MX2012009730A - Tratamiento o prevencion de una infeccion. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con un método para reducir la incidencia o gravedad de una enfermeda o condición en un sujeto, la enfermedad o condición será una asociada con la presencia de un patógeno microbiano en un tejido oral de un sujeto, e incluye el uso de una composición para formar un anti-microbiano y un agente inmunógeno contra un microbio patógeno.

Description

TRATAMIENTO O PREVENCIÓN DE UNA INFECCIÓN CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona con el tratamiento o prevención de enfermedades o condiciones en un sujeto, las enfermedades o condiciones están asociadas con la presencia de un patógeno microbiano en un tejido oral de un sujeto y, en particular, aunque no exclusivamente, con el tratamiento o prevención de enfermedades o condiciones relacionadas con P. gingivalis .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La boca constituye uno de los sitios principales de infección. La infección puede conducir a una enfermedad debilitante del tejido oral y también se ha observado una clara asociación entre la infección de un tejido oral y la enfermedad o condición en otros compartimentos anatómicos.

La periodontitis crónica es un ejemplo de una enfermedad del tejido oral. Esta es una enfermedad inflamatoria de los tejidos que soportan los dientes que conduce a la resorción de hueso alveolar y con el tiempo pérdida de los dientes. La enfermedad es un problema principal de salud pública en todas las sociedades y se estima que afecta hasta el 15% de la población adulta con formas graves que afectan al 5-6%.

El desarrollo y progresión de la periodontitis crónica se ha asociado con bacterias Gram-negativas especificas en la placa subgingival. La presencia de Porphyromonas gingivalis en la placa subgingival se ha asociado en gran medida con la enfermedad.

La persistencia de P. gingivalis en la placa subgingival de pacientes con periodontitis después del tratamiento (raspado y alisado radicular) se ha reportado que está asociada significativamente con pérdida progresiva de hueso alveolar. Además, se ha mostrado que un aumento en los números de células de P. gingivalis en la placa subgingival se correlaciona con la gravedad de la enfermedad, según se mide por la pérdida de fijación, profundidad de la bolsa periodontal y sangrado en el sondeo.

Se ha mostrado que la infección oral con P. gingivalis induce pérdida ósea periodontal en ratones, ratas y primates no humanos. Además, existe una vinculación cada vez mayor de la enfermedad periodontal, y de la infección por P. gingivalis, con enfermedades cardiovasculares y ciertos cánceres .

Muchos otros patógenos microbianos, entre los que se incluyen otras bacterias, hongos, virus y protozoarios se han asociado con la enfermedad del tejido oral y algunos de estos patógenos también provocan enfermedad en otros compartimentos anatómicos vía la infección del tejido oral. Los ejemplos de los anteriores incluyen G. denticola y G. forsythia . La infección por Streptococcus del grupo A es un agente etiológico de la fiebre reumática y la enfermedad cardiaca reumática.

Un problema ha sido que no es clara la forma de obtener una fuerte respuesta protectora contra un patógeno microbiano determinado en circunstancias donde el tejido mucoso se ha inflamado crónicamente, o donde la inflamación aguda del tejido mucoso ha surgido a partir de una intervención quirúrgica y otra dental.

En la especificación no se hace referencia a ninguna técnica anterior, y no se debe tomar como un conocimiento de cualquier forma de sugerencia que esta técnica anterior forme parte del conocimiento general común en Australia o cualquier otra jurisdicción o que esta técnica anterior se podría esperar razonablemente que esté establecida, entendida y considerada como relevante por un experto en la técnica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En ciertas modalidades, se proporciona un método para reducir la incidencia o gravedad de una enfermedad o condición en un sujeto, la enfermedad o condición será una asociada con la presencia de un patógeno microbiano en un tejido oral de un sujeto, el método incluye: tratar a un sujeto, proporcionando con esto las condiciones para la eliminación de prácticamente todos los microorganismos o fragmentos de los mismos del tejido oral del sujeto; después de esto proporcionar un anticuerpo en el sujeto, el anticuerpo para proteger al sujeto contra un patógeno microbiano, la presencia del mismo en el tejido oral se asocia con una enfermedad o condición; reduciendo con esto la incidencia o gravedad de una enfermedad o condición en un sujeto.

En una modalidad, el anticuerpo se proporciona en el sujeto al administrar un inmunógeno al sujeto, el inmunógeno para proteger al sujeto contra un patógeno microbiano .

En una modalidad, se proporciona un método para reducir la incidencia o gravedad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, el método incluye: tratar a un sujeto, eliminando con esto prácticamente todos los microorganismos o fragmentos de los mismos de un tejido oral del sujeto; después de esto administrar una proteina quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmunitaria contra P. gingivalis al sujeto, la proteina incluye un primer péptido unido directamente o a través de un enlazante con un segundo péptido, en donde: (A) el primer péptido incluye: (i) una parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma, u homologa a la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1, o (ii) una parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma, u homologa a la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2, y (B) el segundo péptido incluye: (i) una parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de la P. gingivalis, o (ii) una parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma, u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de la P. gingivalis, o (iii) una parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma, u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis . reduciendo con esto la incidencia o gravedad de una enfermedad o condición en un sujeto.

En otras modalidades, se proporciona una composición o kit que incluye: un agente antimicrobiano para eliminar prácticamente todos los microorganismos o fragmentos de los mismos de un tejido oral del sujeto; un inmunógeno para inmunizar al sujeto contra un patógeno microbiano, la presencia del mismo en un tejido oral se asocia con una enfermedad o condición; la composición o kit para utilizarse en un método descrito anteriormente.

En ciertas modalidades, se proporciona un método para reducir la incidencia o gravedad de una enfermedad o condición en un sujeto, la enfermedad o condición están asociadas con la presencia de un patógeno microbiano en un tejido oral de un sujeto, el método incluye: realizar un procedimiento quirúrgico en el tejido oral de un sujeto; después de esto tratar al sujeto, proporcionando con esto las condiciones para eliminar prácticamente todos los microorganismos o los fragmentos de los mismos del tejido oral del sujeto; proporcionar un anticuerpo en el sujeto, el anticuerpo para proteger al sujeto contra un patógeno microbiano, la presencia del mismo en el tejido oral se asocia con una enfermedad o condición; reduciendo con esto la incidencia o gravedad de una enfermedad o condición en un sujeto.

En una modalidad el procedimiento quirúrgico es un procedimiento dental. Los ejemplos de procedimientos dentales incluyen desbridamiento, raspado y/o alisado radicular.

En una modalidad, la presente invención proporciona una composición para reducir la incidencia o gravedad de una enfermedad o condición en un sujeto, la enfermedad o condición están asociadas con la presencia de un patógeno microbiano en un tejido oral de un sujeto, la composición incluye un agente anti-microbiano como se describe en la presente y un inmunógeno como se describe en la presente.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una composición de la invención en la preparación de un medicamento para reducir la incidencia o gravedad de una enfermedad o condición en un sujeto, la enfermedad o condición están asociadas con la presencia de un patógeno microbiano en un tejido oral de un sujeto. Los ejemplos no limitantes de enfermedades incluyen placa dental, gingivitis, periodontitis, periodontitis crónica, caries dental, pérdida ósea, pérdida ósea alveolar y enfermedad de la arterial coronaria .

En otra modalidad, la invención proporciona una composición para el tratamiento o prevención de la enfermedad periodontal (y/o las otras condiciones identificadas en la presente como adecuadas para el tratamiento) que consiste de un ingrediente activo de un agente antimicrobiano como se describe en la presente y un inmunógeno como se describe en la presente.

En otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende un agente antimicrobiano como se describe en la presente y un inmunógeno como se describe en la presente para utilizarse para reducir la incidencia o gravedad de una enfermedad o condición en un sujeto, la enfermedad o condición están asociadas con la presencia de un patógeno microbiano en un tejido oral de un sujeto.

En otra modalidad, la invención proporciona una composición como se describe en la presente para utilizarse como un medicamento.

En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de una composición de la invención como un ingrediente principal .

En una modalidad, se proporciona un método para formar una respuesta al anticuerpo o para formar una respuesta Th2 a un patógeno oral en un individuo, que incluye los pasos de: proporcionar un individuo en el cual se forme una respuesta al anticuerpo o Th2 a un patógeno oral; evaluar al individuo para determinar si el individuo tiene tejido oral inflamado; inmunizar al individuo con un patógeno oral en circunstancias donde la evaluación revele que el individuo no tiene tejido oral inflamado, formando con esto una respuesta al anticuerpos o una respuesta a Th2 para un patógeno oral en el individuo.

En una modalidad, se proporciona, en un régimen de inmunización para la formación de una respuesta al anticuerpo o la formación de una respuesta a Th2 para un patógeno oral en un individuo que tenga tejido oral inflamado, el paso de administrar un agente anti-inflamatorio al individuo, reduciendo al mínimo con esto la inflamación de, o la eliminación de la inflamación del tejido oral, antes de una inmunización del individuo para la formación de una respuesta al anticuerpo o una respuesta a Th2 para un patógeno oral.

En otra modalidad, se proporciona un método para acondicionar a un individuo que tenga un tejido oral inflamado para formar una respuesta al anticuerpos o para formar una respuesta a Th2 para un patógeno oral con la inmunización con el patógeno, el método incluye el paso de administrar un agente anti-inflamatorio al individuo, reduciendo al mínimo con esto la inflamación de, o la eliminación de la inflamación del tejido oral, antes de una inmunización del individuo con un patógeno para la formación de una respuesta de anticuerpos o la formación de una respuesta Th2 para un patógeno oral.

En una modalidad adicional, se proporciona un método para formar una respuesta de anticuerpos o formar una respuesta Th2 para un patógeno oral en un individuo que tenga tejido oral inflamado que incluye los pasos de: proporcionar un individuo que tenga tejido oral inflamado; aplicar un tratamiento al individuo, eliminando con esto la inflamación del tejido oral; después de esto; inmunizar al individuo con un patógeno oral, formando con esto una respuesta al anticuerpo o formando una respuesta Th2 para el patógeno en el individuo.

En las modalidades descritas anteriormente, se proporcionará una inmunización en el momento cuando el tejido oral no esté inflamado, o cuando la inflamación sea subclínica o asintomática .

Típicamente, una respuesta inmunitaria formada con la inmunización es predominantemente una respuesta a Th2, aunque puede contener componentes detectables de una respuesta a Thl.

Típicamente, la inflamación relevante es periodontitis crónica, en especial periodontitis asociada con la infección por P. gingivalis.

Cuando la periodontitis se asocia con una infección por P. gingivalis, típicamente un inmunógeno para inmunización es una célula de P. gingivalis, un fragmento, un metabolito, o un producto recombinante derivado de la misma, tal como los péptidos quiméricos (en especial KASl-KsAl, KAS2-KLA1) descritos en la presente.

Típicamente, el agente anti-inflamatorio o el agente anti-microbiano según se define en la presente, incluye o consiste en uno o más de un compuesto antiinflamatorio, un antibiótico y un agente anti-biopelícula, los ejemplos de los mismos se describen con mayor detalle en la presente.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, excepto cuando el contexto requiera lo contrario, el término "comprenden" y variaciones del término, tales como "que comprende", "comprende" y "comprendido", no se pretende que incluyan aditivos, componentes, enteros o pasos adicionales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1, muestra una tinción con azul Coomassie y el gel SDS-PAGE o proteínas Kgp recombinantes. Línea 1 = KAS2-KLA1, Línea 2 = KLA1, Línea 3 = KsAl, Línea 4 = KAS1-KsAl . Los marcadores de peso molecular se indican como kDa.

Las figuras 2A, 2B muestran el reconocimiento de anticuerpos del péptido KAS2 y las células W50 de P. gingivalis exterminadas con formalina. (A) el péptido KAS2 se sondeo con antisueros capaces de enfrenar a las células 50 de P. gingivalis exterminadas con formalina (FK-W50), las proteínas recombinantes KASl-KsAl, KAS2-KLA1, y el conjugado KAS2-DT sintético y PBS en un ELISA. (B) las células W50 de P. gingivalis exterminadas se sondearon con antisueros capaces de enfrentar las células 50 de P. gingivalis exterminadas (FK-W50) , las proteínas recombinantes KASl-KsAl, KAS2-KLA1, KLA1 y PBS en una ELISA. Las respuestas a anticuerpos se expresan como el título ELISA OD415 obtenido menos el doble del nivel antecedente, con cada título que representa la desviación media ± estándar de tres valores.

La figura 3, muestra la pérdida ósea horizontal inducida por P. gingivalis de los molares de ratones inmunizados con las proteínas recombinantes y las proteínas quiméricas recombinantes, P. gingivalis exterminada con formalina y adyuvante solo (PBS, IFA) o ratones infectados no oralmente (no inoculados) . En esta figura KAS2-KLA1 se muestra como AS2-LA1, KLA1 se muestra como LA1, KASl-KsAl se muestra como ASI-SAI, KsAl se muestra como sAl. La medición de la pérdida ósea es la media del área medida en milimetros cuadrados (mm2) a partir de la unión cemento-esmalte (CEJ) con la cresta de hueso alveolar (ABC) del costado bucal de cada molar maxilar de los maxilares tanto izquierdo como derecho. Los datos se distribuyeron normalmente según se mide mediante la homogeneidad de varianza de Levene y se presentan como la media (n = 12) en mm2 y se analizaron utilizando el análisis de varianza de una vía y la prueba T3 de Dunnett. *, indica que el grupo tuvo significativamente (P <0,001) menos pérdida ósea que el grupo control (infectado) . i, indica que el grupo tuvo significativamente (P <0,001) más pérdida ósea que el grupo AS2-LA1.

Las figuras 4A, 4B, muestran las respuestas de la subclase de anticuerpos séricos de ratones inmunizados en el modelo de periodontitis . Los sueros a partir de ratones; A (inoculación pre-oral) y B (inoculación pos-oral) inmunizados con proteínas las recombinantes, KsAl, KLA1, KASl-KsAl y KAS2-KLA1 y la cepa W50 de P. gingivalis exterminada con formalina se utilizaron en el ELISA con la cepa W50 de P. gingivalis exterminada con formalina como el antígeno adsorbido. Las respuestas anticuerpos IgG (barras negras) , IgGl (barras grises), IgG2a (barras blancas), IgG2b (barras con franjas horizontales), IgG3 (barras con franjas diagonales), se expresan como el título ELISA (log 2) obtenido, menos el nivel antecedente, con cada título que representa la desviación media ± estándar de tres valores.

Las figuras 5A, 5B, muestra un análisis PEPSCAN de la reactividad de los anticuerpos péptidos-especí fíeos para el solapamiento de péptidos que representan la secuencia de péptido KAS2 433-468. (A) solapamiento de péptidos KAS2 (desplazamiento 1, solapamiento 7) sondeado con KASl-KsAl (barras blancas), antisuero KAS2-KLA1 (barras negras) . (B) solapamiento de péptidos KAS2 (desplazamiento, solapamiento 7) sondeado con antisueros conjugados KAS2-DT . Cada barra muestra la reactividad de anticuerpos (densidad óptica [OD] a 415 nm) .

Las figuras 6A, 6B y 6A, la quimera AS2-LA1 induce una respuesta a anticuerpos en ratones criados por fuera que reconocen las células enteras de P. gingivalis y el complejo RgpA-kgp. Los ratones criados por fuera CD1 se inmunizaron con la quimera AS2-LA1 (50mg/ratón) y los sueros recolectados se utilizaron en ELISA con AS2-LA1 (A) , la cepa 50 de P. gingivalis exterminada con formalina (B) y el complejo RgpA-kgp (C) como los antígenos absorbidos. En esta figura KAS2-KLA1 se muestra como AS2-LA1. Se determinó el título para cada isotipo de inmunoglobulina para cada antigeno y los datos se expresan como el titulo ELISA ( '000) obtenido menos el doble del nivel antecedente, con cada titulo que representa la desviación media ± estándar de tres valores.

La figura 7, modelo de proteina de la proteinasa kgp. KAS2 [Asn433-Lys468] . (A) KAS4 [Asp388-Val395] (B) , KAS5 [Asn510-Asp516] (C) y KAS6 [Ile570-Tyr580] (D) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ahora se hará referencia en detalles a ciertas modalidades de la invención. Mientras que la invención se describirá junto con las modalidades, se debe entender que la intención no limita la invención a estas modalidades. Por el contrario, la invención pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes, que se puedan incluir dentro del alcance de la presente invención según se define por las reivindicaciones.

Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente, que se podrían utilizar en la práctica de la presente invención. La presente invención no se limita de ninguna forma a los métodos y materiales descritos.

Se debe entender que la invención descrita y definida en esta especificación se extiende a todas las combinaciones alternativas de dos o más de las características individuales mencionadas o evidentes a partir del texto o los dibujos. Todas estas combinaciones diferentes constituyen diversos aspectos alternativos de la invención.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, excepto en donde el contexto de lo requerido de otra forma, el término "comprenden" y variaciones del término, tales como "que comprende", "comprende" y "comprendido", no pretenden excluir aditivos, componentes, enteros o pasos adicionales.

Los inventores han encontrado que una respuesta mejorada a la infección, en especial, una respuesta mejorada a anticuerpos se puede obtener al eliminar prácticamente todos los estímulos inflamatorios del tejido oral, antes de, proporcionar una transferencia adoptiva de inmunidad en el tejido, o en el momento de invocar una respuesta inmunitaria en el tejido. El hallazgo es particularmente útil en tanto que se proporciona para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad en el tejido oral y, por extensión, para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad que surge en otros compartimentos anatómicos como una consecuencia de la infección del tejido oral mediante un patógeno microbiano.

De esta forma, en ciertas modalidades, se proporciona un método para reducir la incidencia o gravedad de una enfermedad o condición en un sujeto, la enfermedad o condición será una asociada con la presencia de un patógeno microbiano en un tejido oral de un sujeto, el método incluye: tratar a un sujeto, proporcionando así las condiciones para la eliminación de prácticamente todos los microorganismos y fragmentos de los mismos del tejido oral del sujeto; después de esto proporcionar un anticuerpo en el sujeto, el anticuerpo para proteger al sujeto contra un patógeno microbiano, la presencia del mismo en el tejido oral se asocia con una enfermedad o condición; reducir con esto la incidencia o gravedad de una enfermedad o condición en un sujeto.

En una modalidad, el anticuerpo se proporciona al sujeto al administrar un inmunógeno al sujeto, el inmunógeno para proteger al sujeto contra un patógeno microbiano.

En una modalidad, se proporcionan cantidades efectivas de una composición anti-microbiana para tratar a un sujeto, proporcionando con esto las condiciones para la eliminación de prácticamente todos los microorganismos y fragmentos de los mismos del tejido oral del sujeto y un inmunógeno .

Típicamente, el sujeto denominado en la presente es un animal, en especial un mamífero. En una modalidad, el mamífero es un ser humano. En ciertas modalidades, el mamífero puede ser un animal domesticado o de granja. Los ejemplos de animales domesticados o de granja incluyen caballos, cabras, cerdos y ganado, como ganado vacuno y ovejas. En ciertas modalidades el animal es un animal de compañía, tal como un perro, gato, conejo o cobayo. 1. Definiciones La frase "eliminación de prácticamente todos los microorganismos y fragmentos de los mismos del tejido oral" en general se refiere a proporcionar las condiciones en las cuales los microorganismos o fragmentos o metabolitos de los mismos se reduzcan del tejido en una cantidad suficiente para reducir los estímulos inflamatorios del tejido, reduciendo o reduciendo al mínimo prácticamente uno o más de los síntomas de la inflamación en el tejido. Esto es particularmente el caso cuando el sujeto relevante tiene inflamación crónica del tejido que resulta de la infección crónica. En general, la atención se centra en reducir al mínimo la inflamación del tejido. Por consiguiente, se debe entender que algunos microorganismos, fragmentos y metabolitos de los mismos pueden permanecer después del paso de tratamiento relevante.

En otras modalidades donde el individuo no tiene tejido inflamado, la frese "eliminación de prácticamente todos los microorganismos y fragmentos de los mismos del tejido oral" se refiere a proporcionar las condiciones en las cuales evitar prácticamente la acumulación de microorganismos, fragmentos y metabolitos de los mismos a una cantidad que pudiera provocar la inflamación. Este es particularmente el caso donde el sujeto para tratamiento es normal o de otra manera asintomático para una enfermedad o condición. Lo mismo se aplica cuando una intervención quirúrgica o dental ha eliminado los microorganismos y el objetivo es asegurar que se proporcionen las condiciones que eviten prácticamente la acumulación de microorganismos que pudieran provocar una inflamación. En estas modalidades, el objetivo es evitar la acumulación de cantidades de microorganismos que podrían provocar inflamación, se debe entender que algunos microorganismos, fragmentos o metabolitos del mismo se podrían acumular después del paso de tratamiento relevante.

La frase "reducir la incidencia de una enfermedad o condición" en general se refiere a reducir al mínimo la probabilidad de un sujeto -que sea un individuo normal o asintomática, o un sujeto que tenga una forma temprana de una enfermedad o condición- de progresar a una forma completa activa de la enfermedad o condición. En ciertas modalidades, la frase se refiere a evitar que un sujeto determinado progrese a una forma completa activa de una enfermedad o condición .

La frase "reducir la gravedad de una enfermedad o una condición" en general se refiere a reducir al mínimo uno o más de los síntomas o manifestaciones de una enfermedad o condición. En ciertas modalidades, la frase se refiere al tratamiento de un individuo que tenga una enfermedad o condición .

Un " inmunógeno" en general se refiere a una molécula que sea capaz de invocar o producir una respuesta inmunitaria a un antígeno, de preferencia una respuesta humoral o anticuerpo, por ejemplo, una respuesta a Th2. Los ejemplos de inmunógenos incluyen péptidos y proteínas relacionadas .

La frase "cantidades sinérgicamente efectivas" en general se refiere a cantidades de una composición antimicrobiana e inmunógeno que proporcionen un tratamiento o un efecto preventivo o protector que sea mayor que el efecto que se pueda alcanzar por la composición o inmunógeno cuando cada uno se utiliza solo. En una modalidad, las cantidades sinérgicamente efectivas de la composición anti-microbiana y el inmunógeno sustentan una interrelación de trabajo novedosa entre la composición y el inmunógeno con lo cual el efecto protector o terapéutica del inmunógeno es mucho mayor del que se podría alcanzar cuando se aplica el inmunógeno solo a tejido inflamado. Típicamente, las cantidades sinérgicamente efectivas de una composición microbiana y un inmunógeno proporcionan un título mayor y una respuesta a anticuerpos con mayor afinidad para patógenos microbianos que la que se podría producir cuando el inmunógeno se utiliza solo.

La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" en general se refiere a una cantidad de un compuesto de la presente invención que (i) cure la enfermedad condición o trastorno particular, (ii) atenúe, disminuya o elimine uno o más de los síntomas de la enfermedad condición, o trastorno, en particular, o (iii) retarde la aparición de uno o más de los síntomas de la enfermedad condición o trastornos, particular, descritos en la presente.

Las palabras "tratar" o "tratamiento" se refieren a un tratamiento terapéutico, en donde el objetivo es disminuir (reducir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, de manera enunciativa, el alivio de los síntomas, la disminución del grado de enfermedad, el estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, el retraso o disminución del progresión de la enfermedad, la mejora o instigación del estado de enfermedad, y la remisión (ya sea parcial o total) , si es detectable o indetectable . "Tratamiento", también puede significar la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. El tratamiento puede no necesariamente dar por resultado en la depuración completa de una infección, aunque puede reducir o reducir al mínimo las complicaciones y efectos secundarios de la infección y el progreso de la infección. El éxito o de otra manera el tratamiento se pueden monitorear mediante el examen físico del individuo mediante técnicas citopatológicas, de ADN serológicos, o para la detección de ARNm.

Las palabras "prevenir" y "prevención" en general se refieren a medidas profilácticas o preventivas para proteger o evitar que un individuo tenga una infección determinada relacionada con la progresión o progreso de esta complicación. Los individuos en los cuales se requiere la prevención incluyen aquellos que tengan una infección.

La frase "farmacéuticamente aceptable" indica que la sustancia o composición debe ser compatible química y/o toxicológicamente, con los otros ingredientes que comprenden una formulación, y/o el mamífero que será tratado con la misma .

El término "inserto en paquete" se utiliza para hacer referencia a las instrucciones habitualmente incluidas en los empaques comerciales de productos terapéuticos, que contienen la información relacionada con las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias que se relacionan con el uso de estos productos terapéuticos .

Una respuesta a Thl en general se refiere a una respuesta que implica citoquinas tales como gamma interferón y TNF.

Una respuesta a Th2 en general se refiere a una respuesta que implica citoquinas tales como interleucina-4 , interleucina-5 , interleucina-6, interleucina-10, interleucina-13 , etc. 2. Métodos de tratamiento Los métodos de la invención se pueden aplicar a una amplia gama de sujetos, entre los que se incluyen aquellos que sean asintomáticos para la enfermedad o condición. Estos individuos pueden no tener los síntomas de la enfermedad en el tejido oral u otro tejido. Específicamente, estos individuos pueden no presentar inflamación del tejido mucoso u otro tejido oral. En una modalidad, estos individuos pueden tener, en el contexto de una serie de sujetos seleccionados aleatoriamente, una abundancia relativa normal de patógenos microbianos en la cavidad oral.

En otras modalidades, el sujeto manifiesta síntomas sub-clinicos o clínicos de una enfermedad o condición del tejido oral u otro compartimento anatómico.

Los síntomas de la enfermedad o condición se pueden manifestar en el tejido oral del sujeto. Pueden estar presentes contrastes de la inflamación aguda incluyendo un movimiento aumentado de plasma y leucocitos de la sangre en los tejidos lesionados. Las señales clínicas de infección aguda de la encía pueden estar presentes incluyendo rubor (enrojecimiento), calor (temperatura elevada), tumor (hinchazón) , dolor (molestia) , y functio laesa (pérdida de la función) . La inflamación crónica puede ser caracterizada por la infiltración de células de leucocitos (monocitos, macrófagos, linfocitos, células plasmáticas) . Se puede observar pérdida de tejido y hueso. Los ejemplos de inflamación incluyen queilitis, gingivitis, glositis y estomatitis .

En una modalidad, el sujeto puede tener tejido mucoso u otro tejido oral inflamado. Por ejemplo, el sujeto puede presentar inflamación aguda del tejido oral. Los ejemplos de estos sujetos incluyen aquellos que se hayan sometido a cirugía dental u oral incluyendo desbridamiento, raspado y alisado radicular.

En modalidades adicionales, el sujeto puede presentar inflamación crónica del tejido oral. En un ejemplo, el sujeto puede presentar gingivitis, resorción, de hueso alveolar y eventual pérdida de dientes que provienen de la pérdida progresiva de la unión de colágeno del diente al hueso alveolar. Son posibles otras lesiones de tejido mucoso y oral relacionado.

En una modalidad, la enfermedad o condición es una enfermedad o condición del tejido oral. La periodontitis crónica es un ejemplo particularmente importante. Otras incluyen enfermedades y condiciones caracterizadas por el daño a la mucosa oral como en la fiebre de escarlatina, estomatitis aftosa, granuloma piógeno, difteria, tuberculosis, sífilis, actinomicosis , candidiasis, estomatitis herpética.

Se debe entender que la enfermedad o condición puede ser una enfermedad o condición de un tejido distinto al tejido oral, tal como un órgano o sistema, por ejemplo, el sistema cardiovascular. En una modalidad, la enfermedad o condición es una enfermedad cardiovascular.

La invención se puede aplicar a una gama de patógenos microbianos, en especial aquellos que infectan los tejidos de la cavidad oral. En una modalidad, el patógeno se selecciona del grupo que consiste de bacterias, virus y hongos .

Las bacterias particularmente preferidas se seleccionan del grupo que consiste de: Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola , Tannerella forsythia .

En la siguiente TABLA A se muestran otros ejemplos de patógenos .

Tabla A En una modalidad, se administra al sujeto una composición que forma un agente anti-microbiano, eliminando con esto prácticamente todos los microorganismos o fragmentos de los mismos del tejido oral del sujeto. Los ejemplos se analizan más adelante.

En una modalidad, proporcionar en el sujeto un anticuerpo, por ejemplo al administrar un inmunógeno al sujeto, se presenta de una a dos semanas después del tratamiento de un sitio infectado mediante desbridamiento mecánico y/o la aplicación de uno o más de los agentes antimicrobianos como se define en la presente.

El nivel o presencia de los microorganismos, fragmentos o metabolitos de los mismos se puede determinar al detectar o medir una proteina o fragmento de la misma de un microorganismo .

En otra modalidad, el nivel o presencia de los microorganismos, fragmentos o metabolitos de los mismos en el tejido oral se puede determinar al tomar una muestra del individuo y determinar la presencia de una proteina determinada, o el nivel de expresión de una proteina determinada en la muestra. La presencia o nivel de una proteina se puede detectar mediante cualquier número de análisis. Los ejemplos incluyen inmunoanálisis , cromatografía y espectrometría de masas. Un ejemplo de un inmunoanálisis que se prefiere particularmente es FACS.

Los diversos análisis que se pueden utilizar para detectar la presencia de una proteína blanco en una muestra incluyen: inmunoanálisis enlazado a enzimas (ELISA) : Este método implica la fijación de una muestra, por ejemplo saliva o tejido oral, que contenga una proteina blanco, péptido o un fragmento del mismo a una superficie asi como una placa microtituladora . Un anticuerpo especifico de la proteina blanco acoplado a una enzima se aplica y se deja unir a la proteina blanco, péptido o fragmento del mismo. La presencia del anticuerpo luego se detecta y se cuantifica mediante una reacción colorimétrica que emplea la enzima acoplada al anticuerpo. Las enzimas comúnmente empleadas en este método incluyen peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. Si se calibra bien y queda dentro de la variación lineal de respuesta, la cantidad de proteina blanco, péptido o fragmento del mismo presente en la muestra es proporcional a la cantidad de color producido. Una proteína blanco, péptido o fragmento del mismo estándar en general se emplea para mejorar la exactitud cuantitativa.

Transferencia Western: Este método implica la separación de una proteína blanco, péptido o fragmento del mismo de otra proteína por medio de un gel de acrilamida seguido por transferencia de la proteína, péptido o fragmento del mismo a una membrana (por ejemplo, nilón o PVDF) . La presencia de la proteína blanco, péptido o fragmento del mismo se detecta mediante los anticuerpos específicos para la proteína blanco, péptido o fragmento, que a su vez se detectan mediante los reactivos de unión a anticuerpos. Los reactivos de unión a anticuerpos pueden ser, por ejemplo, proteína A, u otros anticuerpos. Los reactivos de unión a anticuerpos se pueden radiomarcar o enlazar por enzimas como se describió anteriormente. La detección puede ser mediante autorradiografía , reacción colorimétrica o quimioluminiscencia . Este método permite tanto la cuantificación de una cantidad de la proteína blanco, péptido o fragmento del mismo como la determinación de su identidad mediante una posición relativa sobre la membrana lo cual es indicativo de una distancia de migración en el gel de acrilamida durante la electroforesis .

Radio-inmunoanálisis (RIA) : En una versión, este método implica la precipitación de la proteína blanco, péptido o fragmento del mismo deseado con un anticuerpo específico y la proteína de unión al anticuerpo radiomarcado (por ejemplo, la proteína A marcada con I125) inmovilizada sobre un portador precipitable tal como perlas de agarosa. El número de cuenta en el sedimento precipitado es proporcional a la cantidad de la proteína blanco, péptido o fragmento del mismo.

En una versión alternativa del RIA, se emplean una proteína blanco marcada, péptido o fragmento del mismo y una proteína de unión a anticuerpos sin marcar. Una muestra que contiene una cantidad desconocida de una proteina blanco, péptido o fragmento del mismo se agrega en cantidades variables. La disminución en los conteos precipitados de la proteina blanco marcada, péptido o fragmento del mismo es proporcional a la cantidad de la proteína blanco, péptido o fragmento del mismo en la muestra agregada.

Separación celular activada por fluorescencia (FACS) : Este método implica la detección de una proteína blanco, péptido o fragmento del mismo in situ en células mediante los anticuerpos específicos de la proteína blanco, péptido o fragmento del mismo. Los anticuerpos específicos de la proteína blanco, péptido o fragmento del mismo se enlazan a fluoróforos. La detección se realiza por medio de una máquina para separación de células que lee la longitud de onda de la luz emitida de cada célula a medida que pasa a través de un haz de luz. Este método puede emplear dos o más anticuerpos simultáneamente.

Análisis inmunohistoquímicos : Este método implica la detección de una proteína blanco, péptido o fragmento del mismo in situ en células fijadas mediante los anticuerpos específicos de la proteína blanco, péptido o fragmento del mismo. Los anticuerpos específicos de la proteína blanco, péptido o fragmento del mismo se pueden enlazar enzimáticamente o enlazar a fluoróforos. La detección se realiza mediante microscopía y evaluación subjetiva o automática. Si se emplean anticuerpos enlazados a enzimas, se puede requerir una reacción colorimétrica . Se debe apreciar que la inmunohistoquímica con frecuencia va seguida por contratinción de los núcleos celulares utilizando, por ejemplo colorante de hematoxilina o Giemsa.

Análisis de actividad in situ: De acuerdo con este método, se aplica un sustrato cromogénico sobre las células que contienen una enzima activa y la enzima cataliza una reacción en la cual el sustrato se descompone para proporcionar un producto cromogénico visible mediante un haz de luz o un microscopio fluorescente.

Análisis de actividad in vitro: En estos métodos, se mide la actividad de una enzima particular en una mezcla de proteínas extraída de las células. La actividad se puede medir en un espectrofotómetro utilizando métodos colorimétricos o se puede medir en un gel de acrilamida desnaturalizante (es decir, gel para actividad) . Después de la electroforesis, el gel se empapa en una solución que contiene un sustrato y reactivos colorimétricos. La banda de color resultante corresponde a la actividad enzimática de la proteína de interés. Si se calibra bien y queda dentro de la variación lineal de respuesta, la cantidad de enzima presente en la muestra es proporcional a la cantidad de color producido. Una enzima estándar en general se emplea para mejorar la exactitud cuantitativa.

Además, la cantidad de ADN bacteriano se puede determinar mediante PCR cuantitativa como un indicador de la presencia o nivel de microorganismos en un tejido oral.

La presencia o nivel de una proteina de ADN proveniente de Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola , Tannerella forsythia se puede determinar y es indicativa que prácticamente todos los microorganismos o fragmentos de los mismos se han eliminado de un tejido oral de un sujeto.

El agente anti-microbiano y/o inmunógeno se pueden administrar sistémicamente, o directamente al tejido oral, en especial directamente a la mucosa oral.

En una modalidad, el tratamiento del sujeto elimina prácticamente todos los microorganismos o fragmentos de los mismos del tejido oral del sujeto, reduciendo al mínimo con esto la inflamación en el tejido oral del sujeto. En otra modalidad, el tratamiento del sujeto elimina prácticamente todos los microorganismos o fragmentos de los mismos del tejido oral del sujeto, reduciendo al mínimo con esto las respuestas inmunitarias en el tejido oral del sujeto.

El inmunógeno se puede administrar al sujeto después del tratamiento del sujeto para eliminar prácticamente todos los microorganismos y los fragmentos de los mismos del tejido oral del sujeto.

En general, de acuerdo con la invención, el tejido oral relevante no está inflamada, o no tiene inflamación, si está presente en absoluto es asintomática o subclinica en el momento de la inmunización.

Después de la inmunización, el sujeto exhibe una predominancia de una respuesta a Th2, que es en gran medida una respuesta humoral y el individuo tiene niveles detectables de anticuerpos protectores. 3. Composiciones En ciertas modalidades, se proporciona una composición que incluye: un agente antimicrobiano para eliminar prácticamente todos los microorganismos y los fragmentos de los mismos del tejido oral del sujeto; un inmunógeno para inmunizar al sujeto contra un patógeno microbiano, la presencia del mismo en el tejido oral está asociada con una enfermedad o condición; la composición capaz de ser utilizada en un método descrito anteriormente. 3. (a) Agentes antimicrobianos El agente antimicrobiano puede ser cualquier agente que, el efecto del mismo en la administración sea para reducir los estímulos inflamatorios. Estos agentes utilizados solos o en combinación tienen utilidad en la inhibición a corto plazo de la inflamación, la re-emergencia del patógeno periodontal, por ejemplo la formación de biopelículas , y/o la resorción de hueso periodontal. Estos agentes solos o en combinación se pueden aplicar, por ejemplo, tópicamente en una formulación de gel periodontal de liberación lenta, en un sitio periodontal, que puede haber experimentado una intervención quirúrgica, para preparar al sistema inmunitario del paciente para una vacunación contra los patógenos periodontales .

Sin estar vinculados a ninguna teoría o modo de acción, se cree que la aplicación de un agente antimicrobiano, en el sentido en el que se define en la presente, por ejemplo en una formulación de gel periodontal, en el momento del desbridamiento mecánico y la limpieza del sitio periodontal infectado, ayuda a preparar al sistema inmunitario para permitir el desarrollo una respuesta derivada de Th2. Esta respuesta derivada de Th2, da por resultado en la producción de anticuerpos protectores y la prevención de la re-emergencia de los patógenos periodontales y la prevención del progreso de la enfermedad.

En este contexto, los siguientes pueden ser agentes antimicrobianos : un antibiótico, un inmunosupresor y un antiséptico. En ciertas modalidades, el agente puede ser un agente anti-inflamatorio . Los agentes anti-inflamatorios incluyen fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (NSAID) . Los ejemplos de los NSAID incluyen compuestos que inhiben una ciclooxigenasa . Los ejemplos específicos de los NSAID incluyen: aspirina, ibuprofeno y naproxeno. Otros ejemplos de agentes anti-inflamatorios incluyen antagonistas de PAR-2 que incluyen, de manera enunciativa, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen a PAR-2, otro polipéptidos que se unen a PAR-2 e inhiben su actividad, otros compuestos que inhiben la actividad o expresión de PAR-2 incluyendo compuestos orgánicos pequeños y ácidos nucleicos inhibidores que interactúan con los ácidos nucleicos que codifican para PAR-2. Los antagonistas ilustrativos que pueden bloquear o desplazar un ligando endógeno de la unión con PAR-2 y/o la señalización vía PAR-2 incluyen aquellos descritos en la WO 2004/002418 y la WO 2006/023844 (por ejemplo, los péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos LIGK o LIGKV) . Los antagonistas que se unen a PAR-2 y evitan la segmentación proteolítica de la región de PAR-2 que actúa como un ligando encadenado se ejemplifican en la WO 2007/092640.

Los antagonistas que inhiben, reducen o bloquean la expresión de PAR-2 incluyen ácidos nucleicos inhibidores, entre los que se incluyen de manera enunciativa, ribozimas, oligonucleótidos para formación triplex (TFO) , secuencias de guia externa (EGS) que estimulan la segmentación mediante ácidos nucleicos del péptido de RNasa P, ADN antisentido, siARN y microARN especifico para ácidos nucleicos que codifican para PAR-2.

PAR-2 se puede inhibir indirectamente mediante "antagonistas indirectos" que antagonizan la actividad de las proteináceas que bajo circunstancias normales segmentan PAR-2 dando por resultado en su activación. Las proteináceas que pueden segmentar a PAR-2 incluyen gingipainas, tripsinas, triptasas y neutrófilos proteinasa-3. Los ejemplos de antagonistas indirectos que son útiles en un método de la invención o que se puede utilizar en una composición de la invención incluyen inhibidores de tripsina descritos en la O 93/14779 e inhibidores de triptasa descritos en la WO 02/47762.

En una modalidad particularmente preferida, el agente anti-microbiano es un antibiótico. Los ejemplos incluyen antibióticos seleccionados del grupo que consiste de macrólidos, tetraciclinas, penicilinas, inhibidores de fumarato reductasa y péptidos anti-microbianos, como se muestra en la siguiente TABLA B.

Tabla B Anti- Fármaco Nombre comercial en Australia infeccioso (Patrocinador) Macrólidos Roxitromicina Biaxsig (Sanofi-Aventis) Roxar (Sigma) Roxida (Sandoz) Roximicina (Alphapharm) Roxitromicin-RL (Real-RL) Rulide y Rulie D (Sanofi- Aventis ) Metronidazol Flagyl (Sanofi-Aventis) Suspensión de Flagyl S (Sanofi- Aventis ) Metrogyl (Alphapharm) Gel de metronidazol (Orion) Metronido ( Sanofi-Aventis ) Rozex (en forma de crema y gel) (Galderma) Eritromicina DBL Eritromicina (Hospira) EES (Link) E-Micina (Alphpharm) Cápsulas Eryc (Mayne Pharma International ) Clindamicina Cleocina (Pfizer) Cápsulas Dalacina C (Pfizer) Duac Once Daily Gel (Stiefel) Zindaclina (Genepharm) Espiramicina Rovamicina Tetraciclinas Minociclina Akamin (Alphapharm) Doxicilina Doryx (Mayne Pharma International ) Doxsig (Sigma) Tabletas de doxy (Genepharm) Tabletas de doxyhexal (Sandoz) Doxilina (Alphapharm) Frakas (Sigma) Capsulas de GenRX doxiciclina (Apotex) Tabletas de GenRX doxiciclina (Apotex) Vibramicina ( Pfizer) Antiséptico Clorhidrato de Antiséptico savlon (Reckitt clorhexidina Benckiser) Gluconato de Irrigaciones acuosas de clorhexidina clorhexidina y Cetrimida (Pfizer) Solución para irrigación con clorhexidina (Pfizer) Anti-inflamatorio Difflam-C solución antiséptica (iNova) Gel al 2% de lignocaina con clorhexidina 0.05% (Pfizer) Microshield 2 (J & J Medical) Microshield 4 (J & J Medical) Microshield 5 (J & J Medical) Tintura Microshield (J & J Medical ) Plaqacide Mouthrinse (Oral-B) Penicilinas Penicilina G BenPen (CSL) Penicilina V Abbocillin V, Abbocillin VK (Sigma) Cilicaine VK, Cilicaine V (Fawns & McAllen) Cilopen VK (Genepharm) LPV (Aspen) Penhexal VK (Hexal) Ampicilina Administrada como una inyección intramuscular o intravenosa Amoxicilina Cápsulas y suspensión de amoxicilina Sandoz (Sandoz) Tabletas de amoxicilina Sandoz (Sandoz ) Alphamox (Alphapharm) 10 Cápsulas de amohexal (Hexal) Jarabe de amohexal (Hexal) Amoxil Dúo (GlaxoSmithKline) Amoxil Oral (GlaxoSmithKline) Augmentin (GlaxoSmithKline) Tabletas augmentin Dúo, Augmentin Dúo Forte (GlaxoSmithKline) 15 Amoxicilina-DP (Genepharm) Cápsulas APO-amoxicilina (Apotex) Bgramin (Genepharm) Cápsulas amoxicilina Chemmart (Apotex) Cilamox (Sigma) Clamoxyl 125/31.25 (Alphapharm) Clamoxyl Dúo 500/125, Clamoxyl Dúo Forte 875/125 (Alphapharm) Jarabe Clavulin 125 ( enley & James) Clavulin Dúo 500/125 y tabletas Clavulin Dúo Forte (Menley & James ) Curam (Sandoz) GA-Amclav 500/125, tabletas GA- Amclav Forte 875/125 (Genepharm) GenRx Amoxycillin y Ácido Clavulanic 875 mg/125 mg (Apotex) Klacid Hp 7 (Abbott) Maxamox (Sandoz) Polvo de Maxamox para suspensión oral (Sandoz) Preparaciones orales de moxacina (Sandoz) Nexium Hp7 (AstraZeneca ) Ranmoxi (Ranbaxy) Cápsulas de Amoxicilina Terry White Chemists (Apotex) Suspensión de Amoxicilina Terry White Chemists (Apotex) Cefalosporinas Cefalexina Cefalexina Sandoz (Sandoz) lalex (Lennon) Ibilex (Alphapharm) Keflex (Aspen) Rancef (Ranbaxy) Sporahexal (Sandoz) Cefalexina Terry White Chemists En una modalidad, el agente anti-microbiano se selecciona de uno o más de agentes inhibidores o fumarato reductasa. Los agentes inhibidores adecuados incluyen productos naturales, que incluyen de manera enunciativa decursina, verticipirona, paecilaminol , 5-alquenil-3, 3 (2H) -furanonas a partir de Streptomyces spp., nafuredina, ácido mesacónico, rotenona, y análogos naturales, semisintéticos y sintéticos de los mismos. En otro aspecto, los agentes inhibidores pueden ser compuestos sintéticos que incluyen de manera enunciativa, 4 , 6-dinitrofenoles 2-sustituidos; N-óxido de mercaptopiridina; L-092, 201 (Merck Sharpe and Dohme) ; nitro-imidazoles tales como fexindazol megazol benznidazol, MK-436, L-634,549, misonidazol, o bencimidazoles tales como albendazol, cambendazol mebendazol, oxfendazol, parebendazol y tiabendazol, u oxantel o morantel. Los agentes inhibidores preferidos son oxantel, morantel o tiabendazol. Un agente inhibidor particularmente preferido es oxantel.

Se reconocerá por el experto que la selección del agente inhibidor dependerá de varios factores clínicos que determinan si el agente inhibidor es adecuado para utilizarse en un entorno clínico.

El antibiótico puede ser directamente citotóxico para el patógeno microbiano. En otras modalidades, el antibiótico es indirectamente citotóxico, por ejemplo, el antibiótico puede ser un inhibidor de la producción de biopelicula microbiana o algún otro metabolismo.

En una modalidad, el antibiótico es un péptido -microbiana. En la siguiente TABLA C se muestran ejemplo.

Tabla C En una modalidad particularmente preferida, el agente anti-microbiano es un inhibidor de la producción de biopelicula microbiana. Otros agentes preferidos son inhibidores de fumarato reductasa.

En ciertas modalidades, el agente anti-microbiano puede ser un anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal . Los anticuerpos monoclonales ilustrativos que se pueden utilizar son directamente para las moléculas de los patógenos periodontales (por ejemplo, proteasas y adhesinas) u hospederos para la inflamación amortiguada [por ejemplo, anticuerpos, individualmente o en combinación, contra el factor de necrosis tumoral (TNFcc) , interleucina-1 (IL-1), activador de plasminógeno tipo uroquinasa (u-PA) , factor estimulante de colonias de macrofagos y granulocitos (GM-CSF) , factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF) y ligando RANK (RANKL) ] . De preferencia, el anticuerpo es una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos contra diferentes antigenos patógenos y mediadores inflamatorios hospederos. Los anticuerpos monoclonales preferidos que se utilizaran que se dirigen a Porphyromonas gingivalis son aquellos dirigidos al sitio activo de las proteinasas kgp y RgpA y aquellos dirigidos a los motivos de unión en la adhesina Al de las proteinasas Kgp y RgpA.

En una modalidad, el anti-microbiano es un anticuerpo mimético. El anticuerpo mimético puede o no tener la estructura terciaria de un dominio de inmunoglobulina (por ejemplo Dimitrov, 2009, MAb 26-28) . Un anticuerpo mimético puede tener especificidad para unión a una molécula especifica. Un ejemplo de un anticuerpo mimético es la familia de moléculas relacionadas con lipocalinas humanas, conocidas como anticalinas (por ejemplo, Skerra, 2007 Current Opinions in Biotechnology, 18 295-304). De preferencia, una anticalina se dirige, o se une específicamente a una proteína proveniente de Porphyromonas gingivalis . En una modalidad preferida, la anticalina se dirige, o se une específicamente a un sitio activo de una Lys-X-proteinasa o Arg-X-proteinasa , tal como las proteinasas kgp y RgpA. Las anticalinas se pueden utilizar en lugar de los anticuerpos monoclonales, aunque son aproximadamente ocho veces más pequeño con un tamaño de aproximadamente 180 aminoácidos y una masa de aproximadamente 20 kDa . Las anticalinas tienen mejor penetración a tejido que los anticuerpos y son estables a temperaturas de hasta 70°C. A diferencia de los anticuerpos, se pueden producir en células bacterianas similares a E. coli en grandes cantidades.

En ciertas modalidades, el agente anti-microbiano también puede ser un agente anti-biopelícula que puede inhibir, reducir o evitar la formación o desarrollo de biopelicula bacteriana. Un agente anti-biopelicula puede tener una actividad para descomponer la biopelicula y puede provocar una dispersión de la biopelicula. "Actividad para descomponer la biopelicula" en la presente se utiliza para describir la propiedad de una composición o agente que provoque la liberación de bacterias desde la biopelicula. La composición o agente también puede, aunque no necesariamente, reducir la viabilidad de una bacteria en una biopelicula. La "liberación" de bacterias de la biopelicula incluye aumentar del número de bacterias de una biopelicula para adoptar un estado planctónico aumentando con esto la susceptibilidad de una bacteria de una biopelicula para agentes bactericidas. Un agente bactericida, en la presente se utiliza para describir la propiedad de una composición, agente, compuesto, peptidomimético o péptido que reduce directamente la viabilidad de una bacteria.

Por consiguiente, sin estar vinculados por ninguna teoría, o modo de acción, se cree que las composiciones o agentes que exhiben una actividad para descomponer la biopelicula no necesariamente reducen la viabilidad de bacterias en una biopelicula aunque aumentan la causa o inducen a las células bacterianas para que se liberen de la biopelicula. En ciertas modalidades, estas composiciones o agentes pueden provocar o inducir más bacterias en una biopelícula para adoptar un estado planctónico. En otras modalidades, las composiciones o los agentes pueden inhibir o reducir la formación de una biopelícula. En ciertas modalidades, las composiciones o los agentes pueden inhibir o reducir el crecimiento de la biopelícula. En otras modalidades, los agentes anti-microbianos de la invención pueden inhibir o reducir cualquier característica que una biopelícula exhiba lo cual inicia o estimula una enfermedad o condición en un sujeto. En ciertas modalidades, los péptidos o composiciones pueden inhibir o reducir cualquier característica que una biopelícula exhiba lo cual inicia o estimula una enfermedad o condición en un sujeto, sin exterminar las bacterias en la biopelícula.

En ciertas modalidades, una composición antimicrobiana o agente se refiere a la capacidad de prevenir, inhibir o reducir un parámetro mensurable de una biopelícula. Los ejemplos no limitantes de parámetros mensurables de una biopelícula pueden ser biomasa total, espesor promedio, proporción de superficie a bio-volumen, coeficiente de aspereza o la composición bacteriana y su viabilidad de la biopelícula . 3. (b) inmunógenos El inmunógeno se selecciona para invocar una respuesta inmunitaria, de preferencia una respuesta a anticuerpos protectores para el patógeno microbiano de interés .

En una modalidad, el inmunógeno se proporciona en la forma de un péptido, por ejemplo un péptido recombinante .

En una modalidad particularmente relacionada con la infección por P. gingivalís y una enfermedad y condiciones asociadas, el péptido recombinante puede ser una proteina quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmunitaria para P. gingivalis, la proteina incluye un primer péptido unido directamente a través de un enlazante a un segundo péptido, en donde: (A) el primer péptido incluye: (i) parte de, b la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con "la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1, o (ii) parte de, la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2, y (B) el segundo péptido incluye: (i) parte de, ó la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de P. gingivalis, o (ii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis, o (iii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "péptido" se utiliza para hacer referencia a una secuencia de aminoácidos dé hasta aproximadamente 40 residuos de aminoácidos, de preferencia de 5 hasta 40 residuos de aminoácidos .

En una modalidad, un polipéptido se utiliza en lugar de o en otras palabras, en lugar del "segundo péptido". El término "polipéptido" se utiliza para hacer referencia a una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 40 residuos de aminoácidos.

De esta forma, en otro aspecto, se proporciona una proteina quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmunitaria a P. gingivalis, la proteina incluye un péptido unido directamente o a través de un enlazante a un polipéptido en donde: (A) el péptido incluye: (i) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1, o (ii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2, y (B) el polipéptido incluye: (i) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de P. gingivalis, o (ii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis, o (iii) como parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis .

En otro aspecto, la invención proporciona un péptido para inducir una respuesta inmunitaria a P. gingivalis seleccionado del grupo que consiste de: (i) una secuencia que es igual u homologa con la secuencia mostrad en una de la SEC ID NO: 64 a 66, y (ii) una secuencia que es igual u homologa con la i secuencia mostrada en la SEC ID NO: 67 ó 68.

En un aspecto de la invención, donde el péptido tiene una secuencia de la' SEC ID NO: 64 a 68, el péptido se puede proporcionar en la forma de una proteina quimérica o de fusión en la cual el péptido se une directamente o a través de un enlazante a un segundo péptido. En una modalidad, el segundo péptido de la proteina quimérica o de fusión incluye: (i) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de P. gingivalis, o (ii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis, o (iii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis .

En la modalidad descrita anteriormente, se utiliza un polipéptido en lugar de, o en otras palabras en lugar del segundo polipéptido. De esta forma, en otro aspecto, se proporciona una proteina quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmunitaria a P. gingivalis, la proteina incluye un péptido unido directamente o a través de un enlazante para un polipéptido en donde: (A) el péptido incluye: (i) una secuencia que es igual u homologa con la secuencia mostrada en una de la SEC ID NO: 64 a 66; (ii) una secuencia que es igual u homologa con la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 67 ó 68, y.

(B) el polipéptido incluye: (i) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de P. gingivalis, o (ii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis, o (iii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis .

En el sentido en el que se utiliza en la presente, una referencia a un "homólogo" de un péptido o polipéptido es una referencia a un péptido o polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que comparta homología o que sea homólogo, o que tenga identidad con la secuencia de aminoácidos del primer péptido o polipéptido mencionado, de preferencia al menos 90% de identidad de secuencia, de mayor preferencia al menos 95% e incluso de mayor preferencia al menos 98% de identidad de secuencia cuando la comparación se realiza mediante un algoritmo BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias respectivas contra la longitud total de las secuencias de referencia respectivas.

La identidad de secuencia se refiere a coincidencias exactas entre los aminoácidos de dos secuencias que están compartidas. Este homólogo se puede derivar de una variante que se presenta en la naturaleza o un aislado de la Lys-X-proteinasa o Arg-X-proteinasa de P. gingivalis . Alternativamente, puede ser una variante de "sustitución conservadora" de un péptido o polipéptido a partir de la Lys-X-proteinasa o Arg-X-proteinasa de P. gingivalis en la cual se han cambiado uno o más residuos de aminoácidos sin alterar la conformación y función generales del péptido o polipéptido, incluyendo, aunque no significa limitarse al, reemplazo de un aminoácido con uno que tenga propiedades similares. Los aminoácidos con propiedades similares son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los aminoácidos polares/hidrofilicos que se pueden intercambiar incluyen asparagina, glutamina, serina, cisteina, treonina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos no polares/hidrofóbicos que se pueden intercambiar incluyen glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, tirosina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos de carácter ácido que se pueden intercambiar incluyen ácido aspártico y ácido glutámico y los aminoácidos básicos que se pueden intercambiar incluyen histidina, lisina y arginina. De preferencia, estas variantes de sustitución conservadoras tienen menos de 20, de mayor preferencia menos de 15, de mayor preferencia menos de 10, y con la máxima preferencia menos de 5 cambios de aminoácidos.

Una región de una enzima similar a tripsina de P. gingivalis -en especial una Lys-X-proteinasa (kgp) o Arg-X-proteinasa (RgpA) - que define un sitio en una enzima para la segmentación de un enlace peptídico se puede determinar siguiendo las enseñanzas de la especificación en la presente, en particular con relación a la figura 7 y el Ejemplo 9, el cual ejemplifica el proceso para predecir una conformación tridimensional del sitio catalítico según aparece en P. gingivalis para la Lys-X-proteinasa. El Ejemplo 10 proporciona la metodología para modelar la conformación tridimensional de Arg-X-proteinasa .

En ciertas modalidades, la proteína quimérica o de fusión, o el primero o segundos componentes peptídicos de la misma se pueden formar a partir de un peptidomimético . Un peptidomimético es una molécula que limita una o más características de un péptido determinado, por ejemplo la conformación, y que consiste en residuos de aminoácidos, algunos de los cuales pueden no presentarse en la naturaleza.

Habiendo identificado las regiones inmunogénicas del sitio catalítico, los inventores han determinado la secuencia de diversos imunógenos peptídicos contra los cuales se puede presentar una respuesta humoral. En particular, "seis" regiones que flanquean o de otra manera definen el sitio catalítico se han definido como sigue: KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 y KAS6 (véase la Tabla 1). Con esta información, los inventores han sido capaces de cuestionar a las bases de datos de secuencias proteínicas para determinar los péptidos que comparten homología con las secuencias de aminoácidos que forman las regiones que flanquean un sitio catalítico y por lo tanto, que representan los epítopes inmunogénicos encontrados en P. gingivalis . Las secuencias de estos péptidos se identifican por la siguiente fórmula estructural: Tabla 1. Secuencias que flanquean el sitio activo de kgp y RgpA.

Los inventores han encontrado que las proteínas quiméricas, entre las que se incluyen estos péptidos, tienen varias utilidades. Por ejemplo, según se describe en la presente, algunos producen una respuesta humoral que es altamente protectora para el tratamiento o prevención de pérdida ósea según se observa en la periodontitis crónica. Los péptidos que se pueden utilizar en un análisis de diagnóstico en donde pueden detectar o monitorear las especificidades en un suero de un individuo, indicando con esto si se infecta o no al individuo y si es así, si se requieren o se proporcionan o no tratamientos, si han sido o no efectivos.

Se debe entender que la región de una enzima similar a tripsina de P. gingivalis que define un sitio en la enzima para la segmentación de un enlace peptídico ubicado en el C-terminal para Lys o Arg, no comprende una secuencia completa de la-Lys-X proteinasa o la Arg-X-proteinasa .

En el sentido en el que se utilizan en la presente, los términos "proteína heteróloga" o "proteína quimérica o de fusión" se utilizan para hacer referencia a una proteína que consta de unidades funcionales, dominios, secuencias o regiones de aminoácidos derivados de diferentes fuentes o que se derivan de la misma fuente y que se han ensamblado de tal forma que tengan una organización que se distinga de aquella observada en una molécula de la cual se deriva o se relaciona la unidad, dominio, secuencia o región. Una característica común de las proteínas quiméricas o de fusión es que contienen al menos un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es igual o que comparte homología con una secuencia de una enzima similar a tripsina de P. gingivalis que define un sitio catalítico para la segmentación de un enlace peptídico.

En una modalidad preferida, donde el primer péptido comprende un péptido proveniente de la región kgp [432-468], de preferencia es (i) un péptido que comprende una secuencia seleccionada de VSFANYT y VGFANYT, de mayor preferencia una secuencia seleccionada de GVSFANYT, GVGFANYT, VSFANYTA y VGFANYTA, o (ii) un péptido que comprende una secuencia seleccionada de ETAWAD, ETSWAD, TAWADP y TSWADP, de preferencia una secuencia seleccionada de SETA AD, SETSWAD, ETA ADP, ETSWADP, TAWADPL y TSWADPL, de mayor preferencia una secuencia seleccionada de GSETAWAD, GSETSWAD, SETAWADP, SETSWADP, ETAWADPL, ETSWADPL, TAWADPLL y TS ADPLL . De mayor preferencia, este péptido se selecciona de los péptidos KASl [432-454], KAS2 [433-468] y KAS3 [436-455] mostrados en la Tabla 1. Alternativamente, el primer péptido puede ser el péptido PAS1K [432-453], también conocido como PAS1 (K48), descrito en la solicitud de patente internacional No. PCT/AU98/00311 (WO 98/049192) . En la Tabla 3 se muestran los identificadores de secuencias correspondientes a estos péptidos.

Similarmente, en otra modalidad preferida, donde el primer péptido comprende un péptido proveniente de la región RgpA [426-462] , este péptido de preferencia se selecciona de los péptidos RAS1 [426-448], RAS2 [427-462] y RAS3 [430-449] mostrados en la Tabla 1. Alternativamente, el primer péptido puede ser el péptido PAS1R [426-446], también conocido como PAS1 (R45) , descrito en la solicitud de patente internacional No. PCT/AU98/00311 (WO 98/049192).

En la proteina quimérica o de fusión de la invención, el segundo péptido puede ser un péptido proveniente de un dominio de adhesina de una enzima similar a tripsina de P. gingivalis, tal como la Lys-X-proteinasa (kgp) o la Arg-X-proteinasa (RgpA) o HagA (véase la Tabla 2) . Estos dominios algunas veces también se conocen como hemaglutininas . En la Lys-X-proteinasa, los dominios preferidos son KA1, KA2 , KA3, KA4, KA5 como se definen en la Tabla 2. En la Arg-X-proteinasa, los dominios preferidos son RAI, RA2, RA3 y RA4 como se definen en la Tabla 2. En HagA, los dominios preferidos son HagAl, HagAl* y HagAl**.

Tabla 2. Dominios de adhesina dominios de las proteinasas RgpA y Kgp.

Además, para mejorar la respuesta humoral a un péptido de la invención tal como KASl, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 y KAS6 o RAS1, RAS2 y RAS3, RAS y RAS5 cuando se incluyen con el mismo un péptido en una proteina quimérica o de fusión, el dominio de adhesina también contiene epitopes inmunogénicos, por lo tanto que conduce a la producción de múltiples especificidades para provocar una respuesta inmunogénica protectora. El hallazgo de que los epitopes inmunogénicos del dominio de adhesina se conservan en una forma aproximada de la que es una enzima similar a tripsina de P. gingivalis cuando se proporcionan en la proteina quimérica o de fusión de la invención no se anticipa.

Se debe entender que en estas modalidades de la invención, la proteina quimérica o de fusión puede contener cualquiera de uno o más de los péptidos seleccionados de KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 y KAS6/RAS6 conjuntamente con cualquiera de uno o más dominios de adhesina de una enzima similar a tripsina de P. gingivalis, en particular con cualquiera de uno o más dominios de la adhesina de Lys-X-proteinasa (KA1, KA2, KA3, KA4 y KA5) o los dominios de adhesina de la Arg-X-proteinasa (RAI, RA2, RA3 y RA4 ) o los dominios HagA, HagAl, HagAl* y HagAl**.

También se debe entender que no es necesario que el dominio de adhesina sea un dominio completo según se absorba en una enzima similar a tripsina de P. gingivalis . Por ejemplo, el dominio de adhesina puede ser un fragmento de este dominio, en particular, los fragmentos preferidos son los fragmentos de dominio de KsAl y KLAl del dominio de Lys-X-proteinasa Al (véase la Tabla 2) . Cuando el dominio es un fragmento de un dominio de adhesina en general contiene uno o más epitopes específicos del dominio de adhesina.

En la Tabla 3 se muestran los identificadores de secuencia correspondientes a los péptidos relacionados con adhesina .

En una modalidad, el segundo péptido o polipéptido incluye una secuencia mostrada en una o más de las SEC ID NOs: 69 a 79 o una o más de 83 a 85.

La proteína quimérica o de fusión de la presente invención también puede incluir uno o más péptidos adicionales seleccionados de la región kgp [432-468] de la Lys-X-proteinasa y/o uno o más péptidos adicionales seleccionados de la región RgpA [426-462] de la Arg-X-proteinasa .

En modalidades preferidas de la presente invención, la proteína quimérica o de fusión incluye uno o más de KAS1, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 y KAS6, o una o más de RAS1, RAS2 , RAS3, RAS4 y RAS5, conjuntamente con KsAl o KLAl.

De esta forma, en ciertas modalidades, la proteína quimérica o de fusión puede incluir al menos un péptido adicional en donde el péptido adicional incluye: (i) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1, o (ii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2, o (iii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de P. gingivalis, o (iv) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis, o (v) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual,, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis .

Otros ejemplos de dominios, unidades, secuencias o regiones que se pueden incluir en una proteína quimérica o de fusión según se describen en la presente, incluyen los dominios para unión a receptores o ligandos tales como las regiones de unión Fe o receptores Fe, los dominios para mejorar la vida media, tales como albúmina o los dominios para facilitar la expresión o purificación de la proteína quimérica o de fusión.

Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un péptido para inducir una respuesta inmunitaria a P. gingivalis incluyendo la secuencia mostrada en una de las SEC ID NOs: 17, 18, 25 y 26. En una modalidad, el péptido tiene una secuencia que es homologa a una de las SEC ID NOs: 17, 18, 25 y 26. El péptido puede tener una longitud de 5 hasta 40 aminoácidos.

Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica para un péptido que tiene una secuencia mostrad en una de las SEC ID NOs: 17, 18, 25 y 26.

Todavía en otro aspecto, la invención proporciona el uso de un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de las SEC ID NOs: 17, 18, 25 y 26, o un ácido nucleico que codifica para un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de las SEC ID NOs: 17, 18, 25 y 26, para la elaboración de una proteína quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmunitaria a P. gingivalis .

Todavía en otro aspecto, la invención proporciona el uso de un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de las SEC ID NOs: 17, 18, 25 y 26, o un ácido nucleico que codifica para un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de las SEC ID NOs: 17, 18, 25 y 26, para inducir una respuesta inmunitaria a P. gingivalis . En una modalidad, el péptido se administró simultánea o secuencialmente con un segundo péptido que incluye: (i) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de P. gingivalis, o (ii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis, o (iii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa con la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis .

Tabla 3 O^A^S AISW^LYGTGVA ASG ATVS I QITE QK\nrL WEAPSAK AEGSREVKRIGD LFVTIEPANDVR UNEAKVVLAAPNVWGDNTGYQFL^ GPLFTGTASSNLYSAfFEYLIPANADPWTTQN!IVTGQG EWiPGGVYDYCITNPEPASG MWIAiGDGGNQPARYDD FTFEAG KYTFIII R^GJWGDGTD^VS DSPASYTYW Y DGT IKEGLTATTFEEDGVAAGNHEYCVEV YTAGVe P VC DvT^GSNEFAPVONLTGSSVGQKmiWOAPN GTPt PNPNPMPNPGTTLSESFENGIPASWKTIDADG DG HGVWPGIWGI GY!S S^ LrFPALDLPNGGKLTFVWCAQDANYASEHYAVYASSTGN DASNFTNAULEETrrAKG^ PAGTKWAFRHFQS MFYIOLDlVEIKANGiKRADFTFr FESSTH EAPAEtfuCTiDAI^ AHG SNVVSSFSVVNGMALNPD^ YA NDGFPiOHYA MISKTGT GDFTVN^ETPI^N GGARFGLSTEANGAKPQSVWtERTVOLPAGTi WAFRH YNOSOIJ^YIIJLDOIQFT GGSPTPTOYTY YRDGTKÍKE GlJETTFEEI^G G HEYC E lc TAW VNSTQFNWWL^^ NED ÉNGl A^KTTlE^DGf^^ I^ICVSSASY FEG QMPOIWÜ T ELSLPGGG^ VWCAQOANYASEHYAWASSTGWDASNFAWALIEEVLT A WTAPEAiRGTRA GtVVYQ WQLPAGT YVAFRH FGCTDFFWIN Lp WITSGN APSYTYTSYRN I TQI ASGVT EmRDPDU^TGFY GVKVW GESA!ETATLNITSLA 0VTAQ PYTLT GKTlTVTCQGE^YDMNGRRLAAGi¾ MRKLNSLFSLAVLLSLLCWGQTAÁAQGGPKTAPSVTHQ AVQKGIRTSKAKDLRDPIPAGMARHLEAHDWVEDGTGY Q LWDAOH NQ YGASIPEESFWFANGTI PAGLYDPFE Y VPVNADASFSPTN FVLDGTASADI PAGTYPYVI I NP NPGI I YIVGEG\ASKGNDYWEAGKTYHFTVQRQGPGDAASWV TGEGGNEFAPVONLQWSVSGQTVTLIWQAPASDKRTY VLNESFOTQTI^NGWT IDADGDGHNWLSTINVY TAT HTGDGAMFSKSVVTASSGAKIDLSPDNYLVTPKFTVPEN GKLSYV SSOEPWTNEHYGVFLSTTGNEAANFTIKLLEE TLGSGKPAP NLVKSEGVKAPAPYQEmiDLSAYAGQQ VYLAFRH FGCTGI FRLYLDDVAVSGEGSSNDYTYTVYRD WIAQNLTATTFNQENVAPGQYNYCVEVKYTAGVSPKV CKDVTVEGSNEFAFVQ LTGSAVGQ VTLKVVDAPNGTP NPNPGTT LSESFENGIPASW TIDAOGDGNN TTTPPP GGSSFAGHNSAICVSSASYINFEGPQNPDNYLVTPELSL PNGGTl^FWVCAQDANYA^HYTWYASSTGNDASNFA ALUEEVLTAKTW^ TKYVAFRHFGCTDFFWI NLDDVEIKANGKRADFTETFES STHGEAPAEVVTTI DADGOGQGWLCLSSGQLG WLTAHG GTNWASFSWMGMALNPDNYLISKDVTGATKVKYYYAV NDGFPGDH YAV ISKTGTN AGDFTWFEETPNGI NKGG ARFGLSTEANGA POSVVVIÉRTVDLPAGTKYVAFFVHYN CSDU^YÍLLODIQFTMGGSPTPTOYTYTVYROGTKtKEGL TETTFEEDGVATGNHEYCVEV AGVSPKECVNVTVD PVQFNPVQNLTGSAVGQKVTLK DAPNGTPNPNPGTTT LSESFENGIPASWKTIDADGDGNNWTTTPPPGGTSFAG HNSAFCVSSASYINFEGPQNPDNYLV PELSLPNGGTITF WCAQDA YASEHYAWAS5TGNDASNFANALLEEVLT AKTWTAPEAÍRGTRVQG7WYOKTVQLPAGTKYVAFRH FGCTDFFWINLODVEI ANG RADFTETFESSTHGEAPA NGAKf QSVVViERTVDLPAGTKWAF MYNCSDl VÍLLD DIQFTMGGSPTPTDYTr YRDGT IKEGLTETTFEEDG VATGNHEYCVEV AGVSP ECVIWTVDPVQF PVQN LTGSAVGQKVTLKWDAPNGTP PNPGTTTLSESFENGIP ASW TIDAQGDGN NWTTTPPPGGTSFAGHNSAICVSSA SYINFEGPaMPDNYLVTPELSLPNGGTLTFWV<¾QDAN YASEHYAVYASSTGNDASNFANALLEE^.TAKTWTAPE AIRGTRVOGTWQ TVQ^ NLDDVEI AWGKRADFTín'FESSTHGEAPAEWTTfDAOG DGQGWLCLSSGQLGWLTAHGGTNWASFSWNG ALN PDNYUSKDVTGATKVKYYYAV DGFPGDHYAVIWISKTG TNAGDFTWFEETPNGINKGGARFGLSTEANGAKPQSV Wl ERTVDLPAGT YVAFRH YMCSOLNYI LLDDlOFT GG SPTPTDYTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVATGNHEY CV1EV YTA VS ^CV \/™ MDAILKVWAPAS F¾A£VLN£ N WmPPPGGSSFAGHNSAIGVSSASYI N F EGPQNPD NYLVTPELSLPGGGTLTFWVCAGDAMYASEHYAVYASS TGNDASlíFA RLLEEVLTAKTWTAPEAJRGTRVQG Y QK QLPAGTKWAFRHFGCTOFF INLDDWjTSGNAP SYTYTÍY N TQIASGVTETTYRDPD TGFYTYGVKVVY PNGESAI ETATUSl ITSWDWAQ PYTLTWG KTnTVTCQG EAItálYDMI©RRt_AA RIS^^ SYVEKLAV En las proteínas quiméricas o de fusión de la presente invención, el residuo C-terminal del primer péptido se puede enlazar covalentemente al residuo N-terminal de un polipéptido con dominio de adhesina, o el residuo N-terminal del primer péptido se puede enlazar covalentemente al residuo C-terminal de un polipéptido con dominio de adhesina. En esta disposición, el primer péptido y el polipéptido con dominio de adhesina, se dice que estará "enlazado directamente" o "adyacente" .

En otras modalidades, la proteina quimérica o de fusión incluye un enlazante para enlazar al primer péptido a un polipéptido con dominio de adhesina. El enlazante puede ser cualquier enlazante capaz de unir un péptido a un polipéptido, incluyendo enlazante tanto de aminoácidos como de no aminoácidos. De preferencia, el enlazante es no inmunogénico. Los enlazantes adecuados pueden tener hasta 15 aminoácidos de longitud, aunque se prefiere que sean menos de cinco aminoácidos. El enlazante puede funcionar para unir el primer péptido a un polipéptido con dominio de adhesina en una disposición espacial cercano que normalmente se observa en una enzima tripsina de P. gingivalis . Alternativamente, puede separa el primer péptido y el polipéptido con dominio de adhesina.

Las proteínas quiméricas o de fusión de la invención se pueden producir mediante sistemas para expresión recombinantes (tales como, tecnología de ADN recombinante) o mediante síntesis química (tal como, la síntesis de péptidos en fase sólida) . Estas técnicas son bien conocidas en este campo .

La proteína heteróloga o quimérica es particularmente ventajosa debido a que mejora la respuesta humoral obtenida con respecto a la obtenida utilizando el primer o segundo componentes peptidicos de la proteina quimérica o de fusión sola.

Los inventores han encontrado que las proteínas quiméricas, entre las que se incluyen estos péptidos, tienen varias utilidades. Por ejemplo, según se describe en la presente, algunos producen una respuesta humoral que es altamente protectora para el tratamiento o prevención de la pérdida ósea según se observa en la periodontitis crónica. Los péptidos también se pueden utilizar en un análisis de diagnóstico, en donde pueden detectar o monitorear las especificidades en un suero de un individuo, indicando con esto si el individuo está o no infectado y si es así, si se requiere o se proporcionan o no tratamientos, y si estos son efectivos o no.

En una modalidad, la proteína quimérica o de fusión induce una respuesta inmunitaria protectora, típicamente una respuesta que al menos reduce al mínimo o limita el daño al tejido conectivo o de otra manera asociado con una infección por P. gingivalis . En una modalidad, la respuesta protectora al menos reduce al mínimo o limita la pérdida ósea inducida por P. gingivalis. Un sistema modelo para medir la pérdida ósea provocada por una infección por P. gingivalis se analiza en la presente. Típicamente, la respuesta inmunitaria protectora predominantemente es una respuesta humoral. En ciertas modalidades, la respuesta inmunitaria protectora también incluye una respuesta celular.

La presente invención también proporciona una composición que incluye una proteína quimérica o de fusión según se describió ampliamente con anteriormente. Típicamente, la composición es antigénica o inmunogénica . Más particularmente, la invención proporciona una composición adecuada para provocar una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica contra una infección por P. gingival is, incluyendo la proteína quimérica o de fusión, opcionalmente en asociación con un adyuvante. Esta composición también puede incluir otro componente para modular o potenciar la respuesta inmunitaria. En una modalidad, la composición toma la forma de una vacuna.

Una composición preferida incluye inmunógenos que generan una respuesta inmunitaria a los patógenos periodontales Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola y Tannerella forsythia . Los inmunógenos pueden ser una vacuna de célula entera atenuada, o una vacuna con antígeno purificado o de mayor preferencia una vacuna con antígeno recombinante, donde la composición contiene antígenos contra uno o más de los tres patógenos periodontales. En las Tablas D y F se muestran otros ejemplos de péptidos adecuados capaces de formar inmunógenos relevantes para una infección por P. gingivalis, T. denticola y T. forsythia.

Tabla D Tabla E Acceso definición de proteina TDE0011 Alquilhidroperóxido reductasa/peroxirredoxina TDE0017 Proteína hipotética conservada TDE0018 Proteína del dominio LysM TDE0019 Formiato-tetrahidrofolato ligasa (FHS) TDE0042 Fosfato acetiltransferasa (PTA) TDE0046 Proteína de la familia formiminotransferasa- ciclodeaminasa TDE0047 Imidazolonpropionasa (hutl) TDE0048 Proteína hipotética TDE0051 Deshidrogenasa alcohólica, que contiene hierro TDE0068 Peptidasa, familia M20/M25/M40 TDE0102 Proteína de unión a nucleótidos cíclicos TDE0117 Lipoproteína, putativa TDE0139 Proteína hipotética TDE0153 Disulfuro reductasa de la coenzima A, putativa TDE0167 Transportador ABC, proteína de unión a ATP TDE0182 Transportador ABC, proteína de unión a ATP TDE0186 Proteína hipotética TDE0231 ADN polimerasa III, subunidad beta (dnaN) TDE0240 Proteína del complejo glicina reductasa GrdC (grdC) TDE0249 Flavoredoxina, putativa TDE0251 Triptofanasa (tnaA) TDE0296 Formiminotransferasa, putativa TDE0300 Proteína de la familia citosol aminopeptidasa TDE0311 Proteína de la familia que complementa a la timidilato sintasa TDE0313 Proteína del dominio TrkA TDE0325 Proteína hipotética TDE0337 Glucosamina 6-fosfato isomerasa (nagB) TDE0340 Fructosa-bifosfato aldolasa, clase-1 TDE0351 L-lactato deshidrogenasa (idh) TDE0354 Proteína de estrés general 14 TDE0386 Transportador de ABC, proteína de unión al sustrato periplásmico TDE0389 (R) -2-hidroxiglutaril-CoA deshidratase, subunidad beta, putativa TDE0398 Transportador ABC de oligopéptido/dipéptido, proteína de unión a péptidos periplásmicos TDE0405 Proteína con vaina externa principal TDE0407 Glutamato sintasa (NADPH) ,¦ homotetramérica (gltA) TDE0434 Rubreritrina TDE0444 Proteína del dominio clase-1 de glutamina amidotransferasa TDE0449 Ferritina, putativa TDE0451 Arginina deiminasa (arcA) TDE0456 Proteína para biosíntesis de piridoxina TDE0463 Purina nucleósido fosforilasa (deoD) TDE0467 Proteína hipotética TDE0525 Proteína hipotética TDE0576 Glutamil-ARNt (Gln) amidotransferasa, subunidad A (gatA) TDE0585 Proteína hipotética TDE0588 Histidina amonio-liasa (hutH) TDE0603 Proteína hipotética conservada TDE0610 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, putativa TDE0628 Proteína chaperona DnaK (dnaK) TDE0648 Proteína-glutamato metilesterasa (cheB) TDE0664 Proteína de la familia OmpA TDE0665 Proteína de la familia piruvato ferredoxina/flavodoxina oxidorreductasa TDE0677 Proteína hipotética conservada TDE0679 Aminotransferasa, clase V TDE0704 Dominio SPFH/proteína de la familia Banda 7 TDE0731 Proteína hipotética TDE0743 Tiorredoxina reductasa (trxB) TDE0744 Tiorredoxina (trxA) TDE0748 Transportador ABC con compuesto de hierro, proteína de unión al compuesto de hierro periplásmico, putativa TDE0754 Proteína hipotética TDE0758 Transportador ABC con compuesto de hierro, proteína de unión al compuesto de hierro periplásmico, putativa TDE0761 Polipéptido asociado con el complejo proteasa (prcA) TDE0765 Factor de alargamiento para traducción Tu (tuf) TDE0816 Peptidasa, familia M20/M25/M40 .

TDE0823 (3R) -hidroximiristoil- (acil-portadora-proteína) deshidratasa, putativa TDE0829 Aspartil aminopeptidasa, putativa TDE0842 Proteína A con filamento citoplasmático (cfpA) TDE0845 Proteína hipotética conservada TIGR00266 TDE0855 Regulador de respuesta a la unión con ADN TDE0911 Endonucleasa de restricción tipo II TdelII (tdelIIR) TDE0925 Peptidasa T (pepT) TDE0929 Ornitina carbamoiltransferasa (argF) TDE0939 Lipoproteína putativa TDE0947 Factor de alargamiento de traducción G, putativa TDE0949 Enolasa (eno) TDE0951 Lipoproteina putativa TDE0985 Transportadores ABC de oligopéptxdo/dipéptido, proteina de unión al péptido periplásmico, putativa TDE1000 Proteina de la familia 3-hidroxiácido deshidrogenasa TDE1001 Orotato fosforribosiltransferasa (pyrE) TDE1004 Proteina de núcleo filamentoso flagelar TDE1041 Polirribonucleótido nucleotidiltransferasa (pnp) TDE1049 Factor de alargamiento de traducción G (fusA-2) TDE1050 Proteina hipotética TDE1071 Transportador ABC de péptidos, proteina de unión a péptidos Oppa (oppA) TDE1072 Lipoproteina putativa TDE1078 Proteína de la familia metalo-beta-lactamasa TDE1090 Treonil ARNt sintetasa (thrS) TDE1118 Tirosina fenol-liasa (tpl) TDE1127 Proteína del dominio TPR TDE1149 Proteína hipotética TDE1175 Chaperonina, 60 kDa (groEL) TDE1195 Prolil endopeptidasa TDE1231 Proteína hipotética TDE1236 Triosafosfato isomerasa (tpiA) TDE1237 Proteína hipotética TDE1246 Lipoproteina putativa TDE1247 Proteína hipotética TDE1252 Lipoproteina putativa TDE1273 Transportador ABC de oligopéptido/dipéptido , proteína de unión a péptido TDE1283 Lipoproteina de unión a soluto extracelular , putativa TDE1292 Proteína de la familia TldD/PMBA TDE1301 Proteínas para reparación de ADN RecN (recN) TDE1308 Transquetolasa (tkt) TDE1310 Modulador de la proteína de la familia ADN-girasa TDE1356 Lipoproteína putativa TDE1357 Aldosa 1 epimerasa (galM) TDE1371 Proteína de la familia similar a RNB TDE1372 Proteína hipotética TDE1398 Proteína hipotética conservada TDE1408 Proteína con capa externa filamentosa flagelar FlaA, putativa TDE1409 Proteína con capa externa filamentosa flagelar FlaA, putativa TDE1413 Fosfomutasa citidililtransferasa/fosfoenolpiruvato, putativa TDE1415 Nucleotidil transferasa/aminotransferasa, clase V TDE1426 Aminotransferasa, familia DegT/DnrJ/EryCl/StrS TDE1440 Glucosa-l-fosfato timidililtransferasa (rfbA) TDE1475 Proteína con núcleo filamento flagelar TDE1477 Proteína con núcleo filamento flagelar TDE1482 Peptidasa, proteína de la familia M24 TDE1488 Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, tipo I (gap) TDE1491 Proteína para quimiotaxis CheA (cheA) TDE1492 Proteína para quimiotaxis CheW (CheW-1) TDE1493 Proteína para quimiotaxis CheX (CheX) TDE1494 Proteína para quimiotaxis CheY (cheY) TDE1499 Adenilosuccinato liasa, putativa TDE1511 Antígeno superficial patógeno específico, putativo TDE1520 Hidro-liasa, familia de tartrato/fumarato, subunidad alfa TDE1558 Proteína de repetición YD TDE1584 Lipoproteína putativa TDE1589 Proteína para quimiotaxis de unión a purina (CheW-2) TDE1598 Transportador ABC, proteína de unión a ATP TDE1624 Proteína del sistema P para segmentación de glicina, subunidad 2 (gcvP2) TDE1625 Proteina del sistema P para segmentación de glicina, subunidad 1 (gcvPl) TDE1626 Proteina del sistema H para segmentación de glicina (gcvH) TDE1627 Proteina del sistema T para segmentación de glicina (gcvT) TDE1629 Dihidrolipoamida deshidrogenase (IPDA) TDE1631 Citrato liasa, subunidad alfa (citF) TDE1632 Citrato liasa, subunidad beta (citE) TDE1642 Proteina hipotética conservada TDE1658 Proteina de membrana básica, putativa TDE1663 Proteina de la familia OmpA TDE1664 Proteina con dominio conservado TDE1669 Hemolisina TDE1671 Factor activador (tig) TDE1682 ATPasa tipo V, subunidad B (atpB) TDE1697 Fosfoglicerato mutasa (gpm) TDE1712 Proteina con capa externa filamentosa flagelar (flaA) TDE1715 Fosfoglicerato quinasa (pgk) TDE1717 Proteina hipotética TDE1727 Proteina hipotética conservada TDE1728 Proteina hipotética TDE1754 Desulfoferrodoxina/neelaredoxina TDE1848 Proteina hipotética TDE1857 Proteina hipotética conservada TDE1862 Proteina con dominio conservado TDE1915 Deshidrogenasa alcohólica, que contiene hierro TDE1950 Lipoproteina con membrana TMPC, putativa TDE2028 Proteina de la familia OmpA TDE2049 Proteína de unión a soluto extracelular bacteriano, familia 5 TDE2055 Proteína B de unión a hemina (hbpB) TDE2056 proteína A de unión a hemina con membrana externa TDE2058 Proteína hipotética conservada TDE2069 Endoribonucleasa L-PSP, putativa TDE2085 Proteína de la familia de quinasa aminoácido TDE2104 Proteína hipotética TDE2120 Proproteína GrdE2 de complejo de glicina reductasa (grdE-2) TDE2132 Transportador ABC con cobalto, proteína de unión a ATP, putativa TDE2140 Proteasa II (ptrB) TDE2164 Proteína hipotética TDE2188 Proteína hipotética TDE2194 8-amino-7-oxononanoato sintasa, putativa TDE2200 etionina gamma-liasa (megL) TDE2211 Proteína hipotética TDE2217 Lipoproteína de unión a galactosa/glucosa (mglB) TDE2234 Transportador ABC compuesto de hierro, proteína de unión a un compuesto de hierro periplásmico, putativa TDE2235 Metilaspartato amonio-liasa TDE2236 Metilaspartato mutasa, sub-unidad E (glmE) TDE2242 Antígeno, putativo TDE2257 Proteína de la familia 5-nucleotidasa TDE2290 Regulador transcripcional, putativo TDE2300 Proteína del dominio de tripsina/proteínas PDZ TDE2315 Proteína hipotética conservada TIGR00044 TDE2337 Aminopeptidasa TDE2353 Proteína 3 asociada con gancho flagelar TDE2369 Proteína con dominio conservada TDE2390 Proteína hipotética TDE2391 Peptidil-prolil cis-trans isomerasa TDE2392 Proteína hipotética TDE2405 Proteína hipotética conservada TDE2406 Proteínas de la familia TldD/PmbA TDE2422 Proteína ribosómica L7/L12 (rplL) TDE2433 Proteína con membrana treponemal, putativa TDE2439 Proteína hipotética conservada TDE2480 Proteina chaperona HtpG (htpG) TDE2489 Factor 1 para liberación de cadena peptidica (prfA) TDE2508 Proteína hipotética TDE2540 Lipoproteína putativa TDE2567 Proteína hipotética TDE2584 Dipeptidasa TDE2589 Aminopeptidasa, putativa TDE2601 Antígeno superficial, putativo TDE2602 Proteína con membrana externa, putativa TDE2606 Urocanato hidratasa (hutU) TDE2639 Oligoendopeptidasa F (pepF) TDE2647 Lipoiltransferasa y proteína de la familia ligasa de la proteína lipoato TDE2665 Inosin-5-monofosfato deshidrogenase (guaB) TDE2668 Serina hidroximetiltransferasa (glyA) TDE2693 Proteína con repeticiones de anquirina TDE2699 Antígeno, putativo TDE2712 Proteína hipotética TDE2716 Hidrolasa de la superfamilia HAD, subfamilia IA TDE2730 Hidrolasa, familia TatD TDE2734 Proteína hipotética TDE2738 Oligoendopeptidasa F, putativa TDE2754 Ornitina ciclodeaminasa (arcB) TDE2776 Prolina iminopeptidasa (pip) TDE2779 Proteína hipotética 1. Los accesos y definiciones provenientes de TIGR (actualmente de JCVI, www.tiqr.org) . Las definiciones provienen de la anotación automática de TIGR del genoma.

Tabla F Acceso3 Descripción de la proteína3, abreviada13 TF0071 HP-C i TF0299 HP Los números de acceso y las descripciones de las proteínas provienen del sitio web Oralgen (www.oralgen.lanl.gov). Se encuentran números de acceso con guión donde dos genes adyacentes en la base de datos corresponden a una sola proteína según se indica por los datos tanto proteómicos y de homología .

Se sabe de diversos adyuvantes que se utilizan junto con las composiciones de vacuna. Los adyuvantes ayudan en la modulación de la respuesta inmunitaria y en la atención de un nivel más prolongado y superior de inmunidad utilizando cantidades más pequeñas del antigeno de vacuna o menos dosis si el antigeno de vacuna se administra solo. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, adyuvante de Freund incompleto (IFA), adyuvante 65 (que contiene aceite de cacahuete, monooleato de manide y monoestearato de aluminio) , emulsiones oleosas, adyuvante Ribi, los polioles plurónicos, poliaminas, avridina, Quil, saponina, MPL, QS-21, geles minerales tales como sales de aluminio y sales de calcio, nanoparticulas, tales como hidroxiapatita, fosfato de calcio, sales de aluminio, oligomeros de azúcar y polímeros tales como mañano, quitosana. Otros ejemplos que incluyen emulsiones aceite en agua, tales como SAF-1, SAF-0, MF59, Seppic ISA720, y otros adyuvantes en partículas tales como ISCOMMR e ISCOM matrixMR. Una lista extensiva aunque no exhaustiva, de otros ejemplos de adyuvantes se listan en Cox y Coulter 1992 [In: Wong K (ed.) Animáis parasite control utilising technology. Bocea Ratón; CRC press, 1992; 49-112]. Además del adyuvante, la composición de vacuna puede incluir portadores, excipientes, materiales de relleno, tampones o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y convencionales según sea adecuado. Se pueden administrar profilácticamente una o más dosis de la composición de vacuna que contenga el adyuvante para prevenir la periodontitis o terapéuticamente para tratar la periodontitis ya presente. En una modalidad, el adyuvante utilizado se podría seleccionar para facilitar la producción de una respuesta derivada de Th-2. Un ejemplo podría ser Alum.

En la composición preferida, la proteína quimérica o de fusión se combina con un adyuvante mucoso y se administra vía la ruta oral, bucal o nasal. Los ejemplos de adyuvantes mucosas son nanopartículas , toxina de cólera y toxina de E. coli térmolábil, las subunidades B no tóxicas de estas toxinas, los mutantes genéticos de estas toxinas que tienen una toxicidad reducida.

Otros métodos que se pueden utilizar para suministrar la proteína antigénica oral/bucal/nasalmente incluyen la incorporación o absorción de la proteína en o sobre las partículas de un polímero biodegradable (tal como, acrilatos o poliésteres) o nanopartículas (tales como, hidroxiapatita) mediante microencapsulacion para ayudar a la absorción de las microesferas a partir del tracto gastrointestinal u otras superficies mucosas y para proteger MR la degradación de las proteínas. Los liposomas, ISCOM , hidrogeles son ejemplos de otros métodos potenciales que se pueden intensificar adicionalmente mediante la incorporación de moléculas blanco tales como LTB, CTB o lectinas para el suministro de la proteina antigénica al sistema inmunitario mucoso. Además de la proteina antigénica y el adyuvante mucoso o sistema de suministro, la composición de vacuna puede incluir portadores o excipientes, materiales de relleno, recubrimientos, medios de dispersión, agentes antibacterianos y antifungales y tampones o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales según sea adecuado .

Muchos métodos son conocidos para la administración de una composición de vacuna a un sujeto, entre los que se incluyen de manera enunciativa la administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, sublingual, bucal y oral. Estas vias de administración son particularmente útiles para la vacunación .

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifican para una proteina quimérica o de fusión según se describió ampliamente con anterioridad, enlazados opcional y operativamente a al menos un elemento regulador. En una modalidad, el ácido nucleico se proporciona en forma aislada o prácticamente purificada.

Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede se puede insertar en un vector de expresión adecuado para la producción de la proteina quimérica como una proteina recombinante mediante la inserción del vector de expresión en una célula hospedera procariota o eucariota. La expresión exitosa de la proteina recombinante requiere que el vector de expresión contenga los elementos reguladores necesarios para la transcripción y traducción que sean compatibles con, y se reconozcan por el sistema de células hospederas particulares utilizadas para la expresión. Se puede utilizar una variedad de sistemas de células hospederas para expresar la proteina recombinante, los cuales incluyen, de manera enunciativa aquellas transformadas con un vector bacteriófago, un vector de plásmido, o un ADN de cósmido; vectores de levaduras que contengan levadura; vectores fúngales que contengan hongos; lineas celulares de insectos infectados con virus (por ejemplo, baculovirus) ; y lineas celulares de mamífero transíectadas con el plásmido o los vectores de expresión viral, o infectadas con virus recombinante (por ejemplo, virus de vaccinia, adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus, etc.).

Utilizando los métodos conocidos en la técnica de la biología molecular, se pueden incorporar diversos promotores e intensificadores en el vector de expresión, para aumentar la expresión de la proteina recombinante, con la condición de que la expresión aumentada de las secuencias de aminoácidos sea compatible con (por ejemplo, no tóxica con) el sistema de células hospederas particulares utilizado.

La selección del promotor dependerá del sistema de expresión utilizado. Los promotores varían en eficacia, es decir la capacidad de facilitar la transcripción. En general, es conveniente utilizar un promotor fuerte para obtener un alto nivel de transcripción de la secuencia de nucleótidos codificantes y la expresión en una proteina recombinante. Por ejemplo, los promotores bacterianos, de fagos o plásmidos conocidos en la técnica a partir de los cuales se ha observado un alto nivel de transcripción en un sistema de células hospederas que incluyen E. coli incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor recA, el promotor ARN ribosómico, los promotores PR y PL, lacUV5, ompF, bla, Ipp, y lo semejante, se pueden utilizar para proporcionar la transcripción de la secuencia de nucleótidos insertados que codifican para las secuencias de aminoácidos.

Otros elementos control para una transcripción o traducción eficiente incluyen intensificadores, y señales reguladoras. Las secuencias intensificadoras son elementos de ADN que parece aumenta la eficiencia transcripcional de una manera relativamente independiente de su posición y orientación con respecto a una secuencia de nucleótidos codificantes cercanos. De esta forma, dependiendo del sistema de vectores de expresión de células hospederas utilizado, se puede colocar un intensificador ya sea en la dirección 5' o la dirección 3' de las secuencias codificantes insertadas para aumentar la eficiencia de transcripción. Se pueden utilizar otros sitios reguladores, tales como las señales de inicio para transcripción o traducción, para regular la expresión de la secuencia codificante.

En otra modalidad, el vector puede ser un vector de vacuna viral o bacteriana, y se utiliza para proporcionar una vacuna viral recombinante, una vacuna bacteriana recombinante, una vacuna bacteriana atenuada recombinante, o una vacuna viral recombinante inactivada. El virus de vaccinia es el mejor ejemplo conocido, en la técnica, de un virus infeccioso que se manipula mediante ingeniería para expresar antígenos de vacuna derivados de otros organismos. El virus de vaccinia viva recombinante, que se atenúa o de otra manera se tratada de tal forma que no provoque la enfermedad por sí mismo, se utiliza para inmunizar el hospedero. La replicación posterior del virus recombinante dentro del hospedero proporciona una estimulación continua del sistema inmunitario con los antígenos de vacuna proporcionando con esto una inmunidad bastante prolongada.

Otros vectores de vacuna viva incluyen: adenovirus, citomegalovirus, y de preferencia los poxivirus tales como vaccinia [Paoletti and Panicali, patente de los Estados Unidos No. 4,603,112] y las cepas atenuadas de Salmonella [Stocker et al., patente de los Estados Unidos No. 5,210,035; 4,837,151; y 4,735,801, y Curtiss et al., 1988, Vaccine 6:155-160]. Las vacunas vivas son particularmente ventajosas debido a que estimulan continuamente el sistema inmunitario lo cual confiere una inmunidad sustancialmente a largo plazo. Cuando la respuesta inmunitaria es protectora contra la infección posterior por P. ginglvalls, la vacuna viva por si misma se puede utilizar en una vacuna preventiva contra P. gingivalis . En particular, la vacuna viva se puede basar en una bacteria que sea un habitante comensal de la cavidad oral. Esta bacteria se puede transformar con un vector que porta una proteina quimérica recombinante y luego se utiliza para colonizar la cavidad oral, en particular la mucosa oral. Una vez colonizado en la mucosa oral, la expresión de la proteina recombinante estimulará al tejido linfoide asociado mucoso para producir anticuerpos neutralizantes. Para ilustrar adicionalmente esta modalidad, utilizando técnicas biológicas moleculares bien conocidas en la técnica, las secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas quiméricas de esta invención se pueden insertar en el ADN genómico del virus vaccinia en un sitio que permita la expresión de epitopes, pero que afecten negativamente el crecimiento o replicación del vector del virus de vaccinia. El virus recombinante resultante se puede utilizar como el inmunógeno en una formulación de vacuna. Se pueden utilizar los mismos métodos para construir una formulación de vacuna viral recombinante inactiva, excepto que el virus recombinante está inactivado, tal como por medios químicos conocidos en la técnica, antes de utilizarse como un inmunógeno y sin afectar sustancialmente la inmunogenicidad del inmunógeno expresado. La vacuna recombinante inactivada se puede formular con un adyuvante adecuado para intensificar la respuesta inmunologica de los antígenos de la vacuna.

La invención también proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína quimérica o de fusión de esta invención directamente como la formulación de la vacuna. Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas quiméricas, enlazadas funcionalmente a uno o más elementos reguladores, se pueden introducir directamente para inmunizar a un individuo ("transferencia génica directa") contra las cepas patógenas de P. gingivalis. La transferencia génica directa en un individuo vacunado, que da por resultado en la expresión del material genético mediante las células del individuo vacunado, tales como las células endoteliales vasculares, asi como el tejido de los órganos principales, se ha demostrado mediante técnicas en este campo, tales como al inyectar intravenosamente un complejo de plásmido de expresión : liposoma catiónico [Zhu et al., 1993, Science 261:209-211]. Se conocen en la técnica otros métodos efectivos para suministrar el ADN del vector de una célula blanco. En un ejemplo, se ha utilizado un ADN de plásmido recombinante que contiene genes virales para inocular (ya sea parenteral, mucosalmente, o via inmunización por pistola génica) vacunas para inducir una respuesta inmunitaria protectora [Fynan et al. 1993, Proc Nati Acad Sci USA 90:11478-11482]. En otro ejemplo, las células retiradas de un individuo se pueden transfectar o electroporar mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica, dando por resultado en la introducción del ADN del vector recombinante en la célula blanco. Las células que contienen el ADN del vector recombinante luego se pueden seleccionar para utilizar los métodos conocidos en la técnica, tales como mediante el uso de un marcador de selección expresado en el vector, y las células seleccionadas luego se pueden volver a introducir en el individuo para que expresen la proteina recombinante.

En otras modalidades, se proporciona una composición farmacéutica que incluye un agente antimicrobiano y un inmunógeno como se describió anteriormente. La composición puede incluir además un diluyente, excipiente o portador o un agente quimioterapéutico para el tratamiento de una condición o enfermedad asociada con la infección oral y se puede adaptar para administración oral. Las composiciones de esta invención se pueden incorporar en pastillas, o en goma de mascar u otros productos, por ejemplo, al agitar en una base de goma tibia o al recubrir la superficie externa de una base de goma, ilustrativos de los mismos son jelutong, látex de caucho, resinas de vinilita, etc., convenientemente con plastificantes o suavizantes convencionales, azúcar u otros edulcorantes o tales como glucosa, sorbitol y lo seme ante .

Una composición oral de esta invención que contiene la composición farmacéutica mencionada anteriormente se puede preparar y utilizar en diversas formas aplicables a la boca, tales como, dentífrico incluyendo pastas dentales, polvos dentales y dentífricos líquidos, enjuagues bucales, trociscos, gomas de mascar, pastas dentales, cremas para masaje gingival, tabletas para hacer gárgaras, productos lácteos y otras sustancias alimenticias. Una composición oral de acuerdo con esta invención puede incluir además ingredientes adicionales bien conocidos, dependiendo del tipo y forma de una composición oral particular.

En ciertas formas preferidas de la invención, la composición oral puede ser de carácter prácticamente liquido, tal como un lavado bucal o enjuague. En esta preparación, el vehículo típicamente es una mezcla de agua-alcohol que incluye convenientemente un humectante como se describirá más adelante. En general, la proporción en peso de agua a alcohol está en la variación entre aproximadamente 1:1 a aproximadamente 20:1. La cantidad total de la mezcla de agua-alcohol de este tipo de preparación típicamente está en la variación entre aproximadamente 70 a aproximadamente 99.9% en peso de la preparación. El alcohol típicamente es etanol o isopropanol. Se prefiere el etanol.

El pH de estas preparaciones líquidas y otras de la invención en general está en la variación entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 9 y típicamente entre aproximadamente 5.0 hasta 7.0. El pH se puede controlar con un ácido (por ejemplo, ácido cítrico o ácido benzoico) o una base (por ejemplo hidróxido de sodio) o se puede amortiguar (como con citrato de sodio, benzoato, carbonato o bicarbonato, fosfato dibásico de sodio, fosfato monobásico de sodio, etc . ) .

En otras formas convenientes de esta invención, la composición farmacéutica puede ser prácticamente sólida o de carácter pastoso, tal como un polvo dental, una tableta dental o una pasta dental (crema dental) o dentífrico en gel. El vehículo de estas preparaciones orales sólidas o de pasto en general contiene un material pulidor dentalmente aceptable .

En una pasta dental, el vehículo líquido puede comprender agua y típicamente un humectante en una cantidad que varia entre aproximadamente 10% a aproximadamente 80% en peso de la preparación. La glicerina, propilenglicol, sorbitol y polipropilenglicol ejemplifican los humectantes/portadores adecuados. También son ventajosas las mezclas líquidas de agua, glicerina y sorbitol. En los geles claros, donde el índice de refracción es una consideración importante, de preferencia se emplean aproximadamente 2.5-30% en p/p de agua, 0 hasta aproximadamente 70% p/p de glicerina y aproximadamente 20-80% p/p de sorbitol.

La pasta dental, cremas y geles típicamente contienen un espesante natural o sintético o un agente gelificante en proporciones de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 10, de preferencia aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 5% p/p. Un espesante adecuado es hectorita sintética, una arcilla de complejo de magnesio coloidal sintético con silicato de metal alcalino disponible por ejemplo como Laponita (por ejemplo, CP, SP 2002, D) comercializado por Laporte Industries Limited. Laponite D es, aproximadamente, en peso 58.00% de Si02, 25.40% de MgO, 3.05% de Na20, 0.98% de Li20, y algo de agua y metales traza. Su gravedad especifica verdadera es 2.53 y tiene una densidad de volumen evidente de 1.0 g/ml a una humedad de 8%.

Otros espesantes adecuados incluyen musgo de Irlanda, carragenano iota, goma de tragacanto, almidón, polivinilpirrolidona, hidroxietilpropilcelulosa, hidroxibutil-metil-celulosa, hidroxipropi1-meti1-celulosa, hidroxietil-celulosa (por ejemplo, disponible como Natrosol) , carboximetilcelulosa de sodio, y sílice coloidal tal como Syloid finamente triturado (por ejemplo 244). También se pueden incluir agentes solubilizantes tales como, polioles humectantes tales como, propilenglicol, dipropilenglicol y hexilenglicol, celosolves tales como, celosolve de metilo y celosolve de etilo, aceites vegetales y ceras que contengan al menos aproximadamente 12 átomos de carbono en una cadena recta, tales como, aceite de oliva, aceite de ricino y petrolato y ásteres tales como, acetato de amilo, acetato de etilo y benzoato de bencilo.

Se debe entender que, como es convencional, que las preparaciones orales por lo general se venderán o de otra manera se distribuirán en empaques etiquetados adecuadamente. De esta forma, una botella de enjuague bucal tendrá una etiqueta que lo describa, en lo esencial, como un enjuague bucal o lavado bucal y que tenga las instrucciones para utilizarse, y una pasta dental, crema o gel por lo general estará en un tubo plegable, típicamente de aluminio, revestido con plomo o plástico, u otra dosificación para presionar, de bomba o presurizado para dosificar el contenido, teniendo una etiqueta que lo describa, en esencia, como una pasta dental, gel o crema dental.

En las composiciones de la presente invención, se pueden utilizar agentes tensioactivos orgánicos para alcanzar una acción profiláctica aumentada, ayudar para llevar a cabo una dispersión total y completa del agente activo a todo lo largo de la cavidad oral, y hacer que las composiciones de la presente sean cosméticamente más aceptables. El material tensioactivo orgánico de preferencia es aniónico, no iónico o anfolítico por naturaleza y de preferencia no interactúa con el agente activo. Se prefiere emplear, como el agente tensioactivo, un material detergente que imparta a la composición propiedades detergentes y espumantes. Los ejemplos adecuados de tensioactivos aniónicos son sales solubles en agua de monosulfatos de monoglicéridos de ácido graso superior, tales como, la sal de sodio del monoglicérido monosulfatado de ácidos grasos de aceite de coco hidrogenado, sulfatos de alquilo superiores tales como, laurilsulfato de sodio, sulfonatos arilalquílico, tales como, sulfonato de dodecilbenceno sódico, alquilsulfo-acetatos superiores, ásteres de ácido graso superior de 1,2-dihidroxipropansulfonato, y las amidas de acilo alifáticos superior sustancialmente saturadas de compuestos de ácido amino carboxílico alifáticos inferior, tales como aquellos que tienen de 12 a 16 átomos de carbonos en los radicales de ácido graso, alquilo o acilo, y lo semejante. Los ejemplos de las amidas recién mencionadas son N-lauroil sarcosina, y las sales de sodio, potasio y etanolamina de N-lauroilo, N-miristoilo, o N-palmitoil-sarcosina, que deben estar prácticamente libres de jabón o algún material de ácido graso superior similar. Los ejemplos de tensioactivos no iónicos solubles en agua adecuados para utilizarse son productos de condensación de óxido de etileno con diversos compuestos que contienen hidrógeno reactivo que reaccionan con los mismos y que tienen cadenas hidrofóbicas largas (por ejemplo, cadenas alifáticas de aproximadamente 12 hasta 20 átomos de carbono) , los productos de condensación ( "etoxámeros" ) contienen porciones de polioxietileno hidrofílico, tales como los productos de condensación de poli (óxido de etileno) con ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, alcoholes polihídricos (por ejemplo, monoestearato de sorbitán) y óxido de polipropileno (por ejemplo, materiales Pluronic) .

El agente tensioactivo típicamente está presente en una cantidad de aproximadamente 0.1-5% en peso. Es de mencionar, que el agente tensioactivo puede ayudar a disolver el agente activo de la invención y con esto disminuir la cantidad del humectante solubilizante necesario.

En las preparaciones orales de esta invención se pueden incorporar otros diversos materiales tales como agentes blanqueadores, conservadores, siliconas, compuestos de clorofila y/o material amoniacal, tales como urea, fosfato diamónico, y mezclas de los mismos. Cuando están presentes, estos adyuvantes se incorporan en las preparaciones en cantidades que no afecten adversamente de forma sustancial las propiedades y características deseadas.

También se pueden emplear, cualquier material saborizante o edulcorante adecuado. Los ejemplos de constituyentes saborizantes adecuados son aceites saborizantes, por ejemplo, aceite de menta verde, hierbabuena, gaulteria, sasafrás, clavo, salvia, eucalipto, mejorana, canela, limón y naranja, y salicilato de metilo. Los agentes edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, maltosa, sorbitol, xilitol, ciclamato de sodio, perillartina, AMP (aspartilfenilalanina, metiléster) , sacarina, y lo semejante. Adecuadamente, los agentes saborizantes y edulcorantes cada uno o conjuntamente pueden comprenden de aproximadamente 0.1% hasta 5% más de la preparación .

Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la elaboración de composiciones farmacéuticas y estas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste de agentes edulcorantes, agentes saborizantes , agentes colorantes y agentes conservadores para proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y agradables. Las tabletas contienen el ingrediente activo en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para la elaboración de tabletas. Por ejemplo, estos excipientes pueden ser, diluyentes inertes tales como, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; los agentes de granulación y desintegración, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o acacia, y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden estar sin recubrir o pueden estar recubiertas mediante técnicas conocidas para retardar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal o la bolsa periodontal y con esto proporcionar una acción sostenida durante un periodo más prolongado. Por ejemplo, se puede emplear un material para retraso de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato cálcico, fosfato de cálcico o caolín, o como cápsulas de gelatina suave, en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en combinación con excipientes adecuados para la elaboración de suspensiones acuosas. Estos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; los agentes de dispersión o humectantes pueden ser un fosfátido que se presenta en la naturaleza, por ejemplo, lecitina, o los productos de condensación de un óxido de alquileno, ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o los productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o los productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol, o los productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de polietilensorbitan .

Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más agentes conservadores o antimicrobianos, por ejemplo benzoatos, tales como, p-hidroxibenzoato de etilo, o n-propilo, otro ejemplo es el gluconato de clorhexidina, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes , y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina .

Las suspensiones oleosas se pueden formular al suspender los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de ajonjolí o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden agregar agentes edulcorantes tales como aquellos mencionados anteriormente, y agentes saborizantes para proporcionar orales agradables, Estas composiciones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

. Kits En ciertas modalidades, se proporciona un kit que incluye : un agente antimicrobiano para eliminar prácticamente todos los microorganismos o fragmentos de los mismos del tejido oral del sujeto; un inmunógeno para inmunizar al sujeto contra un patógeno microbiano, la presencia del mismo en el tejido oral se asocia con una enfermedad o condición; el kit se adaptará para utilizarse en los métodos descritos anteriormente.

El kit puede incluir: un recipiente que contenga una composición terapéutica en la forma de uno o más de un agente antimicrobiano y un inmunógeno; una etiqueta o inserto en un paquete con las instrucciones para utilizarse.

En ciertas modalidades, se proporciona un kit cuando se utiliza en un método para el uso descrito en la presente .

En ciertas modalidades, el kit puede contener uno o más principios o ingredientes activos adicionales para el tratamiento de una enfermedad o condición.

El kit puede comprender un recipiente y una etiqueta o inserto en el paquete o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, envase blister, etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición terapéutica que es efectiva para tratar la condición y puede tener una abertura de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un émbolo perforable mediante una aguja para inyección hipodérmica) . La etiqueta o inserto del empaque indica que la composición terapéutica se utilizará para tratar la condición de elección. En una modalidad, la etiqueta o el inserto de empaque incluye las instrucciones para utilizarse e indica que la composición terapéutica se puede utilizar para el tratamiento de una enfermedad o condición determinada.

El kit puede comprender (a) una composición terapéutica, y (b) un segundo recipiente con un segundo principio o ingrediente activo contenido en la misma. En esta modalidad el kit de la invención puede comprender además un inserto de envase que indica que se puede utilizar el principio activo u otro para tratar un trastorno o evitar una complicación que es el resultado de una infección determinada. Alternativa o adicionalmente, el kit puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (B FI), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales adecuados desde un punto de vista comercial y el usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que se incluyen a manera de ej emplificación y sin limitación de la invención.

Ejemplo 1 Métodos y materiales .

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento . Cultivos liofilizados de Porphyromonas gingivalis 50 se hicieron crecer anaeróbicamente a 37 °C sobre placas de agar con sangre de caballo sometida a lisis suplementado con 5 ug/ml de hemina, 0.5 g/ml de cisteina (HB agar, <10 subcultivos) . Después de 3-4 días, las colonias se utilizaron para inocular el medio de infusión de corazón y cerebro que contiene 5 mg/ml de hemina, 0.5 g/ml de cisteina (1). Los cultivos de lote se hicieron crecer anaeróbicamente en un MK3 Anaerobio orkstation (Don Whitley Scientific Ltd., Adelaide, Australia) . Las células se recolectaron durante la fase de crecimiento exponencial mediante centrifugación (7500 g, 30 min, 4°C) y se lavaron dos veces con tampón de PG (Tris-HCl 50 m , NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, y cisteina-HCl 5 mM, pH 8.0) en la estación de trabajo anaeróbico. El crecimiento de los cultivos en lote se monitoreó a 650 nm utilizando un espectrofotómetro (modelo 295E, Perkin-Elmer) . La pureza del cultivo se verificó rutinariamente mediante examen microscópico con tinción Gram, y utilizando una variedad de pruebas bioquímicas de acuerdo con Slot (2) .

Construcción de las estructuras pET28 que contienen secuencias de adhesina y secuencias de adhesina con la adición N- erminal de secuencias de proteinasa Kgp. Residuos Kgp que representan los péptidos y péptidos quiméricos del sitio activo (AS) y los dominios de adhesina KgpAl (Al) se sobre-expresaron en E. coli como las proteínas recombinantes (r) con marcas hexa-His utilizando los vectores de expresión pET (Novagen) . Las r-proteínas expresadas fueron rKAS2 y rKLAl y las r-proteínas quiméricas fueron rKAS2-KLAl , rKASl-KsAl y rKAS4-KAS3-KAS5-KAS6-KLAl (también denominadas como multiKAS-KLAl) . En las Tablas 1 y 2 se describen las secuencias de aminoácidos que representan los diversos dominios Al y AS.

Los diversos dominios KAS y KAl del gen kgp se amplificaron a partir de pNSl (3.5 kb BamHI lys del fragmento en pUC18) o el ADN genómico de P. gingivalis, respectivamente, utilizando los cebadores listados en la Tabla 4, la polimerasa de ADN Taq (Invitrogen) y un ciclador térmico PC-960 (Corbett Research Technologies) . Los pares de cebadores KAS2-FOR y KAS2-REV y KLA1-FOR y KLA1-REV se utilizaron para generar fragmentos PCR que codifican para KAS2 y KLA1 respectivamente, utilizando las siguientes condiciones de reacción: 94 °C, a 3 minutos, seguido por 28 ciclos de 94°C, 45 seg (desnaturalización); 62°C, 40 segundos (fijado) y 72°C, 20 segundos (extensión) seguido por un ciclo final de 72°C, 5 min.

El producto PCR quimérico KAS2-KLA1 se produjo mediante empalme génico, mediante extensión de solapamiento (SOEing) como sigue: los productos PCR se proporcionaron utilizando los pares cebadores KAS2-FOR y KAS2-KLAl-quimera-REV y KAS2-KLA1-quimera-FOR y KLA1-REV utilizando las condiciones descritas anteriormente. Los productos PCR luego se fijaron y se realizó una PCR final como cebadores KAS2-F0R y KLA1-REV (94°C, 2 minutos, seguido por 28 ciclos de 94 °C, 30 seg; 50°C, 30 segundos y 72°C, 40 segundos, seguido por un ciclo final de 72°C, 5 min.

Para la preparación del producto PCR KASl-KsAl, se condujeron dos PCR sucesivos utilizando el cebador KASl-KsAl-REV con cada uno de los cebadores KASl-KsAl-FOR 1 y 2 en sucesión (condiciones de reacción 9 °C durante 2 minutos seguidos por 35 ciclos de 94°C, 15 segundos; 63°C, 30 segundos y 72 °C, 2 minutos) para producir el producto PCR KASl-KsAl. Los cebadores KASl-KsAl-FORl y KASl-KsAl-FOR2 contienen una extensión 3' que solapa la 5' del producto PCR anterior .

Para la preparación del fragmento PCR multiKAS-KLA1, se condujeron cuatro PCR sucesivas utilizando el cebador multi-REV con cada uno de los cebadores multi-FOR 1, 2, 3 y 4 en sucesión (las condiciones de reacción fueron 95°C, 2 minutos seguidos por 35 ciclos de 95°C, 20 segundos; 68 °C, 1.5 minutos) para proporcionar el producto PCR multiKAS-KLAl . Cada cebador multi-FOR contuvo una extensión 3' que solapa la 5' del producto PCR anterior.

Los fragmentos PCR que codifican para KAS2, KLA1, KAS2-KLA1, KASl-KsAl y multiKAS-KLAl. Se purificaron utilizando columnas de purificación PCR (Qiagen) , ligados en el vector de clonación TA, pGem-T Easy (Promega) y transformadas E. coli JM109 siguiendo el protocolo del fabricante. Las estructuras pGemT-Easy recombinantes purificadas se digirieron con Ncol y Xhol y se clonaron direccionalmente en Ncol/Xhol digerido pET28b (Novagen) y transformado en la hospedera sin expresión, E. coli JM109 [DH5a] . Las estructuras pET28 recombinantes se purificaron y se transformaron en la hospedera de expresión de E. coli, BL21 (DE3) [HMS174 (DE3) ] (Novagen) y se seleccionaron sobre LB que contuvo 50 µ? de kanamicina siguiendo las instrucciones del fabricante. La integridad de cada inserto se confirmó mediante análisis de secuencia de ADN.

Los cebadores del oligonucleotide (Tabla 4) se han diseñado para incorporar sitios de enzimas de restricción, codones de paro y marcas hexa-His cuando sea necesario. Los cebadores utilizados para el rKAS2, rKLAl y rKAS2-KLAl se designaron para limitar la inclusión de secuencias codificantes extrañas para no más de tres aminoácidos más la marca hexa-His en las r-proteinas. Los rKASl y los rKLAl se diseñaron para contener una marca hexa-His en los esquemas N-terminal y C-terminal respectivamente, de tal forma que se puedan comparar directamente con el rKAS2-KLAl que tiene una marca hexa-His en ambos términos N- y C-. En rKASl-KsAl y rmultiKAS-KLAl las marcas His se encontraron en los términos Tabla 4 Cebadores de oligonucleótidos utilizados para la amplificación de las secuencias de nucleótidos que codifican para los diversos fragmentos quimeras de Kgp Al y AS Números de la secuencia de nucleótidos (nt) a partir de la secuencia del gen de cisteina proteinasa lisina- especifica número de acceso U75366 Expresión y purificación de proteínas recombinantes . Las proteínas recombinantes se expresaron a partir de las estructuras pET28 : : KLA1 (KAS2 , KAS2-LA1, KAS1-SA1, multiKAS-KLAl ) mediante inducción con el isopropil ß-D-tiogalactosidasa (IPTG). Todas las proteínas recombinantes se produjeron en las proteínas de fusión con marca 6-His y se purificaron con el sistema de purificación NI-NTA (Invitrogen) bajo condiciones de desnaturalización. En resumen, se utilizaron transformantes de colonias individuales de E. coli (DE3) para inocular 20 mL de caldo Luria-Bertani (LB) que contuvo 50 pmg/ml de kanamicina a 37 °C en un agitador orbital durante la noche. Éste inoculo luego se utilizó para inocular 1L de LB que contuvo 50 pg/ml de kanamicina. La OD6oo de este cultivo se dejó alcanzar 0.5-0.7 (fase media logarítmica) antes de inducir la expresión de proteínas con isopropilo IPTG a 0.1 mM durante 2 horas a 37 °C con agitación de 200 rpm. Las células se recolectaron (7,500 g) y se volvieron a suspender en un tampón aglutinante desnaturalizante (Urea 8M, fosfato de sodio 20 mM pH 8.0 y NaCl 500 mM) y se sometieron a ultrasonido en hielo durante 3 x 15 s ráfagas a intervalos de 30 s, utilizando un disruptor celular Branson Sonifer 250 (Branson Ultronics Corporación, Danbury, CT) con la micropunta en ajuste 3, luego se sometieron a centrifugación a 39,000 g durante 30 min a 4°C.

Las proteínas recombinantes se purificaron a partir del sobrenadante mediante la carga sobre una columna de Agarosa Ni-NTA pre-equilibrada y luego mediante lavado con tampón de lavado desnaturalizante (Urea 8M, fosfato de sodio 20 mm pH 6.0 y NaCl 500 mm) para eluir las proteínas separadas. La columna luego se lavó utilizando 10 volúmenes de tampón aglutinante B y la proteína recombinante se eluyó con tampón de elusión desnaturalizante (Urea 8M, fosfato de sodio 20 mM pH 6.0, NaCl 500 mM y Imidazol 0.5 M) . La proteína purificada se dializó contra Urea-PBS 2M y se almacenó a -80°C.

Las muestras de proteínas recombinantes se analizaron mediante SDS-PAGE y sus masas moleculares se determinaron utilizando Prot-Param en línea (htt : //au . expasy.org/tools/protparam. html ) . La concentración de proteínas de todas las muestras se determinó mediante el análisis de proteínas Bio-Rad utilizando BSA como un estándar .

Inmunización y el modelo de periodontitis en ratón.

Los experimentos de periodontitis de ratón se realizaron como se describió anteriormente (3) y se aprobaron por la University of Melbourne Ethics Committee for Animal Experimentation. Ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad (12 ratones por grupo) alojados en microaisladores se inmunizaron subcutáneamente (s.c. 100 pL) con ya sea 50 yg de una de las proteínas recombinantes o el complejo RgpA-Kgp, 2 X 109 células exterminadas con formalina de la cepa W50 o PBS de P. gingivalis; cada antígeno se emulsionó en adyuvante de Freund incompleto (IFA) . Después de 30 días, los ratones se reforzaron con el antígeno (inyección s.c, emulsionada en IFA) y luego les extrajo sangre del plexo retrobulbar 12 días más tarde. Cuatro días después de la segunda administración, a los ratones se les administró kanamicina ( Sigma-Aldrich, Nueva Gales del Sur, Australia) a 1 mg/ml en agua desionizada ad libitum durante 7 días. Tres días después del tratamiento al antibiótico (2 días después de la extracción de sangre), los ratones se inocularon oralmente cuatro veces con 2 días de separación con 1 X 1010 de P. gingivalis viable W50 (25 µ?) en tampón PG (Tris-HCl 50 mm, NaCl 150 mm, CaCl2 5 m , y cisteína-HCl 5 mM, pH 8.0) que contuvo 2% (p/vol) de carboximetilcelulosa (CMC; Sigma-Aldrich, Nueva Gales del Sur, Australia) , y un grupo control se infectó de manera simulada con tampón de PG que contuvo 2% (p/vol) CMC sólo. Los inóculos se prepararon en la cámara anaeróbica y luego se aplicaron inmediatamente al margen gingival de los dientes molares maxilares. Dos semanas después, los ratones recibieron otras cuatro dosis (2 días de separación) de 1 X 1010 células de 50 de P. gingivalis viable (25 µ?) en tampón de PG que contuvo 2% (p/vol) de CMC. El número de bacterias viables en cada inoculo se verificó mediante enumeración sobre agar en sangre. Los- ratones se alimentaron con una dieta en polvo suave (Barastock, Australia) y se alojaron en jaulas ajustadas con un fondo de malla de alambre mejorada para evitar el acceso al lecho. Cuatro semanas después de la última dosis, a los ratones se les extrajo sangre del plexo retrobulbar y se sacrificaron, y los maxilares se retiraron y se cortaron a la mitad con una mitad (derecho) utilizada para la medición de pérdida ósea alveolar y la otra mitad (izquierda) utilizada para PCR en tiempo real.

Las mitades derechas de los maxilares se sometieron a ebullición (1 min) en agua desionizada, se descarnaron mecánicamente, y se sumergieron en 2% (p/vol) de hidróxido de potasio (16 horas, 25°C) . Los medio maxilares luego se lavaron (dos veces con agua desionizada) y se sumergieron en 3% (p/vol) de peróxido de hidrógeno (6 horas, 25°C) . Después de que lavaron las mitades de maxilares (dos veces con aguas desionizada), se tiñeron con 0.1% (p/vol) de azul de metileno acuoso, y se capturó una imagen digital del aspecto bucal de cada mitad de maxilar con una cámara digital Olympus DP12 montada en un microscopio de disección, utilizando el software OLYSIA BioReport versión 3.2 (Olympus Australia Pty Ltd., Nueva Gales del Sur, Australia) para evaluar la pérdida ósea horizontal. La pérdida ósea horizontal es una pérdida que se presenta en un plano horizontal, perpendicular a la cresta ósea alveolar (ABC) que da por resultado en una reducción de la cresta alta. Cada mitad maxilar se alineó de tal forma que las cúspides bucal y lingual molares de cada imagen dental se superpusieron, y la imagen se capturó con una escala micrométrica en trama, de tal forma que las mediciones se pudieran estandarizar para cada imagen. El área desde la unión cemento-esmalte al ABC para cada diente molar se midió utilizando el software para formación de imágenes versión 3.2 de software OLYSIÁ BioReport. Las mediciones de pérdida ósea se determinaron dos veces mediante un examinador individual Utilizando ún protocolo aleatorizado y ciego.

Determinación del anticuerpo subclase mediante un ELISA. Para determinar las respuestas al anticuerpo subclase de suero de ratón, se realizaron inmunoanálisis ligadas a enzimas 1 (ELISA) por triplicado utilizando 5 yg/ml de solución de W50 de P. gíngivalis exterminado con formalina en solución salina amortiguada con fosfato (PBS): (Na2HP04 0.01 M, KH2P04 1.5 mm, NaCl 0.15 M) , pí 7'.0, que contuvo 0.1% (vol/vol) de Tween 20 (PBST) para recubrir los pocilios de placas microtituladoras de 'poli iniio' de ' fondo plano (Dynatech Laboratories, McLean, VÁ) . Después del 'retiro de la solución de recubrimiento, se agregó ' a los pocilios PBST que contuvo 2% (p/vol)' de polvo de leche descremada para bloquear el plástico sin recubrir durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de que las células se lavaron cuatro veces con PBST, se agregaron diluciones en serie de suero de ratón en PBST que contuvo 0.5% (p/vol) de leche descremada (SK-PBST) a cada pocilio y se incubaron durante 16 horas a temperatura ambiente. Después de que las célula se lavaron seis veces con PBST, se agregó una dilución 1/2, 000 de IgG de cabra para IgM, IgA, IgGl, IgG2a, IgG2b, o IgG3 de ratón (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) en SK-PBST y se dejó aglutinar durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron seis veces en PBST, y se agregó a cada pocilio una dilución 1/5,000 de inmunoglobulina anti-cabra de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) en SK-PBST y se incubaron a 1 hora a temperatura ambiente. Después de que los pocilios se lavaron seis veces con PBST, se detectó el anticuerpo separado mediante la adición de 100 µ? de sustrato de ABTS [ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenz-tiazolin-6) sulfónico 0.9 mM en ácido cítrico 80 mM que contuvo 0.005% (vol/vol) de peróxido de hidrógeno, pH 4.0] a cada pocilio. La densidad óptica a 415 nm se midió utilizando un lector de microplacas (lector de microplacas Bio-Rad, modelo 450) .

Electroforesis en gel SDS-PAGE y transferencia Western. Se analizaron proteínas recombinantes (10 µg) utilizando el sistema para electroforesis XCell Surelock Mini-Cell. Las proteínas recombinantes se mezclaron en 20 µ? del tampón de muestra reductor (10% [p/vol] SDS, 0.05% [p/vol] azul de bromofenol, 25% [vol/vol] de glicerol, y 0.05% [vol/vol] de 2-mercaptoetanol ) . El pH se ajustó a pH 8.0 con Tris-HCl 1.5 M, y luego la solución se calentó durante 5 min a 100°C. Las proteínas recombinantes (10 g/línea) se cargaron sobre Novex 12% (p/vol) de minigeles pre-fundidos de tris-glicina, y se realizó la electroforesis utilizando una corriente de 30 hasta 50 mA y una diferencia potencial de 125 V utilizando un sistema para electroforesis Novex (Novex, San Diego, CA) . Las proteínas se visualizaron utilizando 0.25% en p/v de azul Coomassie R250.

Análisis de epi opes de la secuencia del péptido (KAS-2) del sitio activo de la protexnasa Kgp. Los sitios de unión a anticuerpos para el péptido KAS2 (433-468 SEC ID NO: 28) del sitio activo de la proteinasa Lys-específica se determinó al sintetizar' ocho péptidos residuales de solapamiento biotinilados N-terminalmente (desplazamiento en uno, solapamiento por siete residuos) sobre un sistema para síntesis con péptidos de multipunta (Chiron Technologies, Melbourne, Australia) utilizando los protocolos para síntesis de péptido en fase sólida estándar para química Fmoc. Se aglutinaron péptidos biotinilados (5 g/mL) en PBS 0.1 M, pH 7.4 a placas recubiertas con estreptavidina durante la noche a 4°C (Nunc, NSW Australia). Después de que los pocilios se lavaron cuatro veces con el epitope PBST, se llevó a cabo el mapeo de los péptidos aglutinados en la placa mediante ELISA 0 mediante las instrucciones de Chiron Technologies utilizando sueros de ratón a dilución de 1:1000 en 1% en p/v de polvo de leche descremada sin grasa en PBS 0.1 M, pH 7.4, que contuvo 0.1% v/v de T een 20 (SK-PBST) . Después de que los pocilios se lavaron seis veces con PBST, se agregó una dilución 1/2,000 de IgG de cabra para IgG de ratón (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) en SK-PBST y se dejó aglutinar durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron seis veces en PBST, y se agregó a cada pocilio una dilución 1/5,000 de inmunoglobulina anti-cabra de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) en SK-PBST y se inocularon durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de que los pocilios se lavaron seis veces con PBST, el anticuerpo aglutinado se detectó mediante la adición de 100 µ? del sustrate ABTS [ácido 2, 2' -azino-bis (3-etilbenzo-tiazolin-6) sulfónico 0.9 mM, en ácido cítrico 80 mM que contuvo 0.005% (vol/vol) de peróxido de hidrógeno, pH 4.0] a cada pocilio. La densidad óptica a 415 nm se midió utilizando un lector de microplacas (lector de microplacas Bio-Rad, modelo 450) .

Análisis estadístico. Los datos de la pérdida ósea se analizaron estadísticamente utilizando un análisis de varianza de un factor (ANOVA) y la prueba T3 de Dunnett (SPSS para Windows, versión 12) . Los títulos de anticuerpos de la sub-clase IgA, Ig , e IgG se analizaron estadísticamente utilizando la prueba t de Student usando el software SPSS (SPSS para Windows, versión 12) .

Ejemplo 2 Caracterización y purificación de las proteínas recombinantes (KsAl , KLA1 , KASl-KsAl y KAS2-KLA1) . Con el fin de caracterizar la capacidad de los fragmentos del dominio Al de la adhesina Kgp y los fragmentos del dominio de la proteínasa Kgp quimérica y Al de la adhesina Kgp para proteger contra la infección por P. gingivalis, se expresaron y purificaron las proteínas recombinantes : -KsAl, KLA1, KAS1-KsAl y KAS2-KLA1. Las proteínas de recombinantes (KsAl y KLA1) y las proteínas quimeras recombinantes (KASl-KsAl y KAS2-KLA1) se purificaron a partir de los cuerpos de inclusión utilizando cromatografía por afinidad con quelato de níquel y las proteínas purificadas analizadas mediante SDS-PAGE (figura 1) . Cada una de las proteínas recombinantes purificadas consistió de una banda proteínica principal con pesos moleculares de 40, 36, 31 y 32 kDa correspondientes a KAS2-KLA1, KLA1, KsAl y KASl-KsAl, y estos pesos correspondieron a las masas moleculares calculadas de las proteínas recombinantes con la marca His utilizando ProtParam. Para caracterizar la inmunogenicidad de las proteínas recombinantes, se utilizaron KsAl, KLA1, KASl-KsAl y KAS2-KLA1 para inmunizar a ratones y los sueros se utilizaron para sondar las placas recubiertas con el péptido KAS2 y las placas recubiertas con las células W50 de P. gingivalis exterminadas con formalina (figuras 2A, 2B) . Se encontró que los antisueros de las proteínas quiméricas recombinantes KASl-KsAl y KAS2-KLA1 reconocen el péptido KAS2 (figura 2A) a un nivel similar a los antisueros KAS2 específicos (conjugado del toxoide de difteria KAS2) así como las células W50 de P. gingivalis exterminadas con formalina (figura 2B) . Sin embargo, los antisueros contra la proteína recombinante KLA1 sólo reconocieron las células W50 de P. gingivalis exterminadas (figura 2B) .

Ejemplo 3 Efecto de la inmunización con las proteínas recombinantes (KsAl, LAl, KASl-KsAl y KAS2-KLA1) sobre la pérdida ósea alveolar inducida por P. gingivalis en el modelo de periodontitis de ratón. Las proteínas recombinantes KsAl, KLAl, KASl-KsAl y KAS2-KLA1, la cepa W50 de P. gingivalis exterminada con formalina y el complejo RgpA-Kgp se utilizaron para determinar y comparar la protección inducida contra P. gingivalis que indujo pérdida ósea alveolar utilizando un modelo de ratón modificado de pérdida ósea periodontal con base en la reportada por Baker et al., (4). Los ratones se inmunizaron (días 0 y 30) con ya sea las proteínas recombinantes KsAl, KLA1, KASl-KsAl o KAS2-KLA1, el complejo RgpA-Kgp o las células de la cepa 50 de P. gingivalis exterminada con formalina (FK-W50) o el adyuvante PBS solo y luego se inocularon oralmente con W50 de P. gingivalis viable. La inmunización con todos los antígenos recombinantes, el complejo RgpA-Kgp y las células FK- 50 protegieron a los ratones BALB/c contra la pérdida ósea alveolar inducida por P. gingivalis a medida que estos animales exhibieron una pérdida ósea significativamente menor (p <0.001) en comparación con el grupo inmunizado con PBS (figura 3). Sin embargo, los ratones inmunizados con KAS2-KLA1 tuvieron significativamente menos pérdida ósea que los ratones inmunizados con KLA1 (p <0.01); KsAl (p <0.001), el complejo RgpA-Kgp (p <0.001), las células FK- 50 (p <0.001) y los ratones no inoculados (p <0.001). No hubo diferencia significativa en la pérdida ósea entre los ratones inmunizados con KAS2-KLA1 y KASl-KsAl. Además, los ratones inmunizados con KASl-KsAl exhibieron significativamente menos pérdida ósea que los ratones no inoculados (p <0.01) y los ratones inmunizados con el complejo RgpA-Kgp (p <0.05), aunque no fueron significativamente diferentes de los ratones inmunizados con KsAl, KLA1, y FK-W50. No hubo una diferencia significativa en la pérdida ósea entre los ratones inmunizados con KsAl, KLA1, el complejo RgpA-Kgp y FK-W50.

Ejemplo 4 Respuestas a la subclase de anticuerpos inducidas mediante la inmunización con las proteinas recombina tes (KsAl, KLA1 , KASl-KsAl y KAS2-KLA1) en los modelos de periodontitis de ratón. Antes y después de la inoculación oral con las células de P. gingivalis viables, a los ratones se les extrajo sangre y los sueros se recolectaron mediante centrifugación. Las figuras 4A, 4B, muestran la reactividad de la subclase del anticuerpo para las células W50 de P. gingivalis exterminadas con formalina para cada inmunógeno (KsAl, KLA1, KASl-KsAl o KAS2-KLA1 o las células de la cepa 50 de P. gingivalis exterminadas con formalina (FK-W50)) en el modelo de periodontitis de ratón. Todos los inmunógenos protectores indujeron un alto titulo del anticuerpo IgG para FK-W50. Además, el inmunógeno protector para cada subclase de anticuerpo predominante inducido fue IgGl con los anticuerpos FK- 50 específicos IgG2a, IgG2b e IgG3 sólo débilmente inmuno-reactivos (figuras 4A, 4B) . La subclase del anticuerpo predominante inducida por cada inmunógeno en la inoculación tanto pre (figura 4A) como pos-oral (figura 4B) fue IgGl.

Ejemplo 5 Mapeo de epitopes de KAS2 (433-468) . Ocho péptidos residuales biotinilados de solapamiento (desplazamiento en uno, solapamiento en siete) para KAS2 (433-468) se sintetizaron y se utilizaron para recubrir placas recubiertas con estreptavidina . Los epitopes de unión a anticuerpo luego se identificaron utilizando antisueros provenientes de ratones inmunizados con el conjugado del toxoide KASl-KsAl, KAS2-KLA1 y KAS2-difteria (figuras 5A, 5B) . Un aumento doble en la densidad óptica (415 nm) anterior se consideró como una respuesta positiva a anticuerpos (OD umbral) . Estos antisueros reconocieron las siguientes secuencias de péptidos derivadas de la SEC ID NO: 28 viz . KASl-KsAl reconocieron los péptidos 435-442, 436-443, 445-452, 446-453 y 447-454 (umbral OD = 0.07, figura 5A) mientras que KAS2-KLA1 reconocieron los péptidos 435-442, 447-454 y 448-455 (umbral ID = 0.07, figura 5A) . Esto sugiere el reconocimiento de un número de epitopes mínimos viz. 436-442 (VSFANYT y su variante VGFANYT) , el péptido 447-452 (ETAWAD y su variante ETSWAD) , y el péptido 448-453 (TAWADP y su variante TSWADP) . Los péptidos que incluyen el epitope del péptido 436-442 incluyen GVSFANYT, GVGFANYT, VSFANYTA y VGFANYTA. Los péptidos que incluyen los epítopes de los péptidos 447-452 y/o 448-453 incluyen SETAWAD, SETSWAD, ETAWADP, ETS ADP, TA ADPL y TSWADPL, más particularmente GSETAWAD, GSETSWAD, SETAWADP, SETS ADP, ETAWADPL, ETSWADPL, TAWADPLL y TSWADPLL.

Ejemplo 6 Síntesis de los péptidos KAS y RAS para la conjugación a una proteina.

Los péptidos se sintetizaron manualmente o al utilizar un sintetizador de péptidos en microondas CEM. Los protocolos para síntesis de péptidos en fase sólido estándar para la química Fmoc se utilizaron en su totalidad. Los péptidos se ensamblaron como la forma de carboxiamida utilizando la resina A -sure derivada del enlazante Rink (AAPPTEC, KY, USA) . EL acoplamiento se llevó a cabo con la activación HBTU/HOBt utilizando 4 equiv del aminoácido Fmoc y 6 equiv de DIPEA. El grupo Fmoc se retiró con el 20% de piperidina en HOBt/DMF 1M.

Las resinas que portan los péptidos KAS o RAS se hincharon en DMF y el grupo Fmoc N-terminal se retiró mediante 2% en v/v de DBU en DMF que contuvo 2% v/v de piperidina. El grupo amino N-terminal luego se derivó con el grupo de ácido S-acetilmercaptoacético (SAMA) utilizando 5 equiv de SAMA-OPfp y 5 equiv de HOBt. La reacción se monitoreo mediante la prueba con ácido trinitrobencensulfónico (TNBSA) . Cuando se regresó la prueba TNBSA negativa la resina se lavó (5 X DMF, 3 x DCM y 3 X dietiléter) . La resina luego se secó bajo el vacio. La segmentación de los péptidos a partir del soporte de resina se realizó utilizando un cóctel de segmentación de TFA : fenol : TIPS.-EDT ragua (92:2:2:2:2) durante 2.5 horas o 4 horas dependiendo del contenido de arginina del péptido. Después de la segmentación, la resina se retiró mediante filtración y el filtrado se concentró a aproximadamente 1 mL bajo un flujo de nitrógeno. Después de que los productos peptidicos se precipitaron en éter frió, los mismos se sometieron a centrifugación y lavaron tres veces. Los precipitados peptidicos se disolvieron en 5 a 10 mL de agua que contuvo 0.1% v/v TFA y el residuo insoluble se retiró mediante centrifugación. Los péptidos se purificaron mediante RP-HPLC.

Se pueden utilizar varias porciones químicas diferentes para derivar los péptidos para la conjugación a proteínas, éstos podrían introducir grupos reactivos tales como; haluros (bromo, cloro e iodo), maleimido, succinimidilo, hidrazinilo, oxima, tiol que luego se podrían utilizar para conjugar el péptido derivado a una proteina tal como KgpAl a través de sus residuos de cisteina natural o se ha derivado con el grupo reactivo complementario que permite que prosiga la ligación química para formar un conjugado péptido-proteína .

Conjugación de los péptidos SAMA a KAl. ? una solución, que contuvo 10 mg/mL de KAl recombinante u otro dominio de adhesina del complejo RgpA-Kgp en solución salina amortiguada con fosfato (fosfato de sodio 0.1 M, NaCl 0.9%, pH 7.4) se agregó 0.1 mL de una solución al 1% p/v del éster de m-maleimido benzoil-N-hidroxisucinimida (MBS) en DMF. Después de 30 min, el MBS sin reaccionar se retiró y el KAl modificado con MBS se recolectó mediante filtración en gel utilizando una columna PD10 (Pharmacia, NSW, Australia) equilibrada en tampón de conjugación (fosfato de sodio 0.1 M, EDTA 5mM; pH 6.0). El péptido SAMA purificado (1.3 pmol) se disolvió en 200 pL 6M de guanidina HC1 que contuvo Tris 0.5 M; EDTA 2mM, pH 6.0 y se diluyó con 800 ]iL de agua MilliQ y se desprotegió in-situ mediante la adición de 25 L de NH2OH 2M (40 equiv) disueltos en agua MilliQ. El MBS-KA1 recolectado se hizo reaccionar inmediatamente con el péptido SAMA desprotegido y se agitó durante una hora a temperatura ambiente. El conjugado del péptido KAl se separó a partir del péptido sin reaccionar mediante filtración en gel utilizando una columna PD10 equilibrada en PBS pH 7.4 y se liofilizó. La reacción se monitoreó utilizando la prueba Ellmans.

Ejemplo 7 Preparación de anticuerpos. El antisuero policlonal para las proteínas recombinantes se aumentó en ratones mediante inmunización con las proteínas subcutáneamente. Los ratones se inmunizaron en el día 0 con 25 pg de la proteína en adyuvante de Freund incompleto y en el día 30 con 25 g de la proteína en adjuvante Freund incompleto. Las inmunizaciones se llevaron a cabo utilizando procedimientos estándar. Se utilizaron antisuero policlonales que tienen un alto título contra las proteínas. Si se desea, los anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra las proteínas recombinantes se obtuvieron utilizando procedimientos estándar.

Ejemplo 8 Inmunización para la generación de anticuerpos .

Ratones BALB/c o CD1 (ratones de rata suiza) 6-8 semanas de edad (10 ratones por grupo) se inmunizaron subcutáneamente (s.c. 100 pL) con ya sea o 50 iq de la quimera KAS2-LA1 y el antígeno emulsionado en adyuvante Freund incompleto (IFA) . Después de 30 días, los' ratones se reforzaron con el antígeno (s.c. inyección, emulsionada en IFA) y 12 días después los ratones se sacrificaron y se extrajo sangre cardiaca para recolectar los sueros.

Determinación del anticuerpo subclase mediante una ELISA. Para determinar las respuestas al anticuerpo sub-clase de sueros de ratón, se realizaron por triplicado inmunoanálisis ligados a enzimas (ELISA) utilizando 5 pg/ml de solución de la quimera KAS2-LA1 o W50 de P. gingivalis exterminada con formalina o el complejo RgpA-Kgp complejo en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) (Na2HP04 0.01 M, KH2P04 1.5 mM, NaCl 0.15 M) , pH 7.0, que contuvo 0.1% (vol/vol) Tween 20 (PBST) para recubrir los pocilios de placas microtituladoras de polivinilo de fondo plano (Dynatech Laboratories, McLean, VA) . Después del retiro de la solución de recubrimiento, el PBST que contiene 2% (p/vol) de polvo de leche descremada se agregó a los pocilios para bloquear el plástico sin recubrir durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, los pocilios se lavaron cuatro veces con PBST, se agregaron a cada pocilio diluciones en serie de sueros de ratón en PBST que contuvo 0.5% (p/vol) leche descremada (SK-PBST) y se incubaron durante 16 horas a temperatura ambiente. Después, los pocilios se lavaron seis veces con PBST, se agregó en SK-PBST una dilución 1/2,000 de IgG de cabra a IgM, IgA, IgGl, IgG2a, IgG2b, o IgG3 de ratón (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) y se dejó aglutinar durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron seis veces en PBST, y se agregó a cada pocilio una dilución 1/5,000 de inmunoglobulina anti-cabra de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, los pocilios se lavaron seis veces con PBST, el anticuerpo aglutinado se detectó mediante la adición de 100 µ? de sustrato ABTS [ácido 2 , 2 ' -azino-bis ( 3-etilbenzo-tiazolin-6) sulfónico 0.9 mM en ácido cítrico 80 mM que contuvo 0.005% (vol/vol) de peróxido de hidrógeno, pH 4.0] a cada pocilio. La densidad óptica a 415 nm se midió utilizando un lector de microplacas (lector de microplacas Bio-Rad, modelo 450) .

Respuestas a la sub-clase de anticuerpos inducidas por la inmunización con la proteina KAS2-KLA1 recombinante en ratones criados (CD1, suizo). Los ratones CDl (suizos) se inmunizaron con la quimera KAS2-LA1, se les extrajo sangre y los sueros se recolectaron mediante centrifugación. Las figuras 6A, 6B y 6C muestran la reactividad de la sub-clase del anticuerpo para la quimera KAS2-LA1, las W50 de P. gingivalis exterminada con formalina y el complejo RgpA-Kgp. La quimera KAS2-LA1 indujo un anticuerpo IgG fuerte con una respuesta al anticuerpo IgGl predominante que reconoció la quimera KAS2-LA1 y tuvo reacción cruzada fuertemente con las células W50 de P. gingivalis FK y el complejo RgpA-Kgp (figuras 6A, 6B y 6C) . Además, la quimera KAS2-LA1 indujo sólo anticuerpos antigeno-especificos IgG2a, IgG2b e IgG3 débilmente inmunoreactivos (figuras 6A, 6B y 6C) .

Ejemplo 9 Desarrollo del modelo estructural Kgp y la identificación de las secuencias accesibles superficiales en el sitio activo .

Nuestro trabajo ha mostrado que los péptidos en el sitio activo de la proteinasa Kgp son bastante inmunogénicos e inducen altos niveles de protección contra la pérdida ósea inducida por P. gingivalis . En un intento por identificar péptidos adicionales en el sitio activo de la proteinasa como vacunas candidato, se desarrolló un modelo del dominio catalítico de Kgp utilizando la serie de programas Orchestrar dentro de Sybyl7.3 (figura 7). El modelo se basa en la estructura PDB lcrv de la proteasa RgpB a partir de P. gingivalis, las proteínas tienen un 23.58% de identidad de pares de bases y la marca Z es 25.09 (un modelo de alta confianza) . El servidor de interacción de proteínas Meta-PPisp predice dos superficies de interacción proteína-proteína para Kgp: la superficie de unión al sustrato (como en RgpB) , y una segunda superficie única para Kgp. Las principales diferencias entre los modelos RgpB y Kgp se encuentran en las asas que enmarcan la segunda superficie de interacción y una separación de 19 residuos (Val526 a Phe545) que se podría modelar en Kgp que cae dentro de la segunda superficie de interacción. La figura 7, muestra el modelo Kgp con las cintas más gruesas que muestran las secuencias accesibles superficiales alrededor del sitio activo proteinasa de Kgp, se encontró que las secuencias accesibles superficiales serán Asp388-Gln39 , Leu421-Ala423, Ala443-Glu447 con Ala451, Asn510-Trp513 , e Ile570-Gly577 con Tyr580. A partir del modelo (figura 6) es evidente que junto con KAS2 (A) otras tres secuencias KAS4 (Asp388-Val395) (B) , KAS5 (Asn510-Asp516) (C) y KAS6 ( Ile570-Tyr580 ) (D) son prominentes con suficiente longitud para ser blancos de vacuna. De esta forma, una proteína quimera recombinante se puede producir que tenga cada uno de los péptidos en secuencia y se una a la N-terminal de KLA1 para producir multiKAS-KLAl que se puede utilizar para inducir una respuesta inmunitaria y por lo tanto proteger contra enfermedades o condiciones relacionadas con P. gingivalis.

Ejemplo 10 Proceso para modelar la Arg-X-proteinasa para identificar regiones inmunogenicas que flanquean el sitio catalítico Se determinó la estructura tridimensional de la Arg-X-proteinasa de acuerdo con los métodos de Eichinger A, Beisel HG, Jacob U, Huber R, Medrano FJ, Banbula A, Potempa J, Travis J, Bode W. Crystal structure of gingipain R: an Arg-specific bacterial cysteine proteinase with a caspase-like fold. EMBO J. 1999 Oct 15; 18 (20) : 5453-62.

Ejemplo 11 El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta dental que contiene anticuerpos.

Ingrediente % p/p Fosfato dicálcico dihidratado 50.0 Glicerol 20.0 Carboximetilcelulosa de sodio 1.0 Laurilsulfato de sodio 1.5 Lauroil sarcosinato de sodio 0.5 Sabor 1.0 Sacarina sódica 0.1 Gluconato de clorhexidina 0.01 Dextranasa 0.01 Anticuerpos específicos que contienen suero de cabra 0.2 Agua balance Ejemplo 12 El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta dental.

Ingrediente % p/p Fosfato dicálcico dihidratado 50.0 Sorbitol 10.0 Glicerol 10.0 Carboximetilcelulosa de sodio 1.0 Laurilsulfato de sodio 1.5 Lauroil sarcosinato de sodio 0.5 Sabor 1.0 Sacarina sódica 0.1 onofluorofosfato de sodio 0.3 Gluconato de clorhexidina 0.01 Dextranasa 0.01 Anticuerpos específicos que contienen suero bovino 0.2 Agua balance Ejemplo 13 El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta dental.

Ingrediente % p/p Fosfato dicálcico dihidratado 50.0 Sorbitol 10.0 Glicerol 10.0 Carboximetilcelulosa de sodio 1.0 Lauroildietanolamida 1.0 Monolaurato de sacarosa 2.0 Sabor 1.0 Sacarina sódica 0.1 Monofluorofosfato de sodio 0.3 Gluconato de clorhexidina 0.01 Dextranasa 0.01 Anticuerpos específicos que contienen Ig de leche bovina 0.1 Agua balance Ejemplo 14 El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta dental.

Ingrediente % p/p Sorbitol 22.0 Musgo de Irlanda 1-0 Hidróxido de sodio (50%) 1.0 Gantrez 19.0 Agua (desionizada) 2.69 Monofluorofosfato de sodio 0.76 Sacarina sódica 0.3 Pirofosfato 2.0 Alúmina hidratada 48.0 Aceite saborizante 0.95 Anticuerpos monoclonales de ratón 0.3 Laurilsulfato de sodio 2.00 Ejemplo 15 El siguiente es un ejemplo de una formulación líquida de pasta dental.

Ingrediente % p/p Poliacrilato de sodio 50 .0 Sorbitol 10 .0 Glicerol 20 .0 Sabor 1 .0 Sacarina sódica 0 .1 Monofluorofosfato de sodio 0 .3 Gluconato de clorhexidina 0. 01 Etanol 3 .0 Anticuerpos específicos que contienen Ig equino 0 .2 Ácido linólico 0. 05 Agua balance Ejemplo 16 El siguiente es un ejemplo de una formulación de enjuague bucal.

Ingrediente % p/p Etanol 20.0 Sabor 1.0 Sacarina sódica ··,,., 0.1 Monofluorofosfato de sodio - 0.3 Gluconatp de clorhexidina 0.01 Lauroildietanolamida 0.3 Anticuerpos específicos que contienen Ig de conejo 0.2 Agua balance Ejemplo 17 El siguiente es un ejemplo de una formulación de enjuague bucal.

Ij}o^:ed¿ervte , % p/p Gantrez S-97 .2.5 Glicerina 10.0 Aceite saborizante . ,, 0.4 Monofluorofosfato ;de sodio . 0.05.

Gluconato de clorhexidina 0.01 Lauroildietanolamida 0.2 Anticuerpos monoclonales de ratón 0.3 Agua balance Ejemplo 18 El siguiente es un ejemplo de una formulación en forma de pastilla.

Ingrediente % p/p Azúcar 75-80 Jarabe de maíz 1-20 Aceite saborizante 1-2 NaF 0.01-0.05 Anticuerpos monoclonales de ratón 0.3 Estearato de Mg 1-5 Agua balance Ejemplo 19 El siguiente es un ejemplo de una formulación de crema para masaje gingival.

Ingrediente % p/p Petrolato blanco 8.0 Propilenglicol Alcohol estearílico 8.0 Polyethylene Glycol 4000 25.0 Polyethylene Glycol 400 37.0 Monoestgearato de sacarosa 0.5 Gluconato de clorohexidina 0.1 Anticuerpos monoclonales de ratón 0.3 Agua balance Ejemplo 20 El siguiente es un ejemplo de una formulación para goma de mascar.

Ingrediente % p/p Base de goma 30.0 Carbonato de calcio 2.0 Sorbitol cristalino 53.0 Glicerina 0.5 Aceite saborizante 0.1 Anticuerpos monoclonales de ratón 0.3 Agua balance Ejemplo 21 El siguiente es un ejemplo de una formulación farmacéutica .

Ingrediente % P/P Anticuerpos monoclonales específicos humanizados 10 Solución salina amortiguada con fosfato estéril 90 Ejemplo 22 El siguiente es un ejemplo de una formulación de periodontal.

Ingrediente % p/p Pluronic F127 20.0 Alcohol estearílico 8.0 Anticuerpos específicos 3.0 Dióxido de silicio col.oidal (Aerosil 200) 1.0 Gluconato de clorhexidina 0.1 Agua balance Ejemplo 23 El siguiente es un ejemplo de una formulación de periodontal.

Ingrediente Pluronic F127 Alcohol estearílico Anticuerpos específicos Dióxido de silicio coloidal (Aerosil 200) 1.0 Pamoato de oxantel 0.1 Agua balance Se debe entender que mientras la invención se ha descrito en detalle en la presente, los ejemplos tienen propósitos únicamente ilustrativos. Otras modificaciones de las modalidades de la presente invención que sean evidentes para aquellos expertos en la técnica de la biología molecular, los diagnósticos dentales, y las disciplinas relacionadas se pretende que queden dentro del alcance de la invención .

Se debe entender que la invención descrita y definida en esta especificación se extiende a todas las combinaciones alternativas de dos o más de las características individuales mencionadas o evidentes a partir del texto o los dibujos. Todas estas combinaciones diferentes constituyen diversos aspectos alternativos de la invención.

Referencias McKee, A. S., A. S. McDermid, A. Baskerville, A. B. Dowsett, D. C. Ellwood, and P. D. Marsh. 1986. Effect of hemin on the physiology and virulence of Bacteroides gingivalis W50. Infecí. Immun. 52:349-355.

Slots, J. 1982. Importance of black-pigmented Bacteroides in human periodontal disease. Host parasite interactions in periodontal diseases . American Society for Microbiology . 0' Brien-Simpson, N. M . , R. Pathirana, R. A. Paolini, Y. -Y. Chen, P. D. Veith, T. V., R. N. Pike, N. Alley, and E. C. Reynolds. 2005. An immune response directed to proteinase and adhesin functional epitopes protects against Porphyromonas gingivalis-induced bone loss. Journal of Immunology 175:3980-3989.

Baker, P. J., R. T. Evans, and D. C. Roopenian. 1994. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Arch Oral Biol 39: 1035-1040.

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Un método para provocar una respuesta a anticuerpos hacia un patógeno oral en un individuo, caracterizado porque incluye los pasos de: proporcionar a un individuo en el cual se provocará una respuesta a anticuerpos hacia un patógeno oral; evaluar al individuo para determinar si el individuo tiene o no tejido oral inflamado; inmunizar al individuo con un patógeno oral en circunstancias donde la valoración revele que el individuo no tiene tejido oral inflamado, provocando con esto una respuesta a anticuerpos hacia un patógeno oral en el individuo.

2. Un régimen de inmunización para provocar una respuesta a anticuerpos hacia un patógeno oral en un individuo que tenga tejido oral inflamado, el régimen de inmunización caracterizado porque incluye el paso de administrar un agente anti-inflamatorio al individuo, reduciendo con esto la inflamación, o eliminando la inflamación del tejido oral, antes de una inmunización del individuo para provocar una respuesta a anticuerpos hacia un patógeno oral.

3. Un método para acondicionar a un individuo que tenga un tejido oral inflamado para provocar una respuesta a anticuerpos hacia un patógeno oral en el momento de la inmunización con el patógeno, el método caracterizado porque incluye el paso de administrar un agente anti-inflamatorio al individuo, reduciendo con esto al mínimo la inflamación, o la eliminación de la inflamación del tejido oral, antes de una inmunización al individuo con un patógeno para provocar una respuesta a anticuerpos hacia un patógeno oral.

4. Un método para provocar una respuesta a anticuerpos hacia un patógeno oral en un individuo que tiene tejido oral inflamado caracterizado porque incluye los pasos de: proporcionar un individuo que tenga tejido oral inflamado; aplicar un tratamiento al individuo, eliminando con esto la inflamación del tejido oral; después de este- inmunizar al individuo con un patógeno oral, provocando con esto una , respuesta a anticuerpos hacia el patógenos en el individuo.

5. Un método o régimen de inmunización de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la inmunización o paso inmunizante se proporcionará en el momento cuando el tejido oral, no esté inflamado, o cuando la inflamación sea subclínica o asintomática .

6. Un método o un régimen de inmunización de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la respuesta a anticuerpos provocada con la inmunización es predominantemente una respuesta a Th2, aunque puede contener componentes detectables de una respuesta a Thl.

7. Un método o régimen de inmunización de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la inflamación es periodontitis crónica.

8. Un método o régimen de inmunización de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la periodontitis está asociada con una infección por P. gingivalis .

9. Un método o régimen de inmunización de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el inmunógeno para la inmunización es una célula, fragmento, metabolito de P. gingivalis, o un producto recombinante derivado del mismo.

10. Un método o régimen de inmunización de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el producto recombinante derivado de P. gingivalis es un péptido quimérico o una proteina de fusión.

11. Un método o régimen de inmunización de conformidad con la reivindicación 10, en donde la proteina quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmunitaria hacia P. gingivalis para el sujeto, la proteína incluye un primer péptido unido directamente o a través de un enlazante a un segundo péptido, caracterizado porque: (A) el primer péptido incluye: (i) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa a la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1, o (ii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa a la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2, y (B) el segundo péptido incluye: (i) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de P. gingivalis, o (ii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis, o (iii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es igual, u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.

12. Un método o régimen de inmunización de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el péptido quimérico o la proteina de fusión es KASl-KsAl o KAS2-KLA1 como se describe en la presente.

13. Un método o régimen de inmunización de conformidad con las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque el agente inflamatorio incluye uno o más de un compuesto anti-inflamatorio, un antibiótico o un agente anti-biopeliculas .