JP7297047B2 - 治療用ツールとしての精密なグリココンジュゲート - Google Patents
治療用ツールとしての精密なグリココンジュゲート Download PDFInfo
- Publication number
- JP7297047B2 JP7297047B2 JP2021500322A JP2021500322A JP7297047B2 JP 7297047 B2 JP7297047 B2 JP 7297047B2 JP 2021500322 A JP2021500322 A JP 2021500322A JP 2021500322 A JP2021500322 A JP 2021500322A JP 7297047 B2 JP7297047 B2 JP 7297047B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- carrier protein
- thiol
- carbohydrate antigen
- glycoconjugate
- carbohydrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 295
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 293
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 293
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 258
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 243
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 243
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 241
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 197
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 168
- OXBLVCZKDOZZOJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-Dihydrothiophene Chemical compound C1CC=CS1 OXBLVCZKDOZZOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 123
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 90
- 238000006596 Alder-ene reaction Methods 0.000 claims description 88
- 230000001699 photocatalysis Effects 0.000 claims description 87
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 81
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 74
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 67
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 59
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 44
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 37
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims description 33
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 26
- 150000001336 alkenes Chemical group 0.000 claims description 26
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 24
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 22
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 20
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 20
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 20
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical group N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N medroxyprogesterone acetate Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@](OC(C)=O)(C(C)=O)CC[C@H]21 PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 14
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 12
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 11
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 10
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 claims description 8
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 7
- VLSDXINSOMDCBK-BQYQJAHWSA-N (E)-1,1'-azobis(N,N-dimethylformamide) Chemical compound CN(C)C(=O)\N=N\C(=O)N(C)C VLSDXINSOMDCBK-BQYQJAHWSA-N 0.000 claims description 6
- VFXXTYGQYWRHJP-UHFFFAOYSA-N 4,4'-azobis(4-cyanopentanoic acid) Chemical compound OC(=O)CCC(C)(C#N)N=NC(C)(CCC(O)=O)C#N VFXXTYGQYWRHJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 claims description 6
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 6
- KYIKRXIYLAGAKQ-UHFFFAOYSA-N abcn Chemical compound C1CCCCC1(C#N)N=NC1(C#N)CCCCC1 KYIKRXIYLAGAKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LBSPZZSGTIBOFG-UHFFFAOYSA-N bis[2-(4,5-dihydro-1h-imidazol-2-yl)propan-2-yl]diazene;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.N=1CCNC=1C(C)(C)N=NC(C)(C)C1=NCCN1 LBSPZZSGTIBOFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tert‐butyl hydroperoxide Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 6
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 5
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 5
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 claims description 5
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 5
- KWVGIHKZDCUPEU-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(OC)(OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 KWVGIHKZDCUPEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- 239000004342 Benzoyl peroxide Substances 0.000 claims description 3
- OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N Benzoylperoxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OOC(=O)C1=CC=CC=C1 OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100020870 La-related protein 6 Human genes 0.000 claims description 3
- 108050008265 La-related protein 6 Proteins 0.000 claims description 3
- 101100490446 Penicillium chrysogenum PCBAB gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 claims description 3
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium peroxydisulfate Substances [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)OOS([O-])=O VAZSKTXWXKYQJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019400 benzoyl peroxide Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 3
- OQJBFFCUFALWQL-UHFFFAOYSA-N n-(piperidine-1-carbonylimino)piperidine-1-carboxamide Chemical compound C1CCCCN1C(=O)N=NC(=O)N1CCCCC1 OQJBFFCUFALWQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- CCTFAOUOYLVUFG-UHFFFAOYSA-N 2-(1-amino-1-imino-2-methylpropan-2-yl)azo-2-methylpropanimidamide Chemical compound NC(=N)C(C)(C)N=NC(C)(C)C(N)=N CCTFAOUOYLVUFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 75
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 75
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 67
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 65
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 59
- LXEKPEMOWBOYRF-QDBORUFSSA-N AAPH Chemical compound Cl.Cl.NC(=N)C(C)(C)\N=N\C(C)(C)C(N)=N LXEKPEMOWBOYRF-QDBORUFSSA-N 0.000 description 58
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 56
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 52
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 43
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 40
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 36
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 36
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 36
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 28
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- -1 alkenyl carbohydrate Chemical class 0.000 description 27
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 27
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 26
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 26
- 125000004672 ethylcarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 26
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 25
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 23
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 20
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 19
- 125000004674 methylcarbonyl group Chemical group CC(=O)* 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 18
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 17
- 238000003072 Ellman's test Methods 0.000 description 16
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 16
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 15
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 15
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 108010008481 Vicia villosa agglutinin-horseradish peroxidase conjugate Proteins 0.000 description 14
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 14
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 14
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 13
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 12
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 11
- VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N Allylamine Chemical compound NCC=C VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 10
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-imine Chemical compound N=C1CCCS1 CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 9
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 9
- 125000002009 alkene group Chemical group 0.000 description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 8
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 8
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 8
- HEVMDQBCAHEHDY-UHFFFAOYSA-N (Dimethoxymethyl)benzene Chemical compound COC(OC)C1=CC=CC=C1 HEVMDQBCAHEHDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 7
- 108010046016 Peanut Agglutinin Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000006177 thiolation reaction Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 6
- WVQGIONPEKJTJL-UHFFFAOYSA-N ON1C(CCC1=O)=O.CCC(=S)S Chemical compound ON1C(CCC1=O)=O.CCC(=S)S WVQGIONPEKJTJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 6
- 125000006367 bivalent amino carbonyl group Chemical group [H]N([*:1])C([*:2])=O 0.000 description 6
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 6
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 6
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 4
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 4
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 108010073443 Ribi adjuvant Proteins 0.000 description 4
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 4
- XXROGKLTLUQVRX-UHFFFAOYSA-N allyl alcohol Chemical compound OCC=C XXROGKLTLUQVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 4
- 229940009859 aluminum phosphate Drugs 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- HUSUHZRVLBSGBO-UHFFFAOYSA-L calcium;dihydrogen phosphate;hydroxide Chemical compound O.[Ca+2].OP([O-])([O-])=O HUSUHZRVLBSGBO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 4
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 4
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 4
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000006552 photochemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 4
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 244000178870 Lavandula angustifolia Species 0.000 description 3
- 235000010663 Lavandula angustifolia Nutrition 0.000 description 3
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 3
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 3
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 3
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 3
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000001102 lavandula vera Substances 0.000 description 3
- 235000018219 lavender Nutrition 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 3
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 3
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 239000003970 toll like receptor agonist Substances 0.000 description 3
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 3
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 2
- KUIFHYPNNRVEKZ-VIJRYAKMSA-N O-(N-acetyl-alpha-D-galactosaminyl)-L-threonine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O KUIFHYPNNRVEKZ-VIJRYAKMSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- LXEKPEMOWBOYRF-UHFFFAOYSA-N [2-[(1-azaniumyl-1-imino-2-methylpropan-2-yl)diazenyl]-2-methylpropanimidoyl]azanium;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC(=N)C(C)(C)N=NC(C)(C)C(N)=N LXEKPEMOWBOYRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 2
- 210000003040 circulating cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012650 click reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- DAKIDYQCFJQMDF-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;pyridine Chemical compound ClCCl.C1=CC=NC=C1 DAKIDYQCFJQMDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000010437 gem Substances 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical class N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 2
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- KJIFKLIQANRMOU-UHFFFAOYSA-N oxidanium;4-methylbenzenesulfonate Chemical compound O.CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 KJIFKLIQANRMOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- WJKHJLXJJJATHN-UHFFFAOYSA-N triflic anhydride Chemical compound FC(F)(F)S(=O)(=O)OS(=O)(=O)C(F)(F)F WJKHJLXJJJATHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000391 vinyl group Chemical class [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQQKDSXCDXHLLF-UHFFFAOYSA-N 1,3-dibromopropan-2-one Chemical class BrCC(=O)CBr LQQKDSXCDXHLLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylpropanoyl chloride Chemical compound CC(C)(C)C(Cl)=O JVSFQJZRHXAUGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethanethiol;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCCS OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical group SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTKMFQOHBDVEBC-UHFFFAOYSA-N 3-bromo-3-buten-1-ol Chemical compound OCCC(Br)=C RTKMFQOHBDVEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101000635808 Bos taurus Tissue factor Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150041968 CDC13 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical group O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006845 Michael addition reaction Methods 0.000 description 1
- 102000018656 Mitogen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010052006 Mitogen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZOGCRVBCLRHQJ-WHWAGLCYSA-N N-acetyl-alpha-neuraminyl-(2->6)-N-acetyl-alpha-D-galactosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@@H](O)O[C@@H]1CO[C@@]1(C(O)=O)O[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C1 CZOGCRVBCLRHQJ-WHWAGLCYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 229940123384 Toll-like receptor (TLR) agonist Drugs 0.000 description 1
- 108010061048 UDPacetylglucosamine pyrophosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 108010038211 Vicia lectins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- OOXMXCKVYWWEGG-UHDSXZAQSA-N [(2r,3r,4r,5s,6r)-5-acetamido-3,4-diacetyloxy-6-prop-2-enyloxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](CC=C)O[C@H](COC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H]1OC(C)=O OOXMXCKVYWWEGG-UHDSXZAQSA-N 0.000 description 1
- WISFGQOOKBVKPD-QBHLCAJUSA-N [(2r,3s,4s,5r,6r)-3,4,5-tribenzoyloxy-6-bromooxan-2-yl]methyl benzoate Chemical compound C([C@H]1O[C@@H]([C@@H]([C@@H](OC(=O)C=2C=CC=CC=2)[C@H]1OC(=O)C=1C=CC=CC=1)OC(=O)C=1C=CC=CC=1)Br)OC(=O)C1=CC=CC=C1 WISFGQOOKBVKPD-QBHLCAJUSA-N 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000008649 adaptation response Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005937 allylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000746 allylic group Chemical group 0.000 description 1
- MGSDFCKWGHNUSM-QVPNGJTFSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->3)-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]2O)NC(C)=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MGSDFCKWGHNUSM-QVPNGJTFSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000009118 appropriate response Effects 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001743 benzylic group Chemical group 0.000 description 1
- HMQPEDMEOBLSQB-UITYFYQISA-N beta-D-Galp-(1->3)-D-GalpNAc Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HMQPEDMEOBLSQB-UITYFYQISA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000004712 cancer cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 description 1
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- XWBDWHCCBGMXKG-UHFFFAOYSA-N ethanamine;hydron;chloride Chemical compound Cl.CCN XWBDWHCCBGMXKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- LRDFRRGEGBBSRN-UHFFFAOYSA-N isobutyronitrile Chemical compound CC(C)C#N LRDFRRGEGBBSRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940075610 mercuric cyanide Drugs 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N molybdate Chemical compound [O-][Mo]([O-])(=O)=O MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N n-[(2r,3r,4s,5r)-4,5,6-trihydroxy-1-oxo-3-[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexan-2-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N 0.000 description 1
- QYZFTMMPKCOTAN-UHFFFAOYSA-N n-[2-(2-hydroxyethylamino)ethyl]-2-[[1-[2-(2-hydroxyethylamino)ethylamino]-2-methyl-1-oxopropan-2-yl]diazenyl]-2-methylpropanamide Chemical compound OCCNCCNC(=O)C(C)(C)N=NC(C)(C)C(=O)NCCNCCO QYZFTMMPKCOTAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- YXCMTWUNIJCGBK-UHFFFAOYSA-N nitromethane;toluene Chemical compound C[N+]([O-])=O.CC1=CC=CC=C1 YXCMTWUNIJCGBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000001662 opsonic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000007112 pro inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010741 sumoylation Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-ylideneazanium;chloride Chemical compound Cl.N=C1CCCS1 ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/738—Cross-linked polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/001172—Sialyl-Thomson-nouvelle antigen [sTn]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/04—Disaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
- A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明の記載は、治療用ツールであるグリココンジュゲートに関する。より具体的には、本発明の記載は、免疫原性および抗原性の担体であるペプチドおよびタンパク質の遊離チオール基に非ランダムにカップリングされた炭水化物抗原、および例えば、光触媒性チオール－エン「クリックケミストリー」反応を使用して、それを生産する改善された方法に関する。抗原、免疫原、ワクチンとしての、および診断における適用も記載される。
本発明の記載は、多数の文書を参照し、それらの内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み入れられる。
免疫療法の最終的な目的は、感染または腫瘍の進行中に生じる方法と類似した方法で免疫系の自然応答と適応応答を引き起こすことである。自然応答と適応免疫応答との間の主要な境界は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特定には、樹状細胞（ＤＣ）である。ＡＰＣは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などのパターン認識受容体（ＰＲＲ）を介して微生物を認識することができる。微生物表面の決定基または異常な天然にはない抗原を認識するとき、ＡＰＣは、成熟および活性化を経て、細胞内区画から細胞表面へのＭＨＣ分子の再分配、サイトカインおよびケモカインの分泌を引き起こす。微生物または腫瘍およびそれらに関連する抗原性マーカーは、エンドサイトーシス経路を介してＡＰＣにより取り込まれる可能性があり、通常そこで分解される。タンパク質のプロセシングによって放出されたペプチドおよび共有結合で連結された抗原は次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示され、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識され、それに続いて、ＡＰＣから共刺激シグナルを受け取ると、異なるサブセット、例えばＴｈ１またはＴｈ２細胞への機能的な成熟を経る。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの分泌と共に主として炎症促進性の応答を引き起こし、それに対してＴｈ２細胞は、典型的なサイトカインを分泌する。Ｔｈ１細胞は主として細胞媒介性の応答に関連するが、Ｔｈ細胞の両方のタイプは、Ｂ細胞による抗体の生産を支持し、順に抗体のアイソタイプおよび機能に影響を与える。例えば、ＩＬ－１２およびＴＮＦ－αは、Ｔｈ１細胞の分化および１型ＩｇＧサブクラスの生産に関連し、それに対してＩＬ－６および他のＴｈ２サイトカインは、２型ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１）生産に寄与する。したがって、ワクチンで誘導された免疫性を適切な応答に適合させて、目的の病原体または腫瘍抗原を処理できることが望ましい。
炭水化物は、タンパク質およびペプチドとは対照的に、Ｔｈ細胞の参加を引き起こす能力を適切に備えていないＴ細胞と無関係の抗原であるため、免疫細胞の増殖、抗体クラススイッチ、および親和性／特異性成熟を誘導することができない。炭水化物ベースのワクチンが初期に遭遇する主要な初期の進歩は、タンパク質担体に適切にコンジュゲートされる場合、Ｔ細胞依存性エピトープとしての機能を果たし、細菌莢膜多糖体が、オプソニン作用性の抗体を生産する必須の免疫化学能力を獲得することが可能になるという発見によって支持されている。
従来、炭水化物抗原を担体タンパク質にコンジュゲートするための戦略は、リシン残基のε－アミノ基上におけるアルデヒド由来の糖の還元的アミノ化、または単なるアミドカップリング反応のいずれかに頼っている。いずれの場合においても、一般的に、部分的およびランダムな炭水化物抗原コンジュゲーションが起こる。さらに、炭水化物コンジュゲーションのために全てのアミドパートナー（グルタミン酸／アスパラギン酸からのリシンまたは酸からのアミン）が使用される場合、あまりにも多くの炭水化物抗原が、担体タンパク質に結合するようになるため、結果として、免疫原性の本来の減損／消滅を伴う必須のＴ細胞ペプチドエピトープのマスキングを引き起こす可能性がある。したがって、現状におけるグリココンジュゲートワクチンを調製するための戦略は不十分であり、調製物は、その炭水化物分布および再現性に関して必要な均一性が欠如しているため（すなわち、タンパク質上への糖の結合点がランダムに分布しており、バッチ間で様々な密度で存在する）、重大な規制および／または商業上の障害に直面している。したがって、より大きい炭水化物抗原均一性、より正確に特徴付け可能な構造、およびバッチ間の再現性を有するグリココンジュゲートワクチンが、極めて望ましいと予想される。
本発明の記載は、正確な（非ランダムな）位置で免疫原性担体タンパク質に直接カップリングされた炭水化物抗原を含むグリココンジュゲート免疫原に関する。より特定には、担体タンパク質は、１個またはそれより多くの遊離チオール基（例えば、システイン残基の側鎖に対応する）を含み、炭水化物抗原は、これらの遊離チオール基の１つまたはそれより多くにおいて、担体タンパク質にコンジュゲートされている。本発明の記載はまた、例えば「クリックケミストリー」アプローチ（例えば、光触媒性チオール－エン反応）を使用して、炭水化物抗原を担体タンパク質の遊離チオール基に直接コンジュゲートすることを含む、グリココンジュゲート免疫原／ワクチンを合成するための改善された方法にも関する。本明細書に記載される改善されたコンジュゲーション方法は、コンジュゲーションの特異性に影響を及ぼさずに、担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を破壊すること（例えば、天然のジスルフィド架橋の切断および／または変性）を回避するために、十分に穏やかな条件下（例えば、水溶性試薬のみの使用、有機溶媒の非存在、または担体タンパク質の変性を回避するのに十分に低い濃度（例えば、＜５％）および／または相対的に中性のｐＨでの有機溶媒の使用）で実行することができる。さらに、本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応は、紫外光下（例えば、３５５ｎｍまたは３６５ｎｍ）、触媒の存在下で実行してもよいし、または短波紫外光下（例えば、２５４ｎｍ）、プロセスをさらに簡易化するために触媒の非存在下で実行してもよい。
一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲート免疫原を生産するための方法であって、（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、末端アルケンは、チオール－エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；（ｂ）１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する担体タンパク質を提供する工程；および（ｃ）光触媒性チオール－エン反応を実行して、１個またはそれより多くの遊離チオール基において、炭水化物抗原を担体タンパク質に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲート免疫原を生産する工程を含み、担体タンパク質は、対象に投与される場合、免疫原性であり、炭水化物抗原の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、対象に投与されるときの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記方法に関する。
一部の実施態様において、光触媒性チオール－エン反応は、担体タンパク質の変性を回避する反応条件下で実行される。実施態様において、アルケニル炭水化物抗原は、水溶性であり、光触媒性チオール－エン反応は、担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を保持する反応条件下で（例えば、いずれの有機溶媒の非存在下で、または担体タンパク質の変性を回避するのに十分に低い濃度（例えば、＜５％）での有機溶媒の存在下で）実行される。光触媒性チオール－エン反応は、触媒（例えば、水溶性または水不溶性触媒）の存在下で、短波（例えば、２５４ｎｍ）および／または長波（例えば、３５５または３６５ｎｍ）紫外光での放射線照射下において実行してもよい。
一部の実施態様において、光触媒性チオール－エン反応は、担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たり１～２００モル当量のアルケニル炭水化物抗原を反応させることを含み；および／または光触媒性チオール－エン反応は、約３～１０、３．５～９．５、４～９、４．５～８．５、５～８、５．５～８、６～８、または６．５～７．５のｐＨで実行される。
一部の実施態様において、炭水化物抗原は、担体タンパク質へのコンジュゲーションの後、対象の内因性酵素によって担体タンパク質から切断可能ではない。一部の実施態様において、アルケニル炭水化物抗原は、末端アルケンに共有結合で連結されているか、および／または炭水化物抗原が、グリコシド結合を介して、例えば、Ｏ－グリコシド結合、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合、または還元的アミノ化により得られた結合を介して、例えばアリルアミンと還元糖（細菌ＣＰＳを含む）との間で、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、Ｂ細胞エピトープを含むか、および／または対象において体液性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、Ｔ細胞エピトープを含むか、および／または対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープの両方を含む、および／または対象において体液性および細胞媒介性免疫応答の両方を誘導する。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）、例えばＴｎ、Ｓ－Ｔｎ、トムゼン－フリーデンライヒ（Thomsen-Friedenreich：ＴＦ）、（２，３）－Ｓ－ＴＦ、（２，６）－Ｓ－ＴＦ、グロボＨ（Globo H）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ－グリコリル－ＧＭ３、Ｌｅａ、ｓＬｅａ、Ｌｅｘ、ｓＬｅｘ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、もしくはそれを含む。一部の実施態様において、光触媒性チオール－エン反応は、同じ炭水化物抗原の少なくとも２つ、または１つより多くのタイプの炭水化物抗原を、担体タンパク質にコンジュゲートさせることによって、多価グリココンジュゲート免疫原（例えば、担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含む）を生産する。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、ウイルス多糖抗原、または細菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）（例えば、肺炎球菌および／または連鎖球菌多糖体の血清型、髄膜炎菌ＣＰＳ；インフルエンザ（例えばインフルエンザａ型またはｂ型）ＣＰＳ）であるか、またはそれを含む。
一部の実施態様において、アルケニル炭水化物抗原は、リンカー（例えば、本明細書に記載されるリンカー）を介して、末端アルケンに連結されている。
一部の実施態様において、担体タンパク質は、１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する１個またはそれより多くのシステイン残基を含む。一部の実施態様において、担体タンパク質は、Ｔ細胞エピトープを含むか、および／または対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する。
一部の実施態様において、担体タンパク質は、Ｂ細胞エピトープを含むか、および／または対象において体液性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、担体タンパク質は、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープの両方を含む、および／または対象において体液性および細胞媒介性免疫応答の両方を誘導する。一部の実施態様において、担体タンパク質は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌（H. influenzae）のプロテインＤ（ＨｉＤ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、サイトカイン、免疫原性ペプチド、例えば破傷風毒素８３１－８４４（配列番号１または２）、アルブミン（例えばウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）、またはそれらの免疫原性フラグメントであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む。一部の実施態様において、担体タンパク質は、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、（ｉ）１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋は、前記光触媒性チオール－エン反応の後、影響を受けないままであり；または（ｉｉ）担体タンパク質を還元剤で前処理して、炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させる。
一部の実施態様において、グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数は、コンジュゲーション前の担体タンパク質上の利用可能な遊離チオール基の数に等しい。一部の実施態様において、グリココンジュゲート免疫原は、対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する。
一部の実施態様において、本明細書に記載される方法は、（ｄ）グリココンジュゲート免疫原を精製する工程をさらに含む。
一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲートワクチンを生産するための方法であって、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバント（例えば、無機化合物、鉱油、微生物誘導体、植物誘導体、サイトカイン、スクアレン、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム（calcium phosphate hydroxide）、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、免疫刺激ポリヌクレオチド（例えば、ＣＰＧ）、免疫刺激脂質、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＱＳ－２１、ムラミルジペプチド、またはそれらのあらゆる組合せ）を用いて製剤化することを含む、上記方法に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原および１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基を有する免疫原性担体タンパク質を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基において、免疫原性担体タンパク質に連結されており、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性担体タンパク質へのコンジュゲーションは、対象に投与されると、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、本明細書に記載されるリンカーを介して、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基に連結されており、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、本明細書に記載される通りである。一部の実施態様において、合成グリココンジュゲート免疫原は、本明細書に記載される多価グリココンジュゲート免疫原であり、本明細書に記載される担体タンパク質を使用する。一部の実施態様において、グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数は、担体タンパク質における溶媒接近可能なシステイン残基の数に等しい。一部の実施態様において、合成グリココンジュゲート免疫原は、対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、合成グリココンジュゲート免疫原は、本明細書に記載される方法によって調製される。
一部の形態において、本発明の記載は、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、および／または本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原を含むグリココンジュゲートワクチン、ならびに医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントに関する。一部の実施態様において、グリココンジュゲートワクチンは、予防ワクチンまたは治療ワクチンである。
一部の形態において、本発明の記載は、対象を免疫化する、対象にワクチン接種する、または対象を処置する方法であって、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲート免疫原、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載されるグリココンジュゲートワクチンを対象に投与することを含む、上記方法に関する。一部の実施態様において、本発明の記載は、疾患を有する対象を免疫化すること、対象にワクチン接種をすること、もしくは対象を処置することにおいて使用するための、またはグリココンジュゲートに特異的に結合する抗体の存在を検出するための、もしくは前記免疫化、ワクチン接種、または処置を検出するための（例えば、対象からの生物学的サンプルにおける）、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原またはグリココンジュゲートワクチンに関する。
一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
－ Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨ２であり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＣＨ３、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１、２、３、４または５であり；
－ Ｒ５は、Ｓ－ＰＣ、共有結合、または構造：
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１、２、３、４または５である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１または２である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１または２である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の実施態様において、本発明の記載は、ｙが、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、１から１０、１から５、または１から３の範囲の整数である、上記で設計された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の実施態様において、糖抗原は、本明細書に記載される炭水化物抗原であり、担体タンパク質は、本明細書に記載される通りであり、合成グリココンジュゲート免疫原は、本明細書に記載される多価グリココンジュゲート免疫原である。
一部の形態において、本発明の記載は、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに本明細書に記載される医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含むワクチンに関する。
一部の形態において、本発明の記載は、ワクチンの製造のための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原の使用に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、前記１つまたはそれより多くの炭水化物または糖抗原の発現の増加に関連する疾患を有する対象を処置するための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載されるワクチンの使用に関する。
一般的な定義
見出し、および他の識別子、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）、（ｉｉ）などは、単に明細書と特許請求の範囲を読みやすくするために提示される。明細書または特許請求の範囲における見出しまたは他の識別子の使用は、工程または要素が、アルファベットまたは数の順で、またはそれらが提示された順で実行されることを必ずしも必要としない。
見出し、および他の識別子、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）、（ｉｉ）などは、単に明細書と特許請求の範囲を読みやすくするために提示される。明細書または特許請求の範囲における見出しまたは他の識別子の使用は、工程または要素が、アルファベットまたは数の順で、またはそれらが提示された順で実行されることを必ずしも必要としない。
言葉「１つの」（aまたはan）の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において用語「含む」と共に使用される場合、「１つの」を意味する場合があるが、「１つまたはそれより多くの」、「少なくとも１つの」および「１つまたは１つより多くの」の意味とも一致する。
用語「約」は、値が、値を決定するために採用されるデバイスまたは方法の誤差の標準偏差を含むことを示すのに使用される。一般的に、用語「約」は、１０％までの起こり得る変動を表すことを意味する。それゆえに、値の１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０％の変動が、用語「約」に含まれる。別段の指定がない限り、範囲の前での用語「約」の使用は、その範囲の両端の値に適用される。
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、言葉「含む」（および含む（comprising）のあらゆる形態、例えば「含む（comprise）」および「含む（comprises）」）、「有する」（および有する（having）のあらゆる形態、例えば「有する（have）」および「有する（has）」）、「包含する」（および包含する（including）のあらゆる形態、例えば「包含する（includes）」および「包含する（include）」）または「含有する」（および含有する（containing）のあらゆる形態、例えば「含有する（contains）」および「含有する（contain）」）は、包括的であるか、または非限定的であり、追加の、記載されていないエレメントまたは方法の工程を排除しない。
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」（例えば、表現「担体タンパク質」における）は、あらゆるペプチド結合したアミノ酸の鎖を意味し、これは、修飾が本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原およびグリココンジュゲートワクチンの免疫原性を破壊しない限り、あらゆるタイプの修飾（例えば、化学的または翻訳後修飾、例えばアセチル化、リン酸化、グリコシル化、硫酸化、ＳＵＭＯ化（sumoylation）、プレニル化、ユビキチン化など）を含んでいてもよいし、または含んでいなくてもよい。さらに明確にするために言えば、用語「タンパク質」および「担体タンパク質」は、本明細書で使用される場合、ペプチドとポリペプチドの両方を包含する。
本明細書で使用される場合、用語「投与」は、投与経路が対象において免疫応答の発生を引き起こしさえすれば、非経口（例えば、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内）、経口、経皮、鼻腔内などの投与経路を含み得る。
本明細書で使用される場合、「対象」は、一般的に、霊長類を含む哺乳動物を指し、特定にはヒトを指す。
本発明の記載の他の目的、利点および特徴は、添付の図面を参照しながら、単なる例として例示された以下に示すそれらの具体的な実施態様の非制限的な記載を読むことで、より明らかになると予想される。
添付の図面は以下の通りである。
配列表
本出願は、約４ＫＢのサイズを有する２０１９年３月１９日に作成されたコンピューター可読の形態の配列表を含有する。コンピューター可読の形態は、参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、約４ＫＢのサイズを有する２０１９年３月１９日に作成されたコンピューター可読の形態の配列表を含有する。コンピューター可読の形態は、参照により本明細書に組み入れられる。
詳細な説明
本発明の記載は、グリココンジュゲート免疫原（例えば、ワクチンとして使用するための、診断における、または特異的な抗グリココンジュゲート抗体などの診断または治療用ツールを生成するための）に関する。本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、一般的に、免疫原性担体タンパク質にカップリングされた炭水化物抗原を含む。より特定には、担体タンパク質は、１個またはそれより多くの遊離チオール基（例えば、システイン残基の側鎖に対応する）を含み、炭水化物抗原は、これらの遊離チオール基の１つまたはそれより多くにおいて、担体タンパク質にコンジュゲートされている。本発明の記載はまた、例えば「クリックケミストリー」アプローチ（例えば、光触媒性チオール－エン反応）を使用して、炭水化物抗原を担体タンパク質の遊離チオール基に直接コンジュゲートすることを含む、グリココンジュゲート免疫原／ワクチンを合成するための改善された方法にも関する。本明細書に記載される改善されたコンジュゲーション方法は、コンジュゲーションの特異性に影響を及ぼさずに、担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を破壊すること（例えば、天然のジスルフィド架橋の切断および／または変性）を回避するために、十分に穏やかな条件下（例えば、水溶性試薬のみの使用、有機溶媒の非存在、担体タンパク質の変性を回避するのに十分に低い濃度（例えば、＜５％）および／または相対的に中性のｐＨでの有機溶媒の使用）で実行することができる。さらに、本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応は、紫外光下（例えば、３５５ｎｍまたは３６５ｎｍ）、触媒の存在下で実行してもよいし、または短波紫外光下（例えば、２５４ｎｍで）、プロセスをさらに簡易化するために触媒の非存在下で実行してもよい。
本発明の記載は、グリココンジュゲート免疫原（例えば、ワクチンとして使用するための、診断における、または特異的な抗グリココンジュゲート抗体などの診断または治療用ツールを生成するための）に関する。本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、一般的に、免疫原性担体タンパク質にカップリングされた炭水化物抗原を含む。より特定には、担体タンパク質は、１個またはそれより多くの遊離チオール基（例えば、システイン残基の側鎖に対応する）を含み、炭水化物抗原は、これらの遊離チオール基の１つまたはそれより多くにおいて、担体タンパク質にコンジュゲートされている。本発明の記載はまた、例えば「クリックケミストリー」アプローチ（例えば、光触媒性チオール－エン反応）を使用して、炭水化物抗原を担体タンパク質の遊離チオール基に直接コンジュゲートすることを含む、グリココンジュゲート免疫原／ワクチンを合成するための改善された方法にも関する。本明細書に記載される改善されたコンジュゲーション方法は、コンジュゲーションの特異性に影響を及ぼさずに、担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を破壊すること（例えば、天然のジスルフィド架橋の切断および／または変性）を回避するために、十分に穏やかな条件下（例えば、水溶性試薬のみの使用、有機溶媒の非存在、担体タンパク質の変性を回避するのに十分に低い濃度（例えば、＜５％）および／または相対的に中性のｐＨでの有機溶媒の使用）で実行することができる。さらに、本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応は、紫外光下（例えば、３５５ｎｍまたは３６５ｎｍ）、触媒の存在下で実行してもよいし、または短波紫外光下（例えば、２５４ｎｍで）、プロセスをさらに簡易化するために触媒の非存在下で実行してもよい。
本明細書に記載されるコンジュゲーション方法によって提供される精密さがより大きいために、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原／ワクチンは、より大きい均一性（その炭水化物分布に関して）、再現性を有することができ、さらに、他のアミノ酸側鎖（例えば、リシンからのアミン、またはグルタミン酸／アスパラギン酸残基からの酸）へのランダムカップリングを頼るグリココンジュゲートと比較してより簡単に特徴付けすることができる。このような特徴は、グリココンジュゲートワクチンの規制当局の承認および／または商業化を容易にする可能性があり、これらはどちらも、従来のアプローチに基づいた場合では難しいことが歴史的に証明されている。
一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲート免疫原を生産するための方法（例えば、対象への投与のための）に関する。用語「対象」は、本明細書で使用される場合、一般的に、好ましくはグリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体の生産を引き起こす、本明細書に記載されるようなグリココンジュゲート免疫原に対する免疫応答を起こすことができる生物（例えば、動物またはヒト）を指す。一部の実施態様において、本明細書に記載される対象は、治療的に処置しようとする患者（例えば、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原でのワクチン接種を介して）であってもよいし、または調査、診断、および／または治療目的のためのツール（例えば、抗体）を生成するための手段として採用される場合もある。グリココンジュゲート免疫原を生産するための方法は、一般的に、チオール特異的な官能基を有する（例えば、それを含むように化学修飾された）炭水化物抗原を提供する工程；１個またはそれより多くの遊離チオール基（例えば、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基、および／またはジスルフィド架橋に関与しないシステイン）を有する担体タンパク質を提供する工程；および炭水化物抗原を担体タンパク質と反応させ、それによって、担体タンパク質の遊離チオール基の位置に対応する１つまたはそれより多くの予測可能な（非ランダム）結合点で炭水化物抗原を担体タンパク質にカップリングする工程を含む。一部の実施態様において、本方法は、グリココンジュゲート免疫原を精製または単離する工程をさらに含んでいてもよく、次いでグリココンジュゲート免疫原は、ワクチン（例えば、アジュバントを含む）として製剤化してもよい。
用語「グリココンジュゲート」は、本明細書で使用される場合、目的の対象における炭水化物抗原の免疫原性を強化するために担体タンパク質にカップリングされた炭水化物抗原（例えば、抗原性の単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖）を指す。表現「炭水化物抗原」および「糖抗原」は、本明細書で使用される場合、同じ意味を有する。用語「免疫原」は、免疫系の成分（例えば、抗体および／またはリンパ球）によって特異的に結合し、目的の対象において体液性および／または細胞媒介性免疫応答を生じさせることが可能な物質を指す。「グリココンジュゲート免疫原」などの表現における用語「免疫原」は、本明細書で使用される場合、特定の使用（例えば、対象において免疫応答を生じさせるための免疫原としての使用）に対する、グリココンジュゲートそれ自体に限らないグリココンジュゲートの能力（すなわち、物理的な特徴または特性）を指す。例えば、一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、生物学的サンプル（例えば、対象からの）におけるグリココンジュゲート免疫原に結合する抗体の存在または非存在を検出するための診断アッセイまたは方法（例えば、インビトロの方法）において採用することができる。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体（例えば、診断的または治療的に適用可能なモノクローナル抗体）をスクリーニングする、同定する、または評価するのに使用することができる。
一部の形態において、本発明の記載は、炭水化物抗原を担体タンパク質の遊離チオール基に直接コンジュゲートするための「クリックケミストリー型」のアプローチの使用に関する。より具体的には、図２で示されるように、光触媒性チオール－エン反応は、炭水化物抗原（Ｒ２）が、光触媒性チオール反応を使用する担体タンパク質のシステインチオール基（－ＳＨ）（Ｒ１）への直接の共有結合に好適な末端アルケン官能基（アルケニル炭水化物抗原）を含有するように改変されている反応であることが好ましい。図３を参照すれば、Ｂ細胞エピトープを含む炭水化物抗原（例えば腫瘍関連炭水化物抗原ＴｎおよびＴＦ）は、チオール－エン反応を介して、破傷風トキソイド（ＴＴ）などの免疫原性担体タンパク質に光化学的にコンジュゲートさせることができ、破傷風トキソイドは、その６個の利用可能なシステイン残基（ただしジスルフィド架橋に関与する４つのシステイン残基は除く）のために６個の遊離チオール基を有することがわかっている。本明細書に記載されるコンジュゲーション方法は、図３に示される破傷風トキソイド担体タンパク質の場合、好ましくは、予測可能な（非ランダムな）結合点でコンジュゲートされた正確に６個の炭水化物抗原をもたらす。本明細書に記載される方法は、末端をアルケン基（末端アルケン）にすることができる、天然または合成のあらゆる単糖、オリゴ糖、および多糖に適用可能である。
一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、末端アルケンに連結されるように（直接的に、またはリンカーまたはスペーサーを介して間接的に）（例えば、グリコシド結合を介して、または例えばアリルアミンと還元糖との間での、好ましくはＮａＢＨ４および／またはＮａＢＨ３ＣＮを使用した還元的アミノ化により得られた結合を介して）化学修飾されていてもよく、この場合、アルケニル炭水化物抗原の末端アルケン基は、チオール－エン反応（例えば、光触媒性チオール－エン反応）を介して、担体タンパク質の遊離チオール（例えば、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基、および／またはジスルフィド架橋に関与しないシステイン）にコンジュゲート可能である。アルケニル炭水化物抗原の末端アルケン基は、一置換されたアルケン、ビニル基、またはアリル基であり得る。好ましい実施態様において、アルケニル炭水化物抗原は、水溶性であることから、本明細書に記載される水性ベースのチオール－エン反応におけるその使用を可能にする。
「グリコシド結合」は、本明細書で使用される場合、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、Ｏ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合、または還元糖の還元的アミノ化（例えば、ＮａＢＨ４または好ましくはＮａＢＨ３ＣＮを使用）により得られた結合の１つまたはそれより多くを含んでいてもよい。一部の実施態様において、グリコシド結合は、投与される対象の内因性酵素（例えば、グリコヒドロラーゼ）によって切断可能ではないグリコシド結合であり得る。このような切断不可能なグリコシド結合は、対象への投与後により長い半減期を有するグリココンジュゲート免疫原をもたらすことができ、これが順に、治療目的および／または抗体生成目的にとってより好都合な免疫応答を生じさせることができる。一部の実施態様において、グリコシド結合は、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合、または例えばアリルアミンと還元糖との間での還元的アミノ化により得られた結合であり得る。
一部の実施態様において、「リンカー」または「スペーサー」の使用が好ましく、このような用語は、本明細書において、炭水化物抗原を対象の免疫系によって認識させることを可能にする（例えば、担体タンパク質によってマスクされるのとは対照的に）、炭水化物抗原と、それがコンジュゲートされている担体タンパク質との十分な物理的な分離を提供する化学的な連結を指すものとして使用される。一部の実施態様において、リンカーは、Ｃ、Ｓ、Ｎ、およびＯから選択される、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の連続する残基の鎖を含んでいてもよい。
用語「コンジュゲート可能な」は、本明細書で使用される場合、実際に分子が互いに共有結合で結合しているかどうかに関係なく、少なくとも２つの分子（例えば、炭水化物抗原および担体タンパク質）が化学反応を介して互いに共有結合で結合する能力または可能性を指す。対照的に、用語「コンジュゲートした」は、少なくとも２つの分子（例えば、炭水化物抗原および担体タンパク質）が互いに共有結合で結合していることを指す。
一部の実施態様において、様々なタイプの炭水化物抗原の末端を、チオール－エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能な末端アルケン基にすることができる。例えば、末端アルケン基を有する炭水化物抗原は、アリルＴｎおよびアリルＴＦ反応物の合成に関する本明細書の実施例２～７に記載されるアプローチを適合させることによって合成することができる。
一部の実施態様において、末端アルケン基を有する炭水化物抗原は、光触媒性チオール－エン反応を使用して、例えば、Ｔｎ－ＴＴおよびＴＦ－ＴＴコンジュゲートの合成に関する本明細書の実施例８および９に記載されるアプローチを適合させることによって、担体タンパク質の遊離チオール基にコンジュゲートさせることができる。例えば、水性溶媒（例えば、ＰＢＳなどの緩衝液）中に溶解させた１種またはそれより多くのアルケニル炭水化物抗原を、紫外光照射に好適な容器（例えば、石英セル）中で、同様に水性溶媒（例えば、ＰＢＳなどの緩衝液）中に溶解させた担体タンパク質と混合する。次いで混合物を、触媒（例えば、光開始剤または活性化剤）の存在または非存在下において、短波、中波または長波紫外光（例えば、約２５４ｎｍ、約３５５ｎｍ、または約３６５ｎｍにピーク波長を有する）下で放射線照射する。本明細書においてチオール－エン反応の文脈で使用される場合、用語「触媒」、「光開始剤」、および「活性化剤」は、光触媒性チオール－エン反応を介した、１個またはそれより多くの遊離チオール基における、炭水化物抗原の担体タンパク質へのコンジュゲーションを促進する物質を指すのに同義的に使用することができる。
一部の実施態様において、触媒は、水溶性光開始剤、例えば水溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物；２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］ジヒドロクロリド（Ｖａｚｏ ４４またはＶＡ－０４４）；２，２’－アゾビス（２－アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）；本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応において光開始剤活性を有する金属もしくは金属イオン；または光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体であり得る。一部の実施態様において、触媒は、水溶性光開始剤、例えば水溶性過酸化物、例えばｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドもしくは過酸化ベンゾイル、もしくは過硫酸アンモニウム、または他の好適な触媒であり得る。
一部の実施態様において、触媒は、水不溶性光開始剤、例えば水不溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物；２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）、４，４’－アゾビス（４－シアノペンタン酸）（ＡＣＶＡ）、１，１’－アゾビス（シアノシクロヘキサン）（ＡＣＨＮ）、ジアゼンジカルボン酸ビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミド）（ＴＭＡＤ）；アゾジカルボン酸ジピペリジド（ＡＤＤ）、または本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応において光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体であり得る。
一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応は、例えば糖の重合を低減する、最小化する、または回避するために、担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たりのアルケニル炭水化物抗原（すなわち、末端アルケンを含む炭水化物抗原）のモル当量の比率を制御することを含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応は、担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たり、１～３００、１～２５０、１～２００、１～１００、または１～１０、１～５、または１～２モル当量の炭水化物抗原を反応させることを含んでいてもよい。
一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応は、担体タンパク質中の総遊離チオール濃度の、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０分の１の低減を達成するのに十分な時間実行される（例えば、エルマン試験によって決定した場合）。一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応は、１０～３００、１０～２７０、１０～２４０、１０～２１０、１０～１８０、１０～１５０、１０～１２０、１０～９０、１０～６０、または１０～３０分間実行される。
一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応は、約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０から、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０までの間のｐＨで実行されてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応は、担体タンパク質の変性を回避するｐＨで実行されてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール－エン反応は、４～５のｐＨで、好ましくはｐＨ４．４で（例えば、酢酸緩衝液中で）実行されてもよい。
一部の実施態様において、水溶性光開始剤の使用（有機溶媒を必要とする光開始剤に優先して）は、本明細書に記載されるチオール－エンコンジュゲーション反応を、水性試薬および水性溶媒のみを使用して実行できるため有利である可能性があり、これは、有機溶媒は、Dondoniら、2009およびDondoniら、2012に記載されたように、担体タンパク質の変性、加えて、遊離ではないシステイン残基（例えば、分子内および／または分子間のジスルフィド結合に関与するシステイン）への望ましくない／予測不可能なコンジュゲーションに寄与する可能性があるためである。
代替の実施態様において、水不溶性光開始剤は、必要に応じて、その溶解のために有機溶媒と共に採用してもよい。好ましくは、有機溶媒の存在または濃度は、担体タンパク質の変性、加えて遊離ではないシステイン残基（例えば、分子内および／または分子間のジスルフィド結合に関与するシステイン）への望ましくない／予測不可能なコンジュゲーションに寄与しないものとする。例えば、このような光開始剤は、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）などであり得る。
本明細書に記載されるチオール－エンアプローチの代替の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、１つまたはそれより多くのチオール特異的な官能基、例えばヨードアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化ベンジル、またはブロモメチルケトンを有するように修飾することができ、これらの官能基は、チオールのＳ－アルキル化によって反応して安定なチオエーテル生成物を生成する（例えばこれは、リシン残基への不要な、ランダムな炭水化物抗原コンジュゲーションを回避することができる、相対的に低いｐＨ、例えば９、８、７．５、または７未満、および５、５．５、または６を超えるｐＨで行われる）。図４に、チオール特異的な官能基（例えば、ヨードアセトアミドおよびマレイミド基）を含むように修飾された炭水化物抗原の例を示す。一部の実施態様において、マレイミド基は、チオール－エン反応を介して担体タンパク質のチオール基にコンジュゲート可能な末端アルケンとして適格である。
一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、１つまたはそれより多くのＢ細胞エピトープを含んでいてもよいし、および／もしくは体液性免疫応答を誘導することができ、および／またはＴ細胞エピトープを含んでいてもよいし、および／または投与のときに対象において細胞媒介性免疫応答を誘導することができる。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、対象に投与されると、少なくとも、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答（例えば、体液性応答に加えて）を誘導することができる。
一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、例えば、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）であってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。がん細胞の外側の細胞膜の糖タンパク質および糖脂質は、特定のＯ－グリカンを過剰発現する。これらの糖タンパク質は、ムチン（ＭＵＣ）として公知のタンパク質ファミリーを集合的に構成し、なかでもＭＵＣ１が最も広く調査されているものの一つである。正常細胞上のＭＵＣは、複雑なグリコシル化パターンを生じさせる活性なグリコシルトランスフェラーゼのために、高度にＯ－グリコシル化されている。がん細胞において、主要なグリコシルトランスフェラーゼの下方調節は、それより短いグリカンの蓄積を引き起こし、ムチン上でより一層限定的なＯ－グリコシル化を引き起こす。これらの変更された、正常細胞とがん性細胞との間のグリコシル化パターンの結果は、ＴＡＣＡの過剰累積であり、これは、他の状況では、正常な組織における複雑なグリコシル化によって隠される（マスクされる）。最も一般的なＴＡＣＡとしては、Ｔｎ抗原（構造Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を有する単糖）、ＴＦ抗原（トムゼン－フリーデンライヒ抗原、構造Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃα１を有する二糖）、およびそれらそれぞれの同源のシアル化類似体が挙げられる。数種のタイプの腫瘍細胞の細胞表面上におけるＴｎ抗原とＴＦ抗原両方の過剰発現は、がん細胞接着およびレクチン受容体を含有する部位（肺、肝臓、リンパ節など）への重篤な転移に寄与する。したがって、一部の実施態様において、本明細書に記載されるＴＡＣＡは、Ｔｎ抗原、ＳＴｎ抗原、トムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、（２，３）－Ｓ－ＴＦ、（２，６）－Ｓ－ＴＦ、グロボＨ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ－グリコリル－ＧＭ３、Ｌｅａ、ｓＬｅａ、Ｌｅｘ、ｓＬｅｘ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む。図１に、一部の共通のＴＡＣＡの構造を示す。本明細書で使用される場合、表現「由来（～から）」は、炭水化物抗原に関して使用される場合、公知の炭水化物抗原から誘導された炭水化物バリアントを指し、この場合、バリアントは、少なくとも公知の炭水化物抗原の抗原性を保持する。当業者にとって、アルケニル末端を有するＴＡＣＡの合成は、Danishefskyら、2015に記載されたように、化学的なプロセスに加えて化学酵素的なプロセスの両方によって実行することができる。
一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、これらに限定されないが、細菌および／もしくはウイルスなどの感染因子に関連する炭水化物抗原、またはこれらに限定されないが、細菌感染および／もしくはウイルス感染などの感染に関連する炭水化物抗原であってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、例えば、ウイルス多糖抗原、または細菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）であってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。一部の実施態様において、細菌ＣＰＳは、肺炎球菌および／または連鎖球菌多糖体の血清型、髄膜炎菌ＣＰＳ、またはインフルエンザ（例えばインフルエンザａ型およびｂ型）ＣＰＳであるか、それ由来であるか、またはそれを含む。
一部の実施態様において、本明細書に記載されるコンジュゲーション方法は、同じまたは１つより多くのタイプの炭水化物抗原を担体タンパク質にコンジュゲートでき、それによって、多価グリココンジュゲート免疫原を生産することができる。一部の実施態様において、本明細書に記載される多価グリココンジュゲート免疫原は、担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される多価グリココンジュゲート免疫原は、担体タンパク質上の単一の遊離チオール基にコンジュゲートされている（例えば、分岐状リンカーを介して）１種より多くの炭水化物抗原を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される多価グリココンジュゲート免疫原は、デンドリマーとして（例えば、多数の分岐を有するリンカーを介して）、担体タンパク質上の単一の遊離チオール基にコンジュゲートされている複数の（例えば、少なくとも３、４、５、６、７８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの）炭水化物抗原を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質は、１個またはそれより多くの遊離チオール基を含む。「遊離チオール」または「遊離チオール基」は、本明細書で使用される場合、化学修飾および／またはコンジュゲーション（例えば、本明細書に記載される炭水化物抗原に対する）に利用可能な１つまたはそれより多くのスルフヒドリル基を有する担体タンパク質を指す。一部の実施態様において、所与の担体タンパク質の遊離チオール濃度は、例えば、本発明の実施例に記載されたようにシステイン標準曲線を使用するエルマン試験を使用して測定することができる。所与の担体タンパク質の遊離チオール濃度は、遊離チオール濃度の低減倍率として表す場合がある。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲートは、本明細書に記載されるコンジュゲーション方法の後、遊離チオール濃度の少なくとも５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、または２分の１に減少し得る（例えば、エルマン試験によって測定される場合）。
一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質は、例えば、担体タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、またはそれらの間のあらゆる溶媒接近可能な位置に、１個またはそれより多くのさらなるシステイン残基が付加されるように操作されていてもよい（溶媒接近可能ではないか、またはタンパク質担体の３次元構造内に「埋め込まれた」位置とは対照的に）。一部の実施態様において、本明細書に記載されるタンパク質担体の遊離チオール基は、反応が、担体タンパク質の免疫原性、構造、または活性を破壊しない程度に穏やかな条件下で実行される場合、光触媒性チオール－エン反応によってアルケニル炭水化物抗原に容易にコンジュゲート可能なシステインと定義することもできる。一部の実施態様において、用語「活性」は、本明細書において担体タンパク質に関して使用される場合、炭水化物抗原の免疫原性（例えば、炭水化物抗原に特異的に結合することがわかっている抗体に対する）を保存する担体タンパク質の能力を指す。
一部の実施態様において、遊離チオール基は、担体タンパク質の１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基、および／またはジスルフィド架橋に関与しないシステインを指す場合もあり、これらは、一部の場合において、担体タンパク質の構造を維持するために重要な場合もある。一部の実施態様において、担体タンパク質は、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であってもよく、その場合、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋は、炭水化物抗原へのコンジュゲーションの後、影響を受けないままである（すなわち、無傷である）。一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質は、それらのＮおよび／またはＣ末端に遊離チオール基を含まない。代替として、一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質は、そのＮおよび／またはＣ末端に、遊離チオール基を含んでいてもよいし、またはそれを含むように操作されていてもよい。一部の実施態様において、担体タンパク質は、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であってもよく、担体タンパク質を、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ）で前処理して、炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させる。このような前処理は、例えば、変性した（還元された）担体タンパク質が、対象において、天然の（還元されていない）担体タンパク質より高い免疫原性を有する場合有用であり得る。
一部の実施態様において、担体タンパク質は、光触媒性チオール－エン反応を実行する前に、または実行と共に、還元剤（例えば、本明細書に記載される）で前処理されてもよい。この前処理は、コンジュゲーションに利用可能な追加の遊離チオール基を露出させることができる。一部の実施態様において、担体タンパク質は、光触媒性チオール－エン反応を実行する前に、または実行と共に、チオール化剤（例えば、２－イミノチオラン（imminothiolane）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドジチオプロピオネート（ＤＰＳ））で前処理されてもよい。この前処理は、コンジュゲーションに利用可能な遊離チオール基の数を増加させるのに採用することができる。一部の実施態様において、担体タンパク質は、光触媒性チオール－エン反応を実行する前に、または実行と共に、チオール化剤で前処理され、その後、還元剤で前処理されてもよい。
一部の実施態様において、担体タンパク質上の隣接する位置にコンジュゲートした複数の炭水化物抗原が多くなりすぎないようにすることが有利な場合がある。一部の実施態様において、担体タンパク質は、好ましくは、システインリッチドメイン（例えば、少なくとも５０％のシステイン残基を含む、少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０個の連続したアミノ酸のセグメント）を欠如していてもよい。
一部の実施態様において、担体タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の総システイン残基を含んでいてもよい。一部の実施態様において、担体タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の総遊離システイン残基を含んでいてもよい。
一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数は、コンジュゲーション前の担体タンパク質上の利用可能な遊離チオール基の数に等しい。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、担体タンパク質１個当たり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の炭水化物抗原を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本発明の記載は、炭水化物コンジュゲーション種に関して、約または少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の均一性を有する（例えば、組成物中のグリココンジュゲート免疫原種／分子の少なくとも９０％が、同じ数の、担体タンパク質にコンジュゲートした炭水化物抗原を有する）、グリココンジュゲート免疫原を含む組成物に関する。
一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質は、好ましくは、グリココンジュゲート免疫原が投与されることになる対象に対して免疫原性であるタンパク質（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）である。好ましくは、炭水化物抗原の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与（すなわち、対象に単独で投与される炭水化物抗原）と比較した場合、対象に投与されるときの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる。
一部の実施態様において、担体タンパク質は、Ｔ細胞エピトープを含んでいてもよいし、および／または投与のときに対象において細胞媒介性免疫応答を誘導することができる。
一部の実施態様において、担体タンパク質は、投与されることになる対象にとって外因性であるタンパク質であり、好ましくは、対象において（近接した）オーソログがない上記タンパク質である。ヒトワクチン生産の状況において、本明細書に記載される担体タンパク質は、「ヒトでの使用に好適な担体タンパク質」または単に「好適な担体タンパク質」を指し、これは、担体タンパク質がヒトにおいて「自己抗原」と認識されないように、ヒトタンパク質とは抗原的に異なる担体タンパク質を意味する。対応するヒトタンパク質に抗原的に類似しすぎている担体タンパク質の使用は、担体タンパク質が「自己抗原」と認識されることを引き起こす可能性があり、これは、ヒトワクチンにおいて理想的ではない場合がある。これまでに、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のリシン残基のε－アミノ基にランダムにコンジュゲートしたＴＦ抗原からなるグリココンジュゲート免疫原が記載され、特徴付けられている（例えば、Demianら、2014；Rittenhouse-Diakunら、1998；Heimburgら、2006；Tatiら、2017）。しかしながら、ＢＳＡの５９個のリシン残基における炭水化物のレベルがランダムで非効率的であるだけでなく（ＢＳＡ分子１個当たり４～６個以下のＴＦ抗原がコンジュゲートされた）、ＢＳＡは、ヒトアルブミンに抗原的に類似しすぎているため、ヒトワクチンにおける担体タンパク質として好適ではないと予想される。一部の実施態様において、担体タンパク質は、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）ではない。
好ましくは、本明細書に記載される担体タンパク質は、すでにヒト対象への投与（例えば、承認されたワクチン）に関して規制当局（例えば、ＦＤＡ）の承認を受けたタンパク質であり得る。一部の実施態様において、担体タンパク質は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌のプロテインＤ（ＨｉＤ）、サイトカイン、またはそれらの免疫原性フラグメント（またはバリアント）であるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む。
一部の実施態様において、担体タンパク質は、１０個のシステイン残基を含有するＴＴであってもよく、これらのシステイン残基のうち４個はジスルフィド架橋に組み込まれ、６個のコンジュゲートした炭水化物抗原を有するグリココンジュゲート免疫原を生じさせる。一部の実施態様において、担体タンパク質は、４個のシステイン残基を含有するＣＲＭ１９７であってもよく、４個のコンジュゲートした炭水化物抗原を有するグリココンジュゲート免疫原を生じさせる。
一部の実施態様において、担体タンパク質は、炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために追加の遊離チオール基を導入するために、追加のシステイン残基が導入されるように操作することができる。一部の実施態様において、システイン残基は、担体タンパク質の溶媒に露出した部分において操作することができる。
一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲートワクチンまたは免疫応答を引き起こす組成物を生産するための方法に関する。本方法は、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを用いて製剤化することを含んでいてもよい。一部の実施態様において、アジュバントは、無機化合物、鉱油、微生物誘導体、植物誘導体、サイトカイン、スクアレン、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、免疫刺激ポリヌクレオチド（例えば、ＣＰＧ）、免疫刺激脂質、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＱＳ－２１、ムラミルジペプチド、ＴｉｔｅｒＭａｘ（商標）、Ｓｔｅｖｉｕｎｅ（商標）、Ｓｔｉｍｕｎｅ（商標）、もしくはそれらのあらゆる組合せであるか、またはそれを含む。
一部の形態において、本発明の記載は、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原および１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基を有する免疫原性担体タンパク質を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基において、免疫原性担体タンパク質に連結されている、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性担体タンパク質へのコンジュゲーションは、対象に投与されると、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる。用語「合成」は、本明細書において使用される場合、ヒトの介入によって生産される、天然産物ではない化合物を指す。
一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、同じ担体タンパク質にコンジュゲートした、１つより多くの種の炭水化物抗原（例えば、１つより多くのタイプのＴＡＣＡ）を含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれより多くのタイプまたは種の炭水化物抗原（例えば、ＴＡＣＡ）を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、Ｔｎ、Ｓ－Ｔｎ、トムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）－Ｓ－ＴＦ、（２，６）－Ｓ－ＴＦ、グロボＨ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ－グリコリル－ＧＭ３、Ｌｅａ、ｓＬｅａ、Ｌｅｘ、およびｓＬｅｘから選択されるＴＡＣＡのあらゆる組合せを含んでいてもよい。一部の実施態様において、各ＴＡＣＡの組合せにおける比率は、標的化される腫瘍に応じて様々であってもよく、１～２０のモル比を含んでいてもよい。このようにして、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、例えば、複数のＴＡＣＡの特定の組合せの発現の増加に関連するがんの具体的な形態に、適合させることができる。
一部の形態において、本発明の記載は、本明細書に記載される方法によって生産されるグリココンジュゲートワクチン、および／または本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原を含み、さらに、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを含むグリココンジュゲートワクチンに関する。用語「ワクチン」は、本明細書で使用される場合、対象に治療上の利益を提供するために対象に投与される、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原を含む組成物を指す。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲートワクチンは、予防ワクチンまたは治療ワクチンであり得る。
ワクチン組成物は、レシピエント動物の年齢、性別、体重、種および状態、ならびに投与経路のような要因を考慮して、医療または獣医学分野における当業者に周知の投薬量および技術によって投与することができる。投与経路は、経皮で、粘膜投与（例えば、口腔、鼻、眼）を介して、または非経口経路（例えば、皮内、筋肉内、皮下）を介してなされ得る。ワクチン組成物は、単独で投与してもよいし、または他の処置または療法と共投与もしくは逐次的に投与してもよい。投与の形態としては、非経口、皮下、皮内または筋肉内投与（例えば、注射投与）のための懸濁液および調製物、例えば滅菌懸濁液またはエマルジョンを挙げることができる。ワクチンは、スプレーとして投与してもよいし、または食物および／または水中に混合されてもよいし、または好適な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理的食塩水、グルコースなどと混和して送達してもよい。組成物は、望ましい投与経路および調製物に応じて、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化または粘度を強化する添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、色素などの補助剤を含有していてもよい。余計な実験を行わずに好適な調製物を調製するために、標準的な製薬に関する教本、例えば「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、1990を参照することができる。
一部の形態において、本発明の記載は、対象を免疫化する、対象にワクチン接種する、または対象を処置する方法であって、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原またはグリココンジュゲートワクチンを対象に投与することを含む、上記方法に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、スルフヒドリル特異的な（チオール特異的な）官能基に連結されるように化学修飾された炭水化物抗原に関する。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、末端アルケンに連結されるように（例えば、グリコシド結合を介して）化学修飾されており、この場合、末端アルケン基は、チオール－エン反応を介して担体タンパク質の遊離チオールにコンジュゲート可能である。一部の実施態様において、炭水化物抗原および末端アルケン基は、本明細書に記載されるリンカーを介して連結されている。一部の実施態様において、末端アルケン基は、ビニル基またはアリル基であり得る。
一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：
一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：
一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
－ Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨ２であり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＣＨ３、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１、２、３、４または５であり；
－ Ｒ５は、Ｓ－ＰＣ、共有結合または構造：
式中、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１、２、３、４または５である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１または２である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１または２である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の実施態様において、本発明の記載は、ｙが、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、または１から１０、１から５、または１から２の範囲の整数である、上述した合成グリココンジュゲート免疫原に関する。
一部の実施態様において、糖抗原は、本明細書に記載される炭水化物抗原であってもよく、および／または担体タンパク質は、本明細書に記載される担体タンパク質であってもよい。一部の実施態様において、合成グリココンジュゲート免疫原は、多価グリココンジュゲート免疫原であってもよく、例えば、担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含む、多価グリココンジュゲート免疫原であってもよい。一部の実施態様において、グリココンジュゲート免疫原は、対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導することができる。
一部の形態において、本発明の記載は、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバント（例えば、本明細書に記載されるようなアジュバント）を含むワクチンに関する。
一部の形態において、本発明の記載は、ワクチンの製造のための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原の使用に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、前記１つまたはそれより多くの炭水化物または糖抗原の発現の増加に関連する疾患を有する対象を処置するための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載されるワクチンの使用に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体を生産するための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載されるワクチンの使用に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体を検出するための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載されるワクチンの使用に関する。
一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲートを生産するための方法であって、（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、末端アルケンは、チオール－エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；（ｂ）本明細書に記載されるチオール－エン反応を介した炭水化物抗原へのコンジュゲーションに好適なコンジュゲート材料を提供する工程であって、前記コンジュゲート材料は、１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する、工程；および（ｃ）光触媒性チオール－エン反応を実行して、炭水化物抗原を、１個またはそれより多くの遊離チオール基においてコンジュゲート材料に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲートを生産する工程を含む、上記方法に関する。一部の実施態様において、コンジュゲート材料は、ポリマー、ポリペプチド、本明細書において定義される担体タンパク質、固体支持体、粒子、または本明細書に記載されるチオール－エン反応を介して炭水化物抗原へのコンジュゲーションに好適な遊離チオール基を有する他のあらゆる材料であるか、またはそれを含む。
一部の形態において、本発明の記載は、炭水化物抗原または炭水化物抗原を含む腫瘍循環細胞に特異的に結合する抗体の存在を検出またはスクリーニングするための、または炭水化物抗原での免疫化またはワクチン接種の結果生じる抗体の存在を検出するための、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートの使用に関する。一部の実施態様において、検出またはスクリーニングは、あらゆる好適な検出方法、例えば免疫吸着測定法、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、または免疫ブロット分析を介して実行されてもよい。
一部の形態において、本発明の記載は、対象を処置する方法であって、本明細書において定義された、または本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートまたはグリココンジュゲート免疫原を投与して、炭水化物抗原に対する前記対象における免疫応答を生じさせること、および前記対象からの生物学的サンプルを、炭水化物抗原に特異的に結合する抗体の存在に関してスクリーニングすることを含む、上記方法に関する。
本発明の記載の他の目的、利点および特徴は、添付の図面を参照しながら、単なる例として例示された以下に示すそれらの具体的な実施態様の非制限的な記載を読むことでより明らかになると予想される。
項目
１．対象への投与のためのグリココンジュゲート免疫原を生産するための方法であって、（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、末端アルケンは、チオール－エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；（ｂ）１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する担体タンパク質を提供する工程；および（ｃ）光触媒性チオール－エン反応を実行して、１個またはそれより多くの遊離チオール基において、炭水化物抗原を担体タンパク質に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲート免疫原を生産する工程を含み、担体タンパク質は、対象に対して免疫原性であり、炭水化物抗原の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、対象に投与されるときの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記方法。
１．対象への投与のためのグリココンジュゲート免疫原を生産するための方法であって、（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、末端アルケンは、チオール－エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；（ｂ）１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する担体タンパク質を提供する工程；および（ｃ）光触媒性チオール－エン反応を実行して、１個またはそれより多くの遊離チオール基において、炭水化物抗原を担体タンパク質に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲート免疫原を生産する工程を含み、担体タンパク質は、対象に対して免疫原性であり、炭水化物抗原の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、対象に投与されるときの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記方法。
２．アルケニル炭水化物抗原が、水溶性である、項目１に記載の方法。
３．前記光触媒性チオール－エン反応が、担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を保持する反応条件下で実行される、項目１または２に記載の方法。
４．前記光触媒性チオール－エン反応が、いずれの有機溶媒の非存在下で実行される、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
５．前記光触媒性チオール－エン反応が、触媒の存在下で実行される、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
６．触媒が、水溶性触媒である、項目５に記載の方法。
７．前記光触媒性チオール－エン反応が、短波紫外光下での放射線照射を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．前記光触媒性チオール－エン反応が、約２５４ｎｍでの放射線照射を含む、項目７に記載の方法。
９．前記光触媒性チオール－エン反応が、長波紫外光下での放射線照射を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
１０．前記光触媒性チオール－エン反応が、約３６５ｎｍでの放射線照射を含む、項目９に記載の方法。
１１．前記光触媒性チオール－エン反応が、担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たり１～１０モル当量のアルケニル炭水化物抗原を反応させることを含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．前記光触媒性チオール－エン反応が、約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０から、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０までの間のｐＨで実行される、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．前記炭水化物抗原が、担体タンパク質へのコンジュゲーションの後、対象の内因性酵素によって担体タンパク質から切断可能ではない、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．前記アルケニル炭水化物抗原が、末端アルケンに共有結合で連結されているか、および／または炭水化物抗原が、グリコシド結合を介して、例えば、Ｏ－グリコシド結合、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合、または例えばアリルアミンと還元糖との間での還元的アミノ化により得られた結合を介して、担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．炭水化物抗原が、Ｂ細胞エピトープを含むか、および／または対象において体液性免疫応答を誘導する、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．炭水化物抗原が、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）であるか、またはそれを含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．ＴＡＣＡが、Ｔｎ、Ｓ－Ｔｎ、トムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）－Ｓ－ＴＦ、（２，６）－Ｓ－ＴＦ、グロボＨ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、またはそれらのあらゆる組合せであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む、項目１６に記載の方法。
１８．前記光触媒性チオール－エン反応が、１つより多くのタイプの炭水化物抗原を、担体タンパク質にコンジュゲートさせることによって、多価グリココンジュゲート免疫原を生産する、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．前記多価グリココンジュゲート免疫原が、担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれより多くの異なるタイプの炭水化物抗原を含む、項目１８に記載の方法。
２０．炭水化物抗原が、ウイルス多糖抗原、または細菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）であるか、またはそれを含む、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．細菌ＣＰＳが、肺炎球菌および／または連鎖球菌多糖体の血清型であるか、それ由来であるか、またはそれを含む、項目２０に記載の方法。
２２．（ａ）における炭水化物抗原が、リンカーを介して、末端アルケンに連結されている、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．担体タンパク質が、１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する１個またはそれより多くのシステイン残基を含む、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
２４．担体タンパク質が、ヒトＴ細胞エピトープを含むか、および／または対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
２５．担体タンパク質が、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌のプロテインＤ（ＨｉＤ）、サイトカイン、またはそれらの免疫原性フラグメントであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む、項目１～２４のいずれか一項に記載の方法。
２６．担体タンパク質が、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、（ｉ）１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋が、前記光触媒性チオール－エン反応の後、影響を受けないままであり；または（ｉｉ）担体タンパク質を還元剤で前処理して、炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させる、項目１～２５のいずれか一項に記載の方法。
２７．グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数が、コンジュゲーション前の担体タンパク質上の利用可能な遊離チオール基の数に等しい、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．グリココンジュゲート免疫原が、対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、項目１～２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．（ｄ）グリココンジュゲート免疫原を精製する工程をさらに含む、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法。
３０．グリココンジュゲートワクチンを生産するための方法であって、項目１～２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを用いて製剤化することを含む、上記方法。
３１．アジュバントが、無機化合物、鉱油、微生物誘導体、植物誘導体、サイトカイン、スクアレン、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、免疫刺激ポリヌクレオチド、免疫刺激脂質、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＱＳ－２１、ムラミルジペプチド、もしくはそれらのあらゆる組合せであるか、またはそれを含む、項目３０に記載の方法。
３２．１つまたはそれより多くの炭水化物抗原および１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基を有する免疫原性担体タンパク質を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基において、免疫原性担体タンパク質に連結されており、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性担体タンパク質へのコンジュゲーションは、対象に投与されると、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
３３．１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、リンカーを介して、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基に連結されている、項目３２に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
３４．１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、項目１３または１４で定義された結合を介して、リンカーに連結されている、項目３２に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
３５．１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、項目２、１５、１６、１７、２０、または２１で定義された通りである、項目３２～３４のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
３６．項目１８または１９で定義された多価グリココンジュゲート免疫原である、項目３２～３５のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
３７．担体タンパク質が、項目２３、２４、２５、または２６で定義された通りである、項目３２～３６のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
３８．グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数が、担体タンパク質における溶媒接近可能なシステイン残基の数に等しい、項目３２～３７のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
３９．対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、項目３２～３８のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
４０．項目１～２９のいずれか一項に記載の方法によって調製される、項目３２～３９のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
４１．項目３０または３１に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、ならびに／または項目３２～４０のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを含むグリココンジュゲートワクチン。
４２．予防ワクチンまたは治療ワクチンである、項目４１に記載のグリココンジュゲートワクチン。
４３．対象を免疫化する、対象にワクチン接種する、または対象を処置する方法であって、項目１～２９のいずれか一項に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲート免疫原、項目３０または３１に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、項目３２～４０のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、または項目４１または４２に記載のグリココンジュゲートワクチンを対象に投与することを含む、上記方法。
４４．疾患を有する対象を免疫化すること、対象にワクチン接種をすること、または対象を処置することにおいて使用するための、項目３２～４０のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、または項目４１または４２に記載のグリココンジュゲートワクチン。
４５．担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：
－ ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；
－ ＰＣは、担体タンパク質であり；
－ Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨ２であり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＣＨ３、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅである）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
４６．担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：
－ ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；
－ ＰＣは、担体タンパク質であり；
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－を形成し、ｍは、１である）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
４７．前記糖抗原が、項目１５、１６、１７、２０、または２１で定義された炭水化物抗原である、項目４５または４６に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
４８．前記担体タンパク質が、項目２３、２４、または２５で定義された担体タンパク質である、項目４５～４７のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
４９．多価グリココンジュゲート免疫原である、項目４５～４９のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
５０．前記多価グリココンジュゲート免疫原が、担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれより多くの異なるタイプの炭水化物抗原を含む、項目４９に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
５１．グリココンジュゲート免疫原が、対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、項目４５～５０のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
５２．項目４５～５１のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含むワクチン。
５３．アジュバントが、項目３１で定義された通りである、項目５２に記載のワクチン。
５４．ワクチンの製造のための、項目１～２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、または項目３２～４０および４５～５１のいずれか１つで定義された合成グリココンジュゲート免疫原の使用。
５５．前記１つまたはそれより多くの炭水化物または糖抗原の発現の増加に関連する疾患を有する対象を処置するための、項目１～２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、項目３０または３１に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、項目３２～４０および４５～５１のいずれか１つで定義された合成グリココンジュゲート免疫原、または項目５２または５３に記載のワクチンの使用。
実施例１：一般的な方法
反応を、商業的に入手可能なＨＰＬＣグレードを使用したアルゴン雰囲気下で行った。商業的に入手可能な試薬（シグマ・アルドリッチ（Sigma Aldrich））をそれ以上精製せずに使用した。Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンおよびＮ－アセチルノイラミン酸は、ローズサイエンティフィック社（Rose Scientific Ltd.）、アルバータ州、カナダから提供された。Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－Ｗａｎｇ樹脂およびＦｍｏｃアミノ酸は、ペプチドテクノロジー社（Peptide Technologies Ltd）、ピエールフォン、Ｑｃ、カナダから商業的に入手可能であった。反応の進行を、シリカゲル６０Ｆ２５４でコーティングされたプレート（Ｅ．メルク（E. Merck））を使用した薄層クロマトグラフィーによってモニターした。クリックチオール－エン光化学反応によるコンジュゲーションを、２つの手持ち式のＵＶ３６５ｎｍランプ（ＵＶ－ＡＣハンドランプ、デュアル２５４／３６５ｎｍ ＵＶ；１１５Ｖ～６０Ｈｚ、０．１６ａｍｐ、ＶＷＲカナダ（VWR Canada）、カタログ番号８９１３１－４９２）の間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー・サイエンティフィック・カナダ（Fisher Scientific Canada）、カタログ番号１４－９５８－１３０）中で行った。フラッシュクロマトグラフィーを、カナダのライフサイエンス（Life Science）からのＺＥＯｐｒｅｐ（商標）シリカゲル６０（４０～６３μｍ）を使用して実行した。検出を、紫外線下で、または２０％エタノールを含む硫酸またはモリブデン酸塩またはＫＭｎＯ４溶液と共にスプレーし、続いて加熱することによって行った。ＮＭＲスペクトルを、ブルカー（Bruker）のＵＬＴＲＡＳＨＩＥＬＤ（商標）３００ＭＨｚおよびブルカーのＡｖａｎｃｅ（商標）ＩＩＩ ＨＤ ６００ＭＨｚ分光計で記録した。プロトンおよび炭素の化学シフト（ｄ）は、７．２６ｐｐｍ（１Ｈ）および７７．１６ｐｐｍ（１３Ｃ）で設定された残留ＣＨＣｌ３の化学シフトに対するｐｐｍで報告される。結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）で報告され、ピーク多重度に関しては以下の略語が使用される：一重項（ｓ）、二重項（ｄ）、二重項の二重項（ｄｄ）、等しい結合定数を有する二重項の二重項（ｔａｐ）、三重項（ｔ）、多重項（ｍ）。分析および割り当てを、ＣＯＳＹ（相関分光法）およびＨＳＱＣ（異核単一量子干渉）実験を使用して行った。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を、アジレント・テクノロジーズ（Agilent technologies）からのＬＣ－ＭＳ－ＴＯＦ（高速液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析）機器を用いて、ＵＱＡＭの分析プラットフォームによってポジティブおよび／またはネガティブエレクトロスプレーモードで測定した。実験式の確認のために、プロトン化イオン（Ｍ＋Ｈ）＋またはナトリウム付加物（Ｍ＋Ｎａ）＋のいずれかを使用した。天然のＴＴおよびＴＴ－コンジュゲートを、２０００ＫＤａのベンゾイル化透析チューブ（シグマ－アルドリッチ（Sigma-Aldrich）（オンタリオ州、カナダ）を使用して透析した。天然の、およびコンジュゲートしたＴＴの両方のチオール含量を、４１２ｎｍでのエルマン試験によって決定した（Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959、82、70～77）。ＴＴ－コンジュゲートの全糖含量を、ＵＶ／ＶＩＳウルトロスペック（Ultrospec）１００プロット分光光度計（バイオクロム（Biochrom）、米国）を使用して４９２ｎｍで測定された比色ＤｕＢｏｉｓ試験によって決定した（Dubois, M.； Gilles, K. A.；Hamilton, J. K.； Rebers, P. A.；Smith, F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Anal. Chem.、1956、28、350～356）。動的光散乱（ＤＬＳ）、粒度分布を、マルバーン（Malvern）からのゼータサイザーナノ（Zetasizer Nano）Ｓ９０を使用して、ＰＢＳ中で測定した。マウスモノクローナルＩｇＧ３抗体ＪＡＡ－Ｆ１１を、これまでにRittenhouse-Diakunら、1998に記載されたようにして生産された。
反応を、商業的に入手可能なＨＰＬＣグレードを使用したアルゴン雰囲気下で行った。商業的に入手可能な試薬（シグマ・アルドリッチ（Sigma Aldrich））をそれ以上精製せずに使用した。Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンおよびＮ－アセチルノイラミン酸は、ローズサイエンティフィック社（Rose Scientific Ltd.）、アルバータ州、カナダから提供された。Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－Ｗａｎｇ樹脂およびＦｍｏｃアミノ酸は、ペプチドテクノロジー社（Peptide Technologies Ltd）、ピエールフォン、Ｑｃ、カナダから商業的に入手可能であった。反応の進行を、シリカゲル６０Ｆ２５４でコーティングされたプレート（Ｅ．メルク（E. Merck））を使用した薄層クロマトグラフィーによってモニターした。クリックチオール－エン光化学反応によるコンジュゲーションを、２つの手持ち式のＵＶ３６５ｎｍランプ（ＵＶ－ＡＣハンドランプ、デュアル２５４／３６５ｎｍ ＵＶ；１１５Ｖ～６０Ｈｚ、０．１６ａｍｐ、ＶＷＲカナダ（VWR Canada）、カタログ番号８９１３１－４９２）の間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー・サイエンティフィック・カナダ（Fisher Scientific Canada）、カタログ番号１４－９５８－１３０）中で行った。フラッシュクロマトグラフィーを、カナダのライフサイエンス（Life Science）からのＺＥＯｐｒｅｐ（商標）シリカゲル６０（４０～６３μｍ）を使用して実行した。検出を、紫外線下で、または２０％エタノールを含む硫酸またはモリブデン酸塩またはＫＭｎＯ４溶液と共にスプレーし、続いて加熱することによって行った。ＮＭＲスペクトルを、ブルカー（Bruker）のＵＬＴＲＡＳＨＩＥＬＤ（商標）３００ＭＨｚおよびブルカーのＡｖａｎｃｅ（商標）ＩＩＩ ＨＤ ６００ＭＨｚ分光計で記録した。プロトンおよび炭素の化学シフト（ｄ）は、７．２６ｐｐｍ（１Ｈ）および７７．１６ｐｐｍ（１３Ｃ）で設定された残留ＣＨＣｌ３の化学シフトに対するｐｐｍで報告される。結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）で報告され、ピーク多重度に関しては以下の略語が使用される：一重項（ｓ）、二重項（ｄ）、二重項の二重項（ｄｄ）、等しい結合定数を有する二重項の二重項（ｔａｐ）、三重項（ｔ）、多重項（ｍ）。分析および割り当てを、ＣＯＳＹ（相関分光法）およびＨＳＱＣ（異核単一量子干渉）実験を使用して行った。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を、アジレント・テクノロジーズ（Agilent technologies）からのＬＣ－ＭＳ－ＴＯＦ（高速液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析）機器を用いて、ＵＱＡＭの分析プラットフォームによってポジティブおよび／またはネガティブエレクトロスプレーモードで測定した。実験式の確認のために、プロトン化イオン（Ｍ＋Ｈ）＋またはナトリウム付加物（Ｍ＋Ｎａ）＋のいずれかを使用した。天然のＴＴおよびＴＴ－コンジュゲートを、２０００ＫＤａのベンゾイル化透析チューブ（シグマ－アルドリッチ（Sigma-Aldrich）（オンタリオ州、カナダ）を使用して透析した。天然の、およびコンジュゲートしたＴＴの両方のチオール含量を、４１２ｎｍでのエルマン試験によって決定した（Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959、82、70～77）。ＴＴ－コンジュゲートの全糖含量を、ＵＶ／ＶＩＳウルトロスペック（Ultrospec）１００プロット分光光度計（バイオクロム（Biochrom）、米国）を使用して４９２ｎｍで測定された比色ＤｕＢｏｉｓ試験によって決定した（Dubois, M.； Gilles, K. A.；Hamilton, J. K.； Rebers, P. A.；Smith, F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Anal. Chem.、1956、28、350～356）。動的光散乱（ＤＬＳ）、粒度分布を、マルバーン（Malvern）からのゼータサイザーナノ（Zetasizer Nano）Ｓ９０を使用して、ＰＢＳ中で測定した。マウスモノクローナルＩｇＧ３抗体ＪＡＡ－Ｆ１１を、これまでにRittenhouse-Diakunら、1998に記載されたようにして生産された。
■一般的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）手順
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の手順は、文献の手順（Papadopoulosら、2012）に従い、Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－Ｗａｎｇ樹脂（６５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１．０当量；１００～２００メッシュ、ローディング＝０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）から開始した。反応を、１．５×１４ｃｍのＥｃｏｎｏ－Ｐａｃ使い捨てカラム（２０ｍＬ）（バイオ－ラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）、オンタリオ州、カナダ）で回転によるかき混ぜによって実行した。１時間の間に、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２中で膨潤させ、次いでろ過し、１時間の間に、ＤＭＦ中で再度調整した。商業的な樹脂またはアミノ酸のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンの溶液（５ｍＬ、２×５分、次いで１×１０分）を用いて除去した。溶媒および試薬をろ過によって除去し、樹脂を、ＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２およびＭｅＯＨで洗浄した（各溶媒で３回）。遊離アミノ基の存在を、カイザー試験またはＴＮＢＳ試験によって検証した。樹脂上の遊離アミンを、ＤＭＦ中の、予め活性化させたＦｍｏｃアミノ酸：３当量のアミノ酸、３当量のＨＢＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および触媒的な量のＨＯＢｔ（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール）の溶液で４℃で（１０分）処理した。次いでこの混合物にＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルアミン、９当量）を添加し、室温で１時間３０分撹拌した。カップリングの完了は、カイザーまたはＴＮＢＳ比色試験を使用して決定した。ろ過の後、樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ除去手順を再度繰り返した。合成配列の末端に、最後の遊離アミンを、アセチル化（１：１：８のＡｃ２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ、１時間）によってキャッピングした。ろ過の後、溶液を切って、樹脂を真空中で乾燥させ、トリフルオロ酢酸／水／エタンジチオール／トリイソプロピルシラン（triisopropysilane）（９４．０／２．５／２．５／１．０）を使用して切断を３時間行った。得られたペプチドをメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを用いて沈殿させ、遠心分離（２０分、２０００ｒｐｍ、３×）によって樹脂ビーズから単離した。沈殿を空気噴流を用いて慎重に乾燥させた。未精製ペプチドをＨ２Ｏ中に溶解させて、樹脂から分離した。次いで溶液を凍結乾燥して、所望のペプチドを得た。
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の手順は、文献の手順（Papadopoulosら、2012）に従い、Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－Ｗａｎｇ樹脂（６５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１．０当量；１００～２００メッシュ、ローディング＝０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）から開始した。反応を、１．５×１４ｃｍのＥｃｏｎｏ－Ｐａｃ使い捨てカラム（２０ｍＬ）（バイオ－ラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）、オンタリオ州、カナダ）で回転によるかき混ぜによって実行した。１時間の間に、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２中で膨潤させ、次いでろ過し、１時間の間に、ＤＭＦ中で再度調整した。商業的な樹脂またはアミノ酸のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンの溶液（５ｍＬ、２×５分、次いで１×１０分）を用いて除去した。溶媒および試薬をろ過によって除去し、樹脂を、ＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２およびＭｅＯＨで洗浄した（各溶媒で３回）。遊離アミノ基の存在を、カイザー試験またはＴＮＢＳ試験によって検証した。樹脂上の遊離アミンを、ＤＭＦ中の、予め活性化させたＦｍｏｃアミノ酸：３当量のアミノ酸、３当量のＨＢＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および触媒的な量のＨＯＢｔ（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール）の溶液で４℃で（１０分）処理した。次いでこの混合物にＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルアミン、９当量）を添加し、室温で１時間３０分撹拌した。カップリングの完了は、カイザーまたはＴＮＢＳ比色試験を使用して決定した。ろ過の後、樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ除去手順を再度繰り返した。合成配列の末端に、最後の遊離アミンを、アセチル化（１：１：８のＡｃ２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ、１時間）によってキャッピングした。ろ過の後、溶液を切って、樹脂を真空中で乾燥させ、トリフルオロ酢酸／水／エタンジチオール／トリイソプロピルシラン（triisopropysilane）（９４．０／２．５／２．５／１．０）を使用して切断を３時間行った。得られたペプチドをメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを用いて沈殿させ、遠心分離（２０分、２０００ｒｐｍ、３×）によって樹脂ビーズから単離した。沈殿を空気噴流を用いて慎重に乾燥させた。未精製ペプチドをＨ２Ｏ中に溶解させて、樹脂から分離した。次いで溶液を凍結乾燥して、所望のペプチドを得た。
■ｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａ
Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－Ｗａｎｇ樹脂（６５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１．０当量；１００～２００メッシュ、ローディング＝０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）から、所望のペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａを白色の粉末として単離した（６２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１０％）。ESI+-LC-MS：[M+2H]+2 C83H135O24N19Sの計算値、906.9819；実測値、906.9849；CAN/H2O 5～95% 5.42分。
Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－Ｗａｎｇ樹脂（６５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１．０当量；１００～２００メッシュ、ローディング＝０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）から、所望のペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａを白色の粉末として単離した（６２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１０％）。ESI+-LC-MS：[M+2H]+2 C83H135O24N19Sの計算値、906.9819；実測値、906.9849；CAN/H2O 5～95% 5.42分。
■Ｃｙｓ－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａ
Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－Ｗａｎｇ樹脂（６５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１．０当量；１００～２００メッシュ、ローディング＝０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）から、所望のペプチドＣｙｓ－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａを白色の粉末として単離した（６２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１０％）。ESI+-LC-MS：[M+2H]+2 C83H135O24N19Sの計算値、906.9819；実測値、906.9844；CAN/H2O 5～95% 5.32分。
Ｆｍｏｃ－β－Ａｌａ－Ｗａｎｇ樹脂（６５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１．０当量；１００～２００メッシュ、ローディング＝０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）から、所望のペプチドＣｙｓ－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａを白色の粉末として単離した（６２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１０％）。ESI+-LC-MS：[M+2H]+2 C83H135O24N19Sの計算値、906.9819；実測値、906.9844；CAN/H2O 5～95% 5.32分。
実施例２：アリル２－アセトアミド－３，６－ジ－Ｏ－ピバロイル－２－デオキシ－α－Ｄ－グルコピラノシド（化合物２）
実施例３：アリル２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴｎ）
■手順Ｂ
アリル２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシドはまた、文献の手順（Fengら、2004）に従ってＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から直接調製することもできる。アリルアルコール（８ｍＬ）中のＮ－アセチルガラクトサミン（４４２ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、室温でＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（２５０μＬ、２ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、混合物を７０℃で２時間撹拌した。この溶液を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。乾燥粗生成物を最小限のＥｔＯＨ（５ｍＬ）中に溶解させた。所望のアリルＴＮ生成物を、ジイソプロピルエーテル中で沈殿させ、白色の固体として単離した（４１７ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ、８０％）。
アリル２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシドはまた、文献の手順（Fengら、2004）に従ってＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から直接調製することもできる。アリルアルコール（８ｍＬ）中のＮ－アセチルガラクトサミン（４４２ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、室温でＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（２５０μＬ、２ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、混合物を７０℃で２時間撹拌した。この溶液を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。乾燥粗生成物を最小限のＥｔＯＨ（５ｍＬ）中に溶解させた。所望のアリルＴＮ生成物を、ジイソプロピルエーテル中で沈殿させ、白色の固体として単離した（４１７ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ、８０％）。
Ｃ－アリルＧａｌＮＡｃ類似体（図５）［１－（２’－アセトアミド－２’－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル）－２－プロペン］を、文献の手順に従って調製した（Cipollaら、2000：３－（２－アセトアミド－３，４，６－トリ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシル）－１－プロペン（Cuiら、1998）（３７１ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ゼンプレン条件（メタノール中の１Ｍナトリウムメトキシド溶液、５ｍＬ、ｐＨ８～９）下で処理した。この溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を、イオン交換樹脂（アンバーライト（登録商標）ＩＲ１２０、Ｈ＋）に添加することによって中和し、ろ過し、ＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を減圧下で除去した。Ｃ－アリルＴＮをシリカゲルでのクロマトグラフィー（９：１～４：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）によって精製し、続いてＥｔＯＨ中で白色の固体として結晶化させた（２１３ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ、８７％）。Ｒｆ＝０．２８；ＥｔＯＨ ４：１；ｍｐ２３０℃（文献値２１５～２１７℃、ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ）；文献のＮＭＲデータにより：1H NMR (CD3OD, 600 MHz)：δ 5.81 (m, 1H, 1CH2CH=CH2), 5.08 (dd, 1H, Jtrans= 17.2, Jgem = 1.7 Hz, 1CH2CH=CH2), 5.02 (dd, 1H, Jcis = 10.2 Hz, 1CH2CH=CH2), 4.22 (dd, 1H, J = 9.3、5.0 Hz, H-2’), 4.14 (dt, 1H, J = 10.0、5.0 Hz, H-1’), 3.91 (dd, 1H, J = 3.0 Hz, H-4’), 3.82-3.64 (m, 4H, H-3’, H-5’およびH-6’ab), 2.45 (m, 1H, H-1a), 3.17 (m, 1H, H-1b)および1.97 ppm (s, CH3) ；13C NMR (CD3OD, 150 MHz)：δ 173.6 (NHCO), 136.2 (1CH2CH=CH2), 117.1 (1CH2CH=CH2), 72.9 (C-1’), 69.7 (C-4’), 69.5 (C-3’およびC-5’), 61.8 (C-6’), 52.0 (C-2’), 32.4 (1CH2)および22.5 ppm (CH3)。ESI+-LCMS：[M+H]+ C11H20O5Nの計算値、246.1336；実測値、246.1332；CAN/H2O 5～95% 1.4分。
Ｓ－アリルＧａｌＮＡｃ類似体（図５）を文献：Knappら、2002に従って調製した。
実施例４：アリル２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（化合物４）
実施例５：アリル（２，３，４，６－テトラ－Ｏ－ベンゾイル－β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－４，６－Ｏ－ベンジリデン－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（化合物６）
実施例６：アリル（β－Ｄ－ガラクトピラノシル）－（１→３）－２－アセトアミド－２－デオキシ－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（アリルＴＦ）
次いで白色の固体である中間体を、１０ｍＬの６０％酢酸水溶液中に溶解させ、得られた溶液を６０℃で１．５時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を凍結乾燥して、最終的なアリルＴＦを白色の固体として得た（４２７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、８４％）。ｍｐ＝２３０～２３２℃；Ｒｆ＝０．５３；１１：６：１のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ；図１１Ａおよび１１Ｂ：1H NMR (D2O, 600 MHz)：δ 5.80 (m, 1H, OCH2CH=CH2), 5.19 (dd, 1H, Jtrans = 17.3 Hz, OCH2CH=CH2), 5.09 (dd, 1H, Jcis = 10.4 Hz, OCH2CH=CH2), 4.77 (d, 1H, J1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.29 (d, 1H, J1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.29 (d, 1H, J1,2= 7.8 Hz, H-1II), 4.16 (dd, 1H, J2,3 = 11.2 Hz, J1,2= 3.7 Hz, H-2), 4.08-4.01 (m, 2H, H-4およびOCH2), 3.92-3.82 (m, 3H, H-3, H-5およびOCH2), 3.73 (dd, 1H, H-4II), 3.63-3.52 (m, 4H, H-6a,bおよびH-6’a,b), 3.47 (m, 2H, H-3IIおよびH-5II), 3.39 (dd, 1H, J2’,3’= 10.0 Hz, J1’,2’ = 7.7 Hz, H-2II)および1.85 ppm (s, 3H, CH3) ；13C NMR (150 MHz, CDC13)：δ 174.6 (NHCO), 133.7 (OCH2CH=CH2), 117.9 (OCH2CH=CH2), 104.7 (C-1II), 96.4 (C-1), 77.2 (C-3), 75.0 (C-5II), 72.5 (C-3II), 70.7 (C-5), 70.6 (C-2II), 68.8 (C-4), 68.6 (C-4II), 68.4 (OCH2), 61.2 (C-6II), 61.0 (C-6), 48.6 (C-2)および22.0 ppm (CH3)。図１１Ｃおよび１１Ｄ：ESI+-HRMS：[M+Na]+ C17H29O11NNaの計算値、446.1633；実測値、446.1613。
実施例７：破傷風トキソイド単量体の精製
破傷風トキソイド（ＴＴ）単量体を、コンジュゲーション前に、ゲルろ過クロマトグラフィーによって得た。１ミリリットルの４．５ｍｇ／ｍｌタンパク質を含有する液体調製物（改変されたローリータンパク質アッセイによって決定した場合）を、ＰＢＳ（２０ｍＭのＮａＨＰＯ４［ｐＨ７．２］、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で平衡化したスーパーデックス（Superdex）（登録商標）２００Ｐｒｅｐグレード（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス（GE Healthcare Life Sciences）、ウプサラ、スウェーデン）を充填したＸＫ１６－１００カラム上にローディングし、同じ緩衝液で溶出した。２つのピークでカラムから溶出したタンパク質：先に溶出したピークは、オリゴマー化されたトキソイドを含有し、後に溶出したピークは、ＴＴ単量体を含有する１５０，０００のＭｒに対応する。後の（単量体）ピークに対応する画分をプールし、脱イオン水に対して脱塩し、セントリコン（Centricon）（登録商標）プラス－７０遠心フィルターデバイス（３０Ｋ ウルトラセルＰＬ（Ultracel PL）膜；ミリポア（Millipore）、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して濃縮し、次いで凍結乾燥した。
破傷風トキソイド（ＴＴ）単量体を、コンジュゲーション前に、ゲルろ過クロマトグラフィーによって得た。１ミリリットルの４．５ｍｇ／ｍｌタンパク質を含有する液体調製物（改変されたローリータンパク質アッセイによって決定した場合）を、ＰＢＳ（２０ｍＭのＮａＨＰＯ４［ｐＨ７．２］、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で平衡化したスーパーデックス（Superdex）（登録商標）２００Ｐｒｅｐグレード（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス（GE Healthcare Life Sciences）、ウプサラ、スウェーデン）を充填したＸＫ１６－１００カラム上にローディングし、同じ緩衝液で溶出した。２つのピークでカラムから溶出したタンパク質：先に溶出したピークは、オリゴマー化されたトキソイドを含有し、後に溶出したピークは、ＴＴ単量体を含有する１５０，０００のＭｒに対応する。後の（単量体）ピークに対応する画分をプールし、脱イオン水に対して脱塩し、セントリコン（Centricon）（登録商標）プラス－７０遠心フィルターデバイス（３０Ｋ ウルトラセルＰＬ（Ultracel PL）膜；ミリポア（Millipore）、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して濃縮し、次いで凍結乾燥した。
実施例８：Ｔｎ－破傷風トキソイドコンジュゲート（Ｔｎ－ＴＴコンジュゲート）
石英セル中で、５００μＬのＰＢＳ中のアリルＴｎ（０．１５ｍｇ、０．５６μｍｏｌ、１８．０当量）の溶液に、４．７ｍｇ（０．０３μｍｏｌ）の破傷風トキソイドを含有する１．５ｍＬのＰＢＳを添加した。この溶液を、アルゴン雰囲気下で脱気した後、２５４ｎｍで７時間放射線照射した。この溶液を、二重に蒸留した水でのいくつかの洗浄液に対して２４時間透析し、凍結乾燥して、Ｔｎ－ＴＴ－Ａコンジュゲートを白色の固体として得た（２．０ｍｇ、４３％）。手順Ｂ：同じチオール－エンクリック反応下で、アセトニトリル（１００μＬ）中の触媒的な量のＤＭＰＡを、ＰＢＳ中の破傷風トキソイド（２ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、０．０６μｍｏｌ）を含有するアリルＴｎ（３ｍｇ、１０．８μｍｏｌ、１８０．０当量）の溶液に添加した。この溶液を３６５ｎｍで１５分間放射線照射した。次いで溶液を２４時間透析し、凍結乾燥して、Ｔｎ－ＴＴ－Ｂコンジュゲートを白色の固体として得た（５．４ｍｇ、６１％）。
実施例９：ＴＦ－破傷風トキソイドコンジュゲート（ＴＦ－ＴＴコンジュゲート）
石英セル中で、５００μＬのＰＢＳ中のアリルＴＦ（０．２４ｍｇ、０．５６μｍｏｌ、１８．０当量）の溶液に、１．５ｍＬの４．７ｍｇ（０．０３μｍｏｌ）の破傷風トキソイドを含有するＰＢＳを添加した。この溶液を、アルゴン雰囲気下で脱気した後、２５４ｎｍで７時間放射線照射した。次いで溶液を２４時間透析し、凍結乾燥して、ＴＦ－ＴＴ－Ａコンジュゲートを白色の固体として得た（２．１ｍｇ、４５％）。手順Ｂ：同じチオール－エンクリック反応下で、アセトニトリル（１００μＬ）中の触媒的な量のＤＭＰＡを、ＰＢＳ（２ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、０．０６μｍｏｌ）中の破傷風トキソイドを含むアリルＴＦ（５ｍｇ、１０．８μｍｏｌ、１８０．０当量）の溶液に添加した。この溶液を３６５ｎｍで１５分間放射線照射した。次いで溶液を２４時間透析し、凍結乾燥して、ＴＦ－ＴＴ－Ｂコンジュゲートを白色の固体として得た（５．３ｍｇ、６０％）。
実施例１０：Ｔｎ－ＴＴおよびＴＦ－ＴＴコンジュゲートの特徴付け
破傷風トキソイド（ＴＴ）単独およびワクチンコンジュゲート（Ｔｎ－ＴＴ－Ａ；Ｔｎ－ＴＴ－Ｂ；ＴＦ－ＴＴ－Ａ；およびＴＦ－ＴＴ－Ｂ）を、ＳＤＳゲル電気泳動によって、糖含量の存在に関して比色分析（Ｄｕｂｏｉｓ試験）によって、チオール含量に関してエルマン試験によって、動的光散乱（ＤＬＳ）（図１２）によって分析し、さらに、公知のマウスモノクローナル抗体ＪＡＡ－Ｆ１１との反応性を、二重の放射免疫拡散を使用して分析した。ＳＤＳゲル電気泳動の結果から、炭水化物抗原（ＴｎおよびＴＦ）の存在に関して、コンジュゲートのモノマー形態も陽性染色されたことが明らかに示された。比色分析（Ｄｕｂｏｉｓ試験）から、コンジュゲーションの後、炭水化物抗原の存在（１０重量％）、および担体タンパク質上に残留した遊離チオール基がないことが確認された。二重の放射免疫拡散分析から、沈殿のバンドは明らかに、新しいＴＦ－ＴＴコンジュゲートの、抗ＴＦモノクローナル抗体ＪＡＡ－Ｆ１１との交差反応性を示すことが解明され、したがって、ＴＦ－ＴＴコンジュゲート上における免疫原性炭水化物抗原（ＴＦ）の存在が確認され、担体タンパク質（破傷風トキソイド）単独の沈殿バンドは観察されなかった。
破傷風トキソイド（ＴＴ）単独およびワクチンコンジュゲート（Ｔｎ－ＴＴ－Ａ；Ｔｎ－ＴＴ－Ｂ；ＴＦ－ＴＴ－Ａ；およびＴＦ－ＴＴ－Ｂ）を、ＳＤＳゲル電気泳動によって、糖含量の存在に関して比色分析（Ｄｕｂｏｉｓ試験）によって、チオール含量に関してエルマン試験によって、動的光散乱（ＤＬＳ）（図１２）によって分析し、さらに、公知のマウスモノクローナル抗体ＪＡＡ－Ｆ１１との反応性を、二重の放射免疫拡散を使用して分析した。ＳＤＳゲル電気泳動の結果から、炭水化物抗原（ＴｎおよびＴＦ）の存在に関して、コンジュゲートのモノマー形態も陽性染色されたことが明らかに示された。比色分析（Ｄｕｂｏｉｓ試験）から、コンジュゲーションの後、炭水化物抗原の存在（１０重量％）、および担体タンパク質上に残留した遊離チオール基がないことが確認された。二重の放射免疫拡散分析から、沈殿のバンドは明らかに、新しいＴＦ－ＴＴコンジュゲートの、抗ＴＦモノクローナル抗体ＪＡＡ－Ｆ１１との交差反応性を示すことが解明され、したがって、ＴＦ－ＴＴコンジュゲート上における免疫原性炭水化物抗原（ＴＦ）の存在が確認され、担体タンパク質（破傷風トキソイド）単独の沈殿バンドは観察されなかった。
■コンジュゲートのＨＰＬＣ分析
グリココンジュゲート調製物のＨＰＬＣ分析を、サイズ排除クロマトグラフィーによって行った。クロマトグラフ分離は、ＳＢ－８０７Ｇガードカラム（昭和電工株式会社（Showa Denko））を先頭に有する、直列に接続した３つの８×３００ｍｍのＳｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋゲルろ過カラム（２つのＳＢ－８０４および１つのＳＢ－８０３）を用いて実行された。グリココンジュゲート免疫原を、示差屈折計（ＲＩ）検出器モデル２３００および波長２８０ｎｍでのＵＶ検出器モデル２６００を備えたナウアー（Knauer）のスマートライン（Smartline）システムを使用して、０．４ｍＬ／分の流速で、０．１ＭのＮａＮＯ３で溶出させた。コンジュゲート調製物（移動相中、８ｍｇ／ｍＬ溶液）を、５０μΛ注入ループを使用して注入した。選択された実験において、空隙容量で溶出する画分は、コンジュゲート画分に対応し、これをプールし、スペクトラポア（Spectra/Por）；分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、１２，０００～１４，０００［スペクトラムラボラトリーズ（Spectrum Laboratories）］）で水に対して透析し、凍結乾燥した。これは、２：１の分画されたコンジュゲートに相当する。
グリココンジュゲート調製物のＨＰＬＣ分析を、サイズ排除クロマトグラフィーによって行った。クロマトグラフ分離は、ＳＢ－８０７Ｇガードカラム（昭和電工株式会社（Showa Denko））を先頭に有する、直列に接続した３つの８×３００ｍｍのＳｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋゲルろ過カラム（２つのＳＢ－８０４および１つのＳＢ－８０３）を用いて実行された。グリココンジュゲート免疫原を、示差屈折計（ＲＩ）検出器モデル２３００および波長２８０ｎｍでのＵＶ検出器モデル２６００を備えたナウアー（Knauer）のスマートライン（Smartline）システムを使用して、０．４ｍＬ／分の流速で、０．１ＭのＮａＮＯ３で溶出させた。コンジュゲート調製物（移動相中、８ｍｇ／ｍＬ溶液）を、５０μΛ注入ループを使用して注入した。選択された実験において、空隙容量で溶出する画分は、コンジュゲート画分に対応し、これをプールし、スペクトラポア（Spectra/Por）；分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、１２，０００～１４，０００［スペクトラムラボラトリーズ（Spectrum Laboratories）］）で水に対して透析し、凍結乾燥した。これは、２：１の分画されたコンジュゲートに相当する。
実施例１１：ペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａの遊離チオールにおけるチオール－エン光化学反応によるＯ－アリル－糖のコンジュゲーションの作用
ペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａ（破傷風毒素（８３１－８４４）；ＭＷ：１８１３、配列番号２）を、３．７×１０－３Ｍのペプチド濃度で水（５００ｕＬ）に溶解させ、これを、キュベットから２～５ｃｍの距離で、２つの手持ち式のＵＶ３６５ｎｍランプ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、（６ｕＬ、０．１Ｍ、３．０当量の）Ｏ－アリル－ＴｎまたはＯ－アリル－ＴＦおよび水溶性触媒ＡＡＰＨ（２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル、２３ｕＬ、０．０２５Ｍ、３．０当量と共に室温で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにした。この溶液を、０、４５、９０および１３５分でサンプリングし、遊離チオール濃度をシステイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。図１３は、遊離チオール濃度が、光チオール－エン反応の結果として、時間依存性の方式で低減されることを示す。
ペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａ（破傷風毒素（８３１－８４４）；ＭＷ：１８１３、配列番号２）を、３．７×１０－３Ｍのペプチド濃度で水（５００ｕＬ）に溶解させ、これを、キュベットから２～５ｃｍの距離で、２つの手持ち式のＵＶ３６５ｎｍランプ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、（６ｕＬ、０．１Ｍ、３．０当量の）Ｏ－アリル－ＴｎまたはＯ－アリル－ＴＦおよび水溶性触媒ＡＡＰＨ（２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル、２３ｕＬ、０．０２５Ｍ、３．０当量と共に室温で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにした。この溶液を、０、４５、９０および１３５分でサンプリングし、遊離チオール濃度をシステイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。図１３は、遊離チオール濃度が、光チオール－エン反応の結果として、時間依存性の方式で低減されることを示す。
実施例１２：Ｏ－アリル－Ｔｎのコンジュゲーションおよびチオール－エン光反応生成物の免疫反応性に対する、ｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａにおけるシステインの位置決定／接近しやすさ、および採用される活性化剤のタイプの作用
Ｎ末端またはＣ末端にシステインを有するペプチドｄＴＴ８３１－８４４を合成し、２ｍＭ（１ｍＬ）の濃度で水に溶解させ、これを、キュベットから２～５ｃｍの距離で、２つの手持ち式のＵＶ３６５ｎｍランプ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００ｕＬ、０．１Ｍ、１０当量のＯ－アリル－Ｔｎおよび触媒的な量（０．２当量）の活性化剤ＡＡＰＨと共に室温で撹拌した。活性化剤を添加した直後に、ＵＶをオンにし、６０分反応させた。０および６０分の時間に、遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。遊離チオールにおける低減倍率は、ｔ＝０／ｔ＝６０におけるチオール濃度に相当する。
Ｎ末端またはＣ末端にシステインを有するペプチドｄＴＴ８３１－８４４を合成し、２ｍＭ（１ｍＬ）の濃度で水に溶解させ、これを、キュベットから２～５ｃｍの距離で、２つの手持ち式のＵＶ３６５ｎｍランプ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００ｕＬ、０．１Ｍ、１０当量のＯ－アリル－Ｔｎおよび触媒的な量（０．２当量）の活性化剤ＡＡＰＨと共に室温で撹拌した。活性化剤を添加した直後に、ＵＶをオンにし、６０分反応させた。０および６０分の時間に、遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。遊離チオールにおける低減倍率は、ｔ＝０／ｔ＝６０におけるチオール濃度に相当する。
図１４に示される結果は、チオール－エン光化学反応コンジュゲーションにおける、Ｎ末端（「ＳＨ－ペプチド」）またはＣ末端（「ペプチド－ＳＨ」）にシステインを有するｄＴＴ８３１－８４４ペプチドの、水溶性（ＡＡＰＨ）または水不溶性活性化剤（ＤＭＰＡ）のいずれかを使用した、遊離チオール濃度における低減倍率を提示する。
チオール－エン光反応生成物の免疫反応性を酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）によって測定した。１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ中の１μｇのペプチドを、９６－ウェルプレート（マキシソープ（Maxisorp）（商標）、ヌンク（Nunc））に、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（Tween）（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでＰＢＳ－Ｔ＋１％ＢＳＡブロッキング溶液を３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（抗Ｔｎ ＶＶＡ）またはピーナッツ凝集素（抗ＴＦ ＰＮＡ）（ＶＶＡ－ｈｒｐ、ＰＮＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ（EY LAbs））の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（Ultra TMB-ELISA）、サーモ・サイエンティフィック（Thermo Scientific））を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテック（Biotek）ＥＬ８０８）においてプレートをＯＤ４５０ｎｍで読んだ。
図１５に示される結果は、水溶性（ＡＡＰＨ）または水不溶性活性化剤（ＤＭＰＡ）のいずれかを使用した、異なるＴｎ－ペプチド（すなわち、コンジュゲートしていない：「ｐｅｐ－Ｃｙｓ」および「Ｃｙｓ－ｐｅｐ」；Ｔｎ－コンジュゲートした：「Ｔｎ－ｐｅｐ」および「ｐｅｐ－Ｔｎ」；「ｕｎｃ」：コーティングされていないプレート）へのレクチン反応性を提示する。興味深いことに、Ｃ末端システインを有するＴＴペプチドは、抗ＴｎレクチンＶＶＡによって特異的に認識され、コンジュゲーション反応は、水溶性活性化剤ＡＡＰＨを用いた場合に最も有効であった。Ｔｎグリココンジュゲートはどれも、陰性対照として使用された抗ＴＦレクチン（ピーナッツレクチン、ＰＮＡ）によって認識されなかった。
実施例１３：Ｏ－アリル－ＴｎへのペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａのチオール－エン光化学反応によるコンジュゲーションに対する波長の作用
ペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａ（ＭＷ：１８１３、配列番号２）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍまたは３５５ｎｍのいずれか（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、１ｍＬの水中の０．５５ｍＭのＯ－アリル－ＴｎおよびＡＡＰＨ（１．４４ｍｇ、５．５ｎｍｏｌ、１０．０当量）またはＤＭＰＡ（０．３ｍｇ、１．１ｎｍｏｌ、２．０当量）と共に室温で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにし、６０分後にオフにして反応を止めた。またペプチドを、活性化剤の非存在下で、ＵＶ２５４ｎｍでも、Ｏ－アリル－Ｔｎにコンジュゲートした。遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。図１６は、３つの異なるコンジュゲーション条件（「３５５ｎｍ＋ＡＡＰＨ」；「３６５ｎｍ＋ＤＭＰＡ」；および「２５４ｎｍ」）の経時的な（分）遊離チオールの減少を示す。
ペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａ（ＭＷ：１８１３、配列番号２）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍまたは３５５ｎｍのいずれか（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、１ｍＬの水中の０．５５ｍＭのＯ－アリル－ＴｎおよびＡＡＰＨ（１．４４ｍｇ、５．５ｎｍｏｌ、１０．０当量）またはＤＭＰＡ（０．３ｍｇ、１．１ｎｍｏｌ、２．０当量）と共に室温で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにし、６０分後にオフにして反応を止めた。またペプチドを、活性化剤の非存在下で、ＵＶ２５４ｎｍでも、Ｏ－アリル－Ｔｎにコンジュゲートした。遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。図１６は、３つの異なるコンジュゲーション条件（「３５５ｎｍ＋ＡＡＰＨ」；「３６５ｎｍ＋ＤＭＰＡ」；および「２５４ｎｍ」）の経時的な（分）遊離チオールの減少を示す。
チオール－エン光反応生成物の免疫反応性を酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）によって測定した。１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ中の指定された量のペプチドを、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）に、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、ウェルをブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
ＥＬＬＡの結果は、図１７に提示され、ＡＡＰＨまたはＤＭＰＡＰの存在下における３６５ｎｍでの、または活性化剤の非存在下における２５４ｎｍでの、チオール－エン光化学反応によってコンジュゲートした様々な量のＴｎ－ペプチドへのＶＶＡレクチン反応性を示す。コンジュゲーション生成物は、レクチンによって検出されたが、コンジュゲートしていないペプチド（「ペプチド」）またはＯ－アリル－Ｔｎ単独（「Ｔｎ」）は非反応性であった。興味深いことに、図１７は、活性化剤の非存在下における２５４ｎｍでのコンジュゲーションが、活性化剤の存在下における３６５ｎｍまたは３５５ｎｍによって生成したものより免疫反応性のグリココンジュゲート生成物を生成したことを示す。
実施例１４：チオール－エン光化学反応によるＣ－アリルおよびＯ－アリル糖のペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａへのコンジュゲーションおよび反応性
ｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａペプチド（ＭＷ：１８１３）を、０．５５ｍＭの濃度で水に溶解させ、その１ｍＬを、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、Ｏ－アリル－Ｔｎ、Ｏ－アリル－ＴＦ、またはＣ－アリル－Ｔｎ（１００ｕＬ、１１ｍＭ、２．０当量）およびＡＡＰＨ（１．４４ｍｇ、５．５ｎｍｏｌ、１０．０当量）と共に室温で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにした。この溶液を、指定された時間でサンプリングし、遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用して測定した。図１８は、試験された異なるアリル糖：Ｏ－アリル－Ｔｎ（「Ｔｎ」）、Ｏ－アリル－ＴＦ（「ＴＦ」）、またはＣ－アリル－Ｔｎ（「ｃＴｎ」）の経時的な（分）遊離チオールの減少を示す。
ｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａペプチド（ＭＷ：１８１３）を、０．５５ｍＭの濃度で水に溶解させ、その１ｍＬを、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、Ｏ－アリル－Ｔｎ、Ｏ－アリル－ＴＦ、またはＣ－アリル－Ｔｎ（１００ｕＬ、１１ｍＭ、２．０当量）およびＡＡＰＨ（１．４４ｍｇ、５．５ｎｍｏｌ、１０．０当量）と共に室温で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにした。この溶液を、指定された時間でサンプリングし、遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用して測定した。図１８は、試験された異なるアリル糖：Ｏ－アリル－Ｔｎ（「Ｔｎ」）、Ｏ－アリル－ＴＦ（「ＴＦ」）、またはＣ－アリル－Ｔｎ（「ｃＴｎ」）の経時的な（分）遊離チオールの減少を示す。
チオール－エン光反応生成物の免疫反応性を酵素結合レクチンアッセイおよび酵素結合免疫吸着測定法によって測定した。１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ中の指定された量のペプチドコンジュゲートを、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）に、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでＰＢＳ－Ｔ＋１％ＢＳＡブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチンもしくはピーナッツ凝集素（ＶＶＡ－ｈｒｐ、ＰＮＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物、または０．１μｇ／ｍｌのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ＪＡＡＦ１１を含有するウェルをＰＢＳ－Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson Immunoresearch））と共にさらに６０分インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
図１９は、Ｏ－アリル－Ｔｎ（ただしＣ－アリル－Ｔｎではなく）を用いて生成したペプチドコンジュゲートのみが抗ＴｎレクチンＶＶＡによって認識されたことを示す。これらの結果は、Ｃ－アリル－Ｔｎは、ペプチドにコンジュゲートしていながらも、レクチンへの結合を可能にするコンフォメーションを有さないことを示唆する。
実施例１５：チオール－エン光化学反応による化学的に還元されたｄＴＴへのＯ－アリル－ＴＦのコンジュゲーション
弱毒化破傷風トキソイド（ｄＴＴ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で透析し（ＭＷＣＯ２，０００）、次いで、１０００当量のＤＴＴと共にインキュベートした。室温および回転下で２時間のインキュベーションの後、還元タンパク質溶液をｐＨ７．４のＰＢＳ中で、遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン（Amicon））によって洗浄した。次いで還元タンパク質（１ｍＬ、３．５１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｎｍｏｌ）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、１．０ｍＬのＰＢＳの最終容量で、Ｏ－アリル－ＴＦ（３０．０当量）およびＡＡＰＨ（２．０当量）と共に撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして反応を開始させ、次いで２時間後に止めた。
弱毒化破傷風トキソイド（ｄＴＴ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で透析し（ＭＷＣＯ２，０００）、次いで、１０００当量のＤＴＴと共にインキュベートした。室温および回転下で２時間のインキュベーションの後、還元タンパク質溶液をｐＨ７．４のＰＢＳ中で、遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン（Amicon））によって洗浄した。次いで還元タンパク質（１ｍＬ、３．５１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｎｍｏｌ）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、１．０ｍＬのＰＢＳの最終容量で、Ｏ－アリル－ＴＦ（３０．０当量）およびＡＡＰＨ（２．０当量）と共に撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして反応を開始させ、次いで２時間後に止めた。
天然のｄＴＴと比較した、ＤＴＴ処理によって生成した還元ｄＴＴの遊離チオール濃度を、緩衝液交換ｄＴＴサンプルで、システイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定し、タンパク質濃度を、ＢＳＡ標準曲線を使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ｄＴＴサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、１００μＬの０．１μｇ／ｍＬのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）の１００μＬの１／１０００希釈物と共にさらに６０分インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
図２０は、ＪＡＡＦ１１（「ｄＴＴ（ＤＴＴ）－ＴＦ」）に対するｄＴＴ－ＴＦの免疫反応性を示すが、還元ｄＴＴ（「ｄＴＴ（ＤＴＴ）」）または天然のｄＴＴ（データは示されない）は非反応性であった。これは、Ｏ－アリル－ＴＦが、実際に、免疫反応性のコンフォメーションでチオール－エン光反応によってｄＴＴにコンジュゲートしたことを示す。
実施例１６：チオール－エン光化学反応による化学的に還元されたｄＴＴへのＯ－アリル－Ｔｎのコンジュゲーション
ｄＴＴを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で透析し（ＭＷＣＯ３０，０００）、次いで０．５ｍＬ（５．８ｍｇ／ｍＬ）を、５０または５００当量のＤＴＴと共に、室温、回転下でインキュベートした。２時間後、還元タンパク質溶液をｐＨ７．４のＰＢＳ中で、遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄した。次いで５００当量のＤＴＴ（７０ｕＬ、０．５ｍｍｏｌ／ｍＬ）で還元されたタンパク質を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、０．１ＭのＯ－アリル－ＴＦ（６０．０当量）および０．１ＭのＡＡＰＨ（４．０当量）と共に撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして反応を開始させ、次いで４５分後に止めた。還元ｄＴＴの遊離チオールが、コンジュゲーションの結果として還元耐性チオエーテル結合を形成したか、またはジスルフィド結合に再酸化したことを検証するために、コンジュゲートした生成物を、１００当量のＤＴＴで１時間処理し、次いで遠心ろ過によって洗浄し、次いで還元処理の前および後にチオール含量を測定した。遊離チオールの適用量を、システイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。タンパク質濃度を、ＢＳＡ標準曲線を使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ｄＴＴを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で透析し（ＭＷＣＯ３０，０００）、次いで０．５ｍＬ（５．８ｍｇ／ｍＬ）を、５０または５００当量のＤＴＴと共に、室温、回転下でインキュベートした。２時間後、還元タンパク質溶液をｐＨ７．４のＰＢＳ中で、遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄した。次いで５００当量のＤＴＴ（７０ｕＬ、０．５ｍｍｏｌ／ｍＬ）で還元されたタンパク質を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、０．１ＭのＯ－アリル－ＴＦ（６０．０当量）および０．１ＭのＡＡＰＨ（４．０当量）と共に撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして反応を開始させ、次いで４５分後に止めた。還元ｄＴＴの遊離チオールが、コンジュゲーションの結果として還元耐性チオエーテル結合を形成したか、またはジスルフィド結合に再酸化したことを検証するために、コンジュゲートした生成物を、１００当量のＤＴＴで１時間処理し、次いで遠心ろ過によって洗浄し、次いで還元処理の前および後にチオール含量を測定した。遊離チオールの適用量を、システイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。タンパク質濃度を、ＢＳＡ標準曲線を使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
図２１は、異なるコンジュゲーション条件後のｄＴＴにおける遊離チオールのモル比を示す。結果から、ｄＴＴタンパク質が用量依存性の方式で還元され、５００当量のＤＴＴでの処理で、９個の遊離チオールに達した（ｄＴＴにおける１０個のシステインの最大限の理論上の数から）ことが示される。チオール－エン光反応によるＯ－アリル－ＴｎまたはＯ－アリル－ＴＦのコンジュゲーションは、非還元ｄＴＴのレベルに、またはそれ未満に遊離チオールを低減した。還元に対するｄＴＴ－Ｔｎコンジュゲートの耐性は、チオール－エン光反応によって形成された還元耐性チオエーテル結合の存在を確認した。
ｄＴＴサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチンもしくはピーナッツ凝集素（ＶＶＡ－ｈｒｐ、ＰＮＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物、または０．１μｇ／ｍＬのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ＪＡＡＦ１１を含むウェルを、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）の１００μＬの１／１０００希釈物と共にさらに６０分インキュベートした。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
図２２は、コンジュゲートしていないｄＴＴと比較した、ｄＴＴ－ＴｎコンジュゲートのレクチンＶＶＡへの高い反応性を示す。
天然のｄＴＴおよびｄＴＴ－Ｔｎコンジュゲートを、１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって分析し、次いでクーマシーブルーで染色した。ゲル電気泳動の結果は、ｄＴＴ－Ｔｎコンジュゲートが、天然の非コンジュゲートｄＴＴより高い分子量に移動したことを示した（データは示されない）。
実施例１７：チオール－エン光反応性によるＯ－アリル－Ｔｎの化学的にチオール化したｄＴＴへのコンジュゲーションに対するＡＡＰＨ濃度の作用
ｄＴＴを、ｐＨ８のＰＢＳ（ＭＷＣＯ３０，０００）中で透析し、次いで１００μＬ（０．８ｍｇ）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、水中の０．１Ｍの２－イミノチオラン塩酸塩の２００当量／タンパク質（シグマ（Sigma））、水中の２００当量／タンパク質の０．１ＭのＯ－アリル－ＴＦ、および水中の０．８当量／タンパク質またはおよそ４５０当量／タンパク質のＡＡＰＨの溶液と共に、１２４μＬの最終容量で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。光化学反応中、１５分に、および４５分での反応の完了時に、サンプルを回収した。セファデックス（Sephadex）（商標）Ｇ２５が充填されたミニスピンカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって、コンジュゲーション生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ｄＴＴを、ｐＨ８のＰＢＳ（ＭＷＣＯ３０，０００）中で透析し、次いで１００μＬ（０．８ｍｇ）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、水中の０．１Ｍの２－イミノチオラン塩酸塩の２００当量／タンパク質（シグマ（Sigma））、水中の２００当量／タンパク質の０．１ＭのＯ－アリル－ＴＦ、および水中の０．８当量／タンパク質またはおよそ４５０当量／タンパク質のＡＡＰＨの溶液と共に、１２４μＬの最終容量で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。光化学反応中、１５分に、および４５分での反応の完了時に、サンプルを回収した。セファデックス（Sephadex）（商標）Ｇ２５が充填されたミニスピンカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって、コンジュゲーション生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
図２３は、２－イミノチオランでの化学的チオール化およびＯ－アリル－Ｔｎの非存在下におけるチオール－エン光化学反応の後のｄＴＴサンプル中の遊離チオールの比率が、２５～３０に達するが、Ｏ－アリル－Ｔｎの存在は、ｄＴＴのチオール比率を、ＡＡＰＨ濃度に対する用量依存性の方式でおよそ２０および５に低減させることを示し、これは、チオエーテル結合がチオール－エン光反応によって形成されたことを示唆している。
ｄＴＴサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
図２４は、レクチンＶＶＡ－ｈｒｐに対するｄＴＴサンプルの反応性を示す。天然のコンジュゲートしていないｄＴＴと比較してＴｎコンジュゲートは、より高い反応性を有することが観察された。さらに、反応性は、光反応の持続時間および使用されるＡＡＰＨ活性化剤の量と相関する。
ｄＴＴコンジュゲート（５μｇ）を、１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって分析し、クーマシーブルーでの染色、またはウェスタンブロット分析のための膜（イモビロン－Ｐ、メルク・ミリポア（Merck Millipore））への移行のいずれかを行った。膜をＰＢＳ－Ｔ＋１％ＢＳＡ中で１時間ブロッキングし、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、次いで、ＰＢＳ－Ｔ中のホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１／１００希釈物と共に室温で１時間または４℃で一晩インキュベートした。次いで膜をＰＢＳ－Ｔで徹底して洗浄し、結合したＶＶＡ－ｈｒｐを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ発色性基質である４－クロロ１－ナフトール（Naphtol）（０．０３％過酸化水素を含有するＰＢＳ中、０．３ｍｇ／ｍＬ、シグマ）を用いて検出した。クーマシー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥと対応するＶＶＡ－ｈｒｐで染色したウェスタンブロットの両方からの結果から、ｄＴＴ－Ｔｎが、天然のｄＴＴより高い分子量に移動したこと、およびＶＶＡへの特異的な反応性を有することが解明され、これは、生成物が実際にＴｎにコンジュゲートしていることを示す（データは示されない）。
実施例１８：チオール－エン光化学反応によるＯ－アリル－ＴｎおよびＯ－アリル－ＴＦの化学的に還元されたＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（１ｍＬＰＢＳ、ｐＨ７．４中の７ｍｇ）を、６００当量のＤＴＴと共に２時間インキュベートし、次いでｐＨ７．４のＰＢＳ中で、遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄した。次いで還元タンパク質を、チオール－エン光化学反応によってＯ－アリル－ＴｎまたはＯ－アリル－ＴＦにコンジュゲートした。還元ＢＳＡ（６００ｕＬ、５．３ｍｇ／ｍＬ、０．０４７ｎｍｏｌ）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、Ｏ－アリル－糖（６０当量）およびＡＡＰＨ（４．０当量）およびｐＨ７．４のＰＢＳ（７２０ｕＬ）と共に撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。４５分後、生成物をｐＨ７．４のＰＢＳで遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄して、全ての未反応のＯ－アリルおよび試薬を除去した。還元ＢＳＡの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ＢＳＡ（１ｍＬＰＢＳ、ｐＨ７．４中の７ｍｇ）を、６００当量のＤＴＴと共に２時間インキュベートし、次いでｐＨ７．４のＰＢＳ中で、遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄した。次いで還元タンパク質を、チオール－エン光化学反応によってＯ－アリル－ＴｎまたはＯ－アリル－ＴＦにコンジュゲートした。還元ＢＳＡ（６００ｕＬ、５．３ｍｇ／ｍＬ、０．０４７ｎｍｏｌ）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、Ｏ－アリル－糖（６０当量）およびＡＡＰＨ（４．０当量）およびｐＨ７．４のＰＢＳ（７２０ｕＬ）と共に撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。４５分後、生成物をｐＨ７．４のＰＢＳで遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄して、全ての未反応のＯ－アリルおよび試薬を除去した。還元ＢＳＡの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチンもしくはピーナッツ凝集素（ＶＶＡ－ｈｒｐ、ＰＮＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物、または０．１μｇ／ｍＬのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ＪＡＡＦ１１を含有するウェルを、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）と共にさらに６０分インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
図２５は、これらの条件下で生成したＢＳＡ－ＴＦおよびＢＳＡ－Ｔｎが、抗ＴＦＪ ＡＡＦ１１モノクローナル抗体および抗ＴｎレクチンＶＶＡそれぞれに対して高度に反応性を有し、特異的であったことを示す。
ＢＳＡ－ＴｎおよびＢＳＡ－ＴＦコンジュゲート（５μｇ）を、クーマシーブルーで染色した１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。使用された条件下でのＢＳＡの還元は、エルマン試験によって測定したところ、１９．２９のチオールのモル比を生じた。いずれかのＯ－アリル－糖とのコンジュゲーションの後、エルマン試験は陰性であったことから、チオール－エン光化学反応によって遊離チオールがＯ－アリル糖に化学的にカップリングされたことが示唆される（データは示されない）。クーマシー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから、両方のＢＳＡ－コンジュゲートが、期待されるＢＳＡの分子量に移動するか、それより高い分子量種に移動したことが示された（データは示されない）。
実施例１９：チオール－エン光化学反応によるＯ－アリル－Ｔｎの化学的に還元されたＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（５００μＬ、７ｍｇ／ｍＬ）を、４００、２００または１０００当量のＤＴＴ（０．５Ｍ）と共に、室温で１時間、回転させながらインキュベートした。次いで還元ＢＳＡ溶液をｐＨ７．４のＰＢＳ中で一晩透析した。次いで還元ＢＳＡの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定し、それらから遊離チオール／ＢＳＡのモル比を計算した。
ＢＳＡ（５００μＬ、７ｍｇ／ｍＬ）を、４００、２００または１０００当量のＤＴＴ（０．５Ｍ）と共に、室温で１時間、回転させながらインキュベートした。次いで還元ＢＳＡ溶液をｐＨ７．４のＰＢＳ中で一晩透析した。次いで還元ＢＳＡの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定し、それらから遊離チオール／ＢＳＡのモル比を計算した。
図２６は、生成した遊離チオールの量と還元剤であるＤＴＴの量との相関を示し、それによれば、還元が、採用された条件下で１０００当量のＤＴＴを用いて実行された場合、約１０のチオール／ＢＳＡに到達する。
次いで還元タンパク質を、様々な比率のＯ－アリル－Ｔｎにコンジュゲートした。還元ＢＳＡ（５ｎｍｏｌ）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、ＡＡＰＨと共に、ｐＨ７．４のＰＢＳ５００μＬの最終容量で、１００当量のＯ－アリル－Ｔｎ／還元ＢＳＡまたは１００当量のＯ－アリル－Ｔｎ／ＢＳＡ－チオールと共に撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。４５分後、生成物を、ｐＨ７．４のＰＢＳで遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄して、未反応のＯ－アリルおよび試薬を除去した。
ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物または０．１μｇ／ｍＬのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ＪＡＡＦ１１を含有するウェルを、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）と共にさらに６０分インキュベートした。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００ｕｌのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
図２７は、レクチンＶＶＡおよび抗ＴＦモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１（＋ヤギ抗マウスＩｇＧ－ｈｒｐコンジュゲート）に対する様々なＢＳＡ－Ｔｎコンジュゲートの反応性を示す。Ｏ－アリルの最大比率でコンジュゲートしたＢＳＡ－コンジュゲートのうち２つが、チオール－エン光化学反応の結果として、特異的にＶＶＡへの高度な反応性を有することを見出した。
ＢＳＡ－Ｔｎコンジュゲート（５μｇ）を、クーマシーブルーで染色した１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって分析するか、または糖タンパク質に関して製造元（ピアース（Pierce））の説明書に従って分析した。結果から、高い分子量に移動したＢＳＡコンジュゲートはグリカンに関して陽性染色されたが、天然のコンジュゲートしていないＢＳＡはそうではなかったことが示された（データは示されない）。
実施例１９：チオール－エン光化学反応によるＯ－アリル－ＴＦの化学的にチオール化ＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（１ｍＬ、０．０８８μｍｏｌ、５．８９ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８．０のＰＢＳ）を、５、１０、または２０当量の２－イミノチオラン（５、１０、２０μＬ、０．１ｍｍｏｌ／ｍＬ）と共に１時間インキュベートした。次いでチオール化ＢＳＡを遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄して未反応の試薬を除去し、その後、チオール－エン光コンジュゲーションによってＯ－アリル－ＴＦにコンジュゲートした。チオール化ＢＳＡ（４４０；４８０；５７５μＬ、６．８；６．４；５．２ｍｇ／ｍＬ）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、３当量／チオールのＯ－アリル－ＴｎおよびＡＡＰＨ（０．２当量／チオール）およびｐＨ７．４のＰＢＳと共に、１ｍＬの最終容量で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。１時間後、生成物をｐＨ７．４のＰＢＳで遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄して、未反応のＯ－アリルおよび他の試薬を除去した。ＢＳＡサンプルの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ＢＳＡ（１ｍＬ、０．０８８μｍｏｌ、５．８９ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８．０のＰＢＳ）を、５、１０、または２０当量の２－イミノチオラン（５、１０、２０μＬ、０．１ｍｍｏｌ／ｍＬ）と共に１時間インキュベートした。次いでチオール化ＢＳＡを遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄して未反応の試薬を除去し、その後、チオール－エン光コンジュゲーションによってＯ－アリル－ＴＦにコンジュゲートした。チオール化ＢＳＡ（４４０；４８０；５７５μＬ、６．８；６．４；５．２ｍｇ／ｍＬ）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、３当量／チオールのＯ－アリル－ＴｎおよびＡＡＰＨ（０．２当量／チオール）およびｐＨ７．４のＰＢＳと共に、１ｍＬの最終容量で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。１時間後、生成物をｐＨ７．４のＰＢＳで遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄して、未反応のＯ－アリルおよび他の試薬を除去した。ＢＳＡサンプルの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、レクチン、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたピーナッツ凝集素（ＰＮＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物、または０．１μｇ／ｍＬのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ＪＡＡＦ１１を含有するウェルを、ＰＢＳ－Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）と共にさらに６０分インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
図２８において、二軸グラフは、ＴＦコンジュゲーション前に測定されたそれぞれのコンジュゲートのチオールの比率に対する、抗ＴＦレクチンＰＮＡまたはｍＡｂ ＪＡＡＦ１１へのＢＳＡ－ＴＦコンジュゲートの反応性を示す。これらの結果は、最もチオール化されたＢＳＡでＪＡＡＦ１１反応性が検出されることを示す。
実施例２０：チオール－エン光化学反応によるＯ－アリル－Ｔｎの化学的にチオール化ＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（２５０μＬ、４．３ｍｇ／ｍＬ）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２－イミノチオラン（シグマ）と共に、２００当量の０．１ＭのＯ－アリル－Ｔｎおよびおよそ４５０当量のＡＡＰＨおよびｐＨ８のＰＢＳの存在または非存在下で、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。サンプルを反応中の指定された時間に取った。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。ＢＳＡサンプルの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ＢＳＡ（２５０μＬ、４．３ｍｇ／ｍＬ）を、キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２－イミノチオラン（シグマ）と共に、２００当量の０．１ＭのＯ－アリル－Ｔｎおよびおよそ４５０当量のＡＡＰＨおよびｐＨ８のＰＢＳの存在または非存在下で、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。サンプルを反応中の指定された時間に取った。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。ＢＳＡサンプルの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
図２９は、ＢＳＡを、２－イミノチオランと、単独で、または３６５ｎｍの光の存在下で反応させたときの遊離チオール官能基の時間依存性の増加を示すが、光化学反応におけるＯ－アリル－Ｔｎの存在または非存在下でのＡＡＰＨの添加は、検出可能な遊離チオールの形成を防ぐ。
ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
図３０において、レクチンＶＶＡに対するＢＳＡコンジュゲートの反応性は、ＥＬＬＡにおいて、Ｏ－アリル－Ｔｎの存在下におけるチオール－エン光化学反応によって生成したＢＳＡのみがＶＶＡによって検出されるが、Ｏ－アリル－Ｔｎの非存在下で生成した生成物は、陰性であることを示す。これらの結果は、ＡＡＰＨおよびＵＶ３６５ｎｍ光が、Ｏ－アリル－糖の非存在下で遊離ジスルフィドのジスルフィドへの再酸化を触媒し、これは、Ｏ－アリル－Ｔｎの存在下におけるチオエーテル結合の形成と競合することを示唆する。
実施例２１：チオール－エン光化学反応によるＯ－アリル－Ｔｎの化学的にチオール化ＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（２５０μＬ、４．３ｍｇ／ｍＬ）を、石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２－イミノチオラン（シグマ）、２００当量の０．１ＭのＯ－アリル－Ｔｎ、および０．８当量のＡＡＰＨまたはおよそ４５０当量のＡＡＰＨのいずれか、ならびにｐＨ８のＰＢＳと共に、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。コンジュゲーションに対する抗酸化剤ビタミンＣ（およそ５ｍＭ）の作用を、大量のＡＡＰＨを含有する条件で試験した。キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に、キュベットを設置した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。サンプルを反応中の指定された時間に取った。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。コンジュゲートしたＢＳＡサンプルの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ＢＳＡ（２５０μＬ、４．３ｍｇ／ｍＬ）を、石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２－イミノチオラン（シグマ）、２００当量の０．１ＭのＯ－アリル－Ｔｎ、および０．８当量のＡＡＰＨまたはおよそ４５０当量のＡＡＰＨのいずれか、ならびにｐＨ８のＰＢＳと共に、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。コンジュゲーションに対する抗酸化剤ビタミンＣ（およそ５ｍＭ）の作用を、大量のＡＡＰＨを含有する条件で試験した。キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に、キュベットを設置した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。サンプルを反応中の指定された時間に取った。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。コンジュゲートしたＢＳＡサンプルの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
図３１は、２つのＹ軸を有し、Ｏ－アリル－ＴｎのＢＳＡへのチオール－エン光コンジュゲーションの結果としての、時間の関数としてのレクチンＶＶＡに対するコンジュゲーション生成物の反応性の増加、および対応する遊離チオールの減少を示す。これらの結果は、反応が、より高い濃度のＡＡＰＨでより有効であったことを示唆する。ビタミンＣの存在下で生成した生成物は、ＶＶＡレクチンに対して反応性を有していなかった（示されていない）。
ＢＳＡ－Ｔｎコンジュゲート（５μｇ）を、クーマシーブルーで染色した１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。結果から、より少ないＡＡＰＨでの反応と比べて、より多くのＡＡＰＨでの反応で高分子量種の量が多いことが示された。ビタミンＣは、高分子量種の形成を防いだ（データは示されない）。
実施例２２：タンパク質のチオール化の機能におけるチオール－エン光化学反応によるＯ－アリル－ＴｎのＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（９３μＬ、１１．７ｍｇ／ｍＬ）を、石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２－イミノチオラン（シグマ）、２００当量の０．１ＭのＯ－アリル－Ｔｎおよび０．０８当量、０．８当量またはおよそ４５０当量のＡＡＰＨのいずれか、ならびにｐＨ８のＰＢＳと共に、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。一部のサンプルでは、２－イミノチオランおよび／またはＡＡＰＨを省き、ｐＨ８のＰＢＳで置き換えた。キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍまたは２５４ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間にキュベットを設置した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ＢＳＡ（９３μＬ、１１．７ｍｇ／ｍＬ）を、石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２－イミノチオラン（シグマ）、２００当量の０．１ＭのＯ－アリル－Ｔｎおよび０．０８当量、０．８当量またはおよそ４５０当量のＡＡＰＨのいずれか、ならびにｐＨ８のＰＢＳと共に、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。一部のサンプルでは、２－イミノチオランおよび／またはＡＡＰＨを省き、ｐＨ８のＰＢＳで置き換えた。キュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍまたは２５４ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間にキュベットを設置した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。
ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ－ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
図３２は、コンジュゲーションが、タンパク質のチオール化の非存在下で実行される場合、またはチオール化したタンパク質が、活性化剤であるＡＡＰＨの非存在下でコンジュゲートされる場合の、ＶＶＡに対する生成物の最小の反応性を示す。しかしながら、ＶＶＡ反応性生成物は、タンパク質チオール化およびＡＡＰＨの非存在下で、ＵＶ２５４ｎｍによって生成される。
実施例２３：高いコンジュゲーション比率におけるＢＳＡ－ＴＦ反応性の非存在
ＢＳＡ（９３μＬ、１１．７ｍｇ／ｍＬ）を、室温のベンチ上で、またはキュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２－イミノチオラン（シグマ）、２００当量の０．１ＭのＯ－アリル－ＴＦおよび０．８当量またはおよそ４５０当量のＡＡＰＨおよびｐＨ８のＰＢＳの存在または非存在下で、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。ＴＦエピトープのコンジュゲートしたガラクトースを、ガラクトース標準を使用したＤｕｂｏｉｓの方法によって測定した。
ＢＳＡ（９３μＬ、１１．７ｍｇ／ｍＬ）を、室温のベンチ上で、またはキュベットから２～５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２－イミノチオラン（シグマ）、２００当量の０．１ＭのＯ－アリル－ＴＦおよび０．８当量またはおよそ４５０当量のＡＡＰＨおよびｐＨ８のＰＢＳの存在または非存在下で、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。ＴＦエピトープのコンジュゲートしたガラクトースを、ガラクトース標準を使用したＤｕｂｏｉｓの方法によって測定した。
ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６－ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ－トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ－Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、抗ＴＦモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１の１００μＬの０．１μｇ／ｍＬ希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、さらに、二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）の１００μＬの１／１０００希釈物と共に６０分インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。
図３３は、２つのＹ軸を有し、より低いガラクトースコンジュゲートと比較して、ＢＳＡ－ＴＦのより低い免疫反応性と、高いガラクトース比率を示す。２つのコンジュゲートにおいてガラクトースが検出されたことによって、ＴＦが、ＢＳＡにコンジュゲートされているが、コンジュゲートしたＴＦの免疫反応性は、高い比率で損なわれることを確認する。
実施例２４：チオール－エン光化学反応によるＯ－アリル－ＴｎのペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－（Ｔｎ）－βＡｌａ ＢＳＡへのコンジュゲーション
図３４は、ｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａおよびＣおよびＮ末端にシステイン残基を有するＣｙｓ－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａの化学構造を、それぞれそれらの表形式のＬＣ－ＭＳデータと共に示す。
図３４は、ｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａおよびＣおよびＮ末端にシステイン残基を有するＣｙｓ－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａの化学構造を、それぞれそれらの表形式のＬＣ－ＭＳデータと共に示す。
図３５は、ペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａ（Ｃ末端）の詳細なＬＣ－ＭＳデータを示す。
図３６は、ペプチドＣｙｓ－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａ（Ｎ末端）の詳細なＬＣ－ＭＳデータを示す。
■手順Ａ
ＵＶキュベット中で、水（１ｍＬ、２ｍＭ）中のペプチドの溶液に、Ｈ２Ｏ（２００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＯ－アリル－Ｔｎの溶液および触媒的な量のＡＡＰＨを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ－ＭＳから、望ましいＴｎ－コンジュゲートペプチドの存在が示された；LC-MS：[M] C94H152O31N20Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0780；CAN/H2O 5～95% 5.08分。
ＵＶキュベット中で、水（１ｍＬ、２ｍＭ）中のペプチドの溶液に、Ｈ２Ｏ（２００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＯ－アリル－Ｔｎの溶液および触媒的な量のＡＡＰＨを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ－ＭＳから、望ましいＴｎ－コンジュゲートペプチドの存在が示された；LC-MS：[M] C94H152O31N20Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0780；CAN/H2O 5～95% 5.08分。
■手順Ｂ（有機溶媒中）
ｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－（Ｔｎ）－βＡｌａ（図３４）。ＵＶキュベット中で、ＭｅＯＨ（１ｍＬ、２ｍＭ）中のペプチドの溶液に、Ｈ２Ｏ（２００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＴｎの溶液および触媒的な量のＤＭＰＡＰを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ－ＭＳから、望ましいペプチド－ＴＮの存在が確認された。LC-MS：[M] C94H152O31N20Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0675；CAN/H2O 5～95% 5.07分。
ｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－（Ｔｎ）－βＡｌａ（図３４）。ＵＶキュベット中で、ＭｅＯＨ（１ｍＬ、２ｍＭ）中のペプチドの溶液に、Ｈ２Ｏ（２００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＴｎの溶液および触媒的な量のＤＭＰＡＰを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ－ＭＳから、望ましいペプチド－ＴＮの存在が確認された。LC-MS：[M] C94H152O31N20Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0675；CAN/H2O 5～95% 5.07分。
図３７は、Ｃ末端ペプチドｄＴＴ８３１－８４４－Ｃｙｓ－βＡｌａにおけるＯ－アリルＴｎの光分解性のＡＡＰＨによって触媒されたチオール－エン反応を示す。
図３８は、Ｃ末端ペプチドにおけるＯ－アリルＴｎのＬＣ－ＭＳプロファイルを示す。
実施例２５：チオール－エン光化学反応によるＯ－アリル－ＴｎのペプチドＣｙｓ－（Ｔｎ）－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａへのコンジュゲーション
■手順Ａ
ＵＶキュベット中で、水（２ｍＬ、０．４８２ｍＭ）中のペプチドＣｙｓ－（Ｔｎ）－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａ（図３３）の溶液に、Ｈ２Ｏ（１００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＴｎの溶液および触媒的な量のＡＡＰＨを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ－ＭＳから、望ましいペプチド－Ｔｎコンジュゲートの存在が示された。LC-MS：[M] C94H152O31N20Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0719；CAN/H2O 5～95% 5.11分。
■手順Ａ
ＵＶキュベット中で、水（２ｍＬ、０．４８２ｍＭ）中のペプチドＣｙｓ－（Ｔｎ）－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａ（図３３）の溶液に、Ｈ２Ｏ（１００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＴｎの溶液および触媒的な量のＡＡＰＨを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ－ＭＳから、望ましいペプチド－Ｔｎコンジュゲートの存在が示された。LC-MS：[M] C94H152O31N20Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0719；CAN/H2O 5～95% 5.11分。
■手順Ｂ
Ｃｙｓ－（Ｔｎ）－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａ（図３３）。ＵＶキュベット中で、メタノール（２ｍＬ、０．４８２ｍＭ）中のペプチドの溶液に、Ｈ２Ｏ（１００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＴｎの溶液および触媒的な量のＤＭＰＡを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ－ＭＳから、望ましいペプチド－Ｔｎの存在が示された。LC-MS：[M] C94H152O31N20Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0817；CAN/H2O 5～95% 5.10分。
Ｃｙｓ－（Ｔｎ）－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａ（図３３）。ＵＶキュベット中で、メタノール（２ｍＬ、０．４８２ｍＭ）中のペプチドの溶液に、Ｈ２Ｏ（１００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＴｎの溶液および触媒的な量のＤＭＰＡを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ－ＭＳから、望ましいペプチド－Ｔｎの存在が示された。LC-MS：[M] C94H152O31N20Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0817；CAN/H2O 5～95% 5.10分。
図３９は、Ｎ末端ペプチドＣｙｓ－ｄＴＴ８３１－８４４－βＡｌａにおけるＯ－アリルＴｎの光分解性のＡＡＰＨによって触媒されたチオール－エン反応を示す。
図４０は、Ｎ末端ペプチドにおけるＯ－アリルＴｎの詳細なＬＣ－ＭＳプロファイルを示す。
参考文献
Cipolla et al., “Stereoselective synthesis of α- C-glycosides of N-acetylgalactosamine”, Tetrahedron Asymm. (2000), 11 ：295-303.
Cui et al., “Stereocontrolled allylation of 2-amino-2-deoxy sugar derivatives by a free-radical procedure”, Carbohydr. Res., (1998), 309：319-330.
Danishefsky et al., “Development of Globo-H Cancer Vaccine”, Acc. Chem Res., (2015), 48(3)：643-652.
Demian et al., “Direct targeted glycation of the free sulfhydryl group of cysteine residue (Cys-34) of BSA. Mapping of the glycation sites of the anti-tumor Thomsen-Friedenreich neoglycoconjugate vaccine prepared by Michael addition reaction,” J. Mass Spectrom., (2014), 49：1223-1233.
Dondoni et al., “A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation：Photoinduced thiol-ene coupling”, Chem. Eur. J., (2009), 15：11444-11449.
Dondoni et al., “Recent applications in thiol-ene coupling as a click process for glycoconjugation”, Chem. Soc. Rev., (2012), 41：573-586.
Feng et al., “Chemo-enzymatic synthesis of fluorinated 2-N-acetamidosugar nucleotides using UDP-GlcNAc pyrophosphorylase”, Org. Biomol. Chem. (2004), 2：1617-1623.
Heimburg et al., “Inhibition of spontaneous breast cancer metastasis by anti-Thomsen-Friedenreich antigen monoclonal antibody JAA-F11.”, Neoplasia, (2006) 8(11)：939-48.
Knapp et al., “Synthesis of α-GalNAc Thioconjugates from an α-GalNAc Mercaptan”, J. Org. Chem. (2002), 67：2995-2999.
Papadopoulos, “Diazo transfer and click chemistry in the solid phase syntheses of lysine-based glycodendrimers as antagonists against Escherichia coli FimH.” Molecular Pharmaceutics (2012), 9(3)：394-403.
Rittenhouse-Diakun et al., “Development and characterization of monoclonal antibody to T-antigen：(gal beta1-3GalNAc-alpha-O)”, Hybridoma, (1998), 17：165-173.
Tati et al., “Humanization of JAA-F11, a Highly Specific Anti-Thomsen-Friedenreich Pancarcinoma Antibody and InVitro Efficacy Analysis.”, Neoplasia, (2017), 19(9)：716-733.
［１］ グリココンジュゲート免疫原を生産するための方法であって、
（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、該末端アルケンは、チオール－エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；
（ｂ）１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する担体タンパク質を提供する工程；および
（ｃ）光触媒性チオール－エン反応を実行して、１個またはそれより多くの遊離チオール基において、該炭水化物抗原を該担体タンパク質に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲート免疫原を生産する工程；
を含み、該担体タンパク質は、対象に投与される場合、免疫原性であり、該炭水化物抗原の該担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、該対象に投与されるときの該炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記方法。
［２］ 前記アルケニル炭水化物抗原が、水溶性である、［１］に記載の方法。
［３］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、担体タンパク質の変性を回避する、および／または担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を保持する反応条件下で実行される、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、いずれの有機溶媒の非存在下で実行されるか、または前記光触媒性チオール－エン反応が、担体タンパク質の変性を回避するのに十分に低い濃度での有機溶媒の存在下で実行される、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、触媒の存在下で実行される、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］ 前記触媒が、
（ａ）水溶性触媒、例えば水溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物；２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］ジヒドロクロリド（Ｖａｚｏ ４４またはＶＡ－０４４）；２，２’－アゾビス（２－アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）；光開始剤活性を有する金属もしくは金属イオン；過酸化物；ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド；過酸化ベンゾイル；過硫酸アンモニウム；もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体；または
（ｂ）水不溶性触媒、例えば水不溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）、４，４’－アゾビス（４－シアノペンタン酸）（ＡＣＶＡ）、１，１’－アゾビス（シアノシクロヘキサン）（ＡＣＨＮ）、ジアゼンジカルボン酸ビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミド）（ＴＭＡＤ）；アゾジカルボン酸ジピペリジド（ＡＤＤ）、もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体である、［５］に記載の方法。
［７］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、短波紫外光下での放射線照射を含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、約２５４ｎｍでの放射線照射を含む、［７］に記載の方法。
［９］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、長波紫外光下での放射線照射を含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、約３５５ｎｍまたは３６５ｎｍでの放射線照射を含む、［９］に記載の方法。
［１１］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、前記担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たり１～２００モル当量の前記アルケニル炭水化物抗原を反応させることを含み；および／または前記光触媒性チオール－エン反応が、１０～３００、１０～２７０、１０～２４０、１０～２１０、１０～１８０、１０～１５０、１０～１２０、１０～９０、１０～６０、または１０～３０分間実行されるか、および／または前記担体タンパク質中の総遊離チオール濃度の、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０分の１の低減を達成するのに十分な時間実行される、［１］～［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０から、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０までの間のｐＨで、および／または担体タンパク質の変性を回避するｐＨで実行される、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］ 前記炭水化物抗原が、前記担体タンパク質へのコンジュゲーションの後、前記対象の内因性酵素によって前記担体タンパク質から切断可能ではない、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］ 前記アルケニル炭水化物抗原が、前記末端アルケンに共有結合で連結されているか、および／または前記炭水化物抗原が、グリコシド結合を介して、例えば、Ｏ－グリコシド結合、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合、または例えばアリルアミンと還元糖との間での還元的アミノ化により得られた結合を介して、前記担体タンパク質にコンジュゲートされている、［１］～［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］ 前記炭水化物抗原が、Ｂ細胞エピトープを含むか、および／もしくは前記対象において体液性免疫応答を誘導し；ならびに／またはＴ細胞エピトープを含むか、および／もしくは前記対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する、［１］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］ 前記炭水化物抗原が、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）であるか、またはそれを含む、［１］～［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］ 前記ＴＡＣＡが、Ｔｎ、Ｓ－Ｔｎ、トムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）－Ｓ－ＴＦ、（２，６）－Ｓ－ＴＦ、グロボＨ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ－グリコリル－ＧＭ３、Ｌｅａ、ｓＬｅａ、Ｌｅｘ、ｓＬｅｘ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む、［１６］に記載の方法。
［１８］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、同じ炭水化物抗原の少なくとも２つ、または１つより多くのタイプの炭水化物抗原を、前記担体タンパク質にコンジュゲートさせることによって、多価グリココンジュゲート免疫原を生産する、［１］～［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］ 前記多価グリココンジュゲート免疫原が、前記担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含む、［１８］に記載の方法。
［２０］ 前記炭水化物抗原が、ウイルス多糖抗原、または細菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）であるか、またはそれを含む、［１］～［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］ 前記細菌ＣＰＳが、肺炎球菌および／または連鎖球菌多糖体の血清型、髄膜炎菌ＣＰＳ、またはインフルエンザ（例えばインフルエンザａ型またはｂ型）ＣＰＳであるか、それ由来であるか、またはそれを含む、［２０］に記載の方法。
［２２］ （ａ）における前記炭水化物抗原が、リンカーを介して、前記末端アルケンに連結されている、［１］～［２１］のいずれか一項に記載の方法。
［２３］ 前記担体タンパク質が、前記１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する１個またはそれより多くのシステイン残基を含むか、または任意選択で、例えば前記担体タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、または溶媒接近可能な位置に、１個またはそれより多くのさらなるシステイン残基が付加されるように操作されている、［１］～［２２］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］ 前記担体タンパク質が、ヒトＴ細胞エピトープを含むか、および／または前記対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する、［１］～［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］ 前記担体タンパク質が、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌のプロテインＤ（ＨｉＤ）、サイトカイン、免疫原性ペプチド、例えば破傷風毒素８３１－８４４（配列番号１または２）、アルブミン（例えばウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）、またはそれらの免疫原性フラグメントであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む、［１］～［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］ （ｉ）前記担体タンパク質が、前記光触媒性チオール－エン反応を実行する前に、または実行と共に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ、または２－メルカプトエタノールなどの還元剤で前処理されるか；
（ｉｉ）前記担体タンパク質が、前記光触媒性チオール－エン反応を実行する前に、または実行と共に、チオール化剤、例えば２－イミノチオランまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミドジチオプロピオネート（ＤＰＳ）で前処理されるか；
（ｉｉｉ）前記担体タンパク質が、前記光触媒性チオール－エン反応を実行する前に、または実行と共に、チオール化剤、例えば２－イミノチオランまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミドジチオプロピオネート（ＤＰＳ）で前処理され、その後、還元剤で前処理されるか；
（ｉｖ）前記担体タンパク質が、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、該１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋は、前記光触媒性チオール－エン反応の後、影響を受けないままであるか；
（ｖ）前記担体タンパク質が、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、前記担体タンパク質を還元剤で前処理して、前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させるか；または
（ｉｖ）前記担体タンパク質が、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、前記担体タンパク質を、チオール化剤（例えば２－イミノチオランまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミドジチオプロピオネート（ＤＰＳ））で前処理して、前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させ、その後、還元剤で前処理する、［１］～［２５］のいずれか一項に記載の方法。
［２７］ 前記グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数が、コンジュゲーション前の前記担体タンパク質上の利用可能な遊離チオール基の数に等しい、［１］～［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］ 前記グリココンジュゲート免疫原が、前記対象に投与されると、前記炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、［１］～［２７］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］ （ｄ）前記グリココンジュゲート免疫原を精製する工程をさらに含む、［１］～［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］ グリココンジュゲートワクチンまたは適応免疫応答を引き起こす組成物を生産するための方法であって、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを用いて製剤化することを含む、上記方法。
［３１］ 前記アジュバントが、無機化合物、鉱油、微生物誘導体、植物誘導体、サイトカイン、スクアレン、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、免疫刺激ポリヌクレオチド（例えばＣＰＧ）、免疫刺激脂質、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＱＳ－２１、ムラミルジペプチド、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｓｔｅｖｉｕｎｅ、Ｓｔｉｍｕｎｅ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、またはそれを含む、［３０］に記載の方法。
［３２］ １つまたはそれより多くの炭水化物抗原および１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基を有する免疫原性担体タンパク質を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、該１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、該１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基において、該免疫原性担体タンパク質に連結されており、該１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の該免疫原性担体タンパク質へのコンジュゲーションは、対象に投与されると、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、該１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［３３］ 前記１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、リンカーを介して、前記１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基に連結されている、［３２］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３４］ 前記１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、［１３］または１４］で定義された結合を介して、前記リンカーに連結されている、［３２］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３５］ 前記１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、［２］、［１５］、［１６］、［１７］、［２０］または［２１］で定義された通りである、［３２］～［３４］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３６］ ［１８］または［１９］で定義された多価グリココンジュゲート免疫原である、［３２］～［３５］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３７］ 前記担体タンパク質が、［２３］、［２４］、［２５］または［２６］で定義された通りである、［３２］～［３６］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３８］ 前記グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数が、前記担体タンパク質における溶媒接近可能なシステイン残基の数に等しい、［３２］～［３７］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３９］ 前記対象に投与されると、前記炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、［３２］～［３８］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［４０］ ［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製される、［３２］～［３９］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［４１］ ［３０］または［３１］に記載の方法によって生産された、および／もしくは［３２］～［４０］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤、ならびに／またはアジュバントを含むグリココンジュゲートワクチン。
［４２］ 予防ワクチンまたは治療ワクチンである、［４１］に記載のグリココンジュゲートワクチン。
［４３］ 対象を免疫化する、対象にワクチン接種する、または対象を処置する方法であって、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲート免疫原、［３０］または［３１］に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、［３２］～［４０］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、または［４１］または［４２］に記載のグリココンジュゲートワクチンを該対象に投与することを含む、上記方法。
［４４］ 疾患を有する対象を免疫化すること、対象にワクチン接種をすること、もしくは対象を処置することにおいて使用するための、または前記グリココンジュゲートに特異的に結合する抗体の存在を検出するための、または前記免疫化、ワクチン接種、または処置（例えば、前記対象からの生物学的サンプルにおける）を検出するための、［３２］～［４０］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、または［４１］または［４２］に記載のグリココンジュゲートワクチン。
［４５］ 担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：
（式中、
－ ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；
－ Ｓ－ＰＣは、担体タンパク質であり；
－ Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨ２であり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＣＨ３、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅである）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［４６］ 担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：
（式中、
－ ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；
－ Ｓ－ＰＣは、担体タンパク質であり；
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－を形成し、ｍは、１である）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［４７］ 担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
（式中、
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、１つまたはそれより多くの糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、該１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
－ Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨ２であり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＣＨ３、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［４８］ 担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
（式中、
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、ｚ個の遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［４９］ 担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
（式中、
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、ｚ個の遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１、２、３、４または５であり；
－ Ｒ５は、Ｓ－ＰＣ、共有結合、または構造：
のラジカルであり、ここでＲ３およびＲ４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［５０］ 前記リンカーが、構造：
（式中、
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１、２、３、４または５である）
を有する、［４９］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５１］ 前記リンカーが、構造：
（式中、
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１または２である）
を有する、［４９］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５２］ 前記リンカーが、構造：
（式中、
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１または２である）
を有する、［４９］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５３］ ｙが、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、または１から１０の範囲の整数である、［４７］～［５２］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５４］ 前記糖抗原が、［１５］、［１６］、［１７］、［２０］または、［２１］で定義された炭水化物抗原である、［４５］～［５３］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５５］ 前記担体タンパク質が、［２３］、［２４］または［２５］で定義された担体タンパク質である、［４５］～［５４］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５６］ 多価グリココンジュゲート免疫原である、［４５］～［５５］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５７］ 前記多価グリココンジュゲート免疫原が、前記担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含む、［５６］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５８］ 前記グリココンジュゲート免疫原が、対象に投与されると、前記炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、［４５］～［５７］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５９］ ［４５］～［５８］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含むワクチン。
［６０］ 前記アジュバントが、［３１］で定義された通りである、［５９］に記載のワクチン。
［６１］ ワクチンの製造のための、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、または［３２］～［４０］および［４５］～［５８］のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原の使用。
［６２］ 前記１つまたはそれより多くの炭水化物または糖抗原の発現の増加に関連する疾患を有する対象を処置するための、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、［３０］または［３１］に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、［３２］～［４０］および［４５］～［５８］のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原、または［５９］または［６０］に記載のワクチンの使用。
［６３］ グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体を生産するための、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、［３０］または［３１］に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、［３２］～［４０］および［４５］～［５８］のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原、または［５９］または［６０］に記載のワクチンの使用。
［６４］ グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体を検出するための、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、［３０］または［３１］に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、［３２］～［４０］および［４５］～［５８］のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原の使用。
［６５］ グリココンジュゲートを生産するための方法であって、
（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、該末端アルケンは、チオール－エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；
（ｂ）本明細書に記載されるチオール－エン反応を介した前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションに好適なコンジュゲート材料を提供する工程であって、前記コンジュゲート材料は、１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する、工程；および
（ｃ）光触媒性チオール－エン反応を実行して、該炭水化物抗原を、該１個またはそれより多くの遊離チオール基において前記コンジュゲート材料に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲートを生産する工程
を含む、上記方法。
［６６］ 前記コンジュゲート材料が、ポリマー、ポリペプチド、前記した項のいずれか一項で定義された担体タンパク質、固体支持体、粒子、または本明細書に記載されるチオール－エン反応を介して前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションに好適な遊離チオール基を有する他のあらゆる材料であるか、またはそれを含む、［６５］に記載の方法。
［６７］ ［１］～［６４］のいずれか一項で定義された１つまたはそれより多くの特徴をさらに含む、［６５］または［６６］に記載の方法。
［６８］ 炭水化物抗原または炭水化物抗原を含む腫瘍循環細胞に特異的に結合する抗体の存在を検出またはスクリーニングするための、または炭水化物抗原での免疫化またはワクチン接種の結果生じる抗体の存在を検出するための、［６５］～［６７］のいずれか一項に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートの使用。
［６９］ 前記検出またはスクリーニングが、あらゆる好適な検出方法、例えば免疫吸着測定法、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、または免疫ブロット分析を介して実行される、［６８］に記載の使用。
［７０］ 対象を処置する方法であって、前記した項のいずれかで定義された、または前記した項のいずれかで定義された方法によって生産されたグリココンジュゲートまたはグリココンジュゲート免疫原を投与して、炭水化物抗原に対する前記対象における免疫応答を生じさせること、および前記対象からの生物学的サンプルを、該炭水化物抗原に特異的に結合する抗体の存在に関してスクリーニングすることを含む、上記方法。
［７１］ 前記した項に記載された１つまたはそれより多くの特徴をさらに含む、［７０］に記載の方法。
Cipolla et al., “Stereoselective synthesis of α- C-glycosides of N-acetylgalactosamine”, Tetrahedron Asymm. (2000), 11 ：295-303.
Cui et al., “Stereocontrolled allylation of 2-amino-2-deoxy sugar derivatives by a free-radical procedure”, Carbohydr. Res., (1998), 309：319-330.
Danishefsky et al., “Development of Globo-H Cancer Vaccine”, Acc. Chem Res., (2015), 48(3)：643-652.
Demian et al., “Direct targeted glycation of the free sulfhydryl group of cysteine residue (Cys-34) of BSA. Mapping of the glycation sites of the anti-tumor Thomsen-Friedenreich neoglycoconjugate vaccine prepared by Michael addition reaction,” J. Mass Spectrom., (2014), 49：1223-1233.
Dondoni et al., “A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation：Photoinduced thiol-ene coupling”, Chem. Eur. J., (2009), 15：11444-11449.
Dondoni et al., “Recent applications in thiol-ene coupling as a click process for glycoconjugation”, Chem. Soc. Rev., (2012), 41：573-586.
Feng et al., “Chemo-enzymatic synthesis of fluorinated 2-N-acetamidosugar nucleotides using UDP-GlcNAc pyrophosphorylase”, Org. Biomol. Chem. (2004), 2：1617-1623.
Heimburg et al., “Inhibition of spontaneous breast cancer metastasis by anti-Thomsen-Friedenreich antigen monoclonal antibody JAA-F11.”, Neoplasia, (2006) 8(11)：939-48.
Knapp et al., “Synthesis of α-GalNAc Thioconjugates from an α-GalNAc Mercaptan”, J. Org. Chem. (2002), 67：2995-2999.
Papadopoulos, “Diazo transfer and click chemistry in the solid phase syntheses of lysine-based glycodendrimers as antagonists against Escherichia coli FimH.” Molecular Pharmaceutics (2012), 9(3)：394-403.
Rittenhouse-Diakun et al., “Development and characterization of monoclonal antibody to T-antigen：(gal beta1-3GalNAc-alpha-O)”, Hybridoma, (1998), 17：165-173.
Tati et al., “Humanization of JAA-F11, a Highly Specific Anti-Thomsen-Friedenreich Pancarcinoma Antibody and InVitro Efficacy Analysis.”, Neoplasia, (2017), 19(9)：716-733.
［１］ グリココンジュゲート免疫原を生産するための方法であって、
（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、該末端アルケンは、チオール－エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；
（ｂ）１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する担体タンパク質を提供する工程；および
（ｃ）光触媒性チオール－エン反応を実行して、１個またはそれより多くの遊離チオール基において、該炭水化物抗原を該担体タンパク質に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲート免疫原を生産する工程；
を含み、該担体タンパク質は、対象に投与される場合、免疫原性であり、該炭水化物抗原の該担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、該対象に投与されるときの該炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記方法。
［２］ 前記アルケニル炭水化物抗原が、水溶性である、［１］に記載の方法。
［３］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、担体タンパク質の変性を回避する、および／または担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を保持する反応条件下で実行される、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、いずれの有機溶媒の非存在下で実行されるか、または前記光触媒性チオール－エン反応が、担体タンパク質の変性を回避するのに十分に低い濃度での有機溶媒の存在下で実行される、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、触媒の存在下で実行される、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］ 前記触媒が、
（ａ）水溶性触媒、例えば水溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物；２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］ジヒドロクロリド（Ｖａｚｏ ４４またはＶＡ－０４４）；２，２’－アゾビス（２－アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）；光開始剤活性を有する金属もしくは金属イオン；過酸化物；ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド；過酸化ベンゾイル；過硫酸アンモニウム；もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体；または
（ｂ）水不溶性触媒、例えば水不溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）、４，４’－アゾビス（４－シアノペンタン酸）（ＡＣＶＡ）、１，１’－アゾビス（シアノシクロヘキサン）（ＡＣＨＮ）、ジアゼンジカルボン酸ビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミド）（ＴＭＡＤ）；アゾジカルボン酸ジピペリジド（ＡＤＤ）、もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体である、［５］に記載の方法。
［７］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、短波紫外光下での放射線照射を含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、約２５４ｎｍでの放射線照射を含む、［７］に記載の方法。
［９］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、長波紫外光下での放射線照射を含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、約３５５ｎｍまたは３６５ｎｍでの放射線照射を含む、［９］に記載の方法。
［１１］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、前記担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たり１～２００モル当量の前記アルケニル炭水化物抗原を反応させることを含み；および／または前記光触媒性チオール－エン反応が、１０～３００、１０～２７０、１０～２４０、１０～２１０、１０～１８０、１０～１５０、１０～１２０、１０～９０、１０～６０、または１０～３０分間実行されるか、および／または前記担体タンパク質中の総遊離チオール濃度の、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０分の１の低減を達成するのに十分な時間実行される、［１］～［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０から、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０までの間のｐＨで、および／または担体タンパク質の変性を回避するｐＨで実行される、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］ 前記炭水化物抗原が、前記担体タンパク質へのコンジュゲーションの後、前記対象の内因性酵素によって前記担体タンパク質から切断可能ではない、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］ 前記アルケニル炭水化物抗原が、前記末端アルケンに共有結合で連結されているか、および／または前記炭水化物抗原が、グリコシド結合を介して、例えば、Ｏ－グリコシド結合、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合、または例えばアリルアミンと還元糖との間での還元的アミノ化により得られた結合を介して、前記担体タンパク質にコンジュゲートされている、［１］～［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］ 前記炭水化物抗原が、Ｂ細胞エピトープを含むか、および／もしくは前記対象において体液性免疫応答を誘導し；ならびに／またはＴ細胞エピトープを含むか、および／もしくは前記対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する、［１］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］ 前記炭水化物抗原が、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）であるか、またはそれを含む、［１］～［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］ 前記ＴＡＣＡが、Ｔｎ、Ｓ－Ｔｎ、トムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）－Ｓ－ＴＦ、（２，６）－Ｓ－ＴＦ、グロボＨ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ－グリコリル－ＧＭ３、Ｌｅａ、ｓＬｅａ、Ｌｅｘ、ｓＬｅｘ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む、［１６］に記載の方法。
［１８］ 前記光触媒性チオール－エン反応が、同じ炭水化物抗原の少なくとも２つ、または１つより多くのタイプの炭水化物抗原を、前記担体タンパク質にコンジュゲートさせることによって、多価グリココンジュゲート免疫原を生産する、［１］～［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］ 前記多価グリココンジュゲート免疫原が、前記担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含む、［１８］に記載の方法。
［２０］ 前記炭水化物抗原が、ウイルス多糖抗原、または細菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）であるか、またはそれを含む、［１］～［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］ 前記細菌ＣＰＳが、肺炎球菌および／または連鎖球菌多糖体の血清型、髄膜炎菌ＣＰＳ、またはインフルエンザ（例えばインフルエンザａ型またはｂ型）ＣＰＳであるか、それ由来であるか、またはそれを含む、［２０］に記載の方法。
［２２］ （ａ）における前記炭水化物抗原が、リンカーを介して、前記末端アルケンに連結されている、［１］～［２１］のいずれか一項に記載の方法。
［２３］ 前記担体タンパク質が、前記１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する１個またはそれより多くのシステイン残基を含むか、または任意選択で、例えば前記担体タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、または溶媒接近可能な位置に、１個またはそれより多くのさらなるシステイン残基が付加されるように操作されている、［１］～［２２］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］ 前記担体タンパク質が、ヒトＴ細胞エピトープを含むか、および／または前記対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する、［１］～［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］ 前記担体タンパク質が、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌のプロテインＤ（ＨｉＤ）、サイトカイン、免疫原性ペプチド、例えば破傷風毒素８３１－８４４（配列番号１または２）、アルブミン（例えばウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）、またはそれらの免疫原性フラグメントであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む、［１］～［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］ （ｉ）前記担体タンパク質が、前記光触媒性チオール－エン反応を実行する前に、または実行と共に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ、または２－メルカプトエタノールなどの還元剤で前処理されるか；
（ｉｉ）前記担体タンパク質が、前記光触媒性チオール－エン反応を実行する前に、または実行と共に、チオール化剤、例えば２－イミノチオランまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミドジチオプロピオネート（ＤＰＳ）で前処理されるか；
（ｉｉｉ）前記担体タンパク質が、前記光触媒性チオール－エン反応を実行する前に、または実行と共に、チオール化剤、例えば２－イミノチオランまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミドジチオプロピオネート（ＤＰＳ）で前処理され、その後、還元剤で前処理されるか；
（ｉｖ）前記担体タンパク質が、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、該１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋は、前記光触媒性チオール－エン反応の後、影響を受けないままであるか；
（ｖ）前記担体タンパク質が、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、前記担体タンパク質を還元剤で前処理して、前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させるか；または
（ｉｖ）前記担体タンパク質が、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、前記担体タンパク質を、チオール化剤（例えば２－イミノチオランまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミドジチオプロピオネート（ＤＰＳ））で前処理して、前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させ、その後、還元剤で前処理する、［１］～［２５］のいずれか一項に記載の方法。
［２７］ 前記グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数が、コンジュゲーション前の前記担体タンパク質上の利用可能な遊離チオール基の数に等しい、［１］～［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］ 前記グリココンジュゲート免疫原が、前記対象に投与されると、前記炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、［１］～［２７］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］ （ｄ）前記グリココンジュゲート免疫原を精製する工程をさらに含む、［１］～［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］ グリココンジュゲートワクチンまたは適応免疫応答を引き起こす組成物を生産するための方法であって、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを用いて製剤化することを含む、上記方法。
［３１］ 前記アジュバントが、無機化合物、鉱油、微生物誘導体、植物誘導体、サイトカイン、スクアレン、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、免疫刺激ポリヌクレオチド（例えばＣＰＧ）、免疫刺激脂質、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＱＳ－２１、ムラミルジペプチド、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｓｔｅｖｉｕｎｅ、Ｓｔｉｍｕｎｅ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、またはそれを含む、［３０］に記載の方法。
［３２］ １つまたはそれより多くの炭水化物抗原および１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基を有する免疫原性担体タンパク質を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、該１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、該１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基において、該免疫原性担体タンパク質に連結されており、該１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の該免疫原性担体タンパク質へのコンジュゲーションは、対象に投与されると、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、該１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［３３］ 前記１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、リンカーを介して、前記１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基に連結されている、［３２］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３４］ 前記１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、［１３］または１４］で定義された結合を介して、前記リンカーに連結されている、［３２］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３５］ 前記１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、［２］、［１５］、［１６］、［１７］、［２０］または［２１］で定義された通りである、［３２］～［３４］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３６］ ［１８］または［１９］で定義された多価グリココンジュゲート免疫原である、［３２］～［３５］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３７］ 前記担体タンパク質が、［２３］、［２４］、［２５］または［２６］で定義された通りである、［３２］～［３６］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３８］ 前記グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数が、前記担体タンパク質における溶媒接近可能なシステイン残基の数に等しい、［３２］～［３７］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［３９］ 前記対象に投与されると、前記炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、［３２］～［３８］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［４０］ ［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製される、［３２］～［３９］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［４１］ ［３０］または［３１］に記載の方法によって生産された、および／もしくは［３２］～［４０］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤、ならびに／またはアジュバントを含むグリココンジュゲートワクチン。
［４２］ 予防ワクチンまたは治療ワクチンである、［４１］に記載のグリココンジュゲートワクチン。
［４３］ 対象を免疫化する、対象にワクチン接種する、または対象を処置する方法であって、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲート免疫原、［３０］または［３１］に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、［３２］～［４０］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、または［４１］または［４２］に記載のグリココンジュゲートワクチンを該対象に投与することを含む、上記方法。
［４４］ 疾患を有する対象を免疫化すること、対象にワクチン接種をすること、もしくは対象を処置することにおいて使用するための、または前記グリココンジュゲートに特異的に結合する抗体の存在を検出するための、または前記免疫化、ワクチン接種、または処置（例えば、前記対象からの生物学的サンプルにおける）を検出するための、［３２］～［４０］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、または［４１］または［４２］に記載のグリココンジュゲートワクチン。
［４５］ 担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：
－ ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；
－ Ｓ－ＰＣは、担体タンパク質であり；
－ Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨ２であり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＣＨ３、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅである）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［４６］ 担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：
－ ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；
－ Ｓ－ＰＣは、担体タンパク質であり；
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－を形成し、ｍは、１である）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［４７］ 担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、１つまたはそれより多くの糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、該１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
－ Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨ２であり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＣＨ３、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［４８］ 担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、ｚ個の遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ３およびＲ４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－またはラジカル－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［４９］ 担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：
－ ｙは、少なくとも１であり；
－ ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
－ ［Ｓ］ｚ－ＰＣは、ｚ個の遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
－ ｚは、少なくともｙに等しく；
－ Ｌは、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１、２、３、４または５であり；
－ Ｒ５は、Ｓ－ＰＣ、共有結合、または構造：
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。
［５０］ 前記リンカーが、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１、２、３、４または５である）
を有する、［４９］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５１］ 前記リンカーが、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１または２である）
を有する、［４９］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５２］ 前記リンカーが、構造：
－ Ｘは、Ｓ、ＮＲ１、ＣＨ２またはＯであり；
－ Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＯＨ、－ＣＯＭｅ、または－ＣＯＥｔであり；
－ ｎは、１、２、３、４、または５であり；
－ Ｒ２は、ＨまたはＭｅであり；
－ ｑは、１、２、３、４、または５であり；
－ ｒは、１または２である）
を有する、［４９］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５３］ ｙが、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、または１から１０の範囲の整数である、［４７］～［５２］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５４］ 前記糖抗原が、［１５］、［１６］、［１７］、［２０］または、［２１］で定義された炭水化物抗原である、［４５］～［５３］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５５］ 前記担体タンパク質が、［２３］、［２４］または［２５］で定義された担体タンパク質である、［４５］～［５４］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５６］ 多価グリココンジュゲート免疫原である、［４５］～［５５］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５７］ 前記多価グリココンジュゲート免疫原が、前記担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含む、［５６］に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５８］ 前記グリココンジュゲート免疫原が、対象に投与されると、前記炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、［４５］～［５７］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。
［５９］ ［４５］～［５８］のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含むワクチン。
［６０］ 前記アジュバントが、［３１］で定義された通りである、［５９］に記載のワクチン。
［６１］ ワクチンの製造のための、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、または［３２］～［４０］および［４５］～［５８］のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原の使用。
［６２］ 前記１つまたはそれより多くの炭水化物または糖抗原の発現の増加に関連する疾患を有する対象を処置するための、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、［３０］または［３１］に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、［３２］～［４０］および［４５］～［５８］のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原、または［５９］または［６０］に記載のワクチンの使用。
［６３］ グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体を生産するための、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、［３０］または［３１］に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、［３２］～［４０］および［４５］～［５８］のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原、または［５９］または［６０］に記載のワクチンの使用。
［６４］ グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体を検出するための、［１］～［２９］のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、［３０］または［３１］に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、［３２］～［４０］および［４５］～［５８］のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原の使用。
［６５］ グリココンジュゲートを生産するための方法であって、
（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、該末端アルケンは、チオール－エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；
（ｂ）本明細書に記載されるチオール－エン反応を介した前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションに好適なコンジュゲート材料を提供する工程であって、前記コンジュゲート材料は、１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する、工程；および
（ｃ）光触媒性チオール－エン反応を実行して、該炭水化物抗原を、該１個またはそれより多くの遊離チオール基において前記コンジュゲート材料に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲートを生産する工程
を含む、上記方法。
［６６］ 前記コンジュゲート材料が、ポリマー、ポリペプチド、前記した項のいずれか一項で定義された担体タンパク質、固体支持体、粒子、または本明細書に記載されるチオール－エン反応を介して前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションに好適な遊離チオール基を有する他のあらゆる材料であるか、またはそれを含む、［６５］に記載の方法。
［６７］ ［１］～［６４］のいずれか一項で定義された１つまたはそれより多くの特徴をさらに含む、［６５］または［６６］に記載の方法。
［６８］ 炭水化物抗原または炭水化物抗原を含む腫瘍循環細胞に特異的に結合する抗体の存在を検出またはスクリーニングするための、または炭水化物抗原での免疫化またはワクチン接種の結果生じる抗体の存在を検出するための、［６５］～［６７］のいずれか一項に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートの使用。
［６９］ 前記検出またはスクリーニングが、あらゆる好適な検出方法、例えば免疫吸着測定法、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、または免疫ブロット分析を介して実行される、［６８］に記載の使用。
［７０］ 対象を処置する方法であって、前記した項のいずれかで定義された、または前記した項のいずれかで定義された方法によって生産されたグリココンジュゲートまたはグリココンジュゲート免疫原を投与して、炭水化物抗原に対する前記対象における免疫応答を生じさせること、および前記対象からの生物学的サンプルを、該炭水化物抗原に特異的に結合する抗体の存在に関してスクリーニングすることを含む、上記方法。
［７１］ 前記した項に記載された１つまたはそれより多くの特徴をさらに含む、［７０］に記載の方法。
Claims (17)
- （ａ）末端アルケンに共有結合で連結された水溶性炭水化物抗原を提供する工程、ここで、該末端アルケンは、チオール－エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能であり、該炭水化物抗原は未保護で水溶性である；
（ｂ）１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する担体タンパク質を提供する工程；および
（ｃ）光触媒性チオール－エン反応を実行して、１個またはそれより多くの遊離チオール基において、該炭水化物抗原を該担体タンパク質に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲート免疫原を生産する工程；
を含む、グリココンジュゲート免疫原を生産する方法であって、
ここで、光触媒性チオール－エン反応は、以下の（１）～（３）：
（１）６～８のｐＨ；
（２）担体タンパク質の変性を回避する反応条件下、ならびに／または、担体タンパク質の活性、抗原性および／あるいは構造を保持する反応条件下；および
（３）担体タンパク質の変性を回避するのに十分に低い濃度での有機溶媒の存在下、または、有機溶媒の非存在下；
にて実行され、
炭水化物抗原は、Ｂ細胞エピトープを含み、対象において体液性免疫応答を誘導するものであり、該担体タンパク質は、対象に投与される場合、免疫原性であり、該炭水化物抗原の該担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、該対象に投与されるときの該炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記方法。 - 光触媒性チオール－エン反応が６．５～７．５のｐＨで実行される、請求項１に記載の方法。
- 前記光触媒性チオール－エン反応が、水溶性触媒の存在下で実行される、請求項１または２に記載の方法。
- 水溶性触媒が、水溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物；２，２’－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］ジヒドロクロリド（Ｖａｚｏ ４４またはＶＡ－０４４）；２，２’－アゾビス（２－アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）；光開始剤活性を有する金属もしくは金属イオン；過酸化物；ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド；過酸化ベンゾイル；過硫酸アンモニウム；もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体である、請求項３に記載の方法。
- 光触媒性チオール－エン反応が、水に不溶性の触媒の存在下で実行される、請求項１に記載の方法。
- 水不溶性触媒が、水不溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオニトリル）、４，４’－アゾビス（４－シアノペンタン酸）（ＡＣＶＡ）、１，１’－アゾビス（シアノシクロヘキサン）（ＡＣＨＮ）、ジアゼンジカルボン酸ビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミド）（ＴＭＡＤ）；アゾジカルボン酸ジピペリジド（ＡＤＤ）、もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体である、請求項５に記載の方法。
- 前記光触媒性チオール－エン反応が、紫外光下での放射線照射を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記光触媒性チオール－エン反応が、前記担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たり１～２００モル当量の前記炭水化物抗原を反応させることを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記炭水化物抗原が、前記担体タンパク質へのコンジュゲーションの後、前記対象の内因性酵素によって前記担体タンパク質から切断可能ではない、請求項１に記載の方法。
- 前記炭水化物抗原が、前記末端アルケンに共有結合で連結されているか、および／または前記炭水化物抗原が、Ｏ－グリコシド結合、Ｓ－グリコシド結合、Ｎ－グリコシド結合、もしくはＣ－グリコシド結合、または、アリルアミンと還元糖との間での還元的アミノ化により得られた結合を介して、前記担体タンパク質にコンジュゲートされている、請求項１に記載の方法。
- 前記炭水化物抗原が、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）、ウイルス多糖抗原または細菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）であるか、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）、ウイルス多糖抗原または細菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ＴＡＣＡが、Ｔｎ、Ｓ－Ｔｎ、トムゼン－フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）－Ｓ－ＴＦ、（２，６）－Ｓ－ＴＦ、グロボＨ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ－グリコリル－ＧＭ３、Ｌｅａ、ｓＬｅａ、Ｌｅｘ、ｓＬｅｘ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、それ由来である、および／または、
ＣＰＳが、肺炎球菌および／または連鎖球菌多糖体の血清型、髄膜炎菌ＣＰＳまたはインフルエンザＣＰＳであるか、それ由来である、請求項１１に記載の方法。 - 前記光触媒性チオール－エン反応によって、１つより多くのタイプの炭水化物抗原を、前記担体タンパク質にコンジュゲートさせる、請求項１に記載の方法。
- （ａ）における前記炭水化物抗原が、リンカーを介して、前記末端アルケンに連結されている、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｂ）で提供される担体タンパク質が、
（１） １個またはそれより多くの遊離チオール基を有する１個またはそれより多くのシステイン残基を含む担体タンパク質、
（２） 担体タンパク質の溶媒接近可能な位置に、１個またはそれより多くのさらなるシステイン残基が付加されるように操作されている担体タンパク質、
（３） チオール化剤で処理された担体タンパク質、
（４） 還元剤で処理された担体タンパク質、または、
（５） 上記（１）～（４）のあらゆる組み合わせ、
である、請求項１に記載の方法。 - 前記担体タンパク質が、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌のプロテインＤ（ＨｉＤ）、サイトカイン、免疫原性ペプチド、破傷風毒素８３１－８４４（配列番号１または２）、アルブミン、またはそれらの免疫原性フラグメントであるか、それ由来である、請求項１に記載の方法。
- グリココンジュゲートワクチンまたは適応免疫応答を引き起こす組成物を生産するための方法であって、請求項１に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを用いて製剤化することを含む、上記方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862647151P | 2018-03-23 | 2018-03-23 | |
| US62/647,151 | 2018-03-23 | ||
| PCT/CA2019/050353 WO2019178699A1 (en) | 2018-03-23 | 2019-03-22 | Precision glycoconjugates as therapeutic tools |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021518435A JP2021518435A (ja) | 2021-08-02 |
| JPWO2019178699A5 JPWO2019178699A5 (ja) | 2022-03-29 |
| JP7297047B2 true JP7297047B2 (ja) | 2023-06-23 |
Family
ID=67984537
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021500322A Active JP7297047B2 (ja) | 2018-03-23 | 2019-03-22 | 治療用ツールとしての精密なグリココンジュゲート |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10610576B2 (ja) |
| EP (1) | EP3768309A4 (ja) |
| JP (1) | JP7297047B2 (ja) |
| KR (1) | KR20200141053A (ja) |
| CN (1) | CN111615400A (ja) |
| AU (1) | AU2019239890A1 (ja) |
| BR (1) | BR112020018974A2 (ja) |
| CA (1) | CA3094406C (ja) |
| CU (1) | CU20200068A7 (ja) |
| IL (1) | IL277415B (ja) |
| MX (1) | MX2020009825A (ja) |
| RU (1) | RU2020131305A (ja) |
| SG (1) | SG11202009113PA (ja) |
| WO (1) | WO2019178699A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4034159A4 (en) * | 2019-09-23 | 2024-02-21 | Koranex Capital | NEOGLYCOCONJUGATES AS VACCINES AND THERAPEUTIC TOOLS |
| CN112125832B (zh) * | 2020-08-12 | 2022-09-20 | 北京大学 | 刺突蛋白受体结合结构域纳米凝胶及其制备方法与应用 |
| WO2022198314A1 (en) * | 2021-03-23 | 2022-09-29 | Koranex Capital | Antibodies binding to o-linked carbohydrates on sars-cov-2 spike protein and uses thereof |
| CN113274488B (zh) * | 2021-04-30 | 2023-08-29 | 山东省药学科学院 | 一种特异性预防真菌感染的寡糖疫苗及其制备方法 |
| CN115671274B (zh) * | 2022-09-29 | 2024-03-12 | 普大生物科技(泰州)有限公司 | 一种载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001508774A (ja) | 1997-01-08 | 2001-07-03 | リーズ，アンドリュー | 遊離タンパク質を含むコンジュゲートワクチンの製造方法およびこの方法により製造したコンジュゲートワクチン、免疫原、および免疫原性試薬 |
| JP2015524839A (ja) | 2012-08-16 | 2015-08-27 | ファイザー・インク | 糖鎖付加プロセスおよび組成物 |
| JP2017531662A (ja) | 2014-10-09 | 2017-10-26 | エムエスディー ウェルカム トラスト ヒルマン ラボラトリーズ プライベート リミテッドＭｓｄ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｈｉｌｌｅｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ． | 改善されたコンジュゲーション方法及びそれから得られる合成オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲート |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4727136A (en) * | 1985-10-01 | 1988-02-23 | Canadian Patents And Development Ltd. | Modified meningococcal group B polysaccharide for conjugate vaccine |
| ES2512496T3 (es) * | 1998-07-22 | 2014-10-24 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Vacunas y pruebas de diagnóstico de Streptococcus suis |
| CU22904A1 (es) * | 1999-08-30 | 2004-01-23 | Univ De Ottawa | Oligosacáridos derivados de ribosa- ribitol-fosfato, métodos para prepararlos, inmunógenos que los comprenden y vacunas que comprenden dichos inmunógenos |
| AU2009249271B2 (en) * | 2008-05-19 | 2014-01-16 | Divergence, Inc. | Methods, devices, kits and compositions for detecting roundworm, whipworm, and hookworm |
| EP2455187A1 (de) * | 2010-11-23 | 2012-05-23 | Schneider GmbH & Co. KG | Vorrichtung und Verfahren zum Bearbeiten einer optischen Linse |
| WO2012069188A1 (en) * | 2010-11-24 | 2012-05-31 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V | Continuous flow processes for photoconjugation of high-molecular chemical entities |
| DK2935299T3 (da) * | 2012-12-20 | 2019-11-18 | Pfizer | Glycokonjugationsfremgangsmåde |
| ITMI20130142A1 (it) * | 2013-01-31 | 2014-08-01 | Biosynth Srl | Vaccini glicoconiugati comprendenti unita' di base di un costrutto molecolare esprimente epitopi multipli incorporati |
| US20170189549A1 (en) * | 2014-06-13 | 2017-07-06 | Glykos Finland Oy | Payload-Polymer-Protein Conjugates |
| WO2016070163A1 (en) * | 2014-10-31 | 2016-05-06 | Almeida Igor C | Glycoconjugates and methods for their use |
| CA2978857C (en) * | 2015-03-19 | 2021-04-20 | Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd | Novel hydrophilic linkers and ligand-drug conjugates thereof |
| CA3037756A1 (en) * | 2015-09-22 | 2017-03-30 | Khashayar Ghandi | Multi-functional anti-microbial polymers and compositions containing same |
-
2019
- 2019-03-22 US US16/362,363 patent/US10610576B2/en active Active
- 2019-03-22 CU CU2020000068A patent/CU20200068A7/es unknown
- 2019-03-22 EP EP19771203.7A patent/EP3768309A4/en active Pending
- 2019-03-22 SG SG11202009113PA patent/SG11202009113PA/en unknown
- 2019-03-22 CA CA3094406A patent/CA3094406C/en active Active
- 2019-03-22 RU RU2020131305A patent/RU2020131305A/ru unknown
- 2019-03-22 KR KR1020207030457A patent/KR20200141053A/ko not_active IP Right Cessation
- 2019-03-22 BR BR112020018974-0A patent/BR112020018974A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2019-03-22 WO PCT/CA2019/050353 patent/WO2019178699A1/en unknown
- 2019-03-22 CN CN201980007736.2A patent/CN111615400A/zh active Pending
- 2019-03-22 JP JP2021500322A patent/JP7297047B2/ja active Active
- 2019-03-22 MX MX2020009825A patent/MX2020009825A/es unknown
- 2019-03-22 AU AU2019239890A patent/AU2019239890A1/en active Pending
-
2020
- 2020-02-27 US US16/803,406 patent/US20200261560A1/en not_active Abandoned
- 2020-09-16 IL IL277415A patent/IL277415B/en unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001508774A (ja) | 1997-01-08 | 2001-07-03 | リーズ，アンドリュー | 遊離タンパク質を含むコンジュゲートワクチンの製造方法およびこの方法により製造したコンジュゲートワクチン、免疫原、および免疫原性試薬 |
| JP2015524839A (ja) | 2012-08-16 | 2015-08-27 | ファイザー・インク | 糖鎖付加プロセスおよび組成物 |
| JP2017531662A (ja) | 2014-10-09 | 2017-10-26 | エムエスディー ウェルカム トラスト ヒルマン ラボラトリーズ プライベート リミテッドＭｓｄ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｈｉｌｌｅｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ． | 改善されたコンジュゲーション方法及びそれから得られる合成オリゴ糖／タンパク質のコンジュゲート |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Chem. Eur. J.，2009年，Vol. 15，pp. 11444-11449 |
| Chem. Soc. Rev.，2012年，Vol. 41，pp. 573-586 |
| Expert Opinion on Drug Discovery，2011年，Vol. 6, No. 10，pp. 1045-1066 |
| Trends in Glycoscience and Glycotechnology，2016年，Vol. 28, No. 164，pp. J99-J106 |
| 高分子論文集，2016年，Vol. 73, No. 5，pp. 389-400 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2020131305A (ru) | 2022-04-26 |
| US10610576B2 (en) | 2020-04-07 |
| CA3094406A1 (en) | 2019-09-26 |
| MX2020009825A (es) | 2020-12-11 |
| WO2019178699A1 (en) | 2019-09-26 |
| AU2019239890A1 (en) | 2020-10-15 |
| CU20200068A7 (es) | 2021-04-07 |
| JP2021518435A (ja) | 2021-08-02 |
| CA3094406C (en) | 2024-05-14 |
| SG11202009113PA (en) | 2020-10-29 |
| BR112020018974A2 (pt) | 2021-01-05 |
| US20200261560A1 (en) | 2020-08-20 |
| KR20200141053A (ko) | 2020-12-17 |
| EP3768309A4 (en) | 2021-12-01 |
| EP3768309A1 (en) | 2021-01-27 |
| IL277415B (en) | 2022-04-01 |
| US20190290746A1 (en) | 2019-09-26 |
| IL277415A (en) | 2020-11-30 |
| CN111615400A (zh) | 2020-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7297047B2 (ja) | 治療用ツールとしての精密なグリココンジュゲート | |
| JP7494276B2 (ja) | 非天然アミノ酸とのポリペプチド抗原接合体 | |
| US10973910B1 (en) | Neoglycoconjugates as vaccines and therapeutic tools | |
| Adamo et al. | Synthetically defined glycoprotein vaccines: current status and future directions | |
| EP3183262A1 (en) | Novel glycan conjugates and use thereof | |
| DK2827899T3 (en) | Polysaccharide-glycolipid conjugate vaccines | |
| JP2018502885A (ja) | 新規なグリカンコンジュゲートおよびその使用方法 | |
| Zheng et al. | Improvement of the immune efficacy of carbohydrate vaccines by chemical modification on the GM3 antigen | |
| Sungsuwan et al. | Structure guided design of bacteriophage Qβ mutants as next generation carriers for conjugate vaccines | |
| Roy et al. | Carrier diversity and chemical ligations in the toolbox for designing tumor-associated carbohydrate antigens (TACAs) as synthetic vaccine candidates | |
| JPWO2019178699A5 (ja) | ||
| JP2024504658A (ja) | 担体材料とコンジュゲートさせるための抗原前駆体を含む反応性炭水化物の合成プロセス | |
| WO2023161528A1 (en) | A CONJUGATE COMPRISING AT LEAST A ß-GLUCAN | |
| Awad | Synthesis of a C-linked disaccharide analogue of the Thomsen Friedenreich (TF)-epitope aO-conjugated to L-serine and formation of a cluster as potential anticancer vaccine | |
| EA044044B1 (ru) | Иммуногенные композиции, содержащие конъюгаты полипептид-антиген с неприродными аминокислотами | |
| Miermont | Syntheses and immunological studies of tumor associated carbohydrate antigens |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210527 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220318 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220318 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20220318 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220601 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220831 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221128 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230118 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230411 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20230411 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230515 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230613 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7297047 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |