KR20200141053A - 치료 도구로서의 정밀 당 접합체 - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 면역원성 담체 단백질에 커플링된 탄수화물 항원을 포함하는 당 접합체, 당 접합체 면역원 및 당 접합체 백신, 또는 생성된 항체의 검출 및 스크리닝에 사용되는 물질에 관한 것이다. 광촉매 티올-엔 반응에 기초한 "클릭-화학" 접근법을 포함하여, 면역 원성 담체 단백질의 유리 티올기에 탄수화물 항원을 보다 직접적이고 정확하게 접합하는 개선된 방법이 기재되어 있다.
Description
본 명세서는 당 접합체 치료 도구에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 명세서는 면역원성 및 항원성 담체(carrier) 펩타이드 및 단백질의 유리 티올기에 비 무작위로 커플링된 탄수화물 항원 및 예를 들어 광촉매 티올-엔 "클릭 화학(click chemistry)" 반응을 사용하여 이를 제조하는 개선된 방법에 관한 것이다. 항원, 면역원, 백신으로서 및 진단에서의 응용도 기재되어 있다.
본 명세서는 다수의 문서를 언급하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
면역 요법의 궁극적인 목적은 감염 또는 종양 진행 중에 생성되는 것과 유사한 방식으로 면역 시스템의 선천성 및 후천성 반응을 유발하는 것이다. 선천성 면역 반응과 후천성 면역 반응 사이의 주요한 인터페이스는 항원 제시 세포(APC: antigen-presenting cell), 특히 수지상 세포(DC: dendritic cell)이다. APC는 톨 유사 수용체(TLR: Toll-like receptor)와 같은 패턴 인식 수용체(PRR: pattern recognition receptor)를 통해 미생물을 인식할 수 있다. 미생물 표면 결정 인자 또는 비정상 및 비 천연 항원을 인식하면 APC는 성숙과 활성화를 거쳐 세포 내 구획에서 세포 표면으로 MHC 분자가 재분배되고 사이토 카인과 케모카인을 분비하게 된다. 미생물 또는 종양 및 이의 관련 항원 마커는, 통상적으로 그것이 분해되는 세포내 경로를 통해 APC에게 포식될 수 있다. 이후, 단백질 처리에 의해 방출된 펩타이드 및 공유적으로 연결된 항원은 MHC 클래스 II 분자 상에 표시되고 CD4+ T 세포에 의해 인식되며, 이는 차례로 APC로부터 수신된 공동 자극 신호에 따라 Th1 또는 Th2 세포와 같은 다른 하위집합(subsets)으로 기능적 성숙을 거치게 된다. Th1 세포는 IFN-γ 및 TNF-α의 분비와 함께 대부분 전염증(pro-inflammatory) 반응을 일으키는 반면, Th2 세포는 통상적인 사이토카인을 분비한다. Th1 세포는 주로 세포 매개 반응과 관련이 있지만 두 유형의 Th 세포는 B 세포에 의한 항체의 생성을 지원하며, 이는 차례로 항체 동형 및 기능에 영향을 미친다. 예를 들어, IL-12 및 TNF-α는 Th1 세포의 분화 및 1 형 IgG 서브클래스의 생성과 관련이 있는 반면, IL-6 및 기타 Th2 사이토카인은 2형 IgG 서브클래스(IgG1) 생성에 기여한다. 따라서, 관심 대상 병원체 또는 종양 항원을 다루기 위해 백신 유도 면역을 적절한 반응에 맞출 수 있는 것이 바람직하다.
탄수화물은 단백질 및 펩타이드와 달리 Th 세포의 참여를 촉발하도록 적절히 구비되지 않는 T 세포 독립 항원이므로 면역 세포 증식, 항체 클래스 전환 및 친화성/특이성 성숙을 유도할 수 없다. 탄수화물 기반 백신과 최초로 접했던 주요 초기 발전은 T 세포 의존성 에피토프 역할을 하는 단백질 담체에 적절하게 접합될 경우 박테리아성 캡슐형 다당류가 광 포식성 항체를 생산하는 데 필요한 면역화학적 능력을 획득할 수 있게 되었다는 발견에 의해 뒷받침되었다.
전통적으로, 탄수화물 항원을 담체 단백질에 접합하기 위한 전략은 알데히드 유래 당을 라이신 잔기의 ε- 아미노기에 환원적 아민화하거나 단순히 아미드 커플링 반응에 의존해 왔다. 양쪽 경우 모두에서, 부분적이고 무작위한 탄수화물 항원 접합이 일반적으로 발생한다. 또한, 모든 아미드 파트너(라이신으로부터의 아민 또는 글루탐산/아스파르트산으로부터의 산)가 탄수화물 접합에 사용되는 경우 너무 많은 탄수화물 항원이 담체 단백질에 부착되어 잠재적으로 필수적인 T 세포 펩타이드 에피토프를 면역원성의 고유한 감소/제거로 마스킹하게 된다. 따라서, 당 접합 백신을 제조하기 위한 현재 전략은 부적절하고 상당한 규제 및/또는 상업적 장애물에 직면하게 되는데, 이는 제조물이 탄수화물 분포 및 재현성 측면에서 필요한 균질성이 부족하기 때문이다(즉, 단백질에 대한 당의 부착 지점이 무작위로 분포되며 배치에서 배치로 다양한 밀도이다). 따라서, 더 큰 탄수화물 항원 균질성, 보다 정확하게는 특성화 가능한 구조 및 배치에서 배치로 재현성을 갖는 당 접합 백신이 매우 바람직할 것이다.
본 명세서는 정확한(비 무작위) 위치에서 면역원성 담체 단백질에 직접 커플링된 탄수화물 항원을 포함하는 당 접합체 면역원에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 담체 단백질은 하나 이상의 유리 티올기(예컨대, 시스테인 잔기의 측쇄에 해당)을 포함하고 탄수화물 항원은 이러한 유리 티올기 중 하나 이상에서 담체 단백질에 접합된다. 본 명세서는 또한 예를 들어 "클릭-화학" 접근법(예컨대, 광촉매 티올-엔 반응)을 사용하여 담체 단백질의 유리 티올기에 탄수화물 항원을 직접 접합시키는 것을 포함하는 당 접합체 면역원/백신을 합성하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 개선된 접합 방법은 접합의 특이성에 영향을 주지 않으면서 담체 단백질의 활성, 면역원성 및/또는 구조를 파괴(예컨대, 천연 이황화 가교의 절단 및/또는 변성)를 피하는 데 충분히 온화한 조건 하(예컨대, 수용성 시약만 사용, 유기 용매의 부재, 또는 담체 단백질 변성을 피하기 위해 충분히 낮은(예컨대, < 5%) 농도의 및/또는 상대적으로 중성 pH의 유기 용매의 사용)에서 수행될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 공정을 더욱 단순화하는, 촉매 존재 하에 자외선(예컨대, 355 nm 또는 365 nm) 하 또는 촉매의 부재 하에 단파 자외선 (예컨대, 254 nm에서) 하에서 수행될 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서는 (a) 티올-엔 반응을 통해 티올기에 직접적으로 접합 가능한 말단 알켄(알케닐 탄수화물 항원)에 공유적으로 연결된 탄수화물 항원을 제공하는 단계; (b) 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 담체 단백질을 제공하는 단계; 및 (c) 하나 이상의 유리 티올기에서 담체 단백질에 탄수화물 항원을 직접 접합하기 위해 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여, 당 접합체 면역원을 제조하는 단계를 포함하며, 담체 단백질은 대상체에 투여되었을 때 면역원성이고, 담체 단백질에 대한 탄수화물 항원의 접합은 비 접합된 탄수화물 항원의 투여에 비하여 대상체에 투여 시 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시키는, 당 접합체 면역원을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 광촉매 티올-엔 반응은 담체 단백질 변성을 피하는 반응 조건 하에서 수행된다. 실시형태에서, 알케닐 탄수화물 항원은 수용성이며 광촉매 티올-엔 반응은 (예컨대, 임의의 유기 용매의 존재 하에 또는 담체 단백질 변성을 피하기 위해 충분히 낮은(예컨대, < 5%)의 농도에서 유기 용매의 존재 하에) 담체 단백질의 활성, 면역원성 및/또는 구조를 유지하는 반응 조건 하에서 수행된다. 광촉매 티올-엔 반응은 단파(예컨대, 254 nm) 및/또는 장파(예컨대, 355 또는 365 nm) 자외선 하의 조사 하에 촉매(예컨대, 수용성 또는 수불용성 촉매)의 존재 하에 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 광촉매 티올-엔 반응은 담체 단백질의 유리 티올기 당 1 내지 200 몰 당량의 알케닐 탄수화물 항원을 반응시키는 것을 포함하며; 그리고/또는 광촉매 티올-엔 반응은 약 3 내지 10, 3.5 내지 9.5, 4 내지 9, 4.5 내지 8.5, 5 내지 8, 5.5 내지 8, 6 내지 8 또는 6.5 내지 7.5의 pH에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 담체 단백질에 대한 접합 후 탄수화물 항원은 대상체의 내인성 효소에 의해 담체 단백질로부터 절단될 수 없다. 일부 실시형태에서, 알릴 아민 및 (박테리아성 CPS를 포함하는) 환원당 사이와 같이, O-글리코시드 결합, S-글리코시드 결합, N-글리코시드 결합 또는 C-글리코시드 결합과 같은 글리코시드 결합 또는 환원성 아민화에 의해 얻어지는 결합을 통해 알케닐 탄수화물 항원은 말단 알켄에 공유적으로 연결되고/연결되거나 탄수화물 항원은 담체 단백질에 접합된다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 항원은 B 세포 에피토프를 포함하고/포함하거나 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 항원은 T 세포 에피토프를 포함하고/포함하거나 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 항원은 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프 양쪽 모두를 포함하고/포함하거나 대상체에서 체액성 면역 반응 및 세포 매개 면역 반응 양쪽 모두를 유도한다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 항원은 Tn, S-Tn, 톰슨 프라이덴리히(TF: Thomsen-Friedenreich), (2,3)-S-TF, (2,6)-S-TF, Globo H, GD2, GD3, GM2, GM3, N-글리콜릴-GM3, Lea, sLea, Lex, sLex, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 종양 관련 탄수화물 항원(TACA)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 광촉매 티올-엔 반응은 적어도 2개의 동일한 탄수화물 항원 또는 1개 초과 유형의 탄수화물 항원을 담체 단백질과 접합시켜 다가 당 접합체 면역원(예컨대, 담체 단백질에 접합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 동일 또는 상이한 유형의 탄수화물 항원 포함)을 제조한다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 항원은 바이러스성 다당류 항원 또는 박테리아성 캡슐형 다당류(CPS)(예컨대, 폐렴구균 및 /또는 연쇄구균 다당류 혈청형, 수막구균 CPS; 인플루엔자(예컨대, 인플루엔자 유형 a 또는 b) CPS)이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 알케닐 탄수화물 항원은 링커(예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 링커)를 통해 말단 알켄에 연결된다.
일부 실시형태에서, 담체 단백질은 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 T 세포 에피토프를 포함하고/포함하거나 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도한다.
일부 실시형태에서, 담체 단백질은 B 세포 에피토프를 포함하고/포함하거나 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프 양쪽 모두를 포함하고/포함하거나 대상체에서 체액성 면역 반응 및 세포 매개 면역 반응 양쪽 모두를 유도한다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차 반응 물질 197(CRM197), 수막구균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자 단백질 D(HiD), 바이러스 유사 입자(VLP), 사이토카인, 파상풍 독소 831-844(서열 ID 번호: 1 또는 2)와 같은 면역원성 펩타이드, 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민) 또는 이들의 면역원성 단편이고, 이들로부터 유래하거나 이들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 하나 이상의 이황화 가교를 갖는 단백질이며, 여기서: (i) 하나 이상의 이황화 가교는 상기 광촉매 티올-엔 반응 후에 영향을 받지 않고 유지되고; 또는 (ii) 담체 단백질은 탄수화물 항원에 대한 접합을 위해 하나 이상의 추가 유리 티올기를 노출시키기 위해 환원제로 전처리된다.
일부 실시형태에서, 당 접합체 면역원에 포함된 탄수화물 항원의 총 수는 접합 전에 담체 단백질 상에서 이용 가능한 유리 티올기의 수와 동일하다. 일부 실시형태에서, 당 접합체 면역원은 대상체에 투여 시에 탄수화물 항원에 세포 매개 면역 반응을 유도한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 (d) 당 접합체 면역원을 정제하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 방법에 의해 당 접합체 면역원을 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트(예컨대, 무기 화합물, 미네랄 오일, 미생물 유도체, 식물 유도체, 사이토카인, 스쿠알렌, 명반(alum), 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 수산화 인산 칼슘, 톨 유사 수용체 작용제, 면역자극성 폴리뉴클레오타이드(예컨대, CPG), 면역자극성 지질, 프로인트 애주번트, RIBI의 애주번트, QS-21, 무라밀 디펩타이드 또는 이들의 임의의 조합)과 제형화하는 단계를 포함하는, 당 접합체 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 하나 이상의 탄수화물 항원 및 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기를 갖는 면역원성 담체 단백질을 포함하는 합성 당 접합체 면역원에 관한 것이며, 하나 이상의 탄수화물 항원은 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기에서 면역원성 담체 단백질에 연결되며, 면역원성 담체 단백질에 대하여 하나 이상의 탄수화물 항원의 접합은 비 접합 탄수화물 항원의 투여와 비교하여 대상체에 투여 시 하나 이상의 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 탄수화물 항원은 본원에 기재된 링커를 통해 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기에 연결되며, 하나 이상의 탄수화물 항원은 본원에 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 합성 당 접합체 면역원은 본원에 기재된 바와 같이 다가 당 접합체 면역원이며, 본원에 기재된 바와 같이 담체 단백질을 사용한다. 일부 실시형태에서, 당 접합체 면역원에 포함된 탄수화물 항원의 총 수는 담체 단백질 상에서 용매-접근 가능한 시스테인 잔기의 수와 동일하다. 일부 실시형태에서, 합성 당 접합체 면역원은 대상체에 투여 시에 탄수화물 항원에 세포 매개 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 합성 당 접합체 면역원은 본원에 기재된 방법에 의해 제조된다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조되고/제조되거나 본원에 기재된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트를 포함하는 당 접합체 백신에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 당 접합체 백신은 예방 백신 또는 치료 백신이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 생성된 당 접합체 면역원, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 백신, 본원에 기재된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 또는 본원에 기재된 바와 같은 당 접합체 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 면역화, 백신접종 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서는 질환이 있는 대상체를 면역화, 백신접종 또는 치료하는 데 사용하거나, 당 접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하기 위하거나, (예컨대, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서) 상기 면역화, 백신접종 또는 치료를 검출하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 또는 당 접합체 백신에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 합성 당 접합체 면역원은 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- y는 적어도 1이고;
- SA는 당 항원 또는 이들의 면역원성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되며, y는 1 초과인 경우, SA는 동일하거나 상이하고;
- [S] z -PC는 하나 이상의 유리 티올기로부터 유래하는 하나 이상의 황 원자를 갖는 담체 단백질이고;
- z는 적어도 1이고 적어도 y와 동일하고; 그리고
- L은 하기 구조를 갖는 링커로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이며,
상기 식에서
- X는 O, S, NR1 또는 CH2이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COCH3 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- R 2 는 H 또는 Me이고; 그리고
y는 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이한, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 합성 당 접합체 면역원은 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- y는 적어도 1이고;
- SA는 당 항원 또는 이들의 면역원성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되며, y는 1 초과인 경우, SA는 동일하거나 상이하고;
- [S] z -PC는 하나 이상의 유리 티올기로부터 유래하는 하나 이상의 황 원자를 갖는 담체 단백질이고;
- z는 적어도 1이고 적어도 y와 동일하고; 그리고
- L은 하기 구조를 갖는 링커로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이며 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 또는 R 3 및 R 4 는 질소 원자에 연결된 카르보닐과 함께 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-을 형성하고, 그리고 m은 1이고; 그리고
y는 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이한, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 합성 당 접합체 면역원은 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- y는 적어도 1이고;
- SA는 당 항원 또는 이들의 면역원성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되며, y는 1 초과인 경우, SA는 동일하거나 상이하고;
- [S] z -PC는 하나 이상의 유리 티올기로부터 유래하는 하나 이상의 황 원자를 갖는 담체 단백질이고;
- z는 적어도 1이고 적어도 y와 동일하고; 그리고
- L은 하기 구조를 갖는 링커로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- r은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 5 은 S-PC, 공유 결합 또는 하기 구조의 라디칼이며,
상기 식에서, R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이며 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 또는 R 3 및 R 4 는 질소 원자에 연결된 카르보닐과 함께 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-을 형성하고, 그리고 m은 1이고; 그리고
y는 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이한, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 상기 정의된 바와 같이 합성 당 접합체 면역원에 관한 것으로서, 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- r은 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 상기 정의된 바와 같이 합성 당 접합체 면역원에 관한 것으로서, 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- r은 1 또는 2이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 상기 정의된 바와 같이 합성 당 접합체 면역원에 관한 것으로서, 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- r은 1 또는 2이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 상기 설계된 바와 같이 합성 당 접합체 면역원에 관한 것으로서, y는 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 3 범위의 정수이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 각각의 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서: SA는 당 항원 또는 이의 부분이고; S-PC는 담체 단백질이고; X는 O, S, NR1 또는 CH2이고; R 1 은 -H, -COH, -COCH3 또는 -COEt이고; n은 1, 2, 3, 4 또는 5이며; 그리고 R 2 는 H 또는 Me인, 합성 당 접합체 면역원; 또는 이의 입체 이성질체에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 각각의 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서: SA는 당 항원 또는 이의 부분이고; S-PC는 담체 단백질이고; X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고; n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이며 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 또는 R 3 및 R 4 는 질소 원자에 연결된 카르보닐과 함께 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-을 형성하고, 그리고 m은 1인, 합성 당 접합체 면역원; 또는 이의 입체 이성질체에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 당 항원은 본원에 기재된 바와 같이 탄수화물 항원이고, 담체 단백질은 본원에 기재된 바와 같으며, 합성 당 접합체 면역원은 본원에 기재된 바와 같이 다가 당 접합체 면역원이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 애주번트를 포함하는 백신에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원 또는 본원에 기재된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원의 백신의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 백신, 본원에 기재된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 또는 본원에 기재된 바와 같은 백신의 상기 하나 이상의 탄수화물 또는 당 항원의 증가된 발현과 관련된 질환이 있는 대상체의 치료를 위한 용도에 관한 것이다.
일반 정의
표제 및 기타 식별자, 예컨대, (a), (b), (i), (ii) 등은 단지 명세서 및 청구 범위를 용이하게 읽을 수 있도록 제공된다. 명세서 또는 청구 범위에서 표제 또는 기타 식별자의 사용은 단계 또는 요소가 반드시 알파벳 순서 또는 숫자 순서 또는 제시된 순서로 수행될 것을 요구하지 않는다.
청구 범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때 단수형 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 일치한다.
용어 "약"은 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 값이 포함함을 나타내는 데 사용된다. 일반적으로, "약"이라는 용어는 최대 10%의 가능한 변형을 지정하는 것을 의미한다. 그러므로, "약"이라는 용어에는 값의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10%의 변동이 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 범위 앞에 "약"이라는 용어를 사용하면 범위의 양쪽 끝에 적용된다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 "포함하는(comprising)" (및 단복수형 "포함하다"와 같은 임의의 형태의 포함하는), "갖는" (및 단복수형 "가지다"와 같은 임의의 형태의 갖는), "포함하는(including)" (및 단복수형 "포함하다"와 같은 임의의 형태의 포함하는) 또는 "함유하는" (및 단복수형 "함유하다"와 같은 임의의 형태의 함유하는)은 포괄적이거나 개방형이며 추가, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에 사용된 "단백질"이라는 용어(예컨대, "담체 단백질"이라는 표현에서)는 변형이 본원에 기재된 당 접합체 면역원 및 당 접합체 백신의 면역원성을 파괴하지 않는 한 임의의 유형의 변형(예컨대, 아세틸화, 인산화, 글리코실화, 황화, 스모일화, 프레닐화, 유비퀴틴화 등과 같은 화학적 또는 번역 후 변형)을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 아미노산의 펩타이드-연결된 사슬을 의미한다. 더 명확하게 하기 위해, 본원에 사용된 용어 "단백질" 및 "담체 단백질"은 펩타이드 및 폴리펩타이드를 양쪽 모두 포함한다.
본원에 사용된 "투여"라는 용어는 투여 경로가 대상체에서 면역 반응을 발생하게 하는 한, 비경구(예컨대, 피하, 피내, 근육 내 또는 정맥 내), 경구, 경피, 비강 내 등과 같은 투여 경로를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "대상체"라는 용어는 일반적으로 영장류를 포함한 포유 동물, 특히 인간을 지칭한다.
본 명세서의 다른 목적, 장점 및 특징은 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 주어진 특정 실시형태에 대한 다음의 비 제한적인 설명을 숙독 시 더욱 명백해질 것이다.
첨부된 도면에서,
도 1은 인간 당 단백질(MUC: human glycoprotein)로부터 주요 종양 관련 탄수화물 항원(TACA: tumor-associated carbohydrate antigen)의 통상적인 화학 구조의 예를 도시한다.
도 2는 탄수화물 항원(B 세포 에피토프)을 면역원성 담체 단백질의 이용 가능한 티올기(예컨대, 파상풍 톡소이드와 같은 T 세포 에피토프)에 직접 접합하기 위한 제안된 "클릭 화학" 접근법을 도시한다.
도 3은 Tn 또는 TF 항원을 담체 단백질 파상풍 톡소이드 상의 6개의 천연 "유리" 시스테인 잔기에 접합시키기 위해 광촉매 티올-엔 반응에 의해 제조된 "정밀(precision) 당 접합체"의 예를 도시한다.
도 4는 티올-특이적 요오드아세트아미도기 또는 말레이미도기에 연결되고 이어서 pH 8 미만(요오드아세트아미도기 또는 말레이미도기)의 반응 또는 티올-엔 반응(말레이미도기)을 통해 담체 단백질 상의 "유리" 시스테인 잔기에 접합된 Tn 또는 TF 항원을 사용하여 제조된 "정밀 당 접합체"의 예를 도시한다.
도 5는 실시예 2 내지 6에 기재된 바와 같이 담체 단백질에 대한 접합 준비가 된 알릴 Tn 항원 및 알릴 TF 항원의 합성을 위한 반응식을 도시한다.
도 6a 내지 도 6d는 알릴 2-아세토아미도-3,6-디-O-피발로일-2-데옥시-α-D-글루코피라노사이드(화합물 2)에 대한 1H-NMR(도 6a) 및 13C-NMR(도 6b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 6c 및 6d)를 도시한다.
도 7a 내지 도 7d는 알릴 2-아세토아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴 Tn)에 대한 1H-NMR(도 7a) 및 13C-NMR(도 7b) 스펙트럼과 질량 분 결과(도 7c 및 7d)를 도시한다.
도 8a 내지 도 8c는 알릴 2-아세토아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 4)에 대한 1H-NMR(도 8a) 스펙트럼과 질량 분 결과(도 8b 및 8c)를 도시한다.
도 9a 내지 도 9d는 알릴 (2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 6)에 대한 1H-NMR(도 9a) 및 13C-NMR(도 9b) 스펙트럼과 질량 분 결과(도 9c 및 9d)를 도시한다.
도 10a 내지 도 10d는 화합물 7에 대한 1H-NMR(도 10a) 및 13C-NMR(도 10b) 스펙트럼과 질량 분 결과(도 10c 및 10d)를 도시한다.
도 11a 내지 도 11d는 알릴 (β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴l TF)에 대한 1H-NMR(도 11a) 및 13C-NMR(도 11b) 스펙트럼과 질량 분 결과(도 11c 및 11d)를 도시한다.
도 12는 TF-TT 당 접합체 단독(상단 좌측 패널), 땅콩 렉틴 단독(상단 우측 패널), 또는 양쪽 모두 조합된(하단 패널)의 동적 광 산란(DLS) 분석의 결과를 도시한다.
도 13은 O-알릴-Tn 및 O-알릴-TF와의 광촉매 티올-엔 접합 반응에서 시간 함수로서 펩타이드 dTT831-840의 티올 농도를 도시한다.
도 14는 펩타이드의 시스테인 위치 및 AAPH 또는 DMPA 존재의 함수로서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에서 펩타이드 dTT831-840의 티올의 배수 감소를 도시한다.
도 15는 펩타이드의 시스테인 위치 및 AAPH 또는 DMPA 존재의 함수로서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 Tn에 접합된 펩타이드 dTT831-840에 대한 렉틴의 반응성을 도시한다.
도 16은 AAPH 또는 DMPA의 존재 하에 상이한 파장에서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에서 펩타이드 dTT831-840의 티올 농도의 동태를 도시한다.
도 17은 AAPH 또는 DMPA의 존재 하에 상이한 파장에서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 Tn에 접합된 펩타이드 dTT831-840에 대한 렉틴 비시아 빌로사(Vicia Villosa)의 반응성을 도시한다.
도 18은 C-알릴 및 O-알릴 당과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에서 펩타이드 dTT831-840의 티올 농도의 동태를 도시한다.
도 19는 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 펩타이드 dTT831-840에 대한 렉틴 및-TF 항체의 반응성을 도시한다.
도 20은 환원된 dTT 또는 O-알릴-TF와의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 환원된 dTT에 대한 TF 항체의 반응성을 도시한다.
도 21은 광촉매 티올-엔 접합 반응의 다양한 단계에서 및 접합된 dTT의 환원 후에 dTT의 티올의 몰비를 도시한다.
도 22는 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 dTT의 렉틴 및 항-TF mAb에 대한 반응성을 도시한다.
도 23은 소량 또는 다량의 AAPH의 존재 하에 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합되거나 접합되지 않은 화학적으로 티올화된 dTT의 티올의 몰비를 도시한다.
도 24는 2개의 상이한 시간에 소량 또는 다량의 AAPH의 존재 하에 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 화학적으로 티올화된 dTT에 대한 렉틴 비시아 빌로사의 반응성을 도시한다.
도 25는 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 환원된 BSA에 대한 렉틴 및-TF 항체의 반응성을 도시한다.
도 26은 환원 조건과 환원된 BSA의 티올의 몰비 사이의 관계를 도시한다.
도 27은 다양한 유리 티올 몰비 및 다양한 양의 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 BSA에 대한 Tn-특이적 비시아 빌로사 렉틴 및 항-TF 항체의 반응성을 도시한다.
도 28은 환원 조건, 환원된 BSA의 티올의 몰비 및 O-알릴-TF와의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 환원된 BSA의 TF 반응성 사이의 관계를 도시한다.
도 29는 AAPH 및 O-알릴-Tn의 존재 또는 부재 하에 화학적 티올화 단독 또는 동시 광촉매 티올-엔 접합 반응과 함께 티올화에 의한 시간 함수로 BSA에서 티올 부가물의 몰비를 도시한다.
도 30은 AAPH 및 O-알릴-Tn의 존재 또는 부재 하에 티올화된 BSA 또는 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 동시에 티올화 및 접합된 BSA와 Tn-특이적 비시아 빌로사 렉틴의 반응성을 도시한다.
도 31은 시간의 함수로서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 BSA의 Tn-특이적 비시아 빌로사 렉틴의 티올 몰비와 반응성 사이의 관계를 도시한다.
도 24는 소량 또는 다량의 AAPH의 존재 하 및 2개의 파장에서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 천연 또는 티올화된 BSA에 대한에 대한 Tn-특이적 비시아 빌로사 렉틴의 반응성을 도시한다.
도 33은 소량 또는 다량의 AAPH에서 O-알릴-Tn과의 티올화 및 광촉매 티올-엔 접합 반응의 상이한 단계에서 갈락토스 몰비 및 BSA에 대한 항-TF mAb의 반응성 사이의 관계를 도시한다.
도 34는 표로 작성된 LC-MS 데이터와 함께 각각 C- 및 N-말단에서 시스테인 잔기를 갖는 dTT831-844-Cys-βAla 및 Cys-dTT831-844-βAla의 화학 구조를 도시한다.
도 35는 펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla의 상세한 LC-MS 데이터를 도시한다.
도 36은 펩타이드 Cys-dTT831-844-βAla의 상세한 LC-MS 데이터를 도시한다.
도 37은 C-말단 펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla 상에서 O-알릴 Tn의 광분해 AAPH-촉매된 티올-엔 반응을 도시한다.
도 38은 C-말단 펩타이드 상에서 O-알릴 Tn의 LC-MS 프로파일을 도시한다.
도 39는 N-말단 펩타이드 Cys-dTT831-844-βAla 상에서 O-알릴 Tn의 광분해 AAPH-촉매된 티올-엔 반응을 도시한다.
도 40은 N-말단 펩타이드 상에서 O-알릴 Tn의 LC-MS 프로파일을 도시한다.
시퀀싱 목록
본 출원은 2019년 3월 19일자로 생성된 약 4KB 크기의 컴퓨터 판독 가능 형태의 서열 목록을 포함한다. 컴퓨터 판독 가능한 형태는 본원에 인용되어 포함된다.
도 1은 인간 당 단백질(MUC: human glycoprotein)로부터 주요 종양 관련 탄수화물 항원(TACA: tumor-associated carbohydrate antigen)의 통상적인 화학 구조의 예를 도시한다.
도 2는 탄수화물 항원(B 세포 에피토프)을 면역원성 담체 단백질의 이용 가능한 티올기(예컨대, 파상풍 톡소이드와 같은 T 세포 에피토프)에 직접 접합하기 위한 제안된 "클릭 화학" 접근법을 도시한다.
도 3은 Tn 또는 TF 항원을 담체 단백질 파상풍 톡소이드 상의 6개의 천연 "유리" 시스테인 잔기에 접합시키기 위해 광촉매 티올-엔 반응에 의해 제조된 "정밀(precision) 당 접합체"의 예를 도시한다.
도 4는 티올-특이적 요오드아세트아미도기 또는 말레이미도기에 연결되고 이어서 pH 8 미만(요오드아세트아미도기 또는 말레이미도기)의 반응 또는 티올-엔 반응(말레이미도기)을 통해 담체 단백질 상의 "유리" 시스테인 잔기에 접합된 Tn 또는 TF 항원을 사용하여 제조된 "정밀 당 접합체"의 예를 도시한다.
도 5는 실시예 2 내지 6에 기재된 바와 같이 담체 단백질에 대한 접합 준비가 된 알릴 Tn 항원 및 알릴 TF 항원의 합성을 위한 반응식을 도시한다.
도 6a 내지 도 6d는 알릴 2-아세토아미도-3,6-디-O-피발로일-2-데옥시-α-D-글루코피라노사이드(화합물 2)에 대한 1H-NMR(도 6a) 및 13C-NMR(도 6b) 스펙트럼과 질량 분석 결과(도 6c 및 6d)를 도시한다.
도 7a 내지 도 7d는 알릴 2-아세토아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴 Tn)에 대한 1H-NMR(도 7a) 및 13C-NMR(도 7b) 스펙트럼과 질량 분 결과(도 7c 및 7d)를 도시한다.
도 8a 내지 도 8c는 알릴 2-아세토아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 4)에 대한 1H-NMR(도 8a) 스펙트럼과 질량 분 결과(도 8b 및 8c)를 도시한다.
도 9a 내지 도 9d는 알릴 (2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 6)에 대한 1H-NMR(도 9a) 및 13C-NMR(도 9b) 스펙트럼과 질량 분 결과(도 9c 및 9d)를 도시한다.
도 10a 내지 도 10d는 화합물 7에 대한 1H-NMR(도 10a) 및 13C-NMR(도 10b) 스펙트럼과 질량 분 결과(도 10c 및 10d)를 도시한다.
도 11a 내지 도 11d는 알릴 (β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴l TF)에 대한 1H-NMR(도 11a) 및 13C-NMR(도 11b) 스펙트럼과 질량 분 결과(도 11c 및 11d)를 도시한다.
도 12는 TF-TT 당 접합체 단독(상단 좌측 패널), 땅콩 렉틴 단독(상단 우측 패널), 또는 양쪽 모두 조합된(하단 패널)의 동적 광 산란(DLS) 분석의 결과를 도시한다.
도 13은 O-알릴-Tn 및 O-알릴-TF와의 광촉매 티올-엔 접합 반응에서 시간 함수로서 펩타이드 dTT831-840의 티올 농도를 도시한다.
도 14는 펩타이드의 시스테인 위치 및 AAPH 또는 DMPA 존재의 함수로서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에서 펩타이드 dTT831-840의 티올의 배수 감소를 도시한다.
도 15는 펩타이드의 시스테인 위치 및 AAPH 또는 DMPA 존재의 함수로서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 Tn에 접합된 펩타이드 dTT831-840에 대한 렉틴의 반응성을 도시한다.
도 16은 AAPH 또는 DMPA의 존재 하에 상이한 파장에서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에서 펩타이드 dTT831-840의 티올 농도의 동태를 도시한다.
도 17은 AAPH 또는 DMPA의 존재 하에 상이한 파장에서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 Tn에 접합된 펩타이드 dTT831-840에 대한 렉틴 비시아 빌로사(Vicia Villosa)의 반응성을 도시한다.
도 18은 C-알릴 및 O-알릴 당과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에서 펩타이드 dTT831-840의 티올 농도의 동태를 도시한다.
도 19는 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 펩타이드 dTT831-840에 대한 렉틴 및-TF 항체의 반응성을 도시한다.
도 20은 환원된 dTT 또는 O-알릴-TF와의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 환원된 dTT에 대한 TF 항체의 반응성을 도시한다.
도 21은 광촉매 티올-엔 접합 반응의 다양한 단계에서 및 접합된 dTT의 환원 후에 dTT의 티올의 몰비를 도시한다.
도 22는 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 dTT의 렉틴 및 항-TF mAb에 대한 반응성을 도시한다.
도 23은 소량 또는 다량의 AAPH의 존재 하에 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합되거나 접합되지 않은 화학적으로 티올화된 dTT의 티올의 몰비를 도시한다.
도 24는 2개의 상이한 시간에 소량 또는 다량의 AAPH의 존재 하에 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 화학적으로 티올화된 dTT에 대한 렉틴 비시아 빌로사의 반응성을 도시한다.
도 25는 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 환원된 BSA에 대한 렉틴 및-TF 항체의 반응성을 도시한다.
도 26은 환원 조건과 환원된 BSA의 티올의 몰비 사이의 관계를 도시한다.
도 27은 다양한 유리 티올 몰비 및 다양한 양의 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 BSA에 대한 Tn-특이적 비시아 빌로사 렉틴 및 항-TF 항체의 반응성을 도시한다.
도 28은 환원 조건, 환원된 BSA의 티올의 몰비 및 O-알릴-TF와의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 환원된 BSA의 TF 반응성 사이의 관계를 도시한다.
도 29는 AAPH 및 O-알릴-Tn의 존재 또는 부재 하에 화학적 티올화 단독 또는 동시 광촉매 티올-엔 접합 반응과 함께 티올화에 의한 시간 함수로 BSA에서 티올 부가물의 몰비를 도시한다.
도 30은 AAPH 및 O-알릴-Tn의 존재 또는 부재 하에 티올화된 BSA 또는 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 동시에 티올화 및 접합된 BSA와 Tn-특이적 비시아 빌로사 렉틴의 반응성을 도시한다.
도 31은 시간의 함수로서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 BSA의 Tn-특이적 비시아 빌로사 렉틴의 티올 몰비와 반응성 사이의 관계를 도시한다.
도 24는 소량 또는 다량의 AAPH의 존재 하 및 2개의 파장에서 O-알릴-Tn과의 광촉매 티올-엔 접합 반응에 의해 접합된 천연 또는 티올화된 BSA에 대한에 대한 Tn-특이적 비시아 빌로사 렉틴의 반응성을 도시한다.
도 33은 소량 또는 다량의 AAPH에서 O-알릴-Tn과의 티올화 및 광촉매 티올-엔 접합 반응의 상이한 단계에서 갈락토스 몰비 및 BSA에 대한 항-TF mAb의 반응성 사이의 관계를 도시한다.
도 34는 표로 작성된 LC-MS 데이터와 함께 각각 C- 및 N-말단에서 시스테인 잔기를 갖는 dTT831-844-Cys-βAla 및 Cys-dTT831-844-βAla의 화학 구조를 도시한다.
도 35는 펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla의 상세한 LC-MS 데이터를 도시한다.
도 36은 펩타이드 Cys-dTT831-844-βAla의 상세한 LC-MS 데이터를 도시한다.
도 37은 C-말단 펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla 상에서 O-알릴 Tn의 광분해 AAPH-촉매된 티올-엔 반응을 도시한다.
도 38은 C-말단 펩타이드 상에서 O-알릴 Tn의 LC-MS 프로파일을 도시한다.
도 39는 N-말단 펩타이드 Cys-dTT831-844-βAla 상에서 O-알릴 Tn의 광분해 AAPH-촉매된 티올-엔 반응을 도시한다.
도 40은 N-말단 펩타이드 상에서 O-알릴 Tn의 LC-MS 프로파일을 도시한다.
시퀀싱 목록
본 출원은 2019년 3월 19일자로 생성된 약 4KB 크기의 컴퓨터 판독 가능 형태의 서열 목록을 포함한다. 컴퓨터 판독 가능한 형태는 본원에 인용되어 포함된다.
본 명세서는 당 접합체 면역원(예컨대, 백신으로서, 진단에서 또는 특이적인 항-당 접합체 항체와 같은 진단 또는 치료 도구를 생성하기 위한 용도로)에 관한 것이다. 본원에 기재된 당 접합체 면역원은 일반적으로 면역원성 담체 단백질에 커플링된 탄수화물 항원을 포함한다. 보다 구체적으로, 담체 단백질은 하나 이상의 유리 티올기(예컨대, 시스테인 잔기의 측쇄에 해당)을 포함하고 탄수화물 항원은 이러한 유리 티올기 중 하나 이상에서 담체 단백질에 접합된다. 본 명세서는 또한 예를 들어 "클릭-화학" 접근법(예컨대, 광촉매 티올-엔 반응)을 사용하여 담체 단백질의 유리 티올기에 탄수화물 항원을 직접 접합시키는 것을 포함하는 당 접합체 면역원/백신을 합성하는 개선된 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 개선된 접합 방법은 접합의 특이성에 영향을 주지 않으면서 담체 단백질의 활성, 면역원성 및/또는 구조를 파괴(예컨대, 천연 이황화 가교의 절단 및/또는 변성)를 피하는 데 충분히 온화한 조건 하(예컨대, 수용성 시약만 사용, 유기 용매의 부재, 담체 단백질 변성을 피하기 위해 충분히 낮은(예컨대, < 5%) 농도의 및/또는 상대적으로 중성 pH의 유기 용매의 사용)에서 수행될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 공정을 더욱 단순화하는, 촉매 존재 하에 자외선(예컨대, 355 nm 또는 365 nm) 하 또는 촉매의 부재 하에 단파 자외선 (예컨대, 254 nm에서) 하에서 수행될 수 있다.
본원에 기재된 접합 방법에 의해 제공되는 더 높은 정밀도로 인하여, 본원에 기재된 당 접합체 면역원/백신은 (탄수화물 분포 측면에서) 더 높은 균질성을 가질 수 있으며, 다른 아미노산 측쇄(예컨대, 라이신으로부터의 아민 또는 글루타메이트/아스파르테이트 잔기로부터의 산)에 대한 무작위 커플링에 의존하는 당 접합체에 비해 특성화하가 더 용이할 수 있다. 이러한 특성은 당 접합체 백신의 규제 승인 및/또는 상업화를 용이하게 할 수 있으며, 이 양쪽 모두 전통적인 접근 방식에 기초하여 어렵다고 역사적으로 입증되었다.
일부 양태에서, 본 명세서는 당 접합체 면역원을 제조하는 방법(예컨대, 대상체에게 투여하기 위한)에 관한 것이다. 본원에 사용된 "대상체"라는 용어는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 당 접합체 면역원에 대한 면역 반응을 개시할 수 있어서, 바람직하게는 당 접합체 면역원과 특이적으로 결합하는 항체의 생성으로 이어지는 살아있는 존재(예컨대, 동물 또는 인간)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 대상체는 치료적으로(예컨대, 본원에 기재된 당 접합체 면역원으로 백신접종을 통해) 치료될 환자일 수 있거나, 연구, 진단 및/또는 치료 목적용 도구(예컨대, 항체)를 생성하기 위한 수단으로 사용될 수 있다. 당 접합체 면역원을 제조하는 방법은 일반적으로 티올-특이적 작용기를 갖는 (예컨대, 이를 포함하기 위해 화학적으로 변형된) 탄수화물 항원을 제공하는 단계; 하나 이상의 유리 티올기(예를 들어, 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기 및/또는 이황화 가교에 관여하지 않는 시스테인)을 갖는 담체 단백질을 제공하는 단계; 및 탄수화물 항원을 담체 단백질과 반응시켜 담체 단백질의 유리 티올기의 위치에 해당하는 하나 이상의 예측 가능한(비 무작위) 부착 지점에서 탄수화물 항원을 담체 단백질에 커플링시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이후 백신(예컨대, 애주번트를 포함)으로 제형화 될 수 있는 당 접합체 면역원을 정제하거나 단리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "당 접합체"라는 용어는 관심의 대상인 대상체에서 탄수화물 항원의 면역원성을 향상시키기 위해 담체 단백질에 커플링된 탄수화물 항원(예컨대, 항원성 단당류, 이당류, 올리고당류 또는 다당류)을 지칭한다. "탄수화물 항원" 및 "당 항원"이라는 표현은 본원에 사용된 것과 동일한 의미를 갖는다. "면역원"이라는 용어는 관심의 대상인 대상체에서 (예컨대, 항체 및/또는 림프구에 의해) 면역 시스템의 성분에 의해 특이적으로 결합될 수 있고 체액성 및/또는 세포 매개 면역 반응을 생성할 수 있는 작용제을 지칭한다. 본원에 사용된 "당 접합체 면역원"과 같은 표현에서 "면역원"이라는 용어는 당 접합체 자체를 특정한 용도(예컨대, 대상체에서 면역 반응을 발생하기 위한 면역원으로서)로 한정하지 않으면서 당 접합체의 능력(즉, 물리적 특성 또는 성질)을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 당 접합체 면역원은 생물학적 샘플(예컨대, 대상체로부터)에서 당 접합체 면역원에 결합하는 항체의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 진단 분석 또는 방법(예를 들어, 시험관 내 방법)에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 당 접합체 면역원은 당 접합체 면역원에 특이적으로 결합하는 항체(예컨대, 진단적으로 또는 치료적으로 적용 가능한 단일클론성 항체)를 스크리닝, 확인 또는 평가하기 위해 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서는 담체 단백질의 유리 티올기에 탄수화물 항원을 직접 접합시키기 위한 "클릭 화학-유형" 접근법의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로, 도 2에 도시된 바와 같이, 광촉매 티올-엔 반응은 탄수화물 항원(R2)이 광촉매 티올 반응을 사용하여 담체 단백질(R1)의 시스테인 티올기(-SH)에 직접 공유 부착하기에 적합한 말단 알켄 작용기(알케닐 탄수화물 항원)를 함유하도록 변형되는 것이 바람직하다. 도 3을 참조하면, B-세포 에피토프를 포함하는 탄수화물 항원(예컨대, 종양 관련 탄수화물 항원 Tn 및 TF)은 6개의 이용 가능한 시스테인 잔기(이황화 가교에 관여하는 4개의 시스테인 잔기 제외)로 인해 6개의 유리 티올기를 갖는 것으로 알려져 있는 파상풍 톡소이드(TT)와 같은 면역원성 담체 단백질에 티올-엔 반응을 통해 광화학적으로 접합될 수 있다. 도 3에 나타낸 파상풍 톡소이드 담체 단백질의 경우, 본원에 기재된 접합 방법은 바람직하게는 예측 가능한(비 무작위) 부착 지점에서 정확히 6개의 탄수화물 항원이 접합되도록 한다. 본원에 기재된 방법은 알켄기로 종결(말단 알켄)하도록 만들어 질 수 있는, 천연 또는 합성의 임의의 단당류, 올리고당류 및 다당류에 적용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 (예컨대, 바람직하게는 NaBH4 및/또는 NaBH3CN을 사용하여, 글리코 시드 결합 또는 알릴 아민과 환원당 사이에서와 같이 환원성 아민화에 의해 수득되는 결합을 통해) 말단 알켄에 (링커 또는 스페이서를 통해 직접 또는 간접적으로) 연결되도록 화학적으로 변형될 수 있으며, 알케닐 탄수화물 항원의 말단 알켄기는 티올-엔 반응(예컨대, 광촉매 티올-엔 반응)을 통해 담체 단백질(예컨대, 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기 및/또는 이황화 가교에 관여하지 않는 시스테인)의 유리 티올에 접합 가능하다. 알케닐 탄수화물 항원의 말단 알켄기는 모노치환된 알켄, 비닐기 또는 알릴기일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 알케닐 탄수화물 항원은 수용성이고, 본원에 기재된 수성 티올-엔 반응에서 이의 사용을 가능하게 한다.
본 명세서에 사용된 "글리코시드 결합"은 S-글리코시드 결합, N-글리코시드 결합, O-글리코시드 결합 또는 C-글리코시드 결합 중 하나 이상 또는 (예컨대, NaBH4 또는 바람직하게는 NaBH3CN 사용하여) 환원당의 환원성 아민화에 의해 수득되는 결합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 글시코시드 결합은 투여될 대상체의 내인성 효소(예컨대, 글리코하이드롤라제(glycohydrolase))에 의해 절단될 수 없는 것일 수 있다. 이러한 절단 불가능한 글리코시드 결합은 대상체에게 투여된 후 더 긴 반감기를 갖는 당 접합체 면역원을 생성할 수 있으며, 이는 차례로 치료 및/또는 항체 발생 목적을 위해 더 바람직한 면역 반응을 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 글리코시드 결합은 S-글리코시드 결합, N-글리코 시드 결합 또는 C-글리코 시드 결합, 또는 알릴 아민과 환원당 사이와 같은 환원성 아민화에 의해 수득된 결합일 수 있다.
일부 실시형태에서, "링커" 또는 "스페이서"의 사용이 바람직하며, 이러한 용어는 탄수화물 항원이 대상체의 면역 시스템에 의해 인식될 수 있도록(예컨대, 담체 단백질에 의해 마스킹되는 것과 반대로) 접합되는 담체 단백질로부터 탄수화물 항원의 충분한 물리적 분리를 제공하는 화학적 연결을 지칭하는데 본원에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 링커는 C, S, N 및 O로부터 선택된 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 인접 잔기의 사슬을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "접합 가능한"이라는 용어는 분자가 실제로 서로 공유적으로 결합하는지 여부에 관계없이 화학 반응을 통해 서로 공유적으로 결합되는 적어도 2개의 분자(예컨대, 탄수화물 항원 및 담체 단백질)의 능력을 지칭한다. 이에 반하여, "접합된"이라는 용어는 서로 공유적으로 결합된 적어도 2개의 분자(예컨대, 탄수화물 항원 및 담체 단백질)를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 상이한 유형의 탄수화물 항원은 티올-엔 반응을 통해 티올기에 직접 접합 가능한 말단 알켄기로 종결하도록 만들어 질 수 있다. 예를 들어, 말단 알켄기를 갖는 탄수화물 항원은 알릴 Tn 및 알릴 TF 반응물의 합성을 위해 실시예 2 내지 7에서 본원에 기재된 접근법을 채택함으로써 합성될 수 있다.
일부 실시헝태에서, 말단 알켄기를 갖는 탄수화물 항원은 예를 들어, Tn-TT 및 TF-TT 접합체의 합성을 위해 실시예 8 및 9에서 본원에 기재된 접근법을 채택함으로써 광촉매 티올-엔 반응을 사용하여 담체 단백질의 유리 티올기에 접합될 수 있다. 예를 들어, 수성 용매(예컨대, PBS와 같은 완충액)에 용해된 하나 이상의 알케닐 탄수화물 항원은 자외선 조사에 적합한 용기(예컨대, 석영 셀)에서 수성 용매(예컨대, PBS와 같은 완충액)에 또한 용해된 담체 단백질과 혼합된다. 이후, 혼합물은 촉매(예컨대, 광개시제 또는 활성화제)의 존재 또는 부재 하에 단파, 중파 또는 장파 자외선(예컨대, 약 254 nm, 약 355 nm 또는 약 365 nm에서 피크 파장을 가짐)하에 조사된다. 본원에 사용된 티올-엔 반응의 맥락에서, "촉매", "광개시제" 및 "활성화제"는 광촉매 티올-엔 반응을 통해 하나 이상의 유리 티올기에서 담체 단백질에 대한 탄수화물 항원의 접합을 가속화하는 물질을 지칭하는 데 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 촉매는 수용성 유리 라디칼 발생 아조 화합물과 같은 수용성 광개시제; 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드(Vazo 44 또는 VA-044); 2,2'-아조비스 (2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH); 광개시제 활성을 갖는 금속 또는 금속 이온; 또는 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응에서 광개시제 활성을 갖는, 이의 임의의 유도체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 촉매는 tert-부틸 하이드로퍼옥사이드 또는 벤조일퍼옥사이드, 또는 암모늄 퍼설페이트와 같은 수용성 광개시제, 또는 다른 적합한 촉매일 수 있다.
일부 실시형태에서, 촉매는 수불용성 유리 라디칼 발생 아조 화합물과 같은 수불용성 광개시제; 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA), 아조비스이소부티로니트릴(AIBN), 2,2′-아조비스(2-메틸프로피오니트릴), 4,4′-아조비스(4-시아노펜탄산)(ACVA), 1,1′-아조비스(시아노사이클로헥산)(ACHN), 디아제네디카르복실산 비스(N,N-디메틸아미드)(TMAD); 아조디카르복실산 디피페리디드(ADD), 또는 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응에서 광개시제 활성을 갖는, 이들의 임의의 유도체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 예를 들어, 당 중합을 감소, 최소화하거나 피하기 위하여 담체 단백질의 유리 티올기 당 알케닐 탄수화물 항원(즉, 말단 알켄을 포함하는 탄수화물 항원)의 몰 당량의 비율을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 담체 단백질의 유리 티올기 당 탄수화물 1 내지 300, 1 내지 250, 1 내지 200, 1 내지 100, 또는 1 내지 10, 1 내지 5, 또는 1 내지 2 몰 당량을 반응시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 (예컨대, 엘만(Ellman) 테스트에 의해 결정되는 바와 같이) 담체 단백질 중의 총 유리 티올 농도의 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50-배 감소를 달성하기에 충분한 시간 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 10 내지 300, 10 내지 270, 10 내지 240, 10 내지 210, 10 내지 180, 10 내지 150, 10 내지 120, 10 내지 90, 10 내지 60 또는 10 내지 30분 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 4.0 및 약 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10 사이의 pH에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 담체 단백질 변성을 피하는 pH에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 광촉매 티올-엔 반응은 4 및 5 사이의 pH에서, 바람직하게는 pH 4.4에서 (예컨대, 아세테이트 완충액에서) 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 티올-엔 접합 반응이 수성 시약 및 수성 용매를 사용해서만 수행될 수 있음에 따라, 수용성 광개시제의 사용은 (유기 용매를 필요로 하는 광개시제에 비해)은 유리할 수 있는데, 이는 문헌[Dondoni et al., 2009] 및 문헌[Dondoni et al., 2012]에 기재된 바와 같이, 유기 용매가 담체 단백질의 변성뿐만 아니라 비-유리 시스테인 잔기(예컨대, 분자 내 및/또는 분자간 이황화 결합에 관여하는 시스테인)에 대한 원치 않는/예측 불가능한 접합에 기여할 수 있기 때문이다.
대안적인 실시형태에서, 수불용성 광개시제는 이의 용해를 위해 필요에 따라 유기 용매와 함께 사용될 수 있다. 바람직하게는, 유기 용매의 존재 또는 농도는 담체 단백질의 변성뿐만 아니라 비-유리 시스테인 잔기(예컨대, 분자 내 및/또는 분자간 이황화 결합에 관여하는 시스테인)에 대한 원치 않는/예측 불가능한 접합에 기여하지 않아야 한다. 예를 들어, 이러한 광개시제는 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA)와 같은 것일 수 있다.
본원에 기재된 티올-엔 접근법에 대한 대안적인 실시형태에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 하나 이상의 티올-특이적 작용기, 예컨대 요오드아세트아미드, 말레이미드, 벤질 할로겐화물 또는 브로모메틸케톤을 갖도록 변형될 수 있으며, 이는 티올의 S-알킬화에 의해 반응하여 안정한 티오에테르 생성물을 생성한다(예컨대, 라이신 잔기에 대한 원치 않는 무작위 탄수화물 항원 접합을 피할 수 있는 9, 8, 7.5 또는 7 미만 및 5, 5.5 또는 6 초과와 같은 비교적 낮은 pH에서 수행됨). 티올-특이적 작용기(예컨대, 요오드아세트아미도기 및 말레이미도기)를 포함하도록 변형된 탄수화물 항원의 예는 도 4에 도시되어 있다. 일부 실시형태에서, 말레이미도기는 티올-엔 반응을 통해 담체 단백질의 티올기에 접합 가능한 말단 알켄으로 적합하다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 하나 이상의 B 세포 에피토프를 포함할 수 있고/있거나 T 세포 에피토프를 포함할 수 있고/있거나 투여 시 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 당 접합체 면역원은 대상체에 투여 시 탄수화물 항원에 (예컨대, 체액성 반응에 더하여) 적어도 세포 매개 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 예를 들어, 종양 관련 탄수화물 항원(TACA)이거나 이를 포함할 수 있다. 암세포의 외부 세포막의 당 단백질과 당 지질은 특정 O-글리칸을 과발현한다. 이러한 당 단백질은 MUC1이 가장 광범위하게 조사되어 있는 총괄적으로 뮤신(MUC: mucin)으로 알려진 단백질 군을 구성한다. 정상 세포 상의 MUC는 복잡한 글리코실화 패턴을 발생시키는 활성 글리코실트랜스퍼라제 인하여 심하게 O- 글리코실화된다. 암세포에서 주요 글리코실트랜스퍼라제의 하향 조절은 더 짧은 글리칸의 축적을 유발하여 뮤신 상에서 훨씬 더 제한된 O-글리코실화를 발생시킨다. 정상 세포와 암 세포 사이의 이러한 변경된 글리코실화 패턴의 결과는 그렇지 않으면 정상 조직 상의 복잡한 글리코실화에 의해 암호화되는(마스킹되는) TACA의 과잉 축적이다. 가장 일반적인 TACA는 Tn 항원(N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 구조를 갖는 단당류), TF 항원(톰슨 프라이덴리히 항원, Galβ1-3GalNAcα1 구조를 갖는 이당류) 및 이들의 동족 시알릴화 유사체를 각각 포함한다. 여러 유형의 종양 세포의 세포 표면에서 Tn 및 TF 항원 양쪽 모두의 과발현은 암세포 부착 및 수용체 렉틴을 포함하는 부위(폐, 간, 림프절 등)로의 심각한 전이에 기여한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 TACA는 Tn 항원, STn 항원, 톰슨 프라이덴리히(TF) 항원, (2,3)-S-TF, (2,6)-S-TF, Globo H, GD2, GD3, GM2, GM3, N-글리콜릴-GM3, Lea, sLea, Lex, sLex, 또는 이들의 임의의 조합이고, 이로부터 온 것이거나 이를 포함한다. 일부 일반적인 TACA의 구조는 도 1에 도시되어 있다. 본원에 사용된 "이로부터 온"이라는 표현은 공지된 탄수화물 항원으로부터 유래된 탄수화물 변이체를 지칭하며, 변이체는 공지된 탄수화물 항원의 항원성을 적어도 유지한다. 당업자를 위해, 알케닐-말단 TACA의 합성은 문헌[Danishefsky et al., 2015]에 기재된 바와 같이 화학적 및 화학효소적 공정 모두에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 박테리아 및/또는 바이러스와 같은 (이에 한정되지는 않는) 감염성 제제와 관련되거나 박테리아 감염 및/또는 바이러스 감염과 같은 (이에 한정되지는 않는) 감염과 관련된 탄수화물 항원일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 탄수화물 항원은 예를 들어 바이러스성 다당류 항원 또는 박테리아성 캡슐형 다당류(CPS)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 박테리아성 CPS는 폐렴구균 및/또는 연쇄구균 다당류 혈청형, 수막구균 CPS 또는 인플루엔자(예컨대, 인플루엔자 유형 a 및 b) CPS이고, 이로부터 온 것이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 접합 방법은 동일하거나 1개 초과 유형의 탄수화물 항원을 담체 단백질에 접합시켜 다가 당 접합체 면역원을 제조할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 다가 당 접합체 면역원은 담체 단백질에 접합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 이상의 동일하거나 상이한 유형의 탄수화물 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 다가 당 접합체 면역원은 (예컨대, 분지형 링커를 통해) 담체 단백질 상의 단일 유리 티올기에 접합된 하나 초과의 탄수화물 항원을 포함할 수 다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 다가 당 접합체 면역원은 (예컨대, 광범위한 분지를 갖는 링커를 통해) 덴드리머로서 담체 단백질 상에서 단일 유리 티올기에 접합된 복수개(예컨대, 적어도 3, 4, 5, 6 ,7 8, 9. 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의) 탄수화물 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 담체 단백질은 하나 이상의 유리 티올기를 포함한다. 본원에 사용된 "유리 티올" 또는 "유리 티올기"는 화학적 변형 및/또는 접합(예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 탄수화물 항원에 대한)에 이용 가능한 하나 이상의 설프하이드릴기를 갖는 담체 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 주어진 담체 단백질의 유리 티올 농도는 예를 들어, 본 실시예에 기재된 바와 같이, 시스테인 표준 곡선을 사용하는 엘만 테스트를 사용하여 측정될 수 있다. 주어진 담체 단백질의 유리 티올 농도는 유리 티올 농도의 배수 감소로 표현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 당 접합체는 (예컨대, 엘만(Ellman) 테스트에 의해 측정되는 바와 같이) 본원에 기재된 접합 방법에 따라 유리 티올 농도의 적어도 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3 또는 2-배 감소를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 담체 단백질은 하나 이상의 추가 시스테인 잔기를, 예를 들어 아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 이들 사이의 담체 단백질의 임의의 용매-접근 가능한 위치에 추가하도록 조작될 수 있다(용매 접근이 불가능하거나 단백질 담체의 3차원 구조 내에 "매립"되지 않는 위치에서는 반대로). 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 단백질 담체의 유리 티올기는 반응이 담체 단백질의 면역원성, 구조 또는 활성을 파괴하지 않을 만큼 충분히 온화한 조건 하에서 수행되는 경우, 광촉매 티올-엔 반응에 의해 알케닐 탄수화물 항원에 용이하게 접합될 수 있는 시스테인으로 정의될 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질과 관련하여 본원에 사용된 "활성"이라는 용어는 탄수화물 항원(예컨대, 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 항체에 대한)의 면역원성을 보존하는 담체 단백질의 능력을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 유리 티올기는 담체 단백질의 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기 및/또는 일부 경우에 담체 단백질의 구조를 유지하는 데 중요할 수 있는 이황화 가교에 관여하지 않는 시스테인을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 하나 이상의 이황화 가교를 갖는 단백질일 수 있고, 여기서 하나 이상의 이황화 가교는 탄수화물 항원에 대한 접합 후에 영향을 받지 않고(즉, 온전하게) 유지된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 담체 단백질은 이의 N 및/또는 C-말단에서 유리 티올기를 포함하지 않는다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 담체 단백질은 이의 N 및/또는 C-말단에서 유리 티올기를 포함할 수 있거나 이를 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 하나 이상의 이황화 가교를 갖는 단백질일 수 있고, 여기서 담체 단백질은 환원제 (예컨대, 디티오트레이톨(DTT), 2-메르캅토에탄올, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 2-메르캅토에틸아민-HCl)로 전처리 되어 탄수화물 항원에 대한 접합을 위해 하나 이상의 추가 유리 티올기를 노출시킬 수 있다. 이러한 전처리는 예를 들어 변성된(환원된) 담체 단백질이 천연(환원되지 않은) 담체 단백질보다 대상체에서 더 높은 면역원성을 가질 경우 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 담체 단백질은 광촉매 티올-엔 반응을 수행하기 전에 또는 수행과 함께 환원제(예컨대, 본원에 기재된 바와 같이)로 전처리될 수 있다. 이 전처리는 접합에 사용할 수 있는 추가 유리 티올기를 노출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 광촉매 티올-엔 반응을 수행하기 전에 또는 수행과 함께 티올화제(예컨대, 2-이미노티올란, N-하이드록시석신이미드 디티오프로피오네이트(DPS))로 전처리될 수 있다. 이 전처리는 접합에 사용할 수 있는 유리 티올기의 수를 증가시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 광촉매 티올-엔 반응을 수행하기 전에 또는 수행과 함께 티올화제로 전처리될 수 있고, 이어서 환원제로 전처리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질 상의 인접한 위치에 접합된 너무 많은 다중 탄수화물 항원을 갖는 것을 피하는 것이 유리할 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 바람직하게는 시스테인이 풍부한 도메인(예컨대, 적어도 50%의 시스테인 잔기를 포함하는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 연속적인 아미노산의 세그먼트)이 결여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 담체 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 총 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 총 유리 시스테인 잔기를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 당 접합체 면역원에 포함된 탄수화물 항원의 총 수는 접합 전에 담체 단백질 상에서 이용 가능한 유리 티올기의 수와 동일하다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 당 접합체 면역원은 담체 단백질 당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 탄수화물 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서는 탄수화물 접합 종의 측면에서 약 또는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 당 접합체 면역원을 포함하는 조성물에 관한 것이다(예컨대, 조성물 중의 적어도 90%의 당 접합체 면역원 종/분자는 담체 단백질에 접합된 동일한 수의 탄수화물 항원을 갖는다).
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 담체 단백질은 당 접합체 면역원에 투여될 대상체에 바람직하게 면역원성인 단백질(예컨대, 펩타이드 또는 폴리펩타이드)이다. 바람직하게는, 탄수화물 항원에 대한 담체 단백질의 접합은 비 접합 탄수화물 항원(즉, 대상체에게 단독으로 투여되는 탄수화물 항원)의 투여와 비교하여 대상체에게 투여 시 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 담체 단백질은 T 세포 에피토프를 포함할 수 있고/있거나 투여 시 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 담체 단백질은 바람직하게는 대상체에서 (가까운) 오르토로그를 갖지 않는, 투여될 대상체에 외인성인 단백질이다. 인간 백신 제조의 맥락에서, 본원에 기재된 담체 단백질은 담체 단백질이 인간에서 "자가 항원"으로 간주되지 않도록 인간 단백질과 항원적으로 구별되는 담체 단백질을 의미하는 "인간 사용에 적합한 담체 단백질" 또는 단순히 "적합한 담체 단백질"을 지칭한다. 해당하는 인간 단백질과 항원적으로 너무 유사한 담체 단백질을 사용하면 인간 백신에서 이상적이지 않을 수 있는 "자가 항원"으로 간주되는 담체 단백질이 될 수 있다. 예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA)의 라이신 잔기의 ε-아미노기에 무작위로 접합된 TF 항원으로 구성된 당 접합체 면역원은 이전에 기재되고 특성화되었다(예컨대, 문헌[Demian et al., 2014; Rittenhouse-Diakun et al., 1998; Heimburg et al., 2006; Tati et al., 2017]). 그러나, BSA의 59개 라이신 잔기 상에서 탄수화물의 수준이 무작위적이고 비효율적이었을 뿐만 아니라(BSA 분자 당 4 내지 6개의 TF 항원이 접합되었음), BSA는 인간 알부민과 항원적으로 너무 유사하기 때문에 인간 백신에서 담체 단백질로서 적합하지 않을 것이다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민)이 아니다.
바람직하게는, 본원에 기재된 담체 단백질은 (예컨대, 승인된 백신에서) 인간 대상체 투여에 대해 규제(예컨대, FDA) 승인을 이미 받은 단백질 일 수 있다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차 반응 물질 197(CRM197), 수막구균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자 단백질 D(HiD), 사이토카인 또는 이들의 면역원성 단편 (또는 변이체)이거나 이들로부터 오거나 이들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 담체 단백질은 10개의 시스테인 잔기를 함유하는 TT 일 수 있으며, 그 중 4개는 이황화 가교에 관여하여 6개의 접합된 탄수화물 항원을 갖는 당 접합체 면역원을 생성한다. 일부 실시형태에서, 담체 단백질은 4개의 시스테인 잔기를 함유하는 CRM197일 수 있으며, 이는 4개의 접합된 탄수화물 항원을 갖는 당 접합체 면역원을 생성한다.
일부 실시형태에서, 담체 단백질은 탄수화물 항원에 대한 접합을 위해 추가 유리 티올기를 도입하기 위해 추가 시스테인 잔기를 도입하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스테인 잔기는 담체 단백질의 용매 노출 부분에서 조작될 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서는 당 접합체 백신 또는 면역 반응 촉발 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 방법은 본원에 기재된 당 접합체 면역원을 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트와 함께 제형화하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 애주번트는 무기 화합물, 미네랄 오일, 미생물 유도체, 식물 유도체, 사이토카인, 스쿠알렌, 명반, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 수산화 인산 칼슘, 톨 유사 수용체 작용제, 면역자극성 폴리뉴클레오타이드(예컨대, CPG), 면역자극성 지질, 프로인트 애주번트, RIBI의 애주번트, QS-21, 무라밀 디펩타이드, TiterMaxTM, SteviuneTM, StimuneTM 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서는 하나 이상의 탄수화물 항원 및 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기를 갖는 면역원성 담체 단백질을 포함하는 합성 당 접합체 면역원에 관한 것이며, 여기서 하나 이상의 탄수화물 항원은 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기에서 면역원성 담체 단백질에 연결된다. 면역원성 담체 단백질에 대한 하나 이상의 탄수화물 항원의 접합은 비 접합 탄수화물 항원의 투여와 비교하여 대상체에게 투여 시 하나 이상의 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시킨다. 본원에 사용된 "합성"이라는 용어는 인간 개입에 의해 생성되는 자연의 생성물이 아닌 화합물을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 당 접합체 면역원은 동일한 담체 단백질에 접합된 하나 초과의 종의 탄수화물 항원(예컨대, 하나 초과의 유형의 TACA)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 당 접합체 면역원은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 유형 또는 종의 탄수화물 항원(예컨대, TACA)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 당 접합체 면역원은 Tn, S-Tn, 톰슨 프라이덴리히(TF), (2,3)-S-TF, (2,6)-S-TF, Globo H, GD2, GD3, GM2, GM3, N-글리콜릴-GM3, Lea, sLea, Lex 및 sLex로부터 선택된 TACA의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각 TACA의 조합에서 비율은 표적 종양에 따라 달라질 수 있으며 1 내지 20 몰비를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에 기재된 당 접합체 면역원은 예를 들어, 다중 TACA의 특정 조합의 증가된 발현과 관련된 특정 형태의 암에 맞춰질 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 방법에 의해 제조되고/제조되거나 본원에 기재된 합성 당 접합체 면역원을 포함하고 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트를 더 포함하는 당 접합체 백신에 관한 것이다. 본원에 사용된 "백신"이라는 용어는 대상체에게 치료적 이점을 제공하기 위해 대상체에게 투여되는 본원에 기재된 당 접합체 면역원을 포함하는 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 당 접합체 백신은 예방 백신 또는 치료 백신일 수 있다.
백신 조성물은 수혜 동물의 연령, 성별, 체중, 종 및 상태 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 의학 또는 수의학 분야의 숙련자에게 주지된 기술에 의해 투여량으로 투여될 수 있다. 투여 경로는 점막 투여(예컨대, 경구, 비강, 안구)를 통해 또는 비경구 경로(예컨대, 피내, 근육 내, 피하)를 통해 경피적일 수 있다. 백신 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 다른 치료 또는 요법과 함께 동시-투여되거나 순차적으로 투여될 수 있다. 투여 형태는 멸균 현탁액 또는 유화액과 같이 비경구, 피하, 피내 또는 근육 내 투여(예컨대, 주사 가능한 투여)용 현탁액 및 제제를 포함할 수 있다. 백신은 스프레이로 투여되거나 음식 및/또는 물에 혼합되거나 멸균 수, 생리 식염수, 포도당 등과 같은 적합한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합되어 전달될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 제제에 따라 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 애주번트, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향료, 색상 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences," 1990]와 같은 표준 약학 텍스트를 참조하여 과도한 실험 없이 적합한 제제를 제조할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 당 접합체 면역원 또는 당 접합체 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체를 면역화, 백신접종 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 설프하이드릴-특이적(티올 특이적) 작용기에 연결되도록 화학적으로 변형된 탄수화물 항원에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 항원은 (예컨대, 글리코시드 결합을 통해) 말단 알켄에 연결되도록 화학적으로 변형되고, 여기서 말단 알켄기는 티올-엔 반응을 통해 담체 단백질의 유리 티올에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 탄수화물 항원 및 말단 알켄기는 본원에 기재된 바와 같은 링커를 통해 연결된다. 일부 실시형태에서, 말단 알켄기는 비닐기 또는 알릴기일 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서는 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 각각의 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서: SA는 당 항원 또는 이의 부분이고; S-PC는 담체 단백질이고; X는 O, S, NR1 또는 CH2이고; R 1 은 -H, -COH, -COCH3 또는 -COEt이고; n은 1, 2, 3, 4 또는 5이며; 그리고 R 2 는 H 또는 Me인, 합성 당 접합체 면역원; 또는 이의 입체 이성질체(예컨대, 부분 입체 이성질체)에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 각각의 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서: SA는 당 항원 또는 이의 부분이고; S-PC는 담체 단백질이고; X는 S, NR1, CH2 또는 O이고; R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고; n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; R 2 는 H 또는 Me이고; q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이며 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 또는 R 3 및 R 4 는 질소 원자에 연결된 카르보닐과 함께 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-을 형성하고, 그리고 m은 1인, 합성 당 접합체 면역원; 또는 이의 입체 이성질체(예컨대, 부분 입체 이성질체)에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, X가 O인 경우, 당 항원은 Tn 또는 Stn을 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 본 명세서는 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 합성 당 접합체 면역원은 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- y는 적어도 1이고;
- SA는 당 항원 또는 이들의 면역원성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되며, y는 1 초과인 경우, SA는 동일하거나 상이하고;
- [S] z -PC는 하나 이상의 유리 티올기로부터 유래하는 하나 이상의 황 원자를 갖는 담체 단백질이고;
- z는 적어도 1이고 적어도 y와 동일하고; 그리고
- L은 하기 구조를 갖는 링커로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이며,
상기 식에서
- X는 O, S, NR1 또는 CH2이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COCH3 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- R 2 는 H 또는 Me이고; 그리고
y는 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이한, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 합성 당 접합체 면역원은 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- y는 적어도 1이고;
- SA는 당 항원 또는 이들의 면역원성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되며, y는 1 초과인 경우, SA는 동일하거나 상이하고;
- [S] z -PC는 하나 이상의 유리 티올기로부터 유래하는 하나 이상의 황 원자를 갖는 담체 단백질이고;
- z는 적어도 1이고 적어도 y와 동일하고; 그리고
- L은 하기 구조를 갖는 링커로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이며 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 또는 R 3 및 R 4 는 질소 원자에 연결된 카르보닐과 함께 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-을 형성하고, 그리고 m은 1이고; 그리고
y는 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이한, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 합성 당 접합체 면역원은 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- y는 적어도 1이고;
- SA는 당 항원 또는 이들의 면역원성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되며, y는 1 초과인 경우, SA는 동일하거나 상이하고;
- [S] z -PC는 하나 이상의 유리 티올기로부터 유래하는 하나 이상의 황 원자를 갖는 담체 단백질이고;
- z는 적어도 1이고 적어도 y와 동일하고; 그리고
- L은 하기 구조를 갖는 링커로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- r은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 5 은 S-PC, 공유 결합 또는 하기 구조의 라디칼이며,
상기 식에서, R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이며 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 또는 R 3 및 R 4 는 질소 원자에 연결된 카르보닐과 함께 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-을 형성하고, 그리고 m은 1이고; 그리고
y는 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이한, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 상기 정의된 바와 같이 합성 당 접합체 면역원에 관한 것으로서, 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- r은 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 상기 정의된 바와 같이 합성 당 접합체 면역원에 관한 것으로서, 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- r은 1 또는 2이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 상기 정의된 바와 같이 합성 당 접합체 면역원에 관한 것으로서, 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- r은 1 또는 2이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서는 상기 기재된 바와 같이 합성 당 접합체 면역원에 관한 것으로서, y는 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2 범위의 정수이다.
일부 실시형태에서, 당 항원은 본원에 기재된 바와 같이 탄수화물 항원일 수 있고/있거나, 담체 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 담체 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 합성 당 접합체 면역원은 예를 들어, 담체 단백질에 접합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 이상의 동일하거나 상이한 유형의 탄수화물 항원을 포함하는 다가 당 접합체 면역원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 당 접합체 면역원은 대상체에 투여 시에 탄수화물 항원에 세포 매개 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트(예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 애주번트)를 포함하는 백신에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원 또는 본원에 기재된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원의 백신의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 백신, 본원에 기재된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 또는 본원에 기재된 바와 같은 백신의 상기 하나 이상의 탄수화물 또는 당 항원의 증가된 발현과 관련된 질환이 있는 대상체의 치료를 위한 용도에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 백신, 본원에 기재된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 또는 본원에 기재된 바와 같은 백신의 당 접합체 면역원에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위한 용도에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원, 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 백신, 본원에 기재된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 또는 본원에 기재된 바와 같은 백신의 당 접합체 면역원에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위한 용도에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 명세서는 (a) 티올-엔 반응을 통해 티올기에 직접적으로 접합 가능한 말단 알켄(알케닐 탄수화물 항원)에 공유적으로 연결된 탄수화물 항원을 제공하는 단계; (b) 본원에 기재된 바와 같은 티올-엔 반응을 통해 탄수화물 항원에 대한 접합에 적합한 접합 물질로서, 상기 접합 물질은 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 접합 물질을 제공하는 단계; 및 (c) 하나 이상의 유리 티올기에서 접합체 물질에 탄수화물 항원을 직접 접합하기 위해 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여, 당 접합체를 제조하는 단계를 포함하는, 당 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 접합체 물질은 중합체, 폴리펩타이드, 본원에 정의된 바와 같은 담체 단백질, 고체 지지체, 입자, 또는 본원에 기재된 바와 같이 티올-엔 반응을 통해 탄수화물 항원에 대한 접합에 적합한 유리 티올기를 갖는 임의의 다른 물질이거나 이를 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서는 본원에 기재된 방법에 의헤 제조된 당 접합체의 탄수화물 항원 또는 탄수화물 항원을 포함하는 종양-순환 세포와 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하거나 스크리닝하기 위하거나 탄수화물 항원에 의한 면역화 또는 백신접종으로 인한 항체의 존재를 검출하기 위한 용도에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 검출 또는 스크리닝은 면역흡착 분석, ELISA, 마이크로어레이 또는 면역블롯 분석과 같은 임의의 적합한 검출 방법을 통해 수행될 수 있다.
일부 양태에서, 본 명세서는 대상체에서 면역 반응을 발생하기 위하여 본원에 정의된 바와 같거나 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조된 당 접합체 또는 당 접합체 면역원을 탄수화물 항원에 투여하는 단계, 및 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플을 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 존재에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서의 다른 목적, 장점 및 특징은 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 주어진 특정 실시형태에 대한 다음의 비 제한적인 설명을 숙독 시 더욱 명백해질 것이다.
항목
1. (a) 티올-엔 반응을 통해 티올기에 직접적으로 접합 가능한 말단 알켄(알케닐 탄수화물 항원)에 공유적으로 연결된 탄수화물 항원을 제공하는 단계; (b) 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 담체 단백질을 제공하는 단계; 및 (c) 하나 이상의 유리 티올기에서 담체 단백질에 탄수화물 항원을 직접 접합하기 위해 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여, 당 접합체 면역원을 제조하는 단계를 포함하며, 담체 단백질은 대상체에 대하여 면역원성이고, 담체 단백질에 대한 탄수화물 항원의 접합은 비 접합된 탄수화물 항원의 투여에 비하여 대상체에 투여 시 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시키는, 대상체 투여용 당 접합체 면역원을 제조하는 방법.
2. 항목 1에 있어서, 알케닐 탄수화물 항원은 수불용성인, 방법.
3. 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 담체 단백질의 활성, 면역원성 및/또는 구조를 유지하는 반응 조건 하에서 수행되는, 방법.
4. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 임의의 유기 용매의 존재 하에 수행되는, 방법.
5. 항목 1 내지 항목 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 촉매의 존재 하에 수행되는, 방법.
6. 항목 5에 있어서, 촉매는 수불용성 촉매인, 방법.
7. 항목 1 내지 항목 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 단파 자외선 하의 조사를 포함하는, 방법.
8. 항목 7에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 약 254 nm에서 조사를 포함하는, 방법.
9. 항목 1 내지 항목 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 장파 자외선 하의 조사를 포함하는, 방법.
10. 항목 9에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 약 365 nm에서 조사를 포함하는, 방법.
11. 항목 1 내지 항목 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 담체 단백질의 유리 티올기 당 탄수화물 1 내지 10 몰 당량을 반응시키는 것을 포함하는, 방법.
12. 항목 1 내지 항목 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 4.0 및 약 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10 사이의 pH에서 수행되는, 방법.
13. 항목 1 내지 항목 12 중 어느 하나에 있어서, 담체 단백질에 대한 접합 후 상기 탄수화물 항원은 대상체의 내인성 효소에 의해 담체 단백질로부터 절단될 수 없는, 방법.
14. 항목 1 내지 항목 13 중 어느 하나에 있어서, 알릴 아민 및 환원당 사이와 같이, O-글리코시드 결합, S-글리코시드 결합, N-글리코시드 결합 또는 C-글리코시드 결합과 같은 글리코시드 결합 또는 환원성 아민화에 의해 얻어지는 결합을 통해 상기 알케닐 탄수화물 항원은 말단 알켄에 공유적으로 연결되고/연결되거나 탄수화물 항원은 담체 단백질에 접합되는, 방법.
15. 항목 1 내지 항목 14 중 어느 하나에 있어서, 탄수화물 항원은 B 세포 에피토프를 포함하고/포함하거나 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도하는, 방법.
16. 항목 1 내지 항목 15 중 어느 하나에 있어서, 탄수화물 항원은 종양 관련 탄수화물 항원(TACA)이거나 이를 포함하는, 방법.
17. 항목 16에 있어서, TACA는 Tn, S-Tn, 톰슨 프라이덴리히(TF), (2,3)-S-TF, (2,6)-S-TF, Globo H, GD2, GD3, GM2, GM3, 또는 이들의 임의의 조합이고, 이로부터 온 것이거나 이를 포함하는, 방법.
18. 항목 1 내지 항목 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 1개 초과 유형의 탄수화물 항원을 담체 단백질에 접합시켜 다가 당 접합체 면역원을 제조하는, 방법.
19. 항목 18에 있어서, 상기 다가 당 접합체 면역원은 담체 단백질에 접합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 상이한 유형의 탄수화물 항원을 포함하는, 방법.
20. 항목 1 내지 항목 19 중 어느 하나에 있어서, 탄수화물 항원은 바이러스성 다당류 항원 또는 박테리아성 캡슐형 다당류(CPS)이거나 이를 포함하는, 방법.
21. 항목 20에 있어서, 박테리아성 CPS는 폐렴구균 및/또는 연쇄구균 다당류 혈청형이고, 이로부터 온 것이거나 이를 포함하는, 방법.
22. 항목 1 내지 항목 21 중 어느 하나에 있어서, (a) 중의 탄수화물 항원은 링커를 통해 말단 알켄에 연결되는, 방법.
23. 항목 1 내지 항목 22 중 어느 하나에 있어서, 담체 단백질은 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는, 방법.
24. 항목 1 내지 항목 23 중 어느 하나에 있어서, 탄수화물 항원은 인간 T 세포 에피토프를 포함하고/포함하거나 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도하는, 방법.
25. 항목 1 내지 항목 24 중 어느 하나에 있어서, 담체 단백질은 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차 반응 물질 197(CRM197), 수막구균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자 단백질 D(HiD), 사이토카인 또는 이들의 면역원성 단편이거나 이들로부터 오거나 이들을 포함하는, 방법.
26. 항목 1 내지 항목 25 중 어느 하나에 있어서, 담체 단백질은 하나 이상의 이황화 가교를 갖는 단백질이며, 여기서: (i) 하나 이상의 이황화 가교는 상기 광촉매 티올-엔 반응 후에 영향을 받지 않고 유지되고; 또는 (ii) 담체 단백질은 탄수화물 항원에 대한 접합을 위해 하나 이상의 추가 유리 티올기를 노출시키기 위해 환원제로 전처리되는, 방법.
27. 항목 1 내지 항목 26 중 어느 하나에 있어서, 당 접합체 면역원에 포함된 탄수화물 항원의 총 수는 접합 전에 담체 단백질 상에서 이용 가능한 유리 티올기의 수와 동일한, 방법.
28. 항목 1 내지 항목 27 중 어느 하나에 있어서, 당 접합체 면역원은 대상체에 투여 시에 탄수화물 항원에 세포 매개 면역 반응을 유도하는, 방법.
29. 항목 1 내지 항목 28 중 어느 하나에 있어서, (d) 당 접합체 면역원을 정제하는 단계를 더 포함하는, 방법.
30. 항목 1 내지 항목 29 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원을 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트와 함께 제형화하는 단계를 포함하는, 당 접합체 백신을 제조하는 방법.
31. 항목 30에 있어서, 애주번트는 무기 화합물, 미네랄 오일, 미생물 유도체, 식물 유도체, 사이토카인, 스쿠알렌, 명반, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 수산화 인산 칼슘, 톨 유사 수용체 작용제, 면역자극성 폴리뉴클레오타이드, 면역자극성 지질, 프로인트 애주번트, RIBI의 애주번트, QS-21, 무라밀 디펩타이드 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함하는, 방법.
32. 하나 이상의 탄수화물 항원 및 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기를 갖는 면역원성 담체 단백질을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 하나 이상의 탄수화물 항원은 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기에서 면역원성 담체 단백질에 연결되며, 면역원성 담체 단백질에 대하여 하나 이상의 탄수화물 항원의 접합은 비 접합 탄수화물 항원의 투여와 비교하여 대상체에 투여 시 하나 이상의 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시키는, 합성 당 접합체 면역원.
33. 항목 32에 있어서, 하나 이상의 탄수화물 항원은 본원에 기재된 링커를 통해 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기에 연결되는, 합성 당 접합체 면역원.
34. 항목 32에 있어서, 하나 이상의 탄수화물 항원은 항목 13 또는 항목 14에 정의된 바와 같이 결합을 통해 링커에 연결되는, 합성 당 접합체 면역원.
35. 항목 32 내지 항목 34 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 탄수화물 항원은 항목 2, 항목 15, 항목 16, 항목 17, 항목 20 또는 항목 21에 정의된 바와 같은, 합성 당 접합체 면역원.
36. 항목 32 내지 항목 35 중 어느 하나에 있어서, 항목 18 또는 항목 19에 정의된 바와 같은 다가 당 접합체 면역원인 합성 당 접합체 면역원.
37. 항목 32 내지 항목 36 중 어느 하나에 있어서, 담체 단백질은 항목 23, 항목 24, 항목 25 또는 항목 26에 정의된 바와 같은, 합성 당 접합체 면역원.
38. 항목 32 내지 항목 37 중 어느 하나에 있어서, 당 접합체 면역원에 포함된 탄수화물 항원의 총 수는 담체 단백질 상에서 용매-접근 가능한 시스테인 잔기의 수와 동일한, 합성 당 접합체 면역원.
39. 항목 32 내지 항목 38 중 어느 하나에 있어서, 대상체에 투여 시에 탄수화물 항원에 세포 매개 면역 반응을 유도하는, 합성 당 접합체 면역원.
40. 항목 32 내지 항목 39 중 어느 하나에 있어서, 항목 1 내지 항목 29 중 어느 하나의 방법에 의해 제조되는 합성 당 접합체 면역원.
41. 항목 30 또는 항목 31의 방법에 의해 제조되며/되거나 항목 32 내지 항목 40 중 어느 하나의 합성 당 접합체 면역원 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트를 포함하는 당 접합체 백신.
42. 항목 41에 있어서, 예방 백신 또는 치료 백신인 당 접합체 백신.
43. 항목 1 내지 항목 29 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원, 항목 30 또는 항목 31의 방법에 의해 제조된 당 접합체 백신, 항목 32 내지 항목 40 중 어느 하나의 합성 당 접합체 면역원 또는 항목 41 또는 항목 42의 당 접합체 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 면역화, 백신접종 또는 치료하는 방법.
44. 질환이 있는 대상체를 면역화, 백신접종 또는 치료하는 데 사용을 위한, 항목 32 내지 항목 40 중 어느 하나의 합성 당 접합체 면역원 또는 항목 41 또는 항목 42의 당 접합체 백신.
45. 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 각각의 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- SA는 당 항원 또는 이의 부분이고;
- PC는 담체 단백질이고;
- X는 O, S, NR1 또는 CH2이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COCH3 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- R 2 는 H 또는 Me인, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체.
46. 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 각각의 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- SA는 당 항원 또는 이의 부분이고;
- PC는 담체 단백질이고;
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이며 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 또는 R 3 및 R 4 는 질소 원자에 연결된 카르보닐과 함께 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-을 형성하고, 그리고 m은 1인, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체.
47. 항목 45 또는 항목 46에 있어서, 상기 당 항원은 항목 15, 항목 16, 항목 17, 항목 20 또는 항목 21에 정의된 바와 같은 탄수화물 항원인, 합성 당 접합체 면역원.
48. 항목 45 내지 항목 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 담체 단백질은 항목 23, 항목 24 또는 항목 25에 정의된 바와 같은 담체 단백질인, 합성 당 접합체 면역원.
49. 항목 45 내지 항목 49 중 어느 하나에 있어서, 다가 당 접합체 면역원인 합성 당 접합체 면역원.
50. 항목 49에 있어서, 상기 다가 당 접합체 면역원은 담체 단백질에 접합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 상이한 유형의 탄수화물 항원을 포함하는, 합성 당 접합체 면역원.
51. 항목 45 내지 항목 50 중 어느 하나에 있어서, 당 접합체 면역원은 대상체에 투여 시에 탄수화물 항원에 세포 매개 면역 반응을 유도하는, 합성 당 접합체 면역원.
52. 항목 45 내지 항목 51 중 어느 하나의 합성 당 접합체 면역원 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트를 포함하는 백신.
53. 항목 52에 있어서, 애주번트는 항목 31에 정의된 바와 같은, 백신.
54. 항목 1 내지 항목 29 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원 또는 항목 32 내지 항목 40 및 항목 45 내지 항목 51 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원의 백신의 제조를 위한 용도.
55. 항목 1 내지 항목 29 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원, 항목 30 또는 항목 31의 방법에 의해 제조된 당 접합체 백신, 항목 32 내지 항목 40 및 항목 45 내지 항목 51 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 또는 항목 52 또는 항목 53의 백신의 상기 하나 이상의 탄수화물 또는 당 항원의 증가된 발현과 관련된 질환이 있는 대상체의 치료를 위한 용도.
실시예
실시예 1: 일반 방법
반응을 상업적으로 이용 가능한 HPLC 등급을 사용하여 아르곤 분위기 하에서 수행하였다. 상업적으로 이용 가능한 시약(Sigma Aldrich)을 추가 정제없이 사용하였다. N-아세틸-D-갈락토사민 및 N-아세틸뉴라민산은 캐나다 앨버타 소재 Rose Scientific Ltd.에서 제공되었다. Fmoc-β-Ala-Wang 수지 및 Fmoc 아미노산은 캐나다 퀘벡 주 삐에흐퐁 소재 Peptide Technologies Ltd로부터 상업적으로 이용할 수 있었다. 반응의 진행을 실리카겔 60 F254 코팅된 플레이트(E. Merck)를 사용하는 박층 크로마토그래피로 모니터링하였다. 클릭 티올-엔 광반응에 의한 접합을 2개의 휴대용 UV 365 nm 램프(UV-AC Hand Lamp, Dual 254/365 nm UV; 115V-60 Hz, 0.16 amps, VWR 캐나다, 카탈로그 번호 89131-492) 사이의 석영 큐벳(10x10 mm 경로 길이, Fisher Scientific Canada, 카탈로그 번호 14-958-130) 플레이스(place)에서 수행하였다. 플래시 크로마토그래피를 Canadian Life Science의 ZEOprepTM 실리카겔 60(40 내지 63 μm)을 사용하여 수행하였다. 검출을 자외선 하에서 또는 20% 에탄올 황산 또는 몰리브데이트 또는 KMnO4 용액으로 분무한 후 가열함으로써 수행하였다. NMR 스펙트럼을 Bruker ULTRASHIELDTM 300MHz 및 Bruker Avance™ III HD 600 MHz 분광계에서 기록하였다. 양성자 및 탄소 화학적 이동(δ)은 7.26 ppm(1H) 및 77.16 ppm(13C)에서 설정되었던 잔류 CHCl3의 화학적 이동에 대해 ppm 단위로 보고된다. 결합 상수(J)는 헤르츠(Hz)로 보고되며 피크 다중도에는 다음과 같은 약어가 사용된다: 단일항(s), 이중항(d), 이중항의 이중항(dd), 동일 결합 상수를 갖는 이중항의 이중항(tap), 삼중항(t), 다중항(m). 상관 분광법(COSY: Correlated SpectroscopY) 및 이종핵 단일 양자 결맞음(HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence) 실험을 사용하여 분석 및 할당을 수행하였다. 고분해능 질량 스펙트럼(HRMS)을 UQAM의 분석 플랫폼에 의해 양극 및/또는 음극 전기분무 모드에서 Agilent technologies의 LC-MS-TOF(액체 크로마토그래피 질량 분석 비행시간) 기기로 측정하였다. 양성자 이온(M+H)+ 또는 나트륨 부가물(M+Na)+ 중 하나를 실험식 확인에 사용하였다. 천연 TT 및 TT-접합체를 2000 KDa 벤조일화된 투석 튜빙(Sigma-Aldrich(캐나다 온타리오 소재))를 사용하여 투석하였다. 천연 및 접합된 TT 양쪽 모두의 티올 함량을 412 nm에서 엘만 테스트에 의해 결정하였다(문헌[Ellman, G.L. Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70-77]). UV/VIS Ultrospec 100 prot 분광광도계(Biochrom, USA)를 사용하여 TT-접합체의 총 당 함량을 492 nm에서 측정한 비색 DuBois 테스트에 의해 결정하였다(문헌[Dubois, M.; Gilles, K. A.; Hamilton, J. K.; Rebers, P. A.; Smith, F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Anal. Chem., 1956, 28, 350-356]). 동적 광 산란(DLS), 입자 크기 분포를 Malvern의 Zetasizer Nano S90을 사용하여 PBS에서 측정하였다. 마우스 단일클론 IgG3 항체 JAA-F11을 문헌[Rittenhouse-Diakun et al., 1998]에서 이전에 설명된 바와 같이 제조하였다.
일반 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 절차
고체상 펩타이스 합성(SPPS)의 절차를 문헌 절차(문헌[Papadopoulos et al., 2012)] 하에 따르고 Fmoc-β-Ala-Wang 수지(650 mg, 0.34 mmol, 1.0 당량; 100 내지 200 메쉬, 로딩 = 0.52 mmol/g)으로 관찰(stare)하였다. 반응을 Econo-Pac 일회용 컬럼 1.5 x 14 cm(20 mL) (Bio-Rad Laboratories, 캐나다 온타리오 주 소재)에서 회전 교반에 의해 수행하였다. 수지를 CH2Cl2에서 1시간 동안 팽윤시킨 다음 여과하고 DMF에서 1시간 동안 재조정하였다. 시판 수지 또는 아미노산의 Fmoc-보호기를 DMF(5 mL, 2 x 5 분 후 1 x 10 분) 중 20% 피페리딘 용액으로 제거하였다. 용매와 시약을 여과에 의해 제거하고 수지를 DMF, CH2Cl2 및 MeOH(각 용매로 3X)로 세척하였다. 유리 아미노기의 존재는 카이저(Kaiser) 테스트 또는 TNBS 테스트로 검증하였다. 수지 상의 유리 아민을 DMF 중의 사전활성화된 Fmoc 아미노산: 3 당량의 아미노산, 3 당량의 HBTU(N,N,N',N'-테트라메틸-O- (1H-벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트) 및 촉매량의 HOBt(1-하이드록시벤조트리아졸)의 용액으로 4℃에서 (10 분) 처리하였다. 이후, DIPEA(디이소프로필아민, 9 당량)를 혼합물에 첨가하고 실온에서 1시간 30분 동안 교반하였다. 커플링의 완료를 카이저 또는 TNBS 비색 테스트를 사용하여 결정하였다. 여과 후 수지를 세척하고 Fmoc 제거 절차를 다시 반복하였다. 합성 순서의 끝에서 최종 유리 아민을 아세틸화에 의해 캡핑하였다(Ac2O/DIPEA/DMF 1:1:8, 1시간). 여과 후, 용액을 배수하고, 수지를 진공 하에 건조시키고 트리플루오로 아세트산/물/에탄디티올/트리이소프로필실란(94.0/2.5/2.5/1.0)을 사용하여 3시간 동안 절단을 수행하였다. 생성된 펩타이드를 메틸 tert-부틸 에테르로 침전시키고 원심분리(20분, 2000 rpm, 3X)에 의해 수지 비드로부터 단리하였다. 침전물을 공기 분사 흐름으로 조심스럽게 건조시켰다. 미정제 펩타이드를 H2O에 용해시켜 수지로부터 분리하였다. 이후, 용액을 동결건조하여 원하는 펩타이드를 얻었다.
dTT831-844-Cys-βAla. Fmoc-β-Ala-Wang 수지(650 mg, 0.34 mmol, 1.0 당량; 100 내지 200 메쉬, 로딩 = 0.52 mmol/g)로부터 원하는 펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla를 백색 분말(62 mg, 0.034 mmol, 10%)로서 단리하였다. ESI+-LC-MS: [M+2H]+2 C83H135O24N19S에 대한 계산치, 906.9819; 실측치, 906.9849; CAN/H2O 5 내지 95% 5.42분.
Cys-dTT831-844-βAla. Fmoc-β-Ala-Wang 수지(650 mg, 0.34 mmol, 1.0 당량; 100 내지 200 메쉬, 로딩 = 0.52 mmol/g)로부터 원하는 펩타이드 Cys-dTT831-844-βAla를 백색 분말(62 mg, 0.034 mmol, 10%)로서 단리하였다. ESI+-LC-MS: [M+2H]+2 C83H135O24N19S에 대한 계산치, 906.9819; 실측치, 906.9844; CAN/H2O 5 내지 95% 5.32분.
실시예 2: 알릴 2-아세트아미도-3,6-디-O-피발로일-2-데옥시-α-D-글루코피라노사이드(화합물 2)
화합물 2
도 5를 참조하면, 아세틸 클로라이드(2.76 mL, 38.80 mmol, 3.43 당량)를 아르곤 분위기 하에서 0℃에서 알릴 알코올(20.8 mL)에 적가하였다. 실온에서, N-아세틸-D-글루코사민(화합물 1)(2.50 g, 11.3 mmol, 1.00 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 3시간 동안 교반한 다음 pH 7까지 고체 NaHCO3를 첨가하여 켄칭하였다. 현탁액을 MeOH로 수회 세척하면서 Celite 패드를 통해 여과하였다. 용매를 감압 하에 제거하고, 미정제 알릴 2-아세트아미도-2-데옥시-D-글루코사민을 Et2O/에탄올로 분쇄하여 침전시켰다. 이후, 용매를 분쇄 후 감압 하에서 수회 제거하였다. 이후, -15℃에서 질소 분위기 하에 건조 디클로로메탄-피리딘(45 mL, v/v, 1:2) 혼합물 중의 미정제 알릴 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D- 글루코피라노사이드 중간체의 현탁액에, 피발로일 클로라이드(3.90 mL, 31.64 mmol, 2.80 당량)을 적가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 실온으로 가온하여 일부 β-아노머(Rf = 0.18); 헥산/EtOAc 1:1)과 함께 원하는 α-아노머(화합물 2)(Rf = 0.32)를 수득하였다. 이후, 혼합물을 CH2Cl2로 희석하고 유기상을 HCl(1M), KHSO4의 포화 수용액, NaHCO3의 포화 용액 및 염수로 연속적으로 수회 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하며 감압 하에 증발시켰다. 황색을 띠는 오일을 실리카겔 상의 플래쉬 크로마토그래피(헥산-EtOAc 6:4 내지 1:1)로 정제하여 원하는 화합물 알릴 2-아세트아미도-3,6-디-O-피발로일-2-데옥시-α-D-글루코피라노사이드(화합물 2)을 백색 고체(4.85 g, 6.78 mmol, 60%)로서 수득하였다. Rf = 0.32; 헥산/EtOAc 1:1; 도 6a 및 도 6b: 1H NMR (CDCl3, 600 MHz): δ 5.87 (dddd, 1H, J H,H = 16.8, 10.5, 6.2, 5.3 Hz, OCH2CH=CH2), 5.77 (d, 1H, J NH,H2 = 9.7 Hz, NH), 5.31-5.25 (m, 1H, OCH2CH=CH 2), 5.22 (dd, 1H, J H,H = 10.4, 1.3 Hz, OCH2CH=CH 2), 5.09 (dd, 1H, J 3,4 = 10.7, J 2,3 = 9.3 Hz, H-3), 4.83 (d, 1H, J 1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.39 (m, 1H, H-6a), 4.35-4.25 (m, 2H, H-6b 및 H-2), 4.19 (m, 1H, OCH 2), 4.02-3.93 (m, 1H, OCH 2), 3.85 (m, 1H, H-5), 3.59-3.48 (m, 1H, H-4), 3.03 (d, 1H, J 4,OH = 5.1 Hz, OH-4), 1.93 (s, 3H, NHCOCH 3), 1.23 (s, 9H, tert-부틸) 및 1.19 ppm (s, 9H, tert-부틸); 13C NMR (CDCl3, 150 MHz): δ 179.8, 179.1 (tert-BuCO), 169.7 (NHCO), 133.2 (OCH2 CH=CH2), 118.1 (OCH2CH=CH2), 96.4 (C-1), 73.4 (C-3), 70.5 (C-5), 69.1 (C-4). 68.2 (OCH2), 63.1 (C-6), 51.4 (C-2), 39.0, 38.9 (2 x C(CH3)3), 27.2, 27.0 (2 x C(CH3)3) 및 23.2 ppm (CH3). 도 6c 및 도 6d: ESI+-HRMS: [M+H]+ C21H36O8N에 대한 계산치, 430.2435; 실측치, 430.2445. β-아노머를 백색 고체(971 mg, 2.26 mmol, 20%)로서 단리하였다. Rf = 0.18; 헥산/EtOAc 1:1; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 6.00 (d, 1H, J NH,H2 = 9.3 Hz, NH), 5.95-5.75 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.35-5.03 (m, 3H, OCH2CH=CH 2 및 H-3), 4.55 (d, 1H, J 1,2 = 8.4 Hz, H-1), 4.47-425 (m, 3H, H-6a, 6b 및 OCH 2), 4.14-3.90 (m, 2H, OCH 2 및 H-2), 3.65-3.43 (m, 2H, H-5 및 H-4), 3.23 (sb, 1H, OH-4), 1.92 (s, 3H, NHCOCH 3), 1.23 (s, 9H, tert-부틸) 및 1.20 ppm (s, 9H, tert-부틸).
실시예 3: 알릴 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴 Tn)
알릴 Tn
도 5를 참조하면, 건조 디클로로메탄-피리딘 (126 mL, v/v 20:1)의 혼합물 중의 디-O-피발로일 화합물(화합물 2)(5.50 g, 12.80 mmol, 1.0 당량)을 아르곤 분위기 하에서 -35℃로 냉각하였다. 이후, 트리플루오로메탄설폰산 무수물(2.58 mL, 15.36 mmol, 1.2 당량)을 첨가하고 혼합물을을 이 온도에서 교반하였다. 온도를 실온으로 2시간 동안 가온하였다. 이후, 물(12 mL)을 용액에 첨가하였다. 혼합물을 가열하고 밤새(12시간) 환류 (대략 50℃) 교반하였다. 실온에 도달한 후, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고 1 M 수성 HCl로 수회 세척하였다. 유기층을 H2O, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하며 감압 하에 증발시켰다. 미정제 생성물을 젬플렌(Zemplen) 조건(메탄올 중의 1 M 나트륨 메톡사이드 용액, 40 mL, pH 9) 하에서 처리하였다. 용액을 50℃에서 밤새 교반하였다. 실온으로 냉각한 후, 용액을 이온 교환 수지(Amberlite® IR 120, H+) 상에 첨가하여 중화시키고, 여과하고, MeOH로 세척하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 알릴 T N 을 동결건조 후 백색 고체로서 MeOH/EtOAc/헥산에 침전시켜 단리하였다(2.36 g, 9.10 mmol, 71%). Rf = 0.32; EtOAc/MeOH 4:1; 도 7a 및 도 7b: 1H NMR (CD3OD, 600 MHz): δ 5.99-5.88 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.31 (dd, 1H, J trans = 17.3, J gem = 1.3 Hz, OCH2CH=CH 2), 5.17 (dd, 1H, J cis = 10.5 Hz, OCH2CH=CH 2), 4.86 (d, 1H, J 1,2 = 3.8 Hz, H-1), 4.27 (dd, 1H, J 2,3 = 11.0 Hz, H-2), 4.20 (m, 1H, OCH 2), 4.00 (m, 1H, OCH 2), 3.89 (dd, J 3,4 = J 4,5 = 2.6 Hz, H-4), 3.85-3.77 (m, 2H, H-3 및 H-5), 3.72 (m, 2H, H-6a 및 H-6b) 및 1.99 ppm (s, 3H, CH 3); 13C NMR (CD3OD, 150 MHz): δ 172.5 (NHCO), 134.2 (OCH2 CH=CH2), 116.1 (OCH2CH=CH2), 96.6 (C-1), 71.2 (C-3), 69.0 (C-4), 68.3 (C-5). 67.8 (OCH2), 61.4 (C-6), 50.2 (C-2) 및 21.2 ppm (CH3). 도 7c 및 도 7d: ESI+-HRMS: [M+H]+ C11H20O6N에 대한 계산치, 262.1285; 실측치, 262.1294.
절차 B: 알릴 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드는 문헌 절차(문헌[Feng et al., 2004])에 따라 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)으로부터 직접 제조할 수도 있다: 실온에서 알릴 알코올(8 mL) 중의 N-아세틸갈락토사민(442 mg, 2 mmol, 1.0 당량) 용액에 BF3.Et2O (250 μL, 2 mmol, 1.0 당량)를 첨가하고 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 실온으로 냉각하고 용매를 감압 하에서 제거하였다. 건조 미정제 생성물을 최소 EtOH(5 mL)에 용해시켰다. 원하는 T N 생성물을 디이소프로필 에테르에 침전시키고 백색 고체(417 mg, 1.60 mmol, 80%)로서 단리하였다.
C-Allyl GalNAc 유사체(도 5)[1-(2'-아세트아미도-2'-데옥시-α-D-갈락토피라노실)-2-프로판]는 문헌 절차(문헌[Cipolla, et al., 2000])에 따라 제조하였다: 3-(2-아세트아미도-3,4,6-트리-O-아세틸-2-데옥시-α-D-갈락토피라노실)-1-프로펜(문헌[Cui et al., 1998])(371 mg, 1.00 mmol, 1.0 당량)을 젬플렌 조건(메탄올 중의 1 M 나트륨 메톡사이드 용액, 5 mL, pH 8 내지 9) 하에서 처리하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 이온 교환 수지(Amberlite® IR 120, H+) 상에 첨가하여 중화시키고, 여과하고, MeOH로 세척하고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. C-알릴 T N 을 실리카겔 상에서 크로마토그래피(EtOAc/MeOH 9:1 내지 4:1)로 정제한 다음 EtOH에서 백색 고체(213 mg, 0.87 mmol, 87 %)로서 결정화시켰다. Rf = 0.28; EtOH 4:1; mp 230℃ (Litt. 215-217℃, EtOAc/EtOH); 문헌 NMR 데이터에 따라: 1H NMR (CD3OD, 600 MHz): δ 5.81 (m, 1H, 1CH2CH=CH2), 5.08 (dd, 1H, J trans = 17.2, J gem = 1.7 Hz, 1CH2CH=CH 2), 5.02 (dd, 1H, J cis = 10.2 Hz, 1CH2CH=CH 2), 4.22 (dd, 1H, J = 9.3, 5.0 Hz, H-2'), 4.14 (dt, 1H, J = 10.0, 5.0 Hz, H-1'), 3.91 (dd, 1H, J = 3.0 Hz, H-4'), 3.82-3.64 (m, 4H, H-3', H-5' 및 H-6'ab), 2.45 (m, 1H, H-1a), 3.17 (m, 1H, H-1b) 및 1.97 ppm (s, CH 3); 13C NMR (CD3OD, 150 MHz): δ 173.6 (NHCO), 136.2 (1CH2 CH=CH2), 117.1 (1CH2CH=CH2), 72.9 (C-1'), 69.7 (C-4'), 69.5 (C-3' 및 C-5'), 61.8 (C-6'), 52.0 (C-2'), 32.4 (1 CH2) 및 22.5 ppm (CH3). ESI+-LCMS: [M+H]+ C11H20O5N에 대한 계산치, 246.1336; 실측치, 246.1332; CAN/H2O 5 내지 95% 1.4분.
S-알릴 GalNAc 유사체(도 5)를 문헌에 따라 제조하였다: 문헌[Knapp et al., 2002].
실시예 4: 알릴 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 4)
화합물 4
도 5를 참조하면, 건조 DMF(20 mL) 중의 알릴 GalNAc(Tn)(2.35 g, 9.0 mmol, 1.0 당량) 및 벤즈알데히드 디메틸아세탈(6.75 mL, 45.0 mmol, 5.0 당량)의 용액에 촉매량의 p-톨루엔설폰산 일수화물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하였다. 5시간 후, 혼합물을 CHCl3로 희석하였고 NaHCO3의 포화 수용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고 물로 세척하고 Na2SO4 상에서 건조시키며 농축하여 백색 고체를 수득하였다. 벤질리덴 아세탈(4)을 동결건조 후 백색 고체로서 EtOAc/헥산에 침전시켜 단리하였다(2.64 g, 7.56, 84%). Rf = 0.21; DCM/MeOH 9.0:0.5; 도 8a: 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 7.59-7.46 (m, 2H, H-ar), 7.43-7.31 (m, 3H, H-ar), 5.91 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.75 (d, 1H, J NH,H2 = 9.0 Hz, NH), 5.58 (s, 1H, PhCH), 5.34-5.17 (m, 2H, OCH2CH=CH 2), 5.01 (d, 1H, J 1,2 = 3.5 Hz, H-1), 4.56-4.42 (ddd, 1H, J 2,3 = 10.9 Hz, J 2,OH = 9.1 Hz, H-2), 4.34 (dd, 1H, J 5,6a = 1.5 Hz, J 6a,6b = 12.5 Hz, H-6a), 4.19 (m, 2H, H-4 및 OCH 2), 4.04 (m, 1H, dd, 1H, J 5,6b = 1.6 Hz, J 6a,6b = 12.5 Hz, H-6b), 4.01 (m, OCH 2), 3.86 (dd, 1H, J 3,4 = 10.9 Hz, H-3), 3.71 (sb, 1H, H-5), 2.80 (d, 1H, J 3,OH = 10.7 Hz, OH-3) 및 2.05 ppm (s, 3H, CH 3); 도 8b 및 도 8c: ESI+-HRMS: [M+H]+ C18H24O6N에 대한 계산치, 350.1598; 실측치, 350.1608.
실시예 5: 알릴 (2,3,4,6-테트라-O-벤조일-β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(화합물 6)
화합물 6
도 5를 참조하면, 화합물 4(2.0 g, 5.72 mmol, 1.0 당량) 및 수은 시안화물(2.17 g, 8.60mmol, 1.5 당량)을 아르곤 분위기 하에서 4 Å 분자체를 함유하는 무수 니트로메탄-톨루엔(100 mL, 3:2, v/v)의 혼합물에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 2,3,4,6-테트라-O-벤조일-α-D-갈락토피라노실 브로마이드(화합물 5)(5.66 g, 8.58 mmol, 1.5 당량)를 혼합물에 첨가하였다. 용액을 70℃에서 5시간 동안 교반한 이후, 실온에서 밤새(8시간) 계속 교반하였다. TLC(DCM/MeOH 9.0:0.5)에 의해 지시된 바와 같이 출발 물질(화합물 4)을 모두 소모 후, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔기를 EtOAc에 용해한 후 셀라이트 패드로 여과하였다. 여액을 10% 요오드화 칼륨 수용액, 포화 탄산 수소 나트륨 용액 및 물로 연속적으로 세척한 다음 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 증발시켜 백색 거품을 수득하였다. 미정제 생성물을 100% 헥산 대 헥산/EtOAc 1:2의 구배를 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 정제하여 원하는 이당류(화합물 6)를 백색 고체(4.98, 5.38 mmol, 94%)로서 수득하였다. mp : 110-111℃, Rf = 0.20; 헥산/EtOAc 1:2; 도 9a 및 도 9b: 1H NMR (CDCl3, 600 MHz): δ 8.06-7.19 (m, 5H, H-ar), 5.98 (dd, 1H, J 3,4' = 3.3 Hz, J 4,5' = 1.0 Hz, H-4II), 5.85-5.78 (m, 2H, OCH2CH=CH2 및 H-2II), 5.60 (dd, 1H, J 2,3' = 10.2 Hz, J 3,4' = 3.4 Hz, H-3II), 5.48 (sb, 1H, NH), 5.23 (m, 3H, OCH2CH=CH 2 및 H-1), 4.68 (dd, 1H, J 5',6a' = 6.9 Hz, J 6a',6b' = 11.4 Hz, H-6aI), 4.63-4.58 (m, 1H, H-2), 4.46-4.36 (m, 3H, H-4. H-5 및 H-6bII), 4.14-4.07 (m, 3H, H-6a, OCH 2 및 H-3), 3.96 (m, 1H, OCH 2), 3.75 (m, 1H, H-6b), 3.51 (m, 1H, H-5) 및 1.40 ppm (s, 3H, CH3); 13C NMR (CDC13, 150 MHz): δ 170.0 (NHCO), 166.0, 165.5, 165.4, 165.2 (CO), 137.6-126.2 (multi, 30 C-arom), 133.2 (OCH2 CH=CH2), 117.8 (OCH2CH=CH2), 102.0 (C-1II), 100.9 (CPhCH), 97,3 (C-1I), 76.1 (C-3), 75.4 (C-4), 71.7 (C-3II 및 C-5II), 70.2 (C-2II), 69.1 (C-6), 68.6 (OCH2), 68.1 (C-4II), 62.9 (C-5), 62.6 (C-6I), 48.2 (C-2) 및 22.5 ppm (CH3). 도 9c 및 도 9d: ESI+-HRMS: [M+H]+ C52H50O15N에 대한 계산치, 928.3175; 실측치, 928.3133.
실시예 6: 알릴 (β-D-갈락토피라노실)-(1→3)-2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노사이드(알릴 TF)
알릴 TF
도 5를 참조하면, 메탄올(12 mL, pH 8 내지 9) 중 1 M 나트륨 메톡사이드 중의 화합물 6(1.12 g, 1.20 mmol, 1.0 당량)의 용액을 출발 물질이 소모될 때까지 실온에서 교반하였다. 1시간 30분 후, 용액을 이온 교환 수지(Amberlite IR 120, H+) 상에 첨가하여 중화시키고, 여과하고, MeOH로 세척하고, 용액을 실리카겔로 현탁시켰고 여과하였으며, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 실리카겔을 100% EtOA로 수회 세척한 이후 제2 용액(EtOAc/MeOH/H2O 1:1:0.1)으로 세척하였다. 조합된 여액을 감압 하에서 증발시켜 중간체(화합물 7)을 백색 고체로서 수득하였다. Rf = 0.20; CHCl3/MeOH/H2O 11:6:1; 도 10a 및 10b: 1H NMR (D2O, 600 MHz): δ 7.47-7.39 (m, 2H, H-ar), 7.37-7.26 (m, 3H, H-ar), 5.82 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.61 (s, 1H, PhCH), 5.20-5.09 (m, 2H, OCH2CH=CH 2), 4.88 (d, 1H, J 1,2 = 3.4 Hz, H-1), 4.47 (dd, H-4), 4.37-4.25 (m, 2H, H-2 및 H-1II), 4.13-3.98 (m, 4H, H-3, H-6a, H-6b, OCH 2), 3.96-3.88 (m, 1H, H-5), 4.56-4.42 (ddd, 1H, J 2,3 = 10.9 Hz, J 2,OH = 9.1 Hz, H-2), 4.34 (dd, 1H, J 5,6a = 1.5 Hz, J 6a,6b = 12.5 Hz, H-6a), 4.19 (m, 2H, H-4 및 OCH 2), 4.04 (m, 1H, dd, 1H, J 5,6b = 1.6 Hz, J 6a,6b = 12.5 Hz, H-6b), 4.01 (m, OCH 2), 3.86 (dd, 1H, J 3,4 = 10.9 Hz, H-3), 3.71 (sb, 1H, H-5), 2.80 (d, 1H, J 3,OH = 10.7 Hz, OH-3) 및 2.05 ppm (s, 3H, CH 3); 3.83 (s, 1H, OCH 2), 3.72 (d, 1H, J 3',4' = J 4',5' = 3.2 Hz, H-4II), 3.65-3.55 (m, 2H, H-6a,b), 3.49, (m, 1H, H-5II), 3.43 (dd, 1H, J 2',3' = 10.0 Hz, J 3',4' = 3.3 Hz, H-3II), 3.33-3.24 (m, 1H, H-2II) 및 1.86 ppm (s, 3H, CH 3); 13C NMR (D2O, 150 MHz): δ 174.6 (NHCO), 136.8 (C-arom), 133.6 (OCH2 CH=CH2), 129.9, 128.7, 126.5 (C-arom), 118.0 (OCH2CH=CH2), 104.9 (C-1II), 101.3 (CHPh), 97.0 (C-1), 76.0 (C-4), 75.0 (C-3), 75.0 (C-5II), 72.4 (C-3II), 70.4 (C-2II), 69.0 (C-6), 68.7 (OCH2CH=CH2), 68.6 (C-4II), 63.0 (C-5), 61.0 (C-6II), 48.6 (C-2) 및 22.0 ppm (CH3). Rf = 0.38; EtOAc/MeOH/H2O 7:3:0.1; Rf = 0.46; ACN/MeOH/H2O 7:2:1. 도 10c 및 도 10d: ESI+-HRMS: [M+H]+ C24H34O11N에 대한 계산치, 512.2126; 실측치, 512.2119.
이후, 백색 고체 중간체를 10 mL의 60% 수성 아세트산에 용해시키고 생성된 용액을 60℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하였으며, 잔기를 동결건조시켜 최종 알릴 TF를 백색 고체(427 mg, 1.0 mmol, 84%)로서 수득하였다. mp = 230-232℃; Rf = 0.53; CHCl3/MeOH/H2O 11:6:1; 도 11a 및 11b: 1H NMR (D2O, 600 MHz): δ 5.80 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.19 (dd, 1H, J trans = 17.3 Hz, OCH2CH=CH 2), 5.09 (dd, 1H, J cis = 10.4 Hz, OCH2CH=CH 2), 4.77 (d, 1H, J 1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.29 (d, 1H, J 1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.29 (d, 1H, J 1,2 = 7.8 Hz, H-1II), 4.16 (dd, 1H, J 2,3 = 11.2 Hz, J 1,2 = 3.7 Hz, H-2), 4.08-4.01 (m, 2H, H-4 및 OCH 2), 3.92-3.82 (m, 3H, H-3, H-5 및 OCH 2), 3.73 (dd, 1H, H-4II), 3.63-3.52 (m, 4H, H-6a,b 및 H-6'a,b), 3.47 (m, 2H, H-3II 및 H-5II), 3.39 (dd, 1H, J 2',3' = 10.0 Hz, J 1',2' = 7.7 Hz, H-2II) 및 1.85 ppm (s, 3H, CH3); 13C NMR (150 MHz, CDC13): δ 174.6 (NHCO), 133.7 (OCH2 CH=CH2), 117.9 (OCH2CH=CH2), 104.7 (C-1II), 96.4 (C-1), 77.2 (C-3), 75.0 (C-5II), 72.5 (C-3II), 70.7 (C-5), 70.6 (C-2II), 68.8 (C-4), 68.6 (C-4II), 68.4 (OCH2), 61.2 (C-6II), 61.0 (C-6), 48.6 (C-2) 및 22.0 ppm (CH3). 도 11c 및 도 11d: ESI+-HRMS: [M+Na]+ C17H29O11NNa에 대한 계산치, 446.1633; 실측치, 446.1613.
실시예 7: 파상풍 톡소이드 단량체의 정제
파상풍 톡소이드(TT) 단량체를 접합 전에 겔 여과 크로마토그래피로 수득하였다. 4.5 mg/ml 단백질(변형된 로우리(Lowry) 단백질 분석에 의해 결정됨)을 포함하는 1 ml의 액체 제제를 PBS(20 mM NaHPO4 [pH 7.2], 150 mM NaCl)에서 평형화된 Superdex®200 Prep Grade(GE Healthcare Life Sciences, 스웨덴 웁살라 시 소재)로 충진된 XK16-100 컬럼에 로딩하고 및 동일한 완충액으로 용리하였다. 2개의 피크에서 칼럼으로부터 용리된 단백질: 전반부에 용리하는 피크는 올리고머화된 톡소이드를 포함하고, 150,000의 Mr에 해당하는 후반부에 용리하는 피크는 TT 단량체를 포함하였다. 후반부(단량체) 피크에 해당하는 분획을 모으고, 탈이온수에 대하여 탈염하고 Centricon® Plus-70 원심분리 필터 장치(30K Ultracel PL 막; Millipore, 매사추세츠 주 빌레리카 소재)를 사용하여 농축한 다음 동결건조하였다.
실시예 8: Tn-파상풍 톡소이드 접합체(Tn-TT 접합체)
Tn-TT 접합체
절차 A: 500 μL PBS 중의 알릴 Tn(0.15 mg, 0.56 μmol, 18.0 당량) 용액에 석영 셀 중에 4.7 mg(0.03 μmol)의 파상풍 톡소이드를 함유하는 1.5 mL의 PBS를 첨가하였다. 용액을 아르곤 분위기 하에서 탈기한 후 7시간 동안 254 nm에서 조사하였다. 용액을 수회의 이중 증류수 세척에 대해 24시간 동안 투석하고 동결건조하여 Tn-TT-A 접합체를 백색 고체(2.0 mg, 43%)로서 수득하였다. 절차 B: 동일한 티올-엔 클릭 반응 하에서, PBS(2 mL, 4.5 mg/mL, 0.06 μmol) 중의 파상풍 톡소이드를 함유하는 알릴 Tn(3 mg, 10.8 μmol, 180.0 당량)의 용액에 아세토니트릴(100 μL) 중의 촉매량의 DMPA를 첨가하였다. 용액을 15분 동안 365 nm에서 조사하였다. 이후 용액을 24시간 동안 투석하고 동결건조하여 Tn-TT-B 접합체를 백색 고체(5.4 mg, 61%)로서 수득하였다.
실시예 9: Tn-파상풍 톡소이드 접합체(TF-TT 접합체)
TF-TT 접합체
절차 A: 500 μL PBS 중의 알릴 TF(0.24 mg, 0.56 μmol, 18.0 당량) 용액에 석영 셀 중에 4.7 mg(0.03 μmol)의 파상풍 톡소이드를 함유하는 1.5 mL의 PBS를 첨가하였다. 용액을 아르곤 분위기 하에서 탈기한 후 7시간 동안 254 nm에서 조사하였다. 이후 용액을 24시간 동안 투석하고 동결건조하여 TF-TT-A 접합체를 백색 고체(2.1 mg, 45%)로서 수득하였다. 절차 B: 동일한 티올-엔 클릭 반응 하에서, PBS(2 mL, 4.5 mg/mL, 0.06 μmol) 중의 파상풍 톡소이드를 갖는 알릴 TF(5 mg, 10.8 μmol, 180.0 당량)의 용액에 아세토니트릴(100 μL) 중의 촉매량의 DMPA를 첨가하였다. 용액을 15분 동안 365 nm에서 조사하였다. 이후 용액을 24시간 동안 투석하고 동결건조하여 TF-TT-B 접합체를 백색 고체(5.3 mg, 60%)로서 수득하였다.
실시예 10: Tn-TT 및 TF-TT 접합체의 특성화
파상풍 톡소이드(TT) 단독 및 백신 접합체(Tn-TT-A; Tn-TT-B; TF-TT-A; 및 TF-TT-B)를 당 함량의 존재(두보이스(Dubois) 테스트), 엘만 테스트에 의한 티올 함량, 동적 광 산란(DLS)(도 12) 및 이중 방사 면역확산(double radial immunodiffusion)을 사용한 공지된 마우스 단일클론성 항체 JAA-F11과의 반응성에 대해 SDS 겔 전기영동, 비색 분석에 의해 분석하였다. SDS 겔 전기영동 결과는 탄수화물 항원(Tn 및 TF)의 존재에 대해 또한 양성으로 염색된 접합체의 단량체 형태를 명확하게 나타내었다. 비색 분석(두보이스 테스트)은 탄수화물 항원(10 중량%)의 존재를 확인하였고 접합 후 담체 단백질 상의 잔류 유리 티올기가 없음을 확인하였다. 이중 방사 면역확산 분석은 새로운 TF-TT 접합체와 항-TF 단일클론성 항체 JAA-F11의 교차 반응을 명확하게 나타내는 침전 밴드를 밝혀내어, TF-TT 접합체 상에서 면역원성 탄수화물 항원(TF)의 존재를 확인하였고 담체 단백질(파상풍 톡소이드) 단독으로는 침전 밴드가 관찰되지 않음을 확인하였다.
접합체의 HPLC 분석 당 접합체 제제의 HPLC 분석을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 크로마토그래피 분리를 SB-807G 가드 컬럼(Showa Denko)에 이어 직렬로 연결된 3개의 8 x 300-mm Shodex OHpak 겔 여과 컬럼(2개의 SB-804 및 1개의 SB-803)으로 수행하였다. 당 접합체 면역원을 280 nm의 파장에서 차등 굴절계(RI) 검출기 모델 2300 및 UV 검출기 모델 2600이 구비된 Knauer Smartline 시스템을 사용하여 0.4 mL/min의 유량으로 0.1 M NaNO3로 용리하였다. 접합체 제제(이동상에서 8 mg/mL 용액)를 50-μΛ 주입 루프를 사용하여 주입하였다. 선택된 실험에서, 접합체 분획에 해당하는 공극 부피에서 용리되는 분획을 모으고, 물 Spectra/Por; 분자량 컷오프(MWCO), 12,000 내지 14,000[Spectrum Laboratories])에 대해 투석하였으며 동결건조하였다. 이는 2:1 분획된 접합체에 해당한다.
실시예 11: 티올-엔 광반응에 의한 O-알릴-당의 접합이 펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla의 유리 티올에 미치는 영향
펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla(파상풍 독소(831-844); MW: 1813, 서열 ID 번호: 2)를 3.7e-3 M 농도의 물에 용해시켰고 (500 uL)의 펩타이드를 실온에서 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는 2개의 휴대용 UV365 nm 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 (6 uL, 0.1 M, 3.0 당량) O-알릴-Tn 또는 O-알릴-TF 및 수용성 촉매 AAPH(2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴, 23 uL, 0.025M, 3.0 당량)와 함께 교반하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켰다. 용액을 0, 45, 90 및 135 분에 샘플링하였고 유리 티올 농도를 시스테인 표준 곡선을 사용하여 엘만 테스트로 측정하였다. 도 13은 광 티올-엔 반응의 결과 유리 티올 농도가 시간 의존적으로 감소함을 보여준다.
실시예 12: dTT831-844-Cys-βAla에서 시스테인 위치/접근성 및 사용된 활성화제의 유형이 O-알릴-Tn의 접합 및 티올-엔 광반응 생성물의 면역반응성에 미치는 영향
펩타이드 dTT831-844를 N-말단 또는 C-말단 시스테인으로 합성하였고 실온에서 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는 2개의 휴대용 UV365 nm 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 (200 uL, 0.1 M, 10 당량) O-알릴-Tn 및 촉매량(0.2 당량)의 활성화제 AAPH와 함께 교반되는 2 mM(1 mL)의 농도로 물에 용해시켰다. 활성화제를 첨가한 직후 UV를 켰고 60분 동안 반응시켰다. 유리 티올 농도를 0분 및 60분의 시간에 시스테인 표준 곡선을 사용하여 엘만 테스트로 측정하였다. 유리 티올의 배수 감소는 t = 0 / t = 60에서 티올 농도에 해당한다.
결과는 도 14에 도시되어 있으며, 이는 티올-엔 광반응 접합에서 N-말단("SH-펩타이드") 또는 C-말단("펩타이드-SH") 시스테인을 가지며 수용성(AAPH) 또는 수불용성 활성화제(DMPA)를 사용하여 dTT831-844 펩타이드에 대한 유리 티올 농도의 배수 감소를 나타낸다.
티올-엔 광반응 생성물의 면역반응성을 효소-결합 렉틴 분석(ELLA: Enzyme-linked lectin assay)에 의해 측정하였다. 100 μL PBS pH 7.4 중의 1 μg의 펩타이드를 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(MaxisorpTM, Nunc)에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 PBS-T+1% BSA 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 양고추냉이 과산화효소(VVA-hrp, PNA-hrp, EY LAbs)와 커플링된 렉틴 비시아 빌로사(항-Tn VVA) 또는 땅콩(Peanut) 응집소(항-TF PNA)의 1/100 희석액 100 μL로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 OD 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
결과는 도 15에 도시되어 있으며, 이는 수용성(AAPH) 또는 수불용성 활성화제(DMPA)를 사용하여 상이한 Tn- 펩타이드(즉, 비(非)접합: "pep-Cys" 및 "Cys-pep"; Tn-접합: "Tn-pep" 및 "pep-Tn"; "unc": 비(非)코팅 플레이트)에 대한 렉틴 반응성을 나타낸다. 흥미롭게도, C-말단 시스테인을 갖는 TT 펩타이드는 항-Tn 렉틴 VVA에 의해 특이적으로 인식되었고, 수용성 활성화제 AAPH와 접합 반응이 가장 효과적이었다. Tn 당 접합체는 음성 대조군으로 사용된 항-TF 렉틴(땅콩 렉틴, PNA)에 의해 인식되지 않았다.
실시예 13: 펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla 대 O-알릴-Tn의 티올-엔 광반응 접합에 미치는 파장의 영향
펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla(MW: 1813, 서열 ID 번호: 2)를 실온에서 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm 또는 355 nm에서의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 1 mL의 물 중의 O-알릴-Tn 0.55 mM 및 AAPH(1.44 mg, 5.5 nmol, 10.0 당량) 또는 (0.3 mg, 1.1 nmol, 2.0 당량) DMPA와 함께 교반하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켜고 (60분) 후 반응을 중지하기 위해 UV를 껐다. 펩타이드를 또한 활성화제의 부재 하 및 UV254 nm에서 O-알릴-Tn에 접합하였다. 유리 티올 농도를 시스테인 표준 곡선을 사용하여 엘만 테스트로 측정하였다. 도 16은 세가지 상이한 접합 조건("355nm + AAPH"; "365nm + DMPA"; 및 "254nm")에 대한 시간(분)에 따른 유리 티올의 감소를 도시한다.
티올-엔 광반응 생성물의 면역반응성을 효소-결합 렉틴 분석(ELLA)에 의해 측정하였다. 100 μL PBS pH 7.4 중의 표시된 양의 펩타이드를 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척하고 웰을 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 양고추냉이 과산화효소(VVA-hrp, EY LAbs)와 커플링된 렉틴 비시아 빌로사의 1/100 희석액 100 μL로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
ELLA 결과는 도 17에 제시되어 있으며, 이는 AAPH 또는 DMPAP의 존재 하에서 365 nm에서 또는 활성화제의 부재 하에서 254 nm에서 티올-엔 광반응에 의해 접합된 다양한 양의 Tn-펩타이드에 대한 VVA 렉틴 반응성을 도시한다. 접합 생성물은 렉틴에 의해 검출된 반면, 비 접합 펩타이드("펩타이드") 또는 O-알릴-Tn 단독("Tn")은 미반응이었다. 흥미롭게도, 도 17은 활성화제의 부재하에 254 nm에서의 접합이 활성화제의 존재 하에 365 nm 또는 355 nm에 의해 생성된 것보다 더 면역반응성인 당 접합체 생성물을 생성했음을 보여준다.
실시예 14: 티올-엔 광반응에 의한 펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla에 대한 C-알릴 및 O-알릴 사카라이드의 접합 및 반응성
dTT831-844-Cys-βAla 펩타이드(MW: 1813)를 0.55 mM의 농도에서 물에 용해하였고 이의 1 mL를 실온에서 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 O-알릴-Tn, O-알릴-TF 또는 C-알릴-Tn(100 uL, 11 mM, 2.0 당량) 및 AAPH(1.44 mg, 5.5 nmol, 10.0 당량)와 함께 교반하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켰다. 용액을 표시된 시간에 샘플링하였고 유리 티올 농도를 시스테인 표준 곡선을 사용하여 엘만 테스트로 측정하였다. 도 18은 시험된 상이한 알릴 사카라이드: O-알릴-Tn("Tn"), O-알릴-TF("TF"), 또는 C-알릴-Tn("cTn")에 대한 시간(분)에 따른 유리 티올의 감소를 도시한다.
티올-엔 광반응 생성물의 면역반응성을 효소-결합 렉틴 분석 및 효소-결합 면역흡착 분석에 의해 측정하였다. 100 μL PBS pH 7.4 중의 표시된 양의 펩타이드 접합체를 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 PBS-T+1% BSA 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 양고추냉이 과산화효소(VVA-hrp, PNA-hrp, EY LAbs)와 커플링된 렉틴 비시아 빌로사(항-Tn VVA) 또는 땅콩 응집소의 1/100 희석액 100 μL 또는 0.1 μg/ml의 TF-특이적 정제된 마우스 단일클론성 항체 JAAF11로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, JAAF11을 함유하는 웰을 PBS-T로 세척한 이후 2차 항체 염소 항-마우스 IgG (H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)와 함께 60분 동안 더 인큐베이션하였다. 이후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
도 19는 O-알릴-Tn(C-알릴-Tn은 아님)으로 생성된 펩타이드 접합체만 항-Tn 렉틴 VVA에 의해 인식되었음을 보여준다. 이러한 결과는 펩타이드에 접합되지만 C-알릴-Tn은 렉틴에 결합할 수 있는 입체형태(conformation)를 갖지 않음을 시사한다.
실시예 15: 티올-엔 광반응에 의해 화학적으로 환원된 dTT에 대한 O-알릴-TF의 접합
해독된 파상풍 톡소이드(dTT)를 PBS pH 7.4(MWCO 2,000)에서 투석한 다음 1000 당량 DTT와 함께 인큐베이션하였다. 실온에서 2시간 인큐베이션하고 회전시킨 후, 환원된 단백질 용액을 원심 여과(MWCO 10,000, Amicon)에 의해 PBS pH 7.4에서 세척하였다. 이후, 환원된 단백질(1 mL, 3.51 mg/mL, 0.02 nmol)를 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 최종 부피 1.0 mL PBS 중의 O-알릴-TF(30.0 당량) 및 AAPH(2.0 당량)와 함께 교반하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켜서 반응을 개시한 이후 2시간 후 중지하였다.
천연 dTT와 비교하여 DTT 처리에 의해 생성된 환원된 dTT의 유리 티올 농도를 시스테인 표준 곡선을 사용하는 엘만 테스트에 의해 완충액 교환된 dTT 샘플에서 측정하였으며, 단백질 농도를 BSA 표준 곡선을 사용하는 브래드포드(Bradford) 분석에 의해 측정하였다.
dTT 샘플의 면역반응성을 측정하기 위해, 1 μg의 단백질 샘플을 100 μL의 PBS pH 7.4에 희석하고 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)의 웰에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 100 μL의 0.1 μg/ml의 TF-특이적 정제된 마우스 단일클론성 항체 JAAF11로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 PBS-T로 세척한 이후 2차 항체 염소 항-마우스 IgG (H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)의 1/1000 희석액 100 μL와 함께 60분 동안 더 인큐베이션하였다. 이후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
도 20은 JAAF11("dTT(DTT)-TF")에 대한 dTT-TF의 면역 반응성을 도시하는 반면, 환원된 dTT("dTT (DTT)") 또는 천연 dTT(데이터 미도시)는 비반응성이었다. 이는 O-알릴-TF가 면역반응성 입체형태에서 티올-엔 광반응에 의해 실제로 dTT에 접합되었음을 나타낸다.
실시예 16: 티올-엔 광반응에 의해 화학적으로 환원된 dTT에 대한 O-알릴-Tn의 접합
dTT를 PBS pH 7.4(MWCO 30,000)에서 투석한 다음 0.5 mL(5.8 mg/mL)를 회전 하의 실온에서 50 또는 500 당량 DTT와 함께 인큐베이션하였다. 2시간 후, 환원된 단백질 용액을 원심 여과(MWCO 10,000, Amicon)에 의해 PBS pH 7.4에서 세척하였다. 이후, 500 당량의 DTT(70 uL, 0.5 mmol/mL)로 환원된 단백질을 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 0.1 M O-알릴-TF(60.0 당량) 및 0.1 M AAPH(4.0 당량)와 함께 교반하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켜서 반응을 개시한 이후 45분 후 중지하였다. 환원된 dTT의 유리 티올이 접합의 결과로 환원-내성 티오-에테르 결합을 형성했는지 또는 이황화 결합으로 재산화되었는지 확인하기 위해 접합된 생성물을 100 당량의 DTT로 1시간 동안 처리한 다음 원심 여과로 세척한 다음 환원 처리 전후에 티올 함량을 측정하였다. 유리 티올 투여량을 시스테인 표준 곡선을 사용하여 엘만 테스트로 측정하였다. 단백질 농도를 BSA 표준 곡선을 사용하여 브래드포드 분석에 의해 측정하였다.
도 21은 상이한 접합 조건 후 dTT에서 유리 티올의 몰비를 도시한다. 결과는 dTT 단백질이 용량 의존적으로 환원되었고 500 당량 DTT로 처리 시 9개의 유리 티올에 도달했음(dTT에서 이론상 최대 10개의 시스테인 수에서 벗어남)을 나타낸다. 티올-엔 광 반응에 의한 O-알릴-Tn 또는 O-알릴-TF의 접합은 유리 티올을 비 환원 dTT 수준 이하로 낮추었다. 환원에 대한 dTT-Tn 접합체의 내성은 티올-엔 광반응에 의해 형성된 환원 내성 티오-에테르 결합의 존재를 확인하였다.
dTT 샘플의 면역반응성을 측정하기 위해, 1 μg의 단백질 샘플을 100 μL의 PBS pH 7.4에 희석하고 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)의 웰에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 양고추냉이 과산화효소(VVA-hrp, PNA-hrp, EY LAbs)와 커플링된 렉틴 비시아 빌로사 또는 땅콩 응집소의 1/100 희석액 100 μL 또는 0.1 μg/ml의 TF-특이적 정제된 마우스 단일클론성 항체 JAAF11로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후 JAAF11을 함유한 웰을 PBS-T로 세척한 후 2차 항체 염소 항-마우스 IgG (H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)의 1/1000 희석액 100 μL와 함께 60분 동안 더 인큐베이션하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
도 22는 비 접합 dTT에 비해 렉틴 VVA에 대한 dTT-Tn 접합체의 높은 반응성을 도시한다.
천연 dTT 및 dTT-Tn 접합체를 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE 전기영동으로 분석한 다음 쿠마시 블루로 염색하였다. 겔 전기영동 결과는 dTT-Tn 접합체가 천연 비 접합 dTT보다 더 높은 분자량으로 이동했음을 보여주었다(데이터 미도시).
실시예 17: 티올-엔 광반응성에 의한 O-Allyl-Tn과 화학적으로 티올화된 dTT의 접합에 AAPH 농도가 미치는 영향
dTT를 PBS pH 8(MWCO 30,000)에서 투석한 후 100 μL(0.8 mg)를 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 물 중의 0.1 M 2-이미노티올란 하이드로클로라이드(Sigma)의 용액의 200 당량/단백질, 물 중의 0.1 M O-말릴-TF의 200 당량/단백질 및 물 중의 0.8 당량/단백질 또는 대략 450 당량/단백질 AAPH를 최종 부피 124 μL와 함께 교반하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켜서 반응을 개시하였다. 15분에 광 반응 동안 및 45분에 반응이 완료될 때 샘플을 회수하였다. 접합 생성물을 SephadexTM G25가 충진된 미니 스핀 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 PBS pH 7.4로 완충액 교환하였다. 유리 티올 농도를 시스테인 표준 곡선을 사용하여 엘만 분석으로 측정하였다. 단백질 농도를 BSA를 표준으로 사용하여 브래드포드 분석에 의해 측정하였다.
도 23은 O-알릴-Tn의 부재 하에서 2-이미노티올란과 티올-엔 광반응을 사용한 화학적 티올화 후 dTT 샘플에서 유리 티올의 비율이 25 내지 30에 도달하는 반면 O-알릴-Tn의 존재는 AAPH 농도에 따라 각각 용량 의존적으로 dTT의 티올 비율을 대략 20 및 5로 감소시키는 것을 보여주는데, 이는 티오-에테르 결합이 티올-엔 광반응에 의해 형성되었음을 시사한다.
dTT 샘플의 면역반응성을 측정하기 위해, 1 μg의 단백질 샘플을 100 μL의 PBS pH 7.4에 희석하고 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)의 웰에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 양고추냉이 과산화효소(VVA-hrp, EY LAbs)와 커플링된 렉틴 비시아 빌로사의 1/100 희석액 100 μL로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
도 24는 렉틴 VVA-hrp에 대한 dTT 샘플의 반응성을 도시한다. 천연 비 접합 dTT에 비해 Tn 접합체의 더 높은 반응성을 관찰하였다. 또한, 반응성은 광반응 기간 및 사용된 AAPH 활성화제의 양과 관련이 있었다.
dTT 접합체(5 μg)를 쿠마시 블루로 염색되거나 웨스턴 블롯 분석을 위해 막(Immobilon-P, Merck Millipore)으로 옮긴 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE 전기 영동으로 분석하였다. 막을 PBS-T + 1% BSA에서 1시간 동안 차단하고, PBS-T로 세척한 후, PBS-T에서 양고추냉이 과산화효소(VVA-hrp, EY LAbs)와 커플링된 렉틴 비시아 빌로사의 1/100 희석액과 함께 실온에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 막을 PBS-T로 광범위하게 세척하고 결합된 VVA-hrp를 양고추냉이 과산화효소 발색 기질 4-클로로 1-나프톨(0.03% 과산화수소를 함유하는 PBS 중의 0.3 mg/mL, Sigma)으로 검출하였다. 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 및 VVA-hrp로 염색된 해당 웨스턴 블롯 양쪽 모두로부터 얻은 결과는 dTT-Tn이 천연 dTT보다 더 높은 분자량으로 이동했으며 VVA에 특이적으로 반응하는 것을 드러내었는데, 이는 생성물이 실제로 Tn에 접합된 것을 나타낸다(데이터 미도시).
실시예 18: 티올-엔 광반응에 의해 화학적으로 환원된 BSA에 대한 O-알릴-Tn 및 O-알릴-TF의 접합
BSA(1 mL PBS 중 7 mg, pH 7.4)를 600 당량 DTT와 함께 2시간 동안 인큐베이션 한 다음 원심 여과(MWCO 10,000, Amicon)에 의해 PBS pH 7.4에서 세척하였다. 이후, 환원된 단백질을 티올-엔 광반응에 의해 O-알릴-Tn 또는 O-알릴-TF에 접합하였다. 환원된 BSA(600 uL, 5.3 mg/mL, 0.047 nmol)를 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 O-알릴-당(60 당량) 및 AAPH(4.0 당량) 및 PBS pH 7.4(720 uL)와 함께 교반하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켜서 반응을 개시하였다. 45분 후, 생성물을 을 원심 여과(MWCO 10,000, Amicon)에 의해 PBS pH 7.4로 세척하여 임의의 미반응 O-알릴 및 시약을 제거하였다. 환원된 BSA의 유리 티올 농도를 시스테인 표준 곡선을 사용하여 엘만 분석으로 측정하였고, 단백질 농도를 BSA를 표준으로 사용하는 브래드포드 분석으로 측정하였다.
BSA 샘플의 면역반응성을 측정하기 위해, 1 μg의 단백질 샘플을 100 μL의 PBS pH 7.4에 희석하고 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)의 웰에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 양고추냉이 과산화효소(VVA-hrp, PNA-hrp, EY LAbs)와 커플링된 렉틴 비시아 빌로사 또는 땅콩 응집소의 1/100 희석액 100 μL 또는 0.1 μg/ml의 TF-특이적 정제된 마우스 단일클론성 항체 JAAF11로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, JAAF11을 함유하는 웰을 PBS-T로 세척한 이후 2차 항체 염소 항-마우스 IgG (H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)와 함께 60분 동안 더 인큐베이션하였다. 이후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
도 25는 이러한 조건 하에서 생성된 BSA-TF 및 BSA-Tn이 각각 항-TF JAAF11 단일클론성 항체 및 항-Tn 렉틴 VVA에 대해 매우 반응성이 높고 특이적임을 보여준다.
BSA-Tn 및 BSA-TF 접합체(5 μg)를 쿠마시 블루로 염색된 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였다. 사용된 조건 하에서 BSA의 환원은 엘만 테스트로 측정된 바와 같이 19.29 티올의 몰비를 생성하였다. O-알릴-당과의 접합 후 엘만 테스트는 음성이었는데, 이는 유리 티올이 티올-엔 광반응에 의해 O-알릴 당과 화학적으로 커플링되었음을 시사한다(데이터 미도시). 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 겔은 BSA의 예상 분자량과 더 높은 분자량 종으로 이동된 BSA-접합체 양쪽 모두를 보여주었다(데이터 미도시).
실시예 19: 티올-엔 광반응에 의해 화학적으로 환원된 BSA에 대한 O-알릴-Tn의 접합
BSA(500 μL, 7 mg/mL)를 400, 200 또는 1000 당량의 DTT(0.5 M)와 함께 실온 및 회전에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 환원된 BSA 용액을 PBS pH 7.4에서 밤새 투석하였다. 이후, 환원된 BSA의 유리 티올 농도를 시스테인 표준 곡선을 사용하여 엘만 분석으로 측정하였고, 단백질 농도를 유리 티올/BSA의 몰비를 계산한 BSA를 표준으로 사용하는 브래드포드 분석으로 측정하였다.
도 26은 생성된 유리 티올의 양과 환원제 DTT의 양 사이의 상관 관계를 나타내며, 이는 사용 조건 하에서 1000 당량 DTT로 환원을 수행했을 경우 약 10 티올/BSA에 도달한다.
이후, 환원된 단백질을 다양한 비율의 O-알릴-Tn에 접합하였다. 환원된 BSA(5 nmol)를 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 AAPH 및 PBS pH 7.4를 함유하는 100 당량의 O-알릴-Tn/환원된 BSA 또는 100 당량의 O-알릴-Tn/BSA-티올을 500 μL의 최종 부피로 함께 교반하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켜서 반응을 개시하였다. 45분 후, 생성물을 을 원심 여과(MWCO 10,000, Amicon)에 의해 PBS pH 7.4로 세척하여 미반응 O-알릴 및 시약을 제거하였다.
BSA 샘플의 면역반응성을 측정하기 위해, 1 μg의 단백질 샘플을 100 μL의 PBS pH 7.4에 희석하고 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)의 웰에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 양고추냉이 과산화효소(VVA-hrp, PNA-hrp, EY LAbs)와 커플링된 렉틴 비시아 빌로사의 1/100 희석액 100 μL 또는 0.1 μg/ml의 TF-특이적 정제된 마우스 단일클론성 항체 JAAF11로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, JAAF11을 함유하는 웰을 PBS-T로 세척한 이후 2차 항체 염소 항-마우스 IgG (H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)와 함께 60분 동안 더 인큐베이션하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 ul의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
도 27은 렉틴 VVA 및 항-TF 단일클론성 항체 JAAF11(+염소 항-마우스 IgG-hrp 접합체)에 대한 다양한 BSA-Tn 접합체의 반응성을 도시한다. O-알릴의 최고 비율로 접합된 2개의 BSA-접합체는 티올-엔 광반응의 결과로 VVA에 대해 특이적으로 반응성이 높은 것으로 밝혀졌다.
BSA-Tn 접합체(5 μg)를 쿠마시 블루로 염색된 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하거나 제조업체의 지침(Pierce)에 따라 당 단백질에 대해 분석하였다. 결과는 고 분자량으로 이동한 BSA 접합체는 글리칸에 대해 양성 염색된 반면 천연 비 접합 BSA는 그렇지 않은 것을 보였다(데이터 미도시).
실시예 19: 티올-엔 광반응에 의해 화학적으로 환원된 BSA에 대한 O-알릴-TF의 접합
BSA(1 mL, 0.088 μmol, 5.89 mg/mL, PBS pH 8.0)를 5, 10 또는 20 당량의 2-이미노티올란(5, 10, 20 μL, 0.1 mmol/mL)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 티올화된 BSA를 원심 여과(MWCO 10,000, Amicon)로 세척하여 미반응 시약을 제거한 후 티올-엔 광접합에 의해 O-알릴-TF에 접합시켰다. 티올화된 BSA(440; 480; 575 μL, 6.8; 6.4; 5.2 mg/mL)를 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 3 당량/티올의 O-알릴-Tn 및 AAPH(0.2 당량/티올) 및 PBS pH7.4를 1 mL의 최종 부피로 함께 교반하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켜서 반응을 개시하였다. 1시간 후, 생성물을 을 원심 여과(MWCO 10,000, Amicon)에 의해 PBS pH 7.4로 세척하여 미반응 O-알릴 및 다른 시약을 제거하였다. BSA 샘플의 유리 티올 농도를 시스테인 표준 곡선을 사용하여 엘만 분석으로 측정하였고, 단백질 농도를 BSA를 표준으로 사용하는 브래드포드 분석으로 측정하였다.
BSA 샘플의 면역반응성을 측정하기 위해, 1 μg의 단백질 샘플을 100 μL의 PBS pH 7.4에 희석하고 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)의 웰에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 양고추냉이 과산화효소(PNA-hrp, EY LAbs)와 커플링된 렉틴 땅콩 응집소의 1/100 희석액 100 μL 또는 0.1 μg/ml의 TF-특이적 정제된 마우스 단일클론성 항체 JAAF11로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, JAAF11을 함유하는 웰을 PBS-T로 세척한 이후 2차 항체 염소 항-마우스 IgG (H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)와 함께 60분 동안 더 인큐베이션하였다. 이후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
도 28에서, 이중 축 그래프는 TF 접합 전에 측정된 각각의 접합체의 티올 비율과 관련하여 항-TF 렉틴 PNA 또는 mAb JAAF11에 대한 BSA-TF 접합체의 반응성을 보여준다. 이 결과는 가장 티올화된 BSA로 JAAF11 반응성이 검출되었음을 보여준다.
실시예 20: 티올-엔 광반응에 의해 화학적으로 티올화된 BSA에 대한 O-알릴-Tn의 접합
BSA(250 μL, 4.3 mg/mL)를 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 200 당량의 0.1 M O-알릴-Tn 및 대략 450 당량 AAPH 및 PBS pH 8의 존재 또는 부재 하에서 200 당량의 0.1 M 2-이미노티올란(시그마)를 316 μL의 최종 부피로 함께 교반하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켜서 반응을 개시하였다. 반응 중 지정된 시간에 샘플을 채취하였다. 반응을 45분 후에 중지하였고, 이후 생성물을 SephadexTM G25 미니 스핀 컬럼을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 PBS pH 7.4로 완충액 교환하였다. BSA 샘플의 유리 티올 농도를 시스테인 표준 곡선을 사용하여 엘만 분석으로 측정하였고, 단백질 농도를 BSA를 표준으로 사용하는 브래드포드 분석으로 측정하였다.
도 29는 BSA와 2-이미노티올란 단독 또는 365 nm 광의 존재 하에 BSA의 반응 시에 유리 티올 기능의 시간 의존적 증가를 도시하는 반면, 광반응에서 O-Allyl-Tn의 존재 또는 부재 하 AAPH의 첨가는 검출 가능한 유리 티올의 형성을 방지한다.
BSA 샘플의 면역반응성을 측정하기 위해, 1 μg의 단백질 샘플을 100 μL의 PBS pH 7.4에 희석하고 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)의 웰에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 양고추냉이 과산화효소(VVA-hrp, EY Labs)와 커플링된 렉틴 비시아 빌로사의 1/100 희석액 100 μL로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
도 30에서, 렉틴 VVA에 대한 BSA 접합체의 반응성은 O-알릴-Tn의 존재 하에 티올-엔 광반응에 의해 생성된 BSA 만이 VVA에 의해 검출되는 반면, O-알릴-Tn의 부재 하에 생성된 생성물은 O-Allyl-Tn은 ELLA에서 음성임을 나타낸다. 이러한 결과는 AAPH 및 UV365nm 광이 O-알릴-Tn의 존재 하에 티오-에테르 결합의 형성과 경쟁하는 O-알릴-당의 부재 하에 유리 이황화물을 이황화물로 재산화하는 것을 촉매한다는 것을 시사한다.
실시예 21: 티올-엔 광반응에 의해 화학적으로 티올화된 BSA에 대한 O-알릴-Tn의 접합
BSA(250 μL, 4.3 mg/mL)를 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 200 당량의 0.1 M의 2-이미노티올란(Sigma), 200 당량의 0.1 M O-알릴-Tn 및 0.8 당량의 AAPH 또는 대략 450 당량 AAPH 및 PBS pH 8를 316 μL의 최종 부피로 함께 교반하였다. 항산화 비타민 C(대략 5 mM)가 접합에 미치는 영향을 다량의 AAPH를 함유하는 조건에서 테스트하였다. 큐벳을 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켜서 반응을 개시하였다. 반응 중 지정된 시간에 샘플을 채취하였다. 반응을 45분 후에 중지하였고, 이후 생성물을 SephadexTM G25 미니 스핀 컬럼을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 PBS pH 7.4로 완충액 교환하였다. 접합된 BSA 샘플의 유리 티올 농도를 시스테인 표준 곡선을 사용하여 엘만 분석으로 측정하였고, 단백질 농도를 BSA를 표준으로 사용하는 브래드포드 분석으로 측정하였다.
BSA 샘플의 면역반응성을 측정하기 위해, 1 μg의 단백질 샘플을 100 μL의 PBS pH 7.4에 희석하고 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)의 웰에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 양고추냉이 과산화효소(VVA-hrp, EY Labs)와 커플링된 렉틴 비시아 빌로사의 1/100 희석액 100 μL로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
이중 Y 축을 갖는 도 31은 시간의 함수로서 렉틴 VVA에 대한 접합 생성물의 반응성의 증가 및 O-알릴-Tn의 BSA와의 티올-엔 광접합의 결과로서 유리 티올의 상응하는 감소를 도시한다. 이러한 결과는 반응이 더 높은 농도의 AAPH에서 더 효과적임을 시사한다. 비타민 C의 존재 하에서 생성된 생성물은 VVA 렉틴에 반응하지 않았다(미도시).
BSA-Tn 접합체(5 μg)를 쿠마시 블루로 염색된 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였다. 결과는 더 낮은 AAPH에서 보다 높은 AAPH에서의 반응에서 더 많은 양의 고 분자량 종을 보여주었다. 비타민 C는 고 분자량 종의 형성을 방지하였다(데이터 미도시).
실시예 22: 단백질 티올화의 기능에서 티올-엔 광반응에 의한 BSA에 대한 O-알릴-Tn의 접합
BSA(93 μL, 11.7 mg/mL)를 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 200 당량의 0.1 M의 2-이미노티올란(Sigma), 200 당량의 0.1 M O-알릴-Tn 및 0.08 당량, 0.8 당량 또는 대략 450 당량의 AAPH 및 PBS pH 8를 316 μL의 최종 부피로 함께 교반하였다. 일부 실시예에서, 2-이미노티올란 및/또는 AAPH를 생략하였고 PBS pH 8로 교체하였다. 큐벳을 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm 또는 254 nm의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켜서 반응을 개시하였다. 반응을 45분 후에 중지하였고, 이후 생성물을 SephadexTM G25 미니 스핀 컬럼을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 PBS pH 7.4로 완충액 교환하였다. 단백질 농도를 BSA를 표준으로 사용하여 브래드포드 분석에 의해 측정하였다.
BSA 샘플의 면역반응성을 측정하기 위해, 1 μg의 단백질 샘플을 100 μL의 PBS pH 7.4에 희석하고 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)의 웰에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 양고추냉이 과산화효소(VVA-hrp, EY Labs)와 커플링된 렉틴 비시아 빌로사의 1/100 희석액 100 μL로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
도 32는 단백질 티올화의 부재 하에 접합이 수행될 경우 또는 활성화제 AAPH의 부재 하에 티올화된 단백질이 접합될 경우 VVA에 대한 생성물의 최소 반응성을 도시한다. 그러나, VVA 반응성 생성물은 단백질 티올화 및 AAPH의 부재 하에 UV254 nm에 의해 생성된다.
실시예 23: 높은 접합 비율에서 BSA-TF 반응성의 부재
BSA(93 μL, 11.7 mg/mL)를 실온에서 벤치 상 또는 큐벳에서 2 내지 5 cm의 거리에 있는, 365 nm의 2개의 휴대용 UV 램프(0.16 amps, VWR) 사이에 배치된 석영 큐벳(10 x 10 mm 경로 길이, Fisher)에서 200 당량의 0.1 M 2-이미노티올란(Sigma), 200 당량의 0.1 M O-알릴-TF 및 0.8 당량 또는 대략 450 당량의 AAPH 및 PBS pH 8의 316 μL의 최종 부피의 존재 또는 부재 하에서 교반하였다. AAPH를 첨가한 직후 UV를 켜서 반응을 개시하였다. 반응을 45분 후에 중지하였고, 이후 생성물을 SephadexTM G25 미니 스핀 컬럼을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 PBS pH 7.4로 완충액 교환하였다. 단백질 농도를 BSA를 표준으로 사용하여 브래드포드 분석에 의해 측정하였다. TF 에피토프의 접합된 갈락토스를 갈락토스 표준을 사용하는 두보이스의 방법으로 측정하였다.
BSA 샘플의 면역반응성을 측정하기 위해, 1 μg의 단백질 샘플을 100 μL의 PBS pH 7.4에 희석하고 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트(Maxisorp, Nunc)의 웰에 흡착하도록 하였다. 이후, 웰을 PBS-TweenTM 0.05%(PBS-T)로 2회 세척한 다음 차단 용액으로 30분 동안 충진하였다. 이후 웰을 PBS-T로 3회 세척하고 100 μL의 0.1 μg/ml의 항-TF 단일클론성 항체 JAAF11로 충진하였다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 주면서 또는 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션한 후 웰을 PBS-T로 4회 세척하고 2차 항체 염소 항-마우스 IgG (H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)의 1/1000 희석액 100 μL와 함께 60분 동안 더 인큐베이션하였다. 이후, 웰을 PBS-T로 4회 세척하고 각 웰에 100 μL의 hrp 기질(Ultra TMB-ELISA, Thermo Scientific)을 첨가하였다. 100 μL의 0.5 N 황산을 첨가하여 반응을 중지하고 플레이트를 450 nm에서 플레이트 판독기(Biotek EL808)에서 판독하였다.
이중 Y-축을 갖는 도 33은 더 낮은 갈락토오스 접합체에 비해 높은 갈락토오스 비를 갖는 BSA-TF의 더 낮은 면역반응성을 도시한다. 2개의 접합체에서 갈락토스의 검출은 TF가 BSA에 접합되었지만 접합된 TF 면역반응성이 높은 비율에서 손상되었음을 확인한다.
실시예 24: 티올-엔 광반응에 의해 펩타이드 dTT831-844-Cys-(T
n
)-βAla BSA에 대한 O-알릴-Tn의 접합
도 34는 표로 작성된 LC-MS 데이터와 함께 각각 C- 및 N-말단에서 시스테인 잔기를 갖는 dTT831-844-Cys-βAla 및 Cys-dTT831-844-βAla의 화학 구조를 도시한다.
도 35는 펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla(C-말단)의 상세한 LC-MS 데이터를 도시한다.
도 36은 펩타이드 Cys-dTT831-844-βAla(N-말단)의 상세한 LC-MS 데이터를 도시한다.
절차 A: 물 중의 펩타이드의 용액(1 mL, 2 mM)에 H2O 중의 O-알릴-Tn의 용액(200 μL, 0.1M, 10 당량) 및 UV 큐벳 중의 촉매량의 AAPH를 첨가하였다. 혼합물을 365 nm 조사 하에 실온에서 60분 동안 교반하였다. 엘만 테스트는 반응이 45분 만에 완료되었음을 보여주었다. 이후, 용액을 동결건조하여 백색 분말을 수득하였고 LC-MS는 원하는 Tn-접합된 펩타이드의 존재를 보여주었다; LC-MS: [M] C94H152O31N20S에 대한 계산치, 2089.0653; 실측치, 2089.0780; CAN/H2O 5 내지 95% 5.08분.
유기 용매에서의 절차 B: dTT831-844-Cys-(T n )-βAla(도 34) MeOH 중의 펩타이드의 용액(1 mL, 2 mM)에 H2O 중의 Tn의 용액(200 μL, 0.1M, 10 당량)과 UV 큐벳 중의 촉매량의 DMPAP를 첨가하였다. 혼합물을 365 nm 조사 하에 실온에서 60분 동안 교반하였다. 엘만 테스트는 반응이 45분 만에 완료되었음을 보여주었다. 이후, 용액을 동결건조하여 백색 분말을 수득하였고 LC-MS는 원하는 펩타이드-TN의 존재를 보여주었다. LC-MS: [M] C94H152O31N20S에 대한 계산치, 2089.0653; 실측치, 2089.0675; CAN/H2O 5 내지 95% 5.07분.
도 37은 C-말단 펩타이드 dTT831-844-Cys-βAla 상에서 O-알릴 Tn의 광분해 AAPH-촉매된 티올-엔 반응을 도시한다.
도 38은 C-말단 펩타이드 상에서 O-알릴 Tn의 LC-MS 프로파일을 도시한다.
실시예 25: 티올-엔 광반응에 의한 펩타이드
Cys-(Tn)-dTT831-844- βAla
에 대한 O-알릴-Tn의 접합
절차 A: 물 중의 펩타이드 Cys-(T n )-dTT831-844- βAla(도 33)의 용액(2 mL, 0.482 mM)에 H2O 중의 Tn의 용액(100 μL, 0.1M, 10 당량) 및 UV 큐벳 중의 촉매량의 AAPH를 첨가하였다. 혼합물을 365 nm 조사 하에 실온에서 60분 동안 교반하였다. 엘만 테스트는 반응이 45분 만에 완료되었음을 보여주었다. 이후, 용액을 동결건조하여 백색 분말을 수득하였고 LC-MS는 원하는 펩타이드-Tn 접합체의 존재를 보여주었다; LC-MS: [M] C94H152O31N20S에 대한 계산치, 2089.0653; 실측치, 2089.0719; CAN/H2O 5 내지 95% 5.11분.
절차 B: Cys-(T n )-dTT831-844- βAla(도 33) 메탄올 중의 펩타이드의 용액(2 mL, 0.482 mM)에 H2O 중의 Tn의 용액(100 μL, 0.1M, 10 당량) 및 UV 큐벳 중의 촉매량의 DMPA를 첨가하였다. 혼합물을 365 nm 조사 하에 실온에서 60분 동안 교반하였다. 엘만 테스트는 반응이 45분 만에 완료되었음을 보여주었다. 이후, 용액을 동결건조하여 백색 분말을 수득하였고 LC-MS는 원하는 펩타이드-Tn의 존재를 보여주었다. LC-MS: [M] C94H152O31N20S에 대한 계산치, 2089.0653; 실측치, 2089.0817; CAN/H2O 5 내지 95% 5.10분.
도 39는 N-말단 펩타이드 Cys-dTT831-844-βAla 상에서 O-알릴 Tn의 광분해 AAPH-촉매된 티올-엔 반응을 도시한다.
도 40은 N-말단 펩타이드 상에서 O-알릴 Tn의 상세한 LC-MS 프로파일을 도시한다.
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<120> PRECISION GLYCOCONJUGATES AS THERAPEUTIC TOOLS
<130> P20-105-INP-ROBIC
<150> US 62/647,151
<151> 2018-03-23
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> Clostridium tetani
<400> 1
Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dTT831-844-Cys-beta-Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> ACETYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> bAla
<400> 2
Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Ala
1 5 10 15
Claims (71)
- 당 접합체 면역원을 제조하는 방법으로서,
(a) 티올-엔 반응을 통해 티올기에 직접적으로 접합 가능한 말단 알켄(알케닐 탄수화물 항원)에 공유적으로 연결된 탄수화물 항원을 제공하는 단계;
(b) 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 담체 단백질을 제공하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 유리 티올기에서 상기 담체 단백질에 상기 탄수화물 항원을 직접 접합하기 위해 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여, 상기 당 접합체를 제조하는 단계;를 포함하며,
상기 담체 단백질은 대상체에 투여되었을 때 면역원성이며 상기 담체 단백질에 대한 상기 탄수화물 항원의 접합은 비 접합 탄수화물 항원의 투여와 비교하여 상기 대상체에게 투여 시 상기 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시키는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 알케닐 탄수화물 항원은 수용성인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은, 담체 단백질 변성을 피하고/피하거나 상기 담체 단백질의 활성, 면역원성 및/또는 구조를 유지하는 반응 조건 하에서 수행되는, 방법.
- 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 임의의 유기 용매의 존재 하에 수행되거나, 또는 상기 광촉매 티올-엔 반응은 담체 단백질 변성을 피하기에 충분히 낮은 농도에서 유기 용매의 존재 하에 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 촉매의 존재 하에 수행되는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 촉매는
(a) 수용성 유리 라디칼 발생 아조 화합물과 같은 수용성 촉매; 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드(Vazo 44 또는 VA-044); 2,2'-아조비스 (2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH); 광개시제 활성을 갖는 금속 또는 금속 이온; 과산화물; tert-부틸 하이드로퍼옥사이드; 벤조일퍼옥사이드; 암모늄 퍼설페이트; 또는 광개시제 활성을 갖는 이들의 임의의 유도체; 또는
(b) 수불용성 유리 라디칼 발생 아조 화합물과 같은 수불용성 촉매; 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(DMPA), 아조비스이소부티로니트릴(AIBN), 2,2′-아조비스(2-메틸프로피오니트릴), 4,4′-아조비스(4-시아노펜탄산)(ACVA), 1,1′-아조비스(시아노사이클로헥산)(ACHN), 디아제네디카르복실산 비스(N,N-디메틸아미드)(TMAD); 아조디카르복실산 디피페리디드(ADD), 또는 광개시제 활성을 갖는, 이들의 임의의 유도체인, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 단파 자외선 하의 조사를 포함하는, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 약 254 nm에서 조사를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 장파 자외선 하의 조사를 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 약 355 nm 또는 365 nm에서 조사를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 상기 담체 단백질의 유리 티올기 당 1 내지 200 몰 당량의 상기 알케닐 탄수화물 항원을 반응시키는 것을 포함하며; 그리고/또는 상기 광촉매 티올-엔 반응은 10 내지 300, 10 내지 270, 10 내지 240, 10 내지 210, 10 내지 180, 10 내지 150, 10 내지 120, 10 내지 90, 10 내지 60 또는 10 내지 30분 동안 및/또는 상기 단백질 중의 총 유리 티올 농도의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50-배 감소를 달성하기에 충분한 시간 동안 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 약 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 4.0 및 약 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10 사이의 pH에서 그리고/또는 담체 단백질 변성을 피하는 pH에서 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 단백질에 대한 접합 후 상기 탄수화물 항원은 상기 대상체의 내인성 효소에 의해 상기 담체 단백질로부터 절단될 수 없는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 알릴 아민과 환원당 사이에서와 같이, O-글리코시드 결합, S-글리코시드 결합, N-글리코시드 결합 또는 C-글리코시드 결합과 같은 글리코시드 결합 또는 환원성 아민화에 의해 얻어지는 결합을 통해, 상기 알케닐 탄수화물 항원은 상기 말단 알켄에 공유적으로 연결되고/연결되거나 상기 탄수화물 항원은 상기 담체 단백질에 접합되는, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄수화물 항원은 B 세포 에피토프를 포함하고/포함하거나 상기 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도하고; 그리고/또는 T 세포 에피토프를 포함하고/포함하거나 상기 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도하는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄수화물 항원은 종양 관련 탄수화물 항원(TACA)이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 TACA는 Tn, S-Tn, 톰슨 프라이덴리히(TF), (2,3)-S-TF, (2,6)-S-TF, Globo H, GD2, GD3, GM2, GM3, N-글리콜릴-GM3, Lea, sLea, Lex, sLex 또는 이들의 임의의 조합이고, 이로부터 온 것이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광촉매 티올-엔 반응은 적어도 2개의 동일한 탄수화물 항원 또는 1개 초과 유형의 탄수화물 항원을 상기 담체 단백질에 접합시켜 다가 당 접합체 면역원을 제조하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 다가 당 접합체 면역원은 상기 담체 단백질에 접합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 이상의 동일하거나 상이한 유형의 탄수화물 항원을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄수화물 항원은 바이러스성 다당류 항원 또는 박테리아성 캡슐형 다당류(CPS)이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 박테리아성 CPS는 폐렴구균 및/또는 연쇄구균 다당류 혈청형, 수막구균 CPS 또는 인플루엔자(예컨대, 인플루엔자 유형 a 또는 b) CPS이고, 이로부터 온 것이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 중의 상기 탄수화물 항원은 링커를 통해 상기 말단 알켄에 연결되는, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 단백질은 상기 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하거나, 하나 이상의 추가 시스테인 잔기를, 예를 들어 아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 상기 담체 단백질의 용매-접근 가능한 위치에 추가하도록 선택적으로 조작되는, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄수화물 항원은 인간 T 세포 에피토프를 포함하고/포함하거나 상기 대상체에서 세포 매개 면역 반응을 유도하는, 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 단백질은 파상풍 톡소이드(TT), 디프테리아 톡소이드(DT), 교차 반응 물질 197(CRM197), 수막구균 외막 단백질 복합체(OMPC), H. 인플루엔자 단백질 D(HiD), 사이토카인, 파상풍 독소 831-844(서열 ID 번호: 1 또는 2)와 같은 면역원성 펩타이드, 알부민(예컨대, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민) 또는 이들의 면역원성 단편이거나, 이들로부터 유래하거나, 또는 이들을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 상기 담체 단백질은 상기 광촉매 티올-엔 반응을 수행하기 전에 또는 수행과 함께 환원제, 예컨대, 디티오트레이톨(DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 2-메르캅토에틸아민-HCl 또는 2-메르캅토에탄올로 전처리되고;
(ii) 상기 담체 단백질은 상기 광촉매 티올-엔 반응을 수행하기 전에 또는 수행과 함께 티올화제, 예컨대, 2-이미노티올란 또는 N-하이드록시석신이미드 디티오프로피오네이트(DPS)로 전처리되고;
(iii) 상기 담체 단백질은 상기 광촉매 티올-엔 반응을 수행하기 전에 또는 수행과 함께 티올화제, 예컨대, 2-이미노티올란 또는 N-하이드록시석신이미드 디티오프로피오네이트(DPS)로 전처리되고 이어서 환원제로 전처리되고;
(iv) 상기 담체 단백질은 하나 이상의 이황화 가교를 갖는 단백질이고, 여기서 상기 하나 이상의 이황화 가교는 상기 광촉매 티올-엔 반응 후에 영향을 받지 않고 유지되고;
(v) 상기 담체 단백질은 하나 이상의 이황화 가교를 갖는 단백질이며, 여기서 상기 담체 단백질은 상기 탄수화물 항원에 대한 접합을 위해 하나 이상의 추가 유리 티올기를 노출시키기 위해 환원제로 전처리되고; 또는
(iv) 상기 담체 단백질은 하나 이상의 이황화 가교를 갖는 단백질이며, 여기서 상기 담체 단백질은 상기 탄수화물 항원에 대한 접합을 위해, 티올화제(예컨대, 2-이미노티올란 또는 N-하이드록시석신이미드 디티오프로피오네이트(DPS))로 전처리되어 하나 이상의 추가 유리 티올기를 노출시키고, 이어서 환원제로 전처리되는, 방법. - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당 접합체 면역원에 포함된 탄수화물 항원의 총 수는 접합 전 상기 담체 단백질 상에서 이용 가능한 유리 티올기의 수와 동일한, 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당 접합체 면역원은 상기 대상체에 투여 시에 상기 탄수화물 항원에 세포 매개 면역 반응을 유도하는, 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, (d) 상기 당 접합체 면역원을 정제하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원을 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트와 함께 제형화하는 단계를 포함하는, 당 접합체 백신 또는 후천성 면역 반응-촉발 조성물을 제조하는 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 애주번트는 무기 화합물, 미네랄 오일, 미생물 유도체, 식물 유도체, 사이토카인, 스쿠알렌, 명반, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 수산화 인산 칼슘, 톨 유사 수용체 작용제, 면역자극성 폴리뉴클레오타이드(예컨대, CPG), 면역자극성 지질, 프로인트 애주번트, RIBI의 애주번트, QS-21, 무라밀 디펩타이드, TiterMax, Steviune, Stimune 또는 이들의 임의의 조합이거나 이를 포함하는, 방법.
- 하나 이상의 탄수화물 항원 및 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기를 갖는 면역원성 담체 단백질을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 상기 하나 이상의 탄수화물 항원은 상기 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기에서 상기 면역원성 담체 단백질에 연결되며, 상기 면역원성 담체 단백질에 대하여 상기 하나 이상의 탄수화물 항원의 접합은 비 접합 탄수화물 항원의 투여와 비교하여 대상체에 투여 시 상기 하나 이상의 탄수화물 항원의 면역원성을 증가시키는, 합성 당 접합체 면역원.
- 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물 항원은 링커를 통해 상기 하나 이상의 용매-접근 가능한 시스테인 잔기에 연결되는, 합성 당 접합체 면역원.
- 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물 항원은 제13항 또는 제14항에 정의된 바와 같이 결합을 통해 상기 링커에 연결되는, 합성 당 접합체 면역원.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물 항원은 제2항, 제15항, 제16항, 제17항, 제20항 또는 제21항에 정의된 바와 같은, 합성 당 접합체 면역원.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제18항 또는 제19항에 정의된 바와 같은 다가 당 접합체 면역원인 합성 당 접합체 면역원.
- 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 단백질은 제23항, 제24항, 제25항 또는 제26항에 정의된 바와 같은, 합성 당 접합체 면역원.
- 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당 접합체 면역원에 포함된 탄수화물 항원의 총 수는 상기 담체 단백질 상에서 용매-접근 가능한 시스테인 잔기의 수와 동일한, 합성 당 접합체 면역원.
- 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에 투여 시에 상기 탄수화물 항원에 세포 매개 면역 반응을 유도하는, 합성 당 접합체 면역원.
- 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 합성 당 접합체 면역원.
- 제30항 또는 제31항의 방법에 의해 제조되며/되거나 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항의 합성 당 접합체 면역원 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트를 포함하는 당 접합체 백신.
- 제41항에 있어서, 예방 백신 또는 치료 백신인 당 접합체 백신.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원, 제30항 또는 제31항의 방법에 의해 제조된 당 접합체 백신, 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항의 합성 당 접합체 면역원 또는 제41항 또는 제42항의 당 접합체 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 면역화하거나, 백신접종하거나 또는 치료하는 방법.
- 질환이 있는 대상체의 면역화, 백신접종 또는 치료에서의 사용, 당 접합체에 특이적으로 결합하는 항체의 존재의 검출, 또는 (예컨대, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서) 상기 면역화, 백신접종 또는 치료의 검출을 위한, 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항의 합성 당 접합체 면역원 또는 제41항 또는 제42항의 당 접합체 백신.
- 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 각각의 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- SA는 당 항원 또는 이의 부분이고;
- S-PC는 담체 단백질이고;
- X는 O, S, NR1 또는 CH2이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COCH3 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- R 2 는 H 또는 Me인, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체. - 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 각각의 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- SA는 당 항원 또는 이의 부분이고;
- S-PC는 담체 단백질이고;
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이며 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 또는 R 3 및 R 4 는 질소 원자에 연결된 카르보닐과 함께 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-을 형성하고, 그리고 m은 1인, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체. - 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 상기 합성 당 접합체 면역원은 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- y는 적어도 1이고;
- SA는 당 항원 또는 이들의 면역원성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되며, y는 1 초과인 경우, SA는 동일하거나 상이하고;
- [S] z -PC는 상기 하나 이상의 유리 티올기로부터 유래하는 하나 이상의 황 원자를 갖는 담체 단백질이고;
- z는 적어도 1이고 적어도 y와 동일하고; 그리고
- L은 하기 구조를 갖는 링커로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이며,
상기 식에서
- X는 O, S, NR1 또는 CH2이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COCH3 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- R 2 는 H 또는 Me이고; 그리고
y는 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이한, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체. - 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 상기 합성 당 접합체 면역원은 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- y는 적어도 1이고;
- SA는 당 항원 또는 이들의 면역원성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되며, y는 1 초과인 경우, SA는 동일하거나 상이하고;
- [S] z -PC는 상기 하나 이상의 유리 티올기로부터 유래하는 하나 이상의 황 원자를 갖는 담체 단백질이고;
- z는 적어도 y와 동일하고; 그리고
- L은 하기 구조를 갖는 링커로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이며 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 또는 R 3 및 R 4 는 질소 원자에 연결된 카르보닐과 함께 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-을 형성하고, 그리고 m은 1이고; 그리고
y는 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이한, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체. - 링커를 통해 담체 단백질의 하나 이상의 유리 티올기에 공유적으로 연결된 하나 이상의 당 항원을 포함하는 합성 당 접합체 면역원으로서, 상기 합성 당 접합체 면역원은 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- y는 적어도 1이고;
- SA는 당 항원 또는 이들의 면역원성 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되며, y는 1 초과인 경우, SA는 동일하거나 상이하고;
-[S] z -PC는 상기 하나 이상의 유리 티올기로부터 유래하는 하나 이상의 황 원자를 갖는 담체 단백질이고;
- z는 적어도 y와 동일하고; 그리고
- L은 하기 구조를 갖는 링커로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- r은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 5 은 S-PC, 공유 결합 또는 하기 구조의 라디칼이며,
상기 식에서, R 3 및 R 4 는 각각 수소 원자이며 m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 또는 R 3 및 R 4 는 질소 원자에 연결된 카르보닐과 함께 라디칼 -CO-CH2- 또는 라디칼 -CO-CH2-CH2-을 형성하고, 그리고 m은 1이고; 그리고
y는 1 초과인 경우, L은 동일하거나 상이한, 합성 당 접합체 면역원;
또는 이의 입체 이성질체. - 제49항에 있어서, 상기 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- r은 1, 2, 3, 4 또는 5인, 합성 당 접합체 면역원. - 제49항에 있어서, 상기 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- r은 1 또는 2인, 합성 당 접합체 면역원. - 제49항에 있어서, 상기 링커는 하기 구조를 가지며,
상기 식에서
- X는 S, NR1, CH2 또는 O이고;
- R 1 은 -H, -COH, -COMe 또는 -COEt이고;
- n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
- R 2 는 H 또는 Me이고;
- q는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; 그리고
- r은 1 또는 2인, 합성 당 접합체 면역원. - 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, y는 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20 또는 1 내지 10 범위의 정수인, 합성 당 접합체 면역원.
- 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당 항원은 제15항, 제16항, 제17항, 제20항 또는 제21항에 정의된 바와 같은 탄수화물 항원인, 합성 당 접합체 면역원.
- 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 단백질은 제23항, 제24항 또는 제25항에 정의된 바와 같은 담체 단백질인, 합성 당 접합체 면역원.
- 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 다가 당 접합체 면역원인 합성 당 접합체 면역원.
- 제56항에 있어서, 상기 다가 당 접합체 면역원은 상기 담체 단백질에 접합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 이상의 동일하거나 상이한 유형의 탄수화물 항원을 포함하는, 합성 당 접합체 면역원.
- 제45항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당 접합체 면역원은 대상체에 투여 시에 상기 탄수화물 항원에 세포 매개 면역 반응을 유도하는, 합성 당 접합체 면역원.
- 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항의 합성 당 접합체 면역원 및 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트를 포함하는 백신.
- 제59항에 있어서, 상기 애주번트는 제31항에 정의된 바와 같은, 백신.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원 또는 제32항 내지 제40항 및 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원의 백신의 제조를 위한 용도.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원, 제30항 또는 제31항의 방법에 의해 제조된 당 접합체 백신, 제32항 내지 제40항 및 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 또는 제59항 또는 제60항의 백신의, 상기 하나 이상의 탄수화물 또는 당 항원의 증가된 발현과 관련된 질환이 있는 대상체의 치료를 위한 용도.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원, 제30항 또는 제31항의 방법에 의해 제조된 당 접합체 백신, 제32항 내지 제40항 및 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원 또는 제59항 또는 제60항의 백신의, 상기 당 접합체 면역원에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위한 용도.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 당 접합체 면역원, 제30항 또는 제31항의 방법에 의해 제조된 당 접합체 백신, 제32항 내지 제40항 및 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 합성 당 접합체 면역원의, 상기 당 접합체 면역원에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위한 용도.
- 당 접합체 면역원을 제조하는 방법으로서,
(a) 티올-엔 반응을 통해 티올기에 직접적으로 접합 가능한 말단 알켄(알케닐 탄수화물 항원)에 공유적으로 연결된 탄수화물 항원을 제공하는 단계;
(b) 본원에 기재된 바와 같은 티올-엔 반응을 통해 상기 탄수화물 항원에 대한 접합에 적합한 접합 물질로서, 상기 접합 물질은 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 접합 물질을 제공하는 단계; 및
(c) 상기 하나 이상의 유리 티올기에서 상기 접합체 물질에 상기 탄수화물 항원을 직접 접합하기 위해 광촉매 티올-엔 반응을 수행하여, 상기 당 접합체를 제조하는 단계;를 포함하는 방법. - 제65항에 있어서, 상기 접합체 물질은 중합체, 폴리펩타이드, 선행하는 항들 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 담체 단백질, 고체 지지체, 입자, 또는 본원에 기재된 바와 같이 티올-엔 반응을 통해 상기 탄수화물 항원에 대한 접합에 적합한 유리 티올기를 갖는 임의의 다른 물질이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제65항 또는 제66항에 있어서, 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 특징을 더 포함하는, 방법.
- 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항의 방법에 의헤 제조된 당 접합체의, 탄수화물 항원 또는 탄수화물 항원을 포함하는 종양-순환 세포와 특이적으로 결합하는 항체의 존재를 검출하거나 스크리닝하기 위하거나 탄수화물 항원에 의한 면역화 또는 백신접종으로 인한 항체의 존재를 검출하기 위한 용도.
- 제68항에 있어서, 상기 검출 또는 스크리닝은 면역흡착 분석, ELISA, 마이크로어레이 또는 면역블롯 분석과 같은 임의의 적합한 검출 방법을 통해 수행되는, 용도.
- 대상체에서 면역 반응을 발생하기 위하여, 선행하는 항들 중 어느 한 항에 정의된 또는 선행하는 항들 중 어느 한 항에 의해 정의된 방법에 의해 제조된 당 접합체 또는 당 접합체 면역원을 탄수화물 항원에 투여하여 대상체에서 면역 반응을 생성하는 단계, 및 상기 탄수화물 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 존재에 대하여, 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
- 제70항에 있어서, 선행하는 항들 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 하나 이상의 특징을 더 포함하는, 방법.
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