. Este vector de ácido nucleico puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido de ADN/ARN, un complejo de ADN-proteína o un complejo de ARN-proteína. Otro aspecto de la invención se relaciona con una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un humano, capaz de haberse inducido dentro de una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en este individuo a un polinucleótido y/o polipéptido BASB030 codificado a partir del mismo, en donde la composición comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB030 recombinante codificado a partir del mismo y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido, polipéptido BASB030 codificado a partir del mismo, u otro polipéptido de la invención. La respuesta • inmunológica se puede usar terapéuticamente o profilácticamente 5 y puede tomar la forma de inmunidad anticuerpo y/o inmunidad celular, tal como inmunidad celular que surge de las células CTL o CD4+ T. Un polipéptido BASB030 o fragmento del mismo se puede fundir con una coproteína o fracción química que puede o no en ^fc 10 sí misma producir anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína fusionada o modificada la cual puede tener propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras . Esta proteína recombinante fusionada, preferiblemente además 15 comprende una coproteína antigénica, tal como la lipoproteína D Haemophilus influenzae, Glutationa-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra coproteína relativamente ^^ grande que solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Más aún, la coprotema puede actuar 20 como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La coproteína se puede unir ya sea al término amino o carboxi de la primera proteína. Esta invención proporciona composiciones, 25 particularmente composiciones de vacunas, y métodos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencia de ADN inmunoestimulantes, tales como las descritas en Sato, Y., y colaboradores, Science 273: 352 (1996). También, esta invención proporciona métodos que usan 5 el polinucleótido descrito o fragmentos particulares del mismo, que se ha demostrado que codifican regiones no variables de proteínas superficiales de células bacterianas, en construcciones de polinucleótidos usadas en estos experimentos de inmunización genética en modelos animales de infección y con M /Sík 10 Neisseria meningi tidis . Estos experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopes de proteínas capaces de provocar una respuesta profiláctica o respuesta inmunoterapéutica. Se cree que este enfoque permitirá la preparación subsecuente de anticuerpos monoclonales de valor 15 particular, derivados del órgano de requisito del animal que resiste o desaparece con éxito la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infección bacteriana, particularmente infección por Neisseria meningi tidis, en mamíferos, particularmente humanos. 20 La invención también incluye una formulación de vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un portador conveniente, tal como un portador aceptable farmacéuticamente. Ya que los polipéptidos y polinucleótidos se pueden desintegrar 25 en el estómago, preferiblemente se administra parenteralmente, incluyendo, por ejemplo, administración que es subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica. Las formulaciones convenientes para la administración parenteral incluyen soluciones de inyección estéril acuosa y no acuosa las cuales pueden contener antioxidantes, reguladores, compuestos bacterioestáticos, y soluciones que vuelven a las formulaciones isotónicas con el fluido corporal, preferiblemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes viscosantes. Las formulaciones se pueden presentar en dosis unitaria o contenedores de dosis múltiples, por ejemplo, ampolletas y frascos cerrados y se pueden almacenar en condiciones secas por enfriamiento requiriendo solamente la visión de portador líquido estéril inmediatamente antes del uso. La formulación de vacuna de la invención también puede incluir sistemas adyuvantes para aumentar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente el sistema adyuvante eleva preferencialmente un tipo de respuesta THl . Una respuesta inmune se puede ampliamente distinguir en dos categorías extremas, siendo una humoral o respuestas inmunes mediadas por células (tradicionalmente caracterizada por anticuerpos y mecanismos efectores celulares de protección respectivamente) . Estas categorías de respuesta se han denominado respuestas tipo THl (respuesta mediada por células) , y respuestas inmunes tipo TH2 (respuestas humorales) .

Las respuestas inmunes tipo THl extremas se pueden caracterizar por la generación de linfocitos T citotóxicos específicos de antígenos, aplotipo restringidos, y respuestas celulares de eliminadores naturales. En ratones las respuestas tipo THl frecuentemente se caracterizan por la generación de anticuerpos de subtipo IgG2a, mientras que en humanos esto corresponde a anticuerpos tipo IgGl . Las respuestas inmunes tipo TH2 se caracterizan por la generación de un rango amplio de isotipos de inmunoglobulinas que incluyen en ratón IgGl, IgA, e IgM. Se puede considerar que la fuerza impulsora detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citocinas. Altos niveles de citocinas tipo THl tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células a un antígeno dado, mientras que altos niveles de citocinas tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales al antígeno. La distinción de respuestas inmunes tipo THl y TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmune que se describe como que es predominantemente THl o predominantemente TH2. Sin embargo, frecuentemente es conveniente considerar las familias de citocinas en los términos descritos en clonas de células T murinas CD4 +ve por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R . and Coffman, R . L . (1989) THl y TH2 cells : different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties . Annual Review of Immunology, 7 , pl45-173) . Tradicionalmente, a respuestas tipo THl se asocian con la producción de citocinas INF-7 e IL-2 mediante linfocitos T. Otras citocinas frecuentemente se asocian directamente con la inducción de respuestas inmunes tipo THl no son producidas por células T, tales como IL-12. En cambio, las respuestas tipo TH2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13. Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son particularmente convenientes a la estimulación ya sea de respuestas de citocina tipo THl o TH2. Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después e una vacunación o infección incluye la medición directa de la producción de citocinas THl o TH2 mediante linfocitos T in vi tro después de la re-estimulación con antígeno, y/o la medición de la proporción IgGl:IgG2a de las respuestas de anticuerpos específicos de antígenos. De este modo, un adyuvante tipo THl es uno que preferencialmente estimula a las poblaciones de células T aisladas para producir altos niveles de citocinas tipo THl cuando se re-estimulan con antígeno in vi tro, y esto mueve el desarrollo tanto de linfocitos T CD8+ citotóxico como respuesta de inmunoglobulina específica de antígeno asociadas con isotipo tipo THl. Los adyuvantes que son capaces de la estimulación preferencial de la respuesta de células THl se describen en la Solicitud de Patente Internacional número WO 94/00153 y WO 95/17209. El monofosforilo lípido 3-Des-O-acilado A (3D-MPL) es uno de estos adyuvantes. Este se conoce a partir de GB 2220211 (Ribi) . Químicamente es una mezcla de monofosforilo lípido A 3-Des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y está fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida del monofosforilo lípido A 3-Des-O-acilado se describe en la Patente Europea número 0 689 454 Bl (SmithKIine Beecham Biologicals SA) . Preferiblemente, las partículas del ED-MPL son suficientemente pequeñas para filtrarse estérilmente a través de una membrana de 0.22 mieras (Patente Europea número 0 689 454) . 3D-MPL estará presente en el rango de 10 microgramos -100 microgramos preferiblemente 25-50 microgramos por dosis en donde el agente típicamente estará presente en un rango de 2-50 microgramos por dosis . Otro adyuvante preferido comprende QS21, un Hplc purificado de fracción no tóxica derivada de la corteza de la Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente esto se puede mezclar con monofosforilo lípido A 3-Des-O-acilado (3D-MPL) , opcionalmente junto con un vehículo. El método de producción de QS21 se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,057,540.

Las formulaciones adyuvantes no reactogénicas que contienen QS21 se han descrito previamente (WO 96/33739) .

Estas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol se ha mostrado que son adyuvantes de estimulación THl con éxito cuando se formulan junto con un antígeno. Los otros adyuvantes que son estimuladores preferenciales de la respuesta celular THl incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo, secuencias CpG no metiladas como se describe en WO 96/02555. Combinaciones de diferentes adyuvantes de estimulación THl, tales como aquellas mencionadas más adelante en la presente, se contemplan por proporcionar un adyuvante que es un estimulante preferencial de respuesta celular THl. Por ejemplo, QS21 se puede formular junto con 3D-MPL. La proporción de QS2l:3D-MPL típicamente estará en el orden de 1:10 a 10:1; preferiblemente 1:5 a 5:1 y frecuentemente sustancialmente 1:1. El rango preferido para la sinergia óptima es 2.5:1 hasta 1:1 3D-MPL:QS21. Preferiblemente un portador también está presente en la composición de vacuna de acuerdo con la invención. El portador puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio. Una emulsión preferida de aceite en agua comprende un aceite metabolizable, tales como escualeno, alfa tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido los antígenos en la composición de vacuna de acuerdo con la información se combinan con QS21 y 3D-MPL en una emulsión. Adicionalmente la emulsión de aceite en agua puede contener • span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina. 5 Típicamente para la administración humana QS21 y 3D- MPL estarán presentes en una vacuna en el rango de 1 microgramo - 200 microgramos, tal como 10-100 microgramos, preferiblemente de 10 microgramos - 50 microgramos por dosis. Típicamente el aceite en agua comprenderá de 2 a 10 por ciento de escualeno, 10 de 2 a 10 por ciento de alfa tocoferol y de 0.3 a 3 por ciento de Tween 80. Preferiblemente la proporción de escualeno: alfa tocoferol es igual a o menor que 1 y esto proporciona una emulsión más estable. Span 85 también puede estar presente a nivel de 1 por ciento. En algunos casos puede ser ventajoso 15 que las vacunas de la presente invención además contengan un estabilizante . El aceite no tóxico en emulsiones de aceite en agua no tóxicas preferiblemente contienen aceite no tóxico, por ejemplo, escualano o escualeno, un emulsificante, por ejemplo, 20 Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina regulada de fosfato. Una formulación adyuvante particularmente potente que involucra QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210. 25 La presente invención también proporciona una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoinmunes y condiciones relacionadas . Esta composición de vacuna polivalente puede incluir un adyuvante que induce a TH-l como se describe anteriormente en la presente. Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos BASB030 y polinucleótidos, se entenderá que cubre fragmentos de los polipéptidos y polinucleótidos que se presentan naturalmente, y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, supresiones, o sustituciones que no afectan sustancialmente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes. El antígeno también se puede administrar en forma de una bacteria completa (muerta o viva) o como fracciones subcelulares, estas posibilidades incluyen la misma N. meningitidis. Composiciones, juegos v administración En otro aspecto de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido BASB030 y/o un polipéptido BASB030 para la administración a una célula o a un organismo multicelular. La invención también se relaciona con composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido discutido en la presente o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se pueden emplear en combinación con un portador o portadores no estériles o estériles para su uso con células, tejidos u organismos, tales como el portador farmacéutico conveniente para la administración a un individuo. Estas composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo de medio o una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estos portadores pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina regulada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de las mismas. La formulación deberá ajustarse al modo de administración. La invención además se relaciona con paquetes y juegos farmacéuticos y de diagnóstico que comprenden uno o más contenedores llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones antes mencionadas de la invención. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención se pueden emplear solos o juntos con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier manera efectiva, conveniente, que incluye, por ejemplo, administración por rutas tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intaperitoneal, intramuscular, subcutáneo, intranasal o intradérmica entre otras.

En terapia o como profiláctico, el agente activo se puede administrar a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica. En otro aspecto, la invención presente proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido y/o polinucleótido, tales como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, péptido agonista o antagonista o un compuesto de molécula pequeña, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estos portadores incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina regulada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de las mismas. La invención además se relaciona con paquetes farmacéuticos y juegos que comprenden uno o más contenedores rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones antes mencionadas de la invención. Los polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos. La composición se adaptará a la ruta de administración, por ejemplo, mediante una ruta sistémica u oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen, típicamente inyección intravenosa. Otras rutas de inyección, tales como subcutánea, intramuscular, o intraperitoneal, se pueden usar. Medios alternativos de la administración sistémica incluyen administración transmucosal y transdérmica usando penetrantes tales como sales biliares o ácido fusídico u otros detergentes. Además, si un polipéptido u otro compuesto de la presente invención se puede formular en una forma entérica o formulación encapsulada, también puede ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos también puede ser tópica y/o localizada en forma de salves, pastas, gels, soluciones, polvos y similares. Para la administración a mamíferos, y particularmente humanos, se espera que el nivel de dosis diaria del agente activo será de 0.01 miligramos/kilogramo hasta 10 miligramos/kilogramo, típicamente alrededor de 1 miligramo/kilogramo. El médico en cualquier caso determinará la dosis real que será la más conveniente para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo particular. Las dosis anteriores son ejemplares del caso promedio. Desde luego, puede haber casos individuales en donde se ameriten rangos de dosis más altas o más bajas, y éstas están dentro del alcance de esta invención. El rango de dosis requerido depende de la elección del péptido, la ruta de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la enfermedad del sujeto, y el juicio del médico responsable. Sin embargo, las dosis convenientes están en el rango de 0.1-100 microgramo/kilogramo de sujeto. Una composición de vacuna es convenientemente una forma inyectable. Los adyuvantes convencionales se pueden emplear para aumentar la respuesta inmune. Una dosis unitaria conveniente para vacunación es de 0.5-5 microgramos/kilogramo de antígeno, y esta dosis preferiblemente se administra 1-3 veces y con un intervalo de 1-3 semanas. Con el rango de dosis indicado, no se observarán efectos tóxicos adversos con los compuestos de la invención que impediría su administración a individuos convenientes. Variaciones amplias en la dosificación necesaria, sin embargo, se esperan en vista de la variedad de compuestos disponibles y de las diferentes eficiencias o distintas rutas de administración. Por ejemplo, la administración oral se esperaría que requiriera dosis mayores que la administración por inyección intravenosa. Las variaciones en los niveles de dosis se pueden ajustar usando rutinas empíricas para optimización, como se sabe bien en la técnica. Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible, y algoritmos Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos forman un recurso de información valioso con el cual se determina sus estructuras en segunda y tercera dimensión así como para identificar secuencias adicionales de homología similar. Estos enfoques se facilitan más almacenando la secuencia en un medio legible de computadora y luego usando los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido para buscar una base de datos de secuencia usando herramientas de búsqueda muy conocidas, tales como el paquete de programa GCG. También se proporciona por la invención métodos para el análisis de secuencias de caracteres o cadenas, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los métodos preferidos de análisis de secuencias incluyen, por ejemplo, métodos de análisis de homología de secuencias, tales como un análisis de identidad y de similaridad, análisis de estructura de ADN, ARN y proteína, ensamble de secuencias, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencias, determinación de cuadro de lectura abierto, llamado de base de ácido nucleico, análisis de uso de codones, recorte de base de ácidos nucleicos, y análisis de pico de cromatograma de secuenciamiento. Se proporciona un método basado en computadora para realizar identificación de homología. Este método comprende los pasos de: proporcionar una primera secuencia de polinucleótidos que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible por computadora; y comparar la primera secuencia de polinucleótidos con cuando menos un segundo polinucleótido o secuencia de polipéptidos para identificar homología.

Un método basado en computadora también se proporciona para realizar identificación de homología, este método comprende los pasos de: proporcionar una primera secuencia de polipéptido que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible por computadora; y comparar la primera secuencia de polipéptido con cuando menos una segunda secuencia de polinucleótido o polipéptido para identificar la homología. Todas las publicaciones y referencias, incluyendo pero sin limitarse a patentes y solicitudes de patentes, citadas en esta especificación se incorporan en la presente mediante referencia por entero como si cada publicación o referencia individual estuviera específicamente e individualmente indicada como incorporada por referencia en la presente como se presentó completamente. Cualquier solicitud de patente a la cual esta solicitud reclama prioridad se incorpora mediante referencia en la presente por completo de la manera descrita anteriormente en las publicaciones y referencias . Definiciones "Identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según sea el caso, determinado comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de la secuencia entre las secuencias de polipéptido o polinucleótido, según sea el caso, determinado por la coincidencia entre cadenas de estas secuencias. "Identidad" fácilmente se puede calcular por métodos conocidos, que incluyen pero no se limitan a los descritos en ( Co putational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M., y Devereus, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H. , y Lipman, D., SIAM J. Applied Math . , 48 : 1073 (1988) . Métodos para determinar la identidad se diseñan para dar la coincidencia más grande entre las secuencias probadas. Más aún, los métodos para determinar la identidad se codifican en programas de computadoras disponibles públicamente. Los métodos de programas de computadoras para determinar la identidad de dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el programa GAP en el paquete de programa GCG (Devereus, J. , y colaboradores, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F., y colaboradores, J. Molec. Biol . 215: 403-410 (1990), y FASTA (Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988). El BLAST familia de programas públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual , Altschul, S., y colaboradores, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Atlschul, S., y colaboradores, J. Mol . Biol . 215 : 403-410 (1990) . El algoritmo muy conocido de Smith Waterman también se puede usar para determinar identidad. Los parámetros para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992) Penalidad de hueco: 8 Penalidad de longitud de hueco: 2 Un programa útil con estos parámetros está disponible públicamente como el programa "gap" para el grupo de computadora de genética, Madison Wl . Los parámetros antes mencionados son los parámetros por omisión para las comparaciones de péptidos (junto con no penalidad para huecos finales) . Parámetros para la comparación de polinucleótido incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970) Matriz de comparación: coincidencias = +10, falta de coincidencia = 0 Penalidad de hueco: 50 Penalidad de longitud de hueco: 3 Disponible como: El programa "gap" del grupo de computadora de genética, Madison Wl . Estos son los parámetros por omisión para las comparaciones de ácidos nucleicos . Un significado preferido para "identidad" para polinucleótidos y polipéptidos, según sea el caso, se proporciona en (1) y (2) más adelante. (1) Las modalidades de polinucleótidos además incluyen un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótido que tiene cuando menos 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100 por ciento de identidad con la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: l o puede incluir hasta cierto número entero de alteraciones de nucleótido en comparación con las secuencias de referencia, en donde las alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en cuando menos una supresión, sustitución de nucleótidos, incluyendo transición y transversión, o inserción, y en donde estas alteraciones pueden presentarse en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia de nucleótido de referencia o en cualquier lado entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos con la secuencia de referencia, y en donde el número de alteraciones de nucleótido se determina multiplicando el número total de nucleótidos en SEQ ID NO: 1 por el entero que define la identidad porcentual dividida entre 100 y luego sustrayendo ese producto del número total de nucleótidos en SEQ ID NO: 1, O: nn = xn - (xn • y) , en donde nn es el número de alteraciones de nucleótidos, xn es el número total de nucleótidos en SEQ ID NO: 1, y es 0.50 para 50 por ciento, 0.60 para 60 por ciento, 0.70 para 70 por ciento, 0.80 para 80 por ciento, 0.85 para 85 por ciento, 0.90 para 90 por ciento, 0.95 para 95 por ciento, 0.97 para 97 por ciento o 100 por ciento , y • es el símbolo para el operador multiplicador, y en donde cualquier producto no entero de xn e y se redondea hacia abajo al entero más cercano antes de sustraerlo de xn. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido se SEQ ID NO: 2 puede crear mutaciones sin sentido, con sentido equivocado o con desfasa iento de cuadro en esta secuencia de codificación y por lo tanto alterar al polipéptido codificado por el polinucleótido siguiendo estas alteraciones. A manera de ejemplo, una secuencia de polinucleótido de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia SEQ ID NO: 1, o sea puede ser 100 por ciento idéntico, o puede incluir hasta cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos en comparación con la secuencia de referencia de manera que la identidad porcentual es menor de 100 por ciento de identidad. Estas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en cuando menos una supresión, sustitución de ácido nucleico, incluyendo transición y transversión, o inserción, y en donde las alteraciones pueden presentarse en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia de polinucleótido de referencia o en cualquier lado entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para una identidad porcentual dada se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en SEQ ID NO: 1 por el entero que define la identidad porcentual dividida entre 100 y luego restando ese producto del número total de ácidos nucleicos en SEQ ID NO: 1, o: nn = xn - (xn • y) , en donde nn es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, xn es el número total de ácidos nucleicos en SEQ ID NO: 1, y es, por ejemplo, 0.70 para 70 por ciento, 0.80 para 80 por ciento, 0.85 para 85 por ciento, etcétera, • es el símbolo para el operador multiplicador, y en donde cualquier producto no entero de xn e y se redondea al entero más cercano antes de sustraerlo de xn. (2) Las modalidades de polipéptido además incluyen un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene cuando menos 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100 por ciento de identidad con una secuencia de referencia de polipéptido SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de polipéptido puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 2 o puede incluir hasta cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con las secuencias de referencia, en donde dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en cuando menos una supresión de aminoácidos, sustitución, incluyendo sustitución conservadora y no conservadora, o inserción, y en donde las alteraciones pueden presentarse en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de polipéptido de referencia o en cualquier lado entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en donde el número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en SEQ ID NO : 2 por el entero que define la identidad porcentual dividida entre 100 y luego restando ese producto del número total de aminoácidos en SEQ ID NO: 2, o: na = xa - (xa • y) , en donde na es el número de alteraciones de aminoácidos, xa es el número total de aminoácidos en SEQ ID NO: 2, y es 0.50 para 50 por ciento, 0.60 para 60 por ciento, 0.70 para 70 por ciento, 0.80 para 80 por ciento, 0.85 para 85 por ciento, 0.90 para 90 por ciento, 0.95 para 95 por ciento, 0.97 para 97 por ciento o 100 por ciento, y • es el símbolo para el operador multiplicador, y en donde cualquier producto no entero de xa e y se redondea hacia abajo al entero más cercano antes de restarlo de xa. A manera de ejemplo, una secuencia de polipéptido de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia SEQ ID NO : 2, esto es puede ser 100 por ciento idéntico, o puede incluir hasta cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de manera que la identidad porcentual es menor de 100 por ciento de identidad. Estas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en cuando menos una supresión de aminoácidos, sustitución, incluyendo sustitución, o inserción conservadora o no conservadora, y en donde las alteraciones pueden presentarse en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de polipéptido de referencia o en cualquier lado entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un por ciento de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en SEQ ID NO: 2 por el entero que define la identidad porcentual dividida entre 100 y luego sustrayendo ese producto del número total de aminoácidos en SEQ ID NO: 2, o: na = xa - (xa • y) , en donde na es el número de alteraciones de aminoácidos, xa es el número total de aminoácidos en SEQ ID NO: 2, y es, por ejemplo, 0.70 para 70 por ciento, 0.80 para 80 por ciento, 0.85 para 85 por ciento, etcétera, y • es el símbolo para el operador de multiplicación, y en donde cualquier producto no entero de xa e y se redondea al entero más cercano antes de sustraerlo de xa. "Individuo (s) " , cuando se usa en la presente con referencia a un organismo, significa un eucariote multicelular, incluyendo, pero sin limitarse a un metazoario, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate, y un humano. "Aislado" significa alterado "por manos del hombre" desde su estado natural, es decir, si se presenta en la naturaleza, ha sido cambiado o removido de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido naturalmente presente en un organismo vivo no está "aislado", sino el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea el término en la presente. Más aún, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo mediante transformación, manipulación genética o mediante otro método recombinante está "aislado" aún si todavía • está presente en dicho organismo, esté este organismo vivo o no 5 vivo . "Polinucleótido (s) " se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado que incluye regiones de cadena simple y doble. 10 "Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero retiene propiedades esenciales. Un variante típico de un polinucleótido difiere en secuencia de nucleótido de otro, por el nucleótido de referencia. Los cambios de 15 nucleótido pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se discute más adelante. Una variante típica de polipéptido difiere en secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de 20 referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de manera que las secuencias de polipéptido de referencia y el variante son bastante similares globalmente y, en muchas regiones, idénticos. Un variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en secuencias de aminoácidos por una o más 25 sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinación.

Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no estar codificado por el código genético. Una variante de polinucleótido o polipéptido puede ser uno que se presenta naturalmente tal como un variante alélico, o puede ser un variante que no se sabe que se presente naturalmente. Los variantes que se presentan de manera no natural de los polinucleótidos y polipéptidos se pueden hacer técnicas de mutagénesis mediante síntesis directa. "Enfermedad (es) " significa que cualquier enfermedad causada o relacionada con infección por bacterias, incluyendo, por ejemplo, infección de las vías respiratorias superiores, enfermedades bacterianas invasivas, tales como bacteremia y meningitis . EJEMPLOS : Los ejemplos más adelante se llevan a cabo usando técnicas estándares, que son muy conocidas y de rutina para aquellos con experiencia en la técnica, excepto donde se describe de otra manera en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitantes de la invención. Ejemplo 1: descubrimiento y secuenciamiento confirmatorio de ADN del gen BASB030 a partir de dos cepas de N.meningi ti di s A: BASB030 en serogrupo B de N.meningi tidis cepa ATCC13090. El gen BASB030 de SEQ ID NO : 1 se descubrió primero en la base de datos de Incyte PathoSeq conteniendo secuencias de ADN genómicas sin terminar de la cepa ATCC13090 de N.meningi tidis . La traducción de la secuencia de polinucleótidos BASB030, mostrada en la SEQ ID NO: 2, mostró similaridad significativa (81 por ciento de identidad en un traslape de 758 aminoácidos) con la proteína de membrana externa PilQ de Neisseria gonorrhoeae. La secuencia del gen BASB030 se confirmó adicionalmente experimentalmente. Para este fin, se extrajo ADN genómico de 10 ° células de N.meningi tidis (cepa ATCC 13090) usando el juego de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen Gmbh) , y un microgramo de este material se sometió a amplificación de ADN de reacción de cadena de polimerasa usando los cebadores PilQl (5' -GGG G GCTAGC AA TAC CAA ACT GAC AAA AAT CAT TTC C-3') [SEQ ID NO: 7] que contiene un sitio Nhel (subrayado) y PÍ1Q2 (5' -GGG G AAGCTT AT AGC GCA GGC TGT TGC CGG C-3') [SEQ ID ?O:8] que contiene un sitio HindIII de redomado interno (subrayado) . Este producto de reacción de cadena de polimerasa se purificó en gel y se sometió a secuenciamiento de AD? usando el juego de secuenciamiento Big Dye Cicle (Perkin-Elmer) y un secuenciador ABI 373 A/PRISM AD?. El secuenciamiento de AD? se realizó en ambas cadenas con una redundancia de dos y la secuencia de longitud completa se ensambló usando un programa SeqMan del paquete de software D?ASTAR Lasergene . La secuencia de AD? resultante y la secuencia de polipéptidos deducidas se mostraron como SEQ ID ?O: 2 y SEQ ID ?O : 4 respectivamente.

B: BASB030 en serogrupo B de N.meninai tidis cepa H44/76. La secuencia del gen BASB030 también se determinó en otra cepa de serogrupo B de N.meningi tidis, la cepa H44/76. Para este fin, se extrajo ADN genómico de la cepa de N.meningitidis, H44/76 usando las condiciones experimentales presentadas en el Ejemplo 1. Este material (un microgramo) se sometió entonces a amplificación de ADN por reacción de cadena de polimerasa usando los cebadores PilQl y PÍ1Q2 específicos para el gen BASB030. Un fragmento de ADN de aproximadamente 2300 pares de bases, se obtuvo, se digirió mediante las endonucleasas de restricción Nhl/HindI II y se insertó en los sitios correspondientes de pET-24b vector de clonación/expresión (?ovagen) usando técnicas de biología molecular estándares (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Eds : Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989) . El pET-24b/BASB030 recombinante se sometió entonces a secuenciamiento de AD? usando el juego Big Dyes (Applied biosystems) y se analizó en un secuenciador de AD? ABI 373/A en las condiciones descritas por el proveedor. Como resultado, las secuencias de polinucleótido y polipéptido deducidas, conocidas como SEQ ID ?O: 5 y SEQ ID ?O: 6 respectivamente, se obtuvieron. Usando el programa MegAlign del paquete D?ASTAR, se realizó una alineación de las secuencias de polinucleótido de SEQ ID ?O: 1,3 y 5, y se exhibe en la Figura 1; una comparación por pares de identidades se resume en la Tabla 1, mostrando que las tres secuencias de genes de polinucleótido BASB030 son todas similares a nivel identidad mayor de 98.0 por ciento. Usando el mismo programa MegAling, se realizó una alineación de la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 2, 4 y 6, y se exhibió en la Figura 2; una comparación por pares de identidades se resume en la Tabla 2, mostrando que las tres secuencias de proteínas BASB030 son todas similares a un nivel de identidad mayor del 95.0 por ciento. Tomados juntos, estos datos indican conservación fuerte de secuencia de gen BASB030 entre las dos cepas del serogrupo B de N.meningi tidis . Tabla 1: Identidades por pares de las secuencias de polinucleótidos BASB030 (en %) polipéptido BASB030 (en Ejemplo 2: Expresión y purificación de proteína BASB030 recombinante en Escherichia coli . La construcción del vector de clonación/expresión pET-24b/BASB030 se describió en el Ejemplo IB. Este vector aloja el gen BASB030 aislado de la cepa H44/76 en fusión con un 5 tramo de 6 residuos de Histidina, colocados bajo el control del gen T7 bacteriófago fuerte promotor 10. Para el estudio de expresión, este vector se introdujo en la cepa de Escherichia coli Novablue (DE3) (Novagen) , en el cual, el gen para la polimerasa T7 se colocó bajo el control del promotor lac A 10 regulable por isopropil-beta-D-tiogalactosida (IPTG) . Los cultivos líquidos (100 mililitros) del Novablue (DE3) [pET- 24b/BASB030] cepa recombinante de E. coli se cultivaron a 37°C bajo agitación hasta la densidad óptica de 600 nm (OD600) alcanzó 0.6. En ese mismo punto, se añadió IPTG a la 15 concentración final de lmM y el cultivo se cultivó durante cuatro horas adicionales. El cultivo se centrifugó a 10,000 rpm y el aglutinado se congeló a -20°C durante cuando menos 10 horas. Después de descongelarse, el aglomerado se resuspendió durante 30 minutos a 25°C en regulador A (6M de clorhidrato de 20 guanidina, 0.1M NaH2P04, 0.01 M Tris, pH 8.0), se pasó tres veces a través de una aguja y se clarificó mediante centrifugación (20000 rpm, 15 minutos) . La muestra se cargó entonces a una velocidad de flujo de 1 mililitro/minuto en una columna Hitrap cargada con Ni2+ (Pharmacia Biotech) . Después 25 del pasaje del flujo a través, la columna se lavó sucesivamente con 40 mililitros de regulador B (8M Urea, 0.1MNaH2PO4, 0.01 M Tris, pH 8.0), 40 mililitros de regulador C (8M Urea, 0.1MNaH2PO4, 0.01 M Tris, pH 6.3). La proteína recombinante BASB030/His6 se eluyó de la columna con 30 mililitros de regulador D (8M Urea, 0.1MNaH2PO4, 0.01 M Tris, pH 6.3) que contenía 500 M de imidazol y se recolectaron tres fracciones de tamaño de 3 mililitros. Como se muestra en la Figura 3, una proteína altamente enriquecida (pureza estimada en más del 90 por ciento de pureza en manchado coomassie) de BASB030/His6, migrando a 85kDa (estimación con relación a la masa molecular) , se eluyó de la columna. Este polipéptido fue reactivo contra un anticuerpo monoclonal de ratón criado contra el motivo 5-histidina (ver Figura 3, franja 2) . Más aún, la proteína PilQ-His6 reco binante, desnaturalizada, pudo solubilizarse en una solución desprovista de urea. Para este fin, el PilQ-His6 desnaturalizada, contenido en 8M de urea se dializó extensamente (2 horas) contra el regulador R (NaCl 150 mM, 10 mM NaH2P04, Arginina 0.5M pH 6.8) conteniendo sucesivamente 6M, 4M, 2M y nada de urea. La preparación correspondiente del PilQ sigue soluble aún después de congelarlo y descongelarlo. Tomados juntos, estos datos indican que el gen BASB030 se puede expresar y purificar ya sea bajo una forma soluble o insoluble, recopíbinante (BASB030/His6) en E. coli . Ejemplo 3: Inmunización de ratones con polipéptidos BASB030 y reconocimiento de la respuesta de anticuerpos sobre polipéptido BASB030 recombinante por ELISA. BASB030 original purificado parcialmente se inyectó tres veces en ratones BALB/C en los días 0, 14 y 28 (5 animales/grupo) . Este polipéptido BASB030 original se derivó directamente de la cepa B de Neisseria meningi tidis (obtenida de J Tommassen) . Los animales se inyectaron por ruta subcutánea con 5 microgramos (primera inyección) y 2 microgramos (segunda y tercera inyecciones) del polipéptido BASB030 formulado en SBAS2 (SB62 emulsión que contenía 5 microgramos de MPL y 5 microgramos de QS21 por dosis) o después de la adsorción sobre A1P04 (con 5 microgramos de MPL) . Un grupo de control negativo consistente en ratones inmunizados con la formulación SBAS2 nada más (sin polipéptido BASB030) también se añadió en el experimento. Los ratones fueron sangrados el día 28 (14 días Post II) y 35 (7 días Post III) con el fin de detectar anticuerpos anti-BASB030 específicos. Los anticuerpos anti-BASB030 específicos fueron medidos por ELISA usando polipéptido BASB030 recombinante parcialmente purificado como proteína recubierta en microplacas. Se hicieron análisis en suero recolectado (de 5 ratones) solamente en Post II (día 28) . Reconocimiento de epítopes BASB030 en la proteína recombinante, mediante ELISA Brevemente, las placas de microtitulación (Maxisorp, Nunc) se recubrieron con 100 microlitros de la solución de BASB030 recombinante a alrededor de 0.5 microgramos/mililitro en PBS 2 horas a 37°C. Después de eso, las placas se lavaron tres veces con 300 microlitros de 150 M de NaCl - 0.05 por ciento de Tween 20. Después de eso, se sobrecubrieron con 100 microlitros de PBS-0.3 por ciento de caseína y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con sacudimiento. Las placas se lavaron de nuevo usando el mismo procedimiento antes de la incubación con anticuerpos. Suero animal se diluyó serialmente dos veces en PBS-0.3 por ciento de caseína 0.05 por ciento de Tween 20 y se pusieron en las microplacas (12 diluciones comenzando en la dilución de 1/100) antes de la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos con sacudimiento. Antes del siguiente paso de lavado idéntico. Inmunoglobulina anti-ratón (de conejo, Dakopatts E0413) conjugado con biotín se usó a 1/2000 en PBS-0.3 por ciento caseína - 0.05 por ciento Tween 20 para detectar anticuerpos anti-BASB030 de ratón. Después del último paso de lavado (como antes) , las placas se incubaron con solución de complejo de estreptavidina-peroxidasa diluida a 1/4000 en la misma solución de solvente durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo condiciones de sacudimiento. Los resultados ilustrados más adelante en la presente muestran que el polipéptido BASB030 es muy inmunogénico en ratones BALB/C, tanto en emulsión SBAS2 como después de la adsorción sobre A1P04/MPL (Figura 4) . Estos anticuerpos, inducidos después de dos inyecciones solamente de la proteína original, fueron capaces de reconocer el polipéptido BASB030 recombinante . La Figura muestra también que la emulsión SBAS2 es un poco más inmunogénica que la formulación A1P04/MPL. El polipéptido BASB030 recombinante purificado también fue inyectado en ratones BALB/C para la evaluación de su inmunogenicidad . Reconocimiento de epítopes originales BASB030 en las células, mediante ELISA de célula entera la cepa homologa H44/76 MenB (B:15:P1.7, 16) se usó como bacteria recubierta para detectar anticuerpos anti-BASB030 específicos en suero animal. En resumen, las placas de microtitulación (Maxisorp, Nunc) se recubrieron con 100 microlitros de una dilución de 1/10 (en PBS) con una solución de bacterias H44/76 de un cultivo de 6 horas, en el cual las bacterias fueron eliminadas por 400 microgramos/mililitro de tetraciclina. Las placas se incubaron a 37°C durante cuando menos 16 horas hasta que las placas se secaron completamente. Entonces, se lavaron tres veces con 300 microlitros de 150 mM de NaCl - 0.05 por ciento de Tween 20. Después de eso, las placas se sobrecubrieron con 100 microlitros de PBS-0.3 por ciento de caseína y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con sacudimiento. Las placas se lavaron de nuevo usando el mismo procedimiento antes de la incubación con anticuerpos. El suero animal se diluyó serialmente dos veces en PBS-0.3 por ciento de caseína 0.05 por ciento de Tween 20 y se puso en las microplacas (12 diluciones comenzando en la dilución de 1/100) antes de la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos con sacudimiento, antes del siguiente paso de lavado idéntico. Inmunoglobulina anti-ratón (de conejo, Dakopatts E0413) conjugado con biotín se usó a 1/2000 en PBS-0.3 por ciento caseína - 0.05 por ciento Tween 20 para detectar anticuerpos anti-BASB030 de ratón. Después del último paso de lavado (como antes) , las placas se incubaron con una solución de complejo de estreptavidina-peroxidasa diluida a 1/4000 en la misma solución solvente durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo condiciones de sacudimiento. Como se muestra en la Figura 5 más adelante en la presente, podemos concluir que hay un reconocimiento de antígeno BASB030 específico en la cepa H44/76 homologa en ratones inmunizados con la molécula purificada formulada en la emulsión SBAS2 así como en el adyuvante A1P04/MPL (depósito de cinco ratones/grupo se hizo) . La respuesta de anticuerpos es mayor con la formulación SBAS2 como se observó en la proteína BASB030 recombinante. Los ratones inyectados con el adyuvante SBAS2 solamente no mostraron una reacción positiva clara. Ejemplo 4: Presencia de anticuerpos anti-BASB030 en suero de pacientes convalecientes humanos En esta prueba, suero convaleciente humano se probó mediante manchado western para detectar la presencia de anticuerpos específicos, usando proteína BASB030 recombinante purificada así como proteína BASB030 original (de J Tommassen, países bajos) . En resumen, 5 microgramos de proteína BASB030 purificada (recombinante u original) se puso en un gel de gradiente SDS-PAGE (4-20 por ciento, Novex, código número EC60252) para migración electroforética. Las proteínas se transfirieron a lámina de nitrocelulosa (0.45 microgramos, Biorad código número 162-0114) a 100 voltios durante una hora usando sistema Bio-rad Trans-blot (código número 170-3930) . Después de eso, el filtro se bloqueó con PBS - 0.05 por ciento Tween 20 durante la noche a temperatura ambiente, antes de la incubación con suero humano. Este suero se diluyó 100 veces en PBS-0.05 por ciento Tween 20, y se incubó en la hoja de nitrocelulosa durante 2 horas a temperatura ambiente con sacudimiento moderado, usando un sistema minimanchado (Miniprotean, Bio-rad código número 170-4017) . Después de tres pasos de lavado repetido en PBS-0.05 por ciento Tween 20 durante 5 minutos, la hoja de nitrocelulosa se incubó a temperatura ambiente durante una hora bajo sacudimiento moderado con los anticuerpos Ig antihumano conjugados (biotinilados, de oveja, Amersham código número RPN1003, o anticuerpos Ig anti-ratón biotinilados, de conejos, Amersham código RPN1001) diluido a 1/500 en el mismo regulador de lavado. La membrana se lavó tres veces como anteriormente, y se incubó durante 30 minutos con agitación usando el complejo de estreptavidina-peroxidasa (Amersham código número 1051) se diluyó a 1/1000 en el regulador de lavado. Después de los últimos tres pasos de lavado repetido, la revelación se presentó durante el tiempo de 10-15 minutos de incubación en una solución de 50 mililitros que contenía 30 miligramos de 4- cloro-1-naftol (Sigma) , 10 mililitros de metanol, 40 mililitros de PBS, y 30 microlitros de H2?2- El manchado se detuvo mientras se lavaba la membrana varias veces con agua destilada. Los resultados ilustrados en las Figuras 6 y 7 (Parte A) muestran que de 5 a 7 de cada 7 sueros de convalecientes reconocieron ya sea la proteína BASB030 original a diferentes pesos moleculares (Figura 6) o la proteína BASB030 recombinante a alrededor de 90 kDa (Figura 7) . Los dos sueros de convalecientes que reaccionaron débilmente contra el polipéptido BASB030 recombinante fueron el número 261469 y el número 261979 (Figura 7) , mientras que sobre el polipéptido BASB030 original, el número 262117 y el número 261979 no muestra ninguna reacción clara (Figura 6) . Aquellos que reaccionan con la intensidad mayor son los mismos en ambas proteínas (recombinante y original) . Estas reacciones podrían reflejar importancia de este polipéptido como un candidato a la vacuna. La proteína BASB030 original parece mostrar cuando menos tres diferentes bandas, los cuales probablemente se atribuyen al polipéptido BASB030, el mayor de es idéntico a ambos gels (alrededor de 90kDa) . El polipéptido BASBÓ30 original, directamente aislado de bacteria presenta productos de degradación, ya que las bandas alrededor de 45 y 35 kDa son claramente visibles. En la parte B de ambos manchados western, se ilustra la reacción de anticuerpos de ratón dirigidos contra la proteína homologa de Neisseria gonorrhoeae (J. Tommassen, países bajos) . Los resultados ilustran claramente que hay una reacción cruzada clara entre ambas proteínas BASB030 homologas: sobre la proteína BASB030 recotnbinante, hay dos bandas claras detectadas, una siendo la banda mayor a 90 kDa como reconocida por suero convaleciente humano, estando la otra alrededor de 70 kDa (Figura 7) . En la proteína BASB030 original, los anticuerpos de ratón no reconocieron solamente las dos bandas mayores a 90 y 45 kDa como se ve con suero convaleciente, sino también las bandas que podrían ser productos de degradación (alrededor 75, 70, 55, 40, 35 y 25 kDa, ver Figura 6) . Ejemplo 5: Eficacia de una vacuna BASB030: actividad de anticuerpos anti-BASB030 Actividad bactericida de anticuerpos anti -BASB030 en homólogos de cepa de Neisseria meningi tidis . La actividad bactericida de suero animal (en depósito) se probó como se describió previamente (1, 2) con sólo diferencias ligeras. En resumen, el serogrupo B de Neisseria meningi tidis (cepa H44/76) se usó para determinar la actividad bactericida de suero animal. En microplacas de 96 pozos de fondo en U (NUNC) , se incubaron 50 microgramos/pozo de diluciones de suero de dos veces en serie con 37.5 microlitros/pozo de la suspensión de meningococos de fase log ajustada a 2.5 104 CFU/mililitro y se incubó durante 15 minutos • a 37°C con sacudimiento a 210 rpm (sacudidor orbital. Forma 5 Scientific). Luego, 12.5 microlitros de complemento de conejo bebé (Pel-freeze Biologicals, US) se añadió antes de la incubación durante una o más de una hora en las mismas condiciones. Después de eso, alícuotas de 10 microlitros de la mezcla de cada pozo se mancharon en placas de agar Mueller- fc 10 Hinton que contenían 1 por ciento de Isovitalex y 1 por ciento de suero de caballo inactivado por calor antes de la incubación durante la noche a 37°C con 5 por ciento C02. El día después, las colonias se contaron para cada dilución probada y se determinaron titulaciones bactericidas conforme la dilución del 15 suero para eliminación del 50 por ciento, en comparación con el control de complemento sin suero. Mediante este método, las colonias individuales se contaron hasta 100 CFU por mancha. Las titulaciones se expresaron como la dilución que indica el 50 por ciento de eliminación, calculado por análisis de 20 regresión. Los resultados ilustrados en la Tabla 3 muestran que los anticuerpos anti-BASB030 tenían un efecto bactericida fuerte sobre la cepa homologa H44/76, como también se observa con el anticuerpo monoclonal anti-PorA usado como control positivo. En la dilución de 1/2560, el porcentaje de 25 eliminación es todavía muy alto (91 por ciento) .

Referencias : 1. Hoogerhout P., Donders E.M.L.M., van Gaans-van den Brink J.A.M., Kuipers B., Brugghe H.F., van Unen L.M.A., • Timmermans H.A.M., Ten Hove G.J., de Jong AD.P.J.M., Peeters C.C.A.M., Wiertz E.J.H.J., and Poolman J:T., Infection and immunity, Sept 1995, vol 63, n°9, p 3473-3478. 2. Maslanka S.E., Gheesling L.L., Libutti D.E., Donaldson K.B.J., Harakeh H.S., Dykes J.K., Arhin F.F., Devi S.J.N., Frasch CE., Huang J.C., Kriz-Kuzemenska P., Lemmon 10 R.D., Lorange M., Peeters C.C.A.M., Quataert S., Tai J.Y., Carlone G.M., and The Multilaboratory Study Group." In Clin. Diagn. Lab. Immunol . , 1997, 4: 156-167.

Tabla 3: Efecto bactericida en anticuerpos anti- 15 BASB030 20 Ejemplo 6: Eficacia de anticuerpos anti-BASB030 en el modelo de protección pasiva (ratas infantes) . Los anticuerpos anti-BASB030 obtenidos de ratones inmunizados (5/grupo, dos grupos) fueron evaluados para determinar su eficacia protectora en el modelo protector de rata infante. El ensayo mide la actividad de aclaramiento de la cepa B de Neisseria meningi tidis por los anticuerpos inyectados 24 horas después del estímulo. En resumen, 100 microlitros de una dilución de 1/10 de un depósito de suero de ratón (con anticuerpos anti-BASB030 específicos) se inyectaron por ruta intraperitoneal (IP) en ratas infantes de 7 días de edad (Sprague Dawley) 24 horas después del estímulo con bacterias vivas (día-1) . En el día 0, ratas infantes, inmunizadas aleatoriamente y pasivamente con suero de ratón en el día -1, se inyectaron con 10 miligramos de dextrano hierro en 100 microlitros por la ruta intraperitoneal, 30 minutos antes del estímulo por la misma ruta intraperitoneal con 10 materias vivas (100 microlitros) de una o más cepas de Neisseria meningi tidis H44/76 (B: 15 :P1.7, 16) , previamente pasada por rata (dos veces) . La cepa de Neisseria meningi tidis se cultivó en medio de TSB líquido por aproximadamente 2 horas. Las bacterias se diluyeron entonces en PBS para obtener una suspensión de 1.108 CFU/mililitro. Las ratas infantes de 7 días de nacidos se usaron para este ensayo. Los grupos estaban compuestos de 8 ratas las cuales se mezclaron aleatoriamente entre camadas antes de la inmunización mediante la inyección intraperitoneal de 100 microlitros de un suero depositado para ser probado. Tres horas después del estímulo, 20 microlitros • de sangre, obtenidos por punción cardiaca después de anestesia, 5 se diluyeron en PBS (1/10, 1/100, 1/1000 y 1/10000) y las diferentes diluciones se plaquearon en medio Mueller Hinton para el conteo de unidades que forman colonia (CFU) . Después de eso (24 horas después) el número de unidades que forman colonias se estimó y comparó con el número de unidades que 10 forman colonia/mililitro de sangre en ratas infantes pasivamente inmunizadas con PBS. El grupo de control consistió en ratas inyectadas PBS . Las medias ponderadas se calcularon para cada animal y la media de cada grupo se comparó con cada otra media. Los resultados obtenidos con anticuerpos anti- 15 BASB030 (Figura 8) ilustran que estos anticuerpos específicos tienen un efecto de aclaramiento sobre la cepa de Neisseria meningi tidis H44/76 en comparación con el grupo de control negativo. Hay hasta una diferencia de 1 log10 observado a favor de los anticuerpos anti-BASB030, en comparación con los 20 anticuerpos no específicos presentes en ratones inyectados con PBS solamente. El efecto protector observado con nuestros anticuerpos anti-BASB030 es equivalente al obtenido con anticuerpos monoclonal anti-PorA bien caracterizado (H44/29, anti-P1.16) . 25 Leyenda de la Figura 3 Se obtuvieron fracciones de proteína BASB030 sustancialmente puras (más del 80 por ciento) en un gel de poliacrilamida de gradiente 4-20 por ciento (NOVEX) bajo condiciones de SDS-PAGE en paralelo con marcador de peso molecular de proteína. Los gels fueron ya sea manchados con azul Coomassie R250 o se analizaron mediante manchado western usando anticuerpo monoclonal anti- (His5) . Materiales depositados Un depósito que contenía la cepa de Serogrupo B de Neisseria meningi tidis fue depositado con la colección de cultivos tipo americanos (en la presente "ATCC") el 22 de junio de 1997 y se les asignó el número de depósito 13090. El depósito se describe como Neisseria meningi tidis (Albrecht y Ghon) y está seca congelada, una biblioteca de insertos de 1.5-2.9 kb construido a partir de aislado de N. meningi tidis . El depósito se describe en Int. Bull. Bacteriol. ?o encl . Taxon. 8: 1-15 (1958) . El depósito de cepa Neisseria meningi tidis se conoce en la presente como "cepa depositada" o como "el AD? de la cepa depositada" . La cepa depositada contiene el gen BASB030 de longitud completa. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en la cepa depositada, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado mediante éste, se controlan en el caso de cualquier conflicto con una descripción de secuencias en la presente. El depósito de la cepa depositada se hizo bajo los términos del Tratado Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Micro-organismos para Propósitos y Procedimiento de Patentes. La cepa será irrevocablemente y sin restricción o condición liberada al público después de la emisión de una patente. La cepa depositada se proporciona únicamente por conveniencia para los expertos en la técnica y no es una admisión de que el depósito de requisito para la habilitación, tal como se requiere bajo el código de los Estados Unidos 35 párrafo 112.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> SmithKIine Beechan Biologicals S.A. <120> Compuestos Novedosos <130> BM 45323 <150> 8 <170> FastSEQ para Windows Versión 1.0 <210> 1 <211> 2310 <212> ADN <213> Bacteria <400> 1 atgaatacca aactgacaaa aaccatttcc ggtctcctcg tcgcaacegc cgcccttcag eo acagcatctg caggaaacat tacagacatc aaa tctcct eectgcceaa caaacagaaa 12o ategtcaaag ccagcttcga caaagagatc gtcaacccga ccggcctcgt aaccteeeea ITO ceggcccgca tegccttgga ctctgaacaa aceggcattt ccatggacca acaggtactc 240 gaatatgccg accctctgtt gagcaaaatc agtgccgcac aaaacageag ccgtgcgcgp 300 ccggttctga atetgaacaa accgggccaa tacaataccg aagtacgcgg aacaaagtc 360 tggatactca ccaaegaatc ggacgatacc gtgcccgeße ccgcacgccc egccgtaaaa 42o gccgogcccg ccgcaccggc aaaaeaacag ggccgccgca ceg-tctacca agcccgaagt 480 atccgtatcc aaacccttta ccccggeaaa acaacagccg ccgßaeegtt taccgagtcc 540 gtagtatccg tacccgcaec gtccageccg gcaaaacaac aggsggcggc accagcaaaa 600 caacagacgg cagcaccagc aaaaeaacag acggcagcac cagcaaaaca acaggcggca 660 gcaccageaa aacaaaccaa 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Ser Ser Thr Asn Thr Glu Leu Lys Lys Ala Val Leu Gly Leu 645 650 655 Thr Val Thr Pro Asn He Thr Pro Asp Gly Gln He He Met Thr Val 660 665 670 Lys He Asn Lys Asp Ser Pro Ala Gln Cys Ala Ser Gly Asn Gln Thr 675 680 685 He Leu Cys He Ser Thr Lys Asn Leu Asn Thr Gln Ala Met Val Glu 690 695 700 Asn Gly Gly Thr Leu He Val Gly Gly He Tyr Glu Glu Asp Asn Gly 705 710 715 720 Asn Thr Leu Thr Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp He Pro Val He Gly 725 730 735 Asn Leu Phe Lys Thr Arg Gly Lys Lys Thr Asp Arg Arg Glu Leu Leu 740 745 750 He Phe He Thr Pro Arg He Met Gly Thr Ala Gly Asn Ser Leu Arg 755 760 765 Tyr <210> 3 <211> 2310 <212> ^DN <213> Bacteria <400> 3 atgaatacca aactgacaaa aatcatttcc ggtctctttg tcgcaaccgc cgcctttcag 60 acagcatctg caggaaacat tacagacatc aaagtttcct ccctgcccaa caaacagaaa 120 atcgtcaaag tcagctttga caaagagatt gtcaacccga ccggcttcgt aacctcctca 180 ccggcccgca tcgccttgga ctttgaacaa accggcattt ccatggatca acaggtactc 240 gaatatgccg atcctctgtt gagcaaaatc agtgccgcac aaaacagcag ccgtgcgcgt 300 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Lys Asn Asp Thr Ser Ala Phe sly Trp Gly Val Asn Ser Oly Phe 545 550 555 560 Gly Gly Asp Asp Lys Trp Gly Ala Olu Thr Lys He Asn Leu Pro He 565 570 575 Thr Ala Ala Ala Asn Ser He Ser Leu Val Arg Ala He Ser Ser Gly 580 585 590 Ala Leu Asn Leu Glu Leu Ser Ala Ser Glu Ser Leu Ser Lys Thr Lys 595 600 605 Thr Leu Ala Asn Pro Arg Val Leu Thr Gln Asn Arg Lys Glu Ala Lys 610 615 620 He Glu Ser Gly Tyr Glu He Pro Phe Thr Val Thr Ser He Ala Asn 625 630 635 640 Gly Gly Ser Ser Thr Asn Thr Glu Leu Lys Lys Ala Val Leu Gly Leu 645 650 655 Thr Val Thr Pro Asn He Thr Pro Asp Gly Gln He He Met Thr Val 660 665 670 Lys He Asn Lys Asp Ser Pro Ala Gln Cys Ala Ser Gly Asn Gln Thr 675 680 685 He Leu Cys He Ser Thr Lys Asn Leu Asn Thr sln Ala Met Val Glu 690 695 700 Asn Gly Gly Thr Leu He Val Gly Gly He Tyr Glu Glu Asp Asn Gly 705 710 715 720 Asn Thr Leu Thr Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp He Pro Val He Gly 725 730 735 Asn Leu Phe Lys Thr Arg Gly Lys Lys Thr Asp Arg Arg Glu Leu Leu 740 745 750 He Phe He Thr Pro Arg He Met Gly Thr Ala Gly Asn Ser Leu Arg 755 760 765 Tyr <210> 5 <211> 2310 <212> ADN <213> Bacteria <400> 5 atgaatacca aactgacaaa aatcatttcc ggtctctttg tcgcaaccgc cgcctttcag 60 acagcatcgg caggaaacat tacagacatc aaagcctcct ccctgcccaa caaacagaaa 120 atcgtcaaag tcagctttga caaagagatt gtcaacccga ccggcttcgt aacctcctca 180 ccggcccgca tcgccttgga ctttgaacaa accggcattt ccatggatca acaggtactc 240 gaatatgccg atcctctgtt gagcaaaatc agcgccgcac aaaacagcag ccgtgcgcgt 300 ctggttccga atctgaacaa accgggccaa tacaataccg aagtacgcgg gaacaaagtt 360 tggatattca ttaacgaatc ggacgatacc gtgtccgccc ccgcacgccc cgccgtaaaa 420 gccgcgcctg ccgcaccggc aaaacaacag gctgccgcac cgtctaccaa gtccgcagca 480 cccgcatccg aaccctttac cccggcaaaa caacaggctg ccgcaccgtt taccgagtcc 540 gtagtatccg tatccgcacc gttcagcccg gcaaaacaac aggcggcggc atcagcaaaa 600 caacaggcgg cagcaccagc aaaacaacag gcggcagcac cagcaaaaca acaggcggca 660 gcaccagcaa aacaaaccaa tatcgatttc cgcaaagacg gcaaaaatgc cggcattatc 720 gaattggctg cattgggctt tgccgggcag cccgacatca gccaacagca cgaccacatc 780 atcgttacgc tgaaaaacca taccctgccg accacgctcc aacgcagttt ggatgtggca 840 gactttaaaa caccggttca aaaggttacg ctgaaacgcc tcaacaacga cacccagctg 900 attatcacaa cagccggcaa ctgggaactc gccaacaaac ccgccgcgcc cggaCacctt 960 accttccaag tcctgccgaa aaaacaaaac ctcgagtcag gcggcgtgaa caatgcgccc 1020 aaaaccttca caggccggaa aatctccctt gacttccaag atgtcgaaat ccgcaccatc 1080 ctgcagattt tggcaaaaga atccggaatg aacattgttg ccagcgactc cgtcaacggc 1140 aaaatgaccc tctccctcaa ggatgtgcct tgggatcagg ctttggattt ggttatgcag 1200 gcgcgcaacc tcgatacgcg ccagcaaggg aatatcgtca aca cgcgcc ccgcgacgag 1260 ctgcttgcca aagacaaagc cctcttacag gcagaaaaag acattgccga tttgggtgcg 1320 ctgtattccc aaaacttcca gttgaaatac aaaaatgtgg aagaattccg cagcatcctg 1380 cgtttggaca atgccgacac gaccggaaac cgcaacacgc ttatcagcgg caggggcagc 1440 gtgctgatcg atcccgccac caacaccctg attgttaccg acacccgcag cgtcaccgaa 1500 aaattccgca aactgattga cgaattggac gtacccgcgc aacaagtgat gattgaggcg 1560 cgtatcgtcg aagcggcaga cggcttctcg cgcgatttgg gcgttaaatt cggcgcgaca 1620 ggcaagaaaa agctgaaaaa tgatacaagc gcattcggct ggggggtaaa ctccggcttc 1680 ggcggcgacg ataaatgggg ggccgaaacc aaaatcaacc tgccgattac cgctgccgca 1740 aacagcattt cgctggtgcg cgcgatttcc tccggtgcct tgaatttgga attgtccgca 1800 tccgaatcgc tttcaaaaac caaaacgctt gccaatccgc gcgtgctgac ccaaaaccgc 1860 aaagaggcca aaatcgaatc cggttacgaa attcctttca ccgtaacctc aatcgcgaac 1920 ggcggcagca gcacgaacac ggaactcaaa aaagccgtct tggggctgac cgttacgccg 1980 aacatcacgc ccgacggcca aatcattatg accgtcaaaa tcaacaagga ctcgcctgcg 2040 caatgtgcct ccggtaatca gacgatcctg tgtatttcga ccaaaaacct gaatacgcag 2100 gctatggttg aaaacggcgg cacattgatt gtcggcggta tttatgaaga agacaacggc 2160 aatacgctga ccaaagtccc cctgttgggc gacacccccg ttatcggcaa cctctttaaa 2220 acacgcggga aaaaaaccga ccgccgcgaa ctgctgattt tcattacccc gaggattatg 2280 ggtacggccg gcaacagcct gcgctattga 2310 <210> 6 <211> 769 <212> PRT <213> Bacteria <400> 6 Met Asn Thr Lys Leu Thr Lys He He Ser Gly Leu Phe Val Ala Thr 1 5 10 15 Ala Ala Phe Gln Thr Ala Ser Ala Gly Asn He Thr Asp He Lys Val 20 25 30 Ser Ser Leu Pro Asn Lys Gln Lys He Val Lys Val Ser Phe Asp Lys 35 40 45 slu He Val Asn Pro Thr Gly Phe Val Thr Ser Ser Pro Ala Arg He 50 55 60 Ala Leu Asp Phe Glu Gln Thr Gly He Ser Met Asp Gln Gln Val Leu 65 70 75 80 Glu Tyr Ala Asp Pro Leu Leu Ser Lys He Ser Ala Ala Gln Asn Ser 85 90 95 Ser Arg Ala Arg Leu Val Leu Asn Leu Asn Lys Pro Gly Gln Tyr Asn 100 105 110 Thr Glu Val Arg Gly Asn Lys Val Trp He Phe He Asn Glu Ser Asp 115 120 125 Asp Thr Val Ser Ala Pro Ala Arg Pro Ala Val Lys Ala Ala Pro Ala 130 135 140 Ala Pro Ala Lys Gln sln Ala Ala Ala Pro Ser Thr Lys Ser Ala Val 145 150 155 lß0 Ser Val Ser Glu Pro Phe Thr Pro Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Pro 165 170 175 Phe Thr slu Ser Val Val Ser Val Ser Ala Pro Phe Ser Pro Ala Lys 180 185 190 Oln sln Ala Ala Ala Ser Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Pro Ala Lys 195 200 205 sln Gln Ala Ala Ala Pro Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Pro Ala Lys 210 215 220 Gln Thr Asn He Asp Phe Arg Lys Asp Gly Lys Asn Ala Oly He He 225 "0 235 240 Olu Leu Ala Ala Leu Oly Phe Ala Gly Gln Pro Asp He Ser Gln Gln 245 250 255 His Asp His He He Val Thr Leu Lys Asn His Thr Leu Pro Thr Thr 260 265 270 Leu Oln Arg Ser Leu Asp Val Ala Asp Phe Lys Thr Pro Val Gln Lys 275 280 285 Val Thr Leu Lys Arg Leu Asn Asn Asp Thr Gln Leu He He Thr Thr 290 295 300 Ala Oly Asn Trp Glu Leu Val Asn Lys Ser Ala Ala Pro Gly Tyr Phe 305 310 31S 32Q Thr Phe Gln Val Leu Pro Lys Lys Oln Asn Leu Glu Ser Gly Gly Val 325 330 335 Asn Asn Ala Pro Lys Thr Phe Thr Gly Arg Lys He Ser Leu Asp Phe 340 345 350 Oln Asp Val Glu He Arg Thr He Leu Gln He Leu Ala Lys Glu Ser 355 360 365 Oly Met Asn He Val Ala Ser Asp Ser Val Asn Oly Lys Met Thr Leu 370 375 380 Ser Leu Lys Asp Val Pro Trp Asp Oln Ala Leu Asp Leu Val Met Gln 385 390 395 400 Ala Arg Asn Leu Asp Met Arg Gln Gln Oly Asn He Val Asn He Ala 405 410 415 Pro Arg Asp Olu Leu Leu Ala Lys Asp Lys Ala Leu Leu Gln Ala Glu 420 425 430 Lys Asp He Ala Asp Leu Gly Ala Leu Tyr Ser Gln Asn Phe Oln Leu 435 440 445 Lys Tyr Lys Asn Val Glu Glu Phe Arg Ser He Leu Arg Leu Asp Asn 450 455 460 Ala Asp Thr Thr Gly Asn Arg Asn Thr Leu He Ser Gly Arg Gly Ser 465 470 475 480 Val Leu He Asp Pro Ala Thr Asn Thr Leu He Val Thr Asp Thr Arg 485 490 495 Ser Val He Glu Lys Phe Arg Lys Leu He Asp Glu Leu Asp Val Pro 500 505 510 Ala Gln Oln Val Met He Glu Ala Arg He Val Glu Ala Ala Asp Gly 515 520 525 Phe Ser Arg Asp Leu Oly Val Lys Phe Gly Ala Thr Gly Lys Lys Lys 530 535 540 Leu Lys Asn Asp Thr Ser Ala Phe Gly Trp Gly Val Asn Ser Gly Phe 545 550 555 560 Gly Gly Asp Asp Lys Trp Gly Ala Glu Thr Lys He Asn Leu Pro He 565 570 575 Thr Ala Ala Ala Asn Ser He Ser Leu Val Arg Ala He Ser Ser Gly 580 585 590 Ala Leu Asn Leu Glu Leu Ser Ala Ser Glu Ser Leu Ser Lys Thr Lys 595 600 605 Thr Leu Ala Asn Pro Arg Val Leu Thr Oln Asn Arg Lys Olu Ala Lys 610 615 620 He Glu Ser Gly Tyr Glu He Pro Phe Thr Val Thr Ser He Ala Asn 625 630 635 640 Gly Gly Ser Ser Thr Asn Thr Glu Leu Lys Lys Ala Val Leu Gly Leu 645 650 655 Thr Val Thr Pro Asn He Thr Pro Asp Gly Gln He He Met Thr Val 660 665 670 Lys He Asn Lys Asp Ser Pro Ala Gln Cys Ala Ser Gly Asn Gln Thr 675 680 685 He Leu Cys He Ser Thr Lys Asn Leu Asn Thr Cln Ala Met Val Glu 690 695 700 Asn Gly Gly Thr Leu He Val Gly Gly He Tyr Glu Glu Asp Asn Gly 705 710 715 720 Asn Thr Leu Thr Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp He Pro Val He Gly 725 730 735 Asn Leu Phe Lys Thr Arg Gly Lys Lys Thr Asp Arg Arg Glu Leu Leu 740 745 750 He Phe He Thr Pro Arg He Met Gly Thr Ala Gly Asn Ser Leu Arg 755 760 765 Tyr <210> 7 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador <400> 7 gggggctagc aataccaaac tgacaaaaat catttcc 37 <210> 8 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador <400> 8 ggggaagctt atagcgcagg ctgttgccgg c 31

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos 90 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO : 6 por toda la longitud de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO : 6, respectivamente.

2. Un polipéptido aislado como se reclama en la reivindicación 1 en el cual la secuencia de aminoácidos tiene cuando menos 95 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 en la longitud entera de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6, respectivamente.

3. El polipéptido como se reclama en la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6.

4. Un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO : 6.

5. Un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

6. Un fragmento inmunogénico del polipéptido como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5 en el cual el fragmento inmunogénico es capaz de promover una respuesta inmune (si es necesaria cuando se acopla con un vehículo) que reconoce al polipéptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO : 6.

7. Un polipéptido como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6 en donde el polipéptido es parte de una proteína de fusión mayor.

8. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7.

9. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene cuando menos 90 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ó 6 en la longitud entera de SEQ ID NO: 4 ó 6 respectivamente, o una secuencia de nucleótidos complementaria con el polinucleótido aislado.

10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene cuando menos 90 por ciento de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 4 ó 6 en toda la región de codificación, o una secuencia de nucleótidos complementaria con el polinucleótido aislado.

11. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene cuando menos 97 por ciento de identidad con la de la SEQ ID NO: 3 ó 5 en la longitud entera de SEQ ID NO: 3 ó 5 respectivamente; o una secuencia de nucleótidos complementaria con el polinucleótido aislado.

12. El polinucleótido aislado como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 11 en la cual la identidad es de cuando menos 99 por ciento a SEQ ID NO: 3 ó 5.

13. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4 ó SEQ ID NO: 6.

14. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO : 5.

15. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que incluye el polipéptido de SEQ ID NO: 4 ó SEQ ID NO : 6 , obtenible seleccionando una biblioteca adecuada bajo condiciones de hibridización estrictas con una sonda etiquetada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 ó SEQ ID NO: 5 o un fragmento de la misma.

16. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2.

17. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 1.

18. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2, obtenible seleccionando una biblioteca adecuada bajo condiciones de hibridización estrictas con una sonda etiquetada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma.

19. Un vector de expresión o un micro-organismo vivo recombinante que comprende un polinucleótido aislado de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 8-18.

20. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 19 que expresa un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos 90 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 ó SEQ ID NO: 6, o una membrana de la célula huésped que contiene al polipéptido expresado.

21. Un proceso para producir un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos 90 por ciento de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 ó SEQ ID NO: 6 que comprende cultivar una célula huésped de la reivindicación 20 bajo condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.

22. Un proceso para expresar un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8-18 que comprende transformar una célula huésped con el vector de expresión que comprende cuando menos uno de los polinucleótidos y cultivar dicha célula huésped bajo condiciones suficientes para la expresión de cualquiera de los polinucleótidos.

23. Una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 y un portador farmacéuticamente 5 aceptable.

24. Una composición de vacuna que comprende una cantidad efectiva del polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 18 y un portador farmacéuticamente efectivo. ^fe 10

25. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24 en donde la composición comprende cuando menos un antígeno de Neisseria meningitidis .

26. Un anticuerpo inmunoespecí ico para el 15 polipéptido o fragmento inmunológico como se reclama por cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7.

27. Un método para diagnosticar infección por Neisseria meningi tidis, que comprende identificar un polipéptido como se reclama en cualquiera de las 20 reivindicaciones de la 1 a la 7, o un anticuerpo que es inmunoespecífico para dicho polipéptido, presente dentro de una muestra biológica de un animal sospechoso de tener esta infección.

28. El uso de una composición que comprende una 25 cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 en la preparación de un medicamento para el uso en general una respuesta inmune en un animal .

29. El uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polinucleótido como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a la 18 en la preparación de un medicamento para su uso para generar una respuesta inmune en un animal .

30. Una composición terapéutica útil para tratar humanos con Neisseria meningi tidis que comprende cuando menos un anticuerpo dirigido contra el polipéptido de las reivindicaciones 1-7 y un portador farmacéuticamente aceptable.