JP2023509156A - Ｃｃｌ２８走化性経路を遮断することによる胃がんの治療方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＣＣＬ２８走化性経路を遮断することによる胃がんの治療方法を提供する。具体的には、ＣＣＬ２８遺伝子またはＣＣＬ２８タンパク質の用途を提供し、胃がんを検出するための試薬またはキットの調製に使用され、前記胃がんは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路およびケモカインＣＣＬ２８関連分子の発現が同時に異常にアップレギュレートされる胃がんである。同時に、本発明は、検出キット、医薬組成物の用途、およびインビボおよびインビトロでの癌細胞の成長を阻害するための方法を提供する。【選択図】なし
Description
［技術分野］
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的には、本発明は、ＣＣＬ２８走化性経路を遮断することによる胃がんの治療方法に関する。
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的には、本発明は、ＣＣＬ２８走化性経路を遮断することによる胃がんの治療方法に関する。
［背景技術］
急速に発展する免疫療法は、無数の癌患者に希望をもたらした。胃がんの分子特徴は、胃がんのＥＢＶ関連サブタイプがＰＤ－Ｌ１発現の上昇を示したことを表し、抗ＰＤ免疫治療がこれらの患者に有効である可能性があることを示唆する。しかしながら、黒色腫および肺がんに比較して、胃がんの免疫微小環境および分子メカニズムの複雑さのために、胃がんにおけるこれらの免疫療法の発展は、多くの実際的な困難に直面している。腫瘍の免疫回避メカニズムも、また腫瘍の免疫治療の主要な障害である。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、腫瘍の免疫回避に関与する重要な免疫阻害型細胞のクラスである。その増加は、抗腫瘍のエフェクター免疫細胞の機能および数の減少を引き起こす同時に、腫瘍の免疫治療または他の療法の有効性の弱体化さらには喪失につながることもできる。長期に胃がんを罹患している患者および他の免疫治療を受けている患者にとっては、自己免疫不全およびそれに由来する疾患が致死になる重要な原因である。
急速に発展する免疫療法は、無数の癌患者に希望をもたらした。胃がんの分子特徴は、胃がんのＥＢＶ関連サブタイプがＰＤ－Ｌ１発現の上昇を示したことを表し、抗ＰＤ免疫治療がこれらの患者に有効である可能性があることを示唆する。しかしながら、黒色腫および肺がんに比較して、胃がんの免疫微小環境および分子メカニズムの複雑さのために、胃がんにおけるこれらの免疫療法の発展は、多くの実際的な困難に直面している。腫瘍の免疫回避メカニズムも、また腫瘍の免疫治療の主要な障害である。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、腫瘍の免疫回避に関与する重要な免疫阻害型細胞のクラスである。その増加は、抗腫瘍のエフェクター免疫細胞の機能および数の減少を引き起こす同時に、腫瘍の免疫治療または他の療法の有効性の弱体化さらには喪失につながることもできる。長期に胃がんを罹患している患者および他の免疫治療を受けている患者にとっては、自己免疫不全およびそれに由来する疾患が致死になる重要な原因である。
従って、副作用を低減しながら難治性胃がんに対する効果的な治療スキームが当技術分野で緊急に必要とされる。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明の目的は、副作用を低減しながら難治性胃がんに対する効果的な治療スキームを提供することである。
［課題を解決するための手段］
［課題を解決するための手段］
本発明の第１の態様は、ＣＣＬ２８遺伝子またはＣＣＬ２８タンパク質またはその検出試薬の用途を提供し、胃がんを検出するための試薬またはキットの調製に使用され、前記胃がんは、Ｗｎｔ／β－カテニン（ｃａｔｅｎｉｎ）シグナル伝達経路およびケモカインＣＣＬ２８関連分子の発現が同時に異常にアップレギュレートされる胃がんである。
別の好ましい例において、前記胃がんの病理学的症状は、
（１）胃組織におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路関連発現のアップレギュレーション、
（２）胃組織におけるケモカインＣＣＬ２８関連発現のアップレギュレーション、
（３）胃腫瘍、
（４）胃壁細胞の喪失、および
（５）胃組織制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増加からなる群から選択される一つまたは複数の病理学的症状を有する。
（１）胃組織におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路関連発現のアップレギュレーション、
（２）胃組織におけるケモカインＣＣＬ２８関連発現のアップレギュレーション、
（３）胃腫瘍、
（４）胃壁細胞の喪失、および
（５）胃組織制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増加からなる群から選択される一つまたは複数の病理学的症状を有する。
別の好ましい例において、前記胃がんの病理学的症状は、体の免疫応答の低下をさらに含む。
別の好ましい例において、前記胃がんは、ｉｎｓｉｔｕ胃がん、腸型胃がんおよびびまん性胃がんを含む。
別の好ましい例において、前記胃がんは、ｉｎｓｉｔｕ胃がん、腸型胃がんおよびびまん性胃がんを含む。
別の好ましい例において、前記胃がんは、ヘリコバクターピロリ陰性の胃がんを含む。
別の好ましい例において、前記胃組織は、胃がん腫瘍組織、胃の傍がん性組織、またはその組み合わせを含む。
別の好ましい例において、前記胃組織は、胃がん腫瘍組織、胃の傍がん性組織、またはその組み合わせを含む。
別の好ましい例において、前記Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路関連発現は、転写因子ＴＣＦ１の発現レベル、転写因子ＴＣＦ４の発現レベル、β－カテニンの含有量、β－カテニン核異所性レベル、β－カテニン／ＴＣＦ４複合体の転写活性、ＧＳＫ３βリン酸化レベルまたはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ケモカインＣＣＬ２８関連分子は、ＣＣＬ２８遺伝子（ゲノムのヌクレオチド配列、ｃＤＮＡ配列、および／またはｍＲＮＡを含む）、ＣＣＬ２８受容体の遺伝子（ゲノムのヌクレオチド配列、ｃＤＮＡ配列、および／またはｍＲＮＡを含む）、ＣＣＬ２８タンパク質、ＣＣＬ２８受容体タンパク質、またはその組み合わせを含む。
別の好ましい例において、前記ＣＣＬ２８の受容体は、ＣＣＲ３、および／またはＣＣＲ１０を含む。
別の好ましい例において、前記キットは、ＣＣＬ２８関連分子のタンパク質またはｍＲＮＡに対して定量的に検出するための試薬および対応するラベルまたは説明書を含む。
別の好ましい例において、前記キットは、ＣＣＬ２８関連分子のタンパク質またはｍＲＮＡに対して定量的に検出するための試薬および対応するラベルまたは説明書を含む。
別の好ましい例において、前記試薬は、ＣＣＬ２８関連分子の特異的プライマー、特異性抗体、プローブおよび／またはチップを含む。
別の好ましい例において、上記の試薬は、核酸チップおよびタンパク質チップ等の検出用チップを含む。
別の好ましい例において、上記の試薬は、核酸チップおよびタンパク質チップ等の検出用チップを含む。
別の好ましい例において、前記核酸チップは、基片および基片上にスポットされた癌関連遺伝子の特異的オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記癌関連遺伝子の特異的オリゴヌクレオチドプローブは、ＣＣＬ２８関連遺伝子またはｍＲＮＡに特異的に結合するプローブを含む。
別の好ましい例において、前記タンパク質チップは、基片および基片上にスポットされた癌関連タンパク質の特異性抗体を含み、前記癌関連タンパク質の特異性抗体は、抗ＣＣＬ２８関連タンパク質の特異性抗体を含む。
別の好ましい例において、前記ＣＣＬ２８関連タンパク質は、融合タンパク質および非融合タンパク質を含む。
別の好ましい例において、前記試薬またはキットには、標準品としてのＣＣＬ２８遺伝子（または核酸分子）またはＣＣＬ２８タンパク質が含まれる。
別の好ましい例において、前記試薬またはキットには、標準品としてのＣＣＬ２８遺伝子（または核酸分子）またはＣＣＬ２８タンパク質が含まれる。
別の好ましい例において、前記ＣＣＬ２８遺伝子（または核酸分子）またはＣＣＬ２８タンパク質は、野生型および／または突然変異型を含む。
別の好ましい例において、前記試薬またはキットには、ＣＣＬ２８遺伝子またはＣＣＬ２８タンパク質を検出するための検出試薬が含まれる。
別の好ましい例において、前記試薬またはキットには、ＣＣＬ２８遺伝子またはＣＣＬ２８タンパク質を検出するための検出試薬が含まれる。
本発明の第２の態様は、胃がんを検出するためのキットを提供し、前記キットには、容器が含まれ、前記容器には、ＣＣＬ２８関連タンパク質またはｍＲＮＡを検出するための検出試薬、およびラベルまたは説明書が含まれ、前記ラベルまたは説明書には、前記キットが胃がんの検出に使用されることが記載される。
別の好ましい例において、前記胃がんは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路およびケモカインＣＣＬ２８関連分子の発現が同時に異常にアップレギュレートされる胃がんである。
別の好ましい例において、前記ラベルまたは説明書に記載される内容は、以下からなる群から選択され、
ａ）傍がん性組織におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量Ａ０に対する被験対象のＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量Ａ１の比率（Ａ１／Ａ０）が≧２である場合、当該被験対象が胃がんに罹患する確率が普通人群よりも高いことを示し、
ｂ）傍がん性組織におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量に対する被験対象におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量の比率Ａ１／Ａ０が≧２である場合、当該Ａ１／Ａ０比が高いほど、前記被験対象の胃がんの悪性の程度がより高いことを示し、および
ｃ）傍がん性組織におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量に対する被験対象におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量の比率Ａ１／Ａ０が≧２である場合、当該Ａ１／Ａ０比が高いほど、前記被験対象の胃がんの予後がより悪く、転移率がより高いことを示す。
ａ）傍がん性組織におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量Ａ０に対する被験対象のＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量Ａ１の比率（Ａ１／Ａ０）が≧２である場合、当該被験対象が胃がんに罹患する確率が普通人群よりも高いことを示し、
ｂ）傍がん性組織におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量に対する被験対象におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量の比率Ａ１／Ａ０が≧２である場合、当該Ａ１／Ａ０比が高いほど、前記被験対象の胃がんの悪性の程度がより高いことを示し、および
ｃ）傍がん性組織におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量に対する被験対象におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量の比率Ａ１／Ａ０が≧２である場合、当該Ａ１／Ａ０比が高いほど、前記被験対象の胃がんの予後がより悪く、転移率がより高いことを示す。
別の好ましい例において、前記検出試薬は、特異的プライマー、特異性抗体、プローブおよび／またはチップを含む。
別の好ましい例において、前記キットは、ｅｘｖｉｖｏでのヒト腫瘍組織サンプルまたは血液サンプルを検出するために使用される。
別の好ましい例において、前記キットは、ｅｘｖｉｖｏでのヒト腫瘍組織サンプルまたは血液サンプルを検出するために使用される。
別の好ましい例において、前記腫瘍組織サンプルは、胃がんサンプルである。
本発明の第３の態様は、ＣＣＬ２８阻害剤の用途を提供し、癌細胞の成長または増殖を阻害するための医薬組成物を調製するために、または胃がんを治療するための医薬組成物を調製するために、前記胃がんは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路およびケモカインＣＣＬ２８関連分子の発現が同時に異常にアップレギュレートされる胃がんである。
本発明の第３の態様は、ＣＣＬ２８阻害剤の用途を提供し、癌細胞の成長または増殖を阻害するための医薬組成物を調製するために、または胃がんを治療するための医薬組成物を調製するために、前記胃がんは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路およびケモカインＣＣＬ２８関連分子の発現が同時に異常にアップレギュレートされる胃がんである。
別の好ましい例において、前記阻害剤は、ＣＣＬ２８および／またはその受容体タンパク質を標的とする抗体または小分子阻害剤、ＣＣＬ２８および／またはその受容体遺伝子を標的とする標的核酸分子または遺伝子エディター、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ＣＣＬ２８の受容体は、ＣＣＲ３、および／またはＣＣＲ１０を含む。
別の好ましい例において、前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、抗体コンジュゲート、小分子抗体、抗体融合タンパク質、およびその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、抗体コンジュゲート、小分子抗体、抗体融合タンパク質、およびその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記小分子抗体は、単鎖抗体ＳｃＦｖ、Ｆａｂ抗体、Ｆｖフラグメント、およびその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ＳｃＦｖ抗体は、治療用細胞で発現（過剰発現を含む）される分泌型単鎖抗体を含む。
別の好ましい例において、前記ＳｃＦｖ抗体は、治療用細胞で発現（過剰発現を含む）される分泌型単鎖抗体を含む。
別の好ましい例において、前記治療用細胞は、間葉系幹細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。
別の好ましい例において、前記ベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルス等の哺乳動物細胞ウイルス、逆転写ウイルス、または他のベクターを含む。
別の好ましい例において、前記ベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルス等の哺乳動物細胞ウイルス、逆転写ウイルス、または他のベクターを含む。
別の好ましい例において、前記阻害剤は、植物抽出物阻害剤、小分子化合物阻害剤、核酸阻害剤、ペプチド阻害剤、多糖類阻害剤、ウイルスベクター阻害剤、リポソームベクター阻害剤、またはナノ粒子ベクター阻害剤からなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、他のＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路阻害剤をさらに含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、腫瘍組織における異常なＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の活性化を相乗的に阻害することができる。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、腫瘍組織における異常なＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の活性化を相乗的に阻害することができる。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、腫瘍組織への制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の浸潤を阻害し、同時に末梢免疫の活性を増強することができる。
本発明の第４の態様は、癌細胞の成長または増殖を阻害するためのインビトロでの非治療的方法を提供し、ＣＣＬ２８阻害剤の存在下で、癌細胞を培養することにより、癌細胞の成長または増殖を阻害する段階を含む。
本発明の第４の態様は、癌細胞の成長または増殖を阻害するためのインビトロでの非治療的方法を提供し、ＣＣＬ２８阻害剤の存在下で、癌細胞を培養することにより、癌細胞の成長または増殖を阻害する段階を含む。
別の好ましい例において、前記方法は、癌細胞の培養系にＣＣＬ２８関連分子阻害剤を添加することにより、癌細胞の成長または増殖を阻害する段階を含む。
別の好ましい例において、前記癌細胞は、胃がん細胞である。
別の好ましい例において、前記癌細胞は、胃がん細胞である。
別の好ましい例において、前記胃がん細胞は、ＡＧＳ細胞株、ＳＣ７９０１細胞株、ＡＺ－５２１細胞株、原発性胃がん細胞、またはその組み合わせから選択される。
本発明の第５の態様は、癌を治療するための候補化合物をスクリーニングする方法を提供し、
（ａ）試験群において、試験化合物を細胞の培養系に添加し、試験群の前記細胞におけるＣＣＬ２８関連分子の発現量および／または活性を観察し、対照群において、試験化合物を同じ細胞の培養系に添加せず、対照群の前記細胞におけるＣＣＬ２８関連分子の発現量および／または活性を観察する段階を含み、
ここで、試験群の細胞におけるＣＣＬ２８関連分子の発現量および／または活性が対照群よりも低い場合、これは、当該試験化合物がＣＣＬ２８関連分子の発現および／または活性に対して阻害効果を有する癌治療の候補化合物であることを表す。
本発明の第５の態様は、癌を治療するための候補化合物をスクリーニングする方法を提供し、
（ａ）試験群において、試験化合物を細胞の培養系に添加し、試験群の前記細胞におけるＣＣＬ２８関連分子の発現量および／または活性を観察し、対照群において、試験化合物を同じ細胞の培養系に添加せず、対照群の前記細胞におけるＣＣＬ２８関連分子の発現量および／または活性を観察する段階を含み、
ここで、試験群の細胞におけるＣＣＬ２８関連分子の発現量および／または活性が対照群よりも低い場合、これは、当該試験化合物がＣＣＬ２８関連分子の発現および／または活性に対して阻害効果を有する癌治療の候補化合物であることを表す。
別の好ましい例において、前記細胞は、癌細胞または正常細胞を含む。
別の好ましい例において、前記細胞は、胃がん細胞または胃細胞である。
別の好ましい例において、前記方法は、
（ｂ）段階（ａ）で得られた候補化合物に対して、癌細胞の成長または増殖に対する阻害効果をさらに試験する段階をさらに含む。
別の好ましい例において、前記細胞は、胃がん細胞または胃細胞である。
別の好ましい例において、前記方法は、
（ｂ）段階（ａ）で得られた候補化合物に対して、癌細胞の成長または増殖に対する阻害効果をさらに試験する段階をさらに含む。
別の好ましい例において、前記段階（ｂ）は、試験群において、癌細胞の培養系に試験化合物を添加し、癌細胞の数および／または成長状況を観察し、対照群において、癌細胞の培養系に試験化合物を添加せず、癌細胞の数および／または成長状況を観察する段階をさらに含み、ここで、試験群の癌細胞の数または成長速度が対照群よりも少ない場合、それは、当該試験化合物が癌細胞の成長または増殖に対して阻害効果を有する癌を治療するための候補化合物であることを表す。
本発明の第６の態様は、胃がんを阻害または治療するための方法を提供し、治療を必要とする対象（哺乳動物）に安全かつ有効量のＣＣＬ２８関連分子阻害剤を投与する段階を含み、前記胃がんは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路およびケモカインＣＣＬ２８関連分子の発現が同時に異常にアップレギュレートされる胃がんである。
［発明の効果］
［発明の効果］
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
本発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究の後、Ｗｎｔ／β－カテニンが胃がん細胞におけるＣＣＬ２８の発現をアップレギュレートし、それによって腫瘍内の制御性Ｔ細胞を増加させることを初めて予期せずに発見した。ＣＣＬ２８走化性経路を遮断する方法を使用すると、腫瘍内の制御性Ｔ細胞の浸潤を非常に効果的に減少させ、かつ腫瘍の発展を阻害することができる。さらなる研究により、このような治療効果は、胃がんモデルにのみ適用され、黒色腫および乳がんなどの他の固形腫瘍には有意な効果がないことが分かる。
これに基づいて、本発明者らは、本発明を完成させた。
これに基づいて、本発明者らは、本発明を完成させた。
用語の説明
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書に使用されるように、具体的に記載された値に関連して使用される場合、「約」という用語は、当該値が記載された値から１％以下しか変化しない可能性があることを指す。例えば、本明細書に使用されるように、「約１００」という表現は、９９から１０１までの間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
本明細書に使用されるように、「含有」または「包括（含む）」という用語は、開放式、半閉鎖式および閉鎖式であり得る。言い換えれば、前記用語も、「基本的にからなる」、または「からなる」を含む。
ケモカインおよびＣＣＬ２８
ケモカインは、細胞の遊走を調節するサイトカインのクラスであり、腫瘍の微小免疫環境の構成及び腫瘍の発生と発展において重要な役割を果たす。
ケモカインは、細胞の遊走を調節するサイトカインのクラスであり、腫瘍の微小免疫環境の構成及び腫瘍の発生と発展において重要な役割を果たす。
Ｃ－Ｃモチーフケモカインリガンド２８（Ｃ－Ｃ ｍｏｔｉｆ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ２８、ＣＣＬ２８）は、５ｐ１２に位置し、８個のエクソンをコードする。ＣＣＬ２８は、その受容体ＣＣＲ３またはＣＣＲ１０を発現する細胞の遊走を仲介するケモカインである。ＣＣＬ２８は、消化管、肺、乳房等の組織の上皮細胞で発現する（図９に示される）。
本発明は、Ｗｎｔ／β－カテニン－ＣＣＬ２８経路が胃がん病理学的過程において発現をアップレギュレートされ、胃がんモデルにおいてもＣＣＬ２８抗体遮断の治療効果を初めて正式に確認された。
本発明において、ケモカインＣＣＬ２８関連分子の発現の異常なアップレギュレーションとは、特定の組織（例えば、胃がん組織）におけるＣＣＬ２８関連分子のｍＲＮＡ発現量Ｃ１と正常組織（例えば、傍がん性組織）におけるＣＣＬ２８関連分子のｍＲＮＡ発現量Ｃ０との比（Ｃ１／Ｃ０）が、≧１．２、好ましくは、≧１．５、より好ましくは、≧２．０または≧２．５であることを指す。
Ｗｎｔ／β－カテニン経路
細胞において、細胞質におけるβ－カテニンレベルは、ＡＰＣ、Ａｘｉｎおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）からなる多タンパク質破壊複合体によって厳密に制御される。多タンパク質破壊複合体は、β－カテニンをリン酸化し、そのユビキチン化およびプロテアソームによって仲介された分解をさらに誘導することができる。Ｗｎｔｓ経路刺激は、破壊複合体の活性を阻害し、細胞質β－カテニンの安定性を破壊し、細胞質β－カテニンを細胞核に移行させてＬＥＦ／ＴＣＦファミリーと一緒に転写を活性化し、このようなβ－カテニン転写標的の活性化プログラムは、特定のＷｎｔ刺激に対する細胞応答性の重要な側面であるカテニン応答性転写効果（ｃａｔｅｎｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＣＲＴ）である。
細胞において、細胞質におけるβ－カテニンレベルは、ＡＰＣ、Ａｘｉｎおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ－３β（ＧＳＫ－３β）からなる多タンパク質破壊複合体によって厳密に制御される。多タンパク質破壊複合体は、β－カテニンをリン酸化し、そのユビキチン化およびプロテアソームによって仲介された分解をさらに誘導することができる。Ｗｎｔｓ経路刺激は、破壊複合体の活性を阻害し、細胞質β－カテニンの安定性を破壊し、細胞質β－カテニンを細胞核に移行させてＬＥＦ／ＴＣＦファミリーと一緒に転写を活性化し、このようなβ－カテニン転写標的の活性化プログラムは、特定のＷｎｔ刺激に対する細胞応答性の重要な側面であるカテニン応答性転写効果（ｃａｔｅｎｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＣＲＴ）である。
ほとんど（全部ではない場合）のＷｎｔに関連する発がん効果は、ＣＲＴの誤調節によって引き起こされるため、β－カテニン－ＴＣＦ／ＬＥＦ複合体を標的とすることは理想的な治療標的になる。Ｗｎｔ／β－カテニン経路は、結腸直腸がん、胃がん等の種類の癌で最も一般的な発がん遺伝子経路の一つであり、癌の発生および発展に重要な役割を果たし、癌治療においても注目される標的の一つである。標準的なＷｎｔシグナル伝達経路において、ＣＴＮＮＢ１およびＡＰＣは、一般に有意に突然変異した遺伝子である。胃がんを例にとると、約７０％の胃がん患者は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の突然変異を伴う。遺伝子の突然変異に加えて、多くのＷｎｔシグナル伝達経路の構成要素の変化は、正の調節因子のアップレギュレーションまたは負の調節因子のダウンレギュレーションによって実現され、最終的に典型的なＷｎｔ経路の活性化につながることができる。研究によると、ヘリコバクターピロリ感染は、胃上皮細胞におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の活性化につながることができる。まとめると、これらの発見は、癌の発病におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の重要な役割を示唆する。
Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の異常は、ほとんどの種類の癌に見られ、腫瘍の発生および発展において非常に重要な癌遺伝子経路である。様々な腫瘍サンプルの分析を通じて、β－カテニンの発現の増加は、腫瘍へのリンパ球の浸潤と負の相関があり、Ｗｎｔ／β－カテニンが免疫治療に耐性を有するようになった腫瘍の免疫回避にも寄与することを示唆する。
本発明は、胃がんの病理学的過程において、β－カテニンおよび転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦ複合体がＣＣＬ２８プロモーター領域と結合することにより、胃がんにおけるＣＣＬ２８の発現をアップレギュレートすることを初めて証明し、胃がんの病理学的過程におけるこのようなＷｎｔ／β－カテニン－ＣＣＬ２８経路の発現は、独自にアップレギュレートされる。本発明の一実施例において、同じ処理方法および用量を使用すると、ＣＣＬ２８抗体は、胃がんの進行を有意に緩和できるが、黒色腫および乳がんなどの他の固形腫瘍には類似な効果がない。
本発明において、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路関連分子の発現の異常なアップレギュレーションとは、特定の組織（例えば、胃がん組織）におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路関連分子のｍＲＮＡ発現量Ｂ１と正常組織（傍がん性組織）におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路関連分子のｍＲＮＡ発現量Ｂ０との（Ｂ１／Ｂ０）が≧１．２、好ましくは、≧１．５、より好ましくは、≧２．０または≧２．５であることを指す。
Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路阻害剤ｉＣＲＴ１４
本明細書において、使用されるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路阻害剤は、ｉＣＲＴ１４である。ｉＣＲＴ１４は、カテニン応答性転写阻害剤である。
本明細書において、使用されるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路阻害剤は、ｉＣＲＴ１４である。ｉＣＲＴ１４は、カテニン応答性転写阻害剤である。
最初の研究において（Ａｎ ＲＮＡｉ－ｂａｓｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｒｅｅ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｎｔ／ｗｉｎｇｌｅｓｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０１１、１０８：５９５）、実験の予備スクリーニングにより、ｄＴＦ１２－ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の統計学的に有意な阻害効果を有する３４個の分子が特定され（総ヒット率は、約０．３％である）、これらの化合物は、ＣＲＴ阻害剤（ｉＣＲＴ）と呼ばれる。
ｉＣＲＴ１４は、チアゾリジンジオンクラスに属するβ－カテニン応答性転写阻害剤であり、Ｗｎｔ／β－カテニン経路阻害剤である。経験的分子式（ヒル表記法）は、Ｃ２１Ｈ１７Ｎ３Ｏ２Ｓである。これは、カテニンβ－カテニンおよび転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦ複合体の効果的な阻害剤である。これは、β－カテニン－ＴＣＦ／ＬＥＦ相互作用を用量依存的な方式で破壊し、結腸腫瘍細胞株でＧ０／Ｇ１停止を引き起こすことにより、結腸癌細胞での細胞増殖および腫瘍成長の減少の持続的減衰を引き起こす。
本発明は、胃がんにおいて、調節因子ＴＣＦ１およびＴＣＦ４がＬＥＦ１でなくβ－カテニンと協力して、ＣＣＬ２８遺伝子の転写を調節することを初めて発見した。
Ｓ３３Ｙ．β－カテニン
本発明において、胃がん細胞にＳ３３Ｙ．β－カテニンプラスミドを移して、β－カテニンのリン酸化を阻害することにより、β－カテニンを過剰発現する目的を達成する。
本発明において、胃がん細胞にＳ３３Ｙ．β－カテニンプラスミドを移して、β－カテニンのリン酸化を阻害することにより、β－カテニンを過剰発現する目的を達成する。
前記Ｓ３３Ｙ．β－カテニンのＤＮＡプラスミドとは、β－カテニンのアミノ酸配列の３３位にあるセリン（Ｓ３３）がチロシン（Ｙ）に突然変異するフラグメントを有するＤＮＡプラスミドを指す。Ｓ３３は、ＧＳＫ３βのリン酸化部位であり、この部位がリン酸化された後にβ－カテニンは、分解経路に入る。Ｓ３３をチロシン（Ｙ）に突然変異させた後の突然変異体Ｓ３３Ｙ．β－カテニンは、リン酸化および分解経路を開始、細胞内でより効率的に濃縮される。この突然変異も、胃腸管腫瘍の一部の患者のサンプルで検出される。本発明は、腫瘍細胞におけるＷｎｔ／β－カテニン経路の異常な活性化の効果を研究するために使用される。
Ｈ．ｆｅｌｉｓ／ＭＮＵ誘導胃がんモデル
ヘリコバクターピロリは、慢性胃炎の主な病因の一つと考えられる。従って、ヘリコバクターピロリを用いて胃がんマウスモデルを構築することは、ヒト胃がんの発生および発展を研究することで非常に重要である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、様々なヘリコバクターピロリ株による胃のコロニー形成に対して有意に耐性がある。従って、Ｈ．ｆｅｌｉｓ（ヘリコバクターピロリの近縁種を使用して）胃がんマウスモデルを構築することは非常に重要である。このような株は、ネコの胃から分離され、マウスの胃の中でコロニーを容易に形成する。それは、マウスに重度の胃炎および萎縮を引き起こすことができる。ｆｅｌｉｓによって感染されたマウスは、胃のＳＰＥＭ、異型性および浸潤性腫瘍を示し、観察期間が比較的に長い。当該モデルでは、胃体の大湾に沿った扁平円柱状接合部（ＳＣＪ）で広範囲な形成異常病変が観察され、大きなポリープ状胃幽門洞腫瘍が発生される。
ヘリコバクターピロリは、慢性胃炎の主な病因の一つと考えられる。従って、ヘリコバクターピロリを用いて胃がんマウスモデルを構築することは、ヒト胃がんの発生および発展を研究することで非常に重要である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、様々なヘリコバクターピロリ株による胃のコロニー形成に対して有意に耐性がある。従って、Ｈ．ｆｅｌｉｓ（ヘリコバクターピロリの近縁種を使用して）胃がんマウスモデルを構築することは非常に重要である。このような株は、ネコの胃から分離され、マウスの胃の中でコロニーを容易に形成する。それは、マウスに重度の胃炎および萎縮を引き起こすことができる。ｆｅｌｉｓによって感染されたマウスは、胃のＳＰＥＭ、異型性および浸潤性腫瘍を示し、観察期間が比較的に長い。当該モデルでは、胃体の大湾に沿った扁平円柱状接合部（ＳＣＪ）で広範囲な形成異常病変が観察され、大きなポリープ状胃幽門洞腫瘍が発生される。
ヘリコバクターによって感染されたマウスモデルの研究により、研究者らは、性別、食餌および重複感染等、胃がんにおける他の補助因子の影響を確認した。ヘリコバクターピロリ感染前のＮ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素（ＭＮＵ）の使用は、より重篤な前がん病変を誘発し、かつ胃がんの発病率を増加させる。マウスモデルの胃がんの発生の誘導におけるＭＮＵの役割は、非常に重要であり、週２回の胃内投与（０．５ｍｇのＭＮＵ）により、ほとんどのＢａｌｂ／ｃマウスが前胃扁平上皮がんで死亡する。ＭＮＵを使用する前の外科的切除は、線胃の高分化型腺がんの発生を促進するのに役立ち、４０週間使用した後の発生率は、１００％である。従って、胃腺体は、ＭＮＵの発がん性硬化に非常に敏感である。２４０ｐｐｍのＭＮＵを飲料水に溶解し、５週間連続（隔週）投与し、６個の系統のマウス実験での結果から、当該方法は胃がんを誘発できることを示す。従って、本スキームは、Ｈ．ｆｅｌｉｓ感染およびＭＮＵ投与の組み合わせを使用して、マウス胃がんモデルを構築する。
免疫回避
免疫回避は、癌の新しい盗聴として認識される。腫瘍の免疫微小環境を理解することは、新しい治療標的を発見し、免疫治療の反応を予測するために重要である。正常な免疫システムは、腫瘍の発生および発展を阻害する。癌が進行するにつれて、腫瘍は、多くの免疫回避メカニズムを発達させて、腫瘍成長を促進する。
免疫回避は、癌の新しい盗聴として認識される。腫瘍の免疫微小環境を理解することは、新しい治療標的を発見し、免疫治療の反応を予測するために重要である。正常な免疫システムは、腫瘍の発生および発展を阻害する。癌が進行するにつれて、腫瘍は、多くの免疫回避メカニズムを発達させて、腫瘍成長を促進する。
マウスモデルおよび腫瘍患者サンプルｋらのデータは、骨髄サプレッサー細胞（ＭＤＳＣｓ）およびＭ２マクロファージが胃がんの免疫阻害に関与することを表す。制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、様々な種類の癌の腫瘍進行を加速するプロセスに関与することが分かっている免疫阻害型細胞のクラスである。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、腫瘍の免疫回避に関与する重要な免疫阻害型細胞のクラスである。その増加は、抗腫瘍エフェクター免疫細胞の機能および数の減少につながる可能性があり、同時に腫瘍免疫治療または他の療法の有効性の弱体化さらには喪失につながる可能性がある。
本発明の好ましい実施例において、ＣＣＬ２８抗体の使用は、制御性Ｔ細胞アポトーシスに影響を与えず、標的された制御性Ｔ細胞の腫瘍への移動を効果的に阻害することができる。同時に、血液中のＴｒｅｇ細胞における比率を低下させず、胃がん腫瘍組織および脾臓中のＴｒｅｇ細胞のみを標的することで、全体的な免疫応答を改善されることもできる。
本発明の技術スキームは、次のような利点を有する。
１．本発明は、ＣＣＬ２８を阻害することにより、異常に上昇したＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路－ＣＣＬ２８を同時に伴う胃がんを治療する。本発明によって提供されるＣＣＬ２８抗体による治療は、腫瘍面積を有意に減少させ、異形成および腸型形質転換を有意に変化させ、明らかに正常な細胞喪失の減少を軽減することができる。
１．本発明は、ＣＣＬ２８を阻害することにより、異常に上昇したＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路－ＣＣＬ２８を同時に伴う胃がんを治療する。本発明によって提供されるＣＣＬ２８抗体による治療は、腫瘍面積を有意に減少させ、異形成および腸型形質転換を有意に変化させ、明らかに正常な細胞喪失の減少を軽減することができる。
２．本発明は、β－カテニン／ＣＣＬ２８が胃がんの発生および悪化と正の相関を有し、従って胃がんの診断、スクリーニングおよび予後判断のための検出方法を提供され、集団の胃がんの発病率をスクリーニングし、胃がんの転移を正確に検出することができる。
３．本発明は、β－カテニン／ＣＣＬ２８を阻害し、その効果は、胃がん腫瘍組織および脾臓中の的Ｔｒｅｇ細胞のみを標的とし、全体的な免疫応答を改善することができる。
４．悪性胃がんを治療するための本発明のＣＣＬ２８走化性経路を遮断する方法は、制御性Ｔ細胞のアポトーシスに影響を与えず、制御性Ｔ細胞の腫瘍への遊走プロセスを標的とし、制御性Ｔ細胞を標的とする免疫療法のためのより新規かつ効果的な手段を提供することができる。
４．悪性胃がんを治療するための本発明のＣＣＬ２８走化性経路を遮断する方法は、制御性Ｔ細胞のアポトーシスに影響を与えず、制御性Ｔ細胞の腫瘍への遊走プロセスを標的とし、制御性Ｔ細胞を標的とする免疫療法のためのより新規かつ効果的な手段を提供することができる。
５．本発明は、ＣＣＬ２８を阻害することにより、腫瘍細胞におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を阻害するための治療的アイデアを提供する。
６．本発明は、異常に上昇したＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路－ＣＣＬ２８を同時に伴う胃がんが、他の腫瘍、さらには固形腫瘍と顕著に異なる疾患表現型であることを発見し、主にＣＣＬ２８走化性経路の遮断芽悪性胃がんの発展を効果的に阻害できることを反映するが、他の腫瘍モデルへの影響は明らかでなく、特に黒色腫細胞Ｂ１６および乳がん細胞４Ｔ１モデルに効果がない。
６．本発明は、異常に上昇したＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路－ＣＣＬ２８を同時に伴う胃がんが、他の腫瘍、さらには固形腫瘍と顕著に異なる疾患表現型であることを発見し、主にＣＣＬ２８走化性経路の遮断芽悪性胃がんの発展を効果的に阻害できることを反映するが、他の腫瘍モデルへの影響は明らかでなく、特に黒色腫細胞Ｂ１６および乳がん細胞４Ｔ１モデルに効果がない。
以下、本発明は、具体的実施例と併せてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記しない限り、パーセンテージおよび部数は、重量に従って計算される。
一般的な実験方法
１．細胞培養
ヒト胃がん細胞株ＡＧＳおよびＳＣ７９０１は、１０％血清（Ｇｂｉｃｏ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン二重抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地で培養される。
１．細胞培養
ヒト胃がん細胞株ＡＧＳおよびＳＣ７９０１は、１０％血清（Ｇｂｉｃｏ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン二重抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地で培養される。
２．ＲＮＡ精製および定量ＰＣＲ
細胞株およびマウス胃組織からのトータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、その後ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を使用して逆転写してｃＤＮＡを合成する。ＱＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）およびＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施する。定量計算は、ΔΔＣｔ法を使用する。
細胞株およびマウス胃組織からのトータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、その後ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を使用して逆転写してｃＤＮＡを合成する。ＱＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）およびＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施する。定量計算は、ΔΔＣｔ法を使用する。
３．ウエスタンブロッティング
胃がん細胞株およびマウス胃組織からのタンパク質を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＲＩＰＡ溶解液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し、タンパク質濃度は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で検出される。β－カテニン（Ａｂｃａｍ）、ＣＣＬ２８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ａｃｔｉｖｅβ－カテニン（Ｍｅｒｃｋ）、ＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ）およびβ－ｔｕｂｕｌｉｎ（Ａｂｃａｍ）等のタンパク質が検出される。
胃がん細胞株およびマウス胃組織からのタンパク質を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＲＩＰＡ溶解液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し、タンパク質濃度は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で検出される。β－カテニン（Ａｂｃａｍ）、ＣＣＬ２８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ａｃｔｉｖｅβ－カテニン（Ｍｅｒｃｋ）、ＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ）およびβ－ｔｕｂｕｌｉｎ（Ａｂｃａｍ）等のタンパク質が検出される。
４．蛍光クロマターゼレポーター遺伝子活性検出
Ｗｎｔ／β－カテニンレポータープラスミドＭ５０Ｓｕｐｅｒ８ＸＴＯＰＦｌａｓｈ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２４５６）および突然変異体対照Ｍ５１Ｓｕｐｅｒ８ＸＦＯＰＦｌａｓｈ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２４５７）は、Ｒａｎｄａｌｌ Ｍｏｏｎからの贈り物である。ヒトＣＣＬ２８遺伝子のプロモーター（２．８ｋｂ、転写開始部位に対して－２５７６／＋２０５である）をホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子構築体ｐＧＬ４にクローニングする。Ｈｉｅｆｆ Ｍｕｔ ＴＭマルチサイト特異的変異誘発キット（Ｙｅａｓｅｎ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）を使用してＣＣＬ２８プロモーター上の潜在的なＴＣＦ／ＬＥＦ結合部位の突然変異を導入して、突然変異ＣＣＬ２８プロモーターレポーター構築体（ｐＧＬ４－ＣＣＬ２８．ｍｕｔ）を生成する。ｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｂｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を使用してプラスミドをトランスフェクトする。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＲＬ－ＣＭＶレポーター遺伝子とのコトランスフェクションによってトランスフェクション効率を標準化する。Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼ測定システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ホタルおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を測定する。
Ｗｎｔ／β－カテニンレポータープラスミドＭ５０Ｓｕｐｅｒ８ＸＴＯＰＦｌａｓｈ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２４５６）および突然変異体対照Ｍ５１Ｓｕｐｅｒ８ＸＦＯＰＦｌａｓｈ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２４５７）は、Ｒａｎｄａｌｌ Ｍｏｏｎからの贈り物である。ヒトＣＣＬ２８遺伝子のプロモーター（２．８ｋｂ、転写開始部位に対して－２５７６／＋２０５である）をホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子構築体ｐＧＬ４にクローニングする。Ｈｉｅｆｆ Ｍｕｔ ＴＭマルチサイト特異的変異誘発キット（Ｙｅａｓｅｎ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）を使用してＣＣＬ２８プロモーター上の潜在的なＴＣＦ／ＬＥＦ結合部位の突然変異を導入して、突然変異ＣＣＬ２８プロモーターレポーター構築体（ｐＧＬ４－ＣＣＬ２８．ｍｕｔ）を生成する。ｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｂｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を使用してプラスミドをトランスフェクトする。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＲＬ－ＣＭＶレポーター遺伝子とのコトランスフェクションによってトランスフェクション効率を標準化する。Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼ測定システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ホタルおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を測定する。
５．クロマチン免疫沈降ＣｈＩＰ
ＳＧＣ７９０１細胞を１％のホルムアルデヒド溶液で１５分間固定し、その後０．１２５Ｍグリシン溶液を加えて反応を停止させる。ＰＢＳで反応液を洗浄し、次にＦａｒｎｈａｍ溶解液を加えて細胞を収集する。遠心分離により細胞ペレットを収集し、細胞をＲＩＰＡ溶解液に再懸濁し、超音波処理装置を使用して細胞内のＤＮＡを断片化する。ＤＮＡフラグメントを、事前に結合された抗体およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入される）複合体とともに、４度回転で一晩インキュベートする。抗体は、抗β－カテニンおよび対照ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）である。磁石を使用してＤＮＡ－タンパク質－抗体－Ｄｙｎａｂｅａｄｓ複合体を沈降させ、最後に緩衝液を使用してＤＮＡフラグメントを溶出する。ＣＣＬ２８プロモーター上の三つの異なるβ－カテニン潜在的結合部位に対して、プライマーを設計して、定量ＰＣＲを行うことにより、サンプル中の三つの部位のＤＮＡフラグメントの含有量を検査する。相対的濃縮は、潜在的なＤＮＡ結合部位での対照ＩｇＧに対するβ－カテニンの相対的結合として計算される。
ＳＧＣ７９０１細胞を１％のホルムアルデヒド溶液で１５分間固定し、その後０．１２５Ｍグリシン溶液を加えて反応を停止させる。ＰＢＳで反応液を洗浄し、次にＦａｒｎｈａｍ溶解液を加えて細胞を収集する。遠心分離により細胞ペレットを収集し、細胞をＲＩＰＡ溶解液に再懸濁し、超音波処理装置を使用して細胞内のＤＮＡを断片化する。ＤＮＡフラグメントを、事前に結合された抗体およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入される）複合体とともに、４度回転で一晩インキュベートする。抗体は、抗β－カテニンおよび対照ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）である。磁石を使用してＤＮＡ－タンパク質－抗体－Ｄｙｎａｂｅａｄｓ複合体を沈降させ、最後に緩衝液を使用してＤＮＡフラグメントを溶出する。ＣＣＬ２８プロモーター上の三つの異なるβ－カテニン潜在的結合部位に対して、プライマーを設計して、定量ＰＣＲを行うことにより、サンプル中の三つの部位のＤＮＡフラグメントの含有量を検査する。相対的濃縮は、潜在的なＤＮＡ結合部位での対照ＩｇＧに対するβ－カテニンの相対的結合として計算される。
６．ヒト末梢血単核細胞の分離および遊走実験
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入される）を使用した勾配遠心分離によって新鮮な末梢血を分離し、その後ＰＢＳで単一細胞に再懸濁し、かつ血球計算盤でカウントする。
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入される）を使用した勾配遠心分離によって新鮮な末梢血を分離し、その後ＰＢＳで単一細胞に再懸濁し、かつ血球計算盤でカウントする。
ＳＧＣ７９０１胃がん細胞株培養液上清を８μｍのｐｏｒｅ ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇから購入される）の下層にプレーティングし、チャンバーに１％血清を含むＰＢＳに再懸濁した２００万個の末梢血単核細胞をプレーティングする。３７℃のインキュベーターに６時間置いて、下層に遊走したＰＢＭＣを収集し、かつフローサイトメトリーによって制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を検出し、ＣＤ３［ＳＫ７］（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入される）、ＣＤ４［ＲＰＡ－Ｔ４］（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入される）、ＣＤ８ａ［ＯＫＴ８］（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入される）、ＣＤ２５［ＢＣ９６］（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入される）およびＦＯＸＰ３［２０６Ｄ］（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入される）等の抗体が使用される。
７．ｉｎｓｉｔｕ胃がんマウスモデルおよび治療スキーム
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ（Ｈ．ｆｅｌｉｓ）およびＮ－メチル（Ｍｅｔｈｙｌ）－Ｎ－ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）（ＭＮＵ）によって誘導された胃がんマウスモデルを構築するために、８週齢の野生型マウスにＨ．ｆｅｌｉｓ株（ＡＴＣＣ ４９１７９）を週に３回強制経口投与し、一周三次，その後２４０ｐｐｍのＭＮＵを含む飲料水を隔週合計１２週間投与する。
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｌｉｓ（Ｈ．ｆｅｌｉｓ）およびＮ－メチル（Ｍｅｔｈｙｌ）－Ｎ－ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）（ＭＮＵ）によって誘導された胃がんマウスモデルを構築するために、８週齢の野生型マウスにＨ．ｆｅｌｉｓ株（ＡＴＣＣ ４９１７９）を週に３回強制経口投与し、一周三次，その後２４０ｐｐｍのＭＮＵを含む飲料水を隔週合計１２週間投与する。
抗体治療スキーム：５０ｍｇ／ｋｇのＣＣＬ２８モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入される）を腹腔内注射し、対照群は、この抗体のアイソタイプ対照ＩｇＧ抗体を使用し、具体的な時間は、図４Ａを参照する。
８．フロー分析
末梢血、脾臓および胃組織中の免疫細胞を検出するために、脾臓および胃を組織ホモジナイザーｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入される）を使用して細胞を分離する。胃組織を１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入される）および５０μｇ／ｍｌ（２０Ｕ／ｍｌ）のＤＮＡ酵素Ｉ（ｓｔｏｃｋ：５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入される）で分解し、組織中の赤血球は、赤血球溶解液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入される）を使用して除去する。フロー検出に使用される抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ会社から購入される。細胞内抗原の検出については、細胞活性化剤（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入される）を使用して６時間刺激する必要がある。細胞間抗原染色は、Ｃｙｔｏ－ＦａｓｔＴＭ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入される）を使用する。核タンパク質は、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入される）で処理される。フローデータは、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入される）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって処理される。
末梢血、脾臓および胃組織中の免疫細胞を検出するために、脾臓および胃を組織ホモジナイザーｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入される）を使用して細胞を分離する。胃組織を１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入される）および５０μｇ／ｍｌ（２０Ｕ／ｍｌ）のＤＮＡ酵素Ｉ（ｓｔｏｃｋ：５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入される）で分解し、組織中の赤血球は、赤血球溶解液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入される）を使用して除去する。フロー検出に使用される抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ会社から購入される。細胞内抗原の検出については、細胞活性化剤（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入される）を使用して６時間刺激する必要がある。細胞間抗原染色は、Ｃｙｔｏ－ＦａｓｔＴＭ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入される）を使用する。核タンパク質は、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入される）で処理される。フローデータは、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入される）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって処理される。
９．免疫組織化学
胃がん患者の組織パラフィン切片は、Ａｌｅｎａｂｉｏ会社から購入される。マウスの胃組織をパラフィンに包埋し、かつ５μｍの組織切片に切断し、脱パラフィンし、抗原を修復し、密閉した後にβ－カテニン（Ａｂｃａｍから購入される）、Ｈ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅβ（ＡＴＰ４Ｂ）（Ａｂｃａｍから購入される）、ＦＯＸＰ３（Ａｂｃａｍから購入される）、ＣＣＬ２８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入される）一次抗体等の抗体で四番置き、翌日に二次抗体でインキュベートし、ＤＡＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈから購入され、上海）を使用して発色させ、最後に核をヘマトキシリンで染色しかつ再水和してマウントする。β－カテニンおよびＣＣＬ２８の定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して統計的に分析される。
胃がん患者の組織パラフィン切片は、Ａｌｅｎａｂｉｏ会社から購入される。マウスの胃組織をパラフィンに包埋し、かつ５μｍの組織切片に切断し、脱パラフィンし、抗原を修復し、密閉した後にβ－カテニン（Ａｂｃａｍから購入される）、Ｈ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅβ（ＡＴＰ４Ｂ）（Ａｂｃａｍから購入される）、ＦＯＸＰ３（Ａｂｃａｍから購入される）、ＣＣＬ２８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入される）一次抗体等の抗体で四番置き、翌日に二次抗体でインキュベートし、ＤＡＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈから購入され、上海）を使用して発色させ、最後に核をヘマトキシリンで染色しかつ再水和してマウントする。β－カテニンおよびＣＣＬ２８の定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して統計的に分析される。
１０．Ｂ１６黒色腫および４Ｔ１乳がん皮下移植腫瘍モデル
対数成長期のＢ１６または４Ｔ１細胞を取り、ＰＢＳで細胞濃度を３×１０６個／ｍＬに調整する。６週齢のＷＴ雌マウスを取り、眼科用ハサミでマウスの右後肢の外側のマウス毛を切り取り、７５％アルコールで滅菌し、各マウスに０．１ｍＬの細胞懸濁液を皮下注射する。その後直径５ｍｍの腫瘍が観察される場合、開始点として記録し、ノギスで腫瘍のサイズを測定および計算する。
対数成長期のＢ１６または４Ｔ１細胞を取り、ＰＢＳで細胞濃度を３×１０６個／ｍＬに調整する。６週齢のＷＴ雌マウスを取り、眼科用ハサミでマウスの右後肢の外側のマウス毛を切り取り、７５％アルコールで滅菌し、各マウスに０．１ｍＬの細胞懸濁液を皮下注射する。その後直径５ｍｍの腫瘍が観察される場合、開始点として記録し、ノギスで腫瘍のサイズを測定および計算する。
１１．統計分析
データは、平均値±ＳＤで表される。グループ間の統計学的有意性は、両側の対応のないスチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）ｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）によって計算される。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であると見なされる。
データは、平均値±ＳＤで表される。グループ間の統計学的有意性は、両側の対応のないスチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）ｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）によって計算される。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であると見なされる。
実施例１．胃がんにおいてβ－カテニンシグナル伝達経路によるＣＣＬ２８発現の誘導
本実施例において、胃がん細胞株におけるケモカイン発現に対するＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の影響を検出する。方法は、次のとおりである。１）胃がん細胞ＳＧＣ７９０１でβ－カテニンを過剰発現し、プラスミドベクターを使用して、ＧＳＫ３βリン酸化部位の突然変異を伴う突然変異型β－カテニン（即ち、Ｓ３３Ｙ、β－カテニン）を発現させることにより、β－カテニンの持続的な活性化を実現し、その後ｑＰＣＲによってケモカイン発現の変化を検出し、２）ヒト胃がん細胞株ＡＧＳおよびＳＧＣ７９０１において、それぞれβ－カテニンをノックダウンまたは過剰発現させることによって、ＷＢを使用してタンパク質レベルでのＣＣＬ２８の発現レベルの変化を検出し、３）臨床胃がん組織サンプルにおいて免疫組織化学的染色後、β－カテニンおよびＣＣＬ２８陽性率の統計学的分析は、β－カテニンとＣＣＬ２８との相関関係を検証する。
本実施例において、胃がん細胞株におけるケモカイン発現に対するＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の影響を検出する。方法は、次のとおりである。１）胃がん細胞ＳＧＣ７９０１でβ－カテニンを過剰発現し、プラスミドベクターを使用して、ＧＳＫ３βリン酸化部位の突然変異を伴う突然変異型β－カテニン（即ち、Ｓ３３Ｙ、β－カテニン）を発現させることにより、β－カテニンの持続的な活性化を実現し、その後ｑＰＣＲによってケモカイン発現の変化を検出し、２）ヒト胃がん細胞株ＡＧＳおよびＳＧＣ７９０１において、それぞれβ－カテニンをノックダウンまたは過剰発現させることによって、ＷＢを使用してタンパク質レベルでのＣＣＬ２８の発現レベルの変化を検出し、３）臨床胃がん組織サンプルにおいて免疫組織化学的染色後、β－カテニンおよびＣＣＬ２８陽性率の統計学的分析は、β－カテニンとＣＣＬ２８との相関関係を検証する。
結果：
ｑＰＣＲ結果は、対照プラスミドと比較して、β－カテニンを過剰発現した後、最も明らかな変化を示したケモカインがＣＣＬ２８であることを示す（図１Ａ）。
ｑＰＣＲ結果は、対照プラスミドと比較して、β－カテニンを過剰発現した後、最も明らかな変化を示したケモカインがＣＣＬ２８であることを示す（図１Ａ）。
ＳＧＣ７９０１およびＡＧＳヒト胃がん細胞株（中国科学院の細胞バンクに由来する）において、野生型（ＷＴ）または分解耐性突然変異体Ｓ３３Ｙ．β－カテニンの過剰発現も、ＣＣＬ２８タンパク質レベルを増加させる（図１Ｂ）。対照的に、このような両方の細胞株でβ－カテニンのノックダウンは、ＣＣＬ２８タンパク質レベルの低下を引き起こす（図１Ｂ）。
実施例２．ヒト胃がん細胞におけるβ－カテニンシグナル伝達経路の直接標的遺伝子であるＣＣＬ２８
本実施例において、バイオインフォマティクスと組み合わせて、ＣＣＬ２８とβ－カテニンシグナル伝達経路との構造的相関を分析し、次に細胞モデルで二つの間の関係を検証する。方法は、次のとおりである。バイオインフォマティクスを使用して、ＣＣＬ２８のプロモーター領域で３個のβ－カテニン／ＴＣＦ転写複合体の潜在的結合部位を見つけ、クロマチン免疫沈降を使用してβ－カテニンが潜在的結合部位で濃縮されるかどうかを分析し、ＣＣＬ２８プロモーターおよび潜在的結合部位配列で突然変異したＣＣＬ２８プロモーター配列をルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングすることによって、ＣＣＬ２８プロモーターの転写活性を検査する。β－カテニン／ＴＣＦを使用して、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子ファミリーメンバーのｓｈＲＮＡノックダウンまたはＴＣＦ／ＬＥＦメンバーの過剰発現後に、ＣＣＬ２８プロモーターの転写活性が検出される。
本実施例において、バイオインフォマティクスと組み合わせて、ＣＣＬ２８とβ－カテニンシグナル伝達経路との構造的相関を分析し、次に細胞モデルで二つの間の関係を検証する。方法は、次のとおりである。バイオインフォマティクスを使用して、ＣＣＬ２８のプロモーター領域で３個のβ－カテニン／ＴＣＦ転写複合体の潜在的結合部位を見つけ、クロマチン免疫沈降を使用してβ－カテニンが潜在的結合部位で濃縮されるかどうかを分析し、ＣＣＬ２８プロモーターおよび潜在的結合部位配列で突然変異したＣＣＬ２８プロモーター配列をルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングすることによって、ＣＣＬ２８プロモーターの転写活性を検査する。β－カテニン／ＴＣＦを使用して、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子ファミリーメンバーのｓｈＲＮＡノックダウンまたはＴＣＦ／ＬＥＦメンバーの過剰発現後に、ＣＣＬ２８プロモーターの転写活性が検出される。
結果：
バイオインフォマティクス分析により、ＣＣＬ２８遺伝子のプロモーター領域に三つの潜在的なβ－カテニン／ＴＣＦ転写複合体の結合領域（図２Ａ）あることが分かる。
バイオインフォマティクス分析により、ＣＣＬ２８遺伝子のプロモーター領域に三つの潜在的なβ－カテニン／ＴＣＦ転写複合体の結合領域（図２Ａ）あることが分かる。
ヒト胃がん細胞ＳＧＣ７９０１において、クロマチン免疫沈降分析により、β－カテニンがプロモーター部位１および３に結合することが分かる（図２Ｂ）。
二つの結合部位配列に対して突然変異した後、β－カテニンがＣＣＬ２８プロモーター活性に対するアップレギュレーション効果は、消失し（図２Ｃ）、これは、β－カテニンがＣＣＬ２８プロモーターで部位に結合することによりＣＣＬ２８遺伝子の転写を直接調節することを示す。
二つの結合部位配列に対して突然変異した後、β－カテニンがＣＣＬ２８プロモーター活性に対するアップレギュレーション効果は、消失し（図２Ｃ）、これは、β－カテニンがＣＣＬ２８プロモーターで部位に結合することによりＣＣＬ２８遺伝子の転写を直接調節することを示す。
Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤ｉＣＲＴ１４を使用して、β－カテニンがＣＣＬ２８プロモーター活性に対するアップレギュレーション効果を同様に減少する（図２Ｄ）。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤ｉＣＲＴ１４処理は、細胞内のβ－カテニンとＴＣＦとの結合およびプロモーターＤＮＡへのβ－カテニン／ＴＣＦ転写複合体の結合をブロックすることにより、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害し、ＣＣＬ２８は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の標的遺伝子として、その転写活性も阻害される。ｓｈＲＮＡノックダウンまたは遺伝子過剰発現後にＣＣＬ２８プロモーター活性を検出することにより、転写因子ＴＣＦ１およびＴＣＦ４がβ－カテニンと協力してＣＣＬ２８遺伝子の転写を調節するが、ＬＥＦ１を調節しないことが分かる。
実施例３．マウスｉｎｓｉｔｕ胃がんにおけるＣＣＬ２８の発現を阻害するＷｎｔシグナル伝達経路阻害剤ｉＣＲＴ１４
本実施例において、ヘリコバクターＨ．ｆｅｌｉｓ感染および発がん剤ＭＮＵを使用してｉｎｎｓｉｔｕマウス胃がんを誘導し、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤ｉＣＲＴ１４を腹腔内注射によって、胃におけるＣＣＬ２８タンパク質の発現レベルを検出する。
本実施例において、ヘリコバクターＨ．ｆｅｌｉｓ感染および発がん剤ＭＮＵを使用してｉｎｎｓｉｔｕマウス胃がんを誘導し、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害剤ｉＣＲＴ１４を腹腔内注射によって、胃におけるＣＣＬ２８タンパク質の発現レベルを検出する。
結果は、図３に示されたとおりである。タンパク質ウエスタンブロット法（図３Ａ）およびＥＬＩＳＡ（図３Ｂ）分析は、すべて、ｉＣＲＴ１４が胃でのＣＣＬ２８タンパク質の発現を有意に減少させることを示し、これは、インビボでのＣＣＬ２８発現もβ－カテニン経路によって調節されることを示す。
実施例４．ＣＣＬ２８と胃がんとの発展程度の相関
本実施例において、免疫組織化学的分析によってＣＣＬ２８とβ－カテニン発現レベルとの相関関係をさらに分析する。結果は、異なる程度の胃がんサンプルにおいて、β－カテニンの発現レベルとＣＣＬ２８の発現レベルとの間には、有意な正の相関関係を有することを示す（図１Ｃおよび１Ｄ）。
本実施例において、免疫組織化学的分析によってＣＣＬ２８とβ－カテニン発現レベルとの相関関係をさらに分析する。結果は、異なる程度の胃がんサンプルにおいて、β－カテニンの発現レベルとＣＣＬ２８の発現レベルとの間には、有意な正の相関関係を有することを示す（図１Ｃおよび１Ｄ）。
Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースに基づいて、ＣＣＬ２８と胃がんの発展程度との関係をさらに分析する。結果は、ＣＣＬ２８のｍＲＮＡレベルが正常組織よりも腸型およびびまん型胃がんの両方で高いことを示す（図４Ａ）。胃がん患者の組織サンプルの免疫組織化学的染色は、ＣＣＬ２８タンパク質レベルが悪性等のグレードのより高い腫瘍においてもより高いことを示す（図４Ｂ）。
まとめると、これらの結果は、ＣＣＬ２８が胃がん細胞におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の標的遺伝子であることを示し、これは、ＣＣＬ２８が胃がんにおける潜在的な病原性因子であることを示す。さらに、ＣＣＬ２８の陽性率は、胃がんの発展または悪性等のグレードの増加とともにより高い。
実施例５．ＣＣＬ２８発現を誘導して制御性Ｔ細胞の遊走を調節するβ－カテニンシグナル伝達経路によって活性化された胃がん細胞
本実施例において、インビトロ遊走実験によって、Ｗｎｔ／β－カテニンによって活性化された腫瘍細胞がＣＣＬ２８を介してヒトＴｒｅｇ細胞を動員できるかどうかを検出する。方法は、次のとおりである。胃がん細胞株ＳＧＣ７９０１でβ－カテニンを過剰発現するか、またはβ－カテニンを過剰発現する同時にｓｈＲＮＡを使用してＣＣＬ２８をノックダウンする胃がん細胞株を構築し、細胞培養液上清を収集し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌの下層にプレーティングし、上層のチャンバーに１×１０６個の末梢血単核細胞をプレーティングし、３７℃のインキュベーターで４時間培養した後、下層に遊走した細胞を収集し、フローサイトメトリーでその免疫細胞の比率および数を分析する。
本実施例において、インビトロ遊走実験によって、Ｗｎｔ／β－カテニンによって活性化された腫瘍細胞がＣＣＬ２８を介してヒトＴｒｅｇ細胞を動員できるかどうかを検出する。方法は、次のとおりである。胃がん細胞株ＳＧＣ７９０１でβ－カテニンを過剰発現するか、またはβ－カテニンを過剰発現する同時にｓｈＲＮＡを使用してＣＣＬ２８をノックダウンする胃がん細胞株を構築し、細胞培養液上清を収集し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌの下層にプレーティングし、上層のチャンバーに１×１０６個の末梢血単核細胞をプレーティングし、３７℃のインキュベーターで４時間培養した後、下層に遊走した細胞を収集し、フローサイトメトリーでその免疫細胞の比率および数を分析する。
結果：
ＳＧＣ７９０１細胞でｓｈＲＮＡによってＳ３３Ｙ．β－カテニン誘導ＣＣＬ２８をノックダウンする（図５Ａ）。
ＳＧＣ７９０１細胞でｓｈＲＮＡによってＳ３３Ｙ．β－カテニン誘導ＣＣＬ２８をノックダウンする（図５Ａ）。
遊走実験において、下層に遊走した末梢血単核細胞をフローサイトメトリーでその中の免疫細胞の変化を分析する（図５Ｂ）。
胃がん細胞株ＳＧＣ７９０１がβ－カテニンを過剰発現する条件下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞における制御性Ｔ細胞の比率および絶対数の両方が有意に増加したが、β－カテニンのノックダウンは、減少する（図５ＣおよびＤ）。これらの結果は、β－カテニンによって活性化された胃腫瘍細胞がインビトロでＣＣＬ２８を介してＴｒｅｇ細胞を動員することを示唆する。
胃がん細胞株ＳＧＣ７９０１がβ－カテニンを過剰発現する条件下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞における制御性Ｔ細胞の比率および絶対数の両方が有意に増加したが、β－カテニンのノックダウンは、減少する（図５ＣおよびＤ）。これらの結果は、β－カテニンによって活性化された胃腫瘍細胞がインビトロでＣＣＬ２８を介してＴｒｅｇ細胞を動員することを示唆する。
フローサイトメトリー結果は、総ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の動員の任意の差異が示されず（図３ＣおよびＤ）、これは、Ｔｒｅｇに対するβ－カテニン／ＣＣＬ２８の独特な効果を示唆する。
実施例６．Ｈ．ｆｅｌｉｓ／ＭＮＵによって誘導される胃がんの進行を阻害するＣＣＬ２８抗体治療
本実施例において、Ｈ．ｆｅｌｉｓ／ＭＮＵ胃がんモデル動物を使用し、ＭＮＵ処理開始後２９週目に（図面では２８週間の終わり、および２９週間の始まりを示す）、モデルマウスにＣＣＬ２８モノクローナル抗体を週１回投与してＣＣＬ２８活性を遮断し、実験スキームは、図６Ａに示されたとおりである。
本実施例において、Ｈ．ｆｅｌｉｓ／ＭＮＵ胃がんモデル動物を使用し、ＭＮＵ処理開始後２９週目に（図面では２８週間の終わり、および２９週間の始まりを示す）、モデルマウスにＣＣＬ２８モノクローナル抗体を週１回投与してＣＣＬ２８活性を遮断し、実験スキームは、図６Ａに示されたとおりである。
結果：抗体処理の８週間後、ＣＣＬ２８抗体治療群のマウスモデルの胃の腫瘍面積は、有意に減少される（図６Ｂ）。組織学的分析は、ＣＣＬ２８抗体療法による異形成および腸型形質転換の顕著な変化を示す（図６Ｃ）。Ｈ＋Ｋ＋ＡＴＰａｓｅの免疫組織化学的分析では、ＣＣＬ２８抗体を使用して治療された後、胃幽門洞部位において壁細胞の喪失の現象が有意に緩和される（図６Ｄ）。これは、ＣＣＬ２８の阻害が胃がんの進行を効果的に軽減できることを示唆する。
実施例７．ＣＣＬ２８抗体治療緩和免疫微小環境的阻害性
本実施例において、実施例６におけるＣＣＬ２８抗体で治療されたモデル動物については、３６週目の終わりに、マウス胃腫瘍サンプルに対してＦＡＣＳ分析を実施する。
結果は、図７に示されたとおりである。ＦＡＣＳ分析は、ＣＣＬ２８抗体で処理されたマウスの胃における制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の有意な現象が確認される（図７Ａ）。興味深いことに、抗ＣＣＬ２８治療は、脾臓のＴｒｅｇ細胞の比率も減少させるが、血液中のＴｒｅｇ細胞の比率を減少せず、これは、ケモカインＣＣＬ２８に依存するＴｒｅｇ動員メカニズムが脾臓および胃に存在することを示す。効果的な免疫療法には末梢免疫の活性化および協調が必要であるため、胃に対する直接的な効果に加えて、脾臓におけるＣＣＬ２８抗体治療の作用も、全体的な免疫応答を高める可能性がある。まとめると、これらのデータは、抗ＣＣＬ２８療法が、Ｔｒｅｇの動員を阻害することにより、Ｈ．ｆｅｌｉｓ／ＭＮＵによって誘導される胃がんの進行を効果的に阻害することを示唆する。
本実施例において、実施例６におけるＣＣＬ２８抗体で治療されたモデル動物については、３６週目の終わりに、マウス胃腫瘍サンプルに対してＦＡＣＳ分析を実施する。
結果は、図７に示されたとおりである。ＦＡＣＳ分析は、ＣＣＬ２８抗体で処理されたマウスの胃における制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の有意な現象が確認される（図７Ａ）。興味深いことに、抗ＣＣＬ２８治療は、脾臓のＴｒｅｇ細胞の比率も減少させるが、血液中のＴｒｅｇ細胞の比率を減少せず、これは、ケモカインＣＣＬ２８に依存するＴｒｅｇ動員メカニズムが脾臓および胃に存在することを示す。効果的な免疫療法には末梢免疫の活性化および協調が必要であるため、胃に対する直接的な効果に加えて、脾臓におけるＣＣＬ２８抗体治療の作用も、全体的な免疫応答を高める可能性がある。まとめると、これらのデータは、抗ＣＣＬ２８療法が、Ｔｒｅｇの動員を阻害することにより、Ｈ．ｆｅｌｉｓ／ＭＮＵによって誘導される胃がんの進行を効果的に阻害することを示唆する。
注意すべきは、ＩＦＮγ＋のＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出することにより（図７ＢおよびＣ）、これらのエフェクターＴ細胞が脾臓または末梢血である程度向上されるが、胃に明らかな変化がない結果を示し、これは、ＣＣＬ２８抗体治療が末梢免疫の活性を向上させることができるが、固形腫瘍に対するエフェクターＴ細胞の浸潤にはほとんど影響を与えないことを示す。
実施例８．黒色腫および乳がんに対して明らかな治療効果がないＣＣＬ２８抗体
本実施例において、他の癌に対するＣＣＬ２８抗体治療の治療効果が検証される。方法は、次のとおりである。マウス黒色腫細胞Ｂ１６および乳がん細胞４Ｔ１を使用して、皮下移植腫瘍を構築する、対数成長期の細胞を取り、トリプシン処理した後にＰＢＳで再懸濁する。６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに麻酔をかけ、シェーバーでマウスの前肢の脇の下を処理し、７５％のアルコールで露出した皮膚を消毒する。細胞密度を調整した細胞懸濁液をマウスの前肢の脇の下には接種し、腫瘍の成長状況を毎日観察および記録する。ここで、Ｂ１６細胞は、５×１０５個／匹であり、４Ｔ１細胞は、１×１０６個／匹である。Ｂ１６移植腫瘍マウスおよび４Ｔ１移植腫瘍マウスは、細胞接種後３～７日目にＣＣＬ２８抗体で処理され、処理方法および用量は、実施例６と同じである。
本実施例において、他の癌に対するＣＣＬ２８抗体治療の治療効果が検証される。方法は、次のとおりである。マウス黒色腫細胞Ｂ１６および乳がん細胞４Ｔ１を使用して、皮下移植腫瘍を構築する、対数成長期の細胞を取り、トリプシン処理した後にＰＢＳで再懸濁する。６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに麻酔をかけ、シェーバーでマウスの前肢の脇の下を処理し、７５％のアルコールで露出した皮膚を消毒する。細胞密度を調整した細胞懸濁液をマウスの前肢の脇の下には接種し、腫瘍の成長状況を毎日観察および記録する。ここで、Ｂ１６細胞は、５×１０５個／匹であり、４Ｔ１細胞は、１×１０６個／匹である。Ｂ１６移植腫瘍マウスおよび４Ｔ１移植腫瘍マウスは、細胞接種後３～７日目にＣＣＬ２８抗体で処理され、処理方法および用量は、実施例６と同じである。
結果は、ＣＣＬ２８抗体または対照ＩｇＧ抗体を使用して治療した後、ＣＣＬ２８抗体がマウス移植腫瘍の成長（図８ＡおよびＢ）および生存率（図８ＣおよびＤ）において明らかな治療有効性を示さなかったことを示す。
まとめおよび議論
本発明者らは、胃がん細胞において、癌における一般的な発がん遺伝子経路の一つであるＷｎｔ／β－カテニンとＣＣＬ２８の発現との相乗効果を発見し、このような効果により、腫瘍内の制御性Ｔ細胞が増加される。後続の多数の創造的研究を通じて、本発明者らは、胃がんにおいて、ＣＣＬ２８のモノクローナル遮断抗体を使用することにより、腫瘍における制御性Ｔ細胞の浸潤を効果的に減少させ、かつ腫瘍の発展を阻害できることを予期せずに発見した。これらの創造的な研究結果は、Ｗｎｔ／β－カテニンが細胞増殖および生存を直接調節する以外の免疫調節メカニズムを有し、新しい免疫治療標的ＣＣＬ２８を提供することを示唆する。
本発明者らは、胃がん細胞において、癌における一般的な発がん遺伝子経路の一つであるＷｎｔ／β－カテニンとＣＣＬ２８の発現との相乗効果を発見し、このような効果により、腫瘍内の制御性Ｔ細胞が増加される。後続の多数の創造的研究を通じて、本発明者らは、胃がんにおいて、ＣＣＬ２８のモノクローナル遮断抗体を使用することにより、腫瘍における制御性Ｔ細胞の浸潤を効果的に減少させ、かつ腫瘍の発展を阻害できることを予期せずに発見した。これらの創造的な研究結果は、Ｗｎｔ／β－カテニンが細胞増殖および生存を直接調節する以外の免疫調節メカニズムを有し、新しい免疫治療標的ＣＣＬ２８を提供することを示唆する。
さらに意外なことには、本発明は、比較実験を通じて、Ｗｎｔ／β－カテニンとＣＣＬ２８との結合効果が、特殊な病理学的状況、即ち胃がんにおいて独特に存在し、他の腫瘍、さらには黒色腫細胞Ｂ１６および乳がん細胞４Ｔ１モデル等の他の固形腫瘍にも存在しないことを証明する。
一方、最近の研究は、制御性Ｔ細胞のアポトーシスは、より高い免疫阻害性につながる可能性があり、制御性Ｔ細胞のアポトーシスを直接標的とする免疫治療方法は、最適な治療効果を達成末うことができないことを示唆する。しかし、本発明は、ＣＣＬ２８走化性経路を遮断するための方法を構築し、制御性Ｔ細胞のアポトーシスに影響を与えずに、制御性Ｔ細胞の腫瘍への遊走プロセスを標的とし、制御性Ｔ細胞を標的とする免疫療法のために新規で効果的な手段を提供することができる。そして、長期的に罹患している胃がんおよび免疫治療を受けている患者にとっては、自己免疫力の低下およびそれに由来する疾患は、致死に至る重要な原因である。従って、本発明によって提供される方法は、胃がんの転移を効果的に阻害することができるだけでなく、患者の自己免疫力を低下させず、さらに全体的な免疫を向上させることもできる。
これに加えて、本発明は、大量の臨床データを通じて、ＣＣＬ２８およびその受容体レベルト胃がんの発生および重症度との相関関係を初めて確認し、それにより胃がんの発生、転移および予後を正確に把握できる検出システムを開発することができる。
まとめると、ＣＣＬ２８遮断療法は、癌治療における臨床応用の大きな可能性を秘めており、他の免疫療法の有効性を向上させる可能性がある。
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態もまた添付の本出願の特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態もまた添付の本出願の特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。
Claims (15)
- ＣＣＬ２８遺伝子またはＣＣＬ２８タンパク質またはその検出試薬の用途であって、
胃がんを検出するための試薬またはキットの調製に使用され、前記胃がんは、Ｗｎｔ／β－カテニン（ｃａｔｅｎｉｎ）シグナル伝達経路およびケモカインＣＣＬ２８関連分子の発現が同時に異常にアップレギュレートされる胃がんであることを特徴とする、用途。 - 前記胃がんの病理学的症状は、
（１）胃組織におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路関連発現のアップレギュレーション、
（２）胃組織におけるケモカインＣＣＬ２８関連発現のアップレギュレーション、
（３）胃腫瘍、
（４）胃壁細胞の喪失、および
（５）胃組織制御性Ｔ細胞の増加
からなる群から選択される一つまたは複数の病理学的症状を有することを特徴とする、
請求項１に記載の用途。 - 前記胃がんは、ｉｎｓｉｔｕ胃がん、腸型胃がん、およびびまん性胃がんを含むことを特徴とする、
請求項１に記載の用途。 - 前記Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路関連発現は、転写因子ＴＣＦ１およびＴＣＦ４の発現レベル、β－カテニンの含有量、β－カテニン核異所性レベル、β－カテニン／ＴＣＦ４複合体の転写活性、ＧＳＫ３βリン酸化レベルまたはその組み合わせを含むことを特徴とする、
請求項１に記載の用途。 - 前記ケモカインＣＣＬ２８関連分子は、ＣＣＬ２８およびその受容体の遺伝子、タンパク質、またはその組み合わせを含むことを特徴とする、
請求項１に記載の用途。 - 前記試薬は、ＣＣＬ２８関連分子の特異的プライマー、特異性抗体、プローブおよび／またはチップを含むことを特徴とする、
請求項１に記載の用途。 - 胃がんを検出するためのキットであって、
前記キットには容器が含まれ、前記容器には、ＣＣＬ２８関連タンパク質またはｍＲＮＡを検出するための検出試薬、およびラベルまたは説明書が含まれ、前記ラベルまたは説明書には、前記キットは胃がんの検出に使用されることが記載されることを特徴とする、キット。 - 前記胃がんは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路におけるケモカインＣＣＬ２８関連分子の発現が同時に異常にアップレギュレートされる胃がんであることを特徴とする、
請求項７に記載のキット。 - 前記検出試薬は、特異的プライマー、特異性抗体、プローブおよび／またはチップを含むことを特徴とする、
請求項７に記載のキット。 - 前記ラベルまたは説明書に記載される内容が、以下からなる群から選択される、請求項７に記載のキット：
ａ）傍がん性組織におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量Ａ０に対する被験対象のＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量Ａ１の比率（Ａ１／Ａ０）が≧２である場合、当該被験対象が胃がんに罹患する確率が普通人群よりも高いことを示すこと、
ｂ）傍がん性組織におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量に対する被験対象におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量の比率Ａ１／Ａ０が≧２である場合、当該Ａ１／Ａ０比が高いほど、前記被験対象の胃がんの悪性の程度が高いことを示すこと、および
ｃ）傍がん性組織におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量に対する被験対象におけるＣＣＬ２８関連タンパク質のｍＲＮＡ発現量の比率Ａ１／Ａ０が≧２である場合、当該Ａ１／Ａ０比が高いほど、前記被験対象の胃がんの予後が悪く、転移率が高いことを示すこと。 - ＣＣＬ２８阻害剤の用途であって、
癌細胞の成長または増殖を阻害するための医薬組成物を調製するために、または胃がんを治療するための医薬組成物を調製するために、前記胃がんは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路およびケモカインＣＣＬ２８関連分子の発現が同時に異常にアップレギュレートされる胃がんであることを特徴とする、用途。 - 前記ＣＣＬ２８阻害剤は、ＣＣＬ２８および／またはその受容体タンパク質を標的とする抗体または小分子阻害剤、ＣＣＬ２８および／またはその受容体遺伝子を標的とする標的核酸分子または遺伝子エディター、またはその組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、
請求項１１に記載の用途。 - 癌細胞の成長または増殖を阻害するためのインビトロでの非治療的方法であって、
ＣＣＬ２８阻害剤の存在下で、癌細胞を培養することにより、癌細胞の成長または増殖を阻害する段階を含むことを特徴とする、癌細胞の成長または増殖を阻害するためのインビトロでの非治療的方法。 - 癌を治療するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験群において、試験化合物を細胞の培養系に添加し、試験群の前記細胞におけるＣＣＬ２８関連分子の発現量および／または活性を観察し、対照群において、試験化合物を同じ細胞の培養系に添加せず、対照群の前記細胞におけるＣＣＬ２８関連分子の発現量および／または活性を観察する段階を含み、
ここで、試験群の細胞におけるＣＣＬ２８関連分子の発現量および／または活性が対照群よりも低い場合、当該試験化合物がＣＣＬ２８関連分子の発現および／または活性に対して阻害効果を有する癌治療の候補化合物であることを表すことを特徴とする、癌を治療するための候補化合物をスクリーニングする方法。 - 胃がんを阻害または治療するための方法であって、
治療を必要とする対象に安全かつ有効量のＣＣＬ２８関連分子阻害剤を投与する段階を含み、前記胃がんは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路におけるケモカインＣＣＬ２８関連分子の発現が同時に異常にアップレギュレートされる胃がんであることを特徴とする、胃がんを阻害または治療するための方法。
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