CN116474096A - 靶向牙龈卟啉单胞菌RgpB在结直肠癌的治疗及预防中的应用 - Google Patents

靶向牙龈卟啉单胞菌RgpB在结直肠癌的治疗及预防中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及靶向牙龈卟啉单胞菌RgpB在结直肠癌的治疗及预防中的应用。牙龈卟啉单胞菌是结直肠癌的独立风险因素，本发明通过研究发现牙龈卟啉单胞菌的RgpB是实现该菌在肿瘤细胞内定植并产生促癌作用的重要因子，可以作为结直肠癌预防或治疗的靶点，在此基础上进一步提供了RgpB抑制剂在制备抗结肠癌药物中的应用，所述RgpB抑制剂选自抑制RgpB蛋白质表达水平或RgpB蛋白活性的抑制剂。

Description

靶向牙龈卟啉单胞菌RgpB在结直肠癌的治疗及预防中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及将RgpB作为结直肠癌预防或治疗的靶点，包括RgpB在靶向预防和治疗结直肠癌中的应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是一种严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤，其总发病率仅次于肺癌、肝癌、胃癌，位居恶性肿瘤第四位，总死亡率位居第五位。结肠肠道微生物群落组成极其复杂，包含了超过1000种已知细菌和超过1200种病毒。这些微生物对结直肠癌有不可忽视的影响。口腔是消化道的起始部分，与胃肠道沟通密切，口腔-胃肠道的菌群交流可能是部分消化道肿瘤的发病原因。目前有多种口腔致病微生物被认为与癌症可能相关，包括：牙龈卟啉单胞菌，具核梭杆菌和白色念珠菌等。
牙龈卟啉单胞菌是一种革兰阴性短杆菌，专性厌氧，常见于牙周袋及感染根管中，是牙周炎的主要致病菌。该细菌具有LPS、Gingipain、FimA等毒力因子，还具有胞内定植的特性，可以通过直接作用于肿瘤细胞或通过创造利于肿瘤细胞的免疫微环境间接作用于肿瘤细胞来促进肿瘤增殖。
本发明的申请人课题组在前期的研究中采用TaqMan探针荧光定量PCR、免疫组化和荧光原位杂交方法检测了人粪便、组织样本中牙龈卟啉单胞菌含量，发现牙龈卟啉单胞菌在结直肠癌患者肠道中有更高的检出率，并且该细菌富集于癌组织中。队列研究发现牙龈卟啉单胞菌肠道感染是结直肠癌的独立风险因素，与结直肠癌患者五年复发率升高、五年总生存率及五年无复发生存率降低显著相关。然而，牙龈卟啉单胞菌作为结直肠癌的独立风险因素，如何促进结直肠癌的发生发展，以及作用于癌发生发展的哪个阶段仍有待进一步研究。此外，寻找新的有效的结直肠癌的诊断和治疗靶点也是本领域亟待解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种标记物在结直肠癌预防和治疗中的应用，所述标记物是RgpB基因或其编码的RgpB蛋白或蛋白片段，RgpB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MKKNFSRIVSIVAFSSLLGGMAFAQPAERGRNPQVRLLSAEQSMSKVQFRMDNLQFTDVQTSKGVAQVPTFTEGVNISEKGTPILPILSRSLAVSETRAMKVEVVSSKFIEKKDVLIAPSKGVISRAENPDQIPYVYGQSYNEDKFFPGEIATLSDPFILRDVRGQVVNFAPLQYNPVTKTLRIYTEIVVAVSETAEAGQNTISLVKNSTFTGFEDIYKSVFMNYEATRYTPVEEKENGRMIVIVAKKYEGDIKDFVDWKNQRGLRTEVKVAEDIASPVTANAIQQFVKQEYEKEGNDLTYVLLVGDHKDIPAKITPGIKSDQVYGQIVGNDHYNEVFIGRFSCESKEDLKTQIDRTIHYERNITTEDKWLGQALCIASAEGGPSADNGESDIQHENVIANLLTQYGYTKIIKCYDPGVTPKNIIDAFNGGISLVNYTGHGSETAWGTSHFGTTHVKQLTNSNQLPFIFDVACVNGDFLFSMPCFAEALMRAQKDGKPTGTVAIIASTINQSWASPMRGQDEMNEILCEKHPNNIKRTFGGVTMNGMFAMVEKYKKDGEKMLDTWTVFGDPSLLVRTLVPTEMQVTAPANISASAQTFEVACDYNGAIATLSDDGDMVGTAIVKDGKAIIKLNESIADETNLTLTVVGYNKVTVIKDVKVEGTSIADVANDKPYTVAVSGKTITVESPAAGLTIFDMNGRRVATAKNRMVFEAQNGVYAVRIATEGKTYTEKVIVK。
RgpB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
TTACTTCACTATAACCTTTTCTGTATACGTCTTGCCTTCAGTAGCGATGCGAACGGCATACACGCCGTTTTGTGCTTCGAATACCATGCGGTTCTTAGCAGTAGCTACACGACGGCCGTTCATATCGAAGATCGTCAGCCCGGCAGCAGGACTTTCTACAGTTATCGTCTTACCTGATACAGCTACAGTATAAGGCTTATCATTGGCTACGTCGGCAATAGATGTACCTTCCACTTTCACATCCTTTATCACAGTAACCTTATTGTATCCTACTACGGTGAGCGTCAAGTTCGTTTCATCAGCGATACTCTCATTTAATTTGATGATAGCCTTACCGTCTTTCACGATAGCAGTGCCGACCATATCACCATCGTCAGAGAGCGTAGCGATAGCACCGTTATAGTCGCAAGCTACTTCGAATGTCTGTGCAGAGGCAGAGATATTTGCCGGAGCCGTAACCTGCATTTCGGTCGGGACAAGTGTACGAACGAGCAGCGAGGGGTCGCCGAATACAGTCCATGTGTCGAGCATCTTCTCACCATCCTTTTTATACTTTTCCACCATAGCAAACATACCGTTCATGGTGACACCACCGAAAGTACGCTTGATGTTGTTCGGGTGTTTTTCGCACAGAATTTCGTTCATCTCATCCTGCCCGCGCATAGGAGAAGCCCAAGACTGGTTGATCGTAGACGCTATGATAGCAACAGTACCTGTCGGCTTACCATCTTTTTGTGCACGCATCAGGGCTTCTGCGAAGCAAGGCATGCTGAATAGGAAATCGCCATTCACACAAGCTACGTCGAAAATAAACGGTAGCTGGTTGCTGTTGGTAAGCTGCTTCACATGAGTGGTGCCGAAGTGAGACGTACCCCAAGCTGTTTCGCTACCGTGGCCCGTATAGTTGACCAACGAGATTCCTCCGTTGAAAGCATCAATAATGTTTTTAGGAGTTACTCCCGGATCATAACATTTGATAATCTTGGTATAGCCATACTGGGTAAGCAGATTGGCGATTACATTCTCATGCTGGATATCACTTTCACCATTGTCTGCGGATGGGCCTCCTTCAGCCGAAGCAATACAAAGAGCCTGACCGAGCCATTTGTCTTCCGTGGTTATATTGCGCTCATAGTGAATAGTCCGATCGATTTGTGTCTTCAGATCCTCTTTGCTCTCACATGAGAAACGACCGATGAAGACTTCGTTGTAGTGGTCATTACCTACTATTTGTCCATATACCTGGTCGGATTTGATCCCCGGAGTAATTTTGGCAGGAATATCTTTGTGATCGCCAACCAAAAGAACATAGGTCAAATCATTACCTTCTTTCTCGTATTCTTGCTTAACGAACTGCTGAATAGCATTAGCTGTAACGGGAGAAGCAATATCTTCTGCCACTTTCACCTCGGTACGGAGACCGCGTTGGTTTTTCCAATCAACGAAATCTTTAATATCTCCCTCATACTTTTTGGCTACGATGACGATCATACGACCATTCTCCTTTTCTTCAACAGGCGTATAGCGCGTAGCTTCATAATTCATGAAGACGCTCTTATAGATATCTTCGAAGCCTGTGAAAGTGCTGTTCTTAACCAAGCTAATCGTATTCTGGCCCGCTTCAGCTGTTTCGCTCACAGCTACAACGATTTCCGTATAGATGCGGAGGGTCTTTGTAACAGGGTTATACTGGAGCGGAGCAAAGTTTACTACCTGACCACGTACATCACGCAGGATGAAAGGATCGCTCAGCGTAGCGATTTCGCCCGGGAAGAACTTGTCTTCATTATAGCTCTGTCCGTACACGTAGGGGATTTGATCAGGATTTTCAGCGCGAGAGATAACACCTTTAGAGGGAGCGATCAGCACATCCTTCTTTTCGATGAATTTGGAAGAAACTACCTCTACCTTCATCGCACGTGTTTCAGAAACGGCAAGAGAACGGGAAAGAATGGGCAATATAGGCGTACCTTTCTCCGAGATATTGACACCTTCGGTGAAGGTAGGCACCTGAGCTACCCCTTTGGAGGTCTGTACGTCTGTGAACTGAAGATTGTCCATACGGAATTGCACCTTGGACATAGACTGCTCAGCGGAGAGCAGTCGTACTTGTGGGTTGCGACCGCGCTCTGCCGGCTGTGCAAACGCCATTCCTCCCAACAGAGAGGAGAATGCTACGATCGAAACGATCCTGCTAAAATTCTTTTTCAT
本申请的发明人通过对比研究发现，高表达RgpB的牙龈卟啉单胞菌33277在癌组织中的定植能力高于W83，而不同牙龈卟啉单胞菌菌株的肠道定植能力高低可能是它们促癌作用差异的主要原因。牙龈卟啉单胞菌通过激活内质网应激促进结肠癌细胞自噬小体形成，同时通过细菌表面毒力因子RgpB来抑制胞浆内自噬小体与溶酶体的结合，从而实现在肿瘤细胞的胞内定植并产生促癌作用。因此牙龈卟啉单胞菌的毒力因子RgpB在其促进结直肠癌的发生发展中有重要作用。
本发明的目的在于提供RgpB抑制剂在制备治疗或预防结直肠癌的药物中的应用。
所述RgpB抑制剂包括但不限于：抑制RgpB蛋白质表达水平或抑制RgpB蛋白活性的抑制剂。
所述抑制RgpB蛋白质表达水平的抑制剂可以是RgpB基因的同源重组构建、反义核酸序列、干扰序列(例如siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA等)，或者能够抑制RgpB基因转录的蛋白质、多肽、酶、小分子化合物等，或者能够抑制RgpB基因的mRNA翻译成蛋白质的蛋白质、多肽、小分子化合物等。
所述抑制RgpB蛋白活性的抑制剂是可以结合RgpB而影响其蛋白质活性的物质，包括但不限于：蛋白RgpB的抗体、抑制RgpB蛋白质活性的蛋白质、多肽、酶、小分子化合物(例如天然化合物、合成化合物等)。
在本发明的一些实施方式中，所述抑制剂为RgpB基因的干扰序列，例如siRNA、shRNA等。
在本发明的一些实施方式中，所述抑制剂为蛋白RgpB的抗体，优选为单克隆抗体。
本发明还提供了一种筛选预防或治疗结直肠癌的药物的方法，所述方法包括以RgpB基因或蛋白RgpB为靶标筛选RgpB抑制剂。
根据本发明，所述筛选药物的方法是在体外进行的。该药物筛选方法可以在医药工业的新药研发过程中使用。
在本发明的一个实施方式中，所述筛选药物的方法包括以下步骤：
1)将受试化学物质与RgpB的基因或蛋白RgpB混合，或者将受试化学物质与表达RgpB的细胞混合；
2)检测所编码蛋白的活性变化、或者受试化学物质是否与所述基因或其编码的蛋白结合、或者所述细胞的RgpB基因或蛋白表达量的变化。
根据本发明，所述筛选药物的方法中步骤2)的检测可以采用本领域已知的各种检测手段，包括但不限于：流式细胞仪、酶联免疫吸附法、MTT法、实时PCR、Westen-blot等。
本文中：
RgpB(精氨酸特异性蛋白酶牙龈蛋白酶B，arg-gingipain RgpB)是牙龈蛋白酶的一种，由RgpB基因编码。
术语“结合剂”、“结合分子”和“结合实体”是同义的，可以互换使用。在本发明的上下文中，结合剂结合、识别所述的基因、蛋白或蛋白片段，与之相互作用、反应或以别的方式发生关联。示例性结合剂可以包括但不限于抗体或其片段、抗原、适配体、核酸(例如DNA和RNA)、蛋白质(例如受体、酶、酶抑制剂、酶底物、配体)、肽、凝集素、脂肪酸或脂质和多糖。例如，在本发明的一些实施例中，结合剂包括抗体或其片段、核酸(例如DNA和RNA)。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核酸”是指由两个或更多个，优选地超过三个并且通常超过十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子。精确的大小将取决于许多因素，其继而取决于寡核苷酸最终的功能或用途。寡核苷酸可以以多种方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。本发明中的核酸可以含有2-100个核苷酸。
术语“抗体”以最宽泛的意义使用，具体地涵盖合成抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、灵长类化抗体、Fab片段、F(ab')片段、单链FvFc(scFvFc)、单链Fv(scFv)、抗独特型(抗Id)抗体和任何其他免疫活性抗体片段，只要它们展示出所希望的生物活性(即，标记相关或结合)即可。在更广的意义上，本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子(即，含有抗原结合部位的分子)的免疫活性片段，其中这些片段可以或可以不与另一个免疫球蛋白结构域(包括但不限于Fc区或其片段)融合。此外，如在此更详细地概述的，术语抗体和多种抗体具体地包括Fc变体或其片段，包括全长抗体和包含Fc区的变体Fc-融合物，其任选地包含至少一个氨基酸残基修饰并且与免疫球蛋白的免疫活性片段融合。
分子的“片段”意思是指分子的任何连续多肽或核苷酸子集。例如跨膜蛋白的片段可以包括仅包含胞外结构域或其某个部分的构建体。就本发明而言，标记片段或衍生物可以包括选择标记的任何免疫反应性或免疫活性部分。
术语“受试者”或“患者”可互换使用，包括但不限于人、非人类动物，例如非人灵长类如黑猩猩和其他猿类和猴种类；农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养受试者如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠，等等。该术语不指示具体的年龄或性别。
术语“受试化学物质”是指被测定活性的化学物质，包括但不限于小分子化合物，核酸(DNA或RNA)，蛋白质或多肽(例如配体、抗体、融合蛋白等)，多糖等。
术语“抑制剂”是指能够抑制RgpB蛋白质表达水平或RgpB蛋白活性的药剂或化合物。术语“抑制”可与“减少”和“阻断”互换使用，并且不需要绝对抑制。根据一些实施方案，抑制剂选自由以下组成的组：化学试剂或部分、蛋白质、多肽或肽和多核苷酸分子。每种可能性代表本发明的单独实施方案。本发明的范围涵盖所述抑制剂的同源物、类似物、变体和衍生物，其中规定这些变体和/或修饰必须抑制或减少RgpB蛋白质表达水平或RgpB蛋白活性。
抑制剂选自由以下组成的组：抗体、多肽、siRNA、RNAi和小分子等。
“RNA干扰(RNAi)”是进化上保守的过程，其中与靶基因相同或高度相似的序列的RNA的表达或引入导致从该靶基因转录的信使RNA(mRNA)的序列特异性降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)，从而抑制靶基因的表达。在一些实施方案中，RNA是双链RNA(dsRNA)。已经在植物、无脊椎动物和哺乳动物细胞中描述了该过程。在自然界中，RNAi由dsRNA特异性核酸内切酶Dicer启动，其促进长dsRNA切割成称为siRNA的双链片段。将siRNA掺入识别和切割靶mRNA的蛋白质复合物中。还可以通过引入核酸分子(例如，合成的siRNAs或RNA干扰剂)来引发RNAi，以抑制或沉默靶基因的表达。如本文所用，RNAi的抑制包括RgpB基因或由靶基因编码的蛋白质(即RgpB)的表达或蛋白质活性或水平的任何降低。与靶基因的表达或由尚未被RNA干扰剂靶向的靶基因编码的蛋白质的活性或水平相比，降低可以是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。
“短干扰RNA”(siRNA)，在本文中也称为“小干扰RNA”，定义为例如通过RNAi起抑制靶基因表达的作用的试剂。siRNA可以化学合成，可以通过体外转录产生，或者可以在宿主细胞内产生。在一个实施方案中，siRNA是双链RNA(dsRNA)分子，其长度为约15至约40个核苷酸，优选约15至约28个核苷酸，更优选约19至约25个核苷酸，更优选约19、20、21或22个核苷酸，并且可以在每条链上含有3'和/或5'突出端，其长度为约0、1、2、3、4或5个核苷酸。突出端的长度在两条链之间是独立的，即一条链上的突出端的长度不依赖于第二条链上的突出端的长度。优选地，siRNA能够通过靶信使RNA(mRNA)的降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)来促进RNA干扰。根据其他实施方案，siRNA是小发夹(也称为茎环)RNA(shRNA)。在一些实施方案中，这些shRNAs由短(例如，19-25个核苷酸)反义链、随后是5-9个核苷酸环和类似的有义链组成。或者，有义链可以在核苷酸环结构之前，并且反义链可以在之后。这些shRNAs可以包含在质粒、逆转录病毒和慢病毒中，并且从例如pol III U6启动子或另一种启动子表达。可以将RNA干扰剂(例如siRNA分子)施用于患有癌症或处于患有癌症风险中的受试者，以抑制RgpB的表达，从而治疗、改善或抑制受试者的癌症。
术语“抑制”是指与没有抑制剂的情况相比，蛋白质或细胞的活性降低。在一些实施方式中，术语“抑制”是指活性降低至少约25％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。在其它实施方式中，抑制是指活性降低约25％至约50％、约50％至约75％、或约75％至100％。在一些实施方式中，抑制是指活性降低约95％至100％，例如活性降低95％、96％、97％、98％、99％、或100％。可使用多种本领域技术人员公知的技术来测量这样的降低。
术语“表达”和“基因表达”含义相同，是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
术语“表达增高”和“高表达”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数增高，和/或翻译增高。根据本发明，基因转录的拷贝数增高，和/或翻译增高是超过正常水平至少1.3倍，例如，至少2、3、4、5、10、20或更多倍。
术语“表达降低”和“低表达”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数降低，和/或翻译降低。根据本发明，基因转录的拷贝数降低，和/或翻译降低是不超过正常水平的0.8倍，例如，不超过0.5、0.33、0.25、0.1或更少倍。
术语“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，既包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)，也包括提供时间线索，如预测某段时间内发生某种结局的可能性。
附图说明
图1：免疫荧光结果显示，牙龈卟啉单胞菌33277和W83能够定植于MC38细胞，箭头所示，细菌表现为点状或云雾状影像(一抗：鼠抗RgpB抗体；二抗：抗鼠Alexa Fluor 594荧光二抗，×400)。
图2：电镜结果显示，牙龈卟啉单胞菌33277和W83能够定植于MC38细胞的细胞质内，箭头所示细胞质内黑色颗粒状影像(银染)为细菌。
图3:牙龈卟啉单胞菌33277组的小鼠腺瘤的数量和体积均与空白对照组有显著的统计学差异(n＝10,**P<0.01，*P<0.05)，而W83组、阴性对照组与空白对照没有显著差异(P>0.05)。图3中A为肿瘤实体图，图3中B为肿瘤数量和体积的统计图。
图4A：箭头显示牙龈卟啉单胞菌DAB染色，牙龈卟啉单胞菌33277和W83组的小鼠腺瘤的免疫组化结果与空白对照组有显著的统计学差异(×400,n＝5,***P<0.001,**P<0.01)，阴性对照组变异链球菌UA159与空白对照没有显著差异(P>0.05)。
图4B：白点显示牙龈卟啉单胞菌Cy3荧光染色(彩色照片中为红色荧光点)，牙龈卟啉单胞菌33277和W83组的小鼠腺瘤的荧光原位杂交结果与空白对照组有显著的统计学差异(×400,n＝5,***P<0.001，**P<0.01)，细菌含量显著高于空白对照组，阴性对照组变异链球菌UA159与空白对照没有显著差异(P>0.05)
图5：PCR检测结果表明：牙龈卟啉单胞菌33277和W83组小鼠结直肠癌腺瘤中的牙龈卟啉单胞菌含量与空白对照组有显著的统计学差异(n＝5,*P<0.05)，阴性对照组变异链球菌UA159与空白对照没有显著差异(P>0.05)。
图6：牙龈卟啉单胞菌33277、W83以及培养基BHI瘤内注射到直肠黏膜下小鼠结直肠癌原位移植瘤模型3周后肿瘤，结果显示，牙龈卟啉单胞菌33277组的肿瘤重量显著大于对照组，而W83组无统计学差异(**P<0.01)。
图7A：箭头显示牙龈卟啉单胞菌DAB染色，牙龈卟啉单胞菌33277和W83组的小鼠腺瘤的牙龈卟啉单胞菌含量有显著差异，并显著高于对照组，且33277组细菌在肿瘤的定植多于W83组(×400，*P<0.05)。
图7B：箭头显示牙龈卟啉单胞菌Cy3荧光染色，牙龈卟啉单胞菌33277和W83组的小鼠腺瘤的免疫组化结果有显著的统计学差异，33277在肿瘤的定植多于W83(×400，***P<0.001，**P<0.01)。
图8：牙龈卟啉单胞菌33277和W83组的小鼠直肠黏膜下肿瘤的PCR检测结果显示：33277组细菌含量高于W83组且有统计学差异(**P<0.01)。
图9：牙龈卟啉单胞菌33277、W83以及BHI瘤内注射到腋前皮下小鼠结直肠癌异位移植瘤模型3周后肿瘤重量和体积的统计学分析，肿瘤体积计算采用如下公式：V＝L×W2/2，牙龈卟啉单胞菌33277组和W83组小鼠的肿瘤均与对照组有显著差异(**P<0.01，*P<0.05)。
图10：牙龈卟啉单胞菌33277表现出比W83更大的绿色荧光面积，表明牙龈卟啉单胞菌33277组织黏附能力强于W83，绿色荧光信号(图中箭头所指亮点)为经过FITC处理的牙龈卟啉单胞菌(***P<0.001)。
图11：基于KEGG数据库的按照差异大小前20位的信号通路，方框所示为可能与促癌作用、胞内定植相关的信号通路。
图12：感染牙龈卟啉单胞菌33277、W83、KDP132不同菌株12h后，结肠癌细胞内质网应激标志蛋白p-PERK、BiP表达上调而CHOP蛋白仅能受33277影响上调；加入4-PBA后，p-PERK、BiP、CHOP蛋白表达均显著下调。(#P<0.05，与同蛋白对照组比较，*P<0.05，与相同菌株处理无4-PBA组比较)。
图13：根据蛋白表达水平Western Blot检测结果条带Image J软件灰度分析计算的相对β-actin的相对表达量，感染牙龈卟啉单胞菌33277、W83、KDP132不同菌株12h后，自噬相关蛋白P62和LC3的蛋白表达水平改变，33277能使P62显著上调，33277、W83、KDP132均能使LC3-II上调；4-PBA能够上调P62表达水平而抑制LC3-II表达。(#P<0.05，与同蛋白对照组比较；*P<0.05，与相同菌株处理无4-PBA组比较)。
图14:根据蛋白表达水平Western Blot检测结果条带Image J软件灰度分析计算的相对β-actin的相对表达量，感染牙龈卟啉单胞菌33277 12h后P62、LC3-II蛋白表达变化趋势与加入Rapamycin、BafilomycinA1的对照组相一致；感染牙龈卟啉单胞菌KDP132 12h后P62、LC3-II蛋白表达变化趋势与仅加入Rapamycin对照组相一致。(*P<0.05)。
图15：感染牙龈卟啉单胞菌33277、KDP132不同菌株12h的自噬流改变，Merged图中黄点(灰阶图中色度最亮的点)所示为自噬小体，红点(灰阶图中色度暗的点)所示为自噬-溶酶体，不同颜色点计数结果以及自噬-溶酶体所占所有形式自噬体的总数的比例结果显示，感染33277或KDP132后细胞自噬受到显著影响，而33277组以自噬小体增加为主，KDP132组以自噬-溶酶体增加为主(*P<0.05)。
图16：感染牙龈卟啉单胞菌33277、W83、KDP132不同菌株12h后，MAPK通路标志蛋白MEK、ERK的磷酸化水平上调；而PI3K-Akt通路标志蛋白Akt的磷酸化水平下调。(#P<0.05，与同蛋白对照组比较)。
图17 KDP132菌株同源重组示意图
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的常规原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。所述的实验方法都是本领域已知和常规的分子生物学、生物化学、细胞生物学的实验方法，或按照相应实验的试剂盒的操作手册说明进行。
实验材料：
细菌：牙龈卟啉单胞菌33277株(购自ATCC)、W83(购自广东微生物研究所)、牙龈卟啉单胞菌RgpB基因缺失突变株KDP132(采用同源重组的方法构建，示意图如图17所示，上游片段的引物：P1:TACGATCTGTACAAGTGGCAAATGCC和P2:TCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCACTTTTTCATTTGCTTGAATTAGTTTTT；下游片段的引物：P3:TTCGTAGTACCTGGAGGGAATAATCAAGTAATTCACACTGCAATTCTCTAA和P4:TGCTACAAACTTCGGCTGGCTCCG；红霉素抗性基因的引物：P5:ATGACAAAAAAGAAATTGCC和P6:CTACGAAGGATGAAATTTTTC；阳性菌筛选用引物：F：GTGCCGACTTCATCTATCGCAA和R：CGATTGTGGTGAACGGCTCTAA；操作步骤可以参考文献，例如Porphyromonas gingivalis Induces Insulin Resistance by Increasing BCAA Levelsin Mice，Journal of Dental Research，2020,Vol.99(7)839-846等)、变异链球菌UA159
细胞：MC38小鼠结肠癌细胞(获自中山大学光华口腔医学院王智课题组)
动物：C57BL6J-APCmin/+小鼠(购自上海南方模式生物中心)、C57 BL6J小鼠(购自中山大学东校区动物中心)
抗体：抗牙龈卟啉单胞菌RgpB一抗(获自悉尼大学)、山羊抗鼠DAB二抗(商购)、羊抗鼠的Alexa Fluor 594
引物及探针：
扩增牙龈卟啉单胞菌特异性基因RgpB序列的引物序列：5’-3’F:TGCAAACCCATCACCTTCAAGAC；R:TCCTTGCTTCTCTTCCTCGGT。
RgpB序列TaqMan探针序列：TGCACAAGGCACAACGCAACAGGGCA。
荧光原位杂交探针(POGI)序列：CAATACTCGTATCGCCCGTTATTC。
细菌接种：小鼠用108CFU的细菌灌胃、瘤内注射或口饲，具体参见实施例。
免疫荧光和切片制备：将固定的组织切片封闭后，用荧光标记抗体或荧光标记探针孵育，然后用荧光显微镜观察并且成像分析，具体参见实施例。
荧光定量PCR：设计并合成PCR引物和探针；配制反应体系(包括DNA、上下游引物、TaqMan探针、灭菌水、2×TAKARA Premix Ex Taq)；进行PCR反应(扩增条件：95℃5min；95℃10sec；60℃20sec；72℃30sec，35cycles；溶解曲线分析：95℃5sec；65℃1min；97℃5min；40℃10sec至冷却)。
Western Blot：将待检测细胞裂解，收集裂解液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上，再用特异性抗体检测。
实施例1：牙龈卟啉单胞菌的促小鼠结直肠癌作用研究。
实验方法：
(1)取浓度为109CFU/mL的牙龈卟啉单胞菌33277株或W83加入到含105/mL的MC38小鼠结肠癌细胞的培养基中，每1mL细胞培养基加入10μL菌液，使MOI＝1:100，然后共培养24h；
(2)取出共培养后的培养皿，弃去上清，PBS洗涤3次，然后用4％多聚甲醛溶液固定15min，取部分制作超薄切片，电镜下观察；
(3)其余样本固定后用EDTA抗原修复液进行抗原修复，然后用山羊血清封闭；
(4)将一抗小鼠源抗牙龈卟啉单胞菌RgpB抗体滴在组织切片上，4℃湿盒孵育过夜；
(5)将二抗羊抗鼠的Alexa Fluor 594滴在组织切片上，常温避光孵育30min；
(6)用DAPI常温孵育15min进行核染，然后用荧光显微镜观察。
实验结果：
(1)牙龈卟啉单胞菌与结直肠癌MC38细胞共培养24h后，免疫荧光结果显示，牙龈卟啉单胞菌33277和W83(红色荧光)位于细胞核(蓝色荧光)(白色箭头所示)周围，表现为红色点状或云雾状影像(图1，在黑白色系的照片中红色荧光是高光的部分，蓝色荧光是相对低光的部分)，说明牙龈卟啉单胞菌与MC38共培养能够定植于细胞。
(2)电镜观察发现细菌可以定植于细胞胞浆内部，细菌表现为胞浆内圆形颗粒状影像(图2)。
实施例2：APCmin/+小鼠自发成瘤模型构建
实验方法：选用了40只6周龄的结直肠自发成瘤APCmin/+小鼠，分成四组，每组10只小鼠，四个组分别为：P.g 33277组、P.g W83组、阴性对照组、空白对照组。小鼠每2天以牙龈卟啉单胞菌33277、牙龈卟啉单胞菌W83、变异链球菌UA159以及培养基BHI灌胃(108CFU)，持续8周，取样观察。将长有结直肠腺瘤的结肠样本制作成瑞士卷石蜡切片，进行苏木素-伊红(H&E)染色观察，可见局部表现出结直肠腺瘤的病理特征。将各组的腺瘤取出固定制作石蜡切片，进行免疫组化和荧光原位杂交染色观察。提取结直肠腺瘤中的DNA，用荧光定量PCR方法检测牙龈卟啉单胞菌特异性基因RgpB的表达量以确定牙龈卟啉单胞菌含量。
实验结果：
(1)牙龈卟啉单胞菌33277组结直肠腺瘤生成数量和体积均高于空白对照组，差异有统计学意义；牙龈卟啉单胞菌W83组结直肠腺瘤数量较空白对照组多，但差异没有统计学意义；变异链球菌灌胃的阴性对照组与空白对照亦没有统计学差异(图3中B)。
(2)免疫组化和荧光原位杂交染色观察可见，牙龈卟啉单胞菌的检出与小鼠体内腺瘤生成结果相一致，牙龈卟啉单胞菌33277表现出比对照组更高的检出率，而W83与对照组相比也有统计学差异，但是在组织中的含量低于33277(图4A，4B)。
(3)PCR检测发现牙龈卟啉单胞菌33277的细菌检出率高于对照组，且W83的细菌含量增多趋势没有33277明显(图5)。
表明牙龈卟啉单胞菌具有早期促进结直肠肿瘤发生发展的作用。
实施例3：C57小鼠直肠黏膜下成瘤模型构建
实验方法：选用了15只6周龄的C57小鼠，分成三组，每组5只小鼠，每只小鼠直肠黏膜下注射5×105MC38细胞，三个组分别为：P.g 33277组、P.g W83组、空白对照组。小鼠每2天以牙龈卟啉单胞菌33277、牙龈卟啉单胞菌W83、以及培养基BHI灌胃(108CFU)，持续3周，处死小鼠，解剖出直肠黏膜下原位移植瘤，测量每个肿瘤的重量。取部分样本多聚甲醛固定，制作石蜡切片待免疫组化和荧光原位杂交。提取肿瘤中的DNA，用荧光定量PCR方法检测牙龈卟啉单胞菌特异性基因RgpB的表达量以确定牙龈卟啉单胞菌含量。
实验结果：
(1)经牙龈卟啉单胞菌灌胃的直肠黏膜下原位移植瘤小鼠的肿瘤3周后肿瘤重量显著高于对照组，而W83组与对照组相比则没有统计学差异(图6)。
(2)免疫组化和荧光原位杂交检测可见，牙龈卟啉单胞菌33277组和W83组的小鼠腺瘤的牙龈卟啉单胞菌有显著差异，并且显著高于对照组，且33277组细菌在肿瘤的定植多于W83组(图7A，7B)。
(3)PCR检测结果显示33277组细菌含量高于W83组且有统计学差异(图8)。
实施例4：C57小鼠腋前皮下成瘤模型构建
实验方法：选用了15只6周龄的C57小鼠，分成三组，每组5只小鼠，每只小鼠腋前皮下注射5×105MC38细胞，三个组分别为：P.g 33277组、P.g W83组、空白对照组。小鼠每2天以牙龈卟啉单胞菌33277、牙龈卟啉单胞菌W83、以及培养基瘤内注射(108CFU)，持续3周后，处死小鼠，解剖出腋前皮下肿瘤，测量每个肿瘤的重量。
实验结果：牙龈卟啉单胞菌33277组和W83组小鼠的肿瘤重量和体积均与对照组有显著差异(图9)。
实验例3、4均表明消化道来源的牙龈卟啉单胞菌能定植于中晚期结直肠癌且发挥促进结直肠癌发展的作用。
实施例5：FITC标记牙龈卟啉单胞菌的癌组织黏附能力测定
实验方法：将牙龈卟啉单胞菌33277和W83两种菌株分别在厌氧环境下加FITC处理，洗净后将细菌重悬液(109CFU/ml)常温下滴加到结直肠癌石蜡切片组织上，于厌氧环境下常温孵育30min，PBS洗涤后，加DAPI常温孵育15min，而后用荧光显微镜观察，Image J测量绿色荧光面积并进行统计学分析。
实验结果：牙龈卟啉单胞菌33277表现出比W83更大的绿色荧光面积，且有统计学差异(图10)。
实施例6：小鼠直肠黏膜下成瘤模型中肿瘤组织的转录组测序分析
根据实施例3的方法构建小鼠直肠黏膜下成瘤模型，取牙龈卟啉单胞菌33277和对照组的直肠粘膜下成瘤小鼠肿瘤样本，提取RNA进行DNA文库构建，然后进行测序。所述工作由北京博奥晶典生物技术有限公司协助完成。
获得测序原始数据后，使用StringTie软件进行表达量分析，利用geometric方法对基因和转录本的表达进行标准化，基因表达水平以每百万测序片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目(Fragments Per Kilo bases per Million fragments,FPKM)表示，并对数标准化为log2FC，log2FC>1定义为高表达而log2FC<1定义为低表达。根据log2FC将测序结果进行统计学分析，获得差异基因(P<0.05)，差异基因进一步用DAVID数据库用于生物信息学分析。
测序结果表明：将33277组和对照组比较，共存在2887个差异表达基因，其中有1632个基因高表达以及1255个基因低表达，根据GO数据库对差异基因的功能进行归类，选取生物过程、细胞结构、分子功能三个大类各自的前20的条目进行观察，发现生物过程相关的功能改变中，突触传导、信号转导、二型免疫应答等功能发生显著变化，其中二型免疫应答可能与牙龈卟啉单胞菌的定植以及促癌作用有关；在细胞结构的改变中，主要表现为细胞外基质的改变和胞浆内细胞器膜的改变，细胞外基质的改变可能与牙龈卟啉单胞菌产生大量蛋白水解酶和胶原酶等毒力因子相关，而胞浆内细胞器膜的改变可能与细菌胞内定植的机制有关；而分子功能改变中，改变的主要是各种不同类型的多肽酶和控制细胞生理功能的受体，这些分子功能的改变可能与细菌定植引起的促癌作用有关。值得注意的是，由于牙龈卟啉单胞菌胞内定植的特性，在GO功能互作分析中，胞浆改变尽管和胞外基质同样显著，但改变的复杂程度要明显大于胞外基质。
发明人基于KEGG数据库对差异基因具体富集的信号通路进行分析，从KEGG分类大标签的整体观发现，除了信号转导、信号分子等概念较宽泛的标签外，改变最多的通路是癌相关通路，有40个，这些通路的改变可能是牙龈卟啉单胞菌促癌的主要原因；而在细胞生物学过程的标签中，变化最显著的是细胞运输和分解代谢过程以及真核细胞间信号交流，各有14条信号通路改变，其中的细胞运输和分解代谢过程的改变可能与牙龈卟啉单胞菌胞内定植有关。将KEGG分析结果得到的所有有差异的通路根据差异由大到小进行排序，对前20位变化显著的信号通路进行观察，结果显示，MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路分别位列第三和第四，由于二者是经典的肿瘤相关信号通路，因此基本可以认为，牙龈卟啉单胞菌33277定植于结直肠癌细胞后，通过激活MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路来产生促癌作用。发明人在分析中发现，钙离子相关通路差异表达也富集(图11)，而钙离子相关的信号通路常与内质网应激相关，而且内质网应激能够通过多种途径促进细胞自噬，与自噬密切相关。因而，推测牙龈卟啉单胞菌可能引起结直肠癌细胞的内质网应激，从而促进自噬小体形成，实现胞内定植。
实施例7：牙龈卟啉单胞菌诱导内质网应激
实验方法：三组MC38细胞分别以牙龈卟啉单胞菌33277、W83、KDP132(RgpB基因缺失突变株)感染12h(MOI＝100:1)，未感染的细胞加入等体积PBS作为空白对照。再以加入内质网应激抑制剂4-PBA(终浓度7.5mM)的受三种细菌感染的细胞样本做对照，提取细胞蛋白进行Western Blot检测。
结果显示：小鼠结肠癌细胞MC38在与牙龈卟啉单胞菌12小时共培养后，p-PERK、BiP、CHOP这三种内质网应激标志蛋白的表达发生改变，其中33277组与对照组相比，p-PERK、BiP、CHOP表达均显著上调，而W83组和KDP132组也能引起蛋白p-PERK、BiP表达较对照组上调，但CHOP没有明显变化；在加入4-PBA内质网应激抑制剂后，只有33277组能够引起p-PERK蛋白表达水平的升高，且升高程度不如未加抑制剂实验中明显，其余各组均与对照无明显差异(图12)。提示牙龈卟啉单胞菌能够引起小鼠结肠癌细胞的内质网应激，内质网应激抑制剂4-PBA能够显著抑制牙龈卟啉单胞菌引起的内质网应激相关蛋白表达水平的升高。
实施例8：牙龈卟啉单胞菌通过激活内质网应激引起细胞自噬
实验方法：三组MC38细胞分别以牙龈卟啉单胞菌33277、W83、KDP132感染(MOI＝100:1)12h，未感染的细胞加入等体积PBS作为空白对照。再以加入内质网应激抑制剂4-PBA(终浓度7.5mM)的受三种细菌感染的细胞样本做对照，提取细胞蛋白进行Western Blot检测。
结果显示：33277组的P62蛋白表达水平显著高于对照组，说明33277菌株处理的结肠癌细胞P62蛋白降解受到抑制，而W83和KDP132菌株抑制P62降解的作用不如33277明显；33277组、W83组、KDP132组的LC3-II表达水平显著高于对照组，说明这几种菌株均有促进结肠癌细胞自噬的作用；另外，同样感染牙龈卟啉单胞菌33277菌株的条件下，4-PBA处理的结肠癌细胞的LC3-II表达水平显著低于无4-PBA处理组，说明内质网应激抑制剂能够阻断牙龈卟啉单胞菌33277引起的自噬(图13)。
细胞自噬是一套复杂的生理过程，是细胞实现“自我清除”和“抵抗入侵”的重要途径。细胞自噬始自自噬调控蛋白ATG等的激活，随后胞浆中游离的LC3I型蛋白发生剪切修饰成为具有活性形式的LC3II型蛋白，然后附着在内质网膜上，形成自噬小体，在这一过程发生的同时，为形成更多的自噬小体，LC3蛋白的表达亦发生升高。自噬小体大量形成后，细胞为清除被自噬小体包裹的物质，自噬小体将在胞浆蛋白P62的介导下与溶酶体结合形成自噬-溶酶体，此时P62蛋白也会随着与溶酶体的结合一同降解，最终通过胞吐作用排出细胞外。
由于KDP132菌株(RgpB基因缺失突变株)为33277遗传背景来源，因此33277菌株和KDP132菌株的表达差异仅有RgpB蛋白。实验结果表明，牙龈卟啉单胞菌在表达RgpB的情况下，能够上调自噬小体蛋白表达的同时减少P62蛋白的降解。结合自噬流荧光双标实验观察结果，发现P62蛋白降解减少是由于自噬小体和溶酶体结合过程受到抑制，自噬-溶酶体形成比例下降。而不表达RgpB的缺失突变株则不能减少P62蛋白降解，自噬-溶酶体形成比例升高，提示RgpB是抑制自噬小体和溶酶体结合的重要毒力因子。
实施例9：自噬诱导剂Rapamycin和自噬-溶酶体形成阻断剂BafilomycinA1诱导实验。
实验方法：六组MC38细胞分别加入PBS空白对照、Bafilomycin A1(终浓度1mM)、Bafilomycin A1(终浓度1mM)+Rapamycin(终浓度250nM)、Rapamycin(终浓度250nM)、牙龈卟啉单胞菌33277、牙龈卟啉单胞菌KDP132孵育(MOI＝100:1)12h，然后提取细胞蛋白进行Western Blot检测。
实验结果：仅加入Bafilomycin A1可以使自噬-溶酶体形成受阻，检测到的P62蛋白表达量轻度上调，但没有统计学差异；加入Rapamycin和BafilomycinA1时P62蛋白表达显著上调；仅加入Rapamycin时，P62表达水平比同时加入Rapamycin和BafilomycinA1的实验组更低；牙龈卟啉单胞菌33277同时具有促进自噬和阻断自噬-溶酶体结合作用，因此33277组的LC3-II、P62表达水平与对照组相比的变化趋势近似同时加入Rapamycin和BafilomycinA1的组；牙龈卟啉单胞菌KDP132仅具有促进自噬作用，不能阻断自噬-溶酶体结合，因此KDP132组的LC3-II、P62表达水平与对照组相比的变化趋势与加入Rapamycin而没有BafilomycinA1的组一致(图14)。通过对比33277组和KDP132组对自噬的不同阶段影响的差异可见，RgpB蛋白可能是牙龈卟啉单胞菌33277发挥抑制自噬-溶酶体形成的重要因子。
实施例10：牙龈卟啉单胞菌33277、KDP132感染对自噬流的影响
实验方法：使用LC3双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3，上海汉恒生物公司)感染MC38细胞，然后再以牙龈卟啉单胞菌33277、KDP132感染成功被腺病毒转染荧光基因的MC38细胞，激光共聚焦显微镜下观察并统计分析。
实验结果表明，两种牙龈卟啉单胞菌菌株感染均能使自噬小体和自噬-溶酶体总数显著增加，但33277组以自噬小体显著增加为主，KDP132组以自噬-溶酶体显著增加为主；从自噬-溶酶体占所有自噬体总量的比例来看，33277组的比例显著小于对照组，而KDP132组的比例显著大于对照组(图15)。
实施例11：牙龈卟啉单胞菌对PI3K/Akt和MAPK信号通路的影响
实验方法：将经过与牙龈卟啉单胞菌33277、W83、KDP132共培养12h的MC38细胞抽提蛋白，检测p-MEK、MEK、p-ERK、ERK、p-Akt308、p-Akt473、Akt的相对表达量。
实验结果：三种牙龈卟啉单胞菌菌株均能上调p-MEK、p-ERK表达水平，说明牙龈卟啉单胞菌能够激活MAPK通路，这可能是牙龈卟啉单胞菌促进肿瘤生长的分子机制；而p-Akt308、p-Akt473则表现为下调作用，说明牙龈卟啉单胞菌能够抑制Akt蛋白的磷酸化水平，降低PI3K-Akt信号通路的活性，这可能是其促进自噬小体形成的原因(图16)。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学附属口腔医院
<120> 靶向牙龈卟啉单胞菌RgpB在结直肠癌的治疗及预防中的应用
<130> GCPCN21410673
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 736
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 1
Met Lys Lys Asn Phe Ser Arg Ile Val Ser Ile Val Ala Phe Ser Ser
1 5 10 15
Leu Leu Gly Gly Met Ala Phe Ala Gln Pro Ala Glu Arg Gly Arg Asn
20 25 30
Pro Gln Val Arg Leu Leu Ser Ala Glu Gln Ser Met Ser Lys Val Gln
35 40 45
Phe Arg Met Asp Asn Leu Gln Phe Thr Asp Val Gln Thr Ser Lys Gly
50 55 60
Val Ala Gln Val Pro Thr Phe Thr Glu Gly Val Asn Ile Ser Glu Lys
65 70 75 80
Gly Thr Pro Ile Leu Pro Ile Leu Ser Arg Ser Leu Ala Val Ser Glu
85 90 95
Thr Arg Ala Met Lys Val Glu Val Val Ser Ser Lys Phe Ile Glu Lys
100 105 110
Lys Asp Val Leu Ile Ala Pro Ser Lys Gly Val Ile Ser Arg Ala Glu
115 120 125
Asn Pro Asp Gln Ile Pro Tyr Val Tyr Gly Gln Ser Tyr Asn Glu Asp
130 135 140
Lys Phe Phe Pro Gly Glu Ile Ala Thr Leu Ser Asp Pro Phe Ile Leu
145 150 155 160
Arg Asp Val Arg Gly Gln Val Val Asn Phe Ala Pro Leu Gln Tyr Asn
165 170 175
Pro Val Thr Lys Thr Leu Arg Ile Tyr Thr Glu Ile Val Val Ala Val
180 185 190
Ser Glu Thr Ala Glu Ala Gly Gln Asn Thr Ile Ser Leu Val Lys Asn
195 200 205
Ser Thr Phe Thr Gly Phe Glu Asp Ile Tyr Lys Ser Val Phe Met Asn
210 215 220
Tyr Glu Ala Thr Arg Tyr Thr Pro Val Glu Glu Lys Glu Asn Gly Arg
225 230 235 240
Met Ile Val Ile Val Ala Lys Lys Tyr Glu Gly Asp Ile Lys Asp Phe
245 250 255
Val Asp Trp Lys Asn Gln Arg Gly Leu Arg Thr Glu Val Lys Val Ala
260 265 270
Glu Asp Ile Ala Ser Pro Val Thr Ala Asn Ala Ile Gln Gln Phe Val
275 280 285
Lys Gln Glu Tyr Glu Lys Glu Gly Asn Asp Leu Thr Tyr Val Leu Leu
290 295 300
Val Gly Asp His Lys Asp Ile Pro Ala Lys Ile Thr Pro Gly Ile Lys
305 310 315 320
Ser Asp Gln Val Tyr Gly Gln Ile Val Gly Asn Asp His Tyr Asn Glu
325 330 335
Val Phe Ile Gly Arg Phe Ser Cys Glu Ser Lys Glu Asp Leu Lys Thr
340 345 350
Gln Ile Asp Arg Thr Ile His Tyr Glu Arg Asn Ile Thr Thr Glu Asp
355 360 365
Lys Trp Leu Gly Gln Ala Leu Cys Ile Ala Ser Ala Glu Gly Gly Pro
370 375 380
Ser Ala Asp Asn Gly Glu Ser Asp Ile Gln His Glu Asn Val Ile Ala
385 390 395 400
Asn Leu Leu Thr Gln Tyr Gly Tyr Thr Lys Ile Ile Lys Cys Tyr Asp
405 410 415
Pro Gly Val Thr Pro Lys Asn Ile Ile Asp Ala Phe Asn Gly Gly Ile
420 425 430
Ser Leu Val Asn Tyr Thr Gly His Gly Ser Glu Thr Ala Trp Gly Thr
435 440 445
Ser His Phe Gly Thr Thr His Val Lys Gln Leu Thr Asn Ser Asn Gln
450 455 460
Leu Pro Phe Ile Phe Asp Val Ala Cys Val Asn Gly Asp Phe Leu Phe
465 470 475 480
Ser Met Pro Cys Phe Ala Glu Ala Leu Met Arg Ala Gln Lys Asp Gly
485 490 495
Lys Pro Thr Gly Thr Val Ala Ile Ile Ala Ser Thr Ile Asn Gln Ser
500 505 510
Trp Ala Ser Pro Met Arg Gly Gln Asp Glu Met Asn Glu Ile Leu Cys
515 520 525
Glu Lys His Pro Asn Asn Ile Lys Arg Thr Phe Gly Gly Val Thr Met
530 535 540
Asn Gly Met Phe Ala Met Val Glu Lys Tyr Lys Lys Asp Gly Glu Lys
545 550 555 560
Met Leu Asp Thr Trp Thr Val Phe Gly Asp Pro Ser Leu Leu Val Arg
565 570 575
Thr Leu Val Pro Thr Glu Met Gln Val Thr Ala Pro Ala Asn Ile Ser
580 585 590
Ala Ser Ala Gln Thr Phe Glu Val Ala Cys Asp Tyr Asn Gly Ala Ile
595 600 605
Ala Thr Leu Ser Asp Asp Gly Asp Met Val Gly Thr Ala Ile Val Lys
610 615 620
Asp Gly Lys Ala Ile Ile Lys Leu Asn Glu Ser Ile Ala Asp Glu Thr
625 630 635 640
Asn Leu Thr Leu Thr Val Val Gly Tyr Asn Lys Val Thr Val Ile Lys
645 650 655
Asp Val Lys Val Glu Gly Thr Ser Ile Ala Asp Val Ala Asn Asp Lys
660 665 670
Pro Tyr Thr Val Ala Val Ser Gly Lys Thr Ile Thr Val Glu Ser Pro
675 680 685
Ala Ala Gly Leu Thr Ile Phe Asp Met Asn Gly Arg Arg Val Ala Thr
690 695 700
Ala Lys Asn Arg Met Val Phe Glu Ala Gln Asn Gly Val Tyr Ala Val
705 710 715 720
Arg Ile Ala Thr Glu Gly Lys Thr Tyr Thr Glu Lys Val Ile Val Lys
725 730 735
<210> 2
<211> 2211
<212> DNA
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 2
ttacttcact ataacctttt ctgtatacgt cttgccttca gtagcgatgc gaacggcata 60
cacgccgttt tgtgcttcga ataccatgcg gttcttagca gtagctacac gacggccgtt 120
catatcgaag atcgtcagcc cggcagcagg actttctaca gttatcgtct tacctgatac 180
agctacagta taaggcttat cattggctac gtcggcaata gatgtacctt ccactttcac 240
atcctttatc acagtaacct tattgtatcc tactacggtg agcgtcaagt tcgtttcatc 300
agcgatactc tcatttaatt tgatgatagc cttaccgtct ttcacgatag cagtgccgac 360
catatcacca tcgtcagaga gcgtagcgat agcaccgtta tagtcgcaag ctacttcgaa 420
tgtctgtgca gaggcagaga tatttgccgg agccgtaacc tgcatttcgg tcgggacaag 480
tgtacgaacg agcagcgagg ggtcgccgaa tacagtccat gtgtcgagca tcttctcacc 540
atccttttta tacttttcca ccatagcaaa cataccgttc atggtgacac caccgaaagt 600
acgcttgatg ttgttcgggt gtttttcgca cagaatttcg ttcatctcat cctgcccgcg 660
cataggagaa gcccaagact ggttgatcgt agacgctatg atagcaacag tacctgtcgg 720
cttaccatct ttttgtgcac gcatcagggc ttctgcgaag caaggcatgc tgaataggaa 780
atcgccattc acacaagcta cgtcgaaaat aaacggtagc tggttgctgt tggtaagctg 840
cttcacatga gtggtgccga agtgagacgt accccaagct gtttcgctac cgtggcccgt 900
atagttgacc aacgagattc ctccgttgaa agcatcaata atgtttttag gagttactcc 960
cggatcataa catttgataa tcttggtata gccatactgg gtaagcagat tggcgattac 1020
attctcatgc tggatatcac tttcaccatt gtctgcggat gggcctcctt cagccgaagc 1080
aatacaaaga gcctgaccga gccatttgtc ttccgtggtt atattgcgct catagtgaat 1140
agtccgatcg atttgtgtct tcagatcctc tttgctctca catgagaaac gaccgatgaa 1200
gacttcgttg tagtggtcat tacctactat ttgtccatat acctggtcgg atttgatccc 1260
cggagtaatt ttggcaggaa tatctttgtg atcgccaacc aaaagaacat aggtcaaatc 1320
attaccttct ttctcgtatt cttgcttaac gaactgctga atagcattag ctgtaacggg 1380
agaagcaata tcttctgcca ctttcacctc ggtacggaga ccgcgttggt ttttccaatc 1440
aacgaaatct ttaatatctc cctcatactt tttggctacg atgacgatca tacgaccatt 1500
ctccttttct tcaacaggcg tatagcgcgt agcttcataa ttcatgaaga cgctcttata 1560
gatatcttcg aagcctgtga aagtgctgtt cttaaccaag ctaatcgtat tctggcccgc 1620
ttcagctgtt tcgctcacag ctacaacgat ttccgtatag atgcggaggg tctttgtaac 1680
agggttatac tggagcggag caaagtttac tacctgacca cgtacatcac gcaggatgaa 1740
aggatcgctc agcgtagcga tttcgcccgg gaagaacttg tcttcattat agctctgtcc 1800
gtacacgtag gggatttgat caggattttc agcgcgagag ataacacctt tagagggagc 1860
gatcagcaca tccttctttt cgatgaattt ggaagaaact acctctacct tcatcgcacg 1920
tgtttcagaa acggcaagag aacgggaaag aatgggcaat ataggcgtac ctttctccga 1980
gatattgaca ccttcggtga aggtaggcac ctgagctacc cctttggagg tctgtacgtc 2040
tgtgaactga agattgtcca tacggaattg caccttggac atagactgct cagcggagag 2100
cagtcgtact tgtgggttgc gaccgcgctc tgccggctgt gcaaacgcca ttcctcccaa 2160
cagagaggag aatgctacga tcgaaacgat cctgctaaaa ttctttttca t 2211

Claims (9)

1.RgpB抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，优选所述RgpB抑制剂选自抑制RgpB蛋白质表达水平或RgpB蛋白活性的抑制剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制RgpB蛋白质表达水平的抑制剂是RgpB基因的反义核酸序列、干扰序列，或者抑制RgpB基因转录的蛋白质、多肽、酶、小分子化合物，或者抑制RgpB基因的mRNA翻译成蛋白质的蛋白质、多肽、小分子化合物，优选，所述抑制剂是siRNA。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制RgpB蛋白活性的抑制剂是蛋白RgpB的抗体、抑制RgpB蛋白质活性的小分子化合物，优选为蛋白RgpB的单克隆抗体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌。
5.一种筛选抗肿瘤药物的方法，所述方法包括以RgpB基因或蛋白RgpB为靶标筛选RgpB抑制剂，所述RgpB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述筛选药物的方法是在体外进行的，包括以下步骤：
1)将受试化学物质与RgpB基因或蛋白RgpB混合，或者将受试化学物质与表达RgpB的细胞混合；
2)检测所编码蛋白的活性变化、或者受试化学物质是否与所述基因或其编码的蛋白结合、或者所述细胞的RgpB基因或蛋白表达量的变化。
7.根据权利要求5-6任一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌。
8.RgpB基因或蛋白RgpB在筛选抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述RgpB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌。
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