ES2512496T3

ES2512496T3 - Vacunas y pruebas de diagnóstico de Streptococcus suis

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Publication number: ES2512496T3
Application number: ES99935176.0T
Authority: ES
Inventors: Hilda Elizabeth Smith
Original assignee: Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek DLO
Current assignee: Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek DLO
Priority date: 1998-07-22
Filing date: 1999-07-19
Publication date: 2014-10-24
Anticipated expiration: 2019-07-19
Also published as: WO2000005378A3; PL204863B1; WO2000005378A2; US7776323B2; HUP0500459A2; PL346369A1; US8728490B2; US20070111236A1; CA2341268C; US7125548B2; AU5070999A; EP1098980A2; HU228700B1; US20110171252A1; CA2341268A1; HUP0500459A3; USRE45170E1; EP1098980B1; US20020055168A1; DK1098980T3

Abstract

Uso de un mutante sin cápsula de Streptococcus suis que tiene una mutación en el agregado génico del polisacárido capsular (cps) para la preparación de una vacuna.

Description

Vacunas y pruebas de diagnóstico de Streptococcus suis

La invención se relaciona con infecciones de cerdos por Streptococcus suis, con vacunas dirigidas contra esas infecciones, con pruebas para diagnosticar las infecciones de Streptococcus suis y con el campo de las vacunas bacterianas, más particularmente a las vacunas dirigidas contra las infecciones deStreptococcus suis.

Las especies de Streptococcus, de las cuales existen una gran variedad que causan infecciones en los animales domésticos y el hombre, se agrupan frecuentemente de acuerdo con los grupos de Lancefield. La tipificación de acuerdo con Lancefield ocurre sobre la base de determinantes serológicos o antígenos que están entre otros, presentes en la cápsula de la bacteria y que permiten sólo una determinación aproximada, frecuentemente las bacterias de un grupo diferente muestran reactividad cruzada uno con el otro, mientras que a otros Estreptococos no se les puede asignar un grupo-determinante en absoluto. Dentro de los grupos, la diferenciación además es frecuentemente posible sobre la base de la serotipificación; estos serotipos contribuyen además a la gran variabilidad antigénica de los Estreptococos, un hecho que crea una serie de dificultades dentro del diagnóstico de y la vacunación contra las infecciones Estreptocócicas.

Las especies de Streptococcus (GAS, Streptococcus pyogenes) del grupo A de Lancefield, son comunes con los niños, que causan infecciones nasofaríngeas y complicaciones de las mismas. Entre los animales, especialmente el ganado es susceptible a GAS, de manera que a menudo se encuentra mastitis.

Los Estreptococos del grupo A son los agentes etiológicos de la faringitis estreptocócica e impétigo, dos de las infecciones bacterianas más comunes en los niños, así como una variedad de infecciones menos comunes pero potencialmente mortales, que incluyen infecciones de tejidos blandos, bacteriemia y neumonía. Además, GAS se asocia únicamente con los síndromes autoinmunes postinfecciosos de fiebre reumática aguda y glomerulonefritis post-estreptocócica.

Varios informes recientes sugieren que la incidencia tanto de infecciones graves debido a GAS como de la fiebre reumática aguda ha aumentado durante la última década, enfocándose renovado el interés en la definición de los atributos o factores de virulencia del organismo que pueden jugar un papel en la patogénesis de estas enfermedades.

GAS produce varios componentes de la superficie y productos extracelulares que pueden ser importantes en la virulencia. La proteína de superficie principal, la proteína M, se estudió con más detalle y demostró convincentemente que juega un papel en la virulencia y la inmunidad. Los aislamientos ricos en proteína M son capaces de crecer en la sangre humana, una propiedad pensada para reflejar la capacidad de la proteína M para interferir con la fagocitosis, y estos aislamientos tienden a ser virulentos en animales de experimentación.

Los Streptococcus del grupo B de Lancefield (GBS) los más frecuentemente se observan en el ganado, causando mastitis, sin embargo, los bebés humanos también son susceptibles, frecuentemente con consecuencias fatales. Los estreptococos del Grupo B (GBS) constituyen una causa principal de sepsis bacteriana y meningitis entre los neonatos humanos nacidos en los Estados Unidos y Europa occidental y están surgiendo como patógenos neonatales importantes en los países en desarrollo también.

Se estima que las cepas de GBS son responsables de entre 10,000 a 15,000 casos de infección invasiva en recién nacidos en los Estados Unidos solamente. A pesar de los avances en el diagnóstico y tratamiento temprano, la sepsis neonatal por GBS continúa produciendo una tasa de mortalidad de 15 a 20%. Además, los sobrevivientes de la meningitis de GBS tienen de 30 a 50% de incidencia de secuelas neurológicas a largo plazo. El reconocimiento cada vez mayor en las últimas dos décadas de GBS como un patógeno importante para los bebés humanos ha generado un interés renovado en la definición de los factores y huéspedes bacterianos importantes en la virulencia de GBS y en la respuesta inmune a la infección por GBS.

Se ha centrado particular atención en el polisacárido capsular como el antígeno de superficie predominante de los organismos. En una modificación del sistema desarrollado originalmente por Rebecca Lancefield, las cepas de GBS se serotipifican sobre la base de diferencias de los antígenos en sus polisacáridos capsulares y la presencia o ausencia de proteínas C serológicamente definidas. Mientras los GBS aislados a partir de fuentes no humanas frecuentemente carecen de una cápsula serológicamente detectable, una gran mayoría de las cepas asociadas con la infección neonatal pertenecen

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a uno de los cuatro principales serotipos capsulares, 1a, 1b, II o III. El polisacárido capsular forma la capa más externa alrededor del exterior de la célula bacteriana, superficial a la pared celular. La cápsula es distinta del carbohidrato del grupo B asociado a la pared celular. Se ha sugerido que la presencia de ácido siálico en la cápsula de la bacteria que causa meningitis es importante para esta bacteria atravesar la barrera sangre-cerebro. Claramente, en S. agalactiae el ácido siálico ha demostrado ser crucial para la función de la virulencia de la cápsula de tipo III. La cápsula de serotipo S. suis se compone de glucosa, galactosa, N-acetilglucosamina, ramnosa y ácido siálico.

El polisacárido del grupo B, en contraste con la cápsula tipo-específica, está presente en todas las cepas de GBS y es la base para los serogrupos de los organismos en el grupo B de Lancefield. Los primeros estudios de Lancefield y colaboradores mostraron que los anticuerpos se elevaron en los conejos contra los organismos GBS completos protegieron a los ratones contra el desafío con cepas de tipo capsular homólogo, demostrando el papel central del polisacárido capsular como un antígeno protector. Los estudios en la década de 1970 por Baker y Kasper demostraron que la sangre del cordón de los lactantes humanos con sepsis por GBS de tipo III uniformemente tuvieron niveles bajos o no detectables de anticuerpos dirigidos contra la cápsula de tipo III, sugiriendo que una deficiencia del anticuerpo anticapsular fue un factor clave en la susceptibilidad de los niños recién nacidos a la enfermedad por GBS.

Las infecciones por el grupo C de Lancefield, tales como aquellas con S. equi, S. zooepidemicus, S. dysgalactiae, y otros se ven principalmente en caballos, ganado y cerdos, pero también pueden cruzar la barrera de especies a los humanos. Las infecciones por el grupo C de Lancefield (S. bovis) se encuentran en los mamíferos y algunas aves, resultando algunas veces en endocarditis o septicemia.

Los grupos E, G, L, P, U y V de Lancefield (S. porcinus, S, canis, S. dysgalactiae) se encuentran en varios huéspedes, y causan infecciones neonatales, infecciones nasofaríngeas o mastitis.

Dentro de los grupos de Lancefield R, S y T, (y con tipos no agrupados) S. suis se encuentra, una causa importante de meningitis, septicemia, artritis y muerte súbita en cerdos jóvenes. Incidentalmente, también puede causar meningitis en el hombre.

El Streptococcus suis es una causa importante de meningitis, septicemia, artritis y muerte súbita en cerdos jóvenes (4, 46). Incidentalmente, también puede causar meningitis en el hombre (1). Las cepas de S.suis generalmente se identifican y clasifican por sus características morfológicas, bioquímicas y serológicas (58, 59, 46). La clasificación serológica se basa en la presencia de polisacáridos antigénicos específicos. Hasta ahora, se han descrito 35 serotipos diferentes (9, 56, 14). En varios países europeos el serotipo 2 de S. suis es el tipo más frecuente aislado de cerdos enfermos, seguido por los serotipos 9 y 1. La tipificación serológica de S. suis se lleva a cabo usando diferentes tipos de pruebas de aglutinación. En estas pruebas, las células de S. suis aisladas y caracterizadas bioquímicamente se aglutinan con un panel de 35 sueros específicos. Estos métodos son muy laboriosos y consumen mucho tiempo.

Poco se sabe acerca de la patogénesis de la enfermedad causada por S.suis, y mucho menos sobre sus varios serotipos tales como el tipo 2. Se han sugerido varios componentes bacterianos, tales como proteínas asociadas con la membrana celular y extracelular, fimbrias, hemaglutininas y hemolisina como factores de virulencia (9, 10, 11, 15, 16, 47, 49). Sin embargo, el papel exacto de estos componentes proteicos en la patogénesis de la enfermedad sigue siendo poco claro (37). Es bien conocido que la cápsula de polisacárido de varios estreptococos y otras bacterias gram-positivas juega un papel importante en la patogénesis (3, 6, 35, 51, 52). La cápsula permite que estos microorganismos resistan la fagocitosis y por lo tanto se considera como un factor de virulencia importante. Recientemente, se sugirió además un papel de la cápsula de S. suis en la patogénesis (5). Sin embargo, la estructura, organización y funcionamiento de los genes responsables de la síntesis de polisacáridos de la cápsula (cps) en S. suis se desconoce. Dentro de las cepas de S. suis los serotipos 1 y 2 pueden diferir en virulencia para cerdos (41, 45, 49). Algunas cepas de tipo 1 y 2 son virulentas, otras cepas no lo son. Debido a que tanto las cepas virulentas como las no virulentas del serotipo 1 y 2 se encapsulan completamente, incluso puede ser que la cápsula no es un factor pertinente necesario para la virulencia.

Los intentos por controlar las infecciones o enfermedad de S. suis aun se dificultan por la falta de conocimiento acerca de la epidemiología de la enfermedad y la falta de vacunas eficaces y pruebas diagnósticas sensibles. Es bien conocido y generalmente aceptado que la cápsula polisacárida de varios estreptococos y otras bacterias gram-positivas juegan un papel importante en la patogénesis. La cápsula permite a estos microorganismos resistir a la fagocitosis y por lo tanto se considera como un importante factor de virulencia.

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En comparación con las cepas S. suis encapsuladas las cepas de S. suis no encapsuladas se fagocitan por los leucocitos polimorfonucleares murinos a un mayor grado. Además, se observó un aumento en el espesor de la cápsula para as cepas virulentas crecidas in vivo mientras que no se observó aumento de cepas avirulentas. Por lo tanto, estos datos demuestran una vez más el papel de la cápsula en la patogénesis de S. suis también.

Las especies de Streptococcus, no agrupadas tales como S. mutans, causan caries en los humanos, S, uberis, causa mastitis en el ganado, y S. pneumonia, causa infecciones graves en los seres humanos, y Enterococcus faecilalis y E. faecium, contribuyen adicionalmente al gran grupo de los estreptococos.

Streptococcus pneumoniae (el pneumococo) es un patógeno humano que causa enfermedades invasivas, como la neumonía, bacteriemia y meningitis. A pesar de la disponibilidad de antibióticos, las infecciones neumocócicas siguen siendo comunes y aun pueden ser fatales, especialmente en los grupos de alto riesgo, tales como los niños pequeños y las personas de edad avanzada. Particularmente en los países en desarrollo, muchos niños menores de cinco años, mueren cada año de neumonía neumocócica. S. pneumoniae es también la causa principal de otitis media y sinusitis. Estas infecciones son menos graves, pero sin embargo incurren en costos médicos importantes, especialmente cuando conducen a complicaciones, tales como la sordera permanente. El nicho ecológico normal del neumococo es la nasofaringe del hombre. Toda la población humana se coloniza por neumococo en un momento u otro, y en un momento dado, hasta el 60% de los individuos pueden ser portadores. El portador nasofaríngeo de neumococo por el hombre es frecuentemente acompañado por el desarrollo de protección a la infección por el mismo serotipo. La mayoría de las infecciones no ocurren después de su transporte prolongado, pero sigue la adquisición de cepas recientemente adquiridas. Muchas bacterias contienen polisacáridos de superficie que actúan como una capa protectora contra el medio ambiente. Los polisacáridos de superficie de bacterias patogénicas generalmente hacen las bacterias resistentes a los mecanismos de defensa del huésped, por ejemplo, la acción lítica de suero o fagocitosis. En este sentido, el polisacárido capsular (CP) serotipoespecífico de Streptococcus pneumoniae, es un importante factor de virulencia. La cepas no encapsuladas son avirulenta, y los anticuerpos dirigidos contra el CP son protectores. La protección es específica al serotipo; cada serotipo tiene su propia estructura CP específica. Noventa serotipos capsulares diferentes se han identificado. Actualmente, CPs de 23 serotipos se incluyen en la vacuna.

Las vacunas dirigidas contra las infecciones de Streptococcus generalmente son objetivo en la utilización de una respuesta inmune dirigida contra la cápsula de polisacárido de las diversas especies de Streptococcus , especialmente ya que la cápsula se considera un factor principal de virulencia para estas bacterias. La cápsula, durante la infección, proporciona resistencia a la fagocitosis y por lo tanto promueve el escape de las bacterias del sistema inmune del huésped, protegiendo las bacterias de la eliminación por los macrófagos y neutrófilos.

La cápsula particularmente confiere la resistencia de la bacteria a la opsonofagocitosis mediada por el complemento. Adicionalmente, algunas bacterias expresan polisacáridos capsulares (CPs) que imitan las moléculas del huésped, evitando así el sistema inmune del huésped. Además, incluso cuando las bacterias se han fagocitado, la destrucción intracelular se dificulta por la presencia de una cápsula.

Se piensa generalmente que sólo cuando el huésped tiene anticuerpos u otros factores séricos dirigidos contra los antígenos de la cápsula, la bacteria conseguirá ser reconocida por el sistema inmune a través de los anticuerpos anticapsulares o factores del suero unidos a su cápsula, y a través de la opsonización, conseguirán fagocitarse y destruirse.

Sin embargo, estos anticuerpos son serotipo-específico, y frecuentemente conferirán sólo protección contra sólo uno de los muchos serotipos conocidos dentro de un grupo de Estreptococos.

Por ejemplo, las vacunas actuales de S. suis disponibles en el comercio que son, generalmente, basadas en las preparaciones de células-bacterianas completas o en fracciones enriquecidas de cápsula de S. suis, confieren sólo protección limitada contra las cepas heterólogas. Además, la actual vacuna neumocócica, licenciada en los Estados Unidos en 1983, consiste de CPs purificados de 23 serotipos neumocócicos mientras que existen al menos 90 tipos de CP.

La composición de esta vacuna neumocócica se basa en la frecuencia de aparición de los aislados de la enfermedad en Estados Unidos y la reactividad cruzada entre varios serotipos. Aunque esta vacuna protege a los adultos sanos contra las infecciones causadas por los serotipos incluidos en la vacuna, no logra elevar una respuesta inmune protectora en los bebés

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menores de 18 meses y es menos eficaz en las personas de edad avanzada. Además, la vacuna confiere sólo protección limitada en pacientes con inmunodeficiencias y malignidades hematológicas.

A la luz de lo anterior, se necesitan vacunas mejoradas contra infecciones por Streptococcus. Se está prestando mucha atención a la producción de vacunas con CP mediante la producción de los polisacáridos pertinentes a través de medios químicos o recombinantes. Sin embargo, la síntesis química de los polisacáridos es costosa, y la síntesis del polisacárido capsular por medios recombinantes requiere conocimiento acerca de los genes pertinentes, que no siempre están disponibles y necesitan que se determinen para cada serotipo pertinente.

La descripción proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un agregado génico capsular (cps) de Streptococcus suis. La biosíntesis de los polisacáridos de la cápsula, generalmente, se ha estudiado en un número de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (32). En las bacterias Gram-negativas, pero además en un número de bacterias gram-positivas, los genes que están implicados en la biosíntesis de polisacáridos se agrupan en un solo locus. Los genes capsulares de Streptococcus suis como se proporcionan por la descripción muestran una organización genética común que implica tres regiones distintas. La región central es serotipo específico y codifica las enzimas responsables de la síntesis y polimerización de los polisacáridos. Esta región se flanquea por dos regiones conservadas en Streptococcus suis que codifican proteínas para las funciones comunes, tales como el transporte del polisacárido a través de la membrana celular. Sin embargo, entre las especies, sólo existen homologías bajas, dificultando la comparación fácil y detección de genes aparentemente similares. Conocer el ácido nucleico que codifica las regiones flanqueantes permite la determinación tipoespecífica del ácido nucleico de la región central de los serotipos de Streptococcus suis, como por ejemplo se describe en la parte experimental de la descripción de la exposición.

La descripción proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica una agregado génico capsular de Streptococcus suis o un gen o fragmento de gen derivado de este. Un ácido nucleico de este tipo es por ejemplo proporcionado por la hibridación del ADN cromosómico derivado de cualquiera de los serotipos de Streptococcus suis con un ácido nucleico que codifica un gen derivado de un agregado génico capsular de serotipo 1, 2 o 9 de Streptococcus suis como se proporciona por la descripción (ver por ejemplo las Tablas 4 y 5) y la clonación de los genes (tipo-específicos) como por ejemplo se describe en la parte experimental de la descripción. Al menos se identifican 14 marcos de lectura abiertos. La mayoría de los genes pertenecen a una sola unidad de transcripción, identificando un control coordinado de estos genes, y las enzimas y proteínas que codifican, actúan en colaboración para proporcionar la cápsula con los polisacáridos pertinentes. La descripción proporciona genes cps y proteínas codificadas de estos implicadas en la regulación (CpsA), determinación de la longitud de la cadena (CpsB, C), exportación (CpsC) y la biosíntesis (CpsE, F, G, H, J, K). Aunque la organización total pareció a primera vista ser similar a la de los agregados génicos de cps yeps de una serie de bacterias Gram-positivas (19, 32, 42), las homologías generales son bajas (ver la Tabla 3). La región implicada en la biosíntesis se localiza en el centro del agregado génico y se flanquea por dos regiones que contienen genes con funciones más comunes.

La descripción proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica una agregado génico capsular del serotipo 2 de Streptococcus suis o un gen o fragmento de gen derivado de este, preferentemente como se identifica en la Figura 3. Los genes en este agregado génico se implican en la biosíntesis de polisacáridos de los componentes y antígenos capsulares. Para una descripción adicional de tales genes ver por ejemplo la Tabla 2 de la descripción, por ejemplo, un gen cpsA se proporciona funcionalmente codificando la regulación de la síntesis de polisacáridos capsulares, mientras que cpsB y la cpsC se implican funcionalmente en la determinación de la longitud de la cadena. Otros genes, tales como cpsD, E, F, G, H, I, J, K y genes relacionados, se implican en la síntesis de polisacáridos, que funcionan por ejemplo como glucosilo-o glicosiltransferasa. Los genes cpsF, G, H, I, J codifican más proteínas tipo-específica que los genes flanqueantes que se encuentran más o menos conservados a través de las especies y pueden servir como base para la selección de iniciadores

o sondas en experimentos de amplificación por PCR o hibridación cruzada para su posterior clonación.

Por ejemplo, la descripción proporciona además un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un agregado génico capsular de serotipo 1 de Streptococcus suis o un gen o fragmento de gen derivado de este preferentemente como se identifica en la Figura 4.

Adicionalmente, la descripción proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un agregado génico capsular de serotipo 9 de Streptococcus suis o un gen o fragmento de gen derivado de este preferentemente como se identifica en la Figura 5.

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Además, la descripción proporciona, por ejemplo, un fragmento o sus partes del locus cps, implicado en la biosíntesis de polisacáridos capsulares, de S. suis, ejemplificado en la parte experimental para el serotipo 1, 2 ó 9, y permite la fácil identificación o detección de fragmentos relacionados derivados de otro serotipo de S. suis.

La descripción proporciona una sonda o iniciador de ácido nucleico derivado de un ácido nucleico de acuerdo con la descripción permitiendo la detección específica a especie o serotipo de Streptococcus suis. Una sonda o iniciador de ese tipo (en la presente descripción se usa indistintamente) es por ejemplo una sonda de ADN, ARN o PNA (ácido nucleico peptídico) que hibrida con el ácido nucleico capsular como se proporciona por la descripción La detección específica de la especie se proporciona preferentemente seleccionando una sonda o secuencia de iniciador a partir de una región especieespecífica (por ejemplo, región flanqueante), mientras que la detección específica de serotipo se proporciona preferentemente seleccionando una sonda o secuencia de iniciador de una región tipo-específica (por ejemplo, región central) de un agregado génico capsular como se proporciona por la descripción. Una sonda o iniciador de ese tipo puede usarse en una forma sin modificar además, por ejemplo, en experimentos de hibridación cruzada o la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) como por ejemplo se describe en la parte experimental de la descripción. En la presente la descripción proporciona el aislamiento y caracterización molecular de genes adicionales cps tipo específico de S. suis tipos 1 y 9. Adicionalmente, se describe la diversidad genética de loci cps de los serotipos 1, 2 y 9, entre los 35 serotipos de S. suis conocidos todavía. Las sondas tipo-específica se identifican. Además, una PCR tipo-específica, por ejemplo, se proporciona para el serotipo 9, siendo un ensayo rápido, fiable y sensible, que se usa directamente en exudados nasal o tonsilar u otras muestras de animales infectados o portadores.

La descripción proporciona además una sonda o iniciador de acuerdo con la descripción adicional proporcionada con al menos una molécula reportera. Ejemplos de moléculas reporteras son múltiples y conocidas en la técnica, por ejemplo una molécula reportera puede comprender ácido nucleico adicional proporcionado con una secuencia específica (por ejemplo, oligo-dT) que hibrida con una secuencia correspondiente a la que la hibridación se puede detectar fácilmente, por ejemplo, porque se ha inmovilizado en un soporte sólido.

Sin embargo, otras moléculas reporteras comprenden cromóforos, por ejemplo, fluorocromos para la detección visual, por ejemplo por microscopía de luz o técnicas de hibridación fluorescente in situ (FISH), o comprenden una enzima tal como peroxidasa de rábano picante para la detección enzimática, por ejemplo, en ensayos ligados a enzimas (EIA). Sin embargo, otras moléculas reporteras comprenden compuestos radiactivos para la detección en ensayos basados en radiación.

En un aspecto preferido de la descripción, al menos una sonda o iniciador se proporciona de acuerdo con la descripción (marcado) con una molécula reportera y una molécula de desactivación, proporcionando junto con la sonda o iniciador no marcado una prueba basada en PCR que permite la detección rápida de la hibridación específica.

La descripción proporciona además una prueba de diagnóstico o kit de prueba que comprende una sonda o iniciador como se proporciona por la descripción. Una prueba o kit de prueba de ese tipo, por ejemplo, una prueba de hibridación cruzada o prueba basada en PCR, se usa favorablemente en la detección rápida y/o la serotipificación de Streptococcus suis. La descripción proporciona además una proteína o fragmento de esta codificada por un ácido nucleico de acuerdo con la descripción. Ejemplos de una proteína o fragmento de este tipo son por ejemplo las proteínas descritas por ejemplo, en la Tabla 2 de la descripción, por ejemplo una proteína cpsA se proporciona funcionalmente codificando la regulación de la síntesis de polisacárido capsular, mientras que cpsB y cpsC se implican funcionalmente en la determinación de la longitud de la cadena. Otras proteínas o fragmentos funcionales de estos como se proporciona por la descripción, tales como cpsD, E, F, G, H, I, J, K y proteínas relacionadas, se implican en la biosíntesis de polisacáridos, funcionando por ejemplo como glucosil-o glicosiltransferasa en la biosíntesis de polisacáridos del antígeno capsular de Streptococcus suis.

La descripción proporciona además un método para producir un antígeno capsular de Streptococcus suis que comprende usar una proteína o fragmento funcional de este como se proporciona por la invención descrita, y proporciona con ello un antígeno capsular de Streptococcus suis obtenible por un método de ese tipo. Una comparación de las secuencias de aminoácidos previstas de los genes cps2 con secuencias encontradas en las bases de datos permitió la asignación de funciones a los marcos de lectura abiertos. La región central contiene las glicosiltransferasas tipo específicas y la polimerasa de polisacárido putativa. Esta región se flanquea por dos regiones que codifican para las proteínas con funciones comunes, tales como la regulación y transporte de polisacárido través de la membrana.

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La biosíntesis del antígeno polisacárido capsular de Streptococcus usando una proteína o fragmento funcional de esta se usa favorablemente en la síntesis quimio-enzimática y el desarrollo de vacunas que ofrecen protección contra la enfermedad estreptocócica serotipo-específica, y se usa favorablemente además en la síntesis y el desarrollo de las vacunas multivalentes contra las infecciones estreptocócicas. Tales vacunas inducen anticuerpos anticapsular que confieren protección.

El documento de Quessy S y otros (1994) Can. J. Vet. Res., vol.58, pp.299-301 y el documento de Busque P y otros (1997) Can. J. Vet. Res., vol.61, pp.275-279 describe inmunización de resp ratones. de cerdos contra la infección por S. suis serotipo 2, usando la cepa de S.suis #1330 viva avirulenta serotipo 2. Dicha cepa # 1330 es una cepa avirulenta caracterizada por un defecto en el espesor de polisacárido capsular cuando se crece in vivo.

Resumen de la invención

La invención en su sentido más amplio es como se define en las reivindicaciones independientes.

La invención proporciona un mutante sin cápsula de Streptococcus suis que tiene una mutación en el agregado génico del polisacárido capsular (CPS) para el uso en una vacuna, y una vacuna que comprende dicho mutante s. suis sin cápsula. Sorprendentemente, y en contra del grano de la doctrina común, la invención proporciona el uso de dicho mutante de Streptococcus suis sin cápsula deficiente en la expresión capsular y que tiene una mutación en el agregado génico del polisacárido capsular (CPS) en la preparación de una vacuna.

Los mutantes de Streptococcus sin cápsula se conocen desde mucho tiempo en la técnica y se pueden encontrar en la naturaleza. Griffith (J. Hyg. 27:113-159, 1928) demostró que los neumococos se puede transformar de un tipo a otro. Si se inyecta neumococos tipo 2 (sin cápsula o sin encapsular) vivo rugoso en los ratones, los ratones podrían sobrevivir. Cuando, sin embargo, se inyecta la misma dosis de tipo 2 viva rugosa mezclada con la de tipo 1 lisa destruida por calor (encapsulada) en un ratón, el ratón podría morir, y de la sangre se puede aislar neumococos vivo liso tipo 1. En ese momento, la importancia de este principio transformador no se entendió. Sin embargo, el entendimiento se produjo cuando se demostró que el ADN constituye el material genético responsable de los cambios fenotípicos durante la transformación.

Los mutantes de Streptococcus deficientes en la expresión capsular se encuentran en varias formas. Algunos son totalmente deficientes y no tienen ninguna cápsula en absoluto, otros forman una cápsula deficiente, caracterizada por una mutación en un agregado génico capsular. La deficiencia por ejemplo, puede incluir la formación capsular en donde la organización del material capsular se ha reorganizado, como por ejemplo demostrable por microscopía electrónica. Sin embargo, otros tienen una cápsula casi completamente desarrollada que sólo es deficiente en un componente particular de azúcar.

Ahora, después de mucho avance de la biotecnología y, a pesar del hecho de que todavía se sabe poco sobre la localización exacta y la secuencia de los genes implicados en la síntesis capsular en Estreptococos, es posible crear mutantes de estreptococos, por ejemplo, mediante recombinación homóloga o mutagénesis de transposones, que por ejemplo, ha sido hecho por GAS (Wessels y otros, PNAS 88:8317-8321, 1991), para GBS (Wesels y otros, PNAS 86: 89838987, 1989), para S. suis (Smith, ID-DLO Annual report 1996, página 18-19; Charland y otros, Microbiol. 144:325-332, 1998) y para S. pneumonia (Kolkman y otros, J. Bact. 178:3736-3741, 1996). Tales mutantes recombinantes derivados, o mutantes isogénicos, se pueden comparar fácilmente con las cepas silvestres de la que se han derivado.

En una modalidad preferida, la invención proporciona el uso de un mutante de Streptococcus suis sin cápsula derivado recombinante que tiene una mutación en el agregado génico del polisacárido capsular (CPS) y deficiente en la expresión capsular en la preparación de una vacuna. Las técnicas recombinantes útiles en la producción de tales mutantes son, por ejemplo recombinación homóloga, mutagénesis de transposones, y otras, de manera que las deleciones, inserciones o mutaciones (puntuales) se introducen en el genoma. Las ventajas del uso de técnicas recombinantes son la estabilidad de los mutantes obtenidos (especialmente con las técnicas de recombinación homóloga y cruzamiento doble), y el conocimiento acerca del sitio exacto de la deleción, mutación o inserción.

En una modalidad mucho más preferida, la invención proporciona un mutante sin cápsula estable deficiente en la expresión capsular y que tiene una mutación en el agregado génico del polisacárido capsular (CPS) obtenible por ejemplo a través de

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recombinación homóloga o cruzamiento en los eventos de integración. Ejemplos de un mutante de ese tipo se puede encontrar en la parte experimental de esta descripción, por ejemplo el mutante 10cpsB o 10cpsEF es un mutante estable de ese tipo como se proporciona por la invención.

La invención proporciona además un mutante de Streptococcus suis sin cápsula que tiene una mutación en el agregado génico del polisacárido capsular (CPS) como una cepa de vacuna y una vacuna que comprende dicho mutante de Streptococcus. Generalmente, dicha cepa o vacuna es aplicable dentro de toda la variedad de infecciones estreptocócicas, ya sea para aquellas con animales o el hombre o con infecciones zoonóticas. Por supuesto, es posible ahora seleccionar primero una cepa de vacuna común y derivar un mutante de Streptococcus deficiente en la expresión capsular de este para la selección de una cepa de vacuna y el uso en la preparación de una vacuna de acuerdo con la invención.

Con la presente la invención se proporcionan vacunas para usar con Streptococci suis notoriamente heterólogos, de los que existe una multitud de serotipos. Con una vacuna como se proporciona por la invención que se deriva de un mutante específico de Streptococcus suis que es deficiente en la expresión capsular, las dificultades relativas a la falta de protección heteróloga pueden eludirse ya que estos mutantes no se basan en antígenos capsulares per se para inducir protección.

En una modalidad preferida, dicha cepa de vacuna se selecciona por su capacidad para sobrevivir o incluso replicar en una célula inmunocompetente o células huésped y por lo tanto puede persistir por un período determinado, que varía entre 1-2 días a más de una o dos semanas, en un huésped, a pesar de su carácter deficiente.

Aunque un huésped inmunodeficiente soportará la replicación de una amplia variedad de bacterias que son deficientes en uno o más factores de virulencia, generalmente se considera una característica de la patogenicidad de estreptococos que pueden sobrevivir durante ciertos períodos o replicar en un huésped normal o células huésped tales como macrófagos. Por ejemplo, Wiliams and Blakemore (Neuropath. Appl. Neurobiol.: 16, 345-356, 1990; Neuropath. Appl. Neurobiol.: 16, 377-392, 1990; J. Infect. Dis.: 162, 474-481, 1990) muestran que tanto las células polimorfonucleares y las células de macrófagos son capaces de fagocitar S. suis patogénicos en cerdos que carecen de anticuerpos anti-S. suis, sólo la bacteria patogénica puede sobrevivir y multiplicarse dentro de los macrófagos en el cerdo.

En una modalidad preferida, la invención, sin embargo, proporciona una cepa vacunal o mutante deficiente o avirulenta como de especifica en la reivindicaciones, que es capaz de sobrevivir al menos 4-5 días, de preferencia al menos 8-10 días en dicho huésped, y de ese modo permitir el desarrollo de una respuesta inmune a la infección por Streptococcus posterior,

Debido a su carácter persistente, pero avirulento, un mutante o cepa de vacuna de Streptococcus como se proporciona por la invención y especifica en las reivindicaciones es muy adecuado para generar respuestas inmunes específicas y/o de larga duración contra antígenos estreptocócicos, además porque posibles respuestas inmunes específicas del huésped dirigidas contra una cápsula son relativamente irrelevantes porque una cepa de vacuna como se proporciona por la invención y especifica en las reivindicaciones generalmente no se reconoce por dichos anticuerpos.

Adicionalmente, la invención proporciona una cepa de vacuna de Streptococcus como se especifica en las reivindicaciones, cuya cepa comprende un mutante capaz de expresar un factor de virulencia o determinante antigénico de Streptococcus.

En una modalidad preferida, dicho factor de virulencia o determinante antigénico se selecciona de un grupo de componentes celulares, tales como la proteína liberada por muramidasa (MRP) factor extracelular (EF) y proteínas asociadas a la membrana de la célula, proteína de choque térmico de 60 kDA, proteína A de superficie neumocócica (Psp A), neumolisina, proteína C, proteína M, fimbrias, hemaglutininas y hemolisina o componentes funcionalmente relacionado a él.

En una modalidad mucho más preferida, la invención proporciona una cepa de vacuna de Streptococcus como se especifica en las reivindicaciones, cuya cepa comprende un mutante capaz de sobre-expresar dicho factor de virulencia. De esta manera, la invención proporciona una cepa de vacuna para la incorporación en una vacuna que específicamente causa un huésped para proporcionar una respuesta inmune dirigida contra determinantes de virulencia antigénicamente importantes (listados anteriormente), proporcionando de ese modo una protección específica dirigida contra dichos determinantes. La sobreexpresión por ejemplo se puede lograr por la clonación del gen implicado detrás de un promotor fuerte, que se expresa, por ejemplo constitucionalmente en un sistema multicopia, ya sea en un plásmido o mediante la integración en un genoma.

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En aún otra modalidad, la invención proporciona una cepa de vacuna de Streptococcus como se especifica en las reivindicaciones, que comprende un mutante capaz de expresar una proteína no de Streptococcus. Un vector-cepa de vacuna de Streptococcus de ese tipo permite, cuando se usa en una vacuna, la protección contra otros patógenos de Streptococcus

Debido a su carácter persistente, pero avirulento, una cepa de vacuna o mutante de Streptococcus como se proporciona por la invención es muy adecuada para generar una respuesta inmunitaria específica y de larga duración, no sólo contra los antígenos estreptocócicos, sino también contra otros antígenos cuando éstos se expresan por dicha cepa. Especialmente los antígenos derivados de otro patógeno se expresan ahora sin los efectos perjudiciales de dicho antígeno o patógeno que de cualquier otra forma habrían perjudicado el huésped

Un ejemplo de un vector de ese tipo es una cepa de vacuna o mutante de Streptococcus como se especifica en las reivindicaciones en donde dicho antígeno se deriva de un patógeno, tales como Actinobacillus pleuropneumonia, Mycoplasmatae, Bordetella, Pasteurella, E. coli, Salmonella, Campylobacter, Serpulina y otros.

La invención proporciona además una vacuna que comprende una cepa de vacuna o mutante de Streptococcus como se especifica en las reivindicaciones y que comprende además un portador o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los portadores o adyuvantes son bien conocidos en la técnica, ejemplos son solución salina regulada con fosfato, soluciones salinas fisiológicas, emulsiones de aceite en agua (doble), hidróxido de aluminio, Specol, bloqueadores o co-polímeros, y otros.

Una vacuna como se especifica en las reivindicaciones puede comprender una cepa de vacuna ya sea en una forma muerta

o viva. Por ejemplo, una vacuna muerta que comprende una cepa que tiene (sobre) expresa un antígeno estreptocócico o heterólogo o de factor de virulencia es muy adecuado para provocar una respuesta inmune. En una modalidad preferida, la invención proporciona una vacuna como se especifica en las reivindicaciones en donde dicha cepa está viva, debido a su carácter persistente, pero avirulento. Una cepa de la vacuna de Streptococcus que se especifica en las reivindicaciones es muy adecuada para generar respuestas inmunes específicas y de larga duración.

Ahora que una vacuna estreptocócica como se especifica en las reivindicaciones se proporciona por la invención, la invención proporciona además un método como se especifica además en las reivindicaciones para controlar o erradicar una enfermedad estreptocócica.

En una modalidad preferida, se proporciona un método para controlar o erradicar una enfermedad estreptocócica causada por Streptococcus suis que comprende probar una muestra, tal como una muestra de sangre, o exudado nasal o garganta, heces, orina, u otras muestras, tales como puede ser muestreada a o después del sacrificio, recogida de al menos un sujeto, tal como un bebé o un cerdo, en una población vacunada con una vacuna que se especifica en las reivindicaciones para la presencia de cepas de Streptococcus suis encapsulados. Ya que una cepa de vacuna o mutante de acuerdo con la invención no es patogénica, y puede distinguirse de las cepas silvestres mediante la expresión capsular, la detección de cepas estreptocócicas encapsuladas (completamente) indica que las infecciones silvestre todavía están presentes. Tales sujetos infectados con el silvestre pueden aislarse del resto de la población hasta que la infección ha desaparecido. Con los animales domésticos, tales como los cerdos, es aún posible eliminar en su conjunto seleccionando al sujeto infectado de la población. La detección de cepas silvestres se puede lograr a través de técnicas de cultivo tradicionales, o por técnicas de detección rápida, tales como la detección por PCR.

En aún otra modalidad, la invención proporciona un método para controlar o erradicar una enfermedad estreptocócica causada por Streptococcus suis que comprende probar una muestra recogida de al menos un sujeto en una población vacunada con una vacuna como se especifica en las reivindicaciones para la presencia de anticuerpos específicos a la cápsula dirigidos contra las cepas de Streptococcus suis. Los anticuerpos específicos a la cápsula se pueden detectar con técnicas clásicas conocidas en la técnica, tales como las usadas para tipificar o serotipificar el grupo de Lancefield.

Una modalidad mucho más preferida de un método proporcionado por la invención para controlar o erradicar una enfermedad estreptocócica causada por Streptococcus suis en una población vacunada con una vacuna como se especifica en las reivindicaciones que comprende probar una muestra recogida de al menos un sujeto en dicha población para la presencia de las cepas de Streptococcus suis encapsuladas y/o para la presencia de anticuerpos específicos a la cápsula dirigidos contra cepas de Streptococcus suis.

Se describe además un ensayo de diagnóstico para probar una muestra para el uso en un método de acuerdo con la invención que comprende al menos un medio para la detección de cepas estreptocócicas encapsuladas y/o para la detección de anticuerpos específicos a la cápsula dirigidos contra cepas estreptocócicas.

La descripción proporciona además una vacuna que comprende un antígeno de acuerdo con la invención y que comprende además un portador o adyuvante adecuado. La inmunogenicidad de un antígeno capsular por ejemplo, se aumenta por el enlace a un portador (tal como una proteína portadora), permitiendo el reclutamiento de células T de ayuda al desarrollar una respuesta inmune.

10 La descripción proporciona además un microorganismo recombinante proporcionado con al menos una parte de un agregado génico capsular derivado de Streptococcus suis. La descripción proporciona, por ejemplo, una bacteria de ácido láctico proporcionada con al menos una parte de un agregado génico capsular derivado de Streptococcus suis. Varias bacterias del ácido láctico de calidad alimentaria (Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus y Streptococcus

15 gordonii Plantarium) se han usado como sistemas de suministro para la inmunización de la mucosa. Se ha demostrado ahora que la administración oral (o mucosa) de L. lactis recombinante, Lactobacillus, y Streptococcus gordonii puede provocar respuestas locales de anticuerpo IgA y/o IgG para un antígeno expresado. Es deseable el uso de rutas orales para la inmunización contra las enfermedades infecciosas porque las vacunas orales son más fáciles de administrar, tienen mayores tasas de cumplimiento, y porque las superficies de las mucosas son las puertas de entrada para muchos agentes

20 microbianos patogénicos. Está dentro de la experiencia del artesano proporcionar dichos microorganismos con genes (adicionales).

La descripción proporciona además un mutante de Streptococcus suis recombinante proporcionado con un agregado génico capsular modificado. Está dentro de la experiencia del artesano intercambiar genes dentro de una especie. En un

25 aspecto preferido, un mutante de Streptococcus suis avirulento se selecciona para ser proporcionado con al menos una parte de un agregado génico capsular modificado de acuerdo con la descripción.

La descripción proporciona además una vacuna que comprende un microorganismo o un mutante proporcionado por la descripción. Una ventaja de una vacuna de ese tipo sobre las vacunas usadas actualmente es que comprenden

30 microorganismos definidos exactamente y antígenos bien caracterizados, lo que permite la determinación exacta de respuestas inmunológicas contra varios antígenos de elección. La invención se explica además en la parte experimental de esta descripción sin limitar la invención a ella.

Parte experimental

Materiales y Métodos

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

40 Las cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Las cepas S. suis se cultivaron en caldo Todd-Hewitt (código CM189, Oxoid), y sembraron en base de agar sangre Columbia (código CM331, Oxoid) que contiene 6% (v/v) de sangre de caballo. Las cepas E. coli se cultivaron en caldo Luria (28) y sembraron en caldo Luria que contiene 1.5% (p/v) de agar. Cuando se necesitó, se añadieron a las placas los antibióticos a las siguientes concentraciones: espectinomicina: 100 ug/ml para S. suis y 50 ug/ml para E. coli y ampicilina, 50 ug/ml.

45 Serotipificación. Las cepas de S.suis se serotipificaron por la prueba de aglutinación en lámina con anticuerpos serotipoespecíficos (44).

Técnicas de ADN. Las manipulaciones de ADN de rutina se realizaron como se describe por Sambrook y otros (36).

50 Actividad de fosfatasa alcalina. Para tamizar las fusiones de PhoA en E.coli, se construyeron bibliotecas de plásmido. Por lo tanto, el ADN cromosómico de S. suis tipo 2 se digirió con AluI. Los fragmentos de 300-500-pb se ligaron a pPHOS2 digerido con SmaI. Las mezclas de ligación se transformaron con la cepa PhoA-E. coli CC118. Los transformantes se sembraron en medio LB suplementado con 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP, 50 ug/ml, Boehringer, Mannheim,

55 Alemania). Las colonias azules se purificaron en placas nuevas de LB/BCIP para verificar el fenotipo azul.

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Análisis de secuencia de ADN. Las secuencias de ADN se determinaron en un Sistema de Secuenciación de ADN 373A (Applied Biosystems, Warrington, GB). Las muestras se prepararon por el uso de un kit de reacción listo para la secuenciación en ciclo con terminador colorante ABI /PRISM (Applied Biosystems). Los datos de secuenciación se ensamblaron y analizaron usando el programa MacMollyTetra. Los iniciadores de secuenciación hechos por encargo se adquirieron de Life Technologies. Los tramos hidrofóbicos dentro de las proteínas fueron previstos por el método de Klein y otros (17). El programa BLAST disponible en Netscape Navigator ™ se usó para buscar secuencias de proteínas relacionadas con las secuencias de aminoácidos deducidas.

Construcción de mutantes knock-out específicos a los genes de S. suis. Para construir las cepas mutantes 10cpsB y 10cpsEF electrotransformamos la cepa 10 del serotipo 2 patogénica (45, 49) de S. suis con pCPS11 y pCPS28 respectivamente. En estos plásmidos los genes de cpsB y cpsEF se alteraron por la inserción de un gen de resistencia a espectinomicina. Para crear pCPS11 el fragmento interno PstI-Bam HI de 400 pb del gen cpsB en pCPS7 se sustituyó por el gen SpcR. Para este propósito pCPS7 se digirió con PstIy BamHI y se ligó al fragmento PstI-BamHI de 1,200-bp, que contiene el gen SpcR, de pIC-spc. Para construir pCPS28 se usó pIC20R. En este plásmido se insertó el fragmento KpnI-SalI de pCPS17 (resultando en pCPS25) y el fragmento XbaI-ClaI de pCPS20 (resultando en pCPS27). pCPS27 se digirió con PstIy XhoI y se ligó al fragmento de PstI-XhoI de 1,200-bp, que contiene el gen SpcR de pIC-spc. La electrotransformación a

S. suis se llevó a cabo como se describe anteriormente (38).

Transferencia de Southern e hibridación. El ADN cromosómico se aisló como se describe por Sambrook y otros. (36). Los fragmentos de ADN se separaron en geles de 0.8% agarosa y se transfirieron a membranas Zeta-Probe GT (Bio-Rad) como se describe por Sambrook y otros (36). Las sondas de ADN se marcaron con [(-32p]dCTP (3000 Ci mmol-1; Amersham) mediante el uso de un kit de marcaje por cebado al azar (Boehringer). El ADN en las membranas se hibridizó a 65 °C con sondas de ADN adecuadas como se recomienda por el proveedor de las membranas Zeta-Probe. Después de la hibridación, las membranas se lavaron dos veces con una solución de 40 mM fosfato sódico, pH 7.2, 1 mM EDTA, 5 % SDS por 30 min a 65 °C y dos veces con una solución de 40 mM fosfato sódico, pH 7.2, 1 mM EDTA, 1 % SDS por 30 min a 65 °C.

PCR. Los iniciadores usados en la PCR decps2J corresponden a las posiciones 13791-13813 y 14465-14443 en el locus de

S. suis cps2. Las secuencias fueron: 5'-CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3' y 5'-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3'. Los iniciadores usados para la PCR de cps1I corresponden a las posiciones 4398-4417 y 4839-4821 en la secuencia de S. suis cps1. Las secuencias fueron: 5'-GGCGGTCTAGCAGATGCTCG-3' y 5'-GCGAACTGTTAGCAATGAC-3'. Los iniciadores usados en la PCR de cps9H corresponden a las posiciones 4406-4126 y 4494-4475 en la secuencia de S. suis cps9. Las secuencias fueron: 5'-GGCTACATATAATGGAAGCCC3' y 5'-CGGAAGTATCTGGGCTACTG-3'.

Construcción de mutantes knock-out específicos a los genes de S. suis. Para construir las cepas mutantes 10cpsB y 10cpsEF electrotransformamos la cepa 10 del serotipo 2 patogénica de S. suis con pCPS11 y pCPS28 respectivamente. En estos plásmidos los genes cpsB ycpsEF se alteraron por la inserción de un gen de resistencia a espectinomicina. Para crear pCPS11 el fragmento PstI-BamHI de 400 pb interno del gen cpsB en pCPS7 se sustituyó por el gen SpcR. Para este propósito pCPS7 se digirió con PstIy BamHI y se ligó al fragmento PstI-BamHI de 1,200-bp, que contiene el gen SpcR, de pIC-spc. Para construir pCPS28 se usó pIC20R. En este plásmido se insertó el fragmento KpnI-SalI de pCPS17 (resultando en pCPS25) y el fragmento XbaI-ClaI de pCPS20 (resultando en pCPS27). pCPS27 se digirió con PstIy XhoI y se ligó al fragmento de PstI-XhoI de 1,200-bp, que contiene el gen SpcR de pIC-spc. La electrotransformación de S. suis se llevó a cabo como se describió antes (38).

Ensayo de fagocitosis. Los ensayos de fagocitosis se realizaron como se describe por Leij y otros (23). En resumen, para opsonizar las células, 107 S. suis células se incubaron con 6% suero de cerdo SPF durante 30 minutos a 37 °C en un rotor de cabeza-sobre-cabeza a 6 rpm. 107 AM y 107 células opsonizadas de S. suis se combinaron y se incubaron a 37 °C bajo rotación continua a 6 rpm. A los 0, 30, 60 y 90 min, muestras de 1 ml se recogieron y mezclaron con 4 ml de EMEM helado para detener la fagocitosis. Los fagocitos se eliminaron por centrifugación durante 4 min a 110 x g y 4 °C. El número de unidades formadoras de colonias (ufc) en los sobrenadantes se determinó. Los experimentos de control se llevaron a cabo simultáneamente combinando 107células opsonizadas de S. suis con EMEM (sin AM).

Ensayos de destrucción. AM (107/ml) y células opsonizadas de S. suis (107/ml) se mezclaron 1 : 1 e incubaron durante 10 min a 37 °C bajo rotación continua a 6 rpm. EMEM helado se añadió para detener además la fagocitosis y destrucción. Para

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eliminar las células S. suis extracelulares se lavaron dos veces los fagocitos (4 min, 110 xg, 4 °C) y se resuspendieron en 5 ml de EMEM que contiene 6% suero SPF. Los tubos se incubaron a 37 °C bajo rotación a 6 rpm. Después de 0, 15, 30, 60 y 90 minutos, se recogieron las muestras y mezclaron con EMEM helado para detener además la destrucción. Las muestras se centrifugaron durante 4 min a 110 x g a 4 °C y las células fagocíticas se lisaron en EMEM que contiene 1% saponina durante 20 min a temperatura ambiente. Se determinó el número de ufc en las suspensiones.

Cerdos. Cerdos libres de gérmenes, cruces de Gran Yorkshire y Dutch Landrace, se obtuvieron de las cerdas, por cesárea. La cirugía se realizó en aisladores estériles de película flexible. Los cerdos se asignaron a los grupos, cada uno que consiste en 4 cerdos, y se alojaron en incubadoras estériles de acero inoxidable.

Infecciones experimentales. Los cerdos se inocularon por vía intranasal con S. suis tipo 2 como se describió antes Para predisponer a los cerdos para la infección con S. suis, cerdos de cinco días edad se inocularon por vía intranasal con aproximadamente 107ufc de la cepa Bordetella bronchiseptica 92932. Dos días después, los cerdos se inocularon por vía intranasal con S. suis tipo 2 (106 ufc). Los cerdos se controlaron dos veces al día para los signos clínicos de la enfermedad, tales como fiebre, signos nerviosos y cojera. Las muestras de sangre se recogieron tres veces a la semana de cada cerdo. Los glóbulos blancos se contaron con un contador de células. Para controlar la infección con S. suis y B. bronchiseptica y comprobar la ausencia de contaminantes, se recogieron exudados de nasofaringe y heces diariamente. Los exudados se sembraron directamente sobre agar Columbia que contiene 6% sangre de caballo. Después de tres semanas los cerdos se sacrificaron y examinaron para cambios patológicos. Las muestras de tejido del sistema nervioso central, serosas, y articulaciones se examinaron histológicamente y bacteriológicamente como se describió antes (45, 49). La colonización de serosas se marcó positivamente cuando S. suis se aisló del pericardio, pleura torácica o el peritoneo. La colonización de las articulaciones se marcó positivamente cuando S. suis se aisló de una o más articulaciones (se marcaron 12 articulaciones por animal).

Vacunación y reto

Los cerdos de una semana se vacunaron por vía intravenosa con una dosificación de 106 ufc de las cepas de S. suis 10cpsEF o 10cpsB. Tres semanas más tarde los cerdos se retaron por vía intravenosa con la cepa 10 serotipo 2 patogénica (107 ufc). El control de la enfermedad, los exámenes hematológicos, serológicos y bacteriológicos, así como exámenes post-mortum fueron como los descritos antes en las infecciones experimentales.

Microscopía Electrónica. Las bacterias se prepararon para la microscopía electrónica como se describe por Wagenaar y otros (50). En breve, las bacterias se mezclaron con agarosa MP (Boehringer) de 37 °C a una concentración de 0.7%. La mezcla se enfrió inmediatamente en hielo. Tras gelificar, las muestras se cortaron en láminas de 1 a 1.5 mm y se incubaron en un fijador que contiene 0.8% glutaraldehído y 0.8% tetraóxido de osmio. Posteriormente, las muestras se fijaron y tiñeron con acetato de uranilo por estimulación de microondas, deshidrataron y embebieron en resina eponaraldita. Las secciones ultra-delgadas se contrastaron con citrato de plomo y examinaron con un microscopio electrónico Philips CM 10 a 80 kV.

Aislamiento de los macrófagos alveolares porcinos (AM). AM porcinos se obtuvieron de los pulmones de cerdos libres de patógenos específicos (SPF). Se recogieron muestras de lavado de pulmón como se describe por van Leengoed y otros (43). Las células se suspendieron en EMEM que contiene 6% (v/v) de suero de cerdos SPF y se ajustaron a107 células por ml.

RESULTADOS

Identificación del locus de cps.

El locus cps locus de S. suis tipo 2 se identificó haciendo uso de una estrategia desarrollada para la identificación genética de las proteínas exportadas (13, 31). En este sistema hicimos uso de un plásmido (pPHOS2) que contiene un gen truncado de la fosfatasa alcalina (13). El gen carecía de la secuencia del promotor, el sitio de inicio de la traducción y la secuencia señal. El gen truncado se precede por un único sitio de restricción SmaI . ADN cromosómico de S. suis tipo 2, digerido con AluI, se clonó al azar en este sitio de restricción. Debido a que la translocación de PhoA a través de la membrana citoplasmática de E. coli se necesita para la actividad enzimática, el sistema se puede usar para seleccionar fragmentos de

S. suis que contienen una secuencia de promotor, un sitio de iniciación de la traducción y una secuencia señal funcional. Se probaron entre 560 clones individuales de E. coli, 16 mostraron un fenotipo azul oscuro cuando se sembraron en medios

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que contienen BCIP. El análisis de secuencia de ADN de los insertos a partir de varios de estos plásmidos se realizaron (resultados no mostrados) y se analizaron las secuencias de aminoácidos deducidas. El perfil de hidrofobicidad de uno de los clones (pPHOS7, resultados no mostrados) demostró que la parte N-terminal de la secuencia se asemejaba a las características de un péptido señal típico: una región corta N-terminal hidrofílica es seguido por una región hidrofóbica de 38 aminoácidos. Estos datos indican que el sistema phoA se usó con éxito para la selección de genes S. suis que codifican proteínas exportadas. Además, las secuencias se analizaron para las similitudes presentes en las bases de datos. La secuencia de pPHOS7 mostró una alta similitud (37% de identidad) con la proteína codificada por el gen cps14Cde Streptococcus pneumoniae (19). Esto sugiere fuertemente que pPHOS7 contiene una parte del operon cps de S. suis tipo 2.

Clonación de los genes cps flanqueantes. Para clonar los genes flanqueantes cps de S. suis tipo 2 el inserto de pPHOS7 se usó como una sonda para identificar los fragmentos de ADN cromosómico que contienen los genes flanqueantes cps. Un fragmento HindIII de 6-kb se identificó y clonó en pKUN19. Este produjo el clon pCPS6 (Fig. 1C). El análisis de secuencia del inserto de pCPS6 reveló que pCPS6 más probablemente contuvo el extremo 5 'del locus cps, pero todavía carece del extremo 3'. Por lo tanto, las secuencias de los extremos 3 'de pCPS6 se usan a su vez como una sonda para identificar los fragmentos cromosómicos que contienen secuencias cps localizadas además corriente abajo. Estos fragmentos se clonaron además en pKUN19, resultando en pCPS17. Usando el mismo sistema de paseo cromosómico posteriormente generamos los plásmidos, pCPS18 pCPS20, pCPS23 y pCPS26, que contienen la secuencia cps corriente abajo.

Análisis del operón cps. Se determinó la secuencia completa de nucleótidos de los fragmentos clonados (figura 4) El examen de la secuencia compilada reveló la presencia de al menos 13 marcos de lectura abierto (Orfs), potenciales que se designaron como Orf 2Y, Orf2X y Cps2A-Cps2K (Fig. 1A). Además, un 14to incompleto, Orf (Orf 2Z) se localizó en el extremo 5' de la secuencia. Se identificaron dos posibles secuencias promotoras. Uno se localizó 313 bp (lugares 1885-1865 y 1884-1889) corriente arriba de Orf2X. La otra secuencia promotora potencial se localizó 68 bp corriente arriba de Orf2Y (lugares 2241-2236 y 2216-2211). Orf2Y se expresa en orientación opuesta. Entre Orfs 2Y y 2Z la secuencia contenía una estructura tallo-lazo potencial, que puede actuar como un terminador de la transcripción. Cada Orf se precede por un sitio de unión al ribosoma y la mayoría de los Orfs se enlazan muy estrechamente. La única interrupción intergénica significativa se encontró entre Cps2G y Cps2H (389 nucleótidos). Sin embargo, no se encontraron en esta región secuencias promotoras potenciales obvias o estructuras de tallo-lazo. Estos datos sugieren que Orf2X y Cps2A-Cps2K se disponen como un operón.

Una visión general de todos los Orfs con sus propiedades se muestra en la Tabla 2. La mayoría de los productos génicos previstos se relaciona con las proteínas implicadas en la biosíntesis de polisacáridos. Orf2Z mostró cierta similitud con la proteína Yits de Bacillus subtilis. YitS se identificó durante el análisis de la secuencia del genoma completo de B. subtilis. La función de la proteína se desconoce.

Orf2Y mostró similitud con la proteína YcxD de B. subtilis (53). Basado en la similitud entre YcxD y MocR de Rhizobium meliloti (33), YcxD se sugirió que es una proteína reguladora.

Orf2X mostró similitud con las proteínas YAAA hipotéticas de Haemophilus influenzae y E. coli. La función de esas proteínas se desconoce.

Los productos génicos codificados por los genes cps2A, cps2B, cps2C ycps2D mostraron similitud aproximada con las proteínas CpsA, CpsC, CpsD y CpsB de varios serotipos de Streptococcus pneumoniae(19), respectivamente. Esto sugiere funciones similares para estas proteínas. Por lo tanto, Cps2A puede tener un papel en la regulación de la síntesis del polisacárido capsular. Cps2B y Cps2C se pueden implicar en la determinación de la longitud de la cadena de la cápsula de tipo 2 y Cps2C puede jugar un papel adicional en la exportación del polisacárido. La proteína Cps2D de S. suis se relaciona con la proteína CpsB de S. pneumoniae y con las proteínas codificadas por los genes de varias otras bacterias Grampositivas implicadas en la síntesis de polisacárido o de exopolisacáridos, pero su función se desconoce (19).

La proteína codificada por el gen cps2E mostró similitud a muchas proteínas bacterianas con actividades de glicosil transferasa: Cps14E y Cps19fE de los serotipos 14 y 19F (18, 19, 29) de S. pneumoniae, CpsE de Streptococcus salvarius (X94980) y CpsD de Streptococcus agalactiae (34). Recientemente, Kolkman y otros (18) mostraron Cps14E es una glucosil-1-fosfato transferasa que une la glucosa a un portador lípido, la primera etapa en la biosíntesis de la unidad de repetición tipo 14 de S. pneumoniae. Basado en estos datos una función similar se puede cumplir por Cps2E de S. suis.

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La proteína codificada por el gen cps2F mostró similitud con la proteína codificada por el gen rfbU de Salmonella enteritica. (25). Esta similitud es más pronunciada en las regiones C-terminal de estas proteínas. El gen rfbU se demostró que codifica la actividad manosiltransferasa (25).

El gen cps2G codificó una proteína que muestra similitud moderada con el producto génico rfbF de Campylobacter hyoilei (22), el producto génico epsF de S. thermophilus (40) y el producto génico capM de S. aureus (24). Sobre la base de la similitud de los genes rfbF, epsF y capM se sugiere codificar las actividades de la galactosiltransferasa. De ahí que, una actividad similar a glicosil transferasa podría ser cumplida por el producto génico cps2G.

El gen cps2H codifica una proteína que es similar a la región N-terminal del producto génico lgtD de Haemophilus influenzae (U32768). Además, los gráficos de hidrofobicidad de Cps2H y LgtD parecieron muy similares en estas regiones (datos no mostrados). Basado en la similitud de secuencia se sugirió que el producto génico lgtD tiene actividad glicosilo transferasa (U32768).

El producto génico codificado por el gen cps2I mostró alguna similitud con una proteína de Actinobacillus actinomycetemcomitans (AB002668). Esta proteína es parte de parte del agregado génico responsable del antígeno específico al serotipo b de A. actimycetemcomitans. La función de la proteína se desconoce.

Los productos génicos codificados por los genes cps2J y cps2K mostraron similitudes significativas con la proteína Cps14J de S. pneumoniae. El gen cps14J de S. pneumoniae mostró codificar una actividad β-1,4-galactosiltransferasa. En S. pneumoniae CpsJ es responsable de la adición de la cuarta (es decir, la última) azúcar en la síntesis del polisacárido de S. pneumoniae serotipo 14 (20). Aun algunas similitudes se encontraron entre Cps2J y Cps2K. 2, 25.5 % similitud). Esta similitud fue más pronunciada en las regiones N-terminal de las proteínas. Recientemente, dos pequeñas regiones conservadas se identificaron en el N-terminal de Cps14J y Cps14I y sus homólogos (20). Estas regiones fueron previstas que son importantes para la actividad catalítica. Ambas regiones, DXS y DXDD (Fig. 2), se encontraron también en Cps2J y Cps2K.

Distribución de los genes cps2 en otros serotipos S. suis. Para examinar la relación entre los genes cps2 y los genes cps en otros serotipos de S. suis, realizamos experimentos de hibridación cruzada. Los fragmentos de ADN de los genescps2individuales se amplificaron por PCR, marcaron con 32P, y usaron para sondear las membranas de Southern de ADN cromosómico de las cepas de referencia de 35 serotipos diferentes de S. suis. Se observaron grandes variaciones en los patrones de hibridación (Tabla 4). Como control positivo se usó una sonda específica para ARNr 16S. La sonda de ARNr 16S hibridizó con todos los serotipos probados. Sin embargo, ninguno de los otros genes probados fueron comunes en todos los serotipos. Basado en la organización genética de los genes sugerimos anteriormente que los genesorfX ycpsAcpsK son parte de un operón y que las proteínas codificadas por estos genes están todas implicadas en la biosíntesis de polisacárido. OrfY y OrfZ no son una parte de este operón, y su papel en la biosíntesis de polisacáridos no está clara. Basado en los datos de similitud de secuencias, OrfY se pueden implicar en la regulación de los genes cps2 Se propone que orfZ no está relacionado con la biosíntesis del polisacárido.

Las sondas específicas para los genes orfZ, orfY, orfX, cpsA, cpsB, cpsC y cpsD hibridan con la mayoría de los otros serotipos. Esto sugiere que la proteína codificada por estos genes no es de tipo-específica, pero puede realizar funciones más comunes en la biosíntesis del polisacárido capsular. Esto confirma los datos previos que mostraron que los genes cps2A-cps2D mostraron una fuerte similitud con los genes cps de varios serotipos de Streptococcus pneumoniae. Basado en esta similitud Cps2A es, posiblemente, una proteína reguladora, mientras que Cps2B y Cps2C pueden jugar un papel en la determinación de la longitud y la exportación del polisacárido. El gen cps2E hibridó con el ADN de los serotipos 1, 2, 14 y 1/2. El gen cps2E mostró una fuerte similitud con el gen cps14E de S. pneumoniae (18). Esta enzima demostró tener una actividad glucosil-1-fosfato y catalizó la transferencia de glucosa a un portador lipídico (18). Estos datos indican que una glicosiltransferasa estrechamente relacionada con Cps14E puede ser responsable de la primera etapa en la biosíntesis del polisacárido en los serotipos 1, 2, 14 y 1/2 de S. suis. Los genes cps2F, cps2G, cps2H, cps2I y cps2J hibridaron sólo con el ADN cromosómico de los serotipos 2 y 1/2. El gencps2G mostró una señal de hibridación débil adicional con el ADN del serotipo 34. En las pruebas de aglutinación el serotipo 1/2 mostró aglutinación con sueros específicos para el serotipo 2, así como con sueros específicos para el serotipo 1. Esto sugiere que el serotipo 1/2 comparte determinantes antigénicos tanto con los tipos 1 como 2. Los datos de hibridación confirmaron estos datos Todas las glicosiltransferasas putativas presentes en el serotipo 2, están presentes además en el serotipo 1/2. El gen cps2K mostró un patrón de hibridación similar como el

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gen cps2E. Se observó la hibridación con el ADN de los serotipos 1, 2, 14 y 1/2 En conjunto estos datos de la hibridación muestran que el agregado génico cps2 se puede dividir en tres regiones: una región central que contiene los genes tipoespecíficos se flanquea por dos regiones que contienen genes comunes para varios serotipos.

Clonación de los genes cps tipo-específicos de los serotipos 1 y 9. Para clonar los genes cps tipo-específico de S. suis serotipo 1 usamos el gen cps2E como una sonda para identificar los fragmentos de ADN cromosómico de tipo 1, que contienen genes cps flanqueantes. Un fragmento EcoRV de 5 kb se identificó y clonó en pKUN19. Esto produjo pCPS1-1 (Figura 1B). Este fragmento se usó a su vez como una sonda para identificar un fragmento HindIII de superposición de 2.2 kb. pKUN19 que contiene este fragmento HindIII se designó pCPS1-2. La misma estrategia se siguió para identificar y clonar los genes cps tipo-específico del serotipo 9. En este caso, usamos los genes cps2D como una sonda. Un fragmento HindIII-XbaI de 0.8 kb se identificó y clonó, produciendo pCPS9-1 (Figura. 1C). Este fragmento se usó a su vez como una sonda para identificar un fragmento XbaI de 4 kb. pKUN19 que contiene este fragmento XbaI 4 kb se designó pCPS9-2.

Análisis de los genes cps1 clonados. La secuencia de nucleótidos completa de los insertos de pCPS1-1 y pCPS1-2 se determinó (figura 5) El examen de la secuencia reveló la presencia de cinco Orfs completos y dos incompletos (Figura 1B). Cada Orf se precede por un sitio de unión al ribosoma. De acuerdo con los datos obtenidos para los genes cps2del serotipo 2, la mayoría de los Orf se enlaza muy estrechamente. Se encontró la única interrupción significativa (718 pb) entre Cps1G y Cps1H. No se pudieron encontrar secuencias promotoras evidentes o estructuras de tallo-lazo potenciales en esta región. Esto sugiere que, como en el serotipo 2, los genes cps en el serotipo 1 se disponen en un operón.

Una visión general de los Orfs y sus propiedades se muestra en la Tabla 2 Como era de esperar sobre la base de los datos de la hibridación (Tabla 4), la proteína codificada por el gen cps1E se relaciona con Cps2E de S. suis tipo 2 (identidad de 86 %). El fragmento clonado en pCPS1-1 careció de la región codificante para los primeros 7 aminoácidos del gencps1E.

La proteína codificada por los genescps1F ycps1G mostró fuerte similitud con las proteínas Cps14F y Cps14G de Streptococcus pneumoniae serotipo 14, respectivamente (20). La función del Cps14F no está completamente clara, pero se ha sugerido que Cps14F puede mejorar el papel de la actividad glicosiltransferasa. El gen cps14G gene de S. pneumoniae se mostró para codificar la actividad ß-1,4-galactosiltransferasa. En el S. pneumoniae tipo 14 se necesita esta actividad para la segunda etapa en la biosíntesis de la subunidad de oligosacáridos (20). Basado en los datos de similitud encontraron la glicosiltransferasa similar y actividades que mejoran que se sugieren para los genes cps 1G ycps1F de S. suis tipo 1.

La proteína codificada por el gen cps1H mostró similitud con la proteína Cps14H de S. pneumoniae (20). Basado en la similitud de secuencia Cps14H se propuso para ser la polimerasa del polisacárido (20).

La proteína codificada por el gen cps1I mostró cierta similitud con la proteína Cps14J de S. pneumoniae (19). El gen cps14J se mostró para codificar una actividad β-1,4-galactosiltransferasa, responsable de la adición de la cuarta (es decir, la última) de azúcar en la síntesis del polisacárido del serotipo 14 de S. pneumoniae.

Entre Cps1G y Cps1H se encontró una interrupción de 718 pb. Esta región reveló tres pequeños Orfs Los tres Orfs se expresaron en tres marcos de lectura diferentes y no se precedieron por los sitios de unión al ribosoma potenciales, ni contenían los sitios de inicio potenciales. Sin embargo, los tres productos génicos potenciales codificadas por esta región mostraron alguna similitud con tres regiones sucesivas de la parte C-terminal de la proteína de EpsK de Streptococcus thermophilus (27 % identidad, 40). La región relacionada con los primeros 82 aminoácidos falta.

Análisis de los genes cps9 clonados. Determinamos además la secuencia de nucleótidos completa de los insertos de pCPS9-1 y pCPS9-2 (Figura 6). El examen de la secuencia reveló la presencia de tres Orfs completos y dos incompletos (Figura 1C). Al igual que en los serotipos 1 y 2, todos los Orfs se precedieron por un sitio de unión de ribosomas y están muy estrechamente acoplados. Como se sugirió por los datos de la hibridación (Tabla 4) las proteínas Cps2D y Cps9D se relacionaron altamente (Tabla 2). Basado en las comparaciones de secuencias pCPS9-1 careció de los primeros 27 aminoácidos de la proteína Cps9D.

La proteína codificada por el gen cps9E mostró cierta similitud con la proteína CapD de Staphylococcus aureus serotipo 1 (24). Basado en los datos de similitud de secuencias la proteína Cap1D se sugirió para ser una epimerasa o una deshidratasa implicada en la síntesis de N-acetilfructosamina o N-acetilgalactosamina (63).

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Cps9F mostró cierta similitud con las proteínas CapM de S. aureusserotipos 5 y 8 (61, 64, 65). Basado en datos de similitud de secuencia Cap5M y Cap8M se proponen para ser glicosiltransferasas (63).

La proteína codificada por el gencps9G mostró cierta similitud con una proteína de Actinobacillus actinomycetemcomitans (AB002668_4). Esta proteína es parte de un agregado génico responsable de los antígenos específicos del serotipo b de Actinobacillus actinomycetemcomitans. La función de la proteína se desconoce.

La proteína codificada por el gen cps9H mostró cierta similitud con el gen rfbB de Yersinia enterolitica (68). La proteína RfbB demostró ser esencial para la síntesis de O-antígeno, pero la función de la proteína en la síntesis del O:3 lipopolisacárido se desconoce.

Genes cps específico a serotipo 1 y serotipo 9. Para determinar si los fragmentos clonados en pCPS1-1, pCPS1-2, pCPS9-1 y pCPS9-2 contenían los genes tipo-específicos para el serotipo 1 y 9, respectivamente, se realizaron experimentos de hibridación cruzada. Los fragmentos de ADN de los genes individuales cps1 y cps9 se amplificaron por PCR, marcaron con 32P, y usaron para sondear las membranas de Southern de ADN cromosómico de las cepas de referencia de los 35 serotipos diferentes de S. suis. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Basado en los datos obtenidos con la sonda cps2E (Tabla 4), la sonda cps1E se esperó hibridar con el ADN cromosómico de los serotipos 1,2, 14, 27 y 1/2 de S. suis. Las sondas cps1H, cps9E y cps9F hibridaron con la mayoría de los otros serotipos. Sin embargo, las sondas cps1F y cps1G y cps1I hibridaron sólo con el ADN cromosómico de los serotipos 1 y 14. Las sondas cps9G y cps9H hibridaron sólo con el serotipo 9. Estos datos sugieren que las sondas cps9G y cps9H son específicas para el serotipo 9 y, por tanto, pueden ser herramientas útiles para el desarrollo de pruebas de diagnóstico rápidas y sensibles para infecciones de S. suis tipo 9.

PCR tipo específico. Hasta ahora, las sondas se probaron sólo en las 35 cepas de referencia diferentes. Para probar el valor diagnóstico de las sondas cps tipo-específicas, se usaron varios otros serotipos 1, 2, 1/2, 9 y 14 de las cepas de S. suis. Además, dado que un método basado en la PCR puede ser aun más rápido y sensible que una prueba de hibridación, probamos si puede usarse una PCR para la serotipificación de las cepas de S. suis. Los conjuntos de iniciadores de oligonucleótidos se eligieron dentro de los genescps2J, cps1I ycps9H. Se esperaron fragmentos amplificados de 675 pb, 380 pb y 390 pb, respectivamente. Los resultados muestran que se amplificaron fragmentos de 675 bp en cepas de tipo 2 y 1/2 usando los iniciadores cps2J; se amplificaron fragmentos de 380 bp en cepas de tipo 1 y 14 usando los iniciadores cps1I y se amplificaron fragmentos de 390 bp en cepas de tipo 9 usando los iniciadores cps9H.

Construcción de mutantes deficientes en la producción de cápsula. Para evaluar el papel de la cápsula de S. suis tipo 2 en la patogénesis, construimos dos mutantes isogénicos en el que se alteró la producción de la cápsula. Para construir el mutante se usó 10cpsB, pCPS11. En este plásmido una parte del gen cps2B se sustituyó por el gen de resistencia a espectinomicina. Para construir la cepa mutante 10cpsEF se usó el plásmido pCPS28. En pCPS28 el extremo 3' del gen cps2E así como el extremo 5' del gen cps2F se sustituyeron por el gen de resistencia a espectinomicina. pCPS11 y pCPS28 se usaron para electrotransformar la cepa 10 de S. suis tipo 2 y las colonias resistentes a espectomicina. Los experimentos de transferencia de Southern e hibridación se usaron para seleccionar el doble cruzamiento en los eventos de integración (resultados no mostrados). Para probar si se alteró la estructura capsular de las cepas 10cpsB y 10cpsEF, usamos una prueba de aglutinación en lámina con una suspensión de las cepas mutantes en suero hiperinmune anti-S. suis tipo 2 (44). Los resultados mostraron que aun en ausencia de antisueros específicos de serotipo, las bacterias aglutinaron. Esto indica que en las cepas mutantes, se alteró la estructura capsular. Para confirmar esto, secciones delgadas de las cepas silvestres y mutantes se compararon mediante microscopía electrónica. Los resultados mostraron que en comparación con el tipo silvestre (Fig. 3A) la cantidad de la cápsula producida por las cepas mutantes se redujo en gran medida (Figuras. y 3C 3B). Casi ningún material capsular pudo detectarse en la superficie de las cepas mutantes.

Los mutantes capsulares son sensibles a la fagocitosis y destrucción por macrófagos alveolares porcinos (PAM).

Los mutantes capsulares se probaron para su capacidad de resistir la fagocitosis por PAM en presencia de suero SPF porcino. La cepa silvestre 10 parece que es resistente a la fagocitosis bajo estas condiciones (Fig. 4A). A diferencia, las cepas mutantes se ingirieron eficientemente por los macrófagos (Fig. 4A). Después de 90 min. más de 99.7% (cepa 10cpsB) y 99.8% (cepa 10cpsEF) de las células mutantes se ingirieron por los macrófagos. Además, como se muestra en la Fig. 4B las cepas ingeridas se destruyeron eficientemente por los macrófagos. 90-98 % de todas las células se destruyeron dentro

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de los 90 min. Ninguna diferencia se pudo observar entre las cepas silvestre y mutante. Estos datos indican que la cápsula de S. suis tipo 2 protege eficazmente el organismo a partir de la captación in vitro por los macrófagos.

Los mutantes capsulares son menos virulentos para los lechones libres de gérmenes. Las propiedades de virulencia de las cepas silvestre y mutante se probaron después de la infección experimental de cerdos recién nacidos libres de gérmenes (45, 49). La Tabla 1 muestra que los signos específicos y no específicos de la enfermedad se pueden observar en todos los cerdos inoculados con la cepa silvestre. Además, todos los cerdos inoculados con la cepa silvestre murieron durante el curso del experimento o se destruyeron a causa de una enfermedad grave o trastornos nerviosos (Tabla 3). A diferencia, los cerdos inoculados con las cepas 10cpsB y 10cpsEF no mostraron signos específicos de enfermedad y todos los cerdos sobrevivieron hasta el final del experimento La temperatura de los cerdos inoculados con la cepa silvestre aumentó 2 días después de la inoculación y permaneció alta hasta el día 5 (Tabla 3). La temperatura de los cerdos inoculados con las cepas mutantes algunas veces superó los 40 °C, sin embargo, pudimos observar diferencias significativas en el índice de la fiebre [es decir el % de las observaciones en un grupo experimental durante el cual los cerdos mostraron fiebre (>40 °C)] entre cerdos inoculados con cepas silvestre y mutante. Todos los cerdos mostraron números de leucocitos polimorfonucleares (PML) (>10 x 109 PML por litro) aumentados (Tabla 3). Sin embargo, en los cerdos inoculados con las cepas mutantes el porcentaje de muestras con números de PML aumentados fue considerablemente inferior. Las cepas de S. suis y B. bronchiseptica se pueden aislar de muestras de exudados nasofaríngeos y heces de todos los cerdos a partir del día 1 post-infección hasta el final del experimento (Tabla 3). Postmortem, la cepa silvestre se pudo aislar frecuentemente del sistema nervioso central (SNC), riñones, corazón, hígado, bazo, serosas, articulaciones y amígdalas. Las cepas mutantes se pueden fácilmente recuperar a partir de las amígdalas, pero nunca se recuperaron a partir del riñón, hígado o bazo. Curiosamente, un número bajo de las cepas mutantes se aislaron del CNS, la serosa, las articulaciones, los pulmones y el corazón. En conjunto, estos datos indican fuertemente que las cepas mutantes de S. suis, deficientes en la producción de cápsula, no son virulentas para los cerdos jóvenes libres de gérmenes.

Describimos la identificación y la caracterización molecular del locus cps, implicado en la biosíntesis del polisacárido capsular, de S. suis. La mayoría de los genes parecen que pertenecen a una sola unidad de transcripción, lo que sugiere un control coordinado de estos genes. Le asignamos funciones a la mayoría de los productos génicos. De ese modo, identificamos regiones implicadas en la regulación (Cps2A), determinación de la longitud de cadena (Cps2B, C), exportación (Cps2C) y biosíntesis (Cps2E, F, G, H, J, K). La región implicada en la biosíntesis se localiza en el centro del agregado de genes y está flanqueado por dos regiones que contienen genes con funciones más comunes. El gen incompleto orf2Z se localizó en el extremo 5' del fragmento clonado. Orf2Z mostró cierta similitud con la proteína YitS de B.subtilis. Sin embargo, debido a que la función de la proteína Yits se desconoce esto no nos dio ninguna información sobre la posible función de Orf2Z. Debido a que el gen orf2Z no es parte del operón cps, no se espera un papel de este gen en la biosíntesis de polisacáridos. La proteína Orf2Y mostró cierta similitud con la proteína YcxD de B.subtilis (53). La proteína YcxD se sugirió que es una proteína reguladora. Del mismo modo, Orf2Y puede involucrarse en la regulación de la biosíntesis de polisacáridos. La proteína Orf2X mostró similitud con las proteínas YAAA de H. influenzae y E. coli. Se desconoce la función de estas proteínas. En S. suis tipo 2 el gen orf2X parece que es el primer gen en el operón cps2. Esto sugiere un papel de Orf2X en la biosíntesis de polisacáridos. En H. influenzae y E. coli, sin embargo estas proteínas no se asocian con los agregados de genes capsulares. El análisis de mutantes isogénicos deficientes de la expresión de Orf2X debe permitir comprender mejor el papel presuntivo de Orf2X en la biosíntesis de polisacáridos de S. suis tipo 2.

Los productos génicos codificados por los genes cps2E, cps2F, cps2G, cps2H, cps2J y cps2K mostraron poca similitud con las glicosiltransferasas de diversas bacterias Gram-positivas o Gram-negativas (18, 19, 20, 22, 25). El producto génico cps2E muestra cierta similitud con la proteína Cps14E de S. pneumoniae (18, 19). Cps14E es una glucosil-1-fosfato transferasa que une la glucosa a un portador lipídico (18). En S. pneumoniae esta es la primera etapa de la biosíntesis de la unidad de repetición del oligosacárido. La estructura de la cápsula de S. suis serotipo 2 contiene glucosa, galactosa, ramnosa, N-acetilglucosamina y ácido siálico en una relación de 3:1:1:1:1 (7). Basado en estos datos concluimos que Cps2E de S. suis tiene actividad glucosiltransferasa, y está implicada en el enlace de la primera azúcar al portador lipídico.

La región C-terminal del producto génico cps2F mostró cierta similitud con la RfbU de Salmonella enteritica. RfbU mostró que tiene actividad manosiltransferasa (24). Debido a que el manosilo no es un componente del polisácarido de S. suis tipo 2, no se espera una actividad manosiltransfererasa en este organismo. No obstante, cps2F codifica una glicosiltransferasa con otra especificación de azúcar.

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Cps2G mostró similitud moderada con una familia de productos génicos sugeridos para codificar las actividades de galactosiltransferasa (22, 24, 40). Por lo tanto una actividad similar se muestra para Cps2G. Cps2H mostró cierta similitud con LgtD de H. influenzae (U32768). Debido a que LgtD se propuso tener actividad glicosiltransferasa, una actividad similar se cumple por Cps2H. Cps2J y Cps2K mostraron similitud con Cps14J de S. pneumoniae (20). Cps2J mostró similitud con Cps14I de S. pneumoniae también. Cps14I mostró tener actividad N-acetilglucosaminiltransferasa, mientras que Cps14J tiene una actividad ß-1,4-galactosiltransferasa (20). En S. pneumoniae Cps14I es responsable por la adición del tercer azúcar y Cps14J por la adición del último azúcar en la síntesis de la unidad de repetición tipo 14 (20). Debido a que la cápsula de S. suis tipo 2 contiene galactosa así como componentes de N-acetil glucosamina, galactosiltransferasa así como N-acetil glucoaminiltransferasa se pueden prever las actividades de los productos génicos cps2J y cps2K, respectivamente. Como se observó para Cps14I y Cps14J, el N-terminal de Cps2J y Cps2K mostró un grado significativo de similitud de secuencia. Dentro de los dominios N-terminal de Cps14I y Cps14J, dos regiones pequeñas se identificaron, las que se conservaron además en otras diversas glicosiltransferasas (22). Dentro de estas dos regiones, dos residuos Asp se propusieron que eran importantes para la actividad catalítica. Las dos regiones conservadas, DXS y DXDD, se encontraron además en Cps2J y Cps2K. La función de Cps2I sigue siendo poco claro. Cps2I mostró cierta similitud con una proteína de A. actinomycetemcomitans. Aunque esta proteína es parte del agregado génico responsable por los antígenos específicos al serotipo-B, se desconoce la función de la proteína. Describimos además la identificación y caracterización de los genes específicos de cps para S. suis serotipos 1, 2 y 9. Después el locus cps2entero de S. suis serotipo 2 se clonó y caracterizó, las funciones para la mayoría de los productos génicos cps2 se pueden asignar por homologías de secuencias. Basado en los datos las actividades glicosiltransferasa, requeridas para la especificidad de tipo, se pueden ubicar en el centro del operón. Experimentos de hibridación cruzada, usando los genes individuales de cps2 como sondas en los ADN cromosómicos de los 35 serotipos diferentes, confirmaron esta idea. Las regiones que contienen los genes tipo-específicos de los serotipos 1 y 9 se pueden clonar y caracterizar, mostrando que existe una organización genética idéntica de los operones cps de otros serotipos de S. suis. Los genes cps1E, cps1F, cps1G, cps1H, y cps1I revelaron una similitud sorprendente con los genes cps14 E, cps14F, cps14G, cps14H y cps14J de S. pneumoniae. Interesantemente, S. pneumoniae serotipo 14 es el serotipo más comúnmente asociado con las infecciones neumocócicas en niños pequeños (54), mientras que las cepas de S. suis serotipo 1 son las más comúnmente aisladas de lechones de menos de 8 semanas (46). En S. pneumoniae loscps14E, cps14G, cps14I y cps14J codifican las glicosiltransferasas requeridas para la síntesis de la unidad de repetición tetramérica tipo 14, mostrando que los genes cps1E, cps1G y cps1I codificaban las glicosiltransferasas. Las funciones precisas de estos genes, así como las especificidades del sustrato de las enzimas se pueden establecer En S. pneumoniae el gen cps14E se mostró que codifica una glucosil-1-fosfato transferasa que cataliza la transferencia de glucosa a un portador lipídico. Además, genes de tipo cpsE se encontraron en S. pneumoniae serotipos 9N, 13, 14, 15B, 15C, 18F, 18A y 19F (60). Mutantes CpsE se construyeron en los serotipos 9N, 13, 14 y 15B. Todas las cepas mutantes carecieron de actividad glucosiltransferasa (60). Además, en todos estos serotipos de S. pneumoniae el gen cpsE parece que es el responsable de la adición de glucosa al portador lipídico. Basado en los datos sugerimos que en S. suis tipo 1 el gen cps1E puede cumplir una función similar. La estructura de la cápsula S. suis tipo 1 se desconoce, pero está compuesta por glucosa, galactosa, N-acetilglucosamina, Nacetilgalactosamina y ácido siálico en una relación de 1: 2.4: 1: 1:1.4 (5). Por lo tanto, se puede fácilmente prever el papel de una actividad glucosiltransferasa de tipo-cpsE. Secuencias de tipo CpsE se encontraron además en serotipos 2, 1/2 y

14. Para la biosíntesis de polisacáridos en S. pneumoniae tipo 14, la transferencia del segundo azúcar de la unidad de repetición al primer azúcar unido a lípido se realiza por los productos génicos de cps14F y cps14G (20). Similar a Cps14F y Cps14G, las proteínas de S. suis tipo 1 Cps1F y Cps1G pueden actuar como una glicosiltransferasa que realiza la misma reacción. Cps14F y Cps14G de S. pneumoniae mostraron similitud con la mitad N-terminal y mitad C-terminal de la proteína SpsK de Sphingomonas(20, 67), respectivamente. Esto sugiere una función combinada para ambas proteínas. Además, secuencias de tipo cps14F y cps14G se encontraron en diversos serotipos de S. pneumoniae y estos genes parecen que siempre existen juntos (60). Lo mismo se observó para S. suis tipo 1. Las sondas cps1F y cps1G hibridaron con cepas tipo 1 y tipo 14. De acuerdo con la similitud encontrada entre el gen cps1H y el gen cps14H de S. pneumoniae (20), cps1H se espera que codifica una polimerasa de polisacárido. La proteína codificada por el gen cps1I mostró cierta similitud con la proteína Cps14J de S. pneumoniae (19). El gen cps14J se mostró que codifica una actividad β-1,4-galactosiltransferasa, responsable por la adición del cuarto es decir último) azúcar en la síntesis del polisacárido S. pneumoniae serotipo 14. En S. suis tipo 2 las proteínas codificadas por los genescps2J y cps2K mostraron similitud con la proteína Cps14J. Sin embargo, no se encontraron homologías significativas

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entre Cps2J, Cps2K y Cps1I. En las regiones N-terminal de Cps14J y Cps14I se identificaron dos regiones conservadas pequeñas, DXS y DXDD (19). Estas regiones parecen que son importantes para la actividad catalítica (13). En las mismas posiciones de la secuencia Cps2I se contuvieron las regiones DXS y DXED. En la región entre Cps1G y Cps1H se identificaron tres Orfs pequeños. Ya que los Orfs se expresaron en tres fragmentos de lectura diferentes, y no contenían sitios de inicio potenciales, no se esperó la expresión. Sin embargo, tres productos génicos potenciales codificados por esta región mostraron cierta similitud con tres regiones sucesivas de la parte C-terminal de la proteína EpsK de Streptococcus thermophilus (27 % de identidad, 40). La región relacionada con los primeros 82 aminoácidos está desprovista. La proteína Epsk se sugirió que juega un papel en la exportación del exopolisacárido produciendo el exopolisacárido polimerizado más hidrófobo a través de una modificación de lípido. Estos datos pueden sugerir que las secuencias en la región entre Cps1G y Cps1H se originaron a partir de la secuencia de tipo epsK. Los experimentos de hibridación mostraron que esta región de tipo epsk se presenta además en otras cepas de serotipo 1 así como en las cepas de serotipo 14 (resultados no mostrados). La función de la mayoría de los genes serotipo 9 clonados se puede establecer. Basado en los datos de similitud de secuencia los genes cps9E y cps9Fpueden ser glicosiltransferasas (61, 24, 63, 64, 65). Además, los genescps9G y cps9H mostraron similitud con los genes ubicados en la región implicada en la biosíntesis del polisacárido, pero se desconoce la función de estos genes (68). Los experimentos de hibridación cruzada usando los genes individuales cps2, cps1y cps9 como sondas mostraron que las sondas cps9G y cps9H hidridaron específicamente con las cepas de serotipo 9. Por lo tanto, estos son útiles como herramientas para la identificación de cepas S. suis tipo 9 tanto para propósitos de diagnóstico así como en estudios epidemiológicos y de transmisión. Previamente desarrollamos un método de PCR que puede usarse para detectar cepas S. suis en exudados nasales y de amígdalas de cerdos (62). El método se usó para identificar por ejemplo cepas patogénicas (EF-positiva) de S. suis serotipo 2 Durante los últimos años, cepas de S. suis tipo 2 junto con cepas serotipo 9 se aíslan frecuentemente de los órganos de cerdos enfermos. Sin embargo, hasta ahora una prueba de diagnóstico rápido y sensible no estuvo disponible para las cepas de tipo 9. Por lo tanto, las sondas específicas al tipo 9 o el PCR específico al tipo 9 es de gran valor diagnóstico. Las sondas cps1F, cps1G y cps1I hibridaron con las cepas del serotipo 1 así como con el serotipo

14. En las pruebas de coaglutinación las cepas de tipo 1 reaccionan con el antisuero anti-tipo 1 así como con el antisuero anti-tipo 14 (56). Esto sugiere la presencia de epitopos comunes entre estos serotipos. Por otra parte, las cepas tipo 1 aglutinaron sólo con el suero anti-tipo 1 (56,57), indicando que es posible detectar diferencias entre esos serotipos. Las sondas cps2F, cps2G, cps2H, cps2I y cps2J hibridaron sólo con los serotipos 2 y 1/2. El serotipo 34 mostró una señal débil de hibridación con la sonda cps2G. Como se mostró en las pruebas de aglutinación las cepas tipo 1/2 reaccionan con el suero dirigido contra el tipo 1 así como con el suero dirigido contra las cepas tipo 2 (46). Por lo tanto, el tipo 1/2 compartió antígenos tanto con el tipo 1 como el 2. Basado en los patrones de hibridación de las cepas del serotipo 1/2 con los genes específicos cps1 y cps2, el serotipo 1/2 parece que está más estrechamente relacionado con las cepas de tipo 2 que con las cepas de tipo 1. En nuestros estudios actuales, identificamos genes, iniciadores o sondas específicos de tipo que se usan para la discriminación de serotipos 1, 14 y 2 y 1/2 y aun otros de los 35 serotipos conocidos. Además, genes, iniciadores o sondas de tipo específico se pueden desarrollar ahora fácilmente para serotipos aún desconocidos, una vez que estén aislados. Clonación y caracterización de una parte adicional del locus cps2. Basado en la secuencia establecida de 11 genes, denominados cps2L a cps2T, orf2U y orf2V, se identificaron. Un gen homólogo a los genes implicados en la polimerización de la unidad de repetición de oligosacárido (cps2O), así como genes implicados en la síntesis en la síntesis del ácido siálico (cps2P a cps2T) se identificaron. Además, los experimentos de hibridación mostraron que los genes implicados en la síntesis del ácido siálico están presentes en S. suis serotipo 1, 2, 14, 27 y 1/2. Las regiones "cps2M" y "cps2N" mostraron similitud con las proteínas implicadas en la biosíntesis del polisacárido de otras bacterias gram-positiva. Sin embargo, estas regiones parecen estar truncadas o fueron no-funcionales como resultado de mutaciones puntuales o de cambio del marco. En su extremo 3' el locus cps2 contuvo dos elementos insercionales ("orf2U" y "orf2V") que parecen ser no-funcionales. Para clonar la parte restante del locus cps2, secuencias del extremo 3' de pCPS26 (Fig. 1C) se usaron para identificar un fragmento cromosómico que contiene secuencias de cps2 ubicadas corriente abajo. Este fragmento se clonó en pKUN19 resultando en pCPS29. Usando un enfoque similar posteriormente aislamos los plásmidos pCPS30 y pCPS34 que contienen secuencias de cps2 corriente abajo (Fig. 1C). Análisis del operón de cps2. Se determinó la secuencia completa de nucleótidos de los fragmentos clonados. El examen de la secuencia compilada reveló la presencia de : una secuencia que codifica la parte C-terminal de Cps2K, seis genes aparentemente funcionales (denominados cps2O-cps2T) y los restos de 5 genes ancestrales diferentes (denominados "cps2L", "cps2M", "cps2N", "orf2U" y "orf2V"). Los últimos genes parecen estar truncados o incompletos como resultado de la presencia de mutaciones

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en los codones de parada o cambio del marco (Fig. 1A). Ni secuencias promotoras potenciales ni estructuras de tallo-lazo potenciales pueden identificarse dentro de la región secuenciada. Un sitio de unión a ribosoma precede a cada ORF y la mayoría de los ORF están muy estrechamente unidos. Tres interrupciones intergénicas se encontraron: una entre "cps2M" y "cps2N" (176 nucleótidos), una entre cps2O y cps2P (525 nucleótidos), y una entre cps2T y "orf2U" (200 nucleótidos). Estos datos y los nuestros anteriormente muestran que Orf2X y Cps2A-Orf2T son parte de una operón simple. Una lista de todos los loci y sus propiedades se muestra en la Tabla 4. La región "cps2L" contuvo tres ORF potenciales, de los aminoácidos 103, 79 y 152, respectivamente, que sólo se separaron uno de otro por codones de parada. Sólo el primer ORF está precedido por un sitio de unión ribosomal potencial y contiene un codón inicial de metionina. Esto sugiere que "cps2L" se origina a partir de un gen ancestral cps2L, que codifica para una proteína de 339 aminoácidos. La función de esta proteína hipotética Cps2L sigue siendo poco claro hasta ahora: no se encontraron homologías significativas entre Cps2L y las proteínas presentes en las genotecas de datos. No está claro si el primer ORF de la región "cps2L" se expresa en una proteína de 103 aminoácidos. La región "cps2M" mostró homología con la N-terminal de 134 aminoácidos de las proteínas NeuA de Streptococcus agalactiae y Escherichia coli (AB017355, 32). Sin embargo, aunque la región "cps2 M" contuvo un sitio de unión al ribosoma potencial, se ausentó un codón de inicio de metionina. Comparada con la secuencia de S. agalactiae, el codón de inicio ATG se reemplazó por un codón AAG que codifica la lisina. Además, la región homóloga a los primeros 58 aminoácidos de la NeuA de S. agalactiae (identidad 77 %) se separó de la región homóloga a los aminoácidos 59-134 de NeuA con una secuencia de ADN repetida de 100 pb (ver después). Adicionalmente, la región homóloga a los aminoácidos 59 a 95 de NeuA (identidad 32%) y la región homóloga a los aminoácidos 96 a 134 de NeuA (identidad 50%) se presentaron en diferentes marcos de lectura. Por lo tanto, el homólogo de NeuA parcial y truncado es probablemente no funcional en S. suis. La región "cps2N" mostró homología con CpsJ de S. agalactiae (núm. de acceso AB017355). Sin embargo, carecieron en S. suis las secuencias homólogas a los primeros 88 aminoácidos de CpsJ. Además, la región homóloga se presentó en dos marcos de lectura diferentes. La proteína codificada por los genes cps2O mostró homología con las proteínas de varios estreptococos implicados en el transporte de la unidad de repetición de oligosacárido (núm. de acceso AB017355), lo que sugiere una función similar para Cps2O. Las proteínas codificadas por los genes cps2P, cps2S y cps2T mostraron homología con las proteínas NeuB, NeuD y NeuA de S. agalactiae y E. coli (núm. de acceso AB017355). Debido a que la región "cps2M" mostró también homología con NeuA de E. coli, el locus de cps2 en

S. suis contiene un gen funcional neuA (cps2T) así como un gen no-funcional ("cps2M"). La homología mutua entre estas dos regiones mostró una identidad del 77 % a nivel de aminoácido en los aminoácidos 1-58 y 49 % en los aminoácidos 59

134. Cps2Q y Cps2R mostraron homología con las partes N-terminal y C-terminal de la proteína NeuC de S. agalactiae y E. coli, respectivamente. Esto sugiere que la función de la proteína NeuC de S. agalactae en S. suis se cumple probablemente por dos proteínas diferentes. Los genes neu en E. coli se conocen que están implicados en la síntesis de ácido siálico. NeuNAc se sintetiza a partir de N-acetilmannosamina y fosfoenolpiruvato por la NeuNAc sintetasa. Posteriormente, NeuNAc se convierte en CMP-NeuNAc por la enzima CMP-NeuNAc sintetasa. CMP-NeuNAc es el sustrato para la síntesis de polisácarido. En E. coli K1 NeuB es la NeuNAc sintetasa, NeuA es la CMP-NeuNAc sintetasa. NeuC se involucró en la síntesis de NeuNAc, pero su papel preciso se desconoce. El papel preciso de NeuD se desconoce. Un papel de las proteínas Cps2P-Cps2T en la síntesis de ácido siálico puede ser fácilmente previsto, ya que la cápsula de S. suis serotipo 2 es rica en ácido siálico. En S. agalactiae se mostró que el ácido siálico era crítico para la función de virulencia de la cápsula tipo III. Además se sugirió que la presencia de ácido siálico en la cápsula de la bacteria que puede causar meningitis, puede ser importante para la capacidad de esta bacteria para atravesar la barrera hematoencefálica. Hasta ahora, sin embargo, el requisito del ácido siálico para la virulencia de S. suis sigue siendo poco claro. "Orf2U" y "Orf2V" mostraron homología con las proteínas localizadas en dos elementos de inserción diferentes. "Orf2U" es homólogo con IS1194 de Streptococcus thermophilus, mientras que "Orf2V" mostró homología con una transposasa potencial de Streptococcus pneumoniae. Esta transposasa putativa recientemente se encontró que se asocia con el locus capsular tipo 2 de S. pneumoniae. Comparado con los elementos de inserción originales en S. thermophilus y S. pneumoniae, tanto "Orf2U" como "Orf2V" es probable que sean no-funcionales debido a las mutaciones de cambio en el marco dentro de sus regiones codificantes. Una observación sorprendente fue la presencia de una secuencia de 100 pb (Fig. 9) que se repitió tres veces dentro del operón cps2. La secuencia está altamente conservada (entre 94% y 98%) y se encontró en las regiones intergénicas entre cps2G y cps2H, dentro de "cps2M" y entre cps2O y cps2P. No se encontraron homologías significativas entre esta secuencia de repetición directa de 100 pb y secuencias presentes en las genotecas de datos, lo que sugiere que la secuencia es única para S. suis. Distribución de las secuencias cps2 entre los 35 serotipos de S. suis. Para examinar la presencia de ácido siálico que codifica genes en otros serotipos de S. suis, realizamos experimentos de hibridación cruzada. Los fragmentos de ADN de los genes cps2 individuales se amplificaron por PCR, radiomarcaron con 32P e hibridaron con ADN cromosómico de las cepas de referencia de los 35 serotipos diferentes de S. suis. Como control positivo se usó una sonda específica del ARNr

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16S de S. suis. La sonda de ARNr 16S hibridó con intensidades casi iguales a todos los serotipos probados (Tabla 4). La secuencia "cps2L" hibridó con el ADN del serotipo 1, 2, 14 y 1/2. Los genes "cps2M", cps2O, cps2P, cps2Q, cps2R, cps2S y cps2T hibridaron con el ADN del serotipo 1, 2, 14, 27 y 1/2. Debido a que los genes cps2P-cps2T están probablemente más implicados en la síntesis de ácido siálico estos resultados sugieren que el ácido siálico es también una parte de la cápsula en el serotipo 1, 2, 14, 27 y 1/2 de S. suis. Esto está de acuerdo con el hallazgo de que los serotipos 1, 2 y 1/2 poseen una cápsula que es rica en ácido siálico. Aunque se desconocen las composiciones químicas de las cápsulas del serotipo 14 y 27, estudios recientes de aglutinación usando lectinas de unión a ácido siálico sugirieron la presencia de ácido siálico en el serotipo 14 de S. suis, pero no en el serotipo 27. En estos estudios, se detectó ácido siálico también en los serotipos 15 y

16. Dado que esta última observación no está de acuerdo con nuestros estudios de hibridación, puede ser que otros genes, no homólogos a los genes cps2P-cps2T, sean responsables por la síntesis del ácido siálico en los serotipos 15 y 16. Una sonda basada en secuencias "cps2N" hibridó con el ADN de los serotipos 1, 2, 14 y 1/2. Una sonda específica para "orf2U" hibridó con los serotipos 1, 2, 7, 14, 24, 27, 32, 34, y 1/2, mientras que una sonda específica para "orf2V" hibridó con muchos serotipos diferentes. Además, se preparó una sonda específica para la secuencia de repetición directa de 100 pb. Esta sonda se hibridó con los serotipos 1, 2, 13, 14, 22, 24, 27, 29, 32, 34 y 1/2 (Tabla 4). Para analizar el número de copias de la secuencia de repetición directa dentro del cromosoma de S. suis serotipo 2, se realizó una hibridación y análisis por transferencia de Southern. Por lo tanto, el ADN cromosómico de S. suis serotipo 2 se digirió con NcoI y se hibridó con una secuencia de repetición directa marcada con 32P. Sólo un fragmento de hibridación, que contiene tres repeticiones directa presente en el locus cps2, se encontró (resultados no mostrados). Esto indica que la secuencia de repetición directa de 100 pb sólo se asocia con el locus cps2. En S. pneumoniae una secuencia de repetición larga de 115-pb se encontró que se asociaba con los genes capsulares de los serotipos 1, 3, 14 y 19F. En S. pneumoniae esta secuencia de 115-pb se encontró además en el área adyacente de otros genes implicados en la virulencia neumocócica (genes de hialuronidasa y neuraminidasa). Una función reguladora de la secuencia de 115-pb en el control coordinado de estos genes relacionados con la virulencia se sugirió. Para estudiar el papel de la cápsula en la resistencia a la fagocitosis y en la virulencia, construimos dos mutantes isogénicos en los que se alteró la síntesis de la cápsula. En 10cpsB, el gen cps2B se alteró con la inserción de un gen de resistencia a antibióticos, mientras que en 10cpsEF se reemplazaron partes de los genes cps2E y cps2F. Ambas cepas mutantes parecen estar completamente no-encapsuladas. Debido a que los genes cps 2 parecen que son parte de un operón los efectos polares no se pueden excluir. Por lo tanto estos datos no dieron ninguna información sobre el papel de Cps2B, Cps2E o Cps2F en la biosíntesis de polisacáridos. Sin embargo, los resultados muestran claramente que el polisacárido capsular de S. suis tipo 2 es un componente de la superficie con la actividad antifagocítica. Las bacterias silvestres encapsuladas in vitro se ingieren por los fagocitos a una frecuencia muy baja, mientras que las bacterias mutantes no encapsuladas se ingieren eficientemente por los macrófagos porcinos. Dentro de las 2 horas, más de 99.6% de las bacterias mutantes se ingirieron y más del 92% de las bacterias ingeridas se destruyeron. Intracelularmente, las cepas silvestres, así como mutantes parece que se destruyen con la misma eficiencia. Esto sugiere que la pérdida de material capsular se asocia con la pérdida de la capacidad para resistir la captación por los macrófagos. Esta pérdida de resistencia a la fagocitosis in vitro se asoció con una atenuación sustancial de la virulencia en cerdos libres de gérmenes. Todos los cerdos inoculados con las cepas mutantes sobrevivieron el experimento y no mostraron ninguno de los signos clínicos específicos de la enfermedad. Sólo algunos signos clínicos inespecíficos de enfermedad pudieron observarse. Además, las bacterias mutantes se pueden reaislar a partir de los cerdos. Esto apoya la idea de que, como en otros estreptococos patógenos, la cápsula de S. suis actúa como un factor de virulencia importante. Los mutantes de transposón preparados por Charland alterados en la producción de cápsulas mostraron una virulencia reducida en cerdos y ratones. Para construir estos mutantes la cepa de referencia de tipo 2 S735 se usó. Anteriormente mostramos que esta cepa es sólo débilmente virulenta para los cerdos jóvenes. Además, el sitio de inserción del transposón está sin resolver hasta ahora. Como un ejemplo adicional en la presente descripción se describe una prueba PCT rápida para Streptococcus suis tipo 7. Estudios epidemiológicos recientes sobre infecciones de Streptococcus suis en cerdos indican que, además de los serotipos 1, 2 y 9, el serotipo 7 se asocia frecuentemente también con animales enfermos. Para este último serotipo, sin embargo, no están disponibles métodos de diagnóstico rápidos y sensibles. Esto dificulta los programas de prevención y control. Describimos aquí el desarrollo de una prueba de PCR específica de tipo para la detección rápida y sensible de S. suis serotipo 7. La prueba se basa en secuencias de ADN de genes capsulares (cps) específicos para el serotipo 7. Estas secuencias se pueden identificar mediante la hibridación cruzada de varios genes cps individuales con los ADN cromosómicos de 35 diferentes serotipos de S. suis. Streptococcus suis es una causa importante de meningitis, septicemia, artritis y muerte súbita en cerdos jóvenes [69,70]. Sin embargo, también puede causar meningitis en el hombre [71]. Los intentos de controlar la enfermedad se dificultan aun por la carencia de conocimientos suficientes sobre la epidemiología de la enfermedad y la carencia de vacunas eficaces y diagnósticos sensibles.

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Cepas de S. suis se pueden identificar y clasificar por sus características morfológicas, bioquímicas y serológicas [70, 73, 74]. La clasificación serológica se basa en la presencia de determinantes antigénicos específicos. Las células de S. suis aisladas y bioquímicamente caracterizadas se aglutinan con un panel de sueros específicos. Estos métodos de tipificación son muy laboriosos y consumen tiempo y sólo se pueden realizar en colonias aisladas. Además, se informó que se pueden producir reacciones cruzadas inespecíficas entre diferentes tipos de S. suis [75, 76]. Hasta ahora, se han descrito 35 serotipos diferentes [7, 78, 79]. S. suis serotipo 2 es el tipo más prevalente aislado a partir de los cerdos enfermos, seguido por los serotipos 9, y 1. Sin embargo, recientemente las cepas del serotipo 7 se aislaron frecuentemente también a partir de puercos enfermos [80, 81, 82]. Esto sugiere que las infecciones con cepas de S. suis serotipo 7 parece que son un problema aumentado. Además, la virulencia de las cepas de S. suis serotipo 7 se confirmó por la infección experimental de cerdos jóvenes [83]. Recientemente, se desarrollaron ensayos rápidos y sensibles de PCR específicos para los serotipos 2 (y 1/2), y 1 (14) y 9 [84]. Estos ensayos se basaron en los loci de cps de los serotipos 2, 1 y 9 de S. suis [84, 85]. Sin embargo, hasta ahora ninguna prueba de diagnóstico rápido y sensible está disponible para S. suis serotipo 7. En la presente describimos el desarrollo de una prueba de PCR para la detección rápida y sensible de cepas S. suis serotipo 7. La prueba se basa en las secuencias de ADN que forman una parte del locus de cps de S. suis serotipo 7. En comparación con los métodos serológicos de serotipificación el ensayo de PCR fue un ensayo rápido, fiable y sensible. Por lo tanto, esta prueba, en conjunto con las pruebas de PCR que previamente desarrollamos para el serotipo 1, 2 y 9, sin duda, contribuirá a un diagnóstico más rápido y fiable de S. suis y facilitará los programas de control y erradicación. Materiales y Métodos Cepas bacterianas, condiciones de crecimiento y serotipificación. Las cepas bacterianas y plásmidos usados en este estudio se enumeran en la Tabla 7. Las cepas de referencia de S. suis se obtuvieron a partir de M. Gottschalk, Canadá. Las cepas de S. suis se crecieron en caldo Todd-Hewitt (código CM189, Oxoid), y sembraron en base de agar sangre Columbia (código CM331, Oxoid) que contiene 6 % (v/v) de sangre de caballo. Las cepas de E. coli se crecieron en caldo Luria [86] y sembraron en caldo Luria que contiene 1.5 % (p/v) de agar. Si requerida, se añadió ampicilina a las placas. Las cepas de S. suis se serotiparon mediante la prueba de aglutinación en lámina con anticuerpos serotipo-específicos [70]. Técnicas de ADN. Manipulaciones de rutina con ADN y reacciones de PCR se realizaron como se describe por Sambrook y otros [88]. La transferencia e hibridación se realizó como descrito previamente [84,86]. Análisis de secuencia de ADN.

Secuencias de ADN se determinaron en un Sistema de Secuenciación de ADN 373A (Applied Biosystems, Warrington, GB). Las muestras se prepararon mediante el uso de un kit de reacción listo para secuenciación en ciclos con terminador colorante (Applied Biosystems). Cebadores de secuenciación hechos por encargo se adquirieron de Life Technologies. Los datos de secuenciación se ensamblaron y se analizaron usando el programa McMollyTetra. El programa BLAST se usó para buscar las secuencias de proteínas homólogas a las secuencias de aminoácidos deducidas. PCR. Los iniciadores usados en la PCR de cps7H corresponden a las posiciones 3334-3354 y 3585-3565 en el locus cps7 de S. suis. Las secuencias fueron:

5'-AGCTCTAACACGAAATAAGGC-3' y 5'-GTCAAACACCCTGGATAGCCG-3'. Las mezclas de reacción contuvieron 10 mM de Tris-HCl, pH 8.3; 1.5 mM de MgCl2; 50 mM de KCl; 0.2 mM de cada uno de los cuatro trifosfatos desoxinucleótidos; 1 microM de cada uno de los iniciadores y 1U de ADN polimerasa AmpliTaq Gold (Perkin Elmer Applied Biosystems, Nueva Jersey). La amplificación de ADN se llevó a cabo en un termociclador Perkin Elmer 9600 y el programa consistió en una incubación durante 10 min at 95 °C y 30 ciclos de 1 min a 95 °C, 2' min a 56 °C y 2 min a 72 °C. Resultados y discusión Clonación de los genes cps específicos al serotipo 7. Para aislar los genes cps de tipo específico de S. suis serotipo 7 se usó el gen cps9E de serotipo 9 como una sonda para identificar los fragmentos del ADN cromosómico de tipo 7 que contienen secuencias de ADN homólogo [84]. Un fragmento PstI de 1.6 kb se identificó y clonó en pKUN19. Este rindió el pCPS7-1 (Fig. 11C). A su vez, este fragmento se usó como una sonda para identificar un fragmento de superposición ScaI-ClaI de 2.7 kb. El pGEM7 que contiene el último fragmento se designó pCPS7-2 (Fig. 11C). Análisis de los genes cps7 clonados. Las secuencias de nucleótido completas de los insertos de pCPS7-1, pCPS7-2 se determinaron El examen de la secuencia cps7 reveló la presencia de dos marcos de lectura abiertos (ORF) completos y dos incompletos (Fig. 11C). Todos los ORF

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se preceden por un sitio de unión al ribosoma. De acuerdo con los datos obtenidos para los genes cps1, cps2 y cps9 de serotipos 1, 2 y 9, respectivamente, los ORF de tipo 7 están muy estrechamente unidos entre sí. La única interrupción intergénica significativa que se encontró entre cps7E y cps7F (443 nucleótidos). No se encontraron secuencias promotoras evidentes o estructuras de tallo-lazo potenciales en esta región. Este sugiere que, como en el serotipo 1, 2 y 9, los genes cps del serotipo 7 forman parte de un operón. Una visión general de los ORF y sus propiedades se muestra en la Tabla 8. Como esperado basado en los datos de hibridación [84], las proteínas Cps9E y Cps7E mostraron una alta similitud (identidad de 99 %, Tabla 8). Basado en las comparaciones de secuencias entre Cps9E y Cps7E, el fragmento PstI de pCPS7-1 carece de la región que codifica los primeros 371 codones de Cps7E. La parte C-terminal de la proteína codificada por el gen cps7F mostró cierta similitud con la proteína BpIG de Bordetella pertussis [88], así como con la parte C-terminal de Cps2E de S. suis [85]. Tanto BplG como Cps2E se sugirieron con actividad glicosiltransferasa y probablemente están implicados en el enlace de la primera azúcar con el portador lipídico [85,88]. La proteína codificada por el gen cps7G mostró similitud con la proteína BlpF de Bordetella pertussis [88]. BplF probablemente debe participar en la biosíntesis de un azúcar amino, lo que sugiere una función similar para Cps7G. La proteína codificada por el gen cps7H mostró similitud con la proteína WbdN de E. coli [89] así como con la parte N-terminal de la proteína Cps2K de S. suis [81]. Tanto WbdN como Cps2K se sugirieron con actividad glicosiltransferasa [85, 89]. Genes cps específicos al serotipo 7. Para determinar si los fragmentos clonados en pCPS7-1 y pCPS7-2 contienen las secuencias de ADN específicas al serotipo 7, se realizaron experimentos de hibridación cruzada. Fragmentos de ADN de los genes cps7 individuales se amplificaron por PCR, marcaron con 32P, y usaron para sondar transferencias puntuales de ADN cromosómico de las cepas de referencia de 35 serotipos diferentes de S. suis. Los resultados se resumen en la Tabla 9. Como esperado, basado en los datos obtenidos con la sonda cps9E [84], la sonda cps7E hibridó con el ADN cromosómico de muchos serotipos diferentes de S. suis. Las sondas cps7F y cps7G mostraron hibridación con el ADN cromosómico de los serotipos 4, 5, 7, 17, y 23 de

S. suis. Sin embargo, la sonda cps7H sólo hibridó con el ADN cromosómico del serotipo 7, indicando que este gen es específico para el serotipo 7. PCR tipo-específico. Probamos si podíamos usar la PCR en lugar de la hibridación para la tipificación de las cepas de S. suis serotipo 7. Para este propósito, seleccionamos un conjunto iniciador de oligonucleótidos dentro del gen cps7H con el cual se esperó un fragmento amplificado de 251 pb. Además, incluimos en nuestro análisis varias cepas de S. suis serotipo 7, excepto la cepa de referencia. Estas cepas se obtuvieron de diferentes países y se aislaron de diferentes órganos (Tabla 7). Los resultados muestran claramente que, un fragmento de aproximadamente 250 pb se amplificó con todas las cepas de tipo 7 usadas (Fig. 12B), mientras que no se obtuvieron productos de PCR con las cepas de los serotipos 1, 2 y 9 (Fig. 12A). Esto sugiere que la prueba de PCR como descrito aquí, es una herramienta de diagnóstico rápido para la identificación de cepas de S. suis serotipo 7. Hasta ahora una prueba de diagnóstico de este tipo no estaba disponible para cepas del serotipo 7. Junto con los ensayos de PCR recientemente desarrollados para el serotipo 1, 2, 1/2, 14 y 9, este ensayo puede ser una importante herramienta de diagnóstico para detectar cerdos portadores de las cepas de serotipo 2, 1/2, 1, 14,9 y 7 y pueden facilitar los programas de control y erradicación.

TABLA 1. Cepas bacterianas y plásmidos

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Tabla 2 Propiedades de los Orf en el locus cps de S. suis serotipo 2 y similitudes con el producto génico de otras bacterias

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Tabla 3. Propiedades de los ORF en los genes cps de S. suis serotipos 1 y 9 y similitudes con el producto génico de otras bacterias

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Tabla 7 Cepas bacterianas y plásmidos

cepa/plásmido.: características pertinentes

Cepa

E.coli

XL2 blue

S. suis

cepas de referencia: serotipos 1-34

5667: serotipo 7, amígdalas (1993)

7037: serotipo 7, órganos (1994)

7044: serotipo 7, cerebros (1994)

7068: serotipo 7 (1994)

7646: serotipo 7 (1994)

7744: serotipo 7, pulmones (1996)

7759: serotipo 7, articulaciones (1996)

8169: serotipo 7 (1997)

15913: serotipo 7, meninges (1998)

Plásmido

pKUN19 funciones de replicación pUC, AmpR

pGEM7Zf(+): funciones de replicación pUC, AmpR

pCPS9-1: pKUN19 que contiene el fragmento de 1 kb HindIII-XbaI del operón decpsdel serotipo 9

pCPS9-2: pKUN19 que contiene el fragmento de 4.0 kb XbaI-XhaI del operón de cpsdel serotipo 9

pCPS7-1: pKUN19 que contiene el fragmento de 1.6-kb PstI del operón de cps de tipo 7

pCPS7-2: pGEM7 que contiene el fragmento de 2.7-kb ScaI-ClaI del operón de cpsde tipo 7

AmpR: resistente a la ampicilina cps: polisacárido capsular

Tabla 8 Propiedades de los Orf en los genes cps de S. suis serotipo 7 y similitudes con el producto génico de otras bacterias

Orf: posición del nucleótido en la secuencia función propuesta del producto génico similitud del producto génico ( % de identidad)

Cps7E: 1-719 Glicosiltransferasa Streptococcus suisCps9E (99 %)

Cps7F: 1164-1863 Glicosiltransferasa Bordetella pertussisBplG1 (43 %)



: Streptococcus suisCps2E1 (33 %)

Cps7G: 1872-3086 biosíntesis del azúcar amino Bordetella pertussisBplF (48 %)

Cps7H: 3104-3737 Glicosiltransferasa Escherichia coliWbdN (35 %)



: Streptococcus suisCps2K2 (31 %)

1Similitud se refiere a la parte C-terminal del producto génico 2Similitud se refiere a la parte N-terminal del producto génico

55 5

LEYENDAS DE LAS FIGURAS

Figura 1. Organización del agregado génico de cps2 de S. suis tipo 2.

(A): mapa genético del agregado génico de cps2. Las flechas sombreadas representan los ORF potenciales. Los ORF interrumpidos indican la presencia de codones de terminación o mutaciones de cambio de marco. Las designaciones de los genes se indican más abajo de los ORF. Las flechas cerradas indican la posición de las secuencias promotoras potenciales. I indica la posición de la secuencia reguladora de la transcripción potencial. | | | indica la posición de la secuencia de repetición de 100-pb.

(B): Mapa físico del locus cps2. Los sitios de restricción son como sigue: A: AluI; C: ClaI; E, EcoRI; H, HindIII; K, KpnI; M, MluI; N, NsiI; P, PstI; S, SnaBI; Sa: SacI; X, XbaI.

(C): Los fragmentos de ADN clonados en varios plásmidos.

Figura 2 El gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra los productos de PCR obtenidos con el ADN cromosómico de las cepas de S.suis pertenecientes a los serotipos 1,2, ½, 9 y 14 y los conjuntos de iniciadores de cps2J, cpslI y cps9H como se describió en Materiales y Métodos. (A) Iniciadores de cpslI.

(B): Iniciadores de cps2J y (C) iniciadores de cps9H. Carriles 1-3: cepas del serotipo 1; carriles 4-6: cepas del serotipo 2; carriles 7-9: cepas del serotipo ½; carriles 10-12: cepas del serotipo 9 y carriles 13-15: cepas del serotipo 14.

(B): El gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra los productos de PCR obtenidos con los exudados de amígdalas recogidos de cerdos portadores de las cepas de S.suis tipo 2, tipo 1 o tipo 9 y los conjuntos iniciadores de cps2j, cps1I y cpsH como se describió en Materiales y Métodos. El ADN bacteriano adecuado para la PCR se preparó usando los métodos tamizaje múltiple como se describió previamente (20). (A) Iniciadores de cps1I. (B) Iniciadores decps2J y (C) iniciadores de cps9H. Carriles 1-3: productos de la PCR obtenidos con exudados de amígdalas recogidos de cerdos portadores de cepas de S.suis tipo 1; carriles 4-6: productos de PCR obtenidos con exudados de amígdalas recogidos de cerdos portadores de cepas de S.suis tipo 2; carriles 7-9: productos de PCR obtenidos con exudados de amígdalas recogidos de cerdos portadores de cepas de S.suistipo 9; carriles 10-12: productos de PCR obtenidos con el ADN cromosómico de las cepas serotipo 9, 2 y 1 respectivamente; carril 13: control negativo, sin ADN presente.

Figura 3 Secuencias de nucleótidos de CPS2 y secuencias de aminoácidos correspondientes a partir de los marcos de lectura abierta.

Figura 4 Secuencias de nucleótidos de CPS1 y secuencias de aminoácidos correspondientes a partir de los marcos de lectura abierta.

Figura 5 Secuencias de nucleótidos de CPS9 y secuencias de aminoácidos correspondientes a partir de los marcos de lectura abierta.

Figura 6 Secuencias de nucleótidos de CPS7 y secuencias de aminoácidos correspondientes a partir de los marcos de lectura abierta.

Figura 7 Alineaciones de las partes N-terminales de Cps2J y Cps2K. Los aminoácidos idénticos están marcados con las barras. Los aminoácidos que se muestran en negrita se conservan también en Cps14I, Cps14J de S. pneumoniae y varias otras glicosiltransferasas (19). Los residuos de aspartato marcados con astériscos están fuertemente conservados.

Figura 8 Micrografías de transmisión electrónica de secciones delgadas de varias cepas de S.suis.

(A) cepa silvestre 10;

(B): cepa mutante 10cpsB;

(C): cepa mutante 10cpsEF.

Bar = 100 nm

Figura 9

(A) Cinética de la fagocitosis de cepas silvestre y mutante de S. suis por macrófagos alveolares porcinos. La fagocitosis se determinó como se describió en Materiales y Métodos. El eje Y representa el número de UFC por mililitro en los fluidos sobrenadantes como se determina por conteo en placa, el X eje x representa el tiempo en minutos.

□ cepa silvestre 10;

○ cepa mutante 10cpsB; ∆ cepa mutante 10cpsEF.

(B) Cinética de destrucción intracelular de cepas silvestre y mutante de S. suis por AM porcino. La destrucción intracelular se determinó como se describió en Materiales y Métodos. El eje Y representa el número de UFC por ml en los fluidos sobrenadantes después de la lisis de los macrófagos como se determina por conteo en placa, el eje X representa el tiempo en minutos.

□ cepa silvestre 10;

○ cepa mutante 10cpsB; ∆ cepa mutante 10cpsEF.

Figura 10 Alineación de la secuencia de nucleótidos del elemento de repetición altamente conservado de 100-pb.

1) repetición de 100-pb entre cps2G y cps2H 2) repetición de 100-pb dentro de "cps2M" 3) repetición de 100-pb entre cps2O y cps2P

Figura 11. Los agregados génicos de cps2, cps9 y cps7 de S. suis serotipos 2, 9 y 7.

(A): Organización genética del agregado génico de cps2 [84]. Las flechas grandes representan los ORF potenciales. Las designaciones de genes se indican más abajo de los ORF. Las flechas idénticamente llenas representan los ORF que mostraron homología. Las flechas cerradas pequeñas indican la posición de secuencias de promotor potenciales. | indica la posición de la secuencia reguladora de la transcripción potencial.

(B): Mapa físico y organización genética del agregado génico de cps9 [15]. Los sitios de restricción son como sigue:

B: BamHI; P: PstI; H: HindIII; X:XbaI. Los fragmentos de ADN clonados en varios plásmidos se indican. Las flechas abiertas representan los ORF potenciales.

(C): Mapa físico y organización genética del agregado génico de cps7. Los sitios de restricción son como sigue: C: ClaI; P: PstI; Sc: ScaI. Los fragmentos de ADN clonados en varios plásmidos se indican. Las flechas abiertas representan los ORF potenciales. Figura 12 (A) El gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra los productos de PCR obtenidos con el ADN cromosómico de las cepas de S. suis pertenecientes a la serotipos 1, 2, 9 y 7 y el conjunto iniciador de cps7H. Las designaciones de las cepas se indican por encima de los carriles. C: control negativo, sin ADN presente. M: marcador de tamaño molecular (lambda digerida con EcoRI y HindIII).

(B): El gel de agarosa teñido con bromuro de etidio que muestra los productos de PCR obtenidos con las cepas serotipo 7 recogidas en diferentes países y a partir de diferentes órganos. El ADN bacteriano adecuado para la PCR se preparó usando los métodos tamizaje múltiple como se describió previamente [89]. Las designaciones de las cepas se indican por encima de los carriles. M: marcador de tamaño molecular (lambda digerida con EcoRI y HindIII).

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Claims

Reivindicaciones

1.

Uso de un mutante sin cápsula de Streptococcus suis que tiene una mutación en el agregado génico del polisacárido capsular (cps) para la preparación de una vacuna.
2.

Una vacuna que comprende un mutante sin cápsula de Streptococcus suis que tiene una mutación en el agregado génico del polisacárido capsular (cps).
3. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicho mutante de Streptococcus suis es una cepa de 10 Streptococcus suis serotipo 2.
4. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 en donde dicho mutante es capaz de expresar un factor de virulencia o determinante antigénico de Streptococcus.

15 5. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 en donde dicho mutante es capaz de expresar una proteína que no es de Streptococcus.
6. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 5 en donde dicha proteína que no es de Streptococcus se deriva de un patógeno.
7. Un método para controlar o erradicar una enfermedad estreptocócica causada por Streptococcus suis que comprende probar una muestra recogida de al menos un sujeto de una población vacunada con una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 para la presencia de cepas encapsuladas de Streptococcus suis.
8. Un método para controlar o erradicar una enfermedad estreptocócica causada por Streptococcus suis que comprende probar una muestra recogida de al menos un sujeto de una población vacunada con una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 para la presencia de anticuerpos específicos a la cápsula dirigidos contra las cepas Streptococcus suis.