KR20010052409A - 나이세리아 메닌지티디스 항원성 폴리펩티드, 상응하는폴리누클레오티드 및 방어 항체 - Google Patents

나이세리아 메닌지티디스 항원성 폴리펩티드, 상응하는폴리누클레오티드 및 방어 항체 Download PDF

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쟝-루이 루엘르
요하네스 페트루스 마리아 토마센
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유니버시티 오브 유트레히트
장 스테판느
스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) BASB030 폴리펩티드와 BASB030 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드, 및 재조합 기법에 의해 이러한 폴리펩티드를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체 및 진단, 예방 및 치료 목적으로 사용되는 이들의 용도를 제공한다.

Description

나이세리아 메닌지티디스 항원성 폴리펩티드, 상응하는 폴리누클레오티드 및 방어 항체 {NEISSERIA MENINGITIDIS ANTIGENIC POLYPEPTIDES, CORRESPONDING POLYNUCLEOTIDES AND PROTECTIVE ANTIBODIES}
나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)(meningococcus)는 사람의 상부 호흡기로부터 종종 단리되는 그람 음성 세균이다. 이것은 때때로 균혈증과 수막염과 같은 침습성 세균 질병을 일으킨다. 수막구균성 질병의 발병률은 지리학적, 계절적 및 해마다의 변화를 나타낸다 [참조: Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989]. 기후가 온난한 국가에서의 대부분의 질병은 혈청형 B의 스트레인으로 인해 발생하고, 발병률은 전체 인구수에서 연간 100,000명 중 1명 내지 10명이며 때로는 더 높은 수치에 도달한다 [참조: Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T. et al. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E., et al. Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990].
주로 중앙 아프리카에서 혈청형 A 수막구균이 대부분을 차지하는 유행병이 발생하며, 때로는 연간 100,000명 중 1000명 이하의 수준에 도달한다 [참조: Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V. Clin. Microbiol. Rev. 2(Supplement), S18-S24, 1989]. 전체적으로 수막구균성 질병의 거의 모든 경우는 혈청형 A, B, C, W-135 및 Y 수막구균에 의해 유발되며, 4가의 A, C, W-135, Y 폴리사카라이드 백신이 이용가능하다 [참조: Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10:335-339, 1982].
폴리사카라이드 백신은 이들을 캐리어 단백질에 화학적으로 컨쥬게이팅시킴으로써 현재 개선되어지고 있다 [참조: Lieberman, J.M., Chiu, S.S., Wong, V.K., et al. JAMA 275: 1499-1503, 1996].
혈청형 B 백신은 이용가능하지 않은데, 이는 B 캡슐형 폴리사카라이드가 비면역원성인 것으로 밝혀졌기 때문이며, 거의 확실하게는, 이것이 숙주 성분과 구조적 유사성을 공유하기 때문이다 [참조: Wyle, F.A., Artenstein, M.S., Brandt, M.L. et al. J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J.M., Leinonen, M., M??kel??, P.M. Lancet ii.: 355-357, 1983].
수 년 동안, 수막구균 외막을 기초로 하는 백신을 개발하려는 실험이 시작되었고, 수행되어 왔다 [참조: de Moraes, J.C., Perkins, B., Camargo, M.C. et al. Lancet 340: 1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E.A. Gronnesby, J.K. et al. 338: 1093-1096, 1991]. 이러한 백신은 좀더 성장한 소아(＞ 4세) 및 청소년에서 57% 내지 85%의 효능을 나타내었다.
다수의 세균 외막 성분, 예를 들어 Pora, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB가 이들 백신에 존재하며, 관찰된 방어에 이들 성분이 기여하는 바는 여전히 추가로 밝혀질 필요가 있다. TbpB와 NspA와 같은 그 밖의 세균의 외막 성분은 동물 또는 사람 항체를 사용함으로써 방어 면역의 유도와 잠재적으로 관련된 것으로 밝혀졌다 [참조: Martin, D., Cadieux, N., Hamel, J., Brodeux, B.R., J. Exp. Med. 185: 1173-1183, 1997; Lissolo, L., Maitre-Wilmotte, C., Dumas, p. et al., Inf. Immun. 63: 884-890, 1995]. 방어 면역의 메카니즘은 항체 매개성 살균 활성 및 옵소닌식작용(opsonophagocytosis)을 포함할 것이다.
균혈증 동물 모델이 모든 항체 매개성 메카니즘을 조합시키기 위해 사용되어 왔다 [참조: Saukkonen, K., Leinonen, M., Abdillahi, H. Poolman, J. T. Vaccine 7: 325-328, 1989]. 후기 보체 성분 매개성 살균 메카니즘이 수막구균 질병에 대한 면역에 결정적인 것으로 일반적으로 받아들여진다 [참조: Ross, S.C., Rosenthal P.J. Berberic, H.M., Densen, P.J. Infect. Dis. 155: 1266-1275, 1987].
나이세리아 메닌지티디스 감염의 빈도는 지난 수 십년 동안 급격하게 상승하였다. 이것은 다중 항생제 내성 스트레인의 출현 및 약화된 면역계를 갖는 사람 수의 증가로 인한 것이었다. 표준 항생제의 전부 또는 일부에 내성인 나이세리아 메닌지티디스 스트레인을 단리시키는 것은 더 이상 희귀한 일이 아니다. 이러한 현상은 신규한 항미생물 제제, 백신, 약물 스크리닝법, 및 이러한 생물체에 대한 진단 시험에 대해 만족스럽게 충족되지 않은 의학계의 필요 및 요구를 만들어냈다.
본 발명은 폴리누클레오티드(본원에서는 "BASB030 폴리누클레오티드(들)"로서 일컬어짐), 이들에 의해 코드화된 폴리펩티드(본원에서는 "BASB030" 또는 "BASB030 폴리펩티드(들)"로서 일컬어짐), 재조합 물질 및 이들을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 세균 감염에 대한 백신을 포함하여, 이러한 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 특정 병원체의 감염을 검출하기 위한 진단용 어세이에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 BASB030, 특히, BASB030 폴리펩티드와 BASB030 폴리누클레오티드, 재조합 물질 및 이들을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 특히 미생물 질병의 예방 및 치료를 포함하는, 이러한 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 미생물 감염과 관련된 질병 및 이러한 감염과 관련된 질환을 검출하는 진단용 어세이, 예를 들어 BASB030 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 검출하는 어세이에 관한 것이다.
다수의 변화와 변형이 본 발명의 사상 및 범주내에서 이루어질 수 있다는 것은 하기 본 발명의 상세한 설명 및 본 발명의 나머지 부분을 숙지한 당업자라면 용이하게 인식할 것이다.
발명의 설명
본 발명은 하기 더욱 상세히 기술되는 BASB030 폴리펩티드와 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 나이세리아 고노로애(Neisseria gonorrhoeae) PilQ 외막 단백질과 아미노산 서열 상동성이 관련된, 나이세리아 메닌지티디스의 BASB030의 폴리펩티드와 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 각각 SEQ ID NO:1,3,5 및 SEQ ID NO:2,4,6에 제공된 누클레오티드 및 아미노산 서열을 갖는 BASB030에 관한 것이다. "DNA"로서 하기 서열 목록에 기재된 서열은 본 발명의 한 가지 구체예를 예시하는 것으로 이해되는데, 이는 당업자가 이러한 서열이 리보폴리누클레오티드를 포함하는 폴리누클레오티드에서 일반적으로 유용하게 사용될 수 있음을 인식할 것이기 때문이다.
폴리펩티드
본 발명의 한 가지 일면에 있어서, 본원에서 "BASB030" 및 "BASB030 폴리펩티드"로서 일컬어지는 나이세리아 메닌지티디스의 폴리펩티드 뿐만 아니라 이들의 생물학적, 진단학적, 예방학적, 임상적 또는 치료적으로 유용한 변이체, 및 이를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명은 하기 폴리펩티드를 추가로 제공한다:
(a) SEQ ID NO:2,4,6의 아미노산 서열과 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 97 내지 99% 이상이거나 정확한 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드;
(b) 각각 SEQ ID NO:1,3,5의 전길이에 걸쳐서 SEQ ID NO:1,3,5와 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 97 내지 99% 이상이거나 정확한 동일성을 갖는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드에 의해 코드화된 폴리펩티드; 또는
(c) SEQ ID NO:2,4,6의 아미노산 서열과 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 97 내지 99% 이상이거나 정확한 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드에 의해 코드화된 폴리펩티드.
SEQ ID NO:2,4,6에 제공된 BASB030 폴리펩티드는 나이세리아 메닌지티디스 스트레인 ATCC 13090 및 H44/76으로부터의 BASB030 폴리펩티드이다.
또한, 본 발명은 BASB030 폴리펩티드의 면역원성 단편, 즉, SEQ ID NO:2,4,6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 동일한 면역원성 활성을 갖는 BASB030 폴리펩티드의 연속 부분을 제공한다. 즉, 단편 (필요에 따라, 캐리어에 커플링되는 경우)은 BASB030 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 유도시킬 수 있다. 이러한 면역원성 단편으로는 예를 들어, N-말단 리더 서열, 및/또는 트랜스멤브레인(transmembrane) 및/또는 C-말단 앵커(anchor) 도메인이 없는 BASB030 폴리펩티드가 있을 수 있다. 한 가지 바람직한 일면에 있어서, 본 발명에 따른 BASB030의 면역원성 단편은 SEQ ID NO:2의 전길이에 걸쳐서 SEQ ID NO:2,4,6의 아미노산 서열과 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 97 내지 99% 이상이거나 정확한 동일성을 갖는 폴리펩티드의 세포외 도메인의 실질적으로 전부를 포함한다.
단편은 본 발명의 임의의 폴리펩티드의 임의의 아미노산 서열의 전부가 아닌 일부와 완전 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. BASB030 폴리펩티드의 경우, 단편은 "자립형(free-standing)"이거나, 이것이 일부 또는 영역으로서 형성되어 있는, 가장 바람직하게는 하나의 거대 폴리펩티드에서 하나의 연속된 영역으로서 형성되어 있는, 거대 폴리펩티드내에 포함되어 있을 수 있다.
바람직한 단편으로는 예를 들어, SEQ ID NO:2,4,6의 아미노산 서열의 일부를 갖는 트렁케이션(truncation) 폴리펩티드 또는 이들의 변이체, 예를 들어 아미노- 및/또는 카르복실-말단 아미노산 서열을 포함하는 일련의 연속된 잔기가 있다. 숙주 세포에 의해 또는 숙주 세포에서 생성된 본 발명의 폴리펩티드의 분해 형태가 또한 바람직하다. 구조적 또는 기능적 속성을 특징으로 하는 단편, 예를 들어 알파-헬릭스와 알파-헬릭스 형성 영역, 베타-시트와 베타-시트 형성 영역, 턴(turn)과 턴 형성 영역, 코일과 코일 형성 영역, 친수성 영역, 소수성 영역, 알파 양친매성 영역, 베타 양친매성 영역, 가요성 영역, 표면 형성 영역, 기질 결합 영역, 및 높은 항원성 인덱스(index) 영역을 포함하는 단편이 또한 바람직하다.
또 다른 바람직한 단편으로는 SEQ ID NO:2,4,6의 아미노산 서열로부터의 15개, 20개, 30개, 40개, 50개 또는 100개 이상의 연속 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO:2,4,6의 아미노산 서열로부터 트렁케이팅(truncating)되거나 결실된 15개, 20개, 30개, 40개, 50개 또는 100개 이상의 연속 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드가 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 단편은 펩티드 합성에 의해 상응하는 온길이 폴리펩티드를 생성시키는 데에 사용될 수 있으므로; 이들 단편은 본 발명의 온길이 폴리펩티드를 생성시키는 데에 있어서 중간물질로서 사용될 수 있다.
수 개, 즉, 5 내지 10개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 1 내지 2개 또는 1개의 아미노산이 임의의 조합된 형태로 치환되거나, 결실되거나, 첨가된 변이체가 특히 바람직하다.
본 발명의 폴리펩티드, 또는 면역원성 단편은 "성숙한(mature)" 단백질이거나, 전구체 또는 융합 단백질과 같은 거대 단백질의 일부일 수 있다. 분비 서열 또는 리더 서열, 프로서열(prosequence), 다중 히스티딘 잔기와 같은 정제를 용이하게 해주는 서열, 또는 재조합체 생성 도중의 안정성을 위한 추가의 서열을 함유하는 추가의 아미노산 서열을 포함시키는 것이 종종 유리하다. 또한, 최종 분자의 면역원성 잠재력을 증가시키기 위해 외인성 폴리펩티드 또는 지질 꼬리(lipid tail) 또는 폴리누클레오티드 서열을 첨가시키는 것이 또한 고려된다.
한 가지 일면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이것의 단편과 다양한 서브클래스의 면역글로불린(IgG, IgM, IgA, IgE)의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 다양한 부분을 포함하는 유전공학처리된 가용성 융합 단백질에 관한 것이다. 면역글로불린으로서 바람직한 것은 사람 IgG, 특히, IgG1의 중쇄의 불변 부분이며, 여기서, 융합은 힌지 영역에서 일어난다. 한 가지 특정한 구체예에 있어서, Fc 부분은 혈액 응고 인자 Xa에 의해 절단될 수 있는 절단 서열을 혼입시킴으로써 간단히 분리될 수 있다.
또한, 본 발명은 유전공학처리에 의해 이들 융합 단백질을 제조하는 방법 및 약물 스크리닝, 진단 및 치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 또 다른 일면은 이러한 융합 단백질을 코드화하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 융합 단백질 기술의 예는 국제 특허 출원 제 WO94/29458호 및 제 WO94/22914호에서 발견될 수 있다.
단백질은 화학적으로 컨쥬게이팅되거나 재조합 융합 단백질로서 발현되어, 융합되지 않은 단백질과 비교하여 발현 시스템에서 증가된 수준이 생성되도록 할 수 있다. 융합 파트너는 T 헬퍼 에피토프(면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 사람에 의해 인식되는 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 데에 도움을 줄 수 있거나, 천연 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질(발현 증강제)을 발현시키는 데에 도움을 줄 수 있다. 바람직하게는, 융합 파트너는 면역학적 융합 파트너 및 발현 증강 파트너 둘 모두일 것이다.
융합 파트너로는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D 및 인플루엔자 바이러스인 NS1으로부터의 구조 단백질 이외의 단백질(hemagglutinin)이 있다. 또 다른 융합 파트너는 LytA로서 공지된 단백질이다. 바람직하게는, 이 분자의 C 말단 부분이 사용된다. LytA는 N-아세틸-L-알라닌 아미다아제, 아미다아제 LytA (lytA 유전자에 의해 코딩됨 {Gene, 43 (1986) page 265-272}), 펩티도글리칸 주쇄에 있는 특정 결합을 특이적으로 분해시키는 자가융해소(autolysin)를 합성하는 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)로부터 유도된다. LytA 단백질의 C 말단 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 몇몇 콜린 유사체에 대한 친화성을 발생시킨다. 이러한 특성은 융합 단백질을 발현시키는 데에 유용한 대장균 C-LytA 발현 플라스미드를 개발하는 데에 이용되어 왔다. C-LytA 단편을 아미노 말단에 함유하는 하이브리드 단백질을 정제하는 방법이 공지되었다 {Biotechnology: 10, (1992) page 795-798}. 잔기 178에서 출발하는 C 말단부에서 발견된 LytA 분자의 반복 부분, 예를 들어 잔기 188-305를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 폴리펩티드의 변이체, 즉, 하나의 잔기가 유사한 특성을 갖는 또 다른 잔기로 치환되는 보존적 아미노산 치환에 의해 대상 폴리펩티드와 달라진 폴리펩티드를 포함한다. 전형적인 이러한 치환은 Ala, Val, Leu 및 Ile 사이에서; Ser와 Thr 사이에서, 산성 잔기인 Asp와 Glu 사이에서; Asn과 Gln 사이에서; 및 염기성 잔기인 Lys와 Arg 사이에서; 또는 방향족 잔기인 Phe과 Tyr 사이에서 일어난다.
본 발명의 폴리펩티드는 임의의 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 폴리펩티드로는 단리된 천연 폴리펩티드, 재조합적으로 생성된 폴리펩티드, 합성적으로 생성된 폴리펩티드, 또는 이들 방법의 조합에 의해 생성된 폴리펩티드가 있다. 이러한 폴리펩티드를 제조하는 수단은 당 분야에 널리 이해되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드가 나이세리아 메닌지티디스로부터 유도되는 것이 가장 바람직하지만, 바람직하게는 동일한 분류학적 속의 다른 생물체로부터 수득될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 예를 들어, 동일한 분류학적 과(family) 또는 목(order)의 생물체로부터 수득될 수 있다.
폴리누클레오티드
본 발명의 목적은 BASB030 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드, 특히, 본원에서 BASB030으로 표시된 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 있어서, 폴리누클레오티드는 온길이 유전자를 포함하는 SEQ ID NO:1,3,5에 제공된 서열 또는 이것의 변이체를 포함하는 BASB030 폴리펩티드를 코드화하는 영역을 포함한다.
SEQ ID NO:1,3,5에 제공된 BASB030 폴리누클레오티드는 나이세리아 메닌지티디스 스트레인 ATCC13090 및 H44/76으로부터의 BASB030 폴리누클레오티드이다.
본 발명의 또 다른 일면으로서, 예를 들어 프로세싱되지 않은 RNA, 리보솜 RNA, mRNA, cDNA, 게놈 DNA, B- 및 Z-DNA를 포함하는, BASB030 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드, 특히 나이세리아 메닌지티디스 BASB030 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 코드화하고/하거나 발현시키는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 본 발명의 추가의 구체예는 생물학적, 진단학적, 예방학적, 임상적 또는 치료학적으로 유용한 폴리누클레오티드와 폴리펩티드, 및 이들의 변이체, 및 이를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일면은 SEQ ID NO:2,4,6의 추론된 아미노산 서열을 갖는 BASB030 폴리펩티드를 코드화하는 하나 이상의 온길이 유전자를 포함하는 단리된 폴리누클레오티드 및 이와 밀접하게 관련된 폴리누클레오티드 및 이들의 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 구체예에 있어서, SEQ ID NO:2,4,6의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 구성된 나이세리아 메닌지티디스로부터의 BASB030 폴리펩티드 또는 이것의 변이체가 제공된다.
본원에 제공된 정보, 예를 들어 SEQ ID NO:1,3,5에 제공된 폴리누클레오티드 서열을 이용하는 경우, BASB030 폴리펩티드를 코드화하는 본 발명의 폴리누클레오티드는 표준 클로닝 및 스크리닝법, 예를 들어 출발 물질로서 나이세리아 메닌지티디스 세포를 사용하는 세균으로부터 염색체 DNA 단편을 클로닝시키고 서열화시킨 후, 온길이 클론을 수득하는 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리누클레오티드 서열, 예를 들어 SEQ ID NO:1,3,5에 제공된 폴리누클레오티드 서열을 수득하기 위해, 전형적으로, 대장균 또는 그 밖의 몇몇 적당한 숙주 중의 나이세리아 메닌지티디스의 염색체 DNA의 클론의 라이브러리가 부분 서열로부터 유도된 방사성표지된 올리고누클레오티드(바람직하게는 길이가 17량체 이상이다)로 프로빙된다. 그 후, 프로브의 DNA와 동일한 DNA를 함유하는 클론은 스트린전트(stringent) 하이브리드화 조건을 이용하여 구별할 수 있다. 최초의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드로부터 설계된 서열화 프라이머에 의한 하이브리드화에 의해 이렇게 확인된 개개의 클론을 서열화시킴으로써, 온길이 유전자 서열을 결정하기 위해 폴리누클레오티드 서열을 양방향으로 신장시킬 수 있다. 편리하게는, 이러한 서열화는, 예를 들어 플라스미드 클론으로부터 제조된 변성된 이중 가닥 DNA를 사용하여 수행된다. 적당한 기법은 마니아티스, 티.(Maniatis, T.), 프리치, 이.에프.(Fritsch, E.F.) 및 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed,; Cold Spring Habor Laboratory Pres, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기재되어 있다 [참조: Screening By Hybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70]. 또한, 온길이 유전자 서열을 수득하기 위해 직접적 게놈 DNA 서열화가 수행될 수 있다. 본 발명을 예시하는 SEQ ID NO:1,3,5에 제공된 각각의 폴리누클레오티드는 나이세리아 메닌지티디스로부터 유도된 DNA 라이브러리에서 발견되었다.
더욱이, SEQ ID NO:1,3,5에 제공된 각각의 서열은 당업자에게 널리 공지된 아미노산 잔기 분자량 값을 사용하여 계산될 수 있는 추론된 분자량을 갖는, SEQ ID NO:2,4,6에 제공된 아미노산 잔기의 대략적인 개수를 갖는 단백질을 코드화하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다.
SEQ ID NO:1의 누클레오티드 1번에 있는 개시 코돈과 누클레오티드 2308번에서 시작하는 정지 코돈 사이에 있는 SEQ ID NO:1의 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드를 코드화한다.
SEQ ID NO:3의 누클레오티드 1번에 있는 첫 번째 코돈과 누클레오티드 2308번에서 시작하는 마지막 코돈 사이에 있는 SEQ ID NO:3의 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO:4의 폴리펩티드를 코드화한다.
SEQ ID NO:5의 누클레오티드 1번에 있는 개시 코돈과 누클레오티드 2308번에서 시작하는 정지 코돈 사이에 있는 SEQ ID NO:5의 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO:6의 폴리펩티드를 코드화한다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 하기 폴리누클레오티드 (a)와 (b)를 포함하거나 이들로 구성된 단리된 폴리누클레오티드를 제공한다:
(a) 각각 SEQ ID NO:1,3,5의 전체 길이에 걸쳐서, SEQ ID NO:1,3,5와 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 한층 더욱더 바람직하게는 97 내지 99% 이상이거나 정확한 동일성을 갖는 폴리누클레오티드 서열; 또는
(b) 각각 SEQ ID NO:2,4,6의 전체 길이에 걸쳐서, SEQ ID NO:2,4,6과 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱더 바람직하게는 95% 이상, 한층 더욱더 바람직하게는 97 내지 99% 이상이거나 100% 정확한 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드 서열.
나이세리아 메닌지티디스를 제외한 종으로부터의 동족체와 오톨로그(ortholog)를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드는, 스트린전트 하이브리드화 조건(예를 들어, 45 내지 65℃ 및 0.1 내지 1%의 SDS 농도를 사용함)하에서 SEQ ID NO:1,3,5의 서열 또는 이것의 단편으로 구성되거나 이를 포함하는 표지되거나 검출가능한 프로브로 적당한 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및 상기 폴리누클레오티드 서열을 함유하는 온길이 유전자 및/또는 게놈 클론을 단리시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명은 전체 길이에 걸쳐서 SEQ ID NO:1,3,5의 코딩 서열(오픈 리딩 프레임)과 동일한 폴리누클레오티드 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 성숙한 폴리펩티드 또는 이것의 단편에 대한 코딩 서열 자체를 제공할 뿐만 아니라 성숙한 폴리펩티드 또는 이것의 단편을, 리더 또는 분비 서열, 프리(pre)-, 또는 프로(pro)- 또는 프리프로(prepro)-단백질 서열을 코드화하는 서열과 같은 또 다른 코딩 서열과 함께 리딩 프레임에 존재하는 형태로 제공한다. 또한, 본 발명의 폴리누클레오티드는 예를 들어, 전사되지만 번역되지 않는 서열, 종결 신호(예를 들어, rho-의존성 및 rho-비의존성 종결 신호), 리보솜 결합 부위, 코자크(Kozak) 서열, mRNA를 안정화시키는 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 신호와 같은 하나 이상의 비코딩 5' 및 3' 서열을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 하나 이상의 비코딩 서열을 함유할 수 있다. 또한, 폴리누클레오티드 서열은 추가의 아미노산을 코드화하는 추가의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 해주는 마커 서열이 코드화될 수 있다. 본 발명의 특정한 구체예에 있어서, 마커 서열은 pQE 벡터(Qiagen, Inc.)로 제공되어 있고 겐츠(Gentz) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 821-824 (1989)]에 기재되어 있는 헥사-히스티딘 펩티드 또는 HA 펩티드 태그(Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)) 이며, 둘 모두는 이들에 융합된 폴리펩티드 서열을 정제시키는 데에 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리누클레오티드로는 구조 유전자 및 이것과 천연적으로 결합되어 이 유전자의 발현을 조절하는 서열을 포함하는 폴리누클레오티드가 있지만, 이에 제한되지 않는다.
SEQ ID NO:2,4,6의 BASB030 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열은 각각 SEQ ID NO:1의 누클레오티드 1 내지 2307에 함유된 폴리펩티드 코드화 서열, SEQ ID NO:3의 누클레오티드 1 내지 2307에 함유된 폴리펩티드 코드화 서열, 또는 SEQ ID NO:5의 누클레오티드 1 내지 2307에 함유된 폴리펩티드 코드화 서열과 동일할 수 있다. 양자택일적으로, 이것은 유전 코드의 중복(축중)의 결과로서 SEQ ID NO:2,4,6의 폴리펩티드를 또한 코드화하는 서열일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드"는 본 발명의 폴리펩티드, 특히 세균 폴리펩티드, 더욱 특히 SEQ ID NO:2,4,6에 제공된 아미노산 서열을 갖는 나이세리아 메닌지티디스 BASB030의 폴리펩티드를 코드화하는 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 또한, 이 용어는 폴리펩티드를 코드화하는 하나의 연속 영역 또는 불연속 영역(예를 들어, 삽입된 파지, 삽입된 삽입 서열, 삽입된 벡터 서열, 삽입된 트랜스포손 서열에 의해 간섭되거나 RNA 편집 또는 게놈 DNA 인식으로 인해 간섭된 폴리누클레오티드)을, 코딩 서열 및/또는 비코딩 서열을 또한 함유할 수 있는 추가의 영역과 함께 포함하는 폴리누클레오티드를 포함한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO:2,4,6의 추론된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 변이체를 코드화하는 본원에 제공된 폴리누클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리누클레오티드의 단편은 예를 들어, 본 발명의 온길이 폴리누클레오티드를 합성하는 데에 사용될 수 있다.
추가의 특히 바람직한 구체예는, 수 개, 즉, 5개 내지 10개, 1개 내지 5개, 1개 내지 3개, 2개, 1개의 아미노산 잔기가 임의의 조합된 형태로 치환되고, 개질되고, 결실되고/되거나 첨가되거나, 아미노산 잔기에 이러한 변화가 하나도 일어나지 않은 SEQ ID NO:2,4,6의 BASB030 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 BASB030 변이체를 코드화하는 폴리누클레오티드이다. 이들 중에서 특히 바람직한 것은 BASB030 폴리펩티드의 특성 및 활성을 변화시키지 않는 사일런트(silent) 치환, 첨가 및 결실이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예는 SEQ ID NO:2,4,6에 제공된 아미노산 서열을 갖는 BASB030 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드와 전체 길이에 걸쳐 85% 이상 동일한 폴리누클레오티드, 및 이러한 폴리누클레오티드에 상보적인 폴리누클레오티드이다. 이 경우, 전체 길이에 걸쳐서 90% 이상 동일한 폴리누클레오티드가 특히 바람직하며, 이러한 특히 바람직한 폴리누클레오티드 중에서, 동일성이 95% 이상인 폴리누클레오티드가 특히 바람직하다. 또한, 동일성이 95% 이상인 폴리누클레오티드 중에서는 동일성이 97% 이상인 폴리누클레오티드가 매우 바람직하고, 이들 중에서, 동일성이 98% 이상 및 99% 이상인 폴리누클레오티드가 특히 매우 바람직하며, 99% 이상인 폴리누클레오티드가 더욱 바람직하다.
바람직한 구체예는 SEQ ID NO:1,3,5의 DNA에 의해 코드화된 성숙한 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드이다.
본 발명의 특정한 구체예에 따르면, SEQ ID NO:1,3,5에 제공된 폴리누클레오티드와 같은, 특히, 스트린전트 조건하에서 BASB030 폴리누클레오티드 서열에 하이브리드화하는 폴리누클레오티드가 제공된다.
또한, 본 발명은 본원에 제공된 폴리누클레오티드 서열에 하이브리드화하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 이 경우, 특히 본 발명은 스트린전트 조건하에서 본원에 제공된 폴리누클레오티드에 하이브리드화하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "스트린전트 조건" 및 "스트린전트 하이브리드화 조건"은 서열들 간에 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상의 동일성이 있는 경우에만 하이브리드화가 일어남을 의미한다. 스트린전트 하이브리드화 조건의 특정한 예는, 50% 포름아미드, 5 x SSC(150mM NaCl, 15mM 트리소듐 시트레이트), 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20㎍/㎖의 변성되고 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃에서 밤새 인큐베이팅시킨 후, 하이브리드화 지지체를 약 65℃에서 0.1x SSC로 세척시켰다. 하이브리드화 및 세척 조건은 널리 공지되어 있고, 샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularly Chapter 11 therein]에 예시되어 있다. 또한, 용액 하이브리드화가 본 발명에 의해 제공된 폴리누클레오티드 서열과 함께 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 스트린전트 하이브리드화 조건하에서 SEQ ID NO:1,3,5에 제공된 폴리누클레오티드 서열에 대한 완전한 유전자를 함유하는 적당한 라이브러리를, SEQ ID NO:1,3,5에 제공된 상기 폴리누클레오티드 서열의 서열 또는 이것의 단편을 갖는 프로브로 스크리닝하고, 상기 폴리누클레오티드 서열을 단리시킴으로써 수득되는 폴리누클레오티드 서열로 구성되거나 이를 포함하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리누클레오티드를 수득하는 데에 유용한 단편으로는 예를 들어, 본원의 어느 한 부분에서 상세히 기술되어 있는 프로브 및 프라이머가 있다.
예를 들어 본 발명의 폴리누클레오티드 어세이에 대해 본원의 어느 한 부분에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 폴리누클레오티드는 BASB030을 코드화하는 온길이 cDNA 및 게놈 클론을 단리시키고, BASB030 유전자에 대해 높은 동일성, 특히 높은 서열 동일성을 갖는 그 밖의 유전자의 cDNA 및 게놈 클론을 단리시키기 위해 RNA, cDNA 및 게놈 DNA에 대한 하이브리드화 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 프로브는 일반적으로 15개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 포함할 것이다. 바람직하게는, 이러한 프로브는 30개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 가질 것이며, 50개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 가질 수 있다. 특히 바람직한 프로브는 20개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 가질 것이며, 30개 미만의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 가질 것이다.
올리고누클레오티드 프로브를 합성하기 위해, BASB030 유전자의 코딩 영역이 SEQ ID NO:1,3,5에 제공된 DNA 서열을 사용하여 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 그 후, 본 발명의 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고누클레오티드는, 라이브러리의 어떤 일원에 프로브가 하이브리드화되는 지를 결정하기 위해 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하는 데에 사용된다.
온길이 DNA를 수득하거나, 짧은 DNA를 신장시키기 위해 당업자가 이용할 수 있고 당업자에게 널리 공지되어 있는 다수의 방법, 예를 들어 cDNA 단부의 라피드 앰플리케이션(Rapid Amplication)(참조: Frohman, et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988)의 방법을 기초로 하는 방법이 존재한다. 예를 들어 마라톤[상표명: Marathon] 기술(Clontech Laboratories Inc.)에 의해 예시된 기법의 최근의 변형은 더 긴 cDNA에 대한 탐색을 현저하게 단순화시켰다. 마라톤 기술의 경우, cDNA가 선택된 조직으로부터 추출된 mRNA로부터 제조되고, '어댑터' 서열이 각각의 단부에 연결되었다. 그 후, 핵산 증폭(PCR)이 유전자 특이적 및 어댑터 특이적 올리고누클레오티드 프라이머의 조합을 이용하여 DNA의 "누락된(missing)" 5' 단부를 증폭시키기 위해 수행된다. 그 후, PCR 반응은 "네스팅된(nested)" 프라이머, 즉, 증폭된 생성물내에서 어닐링되도록 설계된 프라이머(전형적으로, 어댑터 서열에서 3'까지 더 어닐링시키는 어댑터 특이적 프라이머 및 선택된 유전자 서열에서 5'까지 더 어닐링시키는 유전자 특이적 프라이머)를 사용하여 반복된다. 그 후, 이러한 반응의 생성물이 DNA 서열화에 의해 분석될 수 있고, 온길이 DNA는 생성물을 현존하는 DNA에 직접 결합시키거나, 5' 프라이머의 설계를 위한 신규한 서열 정보를 사용하여 별도의 온길이 PCR을 수행함으로써 구성될 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드는 폴리누클레오티드 어세이에 관해 본원에 추가로 논의된 바와 같이, 예를 들어, 질환, 특히 사람 질환의 치료법 및 진단법을 발견하기 위한 조사 시약 및 물질로서 사용될 수 있다.
SEQ ID NOS: 1-6의 서열로부터 유도된 올리고누클레오티드인 본 발명의 폴리누클레오티드는 본원에서 확인된 폴리누클레오티드가 전체적으로 또는 부분적으로 감염된 조직내의 세균에서 전사되는지의 여부를 결정하기 위해 본원에 설명된 공정(바람직하게는 PCR에 대해)이 사용될 수 있다.. 이러한 서열은 또한, 병원체가 유도한 감염의 유형 및 단계를 진단하는데 유용한 것으로 인지되었다.
또한, 본 발명은 성숙한 단백질과 추가적인 아미노 또는 카르복실-말단 아미노산, 또는 성숙한 폴리펩티드의 내부에 있는 아미노산(예를 들어, 성숙한 형태가 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 갖는 경우)인 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 이러한 서열은 전구체로부터 성숙한 형태로의 단백질 프로세싱에 작용할 수 있거나, 단백질을 수송할 수 있거나, 단백질 반감기를 길게하거나 짧게 할 수 있거나, 무엇보다도 어세이 또는 생산을 위한 단백질의 조작을 용이하게 할 수 있다. 일반적으로 생체내의 경우와 같이, 추가적인 아미노산은 세포 효소에 의해 성숙한 단백질로부터 프로세싱될 수 있다.
본 발명의 각각의 모든 폴리누클레오티드에 있어서, 이것에 상보적인 폴리누클레오티드가 제공된다. 이러한 상보적 폴리누클레오티드는 이들이 상보적인 각각의 폴리누클레오티드에 완전히 상보적인 것이 바람직하다.
하나 이상의 프로서열에 융합된 성숙한 형태의 폴리펩티드를 갖는 전구체 단백질은 불활성 형태의 폴리펩티드일 수 있다. 프로서열이 제거되는 경우, 이러한 불활성 전구체는 일반적으로 활성화된다. 프로서열 일부 또는 전부는 활성화 전에 제거될 수 있다. 일반적으로, 이러한 전구체는 프로단백질로 불리워진다.
누클레오티드에 대한 표준의 A, G, C, T/U 표시 이외에, 용어 "N"이 본 발명의 특정 폴리누클레오티드를 설명하는 데에 또한 사용될 수 있다. "N"은 네 개의 DNA 또는 RNA 누클레오티드 중의 어느 하나가 DNA 또는 RNA 서열의 이러한 지정된 위치에서 나타날 수 있음을 의미하며, 단, N이, 근접한 누클레오티드 위치와 함께 취해져서 정확한 리딩 프레임에서 읽혀지는 경우, 이러한 리딩 프레임에서 미성숙한 종결 코돈을 생성시키는 효과를 갖는 핵산은 아닌 것이 바람직하다.
요약하면, 본 발명의 폴리누클레오티드는 성숙한 단백질, 성숙한 단백질과 리더 서열(프리단백질로서 일컬어질 수 있음), 프리단백질 또는 프리프로단백질의 리더 서열이 아닌 하나 이상의 프로서열을 갖는 성숙한 단백질의 전구체를 코드화할 수 있으며, 상기 프리프로단백질은 리더 서열 및 하나 이상의 프로서열을 갖는 프로단백질에 대한 전구체이며, 상기 프로서열은 일반적으로 활성적이고 성숙한 형태의 폴리펩티드를 생성시키는 프로세싱 단계 동안 제거된다.
본 발명의 한 가지 일면에 따르면, 본 발명은 치료학적 또는 예방학적 목적, 특히 유전적 면역을 위한 본 발명의 폴리누클레오티드의 용도를 제공한다.
유전적 면역에서의 본 발명의 폴리누클레오티드의 용도는 바람직하게는, 적합한 전달 방법, 예를 들어, 플라스미드 DNA의 근육으로의 직접 주입(Wolff et al., Hum Mol Genet(1992) 1:363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther.(1983)4:419), 특정한 단백질 캐리어와 복합체화된 DNA의 전달(Wu et al., J Bio Chem. (1989(264:16985), 칼슘 포스페이트로에 의한 DNA의 공침(Benvenisty ＆ Reshef. PNAS USA, (1986)83:9551), 다양한 형태의 리포좀에 의한 DNA의 캡슐화(Kaneda et al., Science(1989)243:375), 입자 충격(Tang et al., Nature(1992) 356:152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol(1993) 12:791) 및 클로닝된 레트로바이러스 벡터를 사용한 생체내 감염(Seeger et al., PANS USA(1984)81:5849)을 이용할 것이다.
벡터, 숙주 세포, 발현 시스템
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리누클레오티드들을 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터로 유전공학적으로 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기법에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 생성에 관한 것이다. 무세포 번역 시스템이 본 발명의 DNA 구성물로부터 유도된 RNA를 사용하여 이러한 단백질을 생성시키는 데에 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전공학적으로 조작된 숙주 세포로부터 당업자에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 추가의 일면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리누클레오티드들을 포함하는 발현 시스템, 이러한 발현 시스템으로 유전공학적으로 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기법에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 생성에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생성에 있어서, 숙주 세포는 일반적으로 발현 시스템 또는 이것의 부분 또는 본 발명의 폴리펩티드를 포함하게 되도록 유전공학적으로 조작될 수 있다. 숙주 세포로의 폴리누클레오티드의 도입은 많은 표준 실험 안내서, 예를 들어, 문헌[Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) and Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)]에 기재된 방법, 예를 들어, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개된 트랜스펙션, 트랜스벡션(transvection), 마이크로인젝션, 양이온 지질 매개된 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 형질도입, 스크랩 로딩(scrape loading), 발사체 도입(ballistic introduciton) 및 감염에 의해 달성될 수 있다.
적합한 숙주의 대표적인 예로는, 세균 세포, 예를 들어, 스트렙토코커스(streptococci), 스타필로코커스(staphylococci), 엔테로코커스(enterococci), 대장균, 스트렙토마이세스(streptomyces), 시아노박테리아(cyanobacteria), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 및 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)의 세포; 진균 세포, 예를 들어, 효모, 클루베로마이세스(Kluveromyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 바시디오마이세테(basidiomycete), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 아스페르길루스(Aspergillus)의 세포; 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9의 세포; 동물 세포, 예를 들어, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 및 보웨스 멜라노마(Bowes melanoma) 세포; 및 식물 세포, 예를 들어 겉씨식물 또는 속씨식물의 세포가 있다.
매우 다양한 발현 시스템이 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 벡터로는, 특히, 염색체-, 에피솜- 및 바이러스-유도된 벡터, 예를 들어, 세균 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포손, 효모 에피솜, 삽입 엘리먼트, 효모 염색체 엘리먼트, 바쿨로바이러스(baculoviruses), 파포바 바이러스(papova viruses), 예를 들어, SV40, 백시니아 바이러스(vaccinia viruses), 아데노바이러스, 계두 바이러스, 슈도라비스 바이러스(pseudorabies viruses), 피코르나바이러스(picornaviruses), 레트로바이러스 및 알파바이러스와 같은 바이러스로부터 유도된 벡터, 및 이들의 혼합물로부터 유도된 벡터, 예를 들어, 플라스미드 및 박테리오파지 유전자 엘리먼트, 예를 들어, 코스미드 및 파지미드로부터 유도된 벡터가 있다. 상기 발현 시스템 구성물은 발현을 조절시킬 뿐만 아니라 발생시키는 조절 영역을 함유할 수 있다. 일반적으로, 숙주에서 폴리누클레오티드를 유지시키거나, 증식시키거나 발현시키고/거나 폴리펩티드를 발현시키는데 적합한 임의의 시스템 또는 벡터가 이러한 경우에 발현에 사용될 수 있다. 적합한 DNA 서열은, 다수의 널리 공지되고 일상적인 기법, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. a LABORATORY MANUAL](supra)에 설명된 기법에 의해 발현 시스템 내로 삽입될 수 있다.
진핵세포에서의 재조합 발현 시스템에의 경우, 번역된 단백질을 소포체의 루멘, 원형질외극 또는 세포외 환경으로 분비시키기 위해, 적합한 분비 시그널이 발현된 폴리펩티드 내로 혼입될 수 있다. 이러한 시그널은 폴리펩티드에 대해 내인성일 수 있거나, 외인성 시그널일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 알루미늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 이온 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)가 정제에 사용된다. 단백질을 리폴딩시키는 널리 공지된 기법이, 세포내 합성, 단리 및/또는 정제 동안에 폴리펩티드가 변성되는 경우, 활성 형태를 재생시키는 데에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 발현 시스템은 바이러스 또는 세균과 같은 살아있는 재조합 미생물일 수 있다. 관심있는 유전자는 살아있는 재조합 바이러스 또는 세균의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 이러한 살아있는 벡터에 의한 접종 및 생체내 감염은 항원의 생체내 발현 및 면역 반응의 유도를 일으킬 것이다. 이러한 목적에 사용되는 바이러스 및 세균으로는 예를 들어, 폭스바이러스(poxviruses)(예를 들어, 백시니아, 계두, 카나리폭스), 알파바이러스(신드비스 바이러스(Sindbis virus), 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus), 베네주엘리안 에콰인 엔세팔리티스 바이러스(Venezuelian Equine Encephalitis Virus), 아데노바이러스, 아데노수반 바이러스, 피코르나바이러스(picornaviruses)(폴리오바이러스(poliovirus), 리노바이러스(rhinovirus)), 헤르페스바이러스(바리셀라 조스터 바이러스(varicella zoster virus) 등), 리스테리아(Listeria), 살모넬라, 시겔라(Shigella), 나이세리아, BCG가 있다. 이러한 바이러스 및 세균은 유독성이거나, 살아있는 백신을 수득하기 위해 다양한 방법으로 약독될 수 있다.
진단, 예후, 혈청형 및 돌연변이 어세이
또한, 본 발명은 진단 시약으로서 사용되는 본 발명의 BASB030 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 진핵세포, 특히 포유동물, 특히 사람에서의 BASB030 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 검출은 질병의 진단, 질병의 단계, 또는 약물에 대한 감염성 생물체의 반응에 대한 진단 방법을 제공할 것이다. 진핵세포, 특히 포유동물, 특히 사람, 특히 BASB030 유전자 또는 단백질을 포함하는 생물체로 감염되거나 감염된 것으로 여겨지는 사람이 본원에 제공된 방법 뿐만 아니라 널리 공지된 다양한 방법에 의해 핵산 또는 아미노산 수준에서 검출될 수 있다.
예후, 진단 또는 기타 분석을 위한 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 감염된 것으로 추정되고/거나 감염된 개체의 몸체 물질로부터 수득될 수 있다. 이러한 공급원 중의 어느 하나로부터의 폴리누클레오티드, 특히 DNA 또는 RNA가 검출에 직접 사용되거나, 분석 전에 PCR 또는 임의의 그 밖의 증폭 기법에 의해 효소적으로 증폭될 수 있다. RNA, 특히 mRNA, cDNA 및 게놈 DNA가 또한 동일한 방법으로 사용될 수 있다. 증폭을 사용함으로써, 개체에 존재하는 감염성 또는 내재성 생물체의 종 및 스트레인의 특징화가 생물체의 선택된 폴리누클레오티드의 유전자형의 분석에 의해 이루어질 수 있다. 결실 및 삽입은 관련된 생물체, 바람직하게는, 동일한 속의 상이한 종 또는 동일한 종의 상이한 스트레인으로부터 선택된 기준 서열의 유전자형과 비교하여 증폭된 생성물의 크기의 변화에 의해 검출될 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 표지된 BASB030 폴리누클레오티드 서열에 하이브리드화시킴으로써 확인될 수 있다. 완전하게 또는 현저하게 매칭된 서열은, 각각 DNA 또는 RNA에 대한 DNase 또는 RNase 분해에 의해, 또는 융점 또는 탈변성 역학(renaturation kinetics)의 차이를 검출함으로써 불완전하게 또는 더욱 현저하게 미스매칭된 이중체와 구별될 수 있다. 또한, 폴리누클레오티드 서열 차이는 기준 서열과 비교하여 겔에서의 폴리누클레오티드 단편의 전기영동적 이동성의 변화에 의해 검출될 수 있다. 이는 변성 제제 유무에 상관 없이 수행될 수 있다. 또한, 폴리누클레오티드 차이는 DNA 또는 RNA 서열화에 의해 검출될 수 있다[참조: Myers et al., science, 230:1242(1985)]. 또한, 특정 위치에서의 서열 변화는 누클라아제 방어 어세이, 예를 들어, RNase, V1 및 S1 방어 어세이, 또는 화학 절단 방법에 의해 밝혀질 수 있다[참조: Cotton et al., Proc. Natl.Acad.Sci., USA. 85:4397-4401(1985)].
또 다른 구체예에서, BASB030 누클레오티드 서열 또는 이것의 단편을 포함하는 올리고누클레오티드 프로브의 배열은 예를 들어, 유전적 돌이변이, 혈청형, 분류학적 분류 또는 동정의 효율적인 스크리닝을 수행하기 위해 구성될 수 있다. 배열 기술 방법은 널리 공지되어 있으며, 포괄적인 적용성을 가지며, 유전자 발현, 유전자 결합 및 유전자 가변성을 포함한 분자 유전학에서의 다양한 문제를 처리하는데 사용될 수 있다[참조: Chee et al., Science. 274:610(1996)].
따라서, 또 다른 일면에서, 본 발명은 하기 (a) 내지 (d)를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다:
(a) 본 발명의 폴리누클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1,3,5의 누클레오티드 서열 또는 이것의 단편;
(b) (a)의 누클레오티드 서열에 상보적인 누클레오티드 서열;
(c) 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2,4,6의 폴리펩티드 또는 이것의 단편; 또는
(d) 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2,4,6의 폴리펩티드에 대한 항체.
임의의 이러한 키트에 있어서, (a), (b), (c) 또는 (d)는 중요한 성분을 포함할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 이러한 키트는 질병 또는 질병에 대한 민감성을 진단하는데 사용될 것이다.
또한, 본 발명은 진단 시약으로서의 본 발명의 폴리누클레오티드의 용도에 관한 것이다. 질병 또는 병원성과 관련된 본 발명의 폴리누클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1,3,5의 변이된 형태의 검출은, 질병의 진단, 질병 경과의 예후, 질병 단계의 측정 또는 질병에 대한 민감성에 추가되거나 이들을 규정할 수 있는 진단 도구를 제공하며, 이는 폴리누클레오티드의 과소-발현, 과다-발현 또는 변화된 발현으로부터 유도된다. 이러한 폴리누클레오티드의 변이를 수반하는 생물체, 특히 감염성 생물체는 본원의 어느 한 부분에 설명된 바와 같은 다양한 기법에 의해 폴리누클레오티드 수준에서 검출될 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 돌연변이체 또는 다형성(대립유전자 변이체)을 수반하는 생물체로부터의 세포는 예를 들어 혈청형을 결정할 수 있도록 다양한 기법에 의해 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 수준에서 검출될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR이 RNA에서의 돌연변이를 검출하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어 진스캔(GeneScan)과 같은 자동화된 검출 시스템과 함께 RT-PCR을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또한, RNA, cDNA 또는 게놈 DNA는 동일한 목적, 즉 PCR에 사용될 수 있다. 한 가지 예로서, BASB030 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드에 상보적인 PCR 프라이머가 변이를 확인하고 분석하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 1, 2, 3 또는 4개의 누클레오티드가 5' 및/또는 3' 말단으로부터 제거되어 있는 프라이머를 제공한다. 이러한 프라이머는 특히 몸체 물질과 같은 개체로부터 유도된 샘플로부터 단리된 BASB030 DNA 및/또는 RNA를 증폭시키는 데에 사용될 수 있다. 이러한 프라이머는 감염된 개체로부터 단리된 폴리누클레오티드를 증폭시키는 데에 사용될 수 있으며, 그 후, 폴리누클레오티드는 폴리누클레오티드 서열을 밝혀내는 다양한 기법에 적용될 수 있다. 이러한 방식으로, 폴리누클레오티드 서열의 변이가 검출되어, 감염 또는 이것의 단계 또는 경과를 진단하고/거나 예후하거나, 감염성 제제를 혈청화시키고/거나 분류하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 개체, 예를 들어 몸체 물질로부터 유도된 샘플로부터, SEQ ID NO: 1,3,5의 서열을 갖는 폴리누클레오티드의 증가된 수준의 발현을 측정하는 것을 포함하여, 질병, 바람직하게는 세균 감염, 더욱 바람직하게는 나이세리아 메닌지티디스에 의해 초래된 감염을 진단하는 방법을 제공한다. BASB030 폴리누클레오티드의 증가되거나 감소된 발현은 예를 들어, 증폭, PCT, RT-PCR, RNase 방어, 노던 블롯팅, 분광법 및 기타 하이브리드화 방법과 같은 폴리누클레오티드의 정량을 위해 당 분야에서 널리 공지된 방법중 하나를 사용함으로써 측정될 수 있다.
또한, 정상 대조 조직 샘플과 비교하여 BASB030 폴리펩티드의 과다발현을 검출하기 위한 본 발명에 따른 진단 어세이가 예를 들어, 감염의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 숙주로부터 유도된 샘플, 예를 들어 몸체 물질 중의 BASB030 폴리펩티드의 수준을 측정하는데 사용될 수 있는 어세이 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 어세이 방법으로는 방사성면역어세이, 경쟁적-결합 어세이, 웨스턴 블롯 분석, 항체 샌드위치 어세이, 항체 검출 및 ELISA 어세이가 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드는 폴리누클레오티드 배열의 성분, 바람직하게는 고밀도 배열 또는 격자(grid)로서 사용될 수 있다. 이러한 고밀도 배열은 진단 및 예후 목적에 특히 유용하다. 예를 들어, 각각 상이한 유전자를 포함하고, 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리누클레오티드(들)를 추가로 포함하는 지점의 세트는 하이브리드화 또는 핵산 증폭을 사용하고, 몸체 샘플로부터 수득되거나 유도된 프로브를 사용하는 것과 같이 프로빙에 사용되어 개체에 특정 폴리누클레오티드 서열 또는 이와 관련된 서열이 존재하는 지를 측정할 수 있다. 이러한 존재는 병원체, 특히 나이세리아 메닌지티디스의 존재를 나타낼 수 있으며, 질병 또는 질병의 경과를 진단하고/거나 예후하는데 유용할 수 있다. SEQ ID NO: 1,3,5의 폴리누클레오티드 서열의 다수의 변이체를 포함하는 격자가 바람직하다. 또한, SEQ ID NO: 2,4,6의 폴리펩티드 서열을 코드화하는 폴리누클레오티드 서열의 다수의 변이체를 포함하는 격자가 바람직하다.
항체
본 발명의 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드 또는 이들의 변이체, 또는 이를 발현시키는 세포는 각각 이러한 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대해 면역특이적인 항체를 생성하는데 면역원으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 특정의 바람직한 구체예에서, BASB030 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대한 항체를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대해 생성된 항체는, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드, 이중 하나 또는 이 둘 모두의 에피토프-함유 단편, 이중 하나 또는 이 둘 모두의 유사체, 또는 이중 하나 또는 이둘 모두를 발현시키는 세포를, 일상적인 프로토콜을 사용하여 동물, 바람직하게는 사람 이외의 동물에게 투여함으로써 수득될 수 있다. 모노클로날 항체의 제조에 있어서, 연속 세포주 배양물에 의해 생성된 항체를 제공하는 당 분야에 공지된 기법이 사용될 수 있다. 실례로는 다양한 기법, 예를 들어, 문헌[Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256:495-495(1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72(1983); Cole et al., pg, 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc.(1985)]에 기재된 기법을 포함한다.
단일 사슬 항체를 생성시키는 방법(미국 특허 제 4,946,778호)이 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대한 단일 사슬 항체를 생성시키는데 적합화될 수 있다. 또한, 형질전환된 마우스 또는 다른 생물체 또는 동물, 예를 들어 기타 포유동물이 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대해 면역특이적인 인간화된 항체를 발현시키는데 사용될 수 있다.
대안적으로, 파지 디스플레이 기술은 항-BASB030을 갖는 것에 대해 스크리닝된 사람으로부터의 림프구의 PCR 증폭된 v-유전자의 레퍼터리로부터 또는 천연 라이브러리로부터 본 발명의 폴리펩티드에 대해 결합 활성을 갖는 항체 유전자를 선택하는데 사용될 수 있다(McCafferty, et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, et al., (1992) Biotechnology 10. 779-783). 또한, 이러한 항체의 친화성은 예를 들어, 사슬 셔플링(shuffling)에 의해 개선될 수 있다(Clackson et al., (1991) Nature 352:628).
상기 설명된 항체는 예를 들어, 친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 정제하기 위해 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 발현시키는 클론을 단리시키거나 확인하는데 사용될 수 있다.
따라서, 특히, BASB030-폴리펩티드 또는 BASB030-폴리누클레오티드에 대한 항체가 감염, 특히 세균 감염을 치료하는데 사용될 수 있다.
항원적으로, 에피토프적으로 또는 면역학적으로 동등한 변이체를 포함하는 폴리펩티드 변이체는 본 발명의 특정한 일면을 형성한다.
바람직하게는, 항체 또는 이것의 변이체는 개체에서 덜 면역원성이 되도록 변형된다. 예를 들어, 개체가 사람인 경우, 항체는 가장 바람직하게는, "인간화"될 수 있으며, 여기서, 하이브리도마-유도된 항체의 상보성 결정 영역 또는 영역들은 예를 들어, 문헌[Jones et al.(1986), Nature 321, 522-525 or Tempest et al., (1991) Biotechnology 9, 266-273]에 기재된 바와 같이 사람 모노클로날 항체 내로 이식되어왔다.
안타고니스트 및 아고니스트-어세이 및 분자
또한, 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 예를 들어, 세포, 무세포 제조물, 화학적 라이브러리, 및 천연 생성물 혼합물에서의 소분자 기질 및 리간드의 결합을 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 기질 및 리간드는 천연 기질 및 리간드일 수 있거나, 구조적 또는 기능적 의태물일 수 있다[참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5(1991)].
스크리닝 방법은, 후보 화합물에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 표지에 의해 후보 화합물이 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드, 또는 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 함유하는 세포 또는 막, 또는 폴리펩티드의 융합 단백질에 결합하는 것을 간단하게 측정할 수 있다. 대안적으로, 스크리닝 방법은 표지된 경쟁물질에 의한 경쟁을 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 스크리닝 방법은, 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 포함하는 세포에 적합한 검출 시스템을 사용함으로써, 후보 화합물이 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 활성화 또는 억제에 의해 생성된 시그널을 초래하는 지를 시험할 수 있다. 활성의 억제제는 일반적으로 공지된 아고니스트의 존재하에서 어세이되며, 후보 화합물의 존재에 의한 아고니스트에 의한 활성화에 대한 효과가 관찰된다. 구성적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 구성적으로 발현된 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는, 경우에 따라, 후보 화합물이 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 활성화의 억제를 초래하는 지의 여부를 시험함으로써, 아고니스트 또는 억제제의 부재하에서 역 아고니스트 또는 억제제에 대한 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 추가로, 스크리닝 방법은 간단히, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 함유하는 용액을 후보 화합물과 혼합시켜 혼합물을 형성시키고, 혼합물 중의 BASB030 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드 활성을 측정하고, 혼합물의 BASB030 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드 활성을 표준 활성과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 융합 단백질, 예를 들어, 본원에 설명된 바와 같이 Fc 부분과 BASB030 폴리펩티드로부터 제조된 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드 뿐만 아니라 계통발생적으로 및/또는 기능적으로 관련된 폴리펩티드의 안타고니스트를 확인하기 위해 고산출량 스크리닝 어세이에 사용될 수 있다(참조: D.Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52-58(1995); and K.Johanson et al., J Biol Chem, 270(16):9459-9471(1995)).
또한, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하고/거나 이것과 상호작용하는 폴리누클레오티드, 폴리펩티드 및 항체는 세포에서의 mRNA 및/또는 폴리펩티드의 생성에 대한 첨가된 화합물의 효과를 검출하기 위한 스크리닝 방법을 구성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, ELISA 어세이가 당 분야에 공지된 표준 방법에 의해 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 사용함으로써, 분비되거나 세포 결합된 수준의 폴리펩티드를 측정하기 위해 구성될 수 있다. 이것은 적합하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 폴리펩티드의 생성을 억제시키거나 증강시킬 수 있는 제제(각각 안타고니스트 또는 아고니스트로도 일컬어짐)를 발견하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 BASB030 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 작용을 증강(아고니스트)시키거나 차단(안타고니스트)시키는 화합물, 특히 정균성 및/또는 멸균성인 화합물을 확인하기 위해 화합물 스크리닝 방법을 제공한다. 스크리닝 방법은 고산출량 기법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아고니스트 또는 안타고니스트를 스크리닝하기 위해, BASB030 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드의 표지된 기질 또는 리간드를 포함하는, 합성 반응 혼합물, 세포 구획물, 예를 들어 막, 세포 엔벨로프(envelope) 또는 세포벽, 또는 이들 중 어느 하나의 제조물은, BASB030 아고니스트 또는 안타고니스트일 수 있는 후보 물질의 존재 또는 부재하에서 인큐베이션된다. BASB030 폴리펩티드를 아고나이징시키거나 안타고나이징할 수 있는 후보 분자의 능력은 표지된 리간드의 감소된 결합 또는 이러한 기질로부터의 생성물의 감소된 생성으로 반영된다. 불필요하게 결합하는 분자(즉, BASB030 폴리펩티드의 효과를 유도시키지 않으면서) 거의 확실하게 우수한 안타고니스트인 것으로 여겨진다. 기질에 잘 결합하며, 경우에 따라, 기질로부터의 이러한 생성물의 생성율을 증가시키거나, 신호 변환을 증가시키거나, 화학적 채널 활성을 증가시키는 분자가 아고니스트이다. 경우에 따라, 기질로부터의 생성물의 생성, 신호 변환 또는 화학적 채널 활성의 비 또는 수준의 검출은 리포터 시스템을 사용함으로써 증강될 수 있다. 이러한 경우에 유용할 수 있는 리포터 시스템은, 생성물로 전환된 비색계의 표지된 기질, BASB030 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 활성의 변화에 반응성인 리포터 유전자 및 당 분야에 공지된 결합 어세이를 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다.
BASB030 아고니스트에 대한 어세이의 또 다른 예는, 경쟁 억제 어세이에 적합한 조건하에서, BASB030 및 잠재적 아고니스트를 BASB030-결합 분자, 재조합 BASB030 결합 분자, 천연 기질 또는 리간드, 또는 기질 또는 리간드 의태물과 혼합시키는 경쟁 어세이이다. BASB030은 결합 분자에 결합되거나 생성물로 전환된 BASB030 분자의 수가 잠재적 안타고니스트의 효과를평가하기 위해 정확하게 결정될 수 있게 되도록 예를 들어, 방사능 또는 비색계 화합물에 의해 표지될 수 있다.
잠재적 안타고니스트는 본 발명의 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드에 결합하여 이것의 활성 및 발현을 억제하거나 단절시키는 작은 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드 및 항체를 포함한다. 또한, 잠재적 안타고니스트는 BASB030 유도된 활성을 유도시키지 않으면서 결합 분자 상의 동일한 부위에 결합하여 BASB030 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드가 결합되지 못하게 함으로써 BASB030 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드의 작용 또는 발현을 억제시키는 작은 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 예를 들어, 밀접하게 관련된 단백질 또는 항체일 수 있다.
잠재적 안타고니스트는 폴리펩티드의 결합 부위에 결합하여 여기를 점유함으로써 정상적인 생물학적 활성이 억제되도록 세포 결합 분자에 결합하는 것을 억제하는 소분자를 포함한다. 소분자의 실례는, 작은 유기 분자, 펩티드 또는 펩티드 유사 분자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 기타 잠재적 안타고니스트는 안티센스 분자를 포함한다(이러한 분자는 하기 문헌 참조: Okano, J.Neurochem. 56:560(1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION. CRC Press, Boca Raton, FL(1988)). 바람직한 잠재적 안타고니스트는 BASB030과 관련된 화합물 및 BASB30의 변이체를 포함한다.
추가적인 일면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이것의 단편, 및 다양한 서브클래스의 면역글로불린(IgG, IgM, IgA, IgE)의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 다양한 부분을 포함하는 유전공학적으로 조작된 가용성 융합 단백질에 관한 것이다. 면역글로불린으로서 바람직한 것은, 사람 IgG, 특히, IgG1의 중쇄의 불변 부분이며, 융합은 힌지 영역에서 발생한다. 특정 구체예에서, Fc 부분은 혈액 응고 인자 Xa로 절단될 수 있는 절단 서열의 혼입에 의해 간단하게 제거될 수 있다. 게다가, 본 발명은 유전공학에 의한 이러한 융합 단백질의 제조 방법 및 약물 스크리닝, 진단 및 치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 추가적 일면은 이러한 융합 단백질을 코드화하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 융합 단백질 기술의 예는, 국제 특허 출원 WO94/29458 및 WO94/22914에서 발견될 수 있다.
본원에 제공된 각각의 폴리누클레오티드 서열은 항균성 화합물의 발견 및 개발에 사용될 수 있다. 발현시에 코드화된 단백질은, 항균성 약물의 스크리닝에 대한 표적물로서 사용될 수 있다. 추가적으로, 코드화된 단백질 또는 샤인-델가르노(Shine-Delgarno)의 아미노 말단 영역을 코드화하는 폴리누클레오티드 서열 또는 각각의 mRNA의 다른 번역 촉진 서열은 관심있는 코딩 서열의 발현을 조절하기 위한 안티센스 서열을 구성하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 병원체 또는 병원체들과 진핵세포, 바람직하게는 포유동물, 후속 감염을 초래하는 숙주사이의 초기 물리적 상호반응을 방해하기 위한 본 발명의 폴리펩티드, 폴리누클레오티드, 아고니스트 또는 안타고니스트의 사용 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 분자는, 세균, 특히 그람 포지티브 및/또는 그람 네거티브 세균의 유치 기기(in-dwelling device)상의 진핵세포, 특히 포유동물, 세포외 매트릭스 단백질 또는 상처부위의 세포외 매트릭스 단백질로의 부착의 방해에 사용될 수 있으며; 진핵세포, 바람직하게는, 포유동물, 세포외 매트릭스 단백질과 조직 손상을 매개하는 세균 BASB030 단백질 사이의 세균 부착을 차단하는데 사용될 수 있고/거나; 유치 기기의 이식 또는 외과 기술 이외의 것에 의해 개시된 감염에서의 정상적인 발병의 진행을 차단하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면에는 BASB030 아고니스트 및 안타고니스트, 바람직하게는 정균성 또는 멸균성인 아고니스트 및 안타고니스트가 제공된다.
본 발명의 안타고니스트 및 아고니스트는 예를 들어, 질병을 억제하고/거나 치료하는데 사용될 수 있다.
추가적 일면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 미모토프(mimotope)에 관한 것이다. 미모토프는, 천연 펩티드를 인지하는 항체에 의해 인지될 수 있거나; 적합한 캐리어에 커플링되는 경우, 천연 펩티드를 인지하는 항체를 증가시킬 수 있는 천연 펩티드와 사실상 유사한(서열적으로 또는 구조적으로) 펩티드 서열이다.
펩티드 미모토프는 선택된 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 특정 목적을 위해 고안될 수 있다. 따라서, 펩티드는 단백질 캐리어로의 컨쥬게이션의 용이함을 목적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 화학적 컨쥬게이션 방법에 있어서는 말단 시스테인을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 담백질 캐리어에 컨쥬게이팅된 펩티드에 있어서, 펩티드의 컨쥬게이팅된 말단으로부터 말단인소수성 말단부를 포함하여, 펩티드의 유리 비컨쥬게이팅된 말단이 캐리어 단백질의 표면에 결합되도록 유지시키는 것이 바람직할 수 있다. 이렇게 나타나므로써, 대부분의 펩티드 형태는 전체 천연 분자 환경에서 발견된 바와 같은 펩티드의 형태를 매우 닮았다. 예를 들어, 상기 펩티드는 N-말단 시스테인 및 C-말단 소수성 아미드화된 테일을 갖도록 변형될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 아미노산을 형성하는 D-입체이성질체의 첨가 또는 치환을 수행하여, 예를 들어, 펩티드의 안정성을 증강시키기 위한 이로운 유도체를 생성시킬 수 있다.
대안적으로, 펩티드 미모토프는, 파지 표출 기법(EP 0 552 267 B1)과 같은 기법에 의해 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 사용함으로써 확인될 수 있다. 이러한 기법으로, 천연 펩티드의 구조를 최소화시켜, 항-천연 펩티드 항체에는 결합할 수 있으나, 천연 폴리펩티드와의 중요한 서열 상동성을 공유할 필요는 없는 많은 수의 펩티드 서열가 생성된다.
백신
본 발명의 또 다른 일면은, 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 생성하는데 적합한 개체에 BASB030 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 이것의 단편 또는 변이체를 접종하여 감염, 특히 세균 감염, 더욱 특히 나이세리아 메닌지티디스 감염으로부터 상기 개체를 방어하는 것을 포함하는, 개체, 특히 포유동물, 바람직하게는 사람에서의 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이렇게 하여 이러한 면역 반응이 세균의 복제를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 일면은 개체에서 면역학적 반응을 유도하는 방법으로서, 면역학적 반응을 유도하여, 예를 들어, 항체 면역 반응 및/또는 예를 들어, 시토카인-생성 T 세포 또는 세포독성 T 세포를 포함하는 T 세포 면역 반응을 유도하여 개체, 바람직하게는 사람을 질환(질환이 개체내에 이미 존재하는지의 여부에 상관없이)으로부터 방어하기 위해, 이러한 개체로 핵산 벡터, 서열 또는 리보자임을 수송하여, 생체내에서 BASB030 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 이들의 단편 또는 변이체 발현을 위해 BASB030 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 이들의 단편 또는 변이체의 발현을 유도하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 투여의 예를 들면, 유전자는 입자상의 코팅 또는 다른 형태로서 목적하는 세포에 가속되어 투여된다. 이러한 핵산 벡터는 DNA, RNA, 리보자임, 변형된 핵산, DNA/RNA 하이브리드, DNA-단백질 복합물 또는 RNA-단백질 복합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가적 일면은, 면역학적 조성물이 개체, 바람직하게는, 면역 반응을 유도할 수 있는 사람에 도입되는 경우, BASB030 폴리누클레오티드 및/또는 이들로부터 코드화된 폴리펩티드에 대한 개체의 면역학적 반응을 유도하는 면역학적 조성물로서, 재조합 BASB030 폴리누클레오티드 및/또는 이들로부터 코드화된 폴리펩티드를 포함하고/거나 상기 BASB030 폴리누클레오티드, 이들로부터 코드화된 폴리펩티드 또는 본 발명의 기타 폴리펩티드의 항원을 코드화하고 발현시키는 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 면역학적 조성물에 관한 것이다. 면역학적 반응은 치료학적으로 또는 예방학적으로 사용될 수 있으며, 항체 면역성 및/또는 세포 면역성 예를 들어, CTL 또는 CD4+ T 세포로부터 발생하는 세포 면역성의 형태를 취할 수 있다.
BASB030 폴리펩티드 또는 이것의 단편은, 스스로 항체를 생성할 수 있거나 없으며, 제 1 단백질을 안정화시킬 수 있으며, 항원성 및/또는 면역원성 특성을 갖는 융합된 또는 변형된 단백질을 생성시킬 수 있는 보조단백질 또는 화학 부분과 유합될 수 있다. 이렇게 융합된 재조합 단백질은 바람직하게는, 항원성 보조단백질, 예를 들어, 헤모필루스 인플루엔자, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST) 또는 베타갈락톡시다아제로부터의 지질단백질 D, 또는 상기 단백질을 안정화시키고, 이들의 생성 및 정제를 촉진하는 기타 비교적 큰 보조단백질을 추가로 포함한다. 게다가, 보조단백질은 상기 단백질을 수용하는 생물체의 면역 시스템의 일반화된 자극을 제공한다는 점에 있어서 보조제로서 작용할 수 있다. 보조단백질은 제 1 단백질의 아미노- 또는 카르복시-말단에 부착될 수 있다.
문헌[Sato, Y. et al., Science 273:352(1996)]에 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드 및 면역자극 DNA 서열을 포함하는 조성물, 특히 백신 조성물 및 방법이 제공된다.
또한, 상기 설명된 폴리누클레오티드 또는 이들의 특정 단편으로서, 나이세리아 메닌지티디스로의 동물 모델 감염에서 이러한 유전자 면역화 실험에 사용되는 폴리누클레오티드 구성물에서 세균 세포 표면 단백질의 비가변 영역을 코드화하는 것으로 입증된 단편을 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 실험은 특히, 예방적 또는 치료적 면역 반응을 야기할 수 있는 단백질 에피토프를 확인하는데 유용할 것이다. 이러한 방법은, 포유동물, 특히 사람에서 세균 감염, 특히 나이세리아 메닌지티디스의 치료학적 처리 또는 예방학적 제제의 개발을 위해, 감염에 성공적으로 저항하거나 제거하는 동물의 필수 기관으로부터 유도된 특정 값의 단일클론성 항체의 후속 제조를 가능하게 하는 것으로 여겨진다.
또한, 본 발명은 적합한 캐리어, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 캐리어와 함께 본 발명의 면역원성 재조합 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드를 포함하는 백신 제형을 포함한다. 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 위에서 분해될 수 있기 때문에, 예를 들어, 피하내, 근내, 정맥내, 피내 투여를 포함하여, 비경구적으로 투여하는 것이 바람직하다. 비경구 투여에 적합한 제형은, 개체의 체액, 바람직하게는 혈액과 등장성인 제형인 산화방지제, 완충제, 박테리오 발육 저지성 화합물 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주입 용액; 및 현탁제 또는 농후제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 상기 제형은 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 유리병에 존재할 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 캐리어를 첨가해야 하는 냉동건조 조건하에 저장될 수 있다.
본 발명의 백신 제형은 또한, 제형의 면역원성을 증진시키기 위한 보조 시스템을 포함한다. 바람직하게는, 보조 시스템은 TH1 유형의 반응을 우선적으로 증가시킨다.
면역 반응은 체액성 또는 세포 매개된 면역 반응인 두 개의 극단적인 카테고리로 넓게 구분될 수 있다(전형적으로, 각각 방어의 항체 및 세포 작동체 메카니즘을 특징으로 함). 반응의 이러한 카테고리는 TH1-유형 반응(세포 매개된 반응) 및 TH2-유형 면역 반응(체액성 반응)으로 불린다.
극단적인 TH1-유형 면역 반응은 항원 특이적 일배체형(haplotype) 제한된 세포독성 T 림프구 및 천연 살해 세포 반응의 발생에 의해 특징지워질 수 있다. 마우스에서 TH1-유형 반응은 종종, IgG2a 서브타입의 항체 생성에 의해 특징지어지는 반면, 사람에서는 IgG1 유형에 상응한다. TH2-유형 면역 반응은 마우스 IgG1, IgA 및 IgM을 포함하는 광범위한 범위의 면역글로불린 이소타입의 생성에 의해 특징지어진다.
이러한 두 유형의 면역 반응의 개발 뒤의 추진력은 시토카인에 있는 것으로 여겨질 수 있다. 고수준의 TH1-유형 시토카인은 제공된 항원에 대한 세포 매개된 면역 반응을 유도하는 경향이 있는 반면, 고수준의 TH2-유형 시토카인은 항원에 대한 체액성 면역 반응을 유도하는 경향이 있다.
TH1 및 TH2-유형 면역 반응의 특징은 절대적이지 않다. 실제로는, 개체는 주로 TH1 또는 주로 TH2로서 언급된 면역 반응을 지지할 것이다. 그러나, 모스만(Mosmann)과 코프만(Coffman)(Mosmann, T.R. and Coffman. R.L.(1989) TH1 and TH2 cells: 상이한 패턴의 림포카인 분비가 상이한 작용 특성을 유도함, Annual Review of Immunology, 7, p145-173)에 의한 바와 같이, 쥐과동물 CD4+ve T 세포 클론에 있어서, 시토카인의 계통을 고려하는 것이 편리하다. 전형적으로, TH1-유형 반응은 T-림프구에 의해 INF-γ 및 IL-2 시토카인의 생성과 관련된다. TH1-유형 면역 반응의 유도와 종종 직접 관련된 기타 시토카인은 T-세포, 예를 들어, IL-12에 의해 생성되지 않는다. 반대로, TH2-유형 반응은 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-13과 관련된다.
특정 백신 보조제는 특히, TH1 또는 TH2-유형 시토카인 반응의 자극에 적합한 것으로 공지되어 있다. 전형적으로, 백신화 또는 감염 후, 면역 반응의 TH1:TH2 균형의 가장 우수한 지시제는, 재자극 후 시험관내에서 T 림프구에 의한 TH1 또는 TH2 시토카인의 생성의 직접적인 측정 및/또는 항원 특이적 항체 반응의 IgG1:IgG2a 비의 측정을 포함한다.
이렇게, TH1-유형 보조제는, 시험관내에서 항원으로 재자극되는 경우, 고수준의 TH1-유형 시토카인을 생성하기 위해 분리된 T-세포 개체군을 선택적으로 자극하고, TH1-유형 이소타입과 관련된 항원 특이적 면역글로불린 및 CD8+ 세포독성 T 림프구 둘 모두의 전개를 촉진한다.
TH1 세포 반응을 선택적으로 자극할 수 있는 보조제는 국제 특허 출원 WO94/00153 및 WO95/17209에 기재되어 있다.
3 데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)은 이러한 보조제중 하나다. 이는 GB 2220211(Ribi)에 공지되어 있다. 화학적으로, 이는 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화된 사슬의 혼합물이며, 리비 이뮤노쳄(Ribi Immunochem)(Montana)에 의해 제조되었다. 바람직한 형태의 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A는 유럽 특허 0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)에 기재되어 있다.
바람직하게는, 3D-MPL의 입자는 0.22마이크론 막을 통해 멸균 여과되기에 충분히 작다(유럽 특허 제 0 689 454).
3D-MPL은 1회용량당 10μg-100μg, 바람직하게는 25-50μg의 범위로 존재하며, 항원은 전형적으로 1회용량당 2-50μg의 범위로 존재할 것이다.
또 다른 바람직한 보조제는 QS21 즉, 퀼리아자 사포나리아 몰리나(Quilaja Saponaria Molina)의 껍질로부터 유도된 Hplc 정제된 비독성 분획을 포함한다. 선택적으로, 이는 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)과 선택적으로 캐리어와 함께 혼합될 수 있다.
QS21의 제조 방법은 미국 특허 제 5,057,540호에 기재되어 있다.
QS21을 함유하는 넌리액토제닉(non-reactogenic) 보조제 제형은 이미 공지되어 있다(WO 96/33739). QS21 및 콜레스테롤을 포함하는 이러한 제형은, 항원과 함께 제형화되는 경우, 성공적인 TH1 자극 보조제인 것으로 입증되었다.
또한, TH1 세포 반응의 선택적인 자극제인 보조제는 WO96/02555에 기재된 바와 같은 면역조절 올리고누클레오티드, 예를 들어, 메틸화되지 않은 CpG 서열을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 상이한 TH1 자극 보조제의 혼합은 또한, TH1 세포 반응의 선택적인 자극제인 보조제를 제공하는 것으로써 여겨진다. 예를 들어, QS21은 3D-MPL과 함께 제형화될 수 있다. QS21:3D-MPL의 비는 전형적으로, 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:5 내지 5:1이며, 종종 실질적으로 1:1이다. 최적의 상승 효과를 위한 바람직한 비는 2.5:1 내지 1:1의 3D-MPL:QS21이다.
바람직하게는, 캐리어가 본 발명에 따른 백신 조성물중에 또한 존재한다. 캐리어는 수중유 에멀션 또는 알루미늄 포스페이트 또는 수산화알루미늄과 같은 알루미늄 염일 수 있다.
바람직한 수중유 에멀션은 스쿠알렌, 알파 토코페롤 및 Tween 80과 같은 대사가능한 오일을 포함한다. 특히 바람직한 일면에서, 본 발명에 따른 백신 조성물중의 항원은 이러한 에멀션에서 QS21 및 3D-MPL와 혼합된다. 추가로, 수중유 에멀션은 스판(span) 85 및/또는 레시틴 및/또는 트리카프릴린을 함유할 수 있다.
전형적으로, 사람 투여에 있어서, QS21 및 3D-MPL은 1회용량 당 1μg-200μg, 예를 들어, 10-100μg, 바람직하게는 10μg-50μg의 양으로 백신중에 존재할 것이다. 전형적으로, 수중유는 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 알파 토코페롤 및 0.3 내지 3% Tween 80을 포함할 것이다. 바람직하게는, 스쿠알렌:알파 토코페롤의 비는 1 이하이며, 이는 더욱 안정적인 에멀션을 제공한다. 또한, 스판 85는 1% 수준으로 존재할 수 있다. 일부의 경우, 본 발명의 백신이 안정화제를 추가로 함유하는 것이 유리할 수 있다.
비독성 수중유 에멀션은 바람직하게는, 수성 캐리어 중에 비독성 오일, 예를 들어, 스쿠알렌 또는 유화제, 예를 들어 Tween 80을 함유한다. 수성 캐리어는 예를 들어, 포스페이트 완충된 염수일 수 있다.
수중유 에멀션중의 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 강력한 보조제는 WO95/17210에 기재되어 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 백신 제형과 기타 항원, 특히 암, 자가면역 질환 및 이와 관련된 질환에 유용한 항원을 포함하는 다가 백신 조성물을 제공한다. 이러한 다가 백신 조성물은 본원에 언급된 바와 같은 TH-1 유도 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명은 특정 BASB030 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 참조로 설명되어 있지만, 이는 천연 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드의 단편, 및 재조합 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 면역원성 특성에 사실상 영향을 끼치지 않는 첨가, 결실 또는 치환된 유사한 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드의 단편을 포함하는 것으로 이해된다.
상기 항원은 전체 세균(죽은 또는 살아있는) 또는 서브셀룰라(subcellular) 분획의 형태로 전달될 수 있으며, 이러한 가능성은 나이세리아 메닌지티디스 자체를 포함한다.
조성물, 키트 및 투여
본 발명의 추가적 일면에 있어서, 세포 또는 다세포 생물체로의 투여를 위해 BASB030 폴리누클레오티드 및/또는 BASB030 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명은 본원에서 논의된 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드 또는 이들의 아고니스트 또는 안타고니스트를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 세포, 조직 또는 생물체에 사용하기 위한 비멸균 또는 멸균 캐리어 또는 캐리어들, 예를 들어, 개체 투여에 적합한 약제학적 캐리어와 혼합된 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 배지 첨가제 또는 치료학적으로 효과적인 양의 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드, 및 약제학적으로 허용되는 캐리어 또는 부형제를 포함한다. 이러한 캐리어는 염수, 완충된 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 제형은 투여 방식에 적합하여야 한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 상기 언급된 조성물의 하나 이상이 성분으로 충전된 하나 이상의 캐리어를 포함하는 진단학적 및 약제학적 팩 및 키트에 관한 것이다.
폴리펩티드, 폴리누클레오티드 및 본 발명의 기타 화합물은 단독으로 또는 치료학적 화합물과 같은 다른 화합물과 함께 사용될 수 있다.
약제학적 조성물은 예를 들어, 국부적, 경구적, 항문, 생식 기관, 정맥내, 복강내, 근내, 피하내, 비내 또는 피내 경로에 의한 투여를 포함한 효과적이고 간편한 방식으로 투여될 수 있다.
치료 또는 예방에 있어서, 활성 제제는 주입가능한 조성물, 예를 들어, 멸균수 분산액, 바람직하게는 등장액으로서 개체에 투여될 수 있다.
추가의 일면에서, 본 발명은, 약제학적으로 허용되는 캐리어 또는 부형제와 혼합된 치료학적 유효량의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드, 예를 들어, 가용성 형태의 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드, 아고니스트 또는 안타고니스트 펩티드 또는 소분자 화합물을 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 이러한 캐리어는 염수, 완충된 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 추가로, 본 발명의 상기 언급된 조성물의 하나 이상이 성분으로 충전된 하나 이상의 캐리어를 포함하는 진단학적 및 약제학적 팩 및 키트에 관한 것이다. 폴리펩티드, 폴리누클레오티드 및 본 발명의 기타 화합물은 단독으로 또는 치료학적 화합물과 같은 다른 혼합물과 함께 사용될 수 있다.
상기 조성물은 예를 들어, 전신 또는 경구 투여의 경로에 적합하게 될 것이다. 전신 투여의 바람직한 형태는 주입, 전형적으로, 정맥내 주입을 포함한다. 다른 주입 경로, 예를 들어, 피하내, 근내 또는 복강내 경로가 사용될 수 있다. 전신 투여에 대한 대안적인 방법은, 담즙 염 또는 푸시드산(fusidic acid) 또는 다른 세정제와 같은 침투를 이용하여, 점막통과 및 경피 투여를 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 다른 화합물이 장(enteric) 제형 또는 캡슐화 제형으로 제형화될 수 있다면, 경구 투여가 또한 가능하다. 이러한 화합물의 투여는 또한, 연고, 페이스트(paste), 겔, 용액, 분말 등의 형태로 국소적 및/또는 국부적으로 수행될 수 있다.
포유동물, 특히 사람에게 투여하는 경우, 활성 제제의 1일 투여수준은 0.01mg/kg 내지 10mg/kg, 전형적으로 약 1mg/kg인 것으로 예상된다. 질환에 따라 의사가 개인에 가장 적합한 실제 용량을 결정할 것이며, 이는 특정 개인의 나이, 체중 및 반응에 따라 변한다. 상기 용량은 평균 용량의 예이다. 물론, 개인에 따라 더 높거나 낮은 양이 적합할 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
요구되는 용량 범위는 선택된 펩티드, 투여 경로, 제형의 특성, 환자의 질환의 특성 및 주치의의 판단에 따른다. 그러나, 적합한 용량은 환자의 1kg 당 0.1 내지 100μg이다.
백신 조성물은 편리하게는 주입가능한 형태를 갖는다. 통상적인 보조제는 면역 반응을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 백신화에 적합한 단위 용량은 항원 1kg 당 0.5 내지 5μg이며, 이러한 용량은 바람직하게는 1 내지 3주의 간견을 두고 1 내지 3회 투여된다. 지적된 용량 범위에서, 적합한 개체로의 투여를 불가능하게 하는 불리한 독성 효과는 본 발명의 화합물에 대해 관찰되지 않았다.
그러나, 요구된 용량에서의 광범위한 변화는 다양한 화합물의 사용 가능성 및 투여의 다양한 경로에 따른 상이한 효능이 예상된다. 예를 들어, 경구 투여는 정맥내 주입에 의한 투여보다 많은 용량을 필요하는 것으로 예상된다. 이러한 용량 수준내에서의 변화는 당해분야에 널리 공지된 바와 같이, 최적화를 위한 표준 실험 절차를 이용하여 조정될 수 있다.
서열 데이타베이스, 유형성 배지(Tangible Medium)에서의 서열 및 알고리듬
폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 귀중한 정보원을 형성하여 이들의 2차원 및 3차원 구조를 결정할 뿐만 아니라 유사한 상동성의 또 다른 서열을 확인한다. 이러한 접근 방법은 컴퓨터 판독 매체로 서열을 저장한 후 공지된 거대분자 구조 프로그램에서 저장된 데이타를 사용함으로써 매우 용이하게 이행되거나 GCG 프로그램 패키지와 같은 널리 공지된 서치 도구를 이용하여 서열 데이타베이스를 서치하는 것이다.
또한, 본 발명은 특징 서열 또는 가닥, 특히 유전자 서열 또는 코딩된 단백질 서열을 분석하는 방법을 제공한다. 바람직한 서열 분석 방법은 예를 들어, 동일성과 유사성 분석과 같은 서열 상동성 분석, DNA, RNA 및 단백질 구조 분석, 서열 어셈블리, 분기학분석, 서열 모티브 분석, 오픈 리딩 프레임 결정, 핵산 염기 콜링, 코돈 사용 분석, 핵산 염기 트리밍 및 시퀀싱 크로마토그램 피크 분석 방법이 포함된다.
컴퓨터 방식 방법이 상동성 확인을 위해 제공된다. 이 방법은 컴퓨터 판독가능한 매질 중에 폴리누클레오티드의 서열을 포함하는 제 1 폴리누클레오티드 서열을 제공하는 단계 및 제 1 폴리누클레오티드 서열을 하나 이상의 제 2 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 상동성을 확인하는 단계를 포함한다.
컴퓨터 방식 방법이 또한 상동성 확인을 위해 제공되며, 이 방법은 컴퓨터 판독가능한 매질 중에 폴리펩티드의 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 서열을 제공하는 단계 및 제 1 폴리펩티드 서열을 하나 이상의 제 2 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 상동성을 확인하는 단계를 포함한다.
특허 및 특허 출원을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌, 본원에 인용되는 모든 문헌 및 참조문헌은 각각의 문헌 또는 참조문헌이 구체적으로 및 개별적으로 완전히 언급되는 참고문헌으로 인용되는 것으로 지시되는 바와 같이 참고문헌으로 인용된다.
정의
당해 공지된 바와 같이, "동일성"은 해당 경우가 서열을 비교함으로써 결정되는 경우일 수 있으므로 두개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 두개 이상의 폴리누클레오티드 서열 간의 관계이다. 당 분야에서, "동일성"은 또한 해당 경우가 서열의 가닥 사이의 매치에 의해 결정되는 경우일 수 있으므로, 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 서열 사이의 서열 관련 정도를 의미한다. "동일성"은 문헌(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis if Sequence Date, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux. J., eds., M Stokton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988))에 기술된 방법을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아닌 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하는 방법은 시험되는 서열간에 최대 매치를 제공하도록 구성된다. 또한, 동일성을 결정하는 방법은 대중적으로 이용할 수 있는 컴퓨터 프로그램으로 복사된다. 두 서열간의 동일성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법에는 GCG 프로그램 패키지에서의 GAP 프로그램(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387(1984)), BLASTP, BLASTN(Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215:403-410(1990), 및 FASTA(Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448(1988))이 포함되나 이로 제한되는 것은 아니다. BLAST 류의 프로그램은 공개적으로 NCBI 및 그 밖의 출처(BLAST Manual. Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990))로부터 공개적으로 입수할 수 있다. 널리 공지된 스미스 워터맨(Smith Waterman) 알고리듬 또한 동일성을 측정하는데 사용될 수 있다.
폴리펩티드 서열 비교를 위한 파라미터는 하기를 포함한다:
알고리듬: 니들맨 앤 운쉬(Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453(1970))
비교 매트릭스: 헤니코프 앤 헤니코프(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919(1992))로부터의 BLOSSUM62
갭 패널티(Gap Penalty): 8
갭 길이 패널티(Gap Length Penalty): 2
이러한 파라미터를 갖는 유용한 프로그램은 지네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, Madison WI)으로부터의 "갭" 프로그램으로서 공개적으로 입수할 수 있다. 상기 언급된 파라미터는 펩티드 비교에 대한 결함 파라미터(말단 갭에 대해 부재 패널티와 함께)이다.
폴리누클레오티드 비교를 위한 파라미터는 하기를 포함한다:
알고리듬: 니들맨 앤 운쉬(Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453(1970))
비교 매트릭스: 매치 = +10, 미스매치 = 0
갭 패널티: 50
갭 길이 패널티: 3
지네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, Madison WI)으로부터의 "갭" 프로그램으로서 입수가능. 이들 파라미터는 핵산 비교를 위한 결함 파라미터이다.
경우에 따라서, 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "동일성"의 바람직한 의미가 하기 (1) 및 (2)에 제시된다:
(1) 폴리누클레오티드 구체예는 추가로 SEQ ID NO: 1의 기준 서열에 대해, 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 또는 100% 동일성을 갖는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함하며, 폴리누클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1의 기준 서열과 동일하거나, 기준 서열과 비교하여 특정 정수 이하의 누클레오티드 변형을 포함할 수 있으며, 이러한 변형은 하나 이상의 누클레오티드 결실, 치환(전이 및 트랜스버젼(transversion) 포함), 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이러한 변형은 기준 누클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치, 또는 개별적으로 기준 서열의 누클레오티드 사이 또는 기준 서열내 하나 이상의 연속 기에 사내된 상기 말단 위치 사이 어느 곳에서나 발생할 수 있으며, 누클레오티드 변형의 개수는 SEQ ID NO: 1에서의 누클레오티드의 총수를 100%으로 나눈 동일성 비율을 나타내는 정수로 곱하고, 이것을 SEQ ID NO: 1의 누클레오티드 총수로부터 빼냄으로써 결정하거나, 하기 식으로 계산할 수 있다:
nn≤ xn- (xn·y)
상기 식에서,
nn은 누클레오티드 변형의 수이고,
xn은 SEQ ID NO: 1 에서의 누클레오티드의 총수이고,
y는 50% 대해 0.50, 60% 대해 0.60, 70% 대해 0.70, 80% 대해 0.80, 85% 대해 0.85, 90% 대해 0.90, 95% 대해 0.95, 97% 대해 0.97 또는 100% 대해 1.00이고,
·는 곱셉 연산기호이고,
xn과 y의 어떠한 정수가 아닌 적(積)은 xn으로부터 그것을 빼내기 전에 가장 가까운 정수로 어림된다. SEQ ID NO: 2의 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드 서열의 변형은 이러한 코딩 서열에서 논센스(nonsense), 미스센스(missense) 또는 프레임시프트(frameshift) 변이를 일으켜, 이러한 변형 후에 폴리누클레오티드에 의해 변형된 폴리펩티드를 변형시킬 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 폴리누클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1의 기준 서열과 동일할 수 있다. 즉, 100% 동일하거나 동일성 비율이 100% 동일성 미만인 기준 서열과 비교하여 특정 정수 이하의 핵산 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 하나 이상의 핵산 결실, 치환(전이 및 트랜스버젼 포함), 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이러한 변형은 기준 폴리누클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치, 또는 개별적으로 기준 서열의 핵산 사이 또는 기준 서열내 하나 이상의 연속 기에 산재된 상기 말단 위치 사이 어느 곳에서나 발생할 수 있다. 핵산 변형의 수는 SEQ ID NO: 1에서의 핵산의 총수를 100%으로 나눈 동일성 비율을 나타내는 정수로 곱하고, 이것을 SEQ ID NO: 1의 핵산의 총수로부터 빼냄으로써 결정하거나, 하기 식으로 계산할 수 있다:
nn≤ xn- (xn·y)
상기 식에서,
nn은 핵산 변형의 수이고,
xn은 SEQ ID NO: 1 에서의 핵산의 총수이고,
y는 70% 대해 0.70, 80% 대해 0.80, 85% 대해 0.85 등이고,
·는 곱셉 연산기호이고,
xn과 y의 어떠한 정수가 아닌 적은 xn으로부터 그것을 빼내기 전에 가장 가까운 정수로 어림된다.
(2) 폴리펩티드 구체예는 추가로 SEQ ID NO: 2의 기준 서열에 대해, 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하며, 폴리누클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2의 기준 서열과 동일하거나, 기준 서열과 비교하여 특정 정수 이하의 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 이러한 변형은 하나 이상의 아미노산 결실, 치환(보전적 및 비보전적 치환 포함), 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이러한 변형은 기준 누클레오티드 서열의 아미노- 또는 카르복시 말단 위치, 또는 개별적으로 기준 서열의 아미노산 사이 또는 기준 서열내 하나 이상의 연속 기에 산재된 상기 말단 위치 사이 어느 곳에서나 발생할 수 있으며, 아미노산 변형 수는 SEQ ID NO: 2에서의 아미노산의 총수를 100%으로 나눈 동일성 비율을 나타내는 정수로 곱하고, 이것을 SEQ ID NO: 2의 아미노산 총수로부터 빼냄으로써 결정하거나, 하기 식으로 계산할 수 있다:
na≤ xa- (xa·y)
상기 식에서,
na는 아미노산 변형의 수이고,
xa은 SEQ ID NO: 2에서의 아미노산의 총수이고,
y는 50% 대해 0.50, 60% 대해 0.60, 70% 대해 0.70, 80% 대해 0.80, 85% 대해 0.85, 90% 대해 0.90, 95% 대해 0.95, 97% 대해 0.97 또는 100% 대해 1.00이고,
·는 곱셉 연산기호이고,
xa과 y의 어떠한 정수가 아닌 적은 xa으로부터 그것을 빼내기 전에 가장 가까운 정수로 어림된다.
예를 들어, 본 발명의 폴리누클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2의 기준 서열과 동일할 수 있다. 즉, 100% 동일하거나 동일성 비율이 100% 동일성 미만인 기준 서열과 비교하여 특정 정수 이하의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 하나 이상의 아미노산 결실, 치환(보전적 및 비보전적 치환 포함), 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이러한 변형은 기준 폴리누클레오티드 서열의 아미노산- 또는 카르복시 말단 위치, 또는 개별적으로 기준 서열의 아미노산 사이 또는 기준 서열내 하나 이상의 연속 기에 산재된 상기 말단 위치 사이 어느 곳에서나 발생할 수 있다. 아미노산 변형의 수는 SEQ ID NO: 2에서의 아미노산의 총수를 100%으로 나눈 동일성 비율을 나타내는 정수로 곱하고, 이것을 SEQ ID NO: 2의 아미노산의 총수로부터 빼냄으로써 결정하거나, 하기 식으로 계산할 수 있다:
na≤ xa- (xa·y)
상기 식에서,
na은 아미노산 변형의 수이고,
xa은 SEQ ID NO: 2에서의 아미노산의 총수이고,
y는 70% 대해 0.70, 80% 대해 0.80, 85% 대해 0.85 등이고,
·는 곱셉 연산기호이고,
xa과 y의 어떠한 정수가 아닌 적은 xa로부터 그것을 빼내기 전에 가장 가까운 정수로 어림된다.
생물체와 관련하여 본원에서 사용된 "개체들"는 후생 동물, 포유 동물, 양과, 소과, 원숭이과, 영장류 및 사람을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 다세포 진핵세포를 의미한다.
"단리된"은 원래 상태로부터 "사람의 손에 의해" 변형된 것을 의미한다. 즉, 천연 발생인 경우에, 원래 환경으로부터 변화되거나 제거되거나, 또는 이둘 모두를 의미한다. 예를 들어, 살아있는 생물체에 원래 존재하는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 원래 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 이러한 용어가 본원에 사용되는 경우에는 "단리된" 것이다. 또한, 변형, 유전자 조작 또는 그 밖의 재조합 방법에 의해 생물체에 도입된 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 생물체가 살아있거나 죽었거나 생물체에 여전히 존재하는 경우에는 "단리된" 것이다.
"폴리누클레오티드(들)"은 일반적으로 단일 및 이중 가닥 영역을 포함하는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 폴리리보누클레오티드 또는 폴리데옥시리보누클레오티드를 의미한다.
"변이체"는 기준 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드와는 상이하나 본질적 특성을 보유한 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 폴리누클레오티드의 대표적인 변이체는 또 다른 기준 폴리누클레오티드와 누클레오티드 서열에서 상이하다. 변이체의 누클레오티드 서열에서의 변화는 기준 폴리누클레오티드에 의해 코드화된 폴리펩티드 서열의 아미노산을 변형시키거나 변형시키지 않을 수 있다. 누클레오티드 변화는 하기 논의되는 바와 같이, 기준 서열에 의해 코드화된 폴리펩티드에서의 아미노산 치환, 첨가, 결실, 융합 및 양말단 잘림을 초래할 수 있다. 대표적인 폴리펩티드의 변이체는 또 다른 기준 폴리펩티드와 아미노산 서열에서 상이하다. 일반적으로, 차이점은, 기준 폴리펩티드와 변이체의 서열이 전반적으로 매우 유사하고, 많은 영역에서 동일하도록 제한된다. 변이체 및 기준 폴리펩티드는 하나 이상의 치환, 첨가, 결실의 조합에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 코드화된 것이거나 아닐 수 있다. 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 변이체는 대립형질 변이체와 같은 천연 발생적일 수 있으며, 또는 천연 발생인 것으로 공지되지 않은 변이체일 수도 있다. 천연 발생이 아닌 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 변이체는 변이생성 기법 또는 직접 합성법에 의해 이루어질 수 있다.
"질병"은 예를 들어, 상부 호흡관 감염, 침입성 세균성 질병(균혈증 및 뇌막염과 같은)을 포함하는 세균에 의한 질병 또는 이러한 세균에 의한 감염과 관련된 질병을 의미한다.
하기 실시예는, 달리 상세하게 설명되는 경우를 제외하고는, 당업자에게 널리 공지되고 일상적인 표준 기법을 사용하여 수행하였다. 이들 실시예는 예시적일 뿐이며, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1: 2개의 나이세리아 메닌지티디스 스트레인으로부터의 BASB030 유전자의 발견 및 확인용 DNA 서열화
A. 나이세리아 메닌지티디스 혈청형 B 스트레인 ATCC13090 중의 BASB030
먼저 나이세리아 메닌지티디스 스트레인 ATCC 13090의 미완성 게놈 DNA 서열을 함유하는 SEQ ID NO:1의 BASB030 유전자를 인사이트 패쏘세크(Incyte PathoSeq) 데이터베이스에서 발견하였다. SEQ ID NO:2에 도시된 BASB030 폴리누클레오티드의 번역은 나이세리아 고노로애 PilQ 외막 단백질에 대해 현저한 유사성(81% 동일성, 758개 아미노산 중첩)을 나타내었다. BASB030 유전자의 서열은 실험적으로 더 확인되었다. 이를 위해, 게놈 DNA를 QIAGEN 게놈 DNA 추출 키트(Qiagen Gmbh)를 사용하여 나이세리아 메닌지티디스 세포(스트레인 ATCC 13090)의 1010개 세포로부터 추출하고, 이러한 물질의 1㎍을 내부 NheI 부위(밑줄그어짐)가 함유된 프라이머 PilQ1 (5'-GGG G GCTAGC AA TAC CAA ACT GAC AAA AAT CAT TTC C-3')[SEQ ID NO:7] 및 내부 HindIII 부위(밑줄그어짐)가 함유된 PilQ2 (5'-GGG G AAGCTT AT AGC GCA GGC TGT TGC CGG C-3')[SEQ ID NO: 8]를 사용하여 중합효소 사슬 반응 DNA 증폭시켰다. 이러한 PCR 생성물을 겔 정제시키고, 빅 다이 사이클 시퀀싱 키트(Big Dye Cycle Sequencing kit)(Perkin-Elmer) 및 ABI 373A/PRISM DNA 시퀀서를 사용하여 DNA 서열화시켰다. DNA 서열화를 중복도가 2인 두 가닥에 대해 수행하고, 온길이 서열을 DNASTAR 레이저진(Lasergene) 소프트웨어 패키지로부터의 SeqMan 프로그램을 사용하여 어셈블링시켰다. 생성된 DNA 서열 및 추론된 폴리펩티드는 각각 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4로서 나타난다.
B: 나이세리아 메닌지티디스 혈청형 B 스트레인 H44/76 중의 BASB030
BASB030 유전자의 서열을 또 다른 나이세리아 메닌지티디스 혈청형 B 스트레인, 즉, 스트레인 H44/76에서 또한 결정하였다. 이를 위해, 게놈 DNA를 실시예 1에 제시된 실험 조건을 사용하여 나이세리아 메닌지티디스 스트레인 H44/76로부터 추출하였다. 그 후, 이러한 물질(1㎍)을 BASB030 유전자에 대해 특이적인 프라이머 PilQ1 및 PilQ2를 사용하여 중합효소 사슬 반응 DNA 증폭시켰다. 약 2300bp DNA 단편을 수득하여, NhI/HindIII 제한 엔도누클레아제에 의해 분해시키고, 표준 분자 생물학 기법(Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Eds: Sambrook, Fritisch ＆ Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989)을 사용하여 pET-24b 클로닝/발현 벡터(Novagen)의 상응하는 부위내로 삽입시켰다. 그 후, 재조합 pET-24b/BASB030을 빅 다이스 키트(Applied biosystems)를 사용하여 DNA 서열화시키고, 공급자에 의해 기술된 조건을 사용하여 ABI 373/A DNA 시퀀서로 분석하였다. 결과적으로, 각각 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6로서 표시되는 폴리누클레오티드 및 추론된 폴리펩티드 서열이 수득되었다. DNASTAR 패키지로부터의 MegAlign 프로그램을 사용하여, SEQ ID NO: 1, 3 및 5의 폴리누클레오티드 서열의 정렬을 수행하여, 도 1에 나타내었다; 동일성의 짝 비교(pairwise comparison)를 표 1에 요약해 놓았고, 이는 3개의 BASB030 폴리누클레오티드 유전자 서열이 모두 98.0%를 넘는 동일성 수준으로 유사함을 나타낸다. 동일한 MegAlign 프로그램을 사용하여, SEQ ID NO: 2, 4 및 6의 폴리펩티드 서열의 정렬을 수행하여, 도 2에 나타내었다; 동일성의 짝 비교를 표 2에 요약해 놓았고, 이는 3개의 BASB030 단백질 서열이 모두 95.0%를 넘는 동일성 수준으로 유사함을 나타낸다.
종합해 보면, 이들 데이터는 2개의 메닌지티디스 혈청형 B 스트레인 중에서의 BASB030 유전자의 강력한 서열 보존을 나타낸다.
표 1: BASB030 폴리누클레오티드 서열의 짝 동일성 (%)
Seq ID No: 3 Seq ID No: 5
Seq ID No: 1 99.9 98.9
Seq ID No: 3 99.0
표 2: BASB030 폴리펩티드 서열의 짝 동일성 (%)
Seq ID No: 4 Seq ID No: 6
Seq ID No: 2 97.4 96.9
Seq ID No: 4 99.3
실시예 2: 대장균에서의 재조합 BASB030 단백질의 발현 및 정제
pET-24b/BASB030 클로닝/발현 벡터의 구성은 실시예 1B에 기술되어 있다. 이러한 벡터는 강력한 박테리오파지 T7 유전자 10 프로모터의 조절을 받는, 6개의 히스티딘 잔기의 스트레치와 융합된 스트레인 H44/76로부터 단리된 BASB030 유전자를 함유한다. 발현 실험을 위해, 이러한 벡터를 대장균 스트레인 노바블루(Novablue)(DE3)(Novagen) 내로 도입시켰는데, 여기서, T7 중합효소에 대한 유전자는 이소프로필-베타-D 티오갈락토시드(IPTG)-조절성 lac 프로모터의 조절을 받는다. 노바블루(DE3)[pET-24b/BASB030] 대장균 재조합 스트레인의 액체 배양물(100㎖)를, 600nm(OD600)에서의 광학 밀도가 0.6에 도달할 때까지 37℃에서 교반하에 성장시켰다. 이 시점에서, IPTG를 1mM의 최종 농도로 첨가시키고, 배양물을 4시간 더 성장시켰다. 그 후, 배양물을 10,000 rpm으로 원심분리시키고, 펠레트를 -20℃에서 10분 이상 동안 동결시켰다. 해동시킨 후, 펠레트를 완충액 A(6M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris, pH 8.0) 중에서 25℃에서 30분간 재현탁시키고, 니들(needle)을 3회 통과시키고, 원심분리(20000rpm, 15분)에 의해 정화시켰다. 그 후, 샘플을 Ni2+로딩된 히트랩(Hitrap) 칼럼(Pharmacia Biotech) 상에 1㎖/분의 유량으로 로딩시켰다. 플로우쓰루(flowthrough)를 통과한 후, 칼럼을 40㎖의 완충액 B(8M 우레아, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris, pH 8.0), 40㎖의 완충액 C(8M 우레아, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris, pH 6.3)으로 계속 세척시켰다. 그 후, 재조합 단백질 BASB030/His6을 500mM 이미다졸이 함유된 30㎖의 완충액 D(8M 우레아, 0.1M NaH2PO4, 0.01M Tris, pH 6.3)를 사용하여 칼럼으로부터 용리시키고, 3㎖ 크기의 단편을 수집하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 85kDa(추정된 상대적 분자량)에서 이동하는, 고도로 농축된(순도는 쿠마시에 염색에서 90%를 넘게 순수한 것으로 추정된다) BASB030/His6 단백질이 칼럼으로부터 용리되었다. 이러한 폴리펩티드는 5-히스티딘 모티프에 대해 유도된 마우스 모노클로날 항체에 대해 반응성이었다 (참조: 도 3, 레인 2). 더욱이, 변성된 재조합 PilQ-His6 단백질은 우레아가 없는 용액 중에서 용해될 수 있다. 이를 위해, 8M 우레아에 함유된 변성된 PilQ-His6이 연속적으로 6M, 4M, 2M의 우레아 및 우레아가 함유되지 않은 완충액 R(NaCl 150mM, 10mM NaH2PO4, 아르기닌 0.5M pH 6.8)에 대해 광범위하게 희석되었다 (2시간). PilQ의 상응하는 제조물은 동결 및 해동 후에도 가용성인 상태로 남아있는다. 종합해 보면, 이들 데이터는 BASB030 유전자가 대장균에서 가용성 또는 불용성 재조합 형태(BASB030/His6)로 발현되고 정제될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: BASB030 폴리펩티드에 의한 마우스의 면역 및 Elisa에 의한 재조합 BASB030 폴리펩티드에 대한 항체 반응의 인식
부분적으로 정제된 천연 BASB030을 0, 14 및 28일째에 BALB/C 마우스에 3회 주입시켰다 (5마리/군). 이러한 천연 BASB030 폴리펩티드를 나이세리아 메닌지티디스 B 스트레인(제이 토마센(J Tommassen)으로부터 입수하였음)으로부터 직접 유도시켰다. 동물을 SBAS2(용량 당 5㎍ MPL 및 5㎍ QS21이 함유된 SB62 에멀션)에 제형화된 BASB030 폴리펩티드 또는 AlPO4(5㎍ MPL과 함께) 상으로 흡착된 후의 BASB030 폴리펩티드 5㎍(1차 주입) 및 2㎍(2차 및 3차 주입)으로 피하 루트에 의해 주입시켰다. SBAS2 제형만으로 면역된(BASB030 폴리펩티드 없이) 마우스로 구성된 네거티브 대조군을 실험에 또한 포함시켰다. 마우스를 28일째(포스트(Post) II 후 14일째) 및 35일째(포스트 III 후 7일째)에 채혈하여, 특이적인 안티-BASB030 항체를 검출하였다. 특이적인 안티-BASB030 항체를 코팅된 단백질로서의 부분적으로 정제된 재조합 BASB030 폴리펩티드 마이크로플레이트 상에서 사용하여 Elisa에 의해 측정하였다. 분석을 포스트 II(28일째)에서만 풀링된 혈청(5마리의 마우스로부터의)에 대해 수행하였다.
ELISA에 의한, 재조합 단백질에 대한 BASB030 에피토프의 인식
간단하게는, 마이크로타이터(microtiter) 플레이트(Maxisorp, Nunc)를 37℃에서 2시간 동안 PBS 중에서 약 0.5㎍/㎖로 재조합 BASB030 용액 100㎕로 코팅시켰다. 그 후, 플레이트를 150mM NaCl - 0.05% Tween 20 300㎕로 3회 세척시켰다. 그 후, 이들을 PBS-0.3% 카제인 100㎕로 과다 코팅시키고, 실온에서 30분간 인큐베이션시키면서 진탕시켰다. 플레이트를 동일한 과정을 사용하여 재세척한 후, 항체와 인큐베이션시켰다. 동물 혈청을 PBS-0.3% 카제인 0.05% Tween 20 중에서 연속적으로 2배 희석시키고, 마이크로플레이트 내로 넣은 후(1/100 희석에서 출발하여 12개의 희석물), 실온에서 30분간 인큐베이션시키면서 진탕시킨 후, 다음의 동일한 세척 단계를 수행하였다. 비오틴에 컨쥬게이팅된 안티-마우스 Ig(토끼(Dakopatts E0413)로부터의)를 PBS-0.3% 카제인 - 0.05% Tween 20 중의 1/2000으로 사용하여 마우스 안티-BASB030 항체를 검출하였다. 최종 세척 단계(상기와 같은) 후, 플레이트를 진탕 조건하에서 실온에서 30분간 동일한 솔밴트(solvant) 용액 중의 1/4000으로 희석된 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 복합체 용액과 인큐베이션시켰다.
하기 예시된 결과는 BASB030 폴리펩티드가 SBAS2 에멀션 중에서 및 AlPO4/MPL 상으로의 흡착 후에, 둘 모두의 경우, BALB/C 마우스에 매우 면역원성임을 나타낸다 (도 4). 천연 단백질만의 2회 주입 후에 유도된 이들 항체는 재조합 BASB030 폴리펩티드를 인식할 수 있다. 또한, 도면은 SBAS2 에멀션이 AlPO4/MPL 제형 보다 약간 더 면역원성임을 나타낸다. 또한, 정제된 재조합 BASB030 폴리펩티드는 이것의 면역원성의 평가를 위해 BALB/C 마우스에 주입되었다.
전체 세포 ELISA에 의한, 세포에 대한 BASB030 천연 에피토프의 인식
동물 혈청에서 특이적인 안티-BASB030 항체를 검출하기 위해 상동 H44/76 MenB 스트레인 (B:15:P1.7, 16)을 코팅된 세균으로서 사용하였다. 간단하게는, 마이크로타이터 플레이트(Maxisorp, Nunc)를 6시간 배양물로부터의 H44/76 세균 용액을 사용하여 1/10 희석물 100㎕ (PBS 중의)로 코팅시켰는데, 여기서, 세균은 400㎍/㎖의 테트라사이클린에 의해 치사되었다. 플레이트가 완전히 건조될 때까지, 플레이트를 37℃에서 16시간 이상 인큐베이션시켰다. 그 후, 이들을 150mM NaCl - 0.05% Tween 20 300㎕로 3회 세척시켰다. 그 후, 플레이트를 PBS-0.3% 카제인 100㎕로 과다 코팅시키고, 실온에서 30분간 인큐베이션시키면서 진탕시켰다. 플레이트를 동일한 과정을 사용하여 재세척시킨 후, 항체와 인큐베이션시켰다. 동물 혈청을 PBS-0.3% 카제인 0.05% Tween 20 중에서 연속적으로 2배 희석시키고, 마이크로플레이트 내로 넣은 후(1/100 희석에서 출발하여 12개의 희석물), 실온에서 30분간 인큐베이션시키면서 진탕시킨 후, 다음의 동일한 세척 단계를 수행하였다. 비오틴에 컨쥬게이팅된 안티-마우스 Ig(토끼(Dakopatts E0413)로부터의)를 PBS-0.3% 카제인 - 0.05% Tween 20 중의 1/2000으로 사용하여 마우스 안티-BASB030 항체를 검출하였다. 최종 세척 단계(상기와 같은) 후, 플레이트를 진탕 조건하에서 실온에서 30분간 동일한 솔밴트(solvant) 용액 중의 1/4000으로 희석된 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 복합체 용액과 인큐베이션시켰다.
하기 도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 SBAS2 에멀션으로 제형화된 정제된 분자로 면역된 마우스 중의 상동 H44/76 스트레인 뿐만 아니라 AlPO4/MPL 보조제에 대해 특이적인 BASB030 항원 인식이 존재하는 것으로 결론지을 수 있다 (5마리 마우스/군의 풀이 수행되었다). 항체 반응은 재조합 BASB030 단백질에 대해 관찰된 바와 같이 SBAS2 제형의 경우에 더 높았다. 보조제 SBAS2만이 주입된 마우스는 선명한 포지티브 반응을 나타내지 못했다.
실시예 4: 사람 회복기 환자로부터의 혈청 중의 안티-BASB030 항체의 존재
이 시험의 경우, 사람 회복기 혈청을 정제된 재조합 BASB030 단백질 뿐만 아니라 천연 BASB030 단백질(제이 토마센(Netherlands)로부터 입수하였음)을 사용하여 특정 항체의 존재에 대해 웨스턴-블롯팅에 의해 시험하였다.
간단하게는, 정제된 BASB030 단백질(재조합 또는 천연) 5㎍을 전기영동적 이동을 위해 SDS-PAGE 구배 겔(4-20%, Novex, code noEC60252) 내로 넣었다. 단백질을 바이오-라드(Bio-rad) 트랜스-블롯 시스템(code no170-3930)을 사용하여 100볼트에서 1시간 동안 니트로셀룰로오스 시트(0.45㎛, Bio-rad code no162-0114)로 옮겼다. 그 후, 필터를 실온에서 밤새 PBS - 0.05% Tween 20으로 블록킹시킨 후, 사람 혈청과 인큐베이션시켰다. 이들 혈청을 PBS - 0.05% Tween 20 중에서 10배 희석시키고, 미니-블롯터(mini-blotter) 시스템(Miniprotean, Bio-rad code no170-4017)을 사용하여 실온에서 2시간 동안 니트로셀룰로오스 시트 상에서 인큐베이션시키면서 진탕시켰다. PBS-0.05% Tween 20 중에서의 5분간의 3회의 반복 세척 단계 후, 니트로셀룰로오스 시트를 동일한 세척 완충액 중에서 1/1000으로 희석된 적합한 컨쥬게이트(양으로부터의 비오티닐화된 안티-사람 Ig 항체(Armersham code noRPN1003) 또는 토끼로부터의 비오티닐화된 안티-마우스 Ig 항체(Armersham code noRPN1001))와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키면서 약하게 진탕시켰다. 막을 전술한 바와 같이 3회 세척하고, 세척 완충액 중에서 1/1000으로 희석된 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 복합체(Armersham code noRPN1051)를 사용하여 30분간 인큐베이션시키면서 교반시켰다. 최종 3회의 반복 세척 후, 30mg의 4-클로로-1-나프톨(Sigma), 10㎖의 메탄올, 40㎖의 PBS 및 30㎕의 H2O2가 함유된 50㎖ 용액 중에서 10 내지 15분의 인큐베이션 시간 동안에 뜻밖의 일이 나타났다. 막을 증류수로 수 회 세척하는 동안에는 착색이 멈추었다.
도 6 및 7에 도시된 결과(파트 A)는 7개의 회복기 혈청 중의 5개 내지 7개는 상이한 분자량에서 천연 BASB030 단백질(도 6) 또는 약 90kDa에서 재조합 BASB030 단백질(도 7)을 인식한다는 것을 나타낸다. 재조합 BASB030 폴리펩티드에 대해 약하게 반응하는 2개의 회복기 혈청은 no261469 및 no261979 (도 7)인 반면, 천연 BASB030 폴리펩티드의 경우, no262117 및 261979는 선명한 반응을 나타내지 않았다 (도 6). 최대 세기로 반응하는 폴리펩티드는 2개 단백질(재조합 및 천연)에서 동일하였다. 이들 반응은 백신 후보체로서의 이러한 폴리펩티드의 중요성을 반영할 수 있다. 천연 BASB030 단백질은 3개 이상의 다른 밴드를 나타내는 것으로 여겨지고, 이들 밴드는 아마도 BASB030 폴리펩티드로 인한 것이며, 최대 밴드는 둘 모두의 겔에서 동일하였다 (약 90kDa). 세균으로부터 직접 단리된 천연 BASB030 폴리펩티드는 분해 생성물을 나타내며, 약 45 및 35kDa의 밴드는 뚜렷히 볼 수 있다. 둘 모두의 웨스턴 블롯의 파트 B에는, 나이세리아 고노로애로부터의 동족체 단백질(J. Tommassen, The Netherland)에 대해 유도된 마우스 항체의 반응이 도시되어 있다. 결과는 둘 모두의 동족체 BASB030 단백질 사이에 선명한 교차반응이 있음을 명백히 나타내며; 재조합 BASB030 단백질의 경우, 2개의 선명한 밴드가 검출되는데, 하나는 사람 회복기 혈청에 의해 인식되는 90kDa의 주밴드이고, 나머지 하나는 약 70kDa에 위치한다 (도 7). 천연 BASB030 단백질의 경우, 마우스 항체는 회복기 혈청에 의해 나타나는 90 및 45kDa의 2개의 주밴드 뿐만 아니라 분해 생성물일 수 있는 밴드(약 75, 70, 55, 40, 35 및 25kDa, 도 6 참조)를 인식한다.
실시예 5: BASB030 백신의 효능: 안티-BASB030 항체의 활성
상동 나이세리아 메닌지티디스 스트레인에 대한 안티-BASB030 항체의 살균 활성
동물 혈청(풀(pool) 상태의)의 살균 활성을 단지 약간의 차이를 두고 전술한 바와 같이(1,2.) 시험하였다. 간단하게는, 나이세리아 메닌지티디스 혈청형 B(H44/76 스트레인)을 사용하여 동물 혈청의 살균 활성을 측정하였다. U자-바닥 96 웰 마이크로플레이트(NUNC)에서, 웰 당 50㎕의 연속 2배 혈청 희석물을 2.5x104CFU/㎖로 조정된 로그기 수막구균 현탁액 37.5㎕/웰과 인큐베이션시키고, 210rpm으로 진탕시키면서(Orbital shaker, Forma Scientific) 37℃에서 15분간 인큐베이션시켰다. 그 후, 새끼 토끼 보체(Pel-freeze Biologicals, US) 12.5㎕를 첨가시킨 후, 동일한 조건에서 1시간 더 인큐베이션시켰다. 그 후, 각각의 웰로부터의 혼합물의 10㎕ 분액을 1% 이소비탈렉스(Isovitalex)와 1%의 열비활성화된 말 혈청이 함유된 뮬러-힌톤(Mueller-Hinton) 아가 플레이트 상으로 스포팅시켰다. 다음날, 코로니를 시험된 각각의 희석물에 대해 계수하고, 살균 타이터를 혈청이 없는 보체 대조표준과 비교하여 50% 치사에 대한 혈청의 희석율로서 측정하였다. 이러한 방법에 의해, 개개의 콜로니는 스포트(spot) 당 100 CFU 이하로 계수될 수 있다. 타이터는 회귀 분석에 의해 계산하여 50% 치사를 유도시키는 희석율로서 표현된다. 표 3에 나타난 결과는 안티-BASB030 항체가, 포지티브 대조표준으로서 사용된 안티-PorA 모노클로날 항체에 의해 또한 관찰되는 바와 같이, H44/76 상동 스트레인에 대한 강력한 살균 효과를 가짐을 나타낸다. 1/2560 희석에서, 치사의 퍼센트는 여전히 매우 높았다 (91%).
참고문헌:
1. Hoogerhout P., Donders E.M.L.M., van Gaans-van den Brink J.A.M., Kuipers B., Brugghe H.F., van Unen L.M.A., Timmermans H.A.M., ten Hove G.J., de Jong AD.P.J.M., Peeters C.C.A.M., Wiertz E.J.H.J., and Poolman J.T.., Infection and immunity, Sept 1995, vol 63, no9, p 3473-3478.
2. Maslanka S.E., Gheesling L.L., Libutti D.E., Donaldson K.B.J., Harakeh H.S., Dykes J.K., Arhin F.F., Devi S.J.N., Frasch C.E., Huang J.C., Kriz-Kuzemenska P., Lemmon R.D., Lorange M., Peeters C.C.A.M., Quataert S., Tai J.Y., Carlone G.M., and The Multilaboratory Study Group." in Clin. Diagn. Lab. Immunol., 1997, 4:156-167.
표 3: 안티-BASB030 항체의 살균 효과
시험된 항체 시험된 희석율 수득된 치사율
안티-PorA 모노클로날 Ab (포지티브 대조표준) 1/10000 100
안티-BASB030 폴리클로날 항체 1/401/801/1601/3201/6401/12801/2560 96685668569691
네거티브 대조표준 1/40 0
실시예 6: 수동 방어 모델(젖먹이 래트)에서의 안티-BASB030 항체의 효능
면역된 마우스(5마리/군, 2 군)로부터 수득된 안티-BASB030 항체를 젖먹이 래트 방어 모델에서의 이들의 방어 효능에 대해 평가하였다. 어세이는 대항(challenge)시키기 24시간 전에 주입된 항체에 의한 나이세리아 메닌지티디스 B 스트레인의 소거 활성을 측정한다.
간단하게는, 마우스 혈청의 풀의 1/10 희석물 100㎕(특정한 안티-BASB030 항체를 함유함)를, 살아있는 세균으로 대항시키기 24시간 전에(-1일째) 7일된 젖먹이 래트(Sprague Dawley) 내로 복강내 루트(IP)에 의해 주입시켰다. 0일째에, -1일째에 마우스 혈청으로 무작위화되고 수동 면역된 젖먹이 래트에게, 미리 래트 계대시킨(2회) 하나 이상의 나이세리아 메닌지티디스 스트레인으로부터의 107개의 살아있는 세균(100㎕)로 동일한 IP 루트에 의해 대항시키기 30분 전에, IP 루트에 의해 100㎕ 중의 철 덱스트란 10㎎를 주입시켰다. 나이세리아 메닌지티디스 스트레인을 약 2시간 동안 액체 TSB 배지에서 성장시켰다. 그 후, 세균을 PBS 중에 희석시켜서, 1.108CFU/㎖ 현탁액을 수득하였다. 7일된 젖먹이 래트를 이러한 어세이에 사용하였다. 군들은 시험하려는 풀링된 혈청 100㎕의 IP 주입에 의한 면역 전에 한배새끼 사이에서 무작위적으로 혼합된 8마리의 래트로 구성되었다. 대항 후 3시간째에, 마취 후 심장 천공에 의해 수득한 20㎕의 혈액을 PBS 중에 희석시키고(1/10, 1/100, 1/1000 및 1/10000), 다수의 희석물을 콜로니 포밍 유닛(Colony Forming Unit)(CFU) 계수를 위해 뮬러 힌톤 배지 상에 플레이팅시켰다. 그 후(24시간 후), CFU의 개수를 평가하고, PBS로 미리 수동 면역시킨 젖먹이 래트의 혈액의 CFU/㎖의 개수와 비교하였다. 대조군은 PBS 주입된 래트로 구성되었다. 칭량된 평균이 각각의 동물에 대해 계산되었고, 각각의 군의 평균을 각각의 다른 평균과 비교하였다. 안티-BASB030 항체로 수득한 결과(도 8 참조)는 이들 특정 항체가 네거티브 대조군과 비교하는 경우에 나이세리아 메닌지티디스 스트레인 H44/76에 대한 소거 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. PBS만이 주입된 마우스에 존재하는 비특이적인 항체와 비교하여 1 log10이하의 안티-BASB030 항체에 대해 관찰된 차이가 존재한다. 본 발명의 안티-BASB030 항체로 관찰된 방어 효과는 잘 특징화된 안티-PorA 모노클로날 항체(H44/29, 안티-P1.16)로 수득된 효과와 균등하였다.
도 3에 대한 범례
실질적으로 순수한 (80% 이상) BASB030 단백질 분획이 단백질 분자량 마커에 대해 병렬적으로 SDS-PAGE 조건하에서 4 내지 20% 구배 폴리아크릴아미드겔(NOVEX) 상에서 수득되었다. 겔은 쿠마시에 블루 R250으로 염색되거나 안티-(His5) 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다.
기탁된 물질
나이세리아 메닌지티디스 세로그룹 B 균주를 함유하는 기탁물질을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, 이하 "ATCC")에 1997년 6월 22일자로 기탁하고, 기탁 번호 13090을 부여받았다. 기탁물질은 나이세리아 메닌지티디스(Albrecht and Ghon)으로서 기재되었으며, N. 메닌지티디스 단리물로부터 구성된 냉동건조된 1.5-2.9kb 인서트 라이브러리이다. 기탁물질은 문헌(Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 8:1-15(1958))에 기재되어 있다.
나이세리아 메닌지티디스 균주 기탁물질을 본원에서는 "기탁 균주" 또는 "기탁 균주의 DNA"로 언급하였다.
기탁된 균주는 전체 길이의 BASB030 유전자를 함유한다. 기탁된 균주에 함유된 폴리누클레오티드의 서열 뿐만 아니라 이로써 코드화된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본원의 서열 기재와 대립되는 경우에는 지배적이다.
기탁된 균주의 기탁은 특허 절차상의 취지에 부합하여 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 규약에 의하여 이루어졌다. 상기 균주는 변경불가능하며, 특허 공고시에 제한 또는 조건없이 대중에게 공개될 것이다. 기탁된 균주는 단지 당해 기술자들에게 편의상 제공되는 것이며, 35 U.S.C. §112하에 요구되는 바와 같이 기탁이 권리부여에 요구됨을 인정하는 것은 아니다.
SEQUENCE LISTING
＜110＞ SmithKline Beecham Biologicals S.A.
＜120＞ Novel Compounds
＜130＞ BM45323
＜160＞ 8
＜170＞ FastSEQ for Windows Version 3.0
＜210＞ 1
＜211＞ 2310
＜212＞ DNA
＜213＞ Neisseria meningitidis
＜400＞ 1
atgaatacca aactgacaaa aatcatttcc ggtctctttg tcgcaaccgc cgcctttcag 60
acagcatctg caggaaacat tacagacatc aaagtttcct ccctgcccaa caaacagaaa 120
atcgtcaaag tcagctttga caaagagatt gtcaacccga ccggcttcgt aacctcctca 180
ccggcccgca tcgccttgga ctttgaacaa accggcattt ccatggatca acaggtactc 240
gaatatgccg atcctctgtt gagcaaaatc agtgccgcac aaaacagcag ccgtgcgcgt 300
ctggttctga atctgaacaa accgggccaa tacaataccg aagtacgcgg gaacaaagtt 360
tggatattca ttaacgaatc ggacgatacc gtgtccgccc ccgcacgccc cgccgtaaaa 420
gccgcgcctg ccgcaccggc aaaacaacag ggctgccgca ccgtctacca agtccgcagt 480
atccgtatcc aaacccttta ccccggcaaa acaacagctg ccgcaccgtt taccgagtcc 540
gtagtatccg tatccgcacc gttcagcccg gcaaaacaac aggcggcggc atcagcaaaa 600
caacagacgg cagcaccagc aaaacaacag acggcagcac cagcaaaaca acaggcggca 660
gcaccagcaa aacaaaccaa tatcgatttc cgcaaagacg gcaaaaatgc cggcattatc 720
gaattggctg cattgggctt tgccgggcag cccgacatca gccaacagca cgaccacatc 780
atcgttacgc tgaaaaacca taccctgccg accacgctcc aacgcagttt ggatgtggca 840
gactttaaaa caccggttca aaaggttacg ctgaaacgcc tcaataacga cacccagctg 900
attatcacaa cagccggcaa ctgggaactc gtcaacaaat ccgccgcgcc cggatacttt 960
accttccaag tcctgccgaa aaaacaaaac ctcgagtcag gcggcgtgaa caatgcgccc 1020
aaaaccttca caggccggaa aatctccctt gacttccaag atgtcgaaat ccgcaccatc 1080
ctgcagattt tggcaaaaga atccgggatg aacattgttg ccagcgactc cgtcaacggc 1140
aaaatgaccc tctccctcaa agacgtacct tgggatcagg ctttggattt ggttatgcag 1200
gcacgcaacc tcgatatgcg ccaacaaggg aacatcgtca acatcgcgcc ccgcgacgag 1260
ctgcttgcca aagacaaagc cttcttacag gcggaaaaag acattgccga tctaggcgcg 1320
ctgtattcac aaaacttcca attgaaatac aaaaatgtgg aagaattccg cagcatcctg 1380
cgtttggaca atgccgacac aaccggaaac cgcaatacgc ttgtcagcgg caggggcagc 1440
gtgctgatcg atcccgccac caataccctg attgttaccg atacccgcag cgtcatcgaa 1500
aaattccgca aactgattga cgaattggac gtacccgcgc aacaagtgat gattgaggcg 1560
cgtatcgtcg aagcggcaga cggcttctcg cgcgatttgg gcgttaaatt cggcgcgaca 1620
ggcaagaaaa agctgaaaaa tgatacaagc gcattcggct ggggggtaaa ctccggcttc 1680
ggcggcgacg ataaatgggg ggccgaaacc aaaatcaacc tgccgattac cgctgccgca 1740
aacagcattt cgctggtgcg cgcgatttcc tccggtgcct tgaatttgga attgtccgca 1800
tccgaatcgc tttcaaaaac caaaacgctt gccaatccgc gcgtgctgac ccaaaaccgc 1860
aaagaggcca aaatcgaatc cggttacgaa attcctttca ccgtaacctc aatcgcgaac 1920
ggcggcagca gcacgaacac ggaactcaaa aaagccgtct tggggctgac cgttacgccg 1980
aacatcacgc ccgacggcca aatcattatg accgtcaaaa tcaacaagga ctcgcctgcg 2040
caatgtgcct ccggtaatca gacgatcctg tgtatttcga ccaaaaacct gaatacgcag 2100
gctatggttg aaaacggcgg cacattgatt gtcggcggta tttatgaaga agacaacggc 2160
aatacgctga ccaaagtccc cctgttgggc gacatccccg ttatcggcaa cctctttaaa 2220
acacgcggga aaaaaaccga ccgccgcgaa ctgctgattt tcattacccc gaggattatg 2280
ggtacggccg gcaacagcct gcgctattga 2310
＜210＞ 2
＜211＞ 769
＜212＞ PRT
＜213＞ Neisseria meningitidis
＜400＞ 2
Met Asn Thr Lys Leu Thr Lys Ile Ile Ser Gly Leu Phe Val Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Phe Gln Thr Ala Ser Ala Gly Asn Ile Thr Asp Ile Lys Val
20 25 30
Ser Ser Leu Pro Asn Lys Gln Lys Ile Val Lys Val Ser Phe Asp Lys
35 40 45
Glu Ile Val Asn Pro Thr Gly Phe Val Thr Ser Ser Pro Ala Arg Ile
50 55 60
Ala Leu Asp Phe Glu Gln Thr Gly Ile Ser Met Asp Gln Gln Val Leu
65 70 75 80
Glu Tyr Ala Asp Pro Leu Leu Ser Lys Ile Ser Ala Ala Gln Asn Ser
85 90 95
Ser Arg Ala Arg Leu Val Leu Asn Leu Asn Lys Pro Gly Gln Tyr Asn
100 105 110
Thr Glu Val Arg Gly Asn Lys Val Trp Ile Phe Ile Asn Glu Ser Asp
115 120 125
Asp Thr Val Ser Ala Pro Ala Arg Pro Ala Val Lys Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Lys Gln Gln Gly Cys Arg Thr Val Tyr Gln Val Arg Ser
145 150 155 160
Ile Arg Ile Gln Thr Leu Tyr Pro Gly Lys Thr Thr Ala Ala Ala Pro
165 170 175
Phe Thr Glu Ser Val Val Ser Val Ser Ala Pro Phe Ser Pro Ala Lys
180 185 190
Gln Gln Ala Ala Ala Ser Ala Lys Gln Gln Thr Ala Ala Pro Ala Lys
195 200 205
Gln Gln Thr Ala Ala Pro Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Pro Ala Lys
210 215 220
Gln Thr Asn Ile Asp Phe Arg Lys Asp Gly Lys Asn Ala Gly Ile Ile
225 230 235 240
Glu Leu Ala Ala Leu Gly Phe Ala Gly Gln Pro Asp Ile Ser Gln Gln
245 250 255
His Asp His Ile Ile Val Thr Leu Lys Asn His Thr Leu Pro Thr Thr
260 265 270
Leu Gln Arg Ser Leu Asp Val Ala Asp Phe Lys Thr Pro Val Gln Lys
275 280 285
Val Thr Leu Lys Arg Leu Asn Asn Asp Thr Gln Leu Ile Ile Thr Thr
290 295 300
Ala Gly Asn Trp Glu Leu Val Asn Lys Ser Ala Ala Pro Gly Tyr Phe
305 310 315 320
Thr Phe Gln Val Leu Pro Lys Lys Gln Asn Leu Glu Ser Gly Gly Val
325 330 335
Asn Asn Ala Pro Lys Thr Phe Thr Gly Arg Lys Ile Ser Leu Asp Phe
340 345 350
Gln Asp Val Glu Ile Arg Thr Ile Leu Gln Ile Leu Ala Lys Glu Ser
355 360 365
Gly Met Asn Ile Val Ala Ser Asp Ser Val Asn Gly Lys Met Thr Leu
370 375 380
Ser Leu Lys Asp Val Pro Trp Asp Gln Ala Leu Asp Leu Val Met Gln
385 390 395 400
Ala Arg Asn Leu Asp Met Arg Gln Gln Gly Asn Ile Val Asn Ile Ala
405 410 415
Pro Arg Asp Glu Leu Leu Ala Lys Asp Lys Ala Phe Leu Gln Ala Glu
420 425 430
Lys Asp Ile Ala Asp Leu Gly Ala Leu Tyr Ser Gln Asn Phe Gln Leu
435 440 445
Lys Tyr Lys Asn Val Glu Glu Phe Arg Ser Ile Leu Arg Leu Asp Asn
450 455 460
Ala Asp Thr Thr Gly Asn Arg Asn Thr Leu Val Ser Gly Arg Gly Ser
465 470 475 480
Val Leu Ile Asp Pro Ala Thr Asn Thr Leu Ile Val Thr Asp Thr Arg
485 490 495
Ser Val Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Ile Asp Glu Leu Asp Val Pro
500 505 510
Ala Gln Gln Val Met Ile Glu Ala Arg Ile Val Glu Ala Ala Asp Gly
515 520 525
Phe Ser Arg Asp Leu Gly Val Lys Phe Gly Ala Thr Gly Lys Lys Lys
530 535 540
Leu Lys Asn Asp Thr Ser Ala Phe Gly Trp Gly Val Asn Ser Gly Phe
545 550 555 560
Gly Gly Asp Asp Lys Trp Gly Ala Glu Thr Lys Ile Asn Leu Pro Ile
565 570 575
Thr Ala Ala Ala Asn Ser Ile Ser Leu Val Arg Ala Ile Ser Ser Gly
580 585 590
Ala Leu Asn Leu Glu Leu Ser Ala Ser Glu Ser Leu Ser Lys Thr Lys
595 600 605
Thr Leu Ala Asn Pro Arg Val Leu Thr Gln Asn Arg Lys Glu Ala Lys
610 615 620
Ile Glu Ser Gly Tyr Glu Ile Pro Phe Thr Val Thr Ser Ile Ala Asn
625 630 635 640
Gly Gly Ser Ser Thr Asn Thr Glu Leu Lys Lys Ala Val Leu Gly Leu
645 650 655
Thr Val Thr Pro Asn Ile Thr Pro Asp Gly Gln Ile Ile Met Thr Val
660 665 670
Lys Ile Asn Lys Asp Ser Pro Ala Gln Cys Ala Ser Gly Asn Gln Thr
675 680 685
Ile Leu Cys Ile Ser Thr Lys Asn Leu Asn Thr Gln Ala Met Val Glu
690 695 700
Asn Gly Gly Thr Leu Ile Val Gly Gly Ile Tyr Glu Glu Asp Asn Gly
705 710 715 720
Asn Thr Leu Thr Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro Val Ile Gly
725 730 735
Asn Leu Phe Lys Thr Arg Gly Lys Lys Thr Asp Arg Arg Glu Leu Leu
740 745 750
Ile Phe Ile Thr Pro Arg Ile Met Gly Thr Ala Gly Asn Ser Leu Arg
755 760 765
Tyr
＜210＞ 3
＜211＞ 2223
＜212＞ DNA
＜213＞ Neisseria meningitidis
＜400＞ 3
attncagaca tcaaagtttc ctccctgccc aacatacaga aaatcgtcaa agtcagcttt 60
gacaaagaga ttgtcaaccc ggccggcttc gtaacctcct caccggcccg catcgccttg 120
gactttgaac aanccggcat ttccatggat caacaggtac tcgaatatnc cgatcctctg 180
ttgagcaaaa tcagtgccgc acaaaacagc anccgtgcgc gtctggttct gaatctgaac 240
aaaccgggcc aatacaatac cgaagtacgc gggaacaaag tttggatatt cattaacgaa 300
tcggacgata ccgtgtccgc cgccgcacgc gccgccgtaa aagccgcgcc tgccgcaccg 360
gcaaaacaac aggctgccgc accgtctacc aagtccgcag tatccgtatc caaacccttt 420
accccggcaa aacaacaggc tgccgcaccg tttaccgagt ccgtagtatc cgtatccgca 480
ccgttcagcc cggcaaaaca acaggcggcg gcatcagcaa aacaacagac ggcagcacca 540
gcaaaacacc agcggcaagc acaagcaaaa caacaggcgg cagcaccagc aaaacaaacc 600
aatatcgatt tccgcaaaga cggcaaaaat gccggcatta tcgaattggc tgcattgggc 660
tttgccgggc agcccgacat cagccaacag cacgaccaca tcatcgttac gctgaaaaac 720
cataccctgc cgaccacgct ccaacgcagt ttggatgtgg cagactttaa aacaccggtt 780
caaaaggtta cgctgaaacg cctcaataac gacacccagc tgattatcac aacagccggc 840
aactgggaac tcgtcaacaa atccgccgcg cccggatact ttaccttcca agtcctgccg 900
aaaaaacaaa acctcgagtc aggcggcgtg aacaatgcgc ccaaaacctt cacaggccgg 960
aaaatctccc ttgacttcca agatgtcgaa atccgcacca tcctgcagat tttggcaaaa 1020
gaatccggga tgaacattgt tgccagcgac tccgtcaacg gcaaaatgac cctctccctc 1080
aaagacgtac cttgggatca ggctttggat ttggttatgc aggcacgcaa cctcgatatg 1140
cgccaacaag ggaacatcgt caacatcgcg ccccgcgacg agctgcttgc caaagacaaa 1200
gccttcttac aggcggaaaa agacattgcc gatctaggcg cgctgtattc acaaaacttc 1260
caattgaaat acaaaaatgt ggaagaattc cgcagcatcc tgcgtttgga caatgccgac 1320
acaaccggaa accgcaatac gcttgtcagc ggcaggggca gcgtgctgat cgatcccgcc 1380
accaataccc tgattgttac cgatacccgc agcgtcatcg aaaaattccg caaactgatt 1440
gacgaattgg acgtacccgc gcaacaagtg atgattgagg cgcgtatcgt cgaagcggca 1500
gacggcttct cgcgcgattt gggcgttaaa ttcggcgcga caggcaagaa aaagctgaaa 1560
aatgatacaa gcgcattcgg ctggggggta aactccggct tcggcggcga cgataaatgg 1620
ggggccgaaa ccaaaatcaa cctgccgatt accgctgccg caaacagcat ttcgctggtg 1680
cgcgcgattt cctccggtgc cttgaatttg gaattgtccg catccgaatc gctttcaaaa 1740
accaaaacgc ttgccaatcc gcgcgtgctg acccaaaacc gcaaagaggc caaaatcgaa 1800
tccggttacg aaattccttt caccgtaacc tcaatcgcga acggcggcag cagcacgaac 1860
acggaactca aaaaagccgt cttggggctg accgttacgc cgaacatcac gcccgacggc 1920
caaatcatta tgaccgtcaa aatcaacaag gactcgcctg cgcaatgtgc ctccggtaat 1980
cagacgatcc tgtgtatttc gaccaaaaac ctgaatacgc aggctatggt tgaaaacggc 2040
ggcacattga ttgtcggcgg tatttatgaa gaagacaacg gcaatacgct gaccaaagtc 2100
cccctgttgg gcgacatccc cgttatcggc aacctcttta aaacacgcgg gaaaaaaacc 2160
gaccgccgcg aactgctgat tttcattacc ccgaggatta tgggtacggc cggcaacagc 2220
ctg 2223
＜210＞ 4
＜211＞ 741
＜212＞ PRT
＜213＞ Neisseria meningitidis
＜400＞ 4
Ile Xaa Asp Ile Lys Val Ser Ser Leu Pro Asn Ile Gln Lys Ile Val
1 5 10 15
Lys Val Ser Phe Asp Lys Glu Ile Val Asn Pro Ala Gly Phe Val Thr
20 25 30
Ser Ser Pro Ala Arg Ile Ala Leu Asp Phe Glu Gln Xaa Gly Ile Ser
35 40 45
Met Asp Gln Gln Val Leu Glu Tyr Xaa Asp Pro Leu Leu Ser Lys Ile
50 55 60
Ser Ala Ala Gln Asn Ser Xaa Arg Ala Arg Leu Val Leu Asn Leu Asn
65 70 75 80
Lys Pro Gly Gln Tyr Asn Thr Glu Val Arg Gly Asn Lys Val Trp Ile
85 90 95
Phe Ile Asn Glu Ser Asp Asp Thr Val Ser Ala Ala Ala Arg Ala Ala
100 105 110
Val Lys Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Pro
115 120 125
Ser Thr Lys Ser Ala Val Ser Val Ser Lys Pro Phe Thr Pro Ala Lys
130 135 140
Gln Gln Ala Ala Ala Pro Phe Thr Glu Ser Val Val Ser Val Ser Ala
145 150 155 160
Pro Phe Ser Pro Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Ser Ala Lys Gln Gln
165 170 175
Thr Ala Ala Pro Ala Lys His Gln Arg Gln Ala Gln Ala Lys Gln Gln
180 185 190
Ala Ala Ala Pro Ala Lys Gln Thr Asn Ile Asp Phe Arg Lys Asp Gly
195 200 205
Lys Asn Ala Gly Ile Ile Glu Leu Ala Ala Leu Gly Phe Ala Gly Gln
210 215 220
Pro Asp Ile Ser Gln Gln His Asp His Ile Ile Val Thr Leu Lys Asn
225 230 235 240
His Thr Leu Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ser Leu Asp Val Ala Asp Phe
245 250 255
Lys Thr Pro Val Gln Lys Val Thr Leu Lys Arg Leu Asn Asn Asp Thr
260 265 270
Gln Leu Ile Ile Thr Thr Ala Gly Asn Trp Glu Leu Val Asn Lys Ser
275 280 285
Ala Ala Pro Gly Tyr Phe Thr Phe Gln Val Leu Pro Lys Lys Gln Asn
290 295 300
Leu Glu Ser Gly Gly Val Asn Asn Ala Pro Lys Thr Phe Thr Gly Arg
305 310 315 320
Lys Ile Ser Leu Asp Phe Gln Asp Val Glu Ile Arg Thr Ile Leu Gln
325 330 335
Ile Leu Ala Lys Glu Ser Gly Met Asn Ile Val Ala Ser Asp Ser Val
340 345 350
Asn Gly Lys Met Thr Leu Ser Leu Lys Asp Val Pro Trp Asp Gln Ala
355 360 365
Leu Asp Leu Val Met Gln Ala Arg Asn Leu Asp Met Arg Gln Gln Gly
370 375 380
Asn Ile Val Asn Ile Ala Pro Arg Asp Glu Leu Leu Ala Lys Asp Lys
385 390 395 400
Ala Phe Leu Gln Ala Glu Lys Asp Ile Ala Asp Leu Gly Ala Leu Tyr
405 410 415
Ser Gln Asn Phe Gln Leu Lys Tyr Lys Asn Val Glu Glu Phe Arg Ser
420 425 430
Ile Leu Arg Leu Asp Asn Ala Asp Thr Thr Gly Asn Arg Asn Thr Leu
435 440 445
Val Ser Gly Arg Gly Ser Val Leu Ile Asp Pro Ala Thr Asn Thr Leu
450 455 460
Ile Val Thr Asp Thr Arg Ser Val Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Ile
465 470 475 480
Asp Glu Leu Asp Val Pro Ala Gln Gln Val Met Ile Glu Ala Arg Ile
485 490 495
Val Glu Ala Ala Asp Gly Phe Ser Arg Asp Leu Gly Val Lys Phe Gly
500 505 510
Ala Thr Gly Lys Lys Lys Leu Lys Asn Asp Thr Ser Ala Phe Gly Trp
515 520 525
Gly Val Asn Ser Gly Phe Gly Gly Asp Asp Lys Trp Gly Ala Glu Thr
530 535 540
Lys Ile Asn Leu Pro Ile Thr Ala Ala Ala Asn Ser Ile Ser Leu Val
545 550 555 560
Arg Ala Ile Ser Ser Gly Ala Leu Asn Leu Glu Leu Ser Ala Ser Glu
565 570 575
Ser Leu Ser Lys Thr Lys Thr Leu Ala Asn Pro Arg Val Leu Thr Gln
580 585 590
Asn Arg Lys Glu Ala Lys Ile Glu Ser Gly Tyr Glu Ile Pro Phe Thr
595 600 605
Val Thr Ser Ile Ala Asn Gly Gly Ser Ser Thr Asn Thr Glu Leu Lys
610 615 620
Lys Ala Val Leu Gly Leu Thr Val Thr Pro Asn Ile Thr Pro Asp Gly
625 630 635 640
Gln Ile Ile Met Thr Val Lys Ile Asn Lys Asp Ser Pro Ala Gln Cys
645 650 655
Ala Ser Gly Asn Gln Thr Ile Leu Cys Ile Ser Thr Lys Asn Leu Asn
660 665 670
Thr Gln Ala Met Val Glu Asn Gly Gly Thr Leu Ile Val Gly Gly Ile
675 680 685
Tyr Glu Glu Asp Asn Gly Asn Thr Leu Thr Lys Val Pro Leu Leu Gly
690 695 700
Asp Ile Pro Val Ile Gly Asn Leu Phe Lys Thr Arg Gly Lys Lys Thr
705 710 715 720
Asp Arg Arg Glu Leu Leu Ile Phe Ile Thr Pro Arg Ile Met Gly Thr
725 730 735
Ala Gly Asn Ser Leu
740
＜210＞ 5
＜211＞ 2310
＜212＞ DNA
＜213＞ Neisseria meningitidis
＜400＞ 5
atgaatacca aactgacaaa aatcatttcc ggtctctttg tcgcaaccgc cgcctttcag 60
acagcatcgg caggaaacat tacagacatc aaagtttcct ccctgcccaa caaacagaaa 120
atcgtcaaag tcagctttga caaagagatt gtcaacccga ccggcttcgt aacctcctca 180
ccggcccgca tcgccttgga ctttgaacaa accggcattt ccatggatca acaggtactc 240
gaatatgccg atcctctgtt gagcaaaatc agtgccgcac aaaacagcag ccgtgcgcgt 300
ctggttctga atctgaacaa accgggccaa tacaataccg aagtacgcgg gaacaaagtt 360
tggatattca ttaacgaatc ggacgatacc gtgtccgccc ccgcacgccc cgccgtaaaa 420
gccgcgcctg ccgcaccggc aaaacaacag gctgccgcac cgtctaccaa gtccgcagta 480
tccgtatccg aaccctttac cccggcaaaa caacaggctg ccgcaccgtt taccgagtcc 540
gtagtatccg tatccgcacc gttcagcccg gcaaaacaac aggcggcggc atcagcaaaa 600
caacaggcgg cagcaccagc aaaacaacag gcggcagcac cagcaaaaca acaggcggca 660
gcaccagcaa aacaaaccaa tatcgatttc cgcaaagacg gcaaaaatgc cggcattatc 720
gaattggctg cattgggctt tgccgggcag cccgacatca gccaacagca cgaccacatc 780
atcgttacgc tgaaaaacca taccctgccg accacgctcc aacgcagttt ggatgtggca 840
gactttaaaa caccggttca aaaggttacg ctgaaacgcc tcaataacga cacccagctg 900
attatcacaa cagccggcaa ctgggaactc gtcaacaaat ccgccgcgcc cggatacttt 960
accttccaag tcctgccgaa aaaacaaaac ctcgagtcag gcggcgtgaa caatgcgccc 1020
aaaaccttca caggccggaa aatctccctt gacttccaag atgtcgaaat ccgcaccatc 1080
ctgcagattt tggcaaaaga atccggaatg aacattgttg ccagcgactc cgtcaacggc 1140
aaaatgaccc tctccctcaa ggatgtgcct tgggatcagg ctttggattt ggttatgcag 1200
gcgcgcaacc tcgatatgcg ccagcaaggg aatatcgtca acatcgcgcc ccgcgacgag 1260
ctgcttgcca aagacaaagc cctcttacag gcagaaaaag acattgccga tttgggtgcg 1320
ctgtattccc aaaacttcca gttgaaatac aaaaatgtgg aagaattccg cagcatcctg 1380
cgtttggaca atgccgacac gaccggaaac cgcaacacgc ttatcagcgg caggggcagc 1440
gtgctgatcg atcccgccac caacaccctg attgttaccg acacccgcag cgtcatcgaa 1500
aaattccgca aactgattga cgaattggac gtacccgcgc aacaagtgat gattgaggcg 1560
cgtatcgtcg aagcggcaga cggcttctcg cgcgatttgg gcgttaaatt cggcgcgaca 1620
ggcaagaaaa agctgaaaaa tgatacaagc gcattcggct ggggggtaaa ctccggcttc 1680
ggcggcgacg ataaatgggg ggccgaaacc aaaatcaacc tgccgattac cgctgccgca 1740
aacagcattt cgctggtgcg cgcgatttcc tccggtgcct tgaatttgga attgtccgca 1800
tccgaatcgc tttcaaaaac caaaacgctt gccaatccgc gcgtgctgac ccaaaaccgc 1860
aaagaggcca aaatcgaatc cggttacgaa attcctttca ccgtaacctc aatcgcgaac 1920
ggcggcagca gcacgaacac ggaactcaaa aaagccgtct tggggctgac cgttacgccg 1980
aacatcacgc ccgacggcca aatcattatg accgtcaaaa tcaacaagga ctcgcctgcg 2040
caatgtgcct ccggtaatca gacgatcctg tgtatttcga ccaaaaacct gaatacgcag 2100
gctatggttg aaaacggcgg cacattgatt gtcggcggta tttatgaaga agacaacggc 2160
aatacgctga ccaaagtccc cctgttgggc gacatccccg ttatcggcaa cctctttaaa 2220
acacgcggga aaaaaaccga ccgccgcgaa ctgctgattt tcattacccc gaggattatg 2280
ggtacggccg gcaacagcct gcgctattga 2310
＜210＞ 6
＜211＞ 769
＜212＞ PRT
＜213＞ Neisseria meningitidis
＜400＞ 6
Met Asn Thr Lys Leu Thr Lys Ile Ile Ser Gly Leu Phe Val Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Phe Gln Thr Ala Ser Ala Gly Asn Ile Thr Asp Ile Lys Val
20 25 30
Ser Ser Leu Pro Asn Lys Gln Lys Ile Val Lys Val Ser Phe Asp Lys
35 40 45
Glu Ile Val Asn Pro Thr Gly Phe Val Thr Ser Ser Pro Ala Arg Ile
50 55 60
Ala Leu Asp Phe Glu Gln Thr Gly Ile Ser Met Asp Gln Gln Val Leu
65 70 75 80
Glu Tyr Ala Asp Pro Leu Leu Ser Lys Ile Ser Ala Ala Gln Asn Ser
85 90 95
Ser Arg Ala Arg Leu Val Leu Asn Leu Asn Lys Pro Gly Gln Tyr Asn
100 105 110
Thr Glu Val Arg Gly Asn Lys Val Trp Ile Phe Ile Asn Glu Ser Asp
115 120 125
Asp Thr Val Ser Ala Pro Ala Arg Pro Ala Val Lys Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Pro Ser Thr Lys Ser Ala Val
145 150 155 160
Ser Val Ser Glu Pro Phe Thr Pro Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Pro
165 170 175
Phe Thr Glu Ser Val Val Ser Val Ser Ala Pro Phe Ser Pro Ala Lys
180 185 190
Gln Gln Ala Ala Ala Ser Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Pro Ala Lys
195 200 205
Gln Gln Ala Ala Ala Pro Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Pro Ala Lys
210 215 220
Gln Thr Asn Ile Asp Phe Arg Lys Asp Gly Lys Asn Ala Gly Ile Ile
225 230 235 240
Glu Leu Ala Ala Leu Gly Phe Ala Gly Gln Pro Asp Ile Ser Gln Gln
245 250 255
His Asp His Ile Ile Val Thr Leu Lys Asn His Thr Leu Pro Thr Thr
260 265 270
Leu Gln Arg Ser Leu Asp Val Ala Asp Phe Lys Thr Pro Val Gln Lys
275 280 285
Val Thr Leu Lys Arg Leu Asn Asn Asp Thr Gln Leu Ile Ile Thr Thr
290 295 300
Ala Gly Asn Trp Glu Leu Val Asn Lys Ser Ala Ala Pro Gly Tyr Phe
305 310 315 320
Thr Phe Gln Val Leu Pro Lys Lys Gln Asn Leu Glu Ser Gly Gly Val
325 330 335
Asn Asn Ala Pro Lys Thr Phe Thr Gly Arg Lys Ile Ser Leu Asp Phe
340 345 350
Gln Asp Val Glu Ile Arg Thr Ile Leu Gln Ile Leu Ala Lys Glu Ser
355 360 365
Gly Met Asn Ile Val Ala Ser Asp Ser Val Asn Gly Lys Met Thr Leu
370 375 380
Ser Leu Lys Asp Val Pro Trp Asp Gln Ala Leu Asp Leu Val Met Gln
385 390 395 400
Ala Arg Asn Leu Asp Met Arg Gln Gln Gly Asn Ile Val Asn Ile Ala
405 410 415
Pro Arg Asp Glu Leu Leu Ala Lys Asp Lys Ala Leu Leu Gln Ala Glu
420 425 430
Lys Asp Ile Ala Asp Leu Gly Ala Leu Tyr Ser Gln Asn Phe Gln Leu
435 440 445
Lys Tyr Lys Asn Val Glu Glu Phe Arg Ser Ile Leu Arg Leu Asp Asn
450 455 460
Ala Asp Thr Thr Gly Asn Arg Asn Thr Leu Ile Ser Gly Arg Gly Ser
465 470 475 480
Val Leu Ile Asp Pro Ala Thr Asn Thr Leu Ile Val Thr Asp Thr Arg
485 490 495
Ser Val Ile Glu Lys Phe Arg Lys Leu Ile Asp Glu Leu Asp Val Pro
500 505 510
Ala Gln Gln Val Met Ile Glu Ala Arg Ile Val Glu Ala Ala Asp Gly
515 520 525
Phe Ser Arg Asp Leu Gly Val Lys Phe Gly Ala Thr Gly Lys Lys Lys
530 535 540
Leu Lys Asn Asp Thr Ser Ala Phe Gly Trp Gly Val Asn Ser Gly Phe
545 550 555 560
Gly Gly Asp Asp Lys Trp Gly Ala Glu Thr Lys Ile Asn Leu Pro Ile
565 570 575
Thr Ala Ala Ala Asn Ser Ile Ser Leu Val Arg Ala Ile Ser Ser Gly
580 585 590
Ala Leu Asn Leu Glu Leu Ser Ala Ser Glu Ser Leu Ser Lys Thr Lys
595 600 605
Thr Leu Ala Asn Pro Arg Val Leu Thr Gln Asn Arg Lys Glu Ala Lys
610 615 620
Ile Glu Ser Gly Tyr Glu Ile Pro Phe Thr Val Thr Ser Ile Ala Asn
625 630 635 640
Gly Gly Ser Ser Thr Asn Thr Glu Leu Lys Lys Ala Val Leu Gly Leu
645 650 655
Thr Val Thr Pro Asn Ile Thr Pro Asp Gly Gln Ile Ile Met Thr Val
660 665 670
Lys Ile Asn Lys Asp Ser Pro Ala Gln Cys Ala Ser Gly Asn Gln Thr
675 680 685
Ile Leu Cys Ile Ser Thr Lys Asn Leu Asn Thr Gln Ala Met Val Glu
690 695 700
Asn Gly Gly Thr Leu Ile Val Gly Gly Ile Tyr Glu Glu Asp Asn Gly
705 710 715 720
Asn Thr Leu Thr Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro Val Ile Gly
725 730 735
Asn Leu Phe Lys Thr Arg Gly Lys Lys Thr Asp Arg Arg Glu Leu Leu
740 745 750
Ile Phe Ile Thr Pro Arg Ile Met Gly Thr Ala Gly Asn Ser Leu Arg
755 760 765
Tyr
＜210＞ 7
＜211＞ 37
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Primer
＜400＞ 7
gggggctagc aataccaaac tgacaaaaat catttcc 37
＜210＞ 8
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Primer
＜400＞ 8
ggggaagctt atagcgcagg ctgttgccgg c 31
1

Claims (28)

  1. SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, 아미노산 서열이, SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 가짐을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
  3. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:6의 단리된 폴리펩티드.
  5. SEQ ID NO:2의 단리된 폴리펩티드.
  6. 면역원성 단편의 면역원 활성이 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6의 폴리펩티드와 실질적으로 동일한, 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 면역원성 단편.
  7. 각각 SEQ ID NO:4 또는 6의 전길이에 걸쳐서 SEQ ID NO:4 또는 6의 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드; 또는 이러한 단리된 폴리누클레오티드에 상보적인 누클레오티드 서열.
  8. 전체 코딩 영역에 걸쳐서 SEQ ID NO:4 또는 6의 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드; 또는 이러한 단리된 폴리누클레오티드에 상보적인 누클레오티드 서열.
  9. 각각 SEQ ID NO:3 또는 5의 전길이에 걸쳐서 SEQ ID NO:3 또는 5의 누클레오티드 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드; 또는 이러한 단리된 폴리누클레오티드에 상보적인 누클레오티드 서열.
  10. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO:3 또는 5와 99% 이상의 동일성을 가짐을 특징으로 하는 단리된 폴리누클레오티드.
  11. SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6의 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  12. SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:5의 폴리누클레오티드를 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  13. 스트린전트(stringent) 하이브리드화 조건하에서 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:5의 서열 또는 이것의 단편을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 적합한 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있는, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6의 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  14. SEQ ID NO:2의 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  15. SEQ ID NO:1의 폴리누클레오티드를 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  16. 스트린전트 하이브리드화 조건하에서 SEQ ID NO:1의 서열 또는 이것의 단편을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 적합한 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있는, SEQ ID NO:2의 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  17. 제 7항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 살아있는 재조합 미생물.
  18. SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 발현시키는 제 17항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 숙주 세포의 막.
  19. SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 생성시키는 방법으로서, 이러한 폴리펩티드을 생성시키기에 충분한 조건하에서 제 18항의 숙주 세포를 배양하고, 배양기로부터 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제 7항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드를 발현시키는 방법으로서, 이러한 폴리누클레오티드 중의 하나 이상을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키고, 이러한 폴리누클레오티드 중의 어느 하나를 발현시키기에 충분한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  21. 유효량의 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포함하는 백신 조성물.
  22. 유효량의 제 7항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드와 약제학적으로 허용되는 캐리어를 포함하는 백신 조성물.
  23. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 조성물이 하나 이상의 다른 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 항원을 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  24. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 면역학적 단편에 대해 면역특이적인 항체.
  25. 나이세리아 메닌지티디스에 감염된 것으로 여겨지는 동물로부터의 생물학적 샘플내에 존재하는, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드에 대해 면역특이적인 항체를 확인하는 것을 포함하여, 나이세리아 메닌지티디스 감염을 진단하는 방법.
  26. 동물에게서 면역 반응을 일으키는 데에 사용되는 약제를 제조하기 위한, 면역학적 유효량의 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 용도.
  27. 동물에게서 면역 반응을 일으키는 데에 사용되는 약제를 제조하기 위한, 면역학적 유효량의 제 7항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드를 포함하는 조성물의 용도.
  28. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 대해 유도된 하나 이상의 항체와 적합한 약제학적 캐리어를 포함하는, 나이세리아 메닌지티디스 질병에 걸린 사람을 치료하는 데에 유용한 치료용 조성물.
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