KR20170109685A

KR20170109685A - 감염 치료 또는 예방

Info

Publication number: KR20170109685A
Application number: KR1020177026249A
Authority: KR
Inventors: 에릭 찰스 레이놀즈
Original assignee: 오럴 헬스 오스트레일리아 피티와이 엘티디
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2011-02-25
Publication date: 2017-09-29
Also published as: SG183376A1; BR112012021383A2; MX342832B; JP5977677B2; RU2617399C2; US9125853B2; CA2790219A1; AU2011220335A1; CA2790219C; EP2538970A4; WO2011103633A1; CN104689308A; AU2011220335B2; US20130129768A1; EP3260135A1; CN102883744A; NZ601890A; CN104689308B; RU2012136724A; ZA201206204B

Abstract

본 발영은 항-균성을 형성하는 조성물 및 병원성 미생물에 대한 면역원을 이용하는 것을 포함하는, 대상에게서 대상의 구강 조직에 병원성 미생물의 존재하는 것과 관련된 질병 또는 질환의 발병(incidence) 또는 심각성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

Description

감염 치료 또는 예방{Treatment or prevention of infection}

본 발명은 질병 또는 질환에 걸린 대상의 치료 또는 예방에 관한 것이며, 대상의 구강 조직(oral tissue)에 존재하는 미생물 병원체와 관련된 상기 질병 또는 질환은, 특히, P. 진지발리스(gingivalis)-관련된 질병 또는 질환의 치료 또는 예방이나, 이에 한정되지 않는다.

입은 감염의 주요 위치 중의 하나로 여겨진다. 감염은 구강 조직의 소모성 질병(debilitating disease)을 초래할 수 있으며 구강 조직의 감염과 다른 해부학적 구획(anatomical compartments)에서의 질병 또는 질환 사이의 명확한 관련성이 관찰되어왔다.

만성 치주염(chronic periodontitis)은 구강 조직 질병 중에 한 예이다. 이것은 치조골(alveolar bone)의 흡수를 초래하여 궁극적으로 치아를 잃게 만드는 치아 지지 조직(supporting tissues)의 염증성 질병이다. 상기 질병은 모든 사회에서 주요 공중 보건 문제(public health problem)이며 심각한 형태로 발병된 5-6%와 함께 성인 인구의 15% 까지 발병할 것으로 추측된다.

만성 치주염(chronic periodontitis)의 발달 및 진행은 치은연하치태(subgingival plaque) 내의 특정 그람-음성 세균(Gram-negative bacteria)과 관련되어 왔다. 치은연하치태 내에 존재하는 포르피로모나스 진지발리스가 질병과 매우 강하게 연관되어 왔다.

처치(스케일링(scaling) 및 치근활택술(root planing)) 후에 치주염(periodontitis) 환자의 치은연하치태(subgingival plaque)에 P. 진지발리스(gingivalis)가 잔존하는 것이 치조골 손실(alveolar bone loss)의 진행과 유의미하게 관련되어 있음이 보고되어 왔다. 또한, 치은연하치태(subgingival plaque)에서의 P. 진지발리스(gingivalis) 세포 수의 증가가 부착 손실(attachment loss), 치주 포켓(periodontal pocket) 깊이 및 탐침시 출혈(bleeding on probing)로서 측정된 질병 심각성(disease severity)와 연관되어 있음이 보고되어 왔다.

P. 진지발리스(gingivalis)에 의한 구강 감염은 마우스, 랫 및 비-인간 유인원에서 치주 골(periodontal bone) 손실을 유도함이 보고되어 왔다. 또한, 치주 질환(periodontal disease) 및 P. 진지발리스(gingivalis) 감염과 심혈관계 질병(cardiovascular diseases) 및 암과의 관련성이 증가되어 왔다.

다른 세균, 균류(fungi), 바이러스(virus) 및 원생동물(protozoa)를 포함한 다른 많은 병원성 미생물(microbial pathogens)은 구강 조직의 질병과 관련이 있어왔으며 또한 상기 병원체들 중 일부는 구강 조직의 감염을 통해 다른 해부학적 구획(anatomical compartments)에 질병을 일으킨다. 형성체(former)의 예는 T. 덴티콜라(denticola) 및 T. 포시티아(forsythia)를 포함한다. A군 연쇄상구균(Group A Streptococcus) 감염은 류마티스성 열(rheumatic fever) 및 류마티스성 심장 질환(rheumatic heart disease)의 원인 인자(aetiological agent)이다.

점막 조직(mucosal tissue)이 만성적으로 염증이 생기거나, 또는 수술 또는 다른 이의 개입으로 점막 조직의 급성 염증이 발생한 상황에서 정해진 병원성 미생물에 어떻게 강한 보호 반응을 얻는지 밝혀지지 않은 것이 문제여 왔다.

명세서 내의 선행기술에 대한 참조는 이 선행기술(prior art)이 호주(Australia) 또는 어떠한 다른 관할권(jurisdiction)에서의 보통 일반적인 지식의 일부를 형성하는 것 또는 이 선행기술이 당업자에 의해 적절하게 확인되고(ascertained), 이해되고 평가(regarded)될 것이라 합리적으로 예상할 수 있는 것의 승인(acknowledgment) 또는 제안(suggestion)의 어떠한 형태가 아니며, 그렇게 받아들여지지 말아야 한다.

참조

1. McKee, A. S., A. S. McDermid, A. Baskerville, A. B. Dowsett, D. C. Ellwood, and P. D. Marsh. 1986. Effect of hemin on the physiology and virulence of Bacteroides gingivalis W50. Infect. Immun. 52:349-355.

2. Slots, J. 1982. Importance of black-pigmented Bacteroides in human periodontal disease. Host parasite interactions in periodontal diseases. American Society for Microbiology.

3. O'Brien-Simpson, N. M., R. Pathirana, R. A. Paolini, Y.-Y. Chen, P. D. Veith, T.

V., R. N. Pike, N. Alley, and E. C. Reynolds. 2005. An immune response directed to proteinase and adhesin functional epitopes protects against Porphyromonas gingivalis-induced bone loss. Journal of Immunology 175:3980-3989.

4. Baker, P. J., R. T. Evans, and D. C. Roopenian. 1994. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Arch Oral Biol 39: 1035-1040.

이 명세서에서 밝혀지고 정의된 본 발명이 글 또는 도에서 언급되거나 분명한 둘 또는 그 이상의 각각의 특징(features)의 모든 대체적인 조합(combination)으로 확대하는 것은 이해될 것이다. 모든 이러한 다른 조합들은 본 발명의 다양한 대체적인 측면으로 여겨진다.

발명의 개요

일부 실시태양에서:

- 미생물 또는 그것의 단편을 대상의 구강 조직으로부터 대체로 모두 제거하기 위한 조건을 제공함으로써, 대상을 치료하는 단계; 그 후에

- 상기 대상에 질병 또는 질환과 관련된 구강 조직에 존재하는 병원성 미생물에 대해 상기 대상을 보호하기 위한 항체를 제공함으로써 대상의 질병 또는 질환의 발병(incidence) 또는 심각성을 감소시키는 단계를 포함하는, 대상의 구강 조직에 병원성 미생물의 존재와 관련된, 대상의 질병 또는 질환의 발병(incidence) 또는 심각성을 감소시키는 방법을 제공한다.

한 실시태양에서, 항체는 대상을 병원성 미생물에 대해 보호하기 위한 면역원(immunogen)을 대상에 투여함으로써 대상에 제공된다.

한 실시태양에서:

- 대체로 모든 미생물 또는 그것의 단편을 대상의 구강 조직으로부터 제거함으로써, 대상을 치료하는 단계; 그 후에

- 대상에 P. 진지발리스(gingivalis)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해, 직접적으로 또는 링커를 통해 이차 펩타이드에 결합된 일차 펩타이드를 포함하는, 키메릭 또는 융합 단백질을 투여함으로써 대상의 질병 또는 질환의 발병(incidence) 또는 심각성을 감소시키는 단계를 포함하는, 대상에서 P. 진지발리스(gingivalis)-관련된 질병 또는 질환의 발병(incidence) 또는 심각성을 감소시키는 방법을 제공한다, 상기에서:

(A) 상기 일차 펩타이드는:

(i) 서열번호 1로 기재되는 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두; 또는

(ii) 서열번호 2 로 기재되는 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두를 포함하며; 및

(B) 상기 이차 펩타이드는:

(i) P. 진지발리스(gingivalis)의 Lys-X-단백질분해효소(proteinase) 부착소 도메인(adhesin domain)의 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두; 또는

(ii) P. 진지발리스(gingivalis)의 Arg-X-단백질분해효소(proteinase) 부착소 도메인(adhesin domain)의 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두; 또는

(iii) P. 진지발리스(gingivalis)의 HagA 부착소 도메인(adhesin domain)의 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두를 포함한다.

다른 실시태양에서:

- 대체로 모든 미생물 또는 그의 단편을 상기 대상의 구강 조직으로부터 제거하기 위한 항-생제;

- 상기 대상을 대상의 구강 조직(oral tissue)에 존재하는 질병 또는 질환과 관련된 병원성 미생물에 대해 면역시키기 위한 면역원(immunogen)을 포함하는 상기에 기재된 방법에 이용하기 위한 조성물 또는 키트를 제공한다.

일부 실시태양은:

- 대상의 구강 조직에 수술(surgical procedure)을 수행하는 단계; 그 후에

- 대체로 모든 미생물 또는 그의 단편을 상기 대상의 구강 조직으로부터 제거하기 위한 조건을 제공함으로써 대상을 치료하는 단계;

- 대상에 대상을 보호하기 위해 대상의 구강 조직에 존재하는 질병 또는 질환과 관련된 병원성 미생물에 대한 항체를 제공하는 단계를 포함하는, 대상에서 대상의 구강 조직에서 병원성 미생물의 존재하는 것과 관련된 질병 또는 질환의 발병(incidence) 또는 심각성을 감소시키는 방법을 제공한다.

한 실시태양에서, 상기 수술(surgical procedure)은 치과 치료(dental procedure)이다. 치과 치료의 예시는 변연절제술(debridement), 스케일링(scaling) 및/또는 치근활택술(root planing)을 포함한다.

한 실시태양에서, 본 발명은 대상의 구강 조직에서 병원성 미생물의 존재하는 것과 관련된 대상의 질병 또는 질환의 발병(incidence) 또는 심각성(severity) 감소를 위한 본 발명에 기재된 항생제(anti -microbial agent) 및 면역원(immunogen)을 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약제(medicament) 제조에서의 대상의 구강 조직에서 병원성 미생물의 존재하는 것과 관련된 대상의 질병 또는 질환의 발병(incidence) 또는 심각성(severity) 감소를 위한 조성물의 용도를 제공한다. 상기 질병은 치석(dental plaque), 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 만성 치주염(chronic periodontitis), 치아 우식증(dental caries), 골 손실(bone loss), 치조골(alveolar bone) 손실 및 관상동맥질환(coronary artery disease)을 포함하나, 이에 한정하지 않는다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 치주 질환(periodontal disease) (및/또는 본 발명에서 밝혀진 치료에 적합한 다른 질환)의 치료 또는 예방을 위한 본 발명에 기재된 항생제 및 면역원의 유효 성분으로 구성되는 조성물을 제공한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 기재된 항생제 및 면역원을 포함하는 대상의 구강 조직에서 병원성 미생물의 존재하는 것과 관련된 대상의 질병 또는 질환의 발병(incidence) 또는 심각성(severity) 감소를 위해 이용하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 기재된 약제(medicament)로 이용하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 조성물의 유효량을 주요 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

한 실시태양에서 개체에 존재하는 구강 병원체에 대한 항체 반응 또는 Th2 반응을 형성을 위한 제공된 방법은 하기의 단계를 포함한다:

- 구강 병원체(oral pathogen)에 항체 또는 Th2 반응을 형성할 개체(Individual)를 제공하는 단계;

- 개체가 염증이 발생한 구강 조직(Inflamed oral tissue)을 가지는지 측정하기 위해 개체를 평가하는 단계;

- 측정으로 개체가 염증이 발생한 구강 조직을 가지고 있지 않은 것을 밝힌 상황에서 구강 병원체와 함께 개체를 면역(immunising)시킴으로써 개체에서 구강 병원체에 대한 항체 반응 또는 Th2 반응을 형성하는 단계.

한 실시태양에서, 구강 병원체에 대한 항체 반응 또는 Th2 반응의 형성을 위해 개체의 면역화에 앞서, 항-염증 약제(anti-inflammatory agent)를 개체에 투여함으로써 염증을 최소화하는, 또는 구강 조직으로부터 염증을 제거하는 단계의, 염증이 발생한 구강 조직을 갖는 개체내의 구강 병원체에 대한 항체 반응 형성 또는 Th2 반응의 형성을 위한 면역화 요법(immunisation regime)이 제공된다.

다른 실시태양에서, 구강 병원체에 대한 항체 반응 또는 Th2 반응의 형성을 위해 개체를 병원체와 함께 면역화하는 것에 앞서, 항-염증 약제를 개체에 투여함으로써 염증을 최소화하는, 또는 구강 조직으로부터 염증을 제거하는 단계를 포함하는, 염증이 발생한 구강 조직을 가지는 개체가 면역화로 구강 병원체에 대해 항체 반응 또는 Th2 반응을 형성하도록 조절하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시태양에서:

- 염증이 발생한 구강 조직을 가지는 개체를 제공하는 단계;

- 치료를 개체에 적용함으로써, 구강 조직으로부터 염증을 제거하는 단계; 그 후에;

- 개체를 구강 병원체와 함께 면역시킴으로써, 개체에서 상기 병원체에 대한 항체 반응을 형성하는 단계를 포함하는 염증이 발생된 구강 조직을 가지는 개체에 존재하는 구강 병원체에 대한 항체 반응 형성 또는 Th2 반응 형성 방법을 제공한다.

상기 기재된 실시태양에서, 면역화(immunisation)는 구강 조직이 감염되지 않았을 때, 또는 염증이 잠재적(subclinical)이거나 무증상(asymptomatic)일 때 제공된다.

일반적으로 면역화 상에서 형성된 면역 반응은 대부분 T 2 반응이나, 검출 가능한 Th1반응의 요소(components)를 포함할 것이다.

일반적으로 염증은 만성 치주염(chronic periodontitis)이 바람직하며, 특히 P. 진지발리스(gingivalis) 감염과 관련된 치주염(periodontitis)이 바람직하다.

P. 진지발리스(gingivalis) 감염과 관련된 치주염(periodontitis)에서, 일반적으로 면역화를 위한 면역원은 P. 진지발리스(gingivalis) 세포, 단편(fragment), 대사 산물(metabolite), 또는 본 발명에 기재된 키메릭 펩타이드(chimeric peptides) (특히 KAS1-KsA1, KAS2-KLA1)와 같은 그것으로부터 파생된 재조합 산물(recombinant product)이다.

일반적으로 본 발명에서 정의된 항-염증 약제(anti-inflammatory agent) 또는 항생제(anti-microbial agent)는 본 발명의 실시예에 더욱 자세히 기재된 하나 또는 그 이상의 항-염증 화합물, 항-생제(anti-biotic) 및 항-생물막 제제(anti-biofilm agent)로 구성되거나 포함한다.

여기서 사용되는 용어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하는(comprising)", "포함하다(comprises)" 및 "포함된(comprised)"과 같은 상기 용어의 변형은 문맥에 달리 해석되지 않는 한, 목적은 추가적인 첨가물(additives), 성분(components), 정수(integers) 또는 단계를 배재하지 않는 것에 있다.

도 1은 재조합 Kgp 단백질의 SDS-PAGE 젤의 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue stain)을 나타낸다. 레인 1= KAS2-KLA1 , 레인 2=KLA1 , 레인 3=KsA1 , 레인 4= KAS1-KsA1. 분자량 마커는 kDa로 나타내어진다.
도 2는 KAS2 펩타이드 인식 항체 및 포르말린 사균(formalin killed) P. 진지발리스(gingivalis) W50 세포를 나타낸다. (A) KAS2 펩타이드는 포르말린 사균 P. 진지발리스(gingivalis) W50 세포(FK-W50), 재조합 단백질 KAS1-KsA1, KAS2-KLA1, 및 합성 KAS2-DT 컨쥬게이트(conjugate) 및 PBS에 대해 형성된 항혈청(antisera)으로 ELISA에서 측정되었다. (B) 포르말린 사균 P. 진지발리스(gingivalis) W50 세포는 포르말린 사균 P. 진지발리스(gingivalis) W50 세포(FK-W50), 재조합 단백질 KAS1-KsA1, KAS2-KLA1, KLA1및 PBS에 대해 형성된 항혈청(antisera)으로 ELISA에서 측정되었다. 항체 반응들은 OD₄₁₅에서의 ELISA 역가(titre)에서 배경 값(background level)의 두 배를 뺀 것으로 표현되며, 각각의 값은 세 값의 평균(mean) ± 표준 편차(standard deviation)이다.
도 3은 재조합 단백질 및 재조합 키메라 단백질, 포르말린-사균 P. gingivalis 및 보조제(adjuvant) (PBS, IFA) 단독으로 면역화된 마우스 또는 비-구두(non-orally)로 감염된 마우스(처리 안된(non-challenged))의 P. gingivalis-유도 상악 어금니(maxillae molars)의 수평적 골 손실(horizontal bone loss)을 나타낸다. 본 도에서, KAS2-KLA1는 AS2-LA1로서 나타내어지고, KLA1는 LA1로서 나타내어지며, KAS1-KsA1는 AS1-sA1로서 나타내어지고, KsA1는 sA1로서 나타내어진다. 골 손실값은 각각의 오른쪽 및 왼쪽 상악(maxillae) 모두의 상악대구치(maxillary molar)의 협측(buccal side) 백악법랑경계(cementoenamel junction) (CEJ)로부터 치조골(alveolar bone crest) (ABC)까지를 밀리미터 제곱으로(mm²) 측정한 면적의 평균값이다. 데이터는 레벤의 변량의 동질성(Levene’s homogeneity of variance)에 의해 측정된 정규 분포(normally distributed)였으며, mm² 평균 (n = 12)으로 나타내어지고 일원분산분석(One-Way analysis of variance) 및 듀넷의 T3 검정(Dunnett’s T3 test)을 이용하여 분석되었다. *은, 골 손실이 대조군(감염된 군)보다 유의적으로(P<0.001) 적은 군을 나타낸다. †은, AS2-LA1 군보다 유의적으로(P<0.001) 더욱 골 손실이 많은 군을 나타낸다.
도 4는 치주염(periodontitis) 모델에서 면역화된 마우스의 반응 항체 서브클래스(antibody subclass) 혈청을 나타낸다. 마우스 유래 혈청(Sera); 재조합 단백질 KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 및 KAS2-KLA1 및 포르말린 사균 P. gingivalis 균주 W50로 면역화된 A (전-경구 투여(pre-oral inoculation)) 및 B (후-경구 투여(post-oral inoculation))가 흡착된 항원으로서의 포르말린 사균 P. gingivalis 균주 W50과 함께 ELISA에 사용되었다. IgG (검은 바), IgG1 (회식 바), IgG2a (흰색 바), IgG2b (수평 줄무늬 바), IgG3 (대각선 줄무늬 바)의 항체 반응이 ELISA 역가(titre) (log 2)에서 배경 값(background level)을 뺀 것으로 표현되었으며, 각각의 역가는 세 값의 평균(mean) ± 표준 편차(standard deviation)이다.
도 5는 KAS2펩타이드 서열 433-468을 나타내는 중복된(overlapping) 펩타이드에 대한 펩타이드-특이적 항체 반응성(peptide-specific antibody reactivity)의 PEPSCAN 분석을 나타낸다. (A) KAS1-KsA1(흰색 바), KAS2-KLA1(검은 바) 항혈청으로 탐지된 KAS2 중복 펩타이드(상쇄 1, 중복 7). (B) KAS2-DT 컨쥬게이트 항혈청으로 탐지된 KAS1 중복 펩타이드(상쇄 , 중복 7). 각각의 바는 항체 반응성을 보여준다(광학밀도(optical density, OD)값 415 nm에서).
도 6. 키메라(Chimera) AS2-LA1는 비근교계(outbred) 마우스에서 P. gingivalis 전체 세포 및 RgpA-Kgp 복합체를 인식하는 항체 반응을 유도한다. CD1 비근교계 마우스는 키메라 AS2-LA1 (50mg/mouse)로 면역화되었고 수득된 혈청은 흡착된 항원으로서 AS2-LA1 (A), 포르말린 사멸된 P. gingivalis 균주 W50 (B) 및 RgpA-Kgp 복합체 (C)와 함께 ELISA에서 사용된 혈청이 수득되었다. 본 도에서, KAS2-KLA1는 AS2-LA1로서 나타내어졌다. 각각의 항원에 대한 각각의 면역글로불린(immunoglobulin) 아형(isotype)의 역가가 측정되었고 데이터는 ELISA 역가(‘000)에서 배경 값(background level)을 뺀 것으로 표현되었으며, 각각의 역가는 세 값의 평균(mean) ± 표준 편차(standard deviation)이다.
도 7. Kgp 단백질분해효소(proteinase)의 단백질 모델. KAS2 [Asn433-Lys468] (A), KAS4 [Asp388-Val395] (B), KAS5 [Asn510-Asp516] (C) 및 KAS6 [Ile570-Tyr580] (D).

실시태양의 구체적인 내용

본 발명의 일부 실시태양을 중심으로 언급될 것이다. 본 발명이 실시태양과 함께 기재될지라도, 본 발명이 실시태양들에 의해 한정되지 않음이 이해될 것이다. 반면, 본 발명의 목적은 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대체, 변형, 및 등가물을 포함하는 데에 있다.

당업계에 숙련된 사람은 본 발명의 실행에 사용될 수 있는 본 발명에 기재된 많은 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 방법 및 재료를 알 수 있다. 본 발명은 기재된 방법 및 재료를 제한하기 위한 것이 아니다.

본 명세서에서 밝혀지고 정의된 본 발명이 글 또는 도에서 언급되거나 분명한 둘 또는 그 이상의 각각의 특징(features)의 모든 대체적인 조합(combination)으로 확대하는 것은 이해될 것이다. 모든 이러한 다른 조합들은 본 발명의 다양한 대체적인 측면으로 여겨진다.

여기서 사용되는 용어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하는(comprising)", "포함하다(comprises)" 및 "포함된(comprised)"과 같은 상기 용어의 변형은 문맥에 달리 해석되지 않는 한, 목적은 추가적인 첨가물(additives), 성분(성분s), 정수(integers) 또는 단계를 배재하지 않는 것에 있다.

본 발명자들은 감염에 대해 향상된 반응, 특히, 향상된 항체 반응을 조직에서 면역력(immunity)의 양자 전이(adoptive transfer) 제공에 앞서, 또는 면역 반응이 조직에서 작동된 때에, 구강 조직으로부터 거의 모든 염증성 자극들(inflammatory stimuli)을 제거하여 얻을 수 있는 것을 발견했다. 상기 발견은 특히 구강 조직에서의 질병의 예방 및/또는 치료, 더 나아가 다른 해부학적 구획에 병원성 미생물에 의한 구강 조직의 감염 결과로서 발생되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위해 제공되는 한 유용하다.

따라서, 일부 실시태양에서:

한 실시태양에서, 미생물(micro-organisms) 또는 그것의 단편을 대상의 구강 조직으로부터 거의 모두 제거하기 위한 조건을 제공함으로써, 대상을 치료하는 항생제 조성물 및 면역원이 상승 효과 유효량(synergistically effective amount)으로 제공된다.

일반적으로, 본 발명에 기재된 상기 대상은 동물, 특히 포유동물을 말한다. 한 실시태양에서, 상기 포유동물은 인간이다. 일부 실시태양에서, 상기 포유동물은 길이든 동물 또는 가축이다. 길든 동물 또는 가축의 예시는 말, 염소, 돼지 및 소 및 양과 같은 가축이다. 일부 실시태양에서, 상기 동물은 개, 고양이, 토끼 또는 기니피그와 같은 반려동물(companion animal)이다.

1.정의

문장 ‘거의 모든 미생물 및 그의 단편을 구강 조직으로부터 제거’는 일반적으로 미생물 또는 그의 단편 또는 대사물이 조직의 염증 자극의 감소를 위해 충분한 정도로 조직으로부터 제거됨으로써, 상기 조직에서 염증의 하나 또는 그 이상의 증상이 유의적으로 감소 또는 최소화되는 조건을 제공하는 것을 말한다. 이것은 특히 대상이 만성 감염에 근간을 두고 있는 조직의 만성 염증을 갖는 경우이다. 일반적인 초점은 조직의 염증을 최소화하는데 있다. 따라서, 몇몇의 미생물, 그의 단편 및 대사물이 관련 치료 단계 후에 잔존하는 것이 이해될 것이다.

또 다른 실시태양에서, 개체는 감염된 조직을 갖지 않는 경우, ‘모든 미생물 및 그의 단편을 구강 조직으로부터 제거’라는 문장은 미생물, 그의 단편 및 대사물이 염증을 일으킬 수 있는 정도로 축적되는 것을 유의적으로 막는 조건을 제공하는 것을 말한다. 이것은 특히 치료를 위한 대상이 정상 또는 질병 또는 질환에 대해 증상이 없는 경우이다. 수술 또는 치과 수술(dental intervention)에 동일한 적용이 미생물을 제거하였으며, 상기 목적은 염증을 야기할 수 있는 양의 미생물의 축적을 유의적으로 보호하는 조건이 제공되는 것을 확실히 하기 위한 것이다. 상기 실시태양에서의 초점은, 염증을 야기할 수 있는 미생물 양의 축적 예방이며, 몇몇 미생물, 단편 또는 그것의 단편 또는 대사물이 관련 치료 단계 후에 축적될 수 있음이 이해되어야 할 것이다.

‘질병 또는 질환의 발생 감소’라는 문장은 일반적으로 정상 또는 무자각 개체, 또는 질병 또는 질환의 초기 형태를 겪고 있는 개체가 완전히 활성화된 형태의 질병 또는 질환으로 진행될 대상의 가능성을 최소화하는 것을 말한다. 일부 실시태양에서, 상기 문장은 대상이 완전한 형태의 질병 또는 질환으로 진행되는 것을 예방하는 것을 말한다.

상기 ‘질병 또는 질환의 심각성 감소’ 문장은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 증상(symptoms) 또는 징후(manifestations) 또는 질병 또는 질환을 최소화하는 것을 말한다. 일부 실시태양에서, 상기 문장은 질병 또는 질환을 가지는 개체를 치료하는 것을 말한다.

‘면역원(immunogen)’은 일반적으로 항원에 대한 면역 반응을 유발 또는 이끌어낼 수 있는 분자를 말하며, 바람직하게는 예를 들어, Th2 반응과 같은, 체액성(humoral) 또는 항체 반응이다. 면역원의 예시는 펩타이드 및 관련된 단백질을 포함한다.

‘상승 효과 유효량(synergistically effective amount)’라는 문장은 일반적으로 조성물(composition) 또는 면역원(immunogen)이 각각 단독으로 사용된 경우에 얻을 수 있는 효과 보다 더욱 큰 치료 또는 예방(preventive) 또는 보호(protective) 효과를 제공하는 항생제 조성물 및 면역원의 양을 말한다. 한 실시태양에서, 항생제 조성물 및 면역원의 상승 효과 유효량은 상기 면역원의 보호 또는 치료적 효과가 면역원이 단독으로 염증이 발생한 조직에 사용되는 경우 얻어질 수 있는 효과 보다 훨씬 큰, 상기 조성물 및 면역원 사이의 신규한 연관성 작용을 뒷받침한다. 일반적으로 항생제 및 면역원의 상승 효과 유효량은 면역원이 단독으로 사용되었을 때 자각될 수 있는 정도 보다 병원성 미생물에 대해 더 높은 역가 및/또는 더 높은 친화도(affinity)의 항체 반응을 제공한다.

‘치료적 유효량(therapeutically effective amount)’이라는 문장은 일반적으로 (i) 특정 질병(disease), 질환(condition), 또는 장애(disorder)를 치료하는, (ii) 특정 질병, 질환, 또는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상을 약화시키는(attenuates), 개선하는(ameliorates) 또는 제거하는(eliminates), 또는 (iii) 본 발명에 기재된 특정 질병, 질환, 또는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상 개시를 지연시키는 본 발명의 조성물의 양을 말한다.

단어 ‘치료하다(treat)’ 또는 ‘치료(treatment)’는 원치 않는 생리적인 변화 또는 장애를 늦추는 목적의 치료상의 처치(therapeutic treatment)를 말한다. 본 발명의 목적을 위해, 이로운 또는 원하는 임상적 결과는 감지할 수 있던 아니던, 증상의 경감(alleviation), 질병 규모(extent)의 축소(diminishment), 질병의 안정된 상태(즉, 더 나빠지지 않는), 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 완화(palliation), 및 차도(remission) (일부 또는 전부)를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, ‘치료(treatment)’는 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존에 비해 연장된 생존(prolonging survival)을 의미할 수 있다. 치료가 반드시 감염을 완전히 없애지는 않을 것이나, 감염의 합병증(complications) 및 부작용(side effects) 및 감염의 진행을 감소시키거나 최소화 할 것이다. 치료의 성공인지 아니면 그 반대인지가 개체의 신체검사(physical examination), 세포병리학적(cytopathological), 혈청학적(serological) DNA, 또는 mRNA 탐지 기법(detection techniques)들에 의해 관찰될 것이다.

단어 ‘예방하다(prevent)’ 및 ‘예방(prevention)’은 일반적으로 합병증 관련된 감염이 합병증으로 진행되지 않도록 개체를 보호 또는 방지(precluding)하기 위한 예방(prophylactic) 또는 예방(preventative) 방법을 말한다. 예방이 필요한 개체들은 감염을 가지는 개체를 포함한다.

문장 ‘약학적으로 허용가능한 (pharmaceutically acceptable)’은 물질 또는 조성물이 제형(formulation)을 포함하는 다른 성분들(ingredients)과, 및/또는 그것으로 치료될 포유동물과 화학적으로 및/또는 독성학적(toxicologically)으로 화합되어야 함을 나타낸다.

용어 ‘패키지 삽입(package insert)’은 관례적으로 징후(indications), 용법(usage), 복용량(dosage), 투여(administration), 사용금지사유(contraindications) 및/또는 치료제의 사용과 관련된 경고에 대한 안내를 포함하는 치료제(therapeutic product)의 상업적 패키지에 포함된 설명서를 나타내기 위해 사용되었다.

Th1 반응은 일반적으로 인터페론 감마(interferon gamma) 및 TNF와 같은 사이토카인들(cytokines)과 관련된 반응을 나타낸다.

Th2 반응은 인터루킨(interleukin)-4, 인터루킨(interleukin)-5, 인터루킨(interleukin)-6, 인터루킨(interleukin)-10, 인터루킨(interleukin)-13 등과 같은 사이토카인들(cytokines)과 관련된 반응을 나타낸다.

2.치료 방법

본 발명의 방법은 상기 질병 또는 질환에 대해 증상이 없는(asymptomatic) 대상을 포함하는 넓은 범위의 대상에 적용 가능하다. 상기 개체들은 구강 또는 다른 조직에 질병의 증상이 없을 것이다. 특히, 상기 개체들은 점막 또는 다른 구강 조직에 염증이 존재하지 않을 것이다. 한 실시태양에서, 대상 집단에서 랜덤하게 선택된 맥락에서, 상기 개체들은 구강(oral cavity)에서 정상적인 병원성 미생물의 상대 빈도(relative abundance)를 가질 것이다.

다른 실시태양에서, 상기 대상은 구강 조직 또는 다른 해부학적 구획(anatomical compartments)의 질병 또는 질환의 준임상(sub clinical) 또는 임상적 증상을 보인다.

상기 질병 또는 질환의 증상들은 상기 대상의 구강 조직에서 드러날 것이다. 혈장(plasma) 및 백혈구(leukocytes)의 혈액으로부터 손상된 조직으로의 증가된 이동을 포함하는 급성 염증(acute inflammation)의 특징들(hallmarks)이 나타날 것이다. 또한, 발적(rubor) (적열상태(redness)), 열(calor) (증가된 열(increased heat)), 종양(tumor) (부종(swelling)), 통(dolor) (통증(pain)), 및 기능 상실(functio laesa) (loss of function)를 포함하는 치은(gingiva)의 급성 감염의 임상적 징후들이 나타날 것이다. 만성 염증은 백혈구 세포 (단핵구(monocytes), 대식세포(macrophages), 림프구(lymphocytes), 형질 세포들(plasma cells)) 침투(infiltration)에 의해 특징지어질 것이다. 조직 및 골 손실이 관찰될 것이다. 염증의 예시는 구순염(cheilist), 치은염(gingivitis), 설염(glossitis) 및 구내염(stomatitis)을 포함한다.

한 실시태양에서, 상기 대상은 염증이 발생한 점막 또는 다른 조직을 가질 것이다. 예를 들어, 상기 대상은 구강 조직의 급성 감염이 존재할 것이다. 상기 대상의 예시는 변연절제술(debridement), 스케일링 및 치근활택술(root planing)을 포함하는 치과 또는 구강 수술을 해 온 대상을 포함한다.

추가적인 실시태양에서, 상기 대상은 구강 조직의 만성 염증을 가질 것이다. 한 실시예에서, 상기 대상은 치은염(gingivitis), 치조골(alveolar bone)의 흡수가 있을 것이며, 결국 치아의 치조골로의 콜라겐 부착(collagen attachment) 손실 진행으로 기인한 치아 손실이 발생할 것이다. 점막의 다른 병변(lesions) 또는 관련된 구강 조직이 가능하다.

한 실시태양에서, 상기 질병 또는 질환은 구강 조직의 질병 또는 질환이다. 만성 치주염(periodontitis)은 특히 중요한 예시이다. 성홍열(Scarlet Fever), 애프더성 구염(Aphthous Stomatitis), 화농성육아종(Pyogenic Granuloma), 디프테리아(Diphtheria), 폐결핵(Tuberculosis), 매독(Syphilis), 방선균증(Actinomycosis), 칸디다증(Candidiasis), 허피스 구내염(Herpetic Stomatitis)의 경우에서와 같이, 구강 점막에 손상을 주는 것으로 특징지어진 다른 질병 및 질환을 포함한다.

질병 또는 질환이 기관(organ) 또는 계(system), 예를 들어, 심혈관계(cardiovascular system)와 같은 구강 조직 보다 다른 조직의 질병 또는 질환인 것이 이해될 것이다. 한 실시태양에서, 상기 질병 또는 질환은 심혈관계 질환(cardiovascular disease)이다.

본 발명은 병원성 미생물, 특히 구강(oral cavity)의 조직을 감염시키는 미생물에 적용 가능하다. 한 실시태양에서, 상기 병원체는 세균, 바일러스 및 균류로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

특히 바람직한 세균은 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 타네렐라 포르시티아(Tannerella forsythia)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

다른 병원체의 예는 하기의 표 5에 나타냈다.

유기체(Organism)	과(패밀리) 예시/ 속(genus) 예시	종(species) 예시
세균(Bacteria)	Streptococci	salivarius
		mutans
		sanguis
		pneumoniae
		pyogenes
		mitis
	Neisseria	meningitidis
	Lactobacilli	plantarum
	Proteus
	Bacteroides
	staphylococci	epidermidis
		aureus
	Pseudomonas	aeruginosa
	Clostridium	perfringens
		tetani
	Corynebacteria
	Enterococci	faecalis

	Veillonella
	Treponema	denticola
	Porphyromonas	gingivalis
	Tanneralla	forsythia
	Aggregatibacter	actinomycetemcomitans
	Actinomycetes
	Spirochetes
	Mycoplasmas
균류(Fungi)	Candida	albicans
		khmerensis
		metapsilosis
		parapsilosis
		tropicalis
	Cladosporium	cladosporioides
		sphaerospermum
		herbarum
		tenuissimum
	Aureobasidium	pullulans
	Saccharomycetales
	Fusarium	culmorum
		oxysporum
		poae
	Aspergillus	amstelodami
		caesiellus
		flavus
		Oryzae
		Penicillioides
		Ruber
	Xylariales
	Glomus	Fulvum
		Mosseae
	Leptosphaeriaceae
	Ascomycete
	Basidiomycete
	Ophiostoma	Floccosum
		Pulvinisporum
	Ectomycorrhiza
	Penicillium	Brevicompactum
		Glabrum
		Spinulosum
	Endophytic fungi
	Glomeromycete.
	Alternaria	Tenuissima
		triticina
	Cryptococcus	cellulolyticus
		diffluens
	Phoma	foveata
		plurivora
	Saccharomyces	bayanus
		cerevisiae
		ellipsoideus
	Schizosaccharomyces	japonicus
		pombe
	Zygosaccharomyces	pseudorouxii
		rouxii
원생동물(Protozoa)	Entamoeba	Gingivalis
	Trichomonas	Tenax
	Leishmania	brasiliensis
바이러스(Viruses)	Herpesvirus	Herpesvirus 1 내지 8
	Papillomavirus	Human papilomavirus (HPV) -1, HPV-3, HPV-27, HPV-29, 및 HPV-57
	Enteroviruses	Coxsackie virus A16 및 enterovirus-71

한 실시태양에서, 항생제를 형성하는 조성물은 대상에 투여됨으로써, 거의 모든 미생물 또는 그의 단편을 상기 대상의 구강 조직으로부터 제거한다. 실시예는 뒤에 더 논의되었다.

한 실시태양에서, 예를 들어 면역원을 대상에 투여하여, 대상에 항체를 제공하는 것은 감염된 부위의 기계적 변연절제술에 의한 치료 및/또는 본 발명에서 정의된 하나 또는 그 이상의 항생제의 적용 한 주 내지 두 주 뒤에 발생한다.

미생물, 그의 단편 또는 대사물의 존재 정도 또는 유무는 미생물 유래 단백질 또는 그의 단편을 검출 또는 측량하여 측정될 수 있다.

다른 실시태양에서, 구강 조직 내의 미생물, 그의 단편 또는 대사물의 존재 정도 또는 유무는 개체로부터 샘플 채취 및 샘플 내의 정해진 단백질의 존재 여부, 또는 발현 정도의 검출에 의해 측정될 수 있다. 단백질의 존재 여부 또는 정도는 여러 가지 분석으로 검출될 수 있다. 예시는 면역분석(immunoassays), 크로마토그래피(chromatography) 및 질량 분석(mass spectrometry)을 포함한다. 면역 분석의 한 예는 특히 FACS가 바람직하다.

샘플 내의 표적 단백질 존재 검출에 이용될 수 있는 다양한 분석은 하기를 포함한다:

효소 결합 면역흡착법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA): 상기 방법은 예를 들면, 침(saliva) 또는 구강 조직과 같은, 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편을 포함하는 샘플을 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 웰과 같은 표면에의 고정(fixation)을 수반한다. 효소에 결합된 항체 특이적 표적 단백질이 사용되며 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편에 결합시킨다. 항체의 존재는 그 뒤에 항체에 결합된 효소를 사용한 비색 반응(colorimetric reaction)에 의해 검출되며 정량된다. 본 방법에서 일반적으로 사용된 효소는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 및 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)를 포함한다. 잘 보정되고(calibrated) 및 반응의 직선 비정(linear range) 내 이면, 샘플에 존재하는 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편의 양은 색이 나타난 양에 비례한다. 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편 기준(standard)은 일반적으로 정량적 정확성(quantitative accuracy)을 향상시키기 위해 이용된다.

웨스턴 블롯: 상기 방법은 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편을 아크릴아마이드 젤(acrylamide gel)를 사용한 뒤 뒤이어 상기 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편을 멤브레인(예를 들어, 나일론(nylon) 또는 PVDF)에 트랜스퍼하여 다른 단백질로부터 분리하는 것을 수반한다. 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편의 존재는 그 뒤에 상기 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편에 특이적인 항체에 의해 검출되며, 결국 항체 결합 시약(antibody binding reagents)에 의해 검출된다. 항체 결합 시약은, 예를 들어, 단백질 A(protein A), 또는 다른 항체들일 것이다. 항체 결합 시약들은 상기에 기재된 바와 같이 방사선 동위 원소 표지(radiolabelled) 또는 효소 연결(enzyme linked)되었을 것이다. 검출은 방사선 사진 촬영술(autoradiography), 비색 반응(colorimetric reaction) 또는 화학 발광(chemiluminescence)에 의한 것일 것이다. 본 방법은 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편의 양의 정량(quantitation), 및 전기영동(electrophoresis) 동안 아크릴아마이드 겔에서의 이동 거리를 보여주는 막(membrane)에서의 상대적인 위치(relative position)에 의해 그 것의 정체 모두를 알 수 있게 해준다.

방사성-면역측정법(Radio-immunoassay, RIA): 한 버전에서, 본 방법은 원하는 표적단백질, 펩타이드 또는 그의 단편과 함께 아가로오스 비드(agarose beads)와 같은 침전 가능한 담체(precipitable carrier)에 고정된 특이적인 항체 및 방사선 표지 된 항체 결합 단백질(예를 들어, I¹²⁵로 표지된 단백질 A)의 침전을 수반한다. 침전된 펠릿(pellet)에 있는 변수(counts)의 수는 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편의 양에 비례한다.

RIA의 대체 버전에서, 표지된 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편 및 표지 안된 항체 결합 단백질이 사용된다. 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편의 양이 불명확한 샘플이 다양한 양으로 추가된다. 표지된 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편으로부터 침전된 변수의 감소는 추가된 샘플에 있는 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편의 양에 비례한다.

형광 활성화 세포 분류기(Fluorescence activated cell sorting, FACS): 본 방법은 표적 단잭질, 펩타이드 또는 그의 단편 특이적 항체에 의한 세포내의 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편의 in situ 검출을 수반한다. 상기 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편 특이적인 항체는 형광물질(fluorophores)에 연결되어있다. 검출은 각각의 세포로부터 발해진 빛이 광선(light beam)으로서 지나가는 파장을 읽는 세포 분류기를 사용하여 수행되었다. 본 방법은 둘 또는 그 이상의 항체를 동시에(simultaneously) 사용할 것이다.

면역 조직 화학 분석(Immunohistochemical analysis): 본 방법은 고정된 세포에서 표적 단백질, 펩타이드 도는 그의 단편 특이적 항체에 의한 in situ 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편의 검출을 수반한다. 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편 특이적인 항체는 효소 또는 형광물질에 연결된 것일 것이다. 검출은 현미경(microscopy) 및 주관적(subjective) 또는 자동적인 평가(evaluation)에 의한다. 효소 연결된 항체가 사용되면, 비색 반응이 요구될 것이다. 면역 조직 화학이 종종 예를 들어 헤마톡실린(Hematoxyline) 또는 김사염색(Giemsa stain)를 이용한 세포 핵의 대비염색제(counterstaining)가 뒤따른다는 것을 확인할 수 있을 것이다.

In situ 활성 분석: 본 발명에 따르면, 색소 생산 기질(chromogenic substrate)이 활성 효소를 포함하는 세포에 사용되며 상기 효소는 기질이 분해되어 광학 또는 형광 현미경(fluorescent microscope)에 의해 보이는 색소 생산 물질(chromogenic product)을 생산하는 반응을 촉진한다.

In vitro 활성 분석: 본 방법에서 세포에서 추출된 단백질 혼합물에 있는 특정 효소의 활성이 측정된다. 상기 활성은 분광광도계(spectrophotometer) 웰에서 비색 방법을 이용하여 또는 비- 변성(non- denaturing) 아크릴아마이드 젤(즉, 활성 젤)에서 측정될 수 있다. 전기영동 후에 상기 젤은 기질 및 비색 시약을 포함하는 용액에 적셔진다. 염색의 결과로 나온 밴드는 관심 있는 단백질의 효소 활성에 상응한다. 잘 보정되고(calibrated) 및 반응의 직선 비정(linear range) 내 이면, 샘플에 존재하는 표적 단백질, 펩타이드 또는 그의 단편의 양은 색이 생산된 양에 비례한다. 효소 표준은 일반적으로 정량적 정확성을 향상시키기 위해 사용된다.

또한, 상기 세균 DNA의 양이 구강 조직내의 미생물의 존재 또는 정도의 지표로서 정량적 PCR(quantitative PCR)에 의해 측정될 것이다.

Porphyromonas gingivalis , Treponema denticola, Tannerella forsythia 유래 단백질 또는 DNA의 존재 여부 또는 정도가 측정될 것이며 대상의 구강 조직으로부터 제거된 거의 모든 미생물 또는 그의 단편을 나타낼 것이다.

항생제 및/또는 면역원이 전신적으로(systemically), 또는 구강 조직, 특히 구강 점막(oral mucosa)에 직접적으로 투여될 것이다.

한 실시태양에서, 대상의 치료는 상기 대상의 구강 조직으로부터 거의 모든 미생물 또는 그의 단편을 제거함으로써 대상의 구강 조직의 염증을 최소화한다. 다른 실시태양에서, 대상의 치료는 거의 모든 미생물 또는 그의 단편을 상기 대상의 구강 조직으로부터 제거함으로써 상기 대상의 구강 조직에서의 면역 반응(immune responses)을 최소화한다.

면역원이 거의 모든 미생물 및 그의 단편을 상기 대상의 구강 조직으로부터 제거하기 위해 상기 대상에 상기 대상의 치료 후에 투여될 것이다.

일반적으로, 본 발명에 따르면, 면역화(immunisation) 때 전혀 증상이 없거나(asymptomatic) 잠재성(sub clinical)으로 나타나면, 관련된 구강 조직은 염증이 발생하지 않거나, 또는 염증이 없는 것이다.

면역화 후에 대상은 주로 체액성 반응(humoral response)인 Th2 반응의 우세(predominance)를 보이며 개체는 검출 가능한 정도의 방어적인 항체(protective antibodies)를 가진다.

3.조성물

일부 실시태양은 하기를 포함하는 조성물을 제공한다:

- 거의 모든 미생물(micro-organisms) 및 그의 단편을 상기 대상의 구강 조직으로부터 제거하기 위한 항생제(anti -microbial agent);

- 상기 대상을 구강 조직에 존재하는 질병 또는 질환에 관련된 병원성 미생물(microbial pathogen)에 대해 면역화하기(immunising) 위한 면역원(immunogen);

상기 기재된 방법에 사용 가능한 상기 조성물

3. (a)항생제(Anti-microbial agents)

항생제는 투여하면 염증 자극(inflammatory stimuli)을 제거하는 효과가 있는 어떤 약제일 것이다. 단독 또는 조합으로 사용된 상기 약제들은 단기적으로(in the short term) 염증, 예를 들어, 생물막 형성(biofilm formation)과 같은 치주 병원체(periodontal pathogen)의 재출현(re-emergence) 및/또는 치주골 흡수(periodontal bone resorption) 억제에 유용성을 가진다. 상기 단독 또는 조합 약제들은 치주 병원체에 대한 백신 접종(vaccination)을 위한 환자의 면역 시스템을 제작하기 위해 예를 들어, 원칙적으로 외과적 개입(surgical intervention)을 겪을 수 있는 치주 위치에서 지속성(slow-release), 치주 젤 제제(periodontal gel formulation)로 사용될 수 있다.

어떤 가설 또는 작용양식(mode of action)에 의한 결합되는 것 없이, 본 발명에 따른 예를 들어 치주 젤 제제와 같은 항생제 적용이 변연절제술(mechanical debridement) 및 감염된 치주 위치를 세정할 때, 면역 시스템이 Th2-편향된(biased) 반응을 발전시키는 것을 준비하는 것을 돕는 것이 신뢰된다. 상기 Th2-편향된 반응은 방어적인 항체의 생산 및 치주 병원체의 재-출현 예방(prevention) 및 질병 진행을 예방하는 결과를 초래한다.

본 맥락에서, 항생제(anti-microbial agents)는: 항생물질(antibiotic), 면역억제제(immunosuppressant) 및 소독제(antiseptic) 일 것이다. 일부 실시태양에서, 약제는 항-염증제(anti-inflammatory agent)일 것이다. 항-염증제는 비스테로이드계 항-염증제(Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs, NSAIDs)를 포함한다. NSAIDs의 예시는 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase)가 억제하는 것 이상으로 억제하는 화합물을 포함한다. NSAIDs의 특정 예시는 아스피린(aspirin), 이부프로펜(ibuprofen) 및 나프록센(naproxen)을 포함한다. 항-염증제의 다른 예시는, PAR-2에 결합하는 항체들 및 항체 단편, PAR-2에 결합하여 활성을 억제하는 다른 폴리펩티드, PAR-2 활성 또는 발현을 억제하는 작은 유기 화합물(organic compounds)을 포함하는 다른 화합물 및 PAR-2를 암호화하는 핵산과 상호 작용(interact)하는 억제성 핵산(inhibitory nucleic acids)을 포함하는 PAR-2의 길항제(antagonists)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 내생의 리간드를 PAR-2 결합 및/또는 PAR-2를 통한 시그널링으로부터 막거나 나타내는 길항제 예시는 WO 2004/002418 및 WO 2006/023844에 기재된 것들을 포함한다(예를 들어, LIGK 또는 LIGKV의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드들). 묶인 리간드(tethered ligand)로서 작용하는 PAR-2에 결합하고 PAR-2 부위의 단백질 가수 분해 절단(proteolytic cleavage)을 예방하는 길항제들은 WO 2007/092640에 예로 들어져있다.

PAR-2의 발현을 억제, 감소 또는 막는 길항제들은 억제성 핵산, 리보자임(ribozymes), 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오티드(triplex-forming oligonucleotides, TFOs), RNase P에 의한 절단을 촉진시키는 외부가이드 서열(external guide sequences, EGSs), 펩타이드 핵산(peptide nucleic acids), 안티센스 DNA(antisense DNA), siRNA, 및 PAR-2를 암호화하는 핵산에 특이적인 마이크로 RNA(microRNA)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

PAR-2는 정상적인 상황하에 PAR-2를 잘라 활성화시키는 단백질 분해 효소(proteases)의 활성에 길항 작용하는 “간접적인 길항제(indirect antagonists)”에 의해 간접적으로 억제될 수 있다. PAR-2를 자를 수 있는 단백질 분해 효소는 진지페인(gingipains), 트립신(trypsins), 트립타아제(tryptases) 및 호중구 프로테이네이즈(neutrophil proteinase)-3을 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 또는 본 발명의 조성물로 사용될 수 있는 간접적 길항제의 예는 WO 93/14779에서 밝혀진 트립신 억제제(trypsin inhibitors) 및 WO 02/47762에서 밝혀진 트립타아제 억제제(tryptase inhibitors)를 포함한다.

한 특정한 바람직한 실시태양에서, 항생제는 항생물질이다. 실시예는 하기 표 6에서 나타낸 바와 같이, 매크로라이드(macrolides), 테트라사이클린(tetracyclines), 페니실린(penicillins), 푸마레이트 환원효소 억제자들(fumarate reductase inhibitors)및 항-미생물 펩타이드(anti-microbial peptides)로 구성되는 군으로부터 선택되는 항생 물질들을 포함한다.

한 실시태양에서, 상기 항-미생물 제제는 푸마레이트 환원효소(fumarate reductase)의 억제제 중 하나 또는 그 이상으로부터 선택된다. 허용 가능한 억제제는 데커신(decursin), 버티시피론(verticipyrone), 페실아미놀(paecilaminol), Streptomyces spp . 유래 5-알케닐(alkenyl)-3,3(2H)-푸라논(furanones),나푸레딘(nafuredin), 메사코닉산(mesaconic acid), 로테논(rotenone)을 포함하는 자연물, 및 그의 자연, 반-합성(semi-synthetic) 및 합성 유사체들(synthetic analogues)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 측면에서, 억제제는 2-치환된(substituted) 4,6-디니트로페놀(dinitrophenols); 머캅토피리딘(mercaptopyridine) N-옥사이드(oxide); L-092,201 (Merck Sharpe 및 Dohme); 펙신다졸 메가졸 벤즈니다졸(fexindazole megazol benznidazole), MK-436, L-634,549, 미소니다졸(misonidazole)과 같은 니트로(nitro)-이미다졸(imidazoles); 또는 알벤다졸(albendazole), 캠벤다졸 미벤다졸(cambendazole mebendazole), 옥스펜다졸(oxfendazole), 페레벤다졸(parebendazole) 및 티아벤다졸(thiabendazole)과 같은 벤즈이미다졸(benzimidazoles); 또는 옥산텔(oxantel) 또는 모란텔(morantel)을 포함하나 이에 한정되지 않는 합성 화합물 일 것이다. 바람직한 억제제는 옥산텔, 모란텔 또는 티아벤다졸이다. 특히 바람직한 억제제는 옥산텔(oxantel)이다.

억제제의 선택이 억제제가 임상 설정(clinical setting)에의 이용에 적합할지 아닐지 결정하는 임상적 인자(clinical factors) 수에 의존적일 것임이 당업자에게 인식될 것이다.

항생 물질은 병원성 미생물에 직접적으로 세포 독성(cytotoxic)을 가질 것이다. 다른 실시태양에서, 항생물질은 간접적으로 세포독성을 가지며, 예를 들어, 항생 물질은 미생물 생물막(microbial biofilm) 생산 또는 몇몇 다른 대사(metabolism)의 억제자일 것이다.

한 실시태양에서, 항생물질(antibiotic)은 항균 펩타이드(anti-microbial peptide)이다. 예시는 하기의 표 7에 나타내어진다.

항생제(Anti-microbial agent)	예시 문헌(Exemplary reference)
_αS1- 카제인(casein) (11-23) (서열번호: 86)를 포함하는 펩타이드	-
β-카제인(casein)(193-209) (서열번호: 87)를 포함하는 펩타이드	-
κ-카제인(casein)(109-137) (서열번호: 88)를 포함하는 펩타이드	-
β-카제인(casein)(193-205) (서열번호: 89)를 포함하는 펩타이드	-
κ-카제인(casein)(117-137) (서열번호: 90)를 포함하는 펩타이드	-
비-글리코실화된(Non-glycosylated) 펩타이드, 예를 들어, κ-카제인(casein)으로부터 유래된	PCT/AU98/00972 (예를 들어, 표 1 참조)
예를 들어, κ-카제인(casein)로부터 유래된 펩타이드 및 이가 양이온(divalent cation)을 포함하는 조성물	PCT/AU2004/001764
예를 들어, κ-카제인(casein)으로부터 유래된 펩타이드	펩타이드들을 이가 양이온과 함께 조성물로 포함하는 PCT/AU98/00972의 글리코실화된 버전의펩타이드
P. gingivalis 폴리펩타이드를 억제하기 위한 약제	PCT/AU2008/001017 (예를 들어, 푸마레이트 환원효소의 억제자 참조. 예를 들어, 옥산텔(oxantel), 모란텔(morantel) 또는 티아벤다졸(thiabendazole))

한 특정 바람직한 실시태양에서, 항-미생물 제제는 미생물 생물막 생산 억제자(inhibitors)이다. 다른 바람직한 약제는 푸마레이트 환원 효소 억제자이다.

일부 실시태양에서, 항-미생물 제제는 항체일 수 있다. 상기 항체는 다클론(polyclonal) 또는 단일클론(polyclonal) 항체일 수 있다. 사용될 수 있는 단일클론 항체의 예시는 염증을 약화시키기 위해 치주 병원체(예를 들어, 단백질분해효소(proteases) 및 부착소(adhesions))의 분자 또는 숙주를 겨냥한다 [예를 들어, 단독 또는 조합으로, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF), 인터루킨-1(interleukin-1, IL-1), 우로키나아제-타입 플라스미노겐 활성자(urokinase-type plasminogen activator, u-PA), 과립 대식세포 집락 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF) 및 RANK 리간드 (RANKL)에 대한 항체들]. 바람직한 항체는 다른 병원체 항원(antigens) 및 염증 중간물질(inflammatory mediators) 숙주를 겨냥하는 단일클론 항체의 혼합물이다. Porphyromonas gingivalis 표적화에 사용될 바람직한 단일클론 항체는 Kgp 및 RgpA 단백질 분해 효소(proteinases)의 활성 자리(active site)를 겨냥하며 Kgp 및 RgpA의 A1 부착소(adhesin)의 결합 모티브(binding motifs)를 겨냥한다.

한 실시태양에서, 항-미생물은 항체 모방(mimetic)이다. 상기 항체 모방 물질은 면역글로불린 도메인의 삼차 구조를 가지거나 가지지 않을 수 있다(예를 들어, Dimitrov, 2009, MAbs 1 26-28). 항체 모방 물질은 특정 분자에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다. 항체 모방물질의 한 예는 안티칼린(anticalins)으로 알려진 인간 리포칼린(lipocalins)과 관련된 분자의 패밀리이다(예컨데. Skerra, 2007 Current Opinions in Biotechnology, 18 295-304). 바람직하게는, 안티칼린은 Porphyromonas gingivalis 유래 단백질을 겨냥하거나, 특이적이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 안티칼린은 Kgp 및 RgpA 단백질 분해 효소와 같은 Lys-X-단백질 분해효소 또는 Arg-X-단백질 분해효소의 활성 자리를 겨냥하거나, 특이적이다. 안티칼린은 단일클론 항체 대신에 사용될 수 있으나, 약 180개 아미노산 크기 및 약 20kDa의 질량으로, 약 8배 더 작다. 안티칼린은 항체보다 조직 침투(penetration)가 더 잘되며 온도 70 ℃까지 안정하다. 항체와 달리, 안티칼린은 E. coli와 같은 세균 세포에서 대량 생산될 수 있다.

또한, 일부 실시태양에서, 항-미생물 제제는 세균의 생물막 형성 또는 발달을 억제, 감소 또는 예방할 수 있는 항-생물막 제제(anti-biofilm agent)일 수 있다. 항-생물막 제제(anti-biofilm agent)는 생물막 교란 활성을 가질 수 있으며 생물막 해산(dispersion)을 야기할 수 있다. 본 발명에 기재된 “생물막 교란 활성(Biofilm disrupting activity)”은 생물막으로부터 세균 방출을 야기하는 조성물 또는 약제의 특성을 설명한다. 또한, 조성물 또는 약제는 생물막 내의 세균들(bacterium)의 생존 능력(viability)을 반드시 감소시키지는 않을 것이다. 생물막으로부터의 세균의 “방출(Release)”은 생물막으로부터의 세균들의 살균제(bactericidal agents)에 대한 감수성(susceptibility)이 증가하게 되는 부유 상태(planktonic state)를 채택하기 위한 생물막으로부터의 세균 수의 증가를 포함한다. 본 발명의 살균제는 세균들의 생존 능력을 직접적으로 감소시키는 조성물(composition), 약제(agent), 화합물(compound), 펩티도미메틱(peptidomimetic) 또는 펩타이드의 특성을 설명하기 위해 사용되었다.

따라서, 어떤 가설 또는 작용 양식(mode of action)에 의한 결합 없이, 생물막 교란 활성을 나타내는 조성물 또는 약제가 생물막 내의 세균의 생존 능력을 반드시 감소시키는 것이 아니라, 세균 세포가 생물막으로부터 방출되도록 야기 또는 유발하는 것임이 신뢰될 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물 또는 약제들은 생물막 내의 세균이 더욱 부유 상태를 채택하도록 야기 또는 유발할 것이다. 다른 실시태양에서, 조성물 또는 약제는 생물막 형성을 억제 또는 감소시킬 것이다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 항-미생물 제제는 생물막이 보이는, 대상에서 질병 또는 질환을 개시 또는 촉진시키는 어떤 특징을 억제 또는 감소시킬것이다. 일부 실시태양에서, 펩타이드 또는 조성물은, 생물막에서 세균 사멸 없이, 대상에서 질병 또는 질환을 개시 또는 촉진시키는 생물막이 보이는 어떤 특징을 억제 또는 감소시킬것이다.

일부 실시태양에서, 항-미생물 조성물 또는 약제는 생물막의 측정 가능한 변수(measurable parameter)를 예방(prevent), 억제(inhibit) 또는 감소시키는 능력을 말한다. 생물막의 측정 가능한 변수의 비-제한적인 예는 생물막의 총 생물질(biomass), 두께 평균, 표면 대 체적(biovolume) 비율, 거칠기(roughness) 또는 세균 조성물 및 그들의 생존 능력(viability)일 것이다.

3. (b)면역원들( Immunogens )

면역원은 면역 반응, 바람직하게는 관심 병원성 미생물에 대한 방어적인 항체 반응을 유발하기 위해 선택된다.

한 실시태양에서, 면역원이 펩타이드의 형태로, 예를 들어 재조합 펩타이드의 형태로 제공된다.

한 실시태양에서, 특히 P. gingivalis 감염 및 질병 및 질환에 관련된 재조합 펩타이드는 P. gingivalis에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 직접적으로 또는 링커를 통해 이차 펩타이드에 연결된 첫째 펩타이드를 포함하는, 키메릭 또는 융합 단백질일 것이다, 상기에서:

(A) 상기 일차 펩타이드는:

(B) 상기 이차 펩타이드는:

본 발명에 기재된, 용어 “펩타이드(peptide)”는 약 40개의 아미노산 잔기를, 바람직하게는 5 내지 40개의 아미노산 서열을 나타내기 위해 사용되었다.

한 실시태양에서, 폴리펩티드는 또는 바꿔말하면 “이차 펩타이드(second peptide)”의 대신 사용되었다. 상기 용어 “폴리펩티드(polypeptide)”는 적어도 약 40개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 나타내기 위해 사용되었다.

따라서, 다른 측면에서는 P. gingivalis에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 직접적으로 또는 폴리펩티드에 링커를 통해 결합된 펩타이드를 포함하는 키메릭 또는 융합 단백질을 제공한다, 상기에서:

(A) 상기 펩타이드는:

(B) 상기 폴리펩타이드는:

다른 측면에서, 본 발명은 P. gingivalis에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 펩타이드를 제공한다:

(i) 서열번호 64 내지 66 중 어느 하나로 기재되는 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두; 및

(ii) 서열번호 67 내지 68 중 어느 하나로 기재되는 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두.

본 발명의 측면에서, 서열번호 64 내지 68의 서열을 갖는 펩타이드가, 이차 펩타이드와 직접 연결된 또는 링커(linker)를 통해 연결된 키메릭 또는 융합 단백질의 형태로 제공될 것이다. 실시태양에서, 키메릭 또는 융합 단백질의 상기 이차 펩타이드는:

(iii) P. 진지발리스(gingivalis)의 HagA 부착소 도메인(adhesin domain)의 서열과 동일한, 또는 상동 (iii) P. 진지발리스(gingivalis)의 HagA 부착소 도메인(adhesin domain)의 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두를 포함한다.

상기 기재된 실시태양에서, 폴리펩티드는 이차 펩타이드 대신에 사용되었다. 따라서, 다른 측면에서 P. gingivalis에 대한 면역 반응을 유발하기 위한, 이차 펩타이드와 직접 연결된 또는 링커(linker)를 통해 연결된 키메릭 또는 융합 단백질을 제공한다, 상기에서:

(A) 상기 펩타이드는:

(ii) 서열번호 67 내지 68 중 어느 하나로 기재되는 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두를 포함한다; 및

(B) 상기 폴리펩타이드는:

본 발명에서 사용된 바와 같이, 언급된 펩타이드 또는 폴리펩타이드의“상동(homologue)”은 BLAST 알고리즘(algorithm)에 의한 비교가 수행되었을 때, 서로 상동성(homology)을 가지는 또는 상동한 아미노산 서열을 가지는, 또는 처음-언급된 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열로 확인된 아미노산 서열 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 바람직하게는 적어도 90% 서열 유사성을 가지는, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 서열 유사성을 가지는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 말하며, 상기에서 알고리즘의 변수들은 각각의 서열과 전체 길이 이상의 각각의 참고 서열들 사이에서 가장 큰 매치(match)를 제공하기 위해 선택된다. 서열 유사성은 비교되는 두 아미노산 서열 사이의 정확한 매치(match)를 말한다. 동족체(homologue)는 자연적으로 발생한 파생물(variant)로부터 유래되거나 P. gingivalis의 Lys-X-단백질 분해 효소 또는 Arg-X-단백질 분해 효소로터 분리될 수 있다. 또는, P. gingivalis의 Lys-X-단백질 분해 효소 또는 Arg-X-단백질 분해 효소 유래 펩타이드 또는 폴리펩타이드의, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 전체적인 구조 및 기능의 변화 없이 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 바뀐 “보전적-치환(conservative-substitution)” 파생물 일 것이며; 유사한 특성을 가지는 아미노산으로 대체하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유사한 특성을 가지는 아미노산은 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 극성(polar)/친수성(hydrophilic) 아미노산들은 아스파라긴(asparagines), 글루타민(glutamine), 세린(serine), 시스테인(cysteine), 트레오닌(threonine), 라이신(lysine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 아스파르트산(aspartic acid) 및 글루탐산(glutamic acid)으로 교체할 수 있으며; 비극성(nonpolar)/소수성(hydrophobic) 아미노산들은 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 프롤린(proline), 티로신(tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan) 및 메티오닌(methionine)으로 교체할 수 있고; 산성 아미노산들(acidic amino acids)은 아스파르트산(aspartic acid) 및 글루탐산(glutamic acid)으로 교체할 수 있으며 및 염기성 아미노산들은(basic amino acids) 히스티딘(histidine), 라이신(lysine) 및 아르기닌(arginine)으로 교체할 수 있다. 바람직하게는 보전적-치환 파생물들은 적어도 20 보다 적게, 더욱 바람직하게는 15 보다 적게, 더욱 바람직하게는 10 보다 적게, 및 가장 바람직하게는 5개의 아미노산이 바뀐다.

P. gingivalis 트립신-유사 효소(trypsin-like enzyme)의 펩타이드 결합의 절단을 위한 효소 내의 부위로 정의된 지역, 특히 Lys-X-단백질 분해 효소 (Kgp) 또는 Arg-X-단백질 분해 효소 (RgpA)은 본 발명의 명세서에서 알려주는 것에 따라 측정될 수 있으며, 특히, Lys-X-단백질 분해 효소에 대해 P. gingivalis에 나타난 바와 같은 촉매 부위(catalytic site)의 삼차 구조(three-dimensional conformation)를 예측하기 위한 과정을 예를 들어주는 도 7 및 실시예 9가 관련된다. 실시예 10은 Arg-X-단백질 분해 효소 삼차 구조(three-dimensional conformation)의 모델링을 위한 방법론(methodology)을 제공한다.

일부 실시태양에서, 키메릭 또는 융합 단백질, 또는 그의 일차 또는 이차 요소(components)는 펩티도미메틱(peptidomimetic)으로부터 형성될 수 있다. 펩티도미메틱은 정해진 펩타이드의 하나 또는 그 이상의, 예를 들어, 구조와 같은 특성을 모방하며, 자연발생적(naturally occurring)이지 않은 아미노산 잔기로 구성되는 분자이다.

본 발명자들은 확인된 촉매 자리의 면역성 부위를 가지는, 이에 대해 체액성 반응(humoral response)이 일어날 수 있는 다양한 펩타이드 면역원의 서열을 결정했다. 특히, 촉매 자리 옆에(flank)있거나 촉매 자리로 규정되는(define) ‘여섯(six)’ 부위는 하기와 같이 정의되었다: KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 및 KAS6 (표 1 참조). 상기 정보를 바탕으로, 본 발명자들은 펩타이드를 결정하기 위해, 촉매 자리의 측면(flank)을 형성하므로 P. gingivalis에서 발견되는 면역원성 에피톱을 나타내는 아미노산 서열과 상동성을 비교하는 단백질 서열 데이터 베이스 정보를 얻는게 가능하였다. 상기 펩타이드들의 서열은 하기 구조식(structural formula)에 의해 확인되었다:

부위(Region)	Kgp Lys-X (서열번호 62에 따른 넘버링)	Kgp Lys-X 공통(Consensus)	RgpA Arg-X (서열번호 61에 따른 넘버링)	RgpA Arg-X 공통(Consensus)
PAS1K/ PAS1R	PAS1K (432-453)	LNTGVSFANYTAHGSETAWADP (서열번호: 30)	PAS1R (426-446)	FNGGISLANYTGHGSETAWGT (서열번호: 34)
KAS1/ RAS1	KAS1 (432-454)	LNTGV[G/S]FANYTAHGSET[S/A]WADP[S/L] (서열번호: 27)	RAS1 (426-448)	FNGGISL[V/A]NYTGHGSETAWGTSH (서열번호: 31)
KAS2/ RAS2	KAS2 (433-468)	NTGV[G/S]FANYTAHGSET[S/A]WADP[S/L][L/V]T[A/T][T/S]Q[V/L]KALTNK[D/N]K (서열번호: 28)	RAS2 (427-462)	NGGISL[V/A]NYTGHGSETAWGTSHFGTTHVKQLTNSNQ (서열번호: 32)
KAS3/RAS3	KAS3 (436-455)	V[G/S]FANYTAHGSET[S/A]WADP[S/L][L/V] (서열번호: 29)	RAS3 (430-449)	ISL[V/A]NYTGHGSETAWGTSHF (서열번호: 33)
KAS4/ RAS4	KAS4 (388-395)	D[S/Y][Y/S]WN[P/S][K/Q][I/V] (서열번호: 64)	RAS4 (379-386)	EGGPSADN (서열번호: 67)
KAS5/ RAS5	KAS5 (510-516)	NSYWGED (서열번호: 65)	RAS5 (508-514)	[N/D]Q[S/Y]WA[S/P]P (서열번호: 68)
KAS6	KAS6 (570-580)	IGN[V/I]THIGAHY (서열번호: 66)

본 발명자들은 상기 펩타이드를 포함하는 키메릭 단백질이 많은 유용성을 가짐을 발견했다. 예를 들어, 본 발명에 기재된 바와 같이, 몇몇은 만성 치주염에서 관찰된 바와 같은 골 손실의 치료 또는 예방을 위해 매우 방어적인 체액성 반응을 생성한다. 또한, 펩타이드들이 개인의 혈청에서 특이성을 검출 또는 관찰함으로써, 개인이 감염되었는지 아닌지 나타낼 수 있는지, 만일 감염되었다면, 치료가 필요한지 또는 치료가 제공되었다면, 치료가 효과적이었는지 진단 분석(diagnostic assay)에 이용된다.

P. gingivalis의 트립신-유사 효소 부위가 Lys 또는 Arg의 C-말단으로 위치한 펩타이드 결합 절단을 위한 효소에서의 자리를 규정하는 것이 Lys-X-단백질 분해 효소 또는 Arg-X-단백질 분해 효소의 완전한 서열을 포함하지 않음이 이해될 것이다.

본 발명에 기재된 바와 같이, 용어 “이형(heterologous) 단백질” 또는 “키메릭(chimeric) 또는 융합 단백질(fusion protein)”은 다른 기원으로부터 파생된 아미노산의 기능적인 단위(functional units), 도메인(domains), 서열 또는 부위로 구성된 또는 같은 기원(source)으로부터 파생된 및 파생되거나 관련된 단위, 도메인, 서열 또는 부위 유래 분자에서 관찰된 것으로부터 구별되는 조직화(organisation)를 갖도록 조립된 단백질을 나타내기 위해 사용되었다. 본 발명의 키메릭 또는 융합 단백질의 일반적인 특성은 그들이 P. gingivalis의 트립신-유사 효소의 펩타이드 결합의 절단을 위한 촉매 자리를 규정하는 서열과 같거나 상동성을 가지는 아미노산 서열을 적어도 하나 가지는 펩타이드를 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 일차 펩타이드는 Kgp[432-468] 부위 유래 펩타이드를 포함하며, 바람직하게는 (i) VSFANYT 및 VGFANYT로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩타이드, 더욱 바람직하게는 GVSFANYT, GVGFANYT, VSFANYTA 및 VGFANYTA로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩타이드; 또는 (ii) ETAWAD, ETSWAD, TAWADP 및 TSWADP로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩타이드, 바람직하게는 SETAWAD, SETSWAD, ETAWADP, ETSWADP, TAWADPL 및 TSWADPL로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩타이드, 더욱 바람직하게는 GSETAWAD, GSETSWAD, SETAWADP, SETSWADP, ETAWADPL, ETSWADPL, TAWADPLL 및 TSWADPLL로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩타이드이다. 더욱 바람직하게는, 상기 펩타이드는 표 1에 기재된 KAS1[432-454], KAS2[433-468] 및 KAS3[436-455] 펩타이드들로부터 선택된다. 또는, 일차 펩타이드는 국제 특허 출원 번호 PCT/AU98/00311 (WO 98/049192)에 기재된, PAS1(K48)로도 알려져있는 PAS1K[432-453] 펩타이드일 것이다. 상기 펩타이드들에 상응하는 식별자(identifiers) 서열들은 표 3에 기재되었다.

유사하게, 다른 바람직한 실시태양에서, 일차 펩타이드는 RgpA[426-462] 부위 유래 펩타이드를 포함하며, 상기 펩타이드는 바람직하게는 표 1에 보여진 RAS1[426-448], RAS2[427-462] 및 RAS3[430-449] 펩타이드로부터 선택된다. 또는, 일차 펩타이드는 국제 특허 출원 번호 PCT/AU98/00311 (WO 98/049192)에 기재된, PAS1(R45)로도 알려져 있는 PAS1R[426-446] 펩타이드 일 것이다.

본 발명의 키메릭 또는 융합 단백질에서, 이차 펩타이드는 Lys-X-단백질 분해 효소 (Kgp) 또는 Arg-X-단백질 분해 효소 (RgpA) 또는 HagA와 같은, P. gingivalis 트립신-유사 효소(trypsin-like enzyme)의 부착소 도메인(adhesin domain) 유래 펩타이드 일 것이다(표 2 참조). 상기 도메인들은 때때로 헤마글루티닌(hemagglutinins)으로도 알려져 있다. Lys-X-단백질 분해 효소에서, 바람직한 도메인은 표 2에서 확인된 바와 같이 KA1, KA2, KA3, KA4, KA5이다. Arg-X-단백질 분해 효소에서, 바람직한 도메인은 표 2에서 확인된 바와 같이 RA1, RA2, RA3 및 RA4이다. HagA에서, 바람직한 도메인은 HagA1, HagA1* 및 HagA1**이다.

Kgp 및 RgpA 단백질 분해 효소의 부착소 도메인.

	A1	sA1	LA1	A2	A3	A4	A5
Kgp Lys-X 단백질 분해 효소(proteinase) 서열번호. 62	KA1 (738-1099) 서열번호: 35	KsA1 (759-989) 서열번호: 36	KLA1 (751- 1056) 서열번호: 37	KA2 (1157-1275) 서열번호: 40	KA3 (1292 -1424) 서열번호: 41	KA4 (1427 -1546) 서열번호: 42	KA5 (1548-1732) 서열번호: 43
RgpA Arg-X 단백질 분해 효소(proteinase) 서열번호. 61	RA1 (720-1081) 서열번호: 38	RsA1 (831-971) 서열번호: 39	-	RA2 (1139-1257) 서열번호: 44	RA3 (1274-1404) 서열번호: 45	RA4 (1432-1706) 서열번호: 46	-
HagA 서열번호. 63	HagA1 (26-351) (서열번호: 80), HagA1* (366-625) (서열번호: 81), HagA1 (820-1077) (서열번호:82) or HagA1 (1272-1529) (서열번호:82)

키메릭 또는 융합 단백질과 함께 포함시키거나 KAS1, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 및 KAS6 또는 RAS1, RAS2 및 RAS3, RAS4 및 RAS5와 같은 본 발명의 펩타이드에 대한 체액성 반응 향상 이외에도, 상기 부착소 도메인은 또한 방어적인 면역원성 반응을 제거하기 위해 다중 특이성의 생성을 초래하는 까닭에 면역원성 에피톱(immunogenic epitopes)을 포함한다. 본 발명의 키메릭 또는 융합 단백질이 제공되었을 때, 부착소 도메인의 면역원성 에피톱이 접촉(approaching) 형태로 P. gingivalis 트립신-유사 효소에 보유되는 것은 기대되지 않는다.

본 발명의 상기 실시태양에서 키메릭 또는 융합 단백질이 하나 또는 그 이상의 어떤 P. gingivalis 트립신-유사 효소의 부착소 도메인과 함께, 특히 어떤 하나 또는 그 이상의 Lys-X-단백질 분해 효소 부착소 도메인(KA1, KA2, KA3, KA4 및 KA5) 또는 도메인 Arg-X- 단백질 분해 효소 부착소 도메인(RA1, RA2, RA3 및 RA4) 또는 HagA 도메인 HagA1, HagA1* 및 HagA1**과 함께, KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 및 KAS6/RAS6로부터 선택되는 어떤 하나 또는 그 이상의 펩타이드를 포함할 것이라는 것이 이해될 것이다.

P. gingivalis 트립신-유사 효소(trypsin-like enzyme)에서 관찰된 바와 같이, 부착소 도메인이 완전한 도메인(complete domain)일 필요가 없는 것 또한 이해될 것이다. 예를 들어, 상기 부착소 도메인은 도메인과 같은 단편일 것이며, 특히, 바람직한 단편은 Lys-X-단백질 분해 효소 A1 도메인의 KsA1 및 KLA1 도메인 단편일 것이다(표 2 참조). 도메인이 부착소 도메인의 단편인 곳은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 부착소 도메인 특이적 에피톱을 포함한다.

펩타이드에 관련된 부착소에 상응하는 서열 식별자들은 표 3에 나타냈다.

한 실시태양에서, 이차 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 하나 또는 그 이상의 서열번호 69 내지 79에 또는 83 내지 85에 표기한 서열을 포함한다.

또한, 본 발명의 키메릭 또는 융합 단백질은 Lys-X-단백질 분해 효소의 Kgp[432-468] 부위로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 추가적인 펩타이드 및/또는 Arg-X-단백질 분해 효소의 RgpA[426-462] 부위로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 추가적인 펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 키메릭 또는 융합 단백질은 KsA1 또는 KLA1와 함께 하나 또는 그 이상의 KAS1, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 및 KAS6, 또는 하나 또는 그 이상의 RAS1, RAS2, RAS3, RAS4 및 RAS5를 포함한다.

따라서, 일부 실시태양에서, 키메릭 또는 융합 단백질은 적어도 하나의 추가적인 펩타이드를 포함할 것이며, 여기에서 상기 추가적인 펩타이드는:

(ii) 서열번호 2 로 기재되는 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두; 또는

(iii) P. 진지발리스(gingivalis)의 Lys-X-단백질분해효소(proteinase) 부착소 도메인(adhesin domain)의 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두; 또는

(iv) P. 진지발리스(gingivalis)의 Arg-X-단백질분해효소(proteinase) 부착소 도메인(adhesin domain)의 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두; 또는

(v) P. 진지발리스(gingivalis)의 HagA 부착소 도메인(adhesin domain)의 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두를 포함한다.

본 발명에 기재된 키메릭 또는 융합 단백질에 포함되는 도메인, 단위(units), 서열 또는 부위의 다른 실시태양은 Fc 결합 부위 또는 Fc 수용체와 같은 수용체(receptors) 또는 리간드, 반감기(half-life)를 향상시키기 위한 알부민(albumin)과 같은 도메인 또는 키메릭 또는 융합 단백질의 발현 또는 정제를 가능하게 하기 위한 도메인에 결합하기 위한 도메인을 포함한다.

다른 하나의 측면에서, 본 발명은 P. gingivalis에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 서열번호: 17, 18, 25 및 26의 서열 중에 하나로 나타내어진 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다. 한 실시태양에서, 펩타이드는 서열번호: 17, 18, 25 및 26 중에 하나와 상동한 서열을 가진다. 펩타이드는 5 내지 40 아미노산의 길이를 가질 것이다.

다른 하나의 측면에서, 본 발명은 서열번호: 17, 18, 25 및 26 중에 하나로 나타내어지는 서열을 가지는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다.

다른 하나의 측면에서, 본 발명은 P. gingivalis에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 키메릭 또는 융합 단백질의 제조를 위해, 서열번호: 17, 18, 25 및 26 중에 하나로 나타내어지는 서열을 가지는 펩타이드, 또는 서열번호: 17, 18, 25 및 26 중에 하나로 나타내어지는 서열을 가지는 펩타이드를 암호화하는 핵산의 용도를 제공한다.

다른 하나의 측면에서, 본 발명은 P. gingivalis에 대한 면역 반응을 유도하기 위해, 서열번호: 17, 18, 25 및 26 중에 하나로 나타내어지는 서열을 가지는 펩타이드, 또는 서열번호: 17, 18, 25 및 26 중에 하나로 나타내어지는 서열을 가지는 펩타이드를 암호화하는 핵산의 용도를 제공한다. 한 실시태양에서, 펩타이드는:

(iii) P. 진지발리스(gingivalis)의 HagA 부착소 도메인(adhesin domain)의 서열과 동일한, 또는 상동 서열의 일부, 또는 모두를 포함하는 이차 펩타이드와 함께 동시에(simultaneously) 또는 순차적(sequentially)으로 투여된다.

서열번호:	아미노산 서열	단편
1	LNTGV[G/S]FANYTAHGSET[S/A]WADP[S/L][L/V]T[A/T][T/S]Q[V/L]KALTNK[D/N]K	Kgp[432-468]
2	FNGGISL[V/A]NYTGHGSETAWGTSHFGTTHVKQLTNSNQ	RgpA[426-462]
3	VSFANYT
4	VGFANYT
5	GVSFANYT
6	GVGFANYT
7	VSFANYTA
8	VGFANYTA
9	ETAWAD
10	ETSWAD
11	TAWADP
12	TSWADP
13	SETAWAD
14	SETSWAD
15	ETAWADP
16	ETSWADP
17	TAWADPL
18	TSWADPL
19	GSETAWAD
20	GSETSWAD
21	SETAWADP
22	SETSWADP
23	ETAWADPL
24	ETSWADPL
25	TAWADPLL
26	TSWADPLL
27	LNTGV[G/S]FANYTAHGSET[S/A]WADP[S/L]	KAS1
28	NTGV[G/S]FANYTAHGSET[S/A]WADP[S/L][L/V]T[A/T][T/S]Q[V/L]KALTNK[D/N]K	KAS2
29	V[G/S]FANYTAHGSET[S/A]WADP[S/L][L/V]	KAS3
30	LNTGVSFANYTAHGSETAWADP	PAS1K
31	FNGGISL[V/A]NYTGHGSETAWGTSH	RAS1
32	NGGISL[V/A]NYTGHGSETAWGTSHFGTTHVKQLTNSNQ	RAS2
33	ISL[V/A]NYTGHGSETAWGTSHF	RAS3
34	FNGGISLANYTGHGSETAWGT	PAS1R
35	ANEAKVVLAADNVWGDNTGYQFLLDADHNTFGSVIPATGPLFTGTASSNLYSANFEYLIPANADPVVTTQNIIVTGQGEVVIPGGVYDYCITNPEPASGKMWIAGDGGNQPARYDDFTFEAGKKYTFTMRRAGMGDGTDMEVEDDSPASYTYTVYRDGTKIKEGLTATTFEEDGVAAGNHEYCVEVKYTAGVSPKVCKDVTVEGSNEFAPVQNLTGSSVGQKVTLKWDAPNGTPNPNPNPNPNPGTTLSESFENGIPASWKTIDADGDGHGWKPGNAPGIAGYNSNGCVYSESFGLGGIGVLTPDNYLITPALDLPNGGKLTFWVCAQDANYASEHYAVYASSTGNDASNFTNALLEETITA	KA1
36	FLLDADHNTFGSVIPATGPLFTGTASSNLYSANFEYLIPANADPVVTTQNIIVTGQGEVVIPGGVYDYCITNPEPASGKMWIAGDGGNQPARYDDFTFEAGKKYTFTMRRAGMGDGTDMEVEDDSPASYTYTVYRDGTKIKEGLTATTFEEDGVAAGNHEYCVEVKYTAGVSPKVCKDVTVEGSNEFAPVQNLTGSSVGQKVTLKWDAPNGTPNPNPNPNPNPGTTLSESF	KsA1
37	WGDNTGYQFLLDADHNTFGSVIPATGPLFTGTASSNLYSANFEYLIPANADPVVTTQNIIVTGQGEVVIPGGVYDYCITNPEPASGKMWIAGDGGNQPARYDDFTFEAGKKYTFTMRRAGMGDGTDMEVEDDSPASYTYTVYRDGTKIKEGLTATTFEEDGVAAGNHEYCVEVKYTAGVSPKVCKDVTVEGSNEFAPVQNLTGSSVGQKVTLKWDAPNGTPNPNPNPNPNPGTTLSESFENGIPASWKTIDADGDGHGWKPGNAPGIAGYNSNGCVYSESFGLGGIGVLTPDNYLITPALDLPNGG		KLA1
38	SGQAEIVLEAHDVWNDGSGYQILLDADHDQYGQVIPSDTHTLWPNCSVPANLFAPFEYTVPENADPSCSPTNMIMDGTASVNIPAGTYDFAIAAPQANAKIWIAGQGPTKEDDYVFEAGKKYHFLMKKMGSGDGTELTISEGGGSDYTYTVYRDGTKIKEGLTATTFEEDGVATGNHEYCVEVKYTAGVSPKVCKDVTVEGSNEFAPVQNLTGSAVGQKVTLKWDAPNGTPNPNPNPNPNPNPGTTTLSESFENGIPASWKTIDADGDGHGWKPGNAPGIAGYNSNGCVYSESFGLGGIGVLTPDNYLITPALDLPNGGKLTFWVCAQDANYASEHYAVYASSTGNDASNFTNALLEETITA		RA1
39	DDYVFEAGKKYHFLMKKMGSGDGTELTISEGGGSDYTYTVYRDGTKIKEGLTATTFEEDGVATGNHEYCVEVKYTAGVSPKVCKDVTVEGSNEFAPVQNLTGSAVGQKVTLKWDAPNGTPNPNPNPNPNPNPGTTTLSESF		RsA1
40	ADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDADGDGQGWLCLSSGQLDWLTAHGGSNVVSSFSWNGMALNPDNYLISKDVTGATKVKYYYAVNDGFPGDHYAVMISKTGTNAGDFTVVFEETPNGIN		KA2
41	PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFRHYNCSDLNYILLDDIQFTMGGSPTPTDYTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVATGNHEYCVEVKYTAGVSPKKCVNVTVNSTQFNPVQNLTAEQAPNSMDAILKWNAPAS		KA3
42	AEVLNEDFENGIPASWKTIDADGDGNNWTTTPPPGGSSFAGHNSAICVSSASYINFEGPQNPDNYLVTPELSLPGGGTLTFWVCAQDANYASEHYAVYASSTGNDASNFANALLEEVLTA		KA4
43	TVVTAPEAIRGTRAQGTWYQKTVQLPAGTKYVAFRHFGCTDFFWINLDDVVITSGNAPSYTYTIYRNNTQIASGVTETTYRDPDLATGFYTYGVKVVYPNGESAIETATLNITSLADVTAQKPYTLTVVGKTITVTCQGEAMIYDMNGRRLAAGRNTVVYTAQGGHYAVMVVVDGKSYVEKLAVK		KA5
44	ADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDADGDGQGWLCLSSGQLDWLTAHGGTNVVSSFSWNGMALNPDNYLISKDVTGATKVKYYYAVNDGFPGDHYAVMISKTGTNAGDFTVVFEETPNGIN		RA2
45	PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFRHYNCSDLNYILLDDIQFTMGGSPTPTDYTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVATGNHEYCVEVKYTAGVSPKKCVNVTVNSTQFNPVKNLKAQPDGGDVVLKWEAPSA		RA3
46	ANEAKVVLAADNVWGDNTGYQFLLDADHNTFGSVIPATGPLFTGTASSDLYSANFESLIPANADPVVTTQNIIVTGQGEVVIPGGVYDYCITNPEPASGKMWIAGDGGNQPARYDDFTFEAGKKYTFTMRRAGMGDGTDMEVEDDSPASYTYTVYRDGTKIKEGLTETTYRDAGMSAQSHEYCVEVKYTAGVSPKVCVDYIPDGVADVTAQKPYTLTVVGKTITVTCQGEAMIYDMNGRRLAAGRNTVVYTAQGGYYAVMVVVDGKSYVEKLAIK		RA4
서열번호:	뉴클레오티드 서열
47	GACCATGGCTCATCACCATCACCATCACAATACCGGAGTCAGCTTTGCA		KAS2-FOR
48	GACTCGAGTTATTTGTCCTTATTAGTGAGTGCTTTC		KAS2-REV
49	GACCATGGCTTGGGGAGACAATACGGGTTAC		KLA1-FOR
50	GACTCGAGACCTCCGTTAGGCAAATCC		KLA1-REV
51	CCGTATTGTCTCCCCATTTGTCCTTATTAGTGAGTGCTTTC		KAS2-KLA1-REV
52	CACTAATAAGGACAAATGGGGAGACAATACGGGTTAC		KAS2-KLA1-FOR
53	CATGGATCTGAGACCGCATGGGCTGATCCACTTTTCTTGTTGGATGCCGAT		KAS1-KsA1-FOR1
54	CCATGGCTTTGAATACCGGAGTCAGCTTTGCAAACTATACAGCGCATGGATCTGAGACCGCA		KAS1-KsA1-FOR2
55	CTCGAGGAATGATTCGGAAAGTGTT		KAS1-KsA1-REV
56	CCATGGCTGATTATAGCTGGAATTCCCAGGTAGTCAGCTTTGCAAACTATACA		multi-FOR1
57	CTTTGCAAACTATACAGCGCATGGATCTGAGACCGCATGGGCTGATCCACTT		multi-FOR2
58	ATGGGCTGATCCACTTCTGAATTCTTATTGGGGCGAGATCGGCAATATTACC		multi-FOR3
59	GATCGGCAATATTACCCATATTGGTGCTCATTACGCTTGGGGAGACAATACG		multi-FOR4
60	CTCGAGACCTCCGTTAGGCAAATCCAATGCCGGTGTTATCAGATAGTTGTCA		Multi-REV
서열번호:	아미노산 서열		전장(Full length)
61	YLITPALDLPNGGKLTFWVCAQDANYASEHYAVYASSTGNDASNFTNALLEETITAKGVRSPEAMRGRIQGTWRQKTVDLPAGTKYVAFRHFQSTDMFYIDLDEVEIKANGKRADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDADGDGQGWLCLSSGQLDWLTAHGGTNVVSSFSWNGMALNPDNYLISKDVTGATKVKYYYAVNDGFPGDHYAVMISKTGTNAGDFTVVFEETPNGINKGGARFGLSTEADGAKPQSVWIERTVDLPAGTKYVAFRHYNCSDLNYILLDDIQFTMGGSPTPTDYTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVATGNHEYCVEVKYTAGVSPKKCVNVTVNSTQFNPVKNLKAQPDGGDVVLKWEAPSAKKTEGSREVKRIGDGLFVTIEPANDVRANEAKVVLAADNVWGDNTGYQFLLDADHNTFGSVIPATGPLFTGTASSDLYSANFESLIPANADPVVTTQNIIVTGQGEVVIPGGVYDYCITNPEPASGKMWIAGDGGNQPARYDDFTFEAGKKYTFTMRRAGMGDGTDMEVEDDSPASYTYTVYRDGTKIKEGLTETTYRDAGMSAQSHEYCVEVKYTAGVSPKVCVDYIPDGVADVTAQKPYTLTVVGKTITVTCQGEAMIYDMNGRRLAAGRNTVVYTAQGGYYAVMVVVDGKSYVEKLAIK		RgpA
62	VYSESFGLGGIGVLTPDNYLITPALDLPNGGKLTFWVCAQDANYASEHYAVYASSTGNDASNFTNALLEETITAKGVRSPKAIRGRIQGTWRQKTVDLPAGTKYVAFRHFQSTDMFYIDLDEVEIKANGKRADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDADGDGQGWLCLSSGQLDWLTAHGGSNVVSSFSWNGMALNPDNYLISKDVTGATKVKYYYAVNDGFPGDHYAVMISKTGTNAGDFTVVFEETPNGINKGGARFGLSTEANGAKPQSVWIERTVDLPAGTKYVAFRHYNCSDLNYILLDDIQFTMGGSPTPTDYTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVATGNHEYCVEVKYTAGVSPKKCVNVTVNSTQFNPVQNLTAEQAPNSMDAILKWNAPASKRAEVLNEDFENGIPASWKTIDADGDGNNWTTTPPPGGSSFAGHNSAICVSSASYINFEGPQNPDNYLVTPELSLPGGGTLTFWVCAQDANYASEHYAVYASSTGNDASNFANALLEEVLTAKTVVTAPEAIRGTRAQGTWYQKTVQLPAGTKYVAFRHFGCTDFFWINLDDVVITSGNAPSYTYTIYRNNTQIASGVTETTYRDPDLATGFYTYGVKVVYPNGESAIETATLNITSLADVTAQKPYTLTVVGKTITVTCQGEAMIYDMNGRRLAAGRNTVVYTAQGGHYAVMVVVDGKSYVEKLAVK		Kgp
63	ASGVTETTYRDPDLATGFYTYGVKVVYPNGESAIETATLNITSLADVTAQKPYTLTVVGKTITVTCQGEAMIYDMNGRRLAAGRNTVVYTAQGGHYAVMVVVDGKSYVEKLAVK		HagA
서열번호:	아미노산 서열		단편(Fragment)
64	D[S/Y][Y/S]WN[P/S][K/Q][I/V]		KAS4
65	NSYWGED		KAS5
66	IGN[V/I]THIGAHY		KAS6
67	EGGPSADN		RAS4
68	[N/D]Q[S/Y]WA[S/P]P		RAS5
69	PVSNLTATTQGQKVTLKWDAPST		ABM1 - RgpA_cat
70	PVSNLTATTQGQKVTLKWEAPSA		ABM1- Kgpcat
71	PVQNLTGSSVGQKVTLKWDAPST		ABM1- KgpA1
72	PVQNLTGSAVGQKVTLKWDAPNG		ABM1 - RgpA1 ＆ RgpAA3
73	PVKNLKAQPDGGDVVLKWEAPSA		ABM1 - HagAA1/*
74	PVQNLTAEQAPNSMDAILKWNAP		ABM1 - KgpA3 ＆ HagAA3
75	PVQNLTQWSVSGQTVTLTWQAPAS		ABM2 - HagAA1
76	YTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVA		ABM2 -ABM2 -RgpAA4
77	YTYTVYRDNVVIAQNLTATTFNQENVA		ABM2 - HagA1*
78	YTYTVYRDGTKIKEGLTA/ETTFEEDGVA		ABM2 All other adhesins
79	PNGTP(NP)_1-6GTT(T)LSESF		ABM3- All adhesins
80	GGPKTAPSVTHQAVQKGIRTSKAKDLRDPIPAGMARIILEAHDVWEDGTGYQMLWDADHNQYGASIPEESFWFANGTIPAGLYDPFEYKVPVNADASFSPTNFVLDGTASADIPAGTYDYVIINPNPGIIYIVGEGVSKGNDYVVEAGKTYHFTVQRQGPGDAASVVVTGEGGNEFAPVQNLQWSVSGQTVTLTWQAPASDKRTYVLNESFDTQTLPNGWTMIDADGDGHNWLSTINVYNTATHTGDGAMFSKSWTASSGAKIDLSPDNYLVTPKFTVPENGKLSYWVSSQEPWTNEHYGVFLSTTGNEAANFTIKLLEETLGSG		HagA1 [26-351]
81	APAPYQERTIDLSAYAGQQVYLAFRHFGCTGIFRLYLDDVAVSGEGSSNDYTYTVYRDNVVIAQNLTATTFNQENVAPGQYNYCVEVKYTAGVSPKVCKDVTVEGSNEFAPVQNLTGSAVGQKVTLKWDAPNGTPNPNPGTTTLSESFENGIPASWKTIDADGDGNNWTTTPPPGGSSFAGHNSAICVSSASYINFEGPQNPDNYLVTPELSLPNGGTLTFWVCAQDANYASEHYAVYASSTGNDASNFANALLEEVLTA		HagA1* [366-625]
82	PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFRHYNCSDLNYILLDDIQFTMGGSPTPTDYTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVATGNHEYCVEVKYTAGVSPKECVNVTVDPVQFNPVQNLTGSAVGQKVTLKWDAPNGTPNPNPGTTTLSESFENGIPASWKTIDADGDGNNWTTTPPPGGTSFAGHNSAICVSSASYINFEGPQNPDNYLVTPELSLPNGGTLTFWVCAQDANYASEHYAVYASSTGNDASNFANALLEEVLTA		HagA1 [820-1077] or HagA1 [1272-1529]
83	PYQPVSNLTATTQGQ		ABM1[436-450]
84	EGLTATTFEEDGVAA		ABM2 [672-686]
85	GTPNPNPNPNPNPNPGT		ABM3 [455-471]

본 발명의 키메릭 또는 융합 단백질에서, 일차 펩타이드의 C-말단 잔기(C-terminal residue)는 부착소도메인 폴리펩티드의 N-말단 잔기(N-terminal residue)에 공유 결합(covalently linked)되었을 것이며, 또는 일차 펩타이드의 N-말단 잔기는 부착소 도메인 폴리펩티드의 C-말단 잔기에 공유 결합되었을 것이다. 본 배열(arrangement)에서, 일차 펩타이드 및 부착소 도메인 폴리펩티드는 “직접적으로 연결된(directly linked)” 또는 “ 인접(adjacent)”이라고 말해진다.

다른 실시태양에서, 키메릭 또는 융합 단백질은 일차 펩타이드를 부착소 도메인 폴리펩티드에 연결하기 위한 링커(linker)를 포함한다. 상기 링커는 아미노산 및 비-아미노산 링커 둘 다를 포함하는, 펩타이드를 폴리펩타이드에 연결(join) 가능한 어떤 링커일 것이다. 바람직하게, 상기 링커는 비-면역원성(non-immunogenic)이다. 적합한 링커는 다섯개의 아미노산보다 적은 것이 바람직하지만, 15개까지의 아미노산 길이일 것이다. 링커는 일차 펩타이드 및 부착소 도메인 폴리펩타이드를 P. gingivalis 트립신-유사 효소에서 정상적으로 관찰되는 것 보다 가까운 공간(spatial) 배열로 야기하는 기능을 갖출 것이다. 또는, 첫번때 펩타이드 및 부착소 도메인 폴리펩타이드를 따로 간격을 둘 것이다.

본 발명의 키메릭 또는 융합 단백질은 재조합 발현 시스템(recombinant expression systems) (재조합 DNA 기술과 같은) 또는 화학적 합성 (고체상 펩타이드 합성과 같은)에 의해 생성될 것이다. 상기 기술들은 당업자에게 자명하다.

비상동(heterologous) 또는 키메릭 단백질은 키메릭 또는 융합 단백질의 일차 또는 이차 펩타이드 요소를 단독으로 이용하여 얻어진 것을 넘어 얻어진 체액성 반응을 향상시키기 때문에 특히 유용하다.

본 발명자들은 상기 펩타이드들을 포함하는 키메릭 단백질이 많은 유용성을 가짐을 발견했다. 예를 들어, 본 발명에 기재된 바와 같이, 몇몇은 만성 치주염에서 관찰되는 골 손실의 치료 또는 예방을 위해 매우 방어적인 체액성 반응을 생성한다. 또한 상기 펩타이드들은 개체의 혈청에서 특이성을 검출 또는 관찰할 수 있음으로써 개체가 감염되었는지 아닌지 및 감염되었다면, 치료가 필요한지 아닌지, 제공되었다면 그것이 효과적이었는지 아닌지를 나타내는 진단 분석에 사용될 것이다.

한 실시태양에서, 키메릭 또는 융합 단백질은 방어적인 면역 반응을 유도하며, 상기 반응은 일반적으로 적어도 최소화하거나 감염과 관련된 것과는 다르게 연결된 조직의 손상을 제한하는 반응이다. 한 실시태양에서, 방어적인 반응은 적어도 P. gingivalis 유도 골 손상을 최소화 또는 제한한다. P . gingivalis 감염에 연관되어 있는 골 손실 측정을 위한, 모델 시스템이 본 발명에서 논의된다. 일반적인 방어 면역 반응은 대부분(predominantly) 체액성 반응이다. 일부 실시태양에서, 상기 방어적인 면역 반응은 또한 세포성 면역반응(cellular response)을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기에 대략적으로 기재된 키메릭 또는 융합 단백질을 포함하는 조성물은 제공한다. 일반적으로 조성물은 항원성(antigenic) 또는 면역성(immunogenic)이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 P. gingivalis 감염에 대해 방어적인 또는 치료적인 면역 반응을 끌어내기 위해 적합한 선택적으로 보조제(adjuvant)와 공동으로 키메릭 또는 융합 단백질을 포함하는, 조성물을 제공한다. 상기와 같은 조성물은 또한 면역 반응을 조절 또는 증강(potentiating)하기 위해 다른 요소(component)를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 상기 조성물은 백신(vaccine)의 형태를 가진다.

바람직한 조성물은 치주염 병원체(periodontal pathogens) Porphyromonas gingivalis,Treponema denticola, 및 Tannerella forsythia에 대한 면역 반응을 발생시키는 면역원(immunogens)을 포함한다. 조성물이 하나 또는 그 이상의 세 치주염 병원체에 대한 항원을 포함하는 경우, 면역원은 약화된 전세포 백신(attenuated whole cell vaccine), 또는 정제된 항원 백신 또는 더욱 바람직하게는 재조합 항원(recombinant antigen) 백신일 수 있다. P . gingivalis, T. denticolaand T. forsythia 감염에 관련된 면역원을 형성할수 있는 적합한 펩타이드의 다른 예는 표 8 내지 F에 나타냈다.

세균(Bacteria)	면역원(들) 예시	참고문헌
Porphryomonas gingivalis	단백질 분해 효소 또는 그의 단편	US 6,017,532 (예를 들어, 서열 목록 참조)
	서열 목록에 특정된 단백질 분해 효소 또는 그의 단편	5,475,097 (예를 들어, 서열 목록 참조)
	PrtK48, PrtR45, PrtR44, PrtK39, PrtK44, PrtR27, PrtR17, PrtK15 및 PrtR15 또는 그의 단편	PCT/AU96/00673
	Ag1, Ag2, Ag3 및 Ag4 또는 그의 단편	PCT/AU97/00212 (예를 들어, 3 페이지의 표 참조).
	시스테인 단백질분해효소(cysteine proteases) 유래 펩타이드 및 부착소(adhesions)	PCT/AU98/00311 (see, for example, Table1)
	폴리펩타이드 및 그의 단편	PCT/AU1998/00311 (예를 들어, 표 1, 2 또는 3 및 서열 목록 참조)
	PrtR-PrtK 단백질 분해 효소(proteinase)-부착소 복합체(adhesin complex) 및 그의 단편	US 6,962,706 (예를 들어, 표 1 또는 서열 목록 참조)
	r-RgpA44 및 r-Kgp39 및 그의 단편	PCT/AU00/01588 (예를 들어, 서열 목록 참조)
	PG32 및 PG33 및 그의 단편	PCT/AU01/00482 (예를 들어, 표 3 또는 서열 목록 참조)
	다중결합(Multimeric) 복합체(complex)	PCT/AU2005/001463
	폴리펩타이드(Polypeptides) 및 그의 단편	PCT/AU2007/000890 (예를 들어, 표 2 참조)
	폴리펩타이드(Polypeptides) 및 그의 단편	PCT/AU2008/001018 (예를 들어, 표 4 참조)
	폴리펩타이드(Polypeptides) 및 그의 단편	PCT/US2004/025778 (예를 들어, 표 2 또는 서열 목록 참조)
	부착소(Adhesins) 및 그의 단편	US 2005/0288866 (예를 들어, 표 5 참조)
	분리된, 정제된 또는 추출된 세균 제제(bacterial preparation)
Treponema denticola	폴리펩타이드(Polypeptides) 및 그의 단편	Veith et al. Biochmica et Biophysica Acta. 2009, vol. 1794: 1421 - 1432에 기재 및 표 Table E에 열거.
	분리된, 정제된 또는 추출된 세균 제제(bacterial preparation)
Tannerella forsythia	폴리펩타이드 및 그의 단편	Veith et al. Journal of Proteome Research (2009) vol. 8: 4279 -4292의 표 1, 2 및 3에 기재 및 표 10에 열거.
	폴리펩타이드 및 그의 단편	Yoo et al. FEMS Microbiol. Lett. (2007) 275: 344-352
	분리된, 정제된 또는 추출된 세균 제제(bacterial preparation)	PCT/IB2004/003310

1. TIGR (now JCVI, ) 유래 Accessions 및 정의. 정의는 게놈의 TIGR의 자동 주석(automated annotation)에서 유래됐다.

ccession^a	단축된^b 단백질 기재(Description)^a,
TF0071	HP-C
TF0299	HP
TF0324	HP-C
TF0399	HP
TF0436	보전된 가설 단백질
TF0508	HP-C
TF0706	가능한 트랜스포드(transport) 단백질
TF0761	HP-C
TF0773	efflux 단백질
TF0810	가능한 efflux 단백질
TF1015	HP-C
TF1038	HP-C
TF1059	가능한 xanthan lyase
TF1300	HP-C
TF1331	Omp
TF1409	Omp TolC
TF1441	HP-C
TF1443	HP
TF1444	HP-C; 가능한 hemin 수용체(receptor)
TF1476	Omp P49
TF1793	polyphosphate-selective porin O
TF1822	리포단백질 silC 전구체(precursor)
TF1959	HP-C
TF2123	HP-C; TPR-반복 단백질
TF2450	Omp
TF2595	HP-C
TF2613	HP-C
TF2734	HP-C
TF2852	HP-C
TF2901	HP-C
TF3007	HP-C
TF3114	HP
TF0041	Omp, TDR
TF0063	HP-C
TF0064	HP-C
TF0301	Omp, TDR
TF0318	Omp, TDR
TF0875	OM 수용체(receptor), TonB-연결된
TF0980	TDR
TF2096	가능한 OmpA, OM-관련 단백질
TF2124	HP-C; 가능한 TDR
TF2778	Omp, TDR
TF3087	HP-C
TF0045	Omp, TDR
TF0044	HP-C
TF0093	Omp, TDR
TF0092	Omp
TF0111	Omp
TF0112	Omp
TF0237	Omp, TDR
TF0238	Omp
TF0275	Omp
TF0277	Omp
TF0313	Omp, TDR
TF0312	Omp
TF0424	수용체(receptor), TonB-연결된
TF0425	Omp
TF0482	수용체(receptor)
TF0483	수용체(receptor)
TF0588	Omp
TF0587	Omp
TF0640	Omp, TDR
TF0641	Omp
TF0654	수용체(receptor), TonB-연결된
TF0655	Omp
TF0682	Omp, TDR
TF0683	HP-C
TF0778	Omp, TDR
TF0779	가능한 Omp
TF0976	수용체(receptor), Ton-연결된
TF0977	가능한 Omp
TF1053	수용체(receptor), TonB-연결된
TF1052	HP-C
TF1057	가능한 수용체(receptor), TonB-연결된
TF1056	HP-C
TF1207	수용체(receptor), TonB-의존
TF1206	HP-C
TF1318	수용체(receptor)
TF1319	Omp
TF1415	Omp, TDR
TF1416	Omp
TF1506-7^a	수용체(receptor), TonB-의존
TF1505	HP-C
TF1535	가능한 수용체(receptor) 단백질
TF1534	HP-C
TF1605	Omp, TDR
TF1606	Omp
TF1989	Omp, 가능한 TDR
TF1990	Omp
TF2032	Omp, TDR
TF2031	HP-C
TF2193	Omp, TDR
TF2192	가능한 Omp
TF2301	Omp, TDR
TF2302	HP-C, 가능한 Omp
TF2347-8^a	Omp, 어쩌면 영양소 결합에 수반된
TF2349	HP-C
TF2403	Omp, TDR
TF2402	Omp, 어쩌면 영양소 결합에 수반된
TF2412	Omp
TF2411	Omp
TF2417	Omp, TDR
TF2416	HP-C
TF2597	수용체(receptor) 단백질; 가능한 TDR
TF2596	HP-C, 가능한 LP
TF2605	Omp, TDR
TF2606	HP-C
TF2725	Omp, TDR
TF2726-7^a	Omp, 어쩌면 영양소 결합에 수반된
TF2728	Omp, TDR
TF2729	가능한 Omp
TF2801	Omp, TDR
TF2802	가능한 Omp
TF3011	Omp, TDR
TF3012	가능한 Omp
TF3104	Omp, TDR
TF3103	Omp
TF_extra^h	Not in LANL
TF0015	Omp (가능한 면역원성 리포단백질)
TF0090	HP-C
TF0091	Omp
TF0220	HP-C
TF0304	peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
TF0305	peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
TF0322	가능한 YngK 단백질
TF0348	HP
TF0365	HP
TF0368	HP
TF0447	HP
TF0546	HP-C
TF0652	HP-C
TF0661	HP
TF0749	protease II
TF0750	HP-C
TF0765	HP-C
TF0945	HP-C; 가능한 표면 단백질
TF1033	endothelin converting enzyme, endopeptidase
TF1055	HP
TF1158	OM LP, NlpE involved in copper resistance
TF1342	가능한 리포단백질
TF1404	HP-C
TF1440	HP
TF1525	HP-C
TF1565	polysaccharide export 단백질, BexD/CtrA/VexA 패밀리
TF1733	HP-C
TF1755	주변세포질(periplasmic) 단백질 분해 효소(protease)
TF1940	TPR-반복-포함 단백질
TF2016	HP
TF2035	HP-C
TF2206	HP-C; 가능한 sugar phosphate isomerase/epimerase
TF2207	exo-alpha-sialidase (neuraminidase)
TF2214	peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
TF2327	HP-C; 가능한 리포단백질
TF2414	HP
TF2415	HP
TF2447	리포단백질
TF2531	가능한 dipeptidyl-peptidase III
TF2804	HP-C
TF2806	HP-C
TF2843	HP-C; 가능한 리포단백질
TF2925	beta-N-acetylglucosaminidase
TF3013	HP-C
TF3024	주변세포질(periplasmic) protease
TF3165	thiol:disulfide 내부 교환(interchange) 단백질
TF0955	HP-C
TF1032	가능한 internalin-관련된 단백질
TF1259	HP
TF1741	HP-C
TF1843	표면 항원(surface antigen) BspA**
TF2116	HP-C; 가능한 hemagglutinin/hemolysin
TF2320	HP
TF2339	HP
TF2592	HP-C
TF2646	HP-C
TF2661-2^a	표층(surface layer) 단백질 A
TF2663	표층(surface layer) 단백질 B
TF2998	surface antigen BspA**
TF3080	HP-C
TF3163	HP-C
TF1478	membrane fusion efflux 단백질
TF0454	xanthine/uracil permease 패밀리 단백질
TF1351	HP-C
TF1970	oxaloacetate decarboxylase, beta 서브유닛(subunit)
TF2574	pre단백질 translocase SecY
TF0477	dipeptide/tripeptide permease, POT 패밀리
TF0789	pre단백질 translocase, secDF 패밀리
TF3036	glucose/galactose 트랜스포터(트랜스포드(transport)er)
TF0797	HP-C
TF0813	glycosyl hydrolase, secreted
TF1201	가능한 pre단백질 translocase
TF1245	LemA 단백질
TF2333	신호 펩티다아제 I
TF2924	DNA-결합 response regulator/sensor histidine kinase
TF3099	HP-C
TF0334	HP
TF0743	HP-C
TF1039	HP-C
TF1101	ABC 트랜스포터(transporter), ATP-결합 단백질
TF1964	MotA/TolQ/ExbB proton channel 패밀리
TF0405	HP-C
TF2920	HP-C
TF3137	Na+-translocating NADH-퀴논(quinine) 환원효소(reductase), 서브유닛(subunit) E
TF1413	가능한 트랜스멤브레인(transmembrane) 단백질
TF0959	주변세포질(periplasmic) 단백질 분해 효소
TF1775	oxido환원효소(reductase), Gfo/Idh/MocA 패밀리
TF2330	HP-C
TF1897	HP-C; 가능한 aminopeptidase
TF0421	alpha-L-fucosidase
TF2803	가능한 NADH-의존 dehydrogenase
TF0183	HP-C
TF0216	50S ribosomal 단백질 L20
TF0217	50S ribosomal 단백질 L35
TF0439	Na+-transporting NADH:유비퀴논(ubiquinone) 옥사이드(oxido)환원효소(reductase), 서브유닛(subunit) 1
TF0841	NADH 탈수소효소(dehydrogenase)/NAD(P)H 질소 환원효소(nitro reductase)
TF1123	glycosyltransferase
TF1150	pyruvate-formate lyase
TF1151	HP-C
TF1193	glycosyl transferase, group 1 패밀리
TF1325	L-fucose isomerase
TF1575	DNA-결합 response regulator
TF1595	HP-C
TF2190	HP-C
TF2421	cytocidal toxin 단백질
TF2551	30S ribosomal 단백질 S10
TF2552	50S ribosomal 단백질 L3
TF2560	30S ribosomal 단백질 S3
TF2566	50S ribosomal 단백질 L5
TF2569	50S ribosomal 단백질 L6
TF2579	30S ribosomal 단백질 S4
TF2649	succinate dehydrogenase, flavo단백질 서브유닛(subunit)
TF2650	succinate dehydrogenase, iron-sulfur 서브유닛(subunit)
TF2838	HP-C
TF3006	transcriptional regulator RprY

^aAccession 번호 및 단백질 기재는 Oralgen website (www.oralgen.lanl.gov) 유래이며, 하이픈으로 연결된 accession 번호들은 프로테오믹스(proteomics) 및 상동성 데이터 둘 다에 의해 나타낸 바와 같이 단일 단백질에 상응하는 데이터베이스에 있는 두 인접한 유전자들이다.

다양한 보조제들(adjuvants)은 백신 조성물과 결합되어 이용된다고 알려져 있다. 보조제들은 면역 반응 조절에 의해, 백신 항원이 단독으로 투여될 때 보다 더 적은 양의 백신 항원 또는 더 소수의 복용량을 이용하여 더욱 내구성이 있고 더 높은 정도의 면역력(immunity)을 습득하는데 도움을 준다. 보조제의 예는 불완전 프로인트 아쥬반트(incomplete Freund's adjuvant, IFA), Adjuvant 65 (땅콩 기름(peanut oil), 만나이드 모노올레이트(mannide monooleate) 및 알루미늄 모노으테아레이트(aluminium monostearate)를 포함하는), 유화제(oil emulsions), Ribi 아쥬반트, 플루오닉 폴리올(pluronic polyols), 폴리아민(polyamines), 아브리딘(Avridine), 퀼(Quil) A, 사포닌(saponin), MPL, QS-21, 알루미늄 염(aluminium salts) 및 칼륨 염((calcium salts)과 같은 미네랄 젤(mineral gels), 하이드로시아파타이트(hydroxyapatite), 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), 알루미늄 염와 같은 나노파티클(nanoparticles), 당 올리고머(sugar oligomers) 및 만난(mannan), 키토산(chitosan)과 같은 폴리머(polymers)를 포함한다. 다른 예는 SAF-1, SAF-0, MF59, Seppic ISA720, 및 ISCOMs^TM 및 ISCOM matrix^TM 와 같은 다른 미립자(particulate) 보조제와 같은 수중 유적(oil in water emulsions)을 포함한다. 보조제의 다른 예들의 광범위하나 완벽한 목록은 Cox and Coulter 1992 [In: Wong WK (ed.) Animals parasite control utilising technology. Bocca Raton; CRC press, 1992; 49-112]에 열거되었다. 보조제에 더하여, 백신 조성물은 적절하게 종래의 약학적으로 허용 가능한 담체, 첨가제(excipients), 충진제(fillers), 완충제(buffers) 또는 희석제(diluents)를 포함할 것이다. 보조제를 포함하는 백신 조성물의 하나 또는 그 이상의 복용량이 치주염을 예방하기 위해 예방적으로 또는 이미 존재하는 치주염의 치료를 위해 치료적으로 투여될 것이다. 한 실시태양에서, 사용된 보조제는 Th-2 편향된 반응의 생성을 가능하게 하기 위해 선택될 것이다. 예는 Alum일 것이다.

바람직한 조성물에서, 키메릭 또는 융합 단백질은 점막 보조제와 함께 조합되며 구강(oral), 입속(buccal), 비강(nasal) 경로를 통해 투여된다. 점막 보조제의 예는 나노파티클(nanoparticles), 콜레라 독소(cholera toxin) 및 열에 불안정한(heat labile) E. coli 독소, 상기 독소들의 비-독성(non-toxic) B 서브유닛(subunits), 독성이 감소된 상기 독소들의 유전적 돌연변이체이다. 항원성 단백질을 구강으로/입속으로/비강으로 전달하기 위해 사용되는 다른 방법은 위장관(gastrointestinal tract) 또는 다른 점막 표면으로부터 미소구체(microspheres)의 흡수를 돕기 위해 또는 단백질의 분해를 막기 위해, 마이크로캡슐화(microencapsulation)에 의한 생분해성(biodegradable) 폴리머 (아크릴레이트(acrylates) 또는 폴리에스터(polyesters)와 같은) 또는 나노파티클(하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)와 같은)의 파티클 속 또는 위로의 단백질 융합(incorporation) 또는 흡수(absorption)를 포함한다. 리포좀(Liposomes), ISCOMs^TM, 하이드로젤(hydrogels)은 항원성 단백질을 점막 면역 시스템에 전달하기 위해 LTB, CTB 또는 렉틴(lectins)과 같은 표적 분자의 융합에 의해 더욱 향상될 수 있는 다른 가능한 방법의 예이다. 항원성 단백질 및 점막 보조제 또는 전달 시스템 뿐만 아니라, 백신 조성물은 적절한 종래의 약학적으로 허용 가능한 담체, 첨가제(excipients), 충진제(fillers), 코팅제(coatings), 분산매(dispersion media), 살균제(antibacterial) 또는 항진균제(antifungal agents), 및 완충제(buffers) 또는 희석제(diluents)를 포함할 수 있다.

백신 조성물을 대상에 투여하기 위해 알려진 많은 방법들은, 피내의(intradermal), 근육내의(intramuscular), 복강내의(intraperitoneal), 정맥내의(intravenous), 피하의(subcutaneous), 비강내의(intranasal), 설하의(sub-lingual), 입속의(buccal), 구강의(oral) 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 투여 경로는 백신 투여에 특히 유용하다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 상기에서 대체적으로 기재된 키메릭 또는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 조절 요소(regulatory element)와 선택적으로 작동가능하게(operatively) 연결된 핵산 분자를 제공한다. 한 실시태양에서, 상기 핵산은 분리된 또는 거의 정제된 형태로 제공된다.

핵산 분자는 예를 들어, 발현 벡터의 원핵 또는 진핵 숙주 세포로의 형질도입에 의한 재조합 단백질로 키메릭 단백질의 생산을 위해 적절한 발현 벡터로 도입될 것이다. 재조합 단백질의 성공적인 발현은 발현 벡터가 전사(transcription) 및 번역(translation)을 위해 필요한 호환 가능한 조절 요소를 포함하고, 발현을 위해 사용된 특정 숙주 세포 시스템에 의해 인식되는 것을 필요로한다. 박테리오파지(bacteriophage) 벡터, 플라스미드(plasmid) 벡터, 또는 코스미드(cosmid) DNA 로 형질도입된 세균; 효모(yeast) 벡터를 포함하는 효모; 균류 벡터(fungal vectors)를 포함하는 균류; 바이러스 (예를 들어, baculovirus)로 감염된 곤충 세포주(insect cell lines); 및 플라스미드 또는 바이러스성 발현 벡터로 형질전환된, 또는 재조합 바이러스 (예를 들어, 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 등등)로 감염된 표유동물 세포주를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다양한 숙주 세포 시스템은 재조합 단백질 발현에 이용될 것이다.

분자 생물학의 당업계에서 알려진 방법을 사용하여, 다양한 프로모터들(promoters) 및 촉진자들(enhancers)이 재조합 단백질의 발현을 증가시키기 위해 융합되어 아미노산 서열의 증가된 발현이 사용된 특정 숙주 세포 시스템과 호환될 수 있게 (예를 들어, 사용된 특정 숙주 세포 시스템에 비-독성인) 제공된 발현 벡터에 도입될 수 있다.

프로모터의 선택은 사용된 발현 시스템에 의존할 것이다. 길이가 다양한 프로모터들은 전사를 가능하게 하는 능력을 가진다. 일반적으로, 고수준의 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및 재조합 단백질로 발현을 위해 강력한 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 당업계에 자명한 E. coli 를 포함한 숙주 세포 시스템에서 고수준의 전사가 관찰된 lac 프로모터(promoter), trp 프로모터(promoter), recA 프로모터(promoter), 리보조말(ribosomal) RNA 프로모터(promoter), P_R 및 P_L 프로모터(promoter), lacUV5, ompF, bla, lpp, 등을 포함하는 세균의, 파지, 또는 플라스미드 프로모터들은 아미노산 서열을 암호화하는 형질도입된 뉴클레오티드 서열의 전사를 제공하기 위해 사용될 수 있다.

효율적인 전사 또는 번역을 위한 다른 대조 요소들은 촉진자, 및 조절 신호를 포함한다. 촉진자(Enhancer) 서열은 주변 암호화 뉴클레오티드 서열에 대한 그 들의 자리(position) 및 방향(orientation)의 방식에서 비교적 독립적으로 전자 효율의 증가를 나타내는 DNA 요소(elements)이다. 따라서, 사용된 숙주 세포 발현 벡터 시스템에 따라, 촉진자는 전사 효율을 증가시키기 위해 도입된 암호화 서열로부터 각각 상류(upstream) 또는 하류(downstream)로 대체될 수 있다. 전사 또는 번역 개시 신호(signals)와 같은 다른 조절 자리가 암호화 서열의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다.

다른 실시태양에서, 벡터는 바이러스 또는 세균 백신 벡터일 것이며, 재조합 바이러스 백신, 재조합 세균 백신, 재조합 약화된 세균 백신, 또는 불활성화된 재조합 바이러스 백신을 제공하기 위해 사용되었다. 백시니아(Vaccinia) 바이러스는 감염성 바이러스(infectious virus)로 다른 유기체(organisms)로부터 유래된 백신 항원을 발현하도록 조작된 당업계에 가장 잘 알려진 예시이다. 약화되거나 아니면 처리되서 그 자신으로는 질병을 일으키지 못하는 재조합 생 백시니아 바이러스가 숙주를 면역시키기 위해 사용되었다. 숙주 내에 있는 재조합 바이러스의 차후의 복제는 백신 항원과 함께 면역 시스템의 지속적인 자극을 제공함으로써 오래 지속되는 면역력을 제공한다.

다른 생백신 벡터들은:

아데노바이러스(adenovirus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 및 바람직하게는 백시니아(vaccinia)와 같은 수두바이러스(poxviruses) [Paoletti and Panicali, U.S. Patent No. 4,603,112] 및 약화된 살모넬라(Salmonella) 균주 [Stocker et al., U.S. Patent No. 5,210,035; 4,837,151; and 4,735,801; and Curtiss et al., 1988, Vaccine 6:155-160]를 포함한다. 생백신들은 상당히 오래-지속되는 면역력을 부여할 수 있도록 면역 시스템을 지속적으로 자극하기 때문에 특히 유익하다. 면역 반응이 뒤의 P. gingivalis 감염에 대해 방어적일 때, 상기 생백신 자체가 P. gingivalis에 대한 방어적인 백신으로 사용될 수 있다. 특히, 생백신은 구강의 공생 서식(commensal inhabitant)하는 세균들(bacterium)을 토대로 할 수 있다. 상기 세균들은 재조합 키메릭 단백질을 가지는 벡터로 형질전환될 수 있으며 그런 다음 구강, 특히 구강 점막(oral mucosa)에서 서실할 수 있다. 구강 점막에 한번 서식하면, 재조합 단백질의 발현은 상쇄하는 항체(neutralising antibodies)를 생산하도록 점막 관련된 림프 조직(lymphoid tissue)을 자극할 것이다. 상기 실시태양을 추가로 설명하기 위해, 당업자에게 자명한 분자 생물학적 기술을 사용하여 본 발명의 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이, 에피톱을 발현하게하지만 백시니아 바이러스 벡터의 성장 또는 복제에 부정적인 영향은 미치지 않는 위치의 백시니아 바이러스 게놈 DNA로 도입될 수 있다. 그 결과로 생긴 재조합 바이러스는 백신 제제(formulation)에서 면역원(immunogen)으로서 사용될 수 있다. 당업자에게 자명한 화학적인 방법에 의한 것과 같은 동일한 방법이 발현된 면역원의 면역원성(immunogenicity)을 주로 유발하는 것 없는 재조합 바이러스가 면역원으로서의 사용에 앞서 불활성화된 경우를 제외한 불활성화된 재조합 바이러스 백신 제제 제조를 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 키메릭 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 곧 바로 백신 제제로 사용하기 위한 용도를 제공한다. 하나 또는 그 이상의 조절 요소와 작동 가능하게 연결된 키메릭 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 개체에 병원성 균주 P. gingivalis에 대한 백신 접종(vaccinate)을 위해 바로 도입 ("직접 유전자 전달(direct gene transfer)")될 수 있다. 주요 장기의 조직 뿐 아니라 혈관내피세포(vascular endothelial cells)와 같은 백신 접종된 개체의 세포에 의해 유전적인 재료들의 발현을 초래하는, 백신 접종된 개체로의 직접 유전자 전달이 발현 플라스미드:양이온 리포좀 복합체(cationic liposome complex) Zhu et al., 1993, Science 261:209-211]의 정맥 주사에 의한 것과 같은 당업계의 기술에 의해 입증되었다. 벡터 DNA을 표적 세포로 전달하기 위한 다른 효과적인 방법은 당업계의 당업자에게 자명하다. 한 실시예에서, 바이러스 유전자를 포함하는 정제된 재조합 플라스미드 DNA가 방어적인 면역 반응을 유도하기 위한 백신을 접종(비경구적으로(parenterally), 점막을 통해(mucosally), 또는 유전자-총 면역화(gene-gun immunization)를 통해)하기 위해 사용되었다[Fynan et al. 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:11478-11482]. 다른 실시예에서, 개체로부터 제거된 세포들은 표적 세포로의 재조합 벡터 DNA의 도입을 초래하는 당업계의 표준 과정(standard procedures)에 의해 형질도입(transfected) 또는 전기천공(electroporated)될 수 있다. 재조합 벡터 DNA를 포함하는 세포들은 벡터에서 발현된 선별 마커(selection marker)를 이용하는 것와 같은 당업계에 자명한 방법들을 이용하기 위해 선별될 수 있으며, 선택된 세포들은 그 뒤에 재조합 단백질을 발현하기 위해 개체에 재-도입(re-introduced)될 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 상기에 기재된 바와 같이 항생물질과 면역원을 포함하는 약학적 조성물이 제공되었다. 조성물은 희석제, 부형제, 또는 담체, 또는 구강감염과 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 화학요법제(chemotherapeutic agent) 또한 포함되며, 구강투여를 위해 번안될 수 있다. 이 발명의 구성물들은 사탕(lozenges), 검(chewing gum) 등 다른 제품(products)에, 예를 들어, 따듯한 검 베이스(gum base)에 혼합하거나, 젤루통(jelutong), 고무 라텍스(rubber latex), 비닐라이트 수지(vinylite resins) 등, 전통적인 가소제(plasticizers) 또는 연화제(softeners), 설탕(sugar), 또는 글루코스(glucose), 솔비톨(Sorbitol) 같은 다른 감미료(sweeteners)의 예와 같이 검 베이스의 바깥 표면에 입히는 등, 혼합될 수 있다.

상기-언급된 약학적 조성물들을 포함하는 본 발명의 조성물은 치약(toothpastes), 치분(toothpowders), 액체 치약(liquid dentifrices), 구강청정제(mouthwashes), 트로키(troches), 검, 치과 페이스트(dental pastes), 잇몸 마사지 크림(gingival massage creams), 가글 정제(gargle tablets), 유제품과 다른 음식물들을 포함하는 치약(dentifrice)으로 준비되고 사용될 수 있다. 본 발명에 의하면 구강용 조성물은 특정한 구강용 조성물의 종류와 형태에 따라서 잘 알려진 재료들을 추가적으로 포함할 수 있다.

일부 바람직한 발명의 형태에서, 구강용 조성물은 구강청정제나 린스(rinse)와 같이 대체로 액체의 성질을 띌 수 있다. 그러한 제제에서 매개물(vehicle)은 일반적으로 물과 알콜의 혼합물(water-alcohol mixture)이며 하기에 기재된 보습제(humectant)를 포함하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 물과 알콜의 무게비율의 범위는 약 1:1 내지 약 20:1이다. 이러한 종류의 제제에서 물과 알콜의 혼합물의 총량의 범위는 전체 제제 무게의 약 70% 내지 약 99.9%이다. 알콜은 일반적으로 에탄올 또는 아이소프로판올이다. 에탄올이 바람직하다.

그러한 액체 및 이 발명의 또 다른 제제들의 pH의 범위는 대개 약 5 내지 약 9이며, 일반적으로 약 5.0 내지 약 7.0이다. pH는 산(예를 들어, 구연산(citric acid) 또는 벤조산(benzoic acid)) 또는 염기 (예를 들어, 수산화나트륨(수산화 나트륨(Sodium Hydroxide)))로 조절되어 완충될 수 있다(시트르산 나트륨(sodium citrate), 벤조에이트(benzoate), 카보네이트(carbonate), 또는 비카보네이트(bicarbonate), 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate), 이인산 이수소나트륨(sodium dihydrogen phosphate) 등으로).

본 발명의 다른 바람직한 형태에서, 약학적 조성물들은, 치분(toothpowder), 구강용 정제 또는 치약(toothpaste) (치아 크림) 또는 젤 치약(dentifrice)과 같이 대체로 고체 또는 페이스트(pasty)의 성질을 띌 수 있다. 고체 또는 페이스트(pasty)와 같은 구강용 제제의 매개물은 일반적으로 이에 허용 가능한 광택제(polishing material)를 포함한다.

치약에서, 액체 매개물은 일반적으로 전체 제제의 약 10% 내지 약 80%를 차지하는물과 보습제(humectant)로 구성된다. 글리세린(Glycerine), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 솔비톨(Sorbitol) 및 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol)이 적절한 보습제/담체의 예이다. 또한, 물, 글리세린 및 솔비톨의 혼합물이 유용하다. 굴절율(refractive index)이 중요한 투명한 젤에서, 약 2.5% - 30% w/w의 물, 0 내지 약 70% w/w의 글리세린 및 약 20%-80% w/w의 솔비톨이 바람직하다.

치약, 크림과 젤들은 대체로 약 0.1 내지 약 10, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5% w/w의 자연산 또는 합성 점증제(thickener) 또는 젤화제(gelling agent)를 포함한다. 적절한 점증제(thickener)는, Laporte Industries Limited가 판매하는 라포나이트(Laponite) (예를 들어, CP, SP 2002, D)와 같은 합성 콜로이드 마그네슘 염화 금속 실리케이트 복합체인 합성 헥토라이트(hectorite)이다. Laponite D는, 무게대비 약 58.00% SiO₂, 25.40% MgO, 3.05% Na₂O, 0.98% Li₂O, 및 약간의 물과 미량의 금속이다. 이 것의 참비중(true specific gravity)은 2.53 이며 8% 습도에서의 겉보기 체적 밀도(apparent bulk density)는 1.0 g/ml이다.

다른 적절한 점증제(thickener)들 중에는 영국 이끼(Irish moss), 아이오타 카라기닌(iota carrageenan), 껌트라가칸트(gum tragacanth), 녹말(starch), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 하이드록시에틸프로필셀룰로오스(hydroxyethylpropylcellulose), 하이드록시부틸 메틸 셀룰로오스(hydroxybutyl methyl cellulose), 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스(hydroxypropyl methyl cellulose), 하이드록시에틸 셀룰로오스 (예를 들어, 나트로졸(Natrosol)로 가능한), 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨(카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨(Sodium carboxymethyl cellulose)), 및 잘게 빻아진 사이로이드(Syloid)와 같은 콜로이달 실리카(예를 들어. 244)를 포함한다. 또한 가용화 약제들은 프로필렌 클리콜(propylene glycol), 디프로필렌 글라이콜(dipropylene glycol) 및 헥실렌 글라이콜(hexylene glycol)과 같은 폴리올스(polyols) 보습제, 메틸 셀로솔부 및 에틸 셀로솔브와 같은 셀로솔브(cellosolves), 올리브 오일, 피마자유(castor oil) 및 바셀린(petrolatum)과 같은 직쇄에 적어도 약 12개의 탄소가 포함된 식물성 오일 및 왁스 및 아밀 아세테이트(amyl acetate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및 벤질 벤조산(benzyl benzoate)과 같은 에스터와 같은 것들이 포함될 수 있다.

통상적으로, 구강용 제제들(oral preparations)은 대체로 적절히 레이블된 포장(labelled packages)에 넣어져서 판매되거나 분배될 것이라 이해된다. 그러므로, 구강 린스(mouth rinse) 한 병은 그것을 실질적으로 구강 린스 또는 구강세정제로 묘사하는 레이블을 갖고 있을것이고, 치약, 크림, 또는 젤은 대체로, 일반적으로는 납이나 플라스틱으로 안을 댄 접을 수 있는 튜브(collapsible tube), 또는 다른 압착, 펌프 또는 가압된 dispenser에, 내용물의 양을 알 수 있는 미터와 그것을 실질적으로 치약, 젤 또는 치아 크림으로 묘사하는 레이블을 가질 것이다.

유기적 계면활성제(Organic surface-active agents)들이 본 발명의 조성물들의 예방효과의 증가, 유효성분의 확실하고 완전한 분산과 미용적으로 더 잘 받아들여지게 하기 위해서 사용될 수 있다. 그러한 유기적 계면활성제는 가급적 음이온(anionic)을 띄거나, 비-이온적(non-ionic)이거나, 또는 양성(ampholytic) 성질을 가져야 하며, 유효성분과 반응하지 않아야 한다. 조성물에 깨끗이 하고(detersive) 거품이 나는 성질을 전하는 세제(detersive material)를 사용하는 것이 바람직하다. 음이온 계면활성제(anionic surfactants)의 적절한 예로는, 코코넛 오일 지방산의 황산화된 모노글리세파이드의 나트륨 염 더 높은 지방산의 모노글리세라이드(monoglyceride) 황산염(monosulfate), 로릴 황산 나트륨(sodium lauryl sulfate), 토데실 벤젠 술폰산염 나트륨(sodium dodecyl benzene sulfonate)과 같은 알킬 아릴 술폰산염(alkyl aryl sulfonates), 더 높은 알킬술포-아세테이트(alkylsulfo-acetates), 1,2-디하이드록시 프로판 술폰산염(dihydroxy propane sulfonate)의 더 높은 지방산 에스터, 및 12 내지 16개의 탄소를 지방산에 가지고 있는 더 낮은 지방족(aliphatic) 아미노 카르복시산(aliphatic amino carboxylic acid) 화합물의 상당히 포화된 더 높은 지방족 아실 아마이드, 알킬 또는 아실 라디칼, 및 등등의 수용성 염 등이 있다. 마지막에 언급된 아마이드(amide)의 예로는 N-로로일 사르코신(N-lauroyl sarcosine), 실질적으로 비누나 비슷한 더 높은 지방산 물질을 포함하지 않는 N-로로일(lauroyl), N-미리스토일(myristoyl), 또는 N- 팔미토일(palmitoyl) 의 소듐, 포타슘, 그리고 에탄올아민염(에탄올(Ethanol)amine salt)이 있다. 사용하기에 적절한 물에 녹는 비이온적 계면활성제의 예로는 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide) 및 긴 소수성 체인 (예를 들어, 12 내지 20개의 카본으로 이루어진 지방족 체인)을 갖고 있으며 반응성 수소(reactive hydrogen)을 갖고 있는 다양한 화합물간의 축합반응물이 있으며, 이러한 축합반응물("ethoxamers")은 예를 들어, 폴리(poly) (에틸렌옥사이드(ethylene oxide)) 와 지방산(fatty acids)의 축합반응물, 지방 알콜, 지방 아마이드, 다가의 알코올(polyhydric alcohols) (예를 들어, 솔비탄 모노스테아레이트(sorbitan monostearate)) 및 폴리프로필렌옥사이드(polypropyleneoxide) (예를 들어, 플루오닉 재료(Pluronic materials)) 처럼 친수성인 폴릭옥시에틸렌 부분을 갖고 있다.

계면활성제는 일반적으로 무게 기준 약 0.1-5% 중량부의 양으로 존재한다. 계면활성제가 본 발명의 활정제(active agent)의 용해를 도움으로써 필요한 용해되는 보습제(solubilizing humectants)의 양을 최소화 할 수 있다는 점은 주목할 만 하다.

미백제들(whitening agents), 방부제들(preservatives), 실리콘(silicones), 엽록소 화합물(chlorophyll compounds) 및/또는 유리아(urea), 인산이암모늄(diammonium phosphate) 및 이들의 혼합물 같은 암모니아 화합물(ammoniated material)과 같은 다양한 물질들이 본 발명의 구강용 제제에 포함될 수 있다. 이런 보조제는 바라는 특성 및 성질에 상당한 부작용을 일으키지 않는 양으로 제제에 포함된다.

어떠한 적절한 향료나 감미료들 또한 사용될 수 있다. 적절한 향료의 예로는 예를 들어, 스피아민트(spearmint), 페퍼민트(peppermint), 윈터그린(wintergreen), 사사프라(sassafras), 클로버(clove), 세이지(sage), 유칼립투스(eucalyptus), 마조람(marjoram), 시나몬(cinnamon), 레몬, 및 오렌지의 오일과 같은, 향 오일들 및 살리실산메틸(methyl salicylate)이 있다. 적절한 감미료(sweetening agents)로는 수크로즈(sucrose), 락토즈(lactose), 말토즈(maltose), 솔비톨(xylitol), 자일리톨(xylitol), 시클람산 나트륨(sodium cyclamate), 페릴라르틴(perillartine), AMP(아스파틸 페닐 알라닌, 메틸 에스터), 사카린 등이 있다. 적합하게, 향료와 감미료는 각각 또는 같이 제제의 약 0.1% 내지 5% 또는 그 이상을 구성할 수 있다.

구강내 사용을 목적으로 하는 조성물들은 약학적 조성물의 생산기술에서 알려진 어떠한 방법으로도 준비될 수 있으며, 그러한 조성물들은 약학적으로 품위있고 맛좋은 제제를 제공하기 위해 감미료, 향료(향료(Flavour)ing agents), 착색제(colouring agents) 그리고 방부제(preserving agents)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 약제를 포함할 수 있다. 정제들은 정제를 생산하는데 적합한 무독성이고 약학적으로 허용가능한 부형제(excipients)와의 혼합물안에 유효성분을 포함하고 있다. 이러한 부형제의 예로는, 탄산칼슘(calcium carbonate), 탄산나트륨(sodium carbonate), 락토오즈, 인산칼슘(calcium phosphate) 또는 인산나트륨(sodium phosphate) 와 같은 비활성(inert) 희석제; 예를 들어, 옥수수 녹말과 같은 과립제(granulating agent) 및 봉해제(disintegrating agent) 또는 알긴산(alginic acid); 예를 들어 녹말, 젤라틴 또는 아카시아(acacia)와 같은 결합제, 및 예를 들어, 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 스테아린산(stearic acid) 또는 탈크(talc)와 같은 윤활제(lubricating agent)가 있다. 상기 정제는 위장관(gastrointestinal tract)에서의 분해(disintegration) 및 흡수(absorption)를 늦추기 위하여 알려진 기술에 의해 탈피될 수 있거나 입혀질(coat) 수 있고, 그렇게 함으로써 장기간에 걸친 지효성(sustained action) 제공한다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트(glyceryl monostearate) 또는 글리세릴 디스테아레이트(glyceryl distearate)와 같은 시간 지체 재료가 이용될 수 있다.

경구 사용을 위한 제형은 유효성분이, 예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린(kaolin)과 같은 비활성 고체 희석제와 섞인 단단한 젤라틴 캡슐 또는 유효성분이 물 또는, 예를 들어, 땅콩 기름(peanut oil), 유동 파라핀(liquid paraffin) 또는 올리브 기름과 같은 중유와 섞인 연성 젤라틴 캡슐로서 존재할 수 있다.

수성 현탁액(aqueous suspension)은 수성 현탁액의 제조에 적합한 첨가제와 섞여서 활성 물질을 포함한다. 이런 첨가제는 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈(sodium carboxymethylcellulose), 메틸셀룰로오즈(methylcellulose), 하이드로프로필 메틸셀룰로오즈(hydropropyl methylcellulose), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 껌트라가칸트(gum tragacanth) 및 아라비아 고무(gum acacia)와 같은 현탁제; 자연발생적 인지질일 수 있는, 예를 들어, 레시틴(lecithin)과 같은 분산제 또는 습윤제(wetting agent), 또는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트(polyoxyethylene stearate)와 같은 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합체, 또는 예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같은 에틸렌 옥사이드와 긴 체인 지방족 알콜의 축합체, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레이트(polyoxyethylene 솔비톨(Sorbitol) monooleate)와 같은 헥시톨(hexitol)에서 파생된 불완전한 에스터의 축합체, 또는 예를 들어 폴리에틸렌 솔비탄 모노올레이트(polyethylene sorbitan monooleate)와 같은 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물(anhydride)의 축합체이다.

또한, 수성 현탁액은 하나 이상의 보존료, 예를 들어, 에틸, 또는 n-프로필 p-히드록시 벤조산염과 같은 벤조산염(benzoate), 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향료, 및 하나 이상의 수크로즈 또는 사카린과 같은 감미제를 포함할 수 있다.

유성 현탁액은 유효성분을, 예를 들어, 땅콩 기름(arachis oil), 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 기름, 또는 유동 파라핀과 같은 광물성 기름(mineral oil)에 현탁하여 만들어질 수 있다. 유성 현탁액은 예를 들어, 밀랍(beeswax), 하드 파라핀(hard paraffin) 또는 세틸 알콜(cetyl alcohol)과 같은 점성부여제를 포함할 수 있다. 상기에 명시된 것과 같은 감미제, 및 향료는 구미에 맞는 경구 제제를 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이런 조성물은 아스코르빈산(ascorbic acid)과 같은 항-산화 첨가제에 의해 보존될 수 있다.

4.키트

일부 실시태양에서:

- 상기 대상의 구강 조직으로부터 거의 모든 미-생물 또는 그의 단편을 제거하기 위한 항-미생물 제제;

- 구강 조직에 존재하는 것이 질병 또는 질환과 관련된 병원성 미생물에 대해 상기 대상을 면역화하기 위한 면역원;

을 포함하는, 상기에 기재된 방법을 이용하는 키트가 제공된다.

키트는:

- 하나 또는 그 이상의 항-미생물 제제의 형태의 약학적 조성물 및 면역원을 보유하고있는 용기(container);

- 사용 설명서가 포함된 레이블 또는 포장을 포함할 것이다.

일부 실시태양에서, 방법에 사용된 또는 본 발명에 기재된 용도 키트가 제공된다.

일부 실시태양에서, 키트는 질병 또는 질환의 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 추가적인 유효 성분(active principles) 또는 요소(ingredients)를 포함할 것이다.

키트는 용기 및 레이블 또는 포장된 용기가 포함할 것이다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병(bottles), 바이알(vials), 주사기(syringes), 블리스터 팩(blister pack), 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 질환의 치료에 효과적인 약학적 조성물을 보유하며 살균 접속구(sterile access port) (예를 들어, 용기는 정맥 주사 용액 백(intravenous solution bag) 또는 피하 주사 바늘(hypodermic injection needle)로 뚫을 수 있는 스토퍼를 가지는 바이알일 것이다.)를 가질 것이다. 레이블 또는 포장은 약학적 조성물이 선택 질환의 치료를 위해 사용된다는 설명서가 삽입된다. 한 실시태양에서, 상기 레이블 또는 포장은 사용을 위한 및 질병 또는 질환의 치료에 사용될 수 있는 약학적 조성물을 나타내는 설명서(instructions)를 포함한다.

키트는 (a) 약학적 조성물; 및 (b) 그 안에 이차 유효 성분 또는 요소를 포함하는 이차 용기를 포함한다. 본 발명의 실시태양의 키트는 유효 성분 및 다른 유효성분이 장애 또는 특정 감염에 기인한 합병증 예방에 이용될 수 있는 것을 나타내는 포장 삽입을 추가적으로 포함할 수 있다. 또는, 추가적으로, 키트는 추가로 주사를 위한 정세균성 물(bacteriostatic water) (BWFI), 생리식염수(phosphate-buffered saline), 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로-허용가능한 버퍼를 포함하는 이차(또는 세번째) 용기를 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한, 다른 버퍼, 희석제, 충진제, 바늘, 및 주사기를 포함하는 다른 재료를 추가로 포함할 것이다.

본 발명은 예시(exemplification)의 방법으로서 포함된 하기의 실시예에 의해 더욱 설명되나, 본 발명의 제한이 아니다.

실시예 1

방법 및 재료.

세균 균주 및 성장 조건. Porphyromonas gingivalis W50이 5 μg/ml의 헤민(haemin), 0.5 μg/ml의 시스테인(cysteine)이 보충된 용해된 말의 혈액 아가 플레이트(horse blood agar plates)에서 37 ℃에서 혐기적으로(anaerobically) 동결 건조된 배양액(Lyophilised cultures)에서 성장하였다 (HB 아가, < 10 패시지(passages)). 3-4일 후에, 콜로니들은 5 μg/ml의 헤민(haemin), 0.5 μg/ml의 시스테인(cysteine)을 포함하는 브레인 하트 인퓨전 배지(brain heart infusion medium)로 접종되었다 (1). 혐기적으로 MK3 Anaerobic Workstation (Don Whitley Scientific Ltd., Adelaide, Australia)에서 미연속 배양(Batch cultures)되었다. 세포들은 지수적 성장기(exponential growth phase) 동안 원심분리기 (7500 g, 30 분, 4 ℃)에 의해 수득되었으며, PG 버퍼 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 및 5 mM 시스테인(cysteine)-HCl, pH 8.0)로 anaerobic workstation에서 두번 씻어졌다. 미연속 배양의 성장이 650 nm에서 분광광도계(spectrophotometer) (295E 모델, Perkin-Elmer). 를 이용하여 관찰되었다. 배양액 순도가 그람 염색(Gram stain), 현미경 실험(microscopic examination) 및 슬롯(Slots)에 따른 다양한 생화학적 실험을 이용하여 일상적으로 확인되었다 (2).

부착소 서열 및 N-말단에 Kgp 단백질 분해 효소( proteinase ) 서열이 추가된 부착소 서열을 포함하는 pET28 컨스트럭트의 제작. Kgp 잔기들을 나타내는 펩타이드 및 활성 자리 (active site, AS)의 키메릭 펩타이드 및 KgpA1 부착소 (A1) 도메인들은 E. coli에서 pET 발현 벡터 (Novagen)를 이용하여 hexa-His 택이 있는 재조합 (r) 단백질로서 과-발현(over-expressed)되었다. 상기 발현된 r-단백질들은 rKAS2, 및 rKLA1이며, r-키메릭 단백질들은 rKAS2-KLA1, rKAS1-KsA1 및 rKAS4-KAS3-KAS5-KAS6-KLA1이다 (또한 multiKAS-KLA1을 말한다). 다양한 A1 및 AS 도메인들을 나타내는 아미노산 서열은 표 1 및 2에 기재된다.

kgp 유전자의 다양한 KAS 및 KA1 도메인들은 표 4에 나열된 프라이머들, Taq DNA 중합효소(polymerase) (Invitrogen) 및 PC960 thermal cycler (Corbett Research Technologies)을 이용하여 pNS1 (pUC18에 있는 3.5 kb BamHI lys 단편) 또는 P. gingivalis 게놈 DNA로부터 각각 증폭되었다. 프라이머 쌍 KAS2-FOR 및 KAS2-REV 및 KLA1-FOR 및 KLA1-REV가 하기의 반응 조건을 이용하여 KAS2 및 KLA1을 암호화하는 PCR 단편을 만드는데 각각 사용되었다: 94 ℃, 3 분, 뒤이어 94 ℃에서 28 사이클(cycles), 45 초 (변성(denaturing)); 62 ℃, 40 초 (풀림(annealing)) 및 72 ℃, 20 초 (연장(extension)) 뒤이어 72 ℃에서 마지막 사이클, 5 분.

KAS2-KLA1 키메릭 PCR 산물은 하기의 오버랩 연장(overlap extension, SOEing)에 의한 유전자 스플라이싱(gene splicing)에 의해 생산되었다: PCR 산물은 KAS2-FOR 및 KAS2-KLA1-chimera-REV 및 KAS2-KLA1-chimera-FOR 및 KLA1-REV의 프라이머 쌍을 이용하여 상기 기재된 조건으로 생산되었다. 상기 PCR 산물은 그 뒤에 풀렸으며(annealed) 최종 PCR이 프라이머들 KAS2-FOR 및 KLA1-REV와 함께 수행되었다 (94 ℃, 2 분, 뒤이어 94 ℃에서 28 사이클, 30 초; 50 ℃, 30 초 및 72 ℃, 40 초 뒤이어 72 ℃에서 최종 사이클, 5 분).

KAS1-KsA1 PCR 산물의 제조를 위해, KAS1-KsA1 PCR 산물을 생산하기 위해 각각의 KAS1-KsA1-FOR 프라이머 1 및 2와 함께 KAS1-KsA1-REV 프라이머를 이용한 잇다른 두 성공적인 PCR이 수행되었다 (반응 조건 94 ℃으로 2 분 동안 뒤이어 94 ℃에서 35 사이클, 15 초; 63 ℃, 30 초 및 72 ℃, 2 분). KAS1-KsA1-FOR1 및 KAS1-KsA1-FOR2 프라이머들은 이전의 PCR 산물의 5’에 겹치는(overlapping) 3’연장(extension)을 포함한다.

multiKAS-KLA1 PCR 단편 제조를 위해, KLA1 PCR 산물을 생산하기 위해 각각의 멀티-FOR 프라이머들 1, 2, 3 및 4 와 함께 멀티-REV 프라이머를 이용하여 잇달아 네 번의 성공적인 PCR이 수행되었다 (반응 조건 95 ℃으로 2 분 동안 뒤이어 95 ℃에서 35 사이클, 20 초; 68 ℃, 1.5 분). 각각의 멀티(multi)-FOR 프라이머는 이전의 PCR 산물의 5’에 겹치는(overlapping) 3’연장(extension)을 포함한다.

KAS2, KLA1, KAS2-KLA1, KAS1-KsA1 및 multiKAS-KLA1를 암호화하는 PCR 단편 모두는 PCR 정제 컬럼(PCR purification columns) (Qiagen)을 이용하여 정제되었으며, TA 클로닝 벡터(cloning vector) pGem-T Easy (Promega)로 연결되었고, 제조사의 프로토콜에 따라 E. coli JM109로 형질도입되었다. 정제된 재조합 pGemT-Easy 컨스트럭트는 NcoI 및 XhoI로 절단되었으며, 방향성있게(directionally) NcoI/XhoI 절단된 pET28b (Novagen)로 클로닝되었고, 비-발현 숙주 E. coli JM109 [DH5α]로 형질도입되었다. 재조합 pET28 컨스트럭트는 정제되었으며, 발현 숙주 E. coli BL21 (DE3) [HMS174(DE3)] (Novagen)으로 형질도입되었고, 제조사의 설명서에 따라 50 μg의 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 LB에서 선별되었다. 각각의 인서트(insert)의 완전성(integrity)이 DNA 서열 분석(DNA sequence analysis)을 통해 확인되었다.

올리고뉴클레오티드 프라이머들 (표 4)이 제한 효소 자리(restriction enzyme sites), 스톱 코돈(stop codons) 및 hexa-His 택(Tags)을 필요한 자리에 융합하기 위해 설계되었다. rKAS2, rKLA1 및 rKAS2-KLA1에 대해 사용된 프라이머들은 r-단백질에 세 아미노산의 hexa-his 택 이외의 관련없는(extraneous) 암호화 서열의 포함(inclusion)을 제한하기 위해 설계되었다. rKAS1 및 rKLA1은 hexa-His 택을 N-말단 및 C-말단 끝에 각각 포함하기 위해 설계되었으므로, rKAS2-KLA1는 hexa-his 택을 N- 및 C-말단에 모두 가지는 것과 직접적으로 비교된다.

KgpA1 및 AS의 다양한 단편 및 키메라를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 증폭을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머들

재조합 (r) 단백질	올리고	서열 (5’-3’)	*특성 (5’-3’)**
rKAS2	KAS2 -FOR	GACCATGGCTCATCACCATCACCATCACAATACCGGAGTCAGCTTTGCA (서열번호: 47)	GA buffer-NcoI (ATG 개시 포함)-CT-(His)₆-AS (nt 1992-2012)
rKAS2	KAS2 -REV	GACTCGAGTTATTTGTCCTTATTAGTGAGTGCTTTC (서열번호: 48)	GA buffer-XhoI-TTA Stop-KAS1 (nt 2099-2075)
rKLA1	KLA1 -FOR	GACCATGGCTTGGGGAGACAATACGGGTTAC (서열번호: 49)	GA buffer-NcoI (ATG 개시 포함)-CT-A1 (nt 2946-2966)
rKLA1	KLA1 -REV	GACTCGAGACCTCCGTTAGGCAAATCC (서열번호: 50)	GA buffer-XhoI-A1 (nt 3863-3845)
rKAS2 - KLA1	KAS2 -KLA1-REV	CCGTATTGTCTCCCCATTTGTCCTTATTAGTGAGTGCTTTC (서열번호: 51)	A1 (nt 2961-2946)-KAS1 (nt 2099-2075)
rKAS2 - KLA1	KAS2 -KLA1-FOR	CACTAATAAGGACAAATGGGGAGACAATACGGGTTAC (서열번호: 52)	KAS1 (nt 2084-2099)-A1 (nt 2946-2966)
rKAS1 - KsA1	KAS1 -KsA1-FOR1	CATGGATCTGAGACCGCATGGGCTGATCCACTTTTCTTGTTGGATGCCGAT (서열번호: 53)	AS (nt 2025-2057)-A1 (nt 2970-2987)-
	KAS1 -KsA1-FOR2	CCATGGCTTTGAATACCGGAGTCAGCTTTGCAAACTATACAGCGCATGGATCTGAGACCGCA 서열번호: 54)	NcoI-CT-AS (nt 1989-2042)
	KAS1 -KsA1-REV	CTCGAGGAATGATTCGGAAAGTGTT (서열번호: 55)	XhoI-A1(nt 3663-3644)
rmultiKAS -KLA1	multi-FOR1	CCATGGCTGATTATAGCTGGAATTCCCAGGTAGTCAGCTTTGCAAACTATACA (서열번호: 56)	NcoI-CT-KAS4 (nt 1857-1880)-KAS3 (nt 2001-2021)
	multi-FOR2	CTTTGCAAACTATACAGCGCATGGATCTGAGACCGCATGGGCTGATCCACTT (서열번호: 57)	KAS3 (nt 2006-2057)
	multi-FOR3	ATGGGCTGATCCACTTCTGAATTCTTATTGGGGCGAGATCGGCAATATTACC (서열번호: 58)	KAS3 (nt 2042-2060)-KAS5 (nt 2223-2240)-KAS6 (nt 2403-2417)
	multi-FOR4	GATCGGCAATATTACCCATATTGGTGCTCATTACGCTTGGGGAGACAATACG (서열번호: 59)	G-KAS6 (nt 2403-2435)-GCT ( spacer)-A1(nt 2946-2960)
	multi-REV	CTCGAGACCTCCGTTAGGCAAATCCAATGCCGGTGTTATCAGATAGTTGTCA (서열번호: 60)	Xho-A1 (nt 3863-3818)

* accession 번호 U75366의 라이신-특이적 시스테인 단백질 분해효소(lysine-specific cysteine proteinase) 유전자 서열 유래 뉴클레오티드 (nt) 서열 번호

재조합 단백질의 발현 및 정제. 재조합 단백질들은 이소프로필 β-D-티오갈락토시다아제(isopropyl β-D-thiogalactosidase, IPTG))로 유도되어 pET28::KLA1(KAS2, KAS2-LA1, KAS1-SA1, multiKAS-KLA1) 컨스트럭트(constructs)로부터 발현되었다. 모든 재조합 단백질들은 6-His 택 융합 단백질로서 생산되었으며 NI-NTA 정제 시스템(NI-NTA purification system) (Invitrogen)으로 변성 조건(denaturing conditions)하에 정제되었다. 간단하게, E. coli (DE3) 단일 콜로니 형질변환체(transformants)가 50 μg/ml 카나마이신(kanamycin)을 포함한 LuriaBertani (LB) 배지 20 mL에 37 ℃에서 하룻밤 동안 궤도 쉐이커에서(orbital shaker) 접종되었다. 상기 접종원(inoculum)은 그 뒤에 50 μg/ml 카나마이신(kanamycin)을 포함한 LB 1L에 접종하기 위해 사용되었다. 단백질 발현을 이소프로필 IPTG 0.1 mM로 2 시간 동안 37 ℃에서 200 rpm로 교반하며 유도하기 전에, 상기 배양액은 OD₆₀₀의 0.5-0.7 (중간-지수기(mid-log phase))에 도달하도록 하였다. 세포들은 수득되었고(7,500g) 변성된 결합 버퍼 (8M Urea, 20 mM Sodium Phosphate pH 8.0 ＆ 500 mM NaCl)에서 재부유되었으며, 세팅 3의 마이크로팁(microtip)을 가진 Branson Sonifer 250 Cell disrupter (Branson Ultronics Corporation, Danbury, CT)를 이용하여 얼음 위에서 3 x 15 s 방출량(bursts)으로 30 s 간격으로 초음파분쇄되었고, 4 ℃, 39,000 g에서 30 분 동안 원심분리되었다. 재조합 단백질은 전-평형맞춰진(pre-equilibrated) Ni-NTA 아가로오스 컬럼(Agarose column)에 로딩되어 상등액으로부터 정제되었고 그 뒤에 결합되지 않은 단백질을 용출하기 위해 변성 세척 버퍼(8M Urea, 20 mM Sodium Phosphate pH 6.0 ＆ 500 mM NaCl)로 씻어졌다. 상기 컬럼은 그 뒤에 10 배의 결합 버퍼 B (8M Urea, 20mM Sodium Phosphate pH 6.0, 500 mM NaCl ＆ 0.5 M 이미다졸)를 이용하여 씻어졌다. 정제된 단백질은 2M Urea-PBS에 대해 투석되었고 -80 ℃에서 보관되었다.

재조합 단백질 샘플들은 SDS-PAGE 및 ProtParam on-line ()를 이용하여 결정된 그들의 분자 질량(molecular masses)에 의해 분석되었다. 모든 샘플의 단백질 농도는 BSA를 표준으로 이용한 Bio-Rad Protein Assay에 의해 측정되었다.

면역화( Immunisation ) 및 마우스 치주염 모델. 상기에서 기재된 바와 같이 마우스 치주염 실험이 수행되었고 (3), 멜번대학교 동물 실험 윤리위원회(Melbourne Ethics Committee)에 의해 공인되었다. 마이크로아이솔레이터(microisolators)에서 사육된 6-8 주령 (그룹 당 12 마우스)BALB/c 마우스는 피하주사(subcutaneously) (s.c. 100 μL)로 50 μg의 재조합 단백질 또는 RgpA-Kgp 복합체(complex), 2 x 10⁹의 P. gingivalis 균주 W50 포르말린 사멸 세포 또는 PBS 중 하나로 각각 면역화되었다; 각각의 항원은 불완전 프로인트 아쥬반트(incomplete Freund’s adjuvant, IFA)에 유화되었다. 30일 후, 마우스들은 항원 (s.c. 주사, IFA에 유화된)으로 부스트되었으며(boosted with antigen), 그런 뒤 12일 후에 교후망(retrobulbar plexus)으로 부터 체혈되었다. 이차 면역화 4일 후, 마우스들에게 1 mg/ml의 카나마이신 (Sigma-Aldrich,New South Wales, Australia)이 포함된 탈염수(deionized water)가 임의로 7일 동안 주어졌다. 항생제 치료 3일 후 (체혈 2일 후), 1 x10¹⁰ 의 생존 가능한 P. gingivalis W50 (25 μl)이 들어있는, 2% (wt/vol) 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)(CMC; Sigma-Aldrich, New South Wales, Australia)를 포함하는 PG 버퍼 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 및 5 mM시스테인(cysteine)-HCl, pH 8.0)로 마우스들은 2일 간격으로 네 번 구강을 통해 접종되었으며, 대조군은 2% (wt/vol)CMC 만을 포함한 PG 버퍼로 가짜로 감염되었다. 접종원들(inocula)은 혐기성 챔버에서 제조되었고 그 뒤에 바로 상악대구치아(maxillary molar teeth)의 치은연(gingival margin)에 사용되었다. 두 주 후, 마우스들은 2% (wt/vol) CMC를 포함하는 PG 버퍼에 녹아있는 1 x 10¹⁰ 개의 생존 가능한 P. gingivalis W50(25 μl) 세포를 네번 투여 받았다 (2일 간격). 각각의 접종에서 생존 가능한 세균의 수는 혈액 아가(blood agar)에서의 계수(enumeration)에 의해 확인되었다. 마우스들은 부드러운 가루 먹이 (Barastock, Australia)를 섭취시켰고 잠을 자지 못하도록 아래가 그물로 만들어진 케이지에서 사육하였다. 마지막 투여 4일 후, 마우스들은 교후망(retrobulbar plexus)으로 부터 체혈되었고 희생되었으며, 상악체(maxillae)가 제거되었고 치조골 손실(alveolar bone loss) 측정에 사용된 한쪽 반(오른쪽) 및 실시간 PCR(real-time PCR)을 위해 사용된 다른 반쪽(왼쪽)으로 잘렸다.

오른쪽 반쪽 상악체(maxillae)는 탈염수에서 가열되었고 (1 분), 기계적으로 살이 발라졌으며, 2% (wt/vol) 수산화 칼륨(potassiumhydroxide)에 담궈졌다 (16 h, 25 ℃). 반쪽 상악체는 그 뒤에 씻어졌고 (탈염수로 두 번) 3% (wt/vol) 과산화수소(hydrogen peroxide)에 담궈졌다 (6 h, 25 ℃). 반쪽 상악체가 씻어진 후 (탈염수로 두 번), 0.1% (wt/vol) 수용성 메틸렌 블루(aqueous methylene blue)로 염색되었으며, 수평적 골 손실을 측정하기 위해 각각의 반쪽 상악체의 입속 측면의 디지털 이미지가 OLYSIA BioReport 소프트웨어 3.2 버전 (Olympus AustraliaPty Ltd., New South Wales, Australia)을 이용하여 검출용 현미경에 마운트된 올림푸스 DP12 디지털 카메라로 캡쳐되었다. 수평적 골 손실은 능선(crest) 높이의 감소를 야기하는 치조골 (ABC)에 직각으로(perpendicular) 수평면에 발생하는 손실이다. 각각의 상악체 반쪽은 정렬되어서 각각의 치아 이미지의 입의 어금니(molar buccal) 및 혀 끝(lingual cusps)이 적재되었으며, 상기 이미지는 마이크로미터 크기로(micrometer scale) 캡쳐되었기 때문에, 측정은 각각의 이미지애 대해 표준화 될 수 있다. 각각의 어금니의 백악법랑경계(cementoenamel junction) 내지 ABC의 영역이 OLYSIA BioReport 소프트웨어 3.2 버전 이미징 소프트웨어를 이용하여 측정되었다. 골 손실 측정은 랜덤화 및 블라인드 프로토콜을 이용하여 단일 실험자에 의해 두번 측정되었다.

ELISA에 의한 항체 서브클래스(subclass antibody)의 측정. 마우스 혈청의 서브클래스 항체의 반응을 측정하기 위해, 효소 결합 면역흡착법 (enzyme-linked immunosorbent assays, ELISAs)이 평면-바닥 폴리비닐 마이크로타이터 플레이트(flat-bottom polyvinyl microtiter plates) (Dynatech Laboratories,McLean, VA)의 웰을 코팅하기 위해 pH7.0인 0.1% (vol/vol) Tween 20 (PBST)를 포함한 PBS(phosphate-bufferedsaline) (0.01 M Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄, 0.15 M NaCl)에 녹아있는 포르말린 사멸 P. gingivalis W50 5-μg/ml의 용액을 이용하여 삼 회 수행되었다. 코팅 용액을 제거한 후에, 2% (wt/vol) 탈지 분유를 포함하는 PBST가 코팅 안된 플라스틱을 차단하기 위해 1h 동안 상온에서 웰에 첨가되었다. 그 후에, 웰들은 PBST로 4번 씻어졌으며, 마우스 혈청을 계열 희석한 0.5% (wt/vol) 탈지 분유를 포함한 PBST (SK-PBST)가 각각의 웰에 첨가되었으며 상온에서 16 h동안 인큐베이션되었다. 웰들이 PBST로 6번 씻어진 후에, 염소(goat) IgG를 마우스 IgM, IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, 또는 IgG3 (Sigma,New South Wales, Australia)에 1/2,000으로 희석한 용액이 SK-PBST에 첨가되었고 상온에서 2 h 동안 결합되었다. 플레이트는 PBST로 6번 씻어졌으며, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 토끼 항-염소 멱역글로불린(horseradish peroxidase-conjugatedrabbit anti-goat immunoglobulin) (Sigma, New South Wales, Australia)을 SK-PBST에 1/5,000으로 희석한 용액이 각각의 웰이 첨가되었고 상온에서 1 h 동안 인큐베이션되었다. 그 후에, 웰들은 PBST로 6번씩 씻어졌고, 결합된 항체는 각각의 웰에 100 μl의 ABTS 기질 [0.9 mM 2,2'-아지노(azino)-비스(bis)(3-에틸벤즈(ethylbenz)-티아졸린(thiazoline)-6)설폰산(sulfonic acid)가 녹아있는 0.005% (vol/vol)의 과산화수소(hydrogen peroxide)를 포함하는 80 mM 시트르산, pH 4.0] 첨가하여 검출되었다. 415 nm에서의 광학밀도(optical density)가 마이크로플레이트 리더기(microplate reader) (Bio-Rad microplatereader, model 450)를 이용하여 측정되었다.

SDS-PAGE 젤 전기영동 및 웨스턴 블로팅. 재조합 단백질들 (10 μg)은 XCell surelock Mini-Cell 전기영동 시스템을 이용하여 분석되었다. 재조합 단백질들은 20 μl의 감소 샘플 버퍼(reducing sample buffer) (10% [wt/vol] SDS,0.05% [wt/vol] 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 25% [vol/vol] 글리세롤(glycerol), 및0.05% [vol/vol] 2-머캅토에탄올(mercapto에탄올(Ethanol)))에 혼합되었다. ph는 1.5 M Tris-HCl로 Ph 8.0으로 맞춰졌으며, 그 뒤에 상기 용액은 100 ℃에서 5분 동안 가열되었다. 재조합 단백질들 (10 μg/래인(lane))은 Novex 12% (wt/vol) Tris-글라이신 프리캐스트 미니 젤(glycine precast mini gels)에 로딩되었으며, Novex 전기영동 시스템(electrophoresissystem) (Novex, San Diego, CA)를 이용하여 전기영동이 30 내지 50mA의 전류(current) 및 125 V의 전위차(potential difference)로 수행되었다. 단백질들은 0.25% w/v 쿠마시 블루(Coomassie blue) R250를 이용하여 가시화되었다.

Kgp 단백질 분해 효소 활성 자리 펩타이드 ( KAS -2) 서열의 에피톱 분석. 멀티핀 펩타이드 합성 시스템(multipin peptide synthesis system) (Chiron Technologies, Melbourne, Australia) 상에서, Fmoc 화학을 위한 표준 고체-상 펩타이드 합성 프로토콜을 이용하여 Lys-특이적 단백질 분해 효소 활성 자리 펩타이드 KAS2 (433-468 서열번호: 28)에 대한 항체 결합자리(antibody binding sites)가 N-말단에 바이오티닐레이트된 겹치는 여덟 잔기 펩타이드 (일곱 잔기에 의해 겹친, 하나 상쇄)의 합성에 의해 측정되었다. pH 7.4의 0.1 M PBS에 녹아있는 바이오티닐레이트된 펩타이드 (5 μg/mL)는 스트렙타비딘(strepavidin) 코팅된 플레이트에 4 ℃에서 하룻밤 동안 결합되었다 (Nunc, NSW Australia). 웰들은 PBST로 4번 씻어진 후에, 플레이트-결합된 펩타이드들의 에피톱 매핑(epitope mapping)이 1% w/v 탈지 분유가 녹아있는 0.1% v/v Tween 20 (SK-PBST)를 포함하는 0.1 M PBS, pH 7.4에 1:1000으로 희석한 마우스 혈청을 이용하여 ELISA에 의해 Chiron Technologies 설명서에 따라 수행되었다. PBST로 웰들을 6번 씻은 후에, 염소(goat) IgG를 마우스 IgG (Sigma,New South Wales, Australia)에 희석한 용액을 SK-PBST에 첨가하였으며 상온에서 2 h 동안 결합되었다. 플레이트들은 PBST로 6번 씻어졌으며, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 토끼 항-염소 멱역글로불린(horseradish peroxidase-conjugatedrabbit anti-goat immunoglobulin) (Sigma, New South Wales, Australia)을 SK-PBST에 1/5,000으로 희석한 용액이 각각의 웰에 첨가되었고, 상온에서 1 h 동안 인큐베이션되었다. PBST로 웰들을 6번 씻은 후에, 결합된 항체는 각각의 웰에 100 μl의 ABTS 기질 [0.9 mM 2,2'-아지노(azino)-비스(bis)(3-에틸벤즈(ethylbenz)-티아졸린(thiazoline)-6)설폰산(sulfonic acid)가 녹아있는 0.005% (vol/vol)의 과산화수소(hydrogen peroxide)를 포함하는 80 mM 시트르산, pH 4.0] 첨가하여 검출되었다. 415 nm에서의 광학밀도(optical density)가 마이크로플레이트 리더기(microplate reader) (Bio-Rad microplatereader, model 450)를 이용하여 측정되었다.

통계 분석. 골 손실 데이터는 일원분산분석(One-Way analysis of variance) (ANOVA) 및 듀넷의 T3 검정(Dunnett’s T3 test) (SPSS for Windows, version 12)를 이용하여 통계학적으로 분석되었다. IgA, IgM, 및 IgG 서브클래스 항체 역가가 SPSS 소프트웨어 (SPSS forWindows, version 12)를 이용한 스튜던트 t 테스트(Student's t test)를 이용하여 통계적으로 분석되었다.

실시예 2

재조합 단백질 ( KsA1 , KLA1 , KAS1 - KsA1 및 KAS2 - KLA1 )의 특성 묘사(Characterisation) 및 정제(purification).P . gingivalis 감염에 대해 방어하기 위해 Kgp 부착소 A1 도메인 단편 및 키메라 Kgp 단백질 분해효소 및 Kgp 부착소 A1 도메인 단편의 능력을 특징짓기 위해, 본 발명자들은 재조합 단백질을 발현 및 정제했다: - KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 및 KAS2-KLA1. 재조합 단백질 (KsA1 및 KLA1) 및 재조합 키메라 단백질 (KAS1-KsA1 및 KAS2-KLA1)이 봉입체(inclusion bodies)로부터 니켈 킬레이트 친화 크로마토그래피(nickel chelate affinity chromatography)를 이용하여 정제되었고 정제된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분석되었다 (도 1). 각각의 정제된 재조합 단백질은 KAS2-KLA1, KLA1, KsA1 및 KAS1-KsA1에 상응하는 40, 36, 31 및 32 kDa의 분자량, 및 ProtParam을 이용한 His-택 재조합 단백질의 계산된 분자 질량에 상기 상응하는 질량들을 가진 하나의 주요 단백질 밴드로 구성되며, 장들된다. 면역원성을 특징짓기 위해 재조합 단백질 KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 및 KAS2-KLA1가 마우스를 면역화시키기 위해 사용되었으며, 혈청은 KAS2 펩타이드 코팅된 플레이트 및 포르말린 사멸 P. gingivalis W50 세포로 코팅된 플레이트를 표지하기 위해 사용되었다 (도 2). 재조합 키메라 단백질 KAS1-KsA1 및 KAS2-KLA1 항혈청은 KAS2 펩타이드 (도 2A)를 포르말린 사멸 P. gingivalis W50 세포들처럼 (도 2B), KAS2 특이적 항혈청과 비슷한 정도로 인식하기 위해 발견되었다. 그러나, 재조합 단백질 KLA1에 대한 항혈청은 오직 사멸된 P. gingivalis W50 세포만을 인식하였다 (도 2B).

실시예 3

마우스 치주염 모델에서의 P. gingivalis 유도 치조골 손실에 대한 재조합 단백질 (KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 and KAS2-KLA1)의 면역화 효과. 재조합 단백질 KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 및 KAS2-KLA1, 포르말린 사멸 P. gingivalis 균주 W50 및 RgpA-Kgp 복합체(complex)는 P. gingivalis 유도 치조골 손실에 대해 유도된 보호(protection)를 측정 및 비교하기 위해 Baker et al (4)에 보고된 사실에 기초하여 한정된 치조골 손실 마우스 모델을 이용하여 사용되었다. 마우스들은 각각의 재조합 단백질 KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 또는 KAS2-KLA1, RgpA-Kgp 복합체(complex) 또는 포르말린 사멸된 P. gingivalis W50 균주 (FK-W50) 세포들 또는 PBS 아쥬반트 단독으로 면역화되었으며, 그 뒤에 생균(viable) P. gingivalis W50가 구강 투여되었다. 모든 재조합 항원, gpA-Kgp 복합체(complex) 및 FK-W50 세포들로의 면역화는 PBS로 면역화된 군에 비해 상기 동물들이 유의적으로(p<0.001) 골 손실이 감소하는 것을 보인 것처럼 P. gingivalis-유도 치조골 손실로부터 BALB/c 마우스를 보호했다(도 3). 그러나, KAS2-KLA1 면역화된 마우스는 KLA1 (p<0.01); KsA1 (p<0.001), RgpA-Kgp 복합체(complex) (p<0.001), FK-W50 세포들 (p<0.001) 및 실험되지 않은(non-challenged) 마우스들 (p<0.001)로 면역화된 마우스들 보다 더욱 많이 유의적으로 골 손실을 감소시켰다. KAS2-KLA1 및 KAS1-KsA1로 면역화된 마우스들 사이에는 골 손실에 큰 차이가 없었다. 또한, KAS1-KsA1 면역화된 마우스들은 실험되지 않은 마우스들 (p<0.01) 및 RgpA-Kgp 복합체(complex) 면역화된 마우스들 (p<0.05)보다 유의적으로 적은 골 손실을 보였으나, KsA1, KLA1, 및 FK-W50 면역화된 마우스들과 유의성있게 다르지 않았다. KsA1, KLA1, RgpA-Kgp 복합체(complex) 및 FK-W50 면역화된 마우스들 사이에는 골 손실에 유의성 큰 차이가 없었다.

실시예 4

마우스 치주염 모델에서의 재조합 단백질들 ( KsA1 , KLA1 , KAS1 - KsA1 및 KAS2-KLA1) 로 면역화하여 유도된 항체 서브클래스 반응. 생균P . gingivalis 세포로 구강 접종 시도 전 및 후, 마우스들은 체혈되었고 혈청이 원심분리에 의해 수득되었다. 도 4는 마우스 치주염 모델에서의 각각 면역원 (KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 또는 KAS2-KLA1 또는 포르말린 사멸 P. gingivalis W50 균주 (FK-W50) 세포들)에 대한 포르말린-사멸 P. gingivalis W50 세포에 대한 항체 서브클래스 반응성(reactivity)을 나타낸다. 방어적 면역원들 모두는 FK-W50에 대해 높은 IgG 항체 역가를 유도했다. 또한, 각각의 방어적 면역원이 유도한 우세한 항체 서브클래스는 IgG1와 약한 면역반응성의 IgG2a, IgG2b 및 IgG3 FK-W50-특이적 항체들이다 (도 4). 전 (도 4A) 및 후-구강 접종 (도 4B) 모두에서 각각의 면역원에 의해 유도된 우세한 항체 서브클래스는 IgG1이다.

실시예 5

KAS2 (433- 468)의 에피톱 매핑(Epitope mapping). KAS2 (433-468)에 대한 바이오티닐레이트된(biotinylated) 여덟개의 잔기 펩타이드의 겹침(Overlapping) (일곱 잔기에 의해 겹친, 하나 상쇄)은 합성되었고 스트렙타비딘 코팅된 플레이트를 코팅하기 위해 사용되었다. 항체 결합 에피톱은 그 뒤에 항혈청을 이용하여 KAS1-KsA1, KAS2-KLA1 및 KAS2-디프테리아 독소 컨쥬게이트(diphtheria toxoid conjugate)로 면역화된 마우스로부터 확인되었다 (도 5). 광학 밀도 (415 nm)에서의 배경대비 두 배 증가는 양성 항체 반응(positive antibody response)으로 여겨진다 (역치 OD). 항혈청은 서열번호 28 viz로부터 유래된 하기의 펩타이드 서열을 인식하였다. KAS1 - KsA1는 펩타이드 435-442, 436-443, 445-452, 446-453 및 447-454펩타이드을 인식하였으나, KAS2 - KLA1는 펩타이드 435-442, 447-454 및 448-455를 인식하였다 (역치 OD = 0.07, 도 5A). 이것은 최소한의 수의 에피톱 viz. 펩타이드 436-442 (VSFANYT 및 그것의 변이형 VGFANYT), 펩타이드 447-452 (ETAWAD 및 그것의 변이형 ETSWAD), 및 펩타이드 448-453 (TAWADP 및 그것의 변이형 TSWADP)를 인식함을 시사한다. 펩타이드 436-442 에피톱을 포함하는 펩타이드들은 GVSFANYT, GVGFANYT, VSFANYTA 및 VGFANYTA를 포함한다. 447-452 및/또는 448-453 에피톱을 포함하는 펩타이드들은 SETAWAD, SETSWAD, ETAWADP, ETSWADP, TAWADPL 및 TSWADPL을, 더욱 바람직하게는 GSETAWAD, GSETSWAD, SETAWADP, SETSWADP, ETAWADPL, ETSWADPL, TAWADPLL 및 TSWADPLL를 포함한다.

실시예 6

단백질에 대한 결합을 위한 KAS 및 RAS 펩타이드의 합성.

펩타이드들은 매뉴얼대로 또는 CEM Microwave peptide synthesizer를 이용하여 합성되었다. Fmoc 화학을 위한 표준 고체-상 펩타이드 합성 프로토콜이 내내 사용되었다. 펩타이드들은 Rink-linker derived AM-sure resin (AAPPTEC, KY, USA)을 이용하여 카르복시아마이드 (carboxyamide) 형태로 조립되었다. 4개의 등가 Fmoc-아미노산 및 6개의 등가 DIPEA를 이용하여 HBTU/HOBt 활성화와 함께 결합이 완성되었다. Fmoc 기는 20% 피페리딘(piperidine)에 의해 1M HOBt/DMF 에서 제거되었다.

KAS 또는 RAS 펩타이드를 가지는 수지(Resins)는 DMF에서 부풀었고 N-말단 Fmoc 기는 2% v/v 피페리딘을 포함하는 DMF에 녹아있는 2% v/v DBU에 의해 제거되었다. N-말단 아미노기는 그 뒤에 5개의 등가 SAMA-OPfp 및 5개의 등가 HOBt를 이용하여 S-아세틸머캅토아세트산(Acetylmercaptoacetic acid) (SAMA) 기로 변형되었다(derivatised). 상기 반응은 트리니트로벤젠 설포닉산(trinitrobenzene sulphonic acid) (TNBSA) 시험으로 관찰되었다. TNBSA 시험이 음수로 돌아설 때 수지는 씻어졌다 (5 x DMF, 3 x DCM 및 3 x 디에틸 에테르(diethyl ether)). 수지는 그 뒤에 진공하에 건조되었다. TFA:페놀(phenol):TIPS:EDT:물(water) (92:2:2:2:2) 절단 칵테일(cleavage cocktail)을 이용하여, 펩타이드의 아르기닌 함유량에 의존적으로 2.5 시간 또는 4시간 동안 수지에서 펩타이드의 절단이 수행되었다. 절단 후에, 수지는 여과에 의해 제거되었으며, 질소류(stream of nitrogen) 하에 거의 1 mL로 농축되었다. 펩타이드 산물이 찬 에테르에서 침전된 후에, 원심분리되었고 세번 씻어졌다. 상기 펩타이드 침전물은 0.1% v/v TFA이 포함된 5 내지 10 mL의 물에 용해되었고 불용해성 수지가 원심분리에 의해 제거되었다. 펩타이드들은 RP-HPLC에 의해 정제되었다.

많은 다른 화학 성분들(moieties)이 단백질에 결합되기 위한, halides (bromo, chloro and iodo), maleimido, succinimidyl, hydrazinyl, oxime, thiol 와 같은 반응기에 도입되고 그 뒤에 변형된 펩타이드를 음성 시스테인 잔기를 통해 KgpA1와 같은 단백질에 결합시키는데 사용된 또는 나아가 펩타이드-단백질 컨쥬게이트를 형성하도록 상보적인 화학적 연결이 되도록 만드는 반응기로 변형된, 펩타이드들의 변형을 위해 사용될 수 있다.

SAMA - 펩타이드와 KA1의 결합(Conjugation). 포스페이트-버퍼 살린(phosphatebuffered saline) (0.1M 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 0.9% NaCl, pH 7.4)에 재조합 KA1 또는 RgpA-Kgp 복합체(complex)의 다른 부착소 도메인이 10 mg/mL 포함된 용액에, 1% w/v으로 m말레이미도 벤조일(maleimido benzoyl)N하이드록시숙신이미드 에스테르(hydroxysuccinimide ester) (MBS) 용액이 녹아있는 DMF가 첨가되었다. 30분 뒤에 반응 안된 MBS가 제거되었고, 컨쥬게이션 버퍼 (0.1M sodium phosphate, 5 mM EDTA; pH 6.0)로 평형된 PD10 컬럼 (Pharmacia, NSW, Australia)을 이용하여 젤 여과에 의해 MBS-변형된 KA1가 수득되었다. 정제된 SAMA-펩타이드(1.3 mmole)은 0.5 M Tris; 2mM EDTA, pH 6.0를 포함하는 구아닌 HCl 200mL에 용해되었으며 MilliQ 증류수로 희석되었고 MilliQ 증류수에 녹아있는 2M NH₂OH (40 equiv) 25 mL 첨가에 의해 in-situ 탈보호화되었다. 수득된 MBS-KA1는 즉시 탈보호화된 SAMA-펩타이드와 함께 반응되었고 상온에서 한시간 동안 교반되었다. 펩타이드-KA1 컨쥬게이트는 PBS pH 7.4로 평형화된 PD10 컬럼을 이용하여 젤 여과에 의해 반응 안된 펩타이드들로부터 분리되었고 동결건조되었다. 반응은 엘만 테스트를 이용하여 관찰되었다.

실시예 7

항체 제조. 재조합 단백질에 대한 다클론 항혈청이 단백질을 이용한 피하(subcutaneously) 면역화에 의해 마우스에서 유도되었다. 마우스들은 데이 0에 불완전 프로인트 아쥬반트에 있는 단백질 25 μg으로 면역화되었으며 데이 30에 불완전 프로인트 아쥬반트에 있는 단백질 25 μg으로 면역화되었다. 면역화는 표준 방법를 이용하여 수행되었다. 단백질에 대해 높은 역가를 가지는 다클론 항혈청(Polyclonal antisera)이 얻어졌다. 재조합 단백질에 대해 특이적으로 유도된 원하는 단일클론 항체가 표준 방법을 이용해 얻어졌다.

실시예 8

항체 생성을 위한 면역화(Immunization). 6-8 주령의 BALB/c 또는 CD1 마우스들 (Swiss 이계 교배 마우스들) (그룹 당 10 마우스)이 불완전 프로인트 아쥬반트 (IFA)에 유회된 50 μg의 KAS2-LA1 키메라 및 항원이 피하로(s.c. 100 μL) 면역화되었다. 30일 후, 상기 마우스들은 항원으로 부스팅(s.c. 주사, IFA에 유화되어서)되었으며, 12일 후, 상기 마우스들을 죽였고 혈청을 수득하기 위해 심장에서 체혈하였다.

ELISA에 의한 서브클래스 항체의 측정. 마우스 혈청의 서브클래스 항체 반응을 측정하기 위해, 효소 결합 면역흡착법 (ELISAs)이 평면-바닥 폴리비닐 마이크로타이터 플레이트(Dynatech Laboratories, McLean, VA)의 웰을 코팅하기 위해, 0.1% (vol/vol) Tween 20를 포함하는 phosphate-buffered saline (PBS) (0.01 M Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄, 0.15 M NaCl), pH 7.0 (PBST)에 녹아있는 KAS2-LA1 키메라 또는 포르말린 사멸된 P. gingivalis W50 또는 RgpA-Kgp 복합체(complex) 용액 5-μg/ml를 이용하여 세번 반복 수행되었다. 코팅 용액 제거 후에, 2% (wt/vol) 탈지 분유를 포함하는 PBST가 코팅되지 않은 플라스틱을 차단하기 위해 웰에 상온에서 1 h 동안 첨가되었다. 웰이 PBST로 4번 씻어진 후에, 0.5% (wt/vol) 탈지 분유 포함하는 PBST (SK-PBST)에 계열 희석(serial dilutions)된 마우스 혈청이 각각의 웰에 첨가되었고 상온에서 16 h 동안 인큐베이션되었다. 웰들이 PBST로 6번 씻어진 후에, 염소(goat) IgG를 마우스 IgM, IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, 또는 IgG3 (Sigma,New South Wales, Australia)에 1/2,000으로 희석한 용액이 SK-PBST에 첨가되었고 상온에서 2 h 동안 결합되었다. 플레이트는 PBST로 6번 씻어졌으며, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 토끼 항-염소 면역글로불린(horseradish peroxidase-conjugatedrabbit anti-goat immunoglobulin) (Sigma, New South Wales, Australia)을 SK-PBST에 1/5,000으로 희석한 용액이 각각의 웰이 첨가되었고 상온에서 1 h 동안 인큐베이션되었다. 그 후에, 웰들은 PBST로 6번씩 씻어졌고, 결합된 항체는 각각의 웰에 100 μl의 ABTS 기질 [0.9 mM 2,2'-아지노(azino)-비스(bis)(3-에틸벤즈(ethylbenz)-티아졸린(thiazoline)-6)설폰산(sulfonic acid)가 녹아있는 0.005% (vol/vol)의 과산화수소(hydrogen peroxide)를 포함하는 80 mM 시트르산, pH 4.0] 첨가하여 검출되었다. 415 nm에서의 광학밀도(optical density)가 마이크로플레이트 리더기(microplate reader) (Bio-Rad microplatereader, model 450)를 이용하여 측정되었다.

이계 교배 (CD1, Swiss) 마우스에서의 재조합 단백질들 ( KsA1 , KLA1 , KAS1 -KsA1 및 KAS2-KLA1) 로 면역화하여 유도된 항체 서브클래스 반응. CD1 (Swiss) 마우스들은 KAS2-LA1 키메라로 면역화되었고, 체혈되었으며 혈청이 원심분리에 의해 수득되었다. 도 6은 KAS2-LA1 키메라, 포르말린-사멸된 P. gingivalis W50 세포들 및 RgpA-Kgp 복합체(complex)에 대한 항체 서브클래스의 반응성을 나타낸다. 상기 KAS2-LA1 키메라는 인식된 IgG1 항체 반응에 우세를 가지는 강한 IgG 항체를 유도했고 상기 항체는 KAS2-LA1 키메라를 인식하였으며 FK P. gingivalis W50 세포들 및 RgpA-Kgp 복합체(complex)와 강하게 교차반응(cross reacted)하였다 (도 6). 또한, KAS2-LA1 키메라는 오직 약한 면역 반응의 IgG2a, IgG2b 및 IgG3 항원-특이적 항체들을 유도했다 (도 6).

실시예 9

Kgp 구조적 모델 개발 및 활성 자리 표면 접근 가능한 서열(Active Site Surface Accessible Sequences)의 확인.

본 발명은 Kgp 단백질 분해효소 활성 자리 펩타이드가 매우 면역원성이며 P. gingivalis-유도 골 손실에 대한 고수준의 방어를 유도하는 것을 나타낸다. 백신 후보로서의 추가적인 단백질 분해 효소 활성 자리 펩타이드를 확인하기 위한 시도에서, Kgp의 촉매 도메인 모델이 Orchestrar suite of programs within Sybyl7.3를 이용하여 개발되었다 (도 7). 상기 모델은 P. gingivalis 유래 RgpB 단백질 분해 효소의 PDB 구조 1crv에 기초하며, 상기 단백질들은 23.58%의 쌍별 동일성(pairwise identity)을 가지고, Z-스코어는 25.09이다 (높은-신뢰 모델). Meta-PPisp 단백질 상호작용 서버는 Kgp에 대한 두 단백질-단백질 상호작용 표면: 기질 결합 표면 (RgpB에서와 같이), 및 Kgp에 대해 특이한 이차 표면을 예측한다. RgpB 및 Kgp 모델 사이의 주요한 차이점은 이차 상호작용 표면 및 이차 상호작용 표면 내에 못미치는 Kgp에서의 모델이 될 수 없는 19-잔기 갭 (Val526 내지 Phe545)을 끼우는 루프(loops)에 있다. 도 7은 Kgp의 단백질 분해 효소 활성 자리 근처에 표면 접근 가능 서열을 보이는 두꺼운 리본을 가진 Kgp 모델을 나타내며, 상기 표면 접근가능 서열은 Asp388-Gln394, Leu421-Ala423, Ala451와 Ala443-Glu447, Asn510-Trp513, 및 Tyr580와 Ile570-Gly577인 것으로 밝혀졌다. 모델에 따르면 (도 6), KAS2 (A), 세 다른 서열 KAS4 (Asp388-Val395) (B), KAS5 (Asn510-Asp516) (C) ALC KAS6 (Ile570-Tyr580) (D)가 우세하며 백신 표적이 되기 위해 충분한 길이인 것이 명백하다. 따라서, 재조합 키메라 단백질은 각각의 상기 서열을 갖는 펩타이드를 가지도록 생산될 수 있으며, multiKAS-KLA1를 생산하기 위해 KL1의 N-말단에 결합될 수 있고, 면역 반응을 유도해서 관련된 질병 또는 질환의 방어를 위해 이용될 수 있다.

실시예 10

촉매 자리 주변에 있는 면역원성 부위를 확인하기 위해 Arg -X-단백질 분해 효소를 모델링하기 위한 과정.

*Arg-X 단백질 분해 효소의 삼차 구조(three dimensional structure)가 Eichinger A, Beisel HG, Jacob U, Huber R, Medrano FJ, Banbula A, Potempa J, Travis J, Bode W. Crystal structure of gingipain R: an Arg-specific bacterial cysteine 단백질ase with a caspase-like fold. EMBO J. 1999 Oct 15;18(20):5453-62 방법에 따라 밝혀졌다.

실시예 11

하기는 항체를 포함하는 치약(toothpaste) 제형(formulation)의 실시예이다.

성분% w/w

제2인산칼슘(Dicalcium phosphate dihydrate) 50.0

글리세롤(Glycerol) 20.0

카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨(Sodium carboxymethyl cellulose) 1.0

라우로일유산소다(Sodium lauryl sulphate) 1.5

소듐라우로일사코시네이트(Sodium lauroyl sarcosinate) 0.5

향료(Flavour) 1.0

사카린 나트륨(Sodium saccharin) 0.1

*글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.01

덱스트라나아제(Dextranase) 0.01

특이적인 항체를 포함하는 염소 혈청 0.2

증류수 balance

실시예 12

하기는 치약 제형의 실시예이다.

성분% w/w

제2인산칼슘(Dicalcium phosphate dihydrate) 50.0

솔비톨(Sorbitol) 10.0

글리세롤(Glycerol) 10.0

라우로일유산소다(Sodium lauryl sulphate) 1.5

소듐라우로일사코시네이트(Sodium lauroyl sarcosinate) 0.5

향료(Flavour) 1.0

사카린 나트륨(Sodium saccharin) 0.1

일불소인산나트륨(Sodium monofluorophosphate) 0.3

글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.01

덱스트라나아제(Dextranase) 0.01

특이적인 항체를 포함하는 소혈청 0.2

증류수 balance

실시예 13

하기는 치약 제형의 실시예이다..

성분% w/w

제2인산칼슘(Dicalcium phosphate dihydrate) 50.0

솔비톨(Sorbitol) 10.0

글리세롤(Glycerol) 10.0

라우로일 디에탄올아마이드(Lauroyl di에탄올(Ethanol)amide) 1.0

수크로스 모노라우레이트(Sucrose monolaurate) 2.0

향료(Flavour) 1.0

사카린 나트륨(Sodium saccharin) 0.1

일불소인산나트륨(Sodium monofluorophosphate) 0.3

글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.01

덱스트라나아제(Dextranase) 0.01

특이적인 항체를 포함하는 우유 Ig 0.1

증류수 balance

실시예 14

하기는 치약 제형의 실시예이다.

성분% w/w

솔비톨(Sorbitol) 22.0

영국 이끼(Irish moss) 1.0

수산화 나트륨(Sodium Hydroxide) (50%) 1.0

Gantrez 19.0

증류수 (deionised) 2.69

일불소인산나트륨(Sodium monofluorophosphate) 0.76

사카린 나트륨(Sodium saccharin)e 0.3

파이로인산(Pyrophosphate) 2.0

알루미나 수화물(Hydrated alumina) 48.0

향유 0.95

마우스 단일클론 항체 0.3

라우로일유산소다(Sodium lauryl sulphate) 2.00

실시예 15

하기는 액상 치약 제형의 실시예이다.

성분% w/w

폴리아크릴산나트륨(Sodium polyacrylate) 50.0

솔비톨(Sorbitol) 10.0

글리세롤(Glycerol) 20.0

향료(Flavour) 1.0

사카린 나트륨(Sodium saccharin) 0.1

일불소인산나트륨(Sodium monofluorophosphate) 0.3

글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.01

에탄올(Ethanol) 3.0

특이적인 항체를 포함하는 말(Equine) Ig 0.2

리놀레산(Linolic acid) 0.05

증류수 balance

실시예 16

하기는 구강청결제 제형의 실시예이다.

성분% w/w

에탄올(Ethanol) 20.0

향료(Flavour) 1.0

사카린 나트륨(Sodium saccharin) 0.1

일불소인산나트륨(Sodium monofluorophosphate) 0.3

글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.01

라우로일 디에탄올아마이드(Lauroyl di에탄올(Ethanol)amide) 0.3

특이적인 항체를 포함하는 토끼 Ig 0.2

증류수 balance

실시예 17

하기는 구강청결제 제형의 실시예이다.

*성분% w/w

Gantrez S-97 2.5

글리세린(Glycerine) 10.0

향유 0.4

일불소인산나트륨(Sodium monofluorophosphate) 0.05

글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.01

라우로일 디에탄올아마이드(Lauroyl di에탄올(Ethanol)amide) 0.2

마우스 단일클론 항체 0.3

증류수 balance

실시예 18

하기는 목캔디 제형의 실시예이다.

성분% w/w

설탕 75-80

옥수수 시럽 1-20

향유 1-2

NaF 0.01-0.05

마우스 단일클론 항체 0.3

Mg 스테아레이트(stearate) 1-5

증류수 balance

실시예 19

하기는 잇몸 마사지 크림 제형의 실시예이다.

성분% w/w

백색 바셀린(White petrolatum) 8.0

프로필렌 글라이콜(propylene glycol) 4.0

스테아릴 알콜(Stearyl alcohol) 8.0

폴리에틸렌 글라이콜(Polyethylene Glycol) 4000 25.0

폴리에틸렌 글라이콜(Polyethylene Glycol) 400 37.0

수크로스 모노스테아레이트 0.5

글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.1

마우스 단일클론 항체 0.3

증류수 balance

실시예 20

하기는 츄잉검 제형의 실시예이다.

성분% w/w

껌 베이스 30.0

탄산칼슘(Calcium carbonate) 2.0

솔비톨 결정(Sorbitol Crystalline) 53.0

글리세린 0.5

향유 0.1

마우스 단일클론 항체 0.3

증류수 balance

실시예 21

하기는 약학적 조성물의 실시예이다.

성분% w/w

인간화된 특이적인 단일 클론 항체 10

살균된 PBS(Sterile phosphate buffered saline) 90

실시예 22

하기는 치주 젤 제형의 실시예이다.

성분% w/w

플루오닉(Pluronic) F127 20.0

스테아릴 알콜(Stearyl alcohol) 8.0

특이적인 항체들 3.0

콜로이드 이산화규소(Colloidal silicon dioxide) (Aerosil 200) 1.0

글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.1

증류수 balance

실시예 23

하기는 치주 젤 제형의 실시예이다.

성분% w/w

플루오닉(Pluronic) F127 20.0

스테아릴 알콜(Stearyl alcohol) 8.0

특이적인 항체들 3.0

콜로이드 이산화규소(Colloidal silicon dioxide) (Aerosil 200) 1.0

옥산텔 파모에이트(Oxantel pamoate) 0.1

증류수 balance

본 발명이 여기에 자세히 설명되는 동안, 상기 실시예는 오직 목적을 나타내기 위한 것임이 이해되어야 할 것이다. 본 발명의 실시태양의 분자 생물학, 치과 치료, 및 관련된 과목의 당업계의 숙련된 당업자에게 명백한 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 목적이 있다.

<110> Oral Health Australia Pty Ltd <120> Treatment or prevention of infection <130> 81858107TPG <150> AU2010900846 <151> 2010-02-26 <160> 90 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> X can be either G or S <220> <221> VARIANT <222> (18) <223> X can be either S or A <220> <221> VARIANT <222> (23) <223> X can be either S or L <220> <221> VARIANT <222> (24) <223> X can be either L or V <220> <221> VARIANT <222> (26) <223> X can be either A or T <220> <221> VARIANT <222> (27) <223> X can be either T or S <220> <221> VARIANT <222> (29) <223> X can be either V or L <220> <221> VARIANT <222> (36) <223> X can be either D or N <400> 1 Leu Asn Thr Gly Val Xaa Phe Ala Asn Tyr Thr Ala His Gly Ser Glu 1 5 10 15 Thr Xaa Trp Ala Asp Pro Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Gln Xaa Lys Ala Leu 20 25 30 Thr Asn Lys Xaa Lys 35 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> X can be either V or A <400> 2 Phe Asn Gly Gly Ile Ser Leu Xaa Asn Tyr Thr Gly His Gly Ser Glu 1 5 10 15 Thr Ala Trp Gly Thr Ser His Phe Gly Thr Thr His Val Lys Gln Leu 20 25 30 Thr Asn Ser Asn Gln 35 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 3 Val Ser Phe Ala Asn Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 4 Val Gly Phe Ala Asn Tyr Thr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 5 Gly Val Ser Phe Ala Asn Tyr Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 6 Gly Val Gly Phe Ala Asn Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 7 Val Ser Phe Ala Asn Tyr Thr Ala 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 8 Val Gly Phe Ala Asn Tyr Thr Ala 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 9 Glu Thr Ala Trp Ala Asp 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 10 Glu Thr Ser Trp Ala Asp 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 11 Thr Ala Trp Ala Asp Pro 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 12 Thr Ser Trp Ala Asp Pro 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 13 Ser Glu Thr Ala Trp Ala Asp 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 14 Ser Glu Thr Ser Trp Ala Asp 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 15 Glu Thr Ala Trp Ala Asp Pro 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 16 Glu Thr Ser Trp Ala Asp Pro 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 17 Thr Ala Trp Ala Asp Pro Leu 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 18 Thr Ser Trp Ala Asp Pro Leu 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 19 Gly Ser Glu Thr Ala Trp Ala Asp 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 20 Gly Ser Glu Thr Ser Trp Ala Asp 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 21 Ser Glu Thr Ala Trp Ala Asp Pro 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 22 Ser Glu Thr Ser Trp Ala Asp Pro 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 23 Glu Thr Ala Trp Ala Asp Pro Leu 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 24 Glu Thr Ser Trp Ala Asp Pro Leu 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 25 Thr Ala Trp Ala Asp Pro Leu Leu 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 26 Thr Ser Trp Ala Asp Pro Leu Leu 1 5 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> X can be either G or S <220> <221> VARIANT <222> (18) <223> X can be either S or A <220> <221> VARIANT <222> (23) <223> X can be either S or L <400> 27 Leu Asn Thr Gly Val Xaa Phe Ala Asn Tyr Thr Ala His Gly Ser Glu 1 5 10 15 Thr Xaa Trp Ala Asp Pro Xaa 20 <210> 28 <211> 36 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> X can be either G or S <220> <221> VARIANT <222> (17) <223> X can be either S or A <220> <221> VARIANT <222> (22) <223> X can be either S or L <220> <221> VARIANT <222> (23) <223> X can be either L or V <220> <221> VARIANT <222> (25) <223> X can be either A or T <220> <221> VARIANT <222> (26) <223> X can be either T or S <220> <221> VARIANT <222> (28) <223> X can be either V or L <220> <221> VARIANT <222> (35) <223> X can be either D or N <400> 28 Asn Thr Gly Val Xaa Phe Ala Asn Tyr Thr Ala His Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Xaa Trp Ala Asp Pro Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Gln Xaa Lys Ala Leu Thr 20 25 30 Asn Lys Xaa Lys 35 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> X can be either G or S <220> <221> VARIANT <222> (14) <223> X can be either S or A <220> <221> VARIANT <222> (19) <223> X can be either S or L <220> <221> VARIANT <222> (20) <223> X can be either L or V <400> 29 Val Xaa Phe Ala Asn Tyr Thr Ala His Gly Ser Glu Thr Xaa Trp Ala 1 5 10 15 Asp Pro Xaa Xaa 20 <210> 30 <211> 22 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 30 Leu Asn Thr Gly Val Ser Phe Ala Asn Tyr Thr Ala His Gly Ser Glu 1 5 10 15 Thr Ala Trp Ala Asp Pro 20 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> X can be either V or A <400> 31 Phe Asn Gly Gly Ile Ser Leu Xaa Asn Tyr Thr Gly His Gly Ser Glu 1 5 10 15 Thr Ala Trp Gly Thr Ser His 20 <210> 32 <211> 36 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> X can be either V or A <400> 32 Asn Gly Gly Ile Ser Leu Xaa Asn Tyr Thr Gly His Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Ser His Phe Gly Thr Thr His Val Lys Gln Leu Thr 20 25 30 Asn Ser Asn Gln 35 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> X can be either V or A <400> 33 Ile Ser Leu Xaa Asn Tyr Thr Gly His Gly Ser Glu Thr Ala Trp Gly 1 5 10 15 Thr Ser His Phe 20 <210> 34 <211> 21 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 34 Phe Asn Gly Gly Ile Ser Leu Ala Asn Tyr Thr Gly His Gly Ser Glu 1 5 10 15 Thr Ala Trp Gly Thr 20 <210> 35 <211> 362 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 35 Ala Asn Glu Ala Lys Val Val Leu Ala Ala Asp Asn Val Trp Gly Asp 1 5 10 15 Asn Thr Gly Tyr Gln Phe Leu Leu Asp Ala Asp His Asn Thr Phe Gly 20 25 30 Ser Val Ile Pro Ala Thr Gly Pro Leu Phe Thr Gly Thr Ala Ser Ser 35 40 45 Asn Leu Tyr Ser Ala Asn Phe Glu Tyr Leu Ile Pro Ala Asn Ala Asp 50 55 60 Pro Val Val Thr Thr Gln Asn Ile Ile Val Thr Gly Gln Gly Glu Val 65 70 75 80 Val Ile Pro Gly Gly Val Tyr Asp Tyr Cys Ile Thr Asn Pro Glu Pro 85 90 95 Ala Ser Gly Lys Met Trp Ile Ala Gly Asp Gly Gly Asn Gln Pro Ala 100 105 110 Arg Tyr Asp Asp Phe Thr Phe Glu Ala Gly Lys Lys Tyr Thr Phe Thr 115 120 125 Met Arg Arg Ala Gly Met Gly Asp Gly Thr Asp Met Glu Val Glu Asp 130 135 140 Asp Ser Pro Ala Ser Tyr Thr Tyr Thr Val Tyr Arg Asp Gly Thr Lys 145 150 155 160 Ile Lys Glu Gly Leu Thr Ala Thr Thr Phe Glu Glu 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31 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 50 gactcgagac ctccgttagg caaatcc 27 <210> 51 <211> 41 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 51 ccgtattgtc tccccatttg tccttattag tgagtgcttt c 41 <210> 52 <211> 37 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 52 cactaataag gacaaatggg gagacaatac gggttac 37 <210> 53 <211> 51 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 53 catggatctg agaccgcatg ggctgatcca cttttcttgt tggatgccga t 51 <210> 54 <211> 62 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 54 ccatggcttt gaataccgga gtcagctttg caaactatac agcgcatgga tctgagaccg 60 ca 62 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 55 ctcgaggaat gattcggaaa gtgtt 25 <210> 56 <211> 53 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 56 ccatggctga ttatagctgg aattcccagg tagtcagctt tgcaaactat aca 53 <210> 57 <211> 52 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 57 ctttgcaaac tatacagcgc atggatctga gaccgcatgg gctgatccac tt 52 <210> 58 <211> 52 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 58 atgggctgat ccacttctga attcttattg gggcgagatc ggcaatatta cc 52 <210> 59 <211> 52 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 59 gatcggcaat attacccata ttggtgctca ttacgcttgg ggagacaata cg 52 <210> 60 <211> 52 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 60 ctcgagacct ccgttaggca aatccaatgc cggtgttatc agatagttgt ca 52 <210> 61 <211> 1706 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 61 Met Lys Asn Leu Asn Lys Phe Val Ser Ile Ala Leu Cys Ser Ser Leu 1 5 10 15 Leu Gly Gly Met Ala Phe Ala Gln Gln Thr Glu Leu Gly Arg Asn Pro 20 25 30 Asn Val Arg Leu Leu Glu Ser Thr Gln Gln Ser Val Thr Lys Val Gln 35 40 45 Phe Arg Met Asp Asn Leu Lys Phe Thr Glu Val Gln Thr Pro Lys Gly 50 55 60 Ile Gly Gln Val Pro Thr Tyr Thr Glu Gly Val Asn Leu Ser Glu Lys 65 70 75 80 Gly Met Pro Thr Leu Pro Ile Leu Ser Arg Ser Leu Ala Val Ser Asp 85 90 95 Thr Arg Glu Met Lys Val Glu Val Val Ser Ser Lys Phe Ile Glu Lys 100 105 110 Lys Asn Val Leu Ile Ala Pro Ser Lys Gly Met Ile Met Arg Asn 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Asn Pro Val Gln Asn Leu Thr Gly Ser Ala Val Gly Gln Lys 1380 1385 1390 Val Thr Leu Lys Trp Asp Ala Pro Asn Gly Thr Pro Asn Pro Asn Pro 1395 1400 1405 Gly Thr Thr Thr Leu Ser Glu Ser Phe Glu Asn Gly Ile Pro Ala Ser 1410 1415 1420 Trp Lys Thr Ile Asp Ala Asp Gly Asp Gly Asn Asn Trp Thr Thr Thr 1425 1430 1435 1440 Pro Pro Pro Gly Gly Thr Ser Phe Ala Gly His Asn Ser Ala Ile Cys 1445 1450 1455 Val Ser Ser Ala Ser Tyr Ile Asn Phe Glu Gly Pro Gln Asn Pro Asp 1460 1465 1470 Asn Tyr Leu Val Thr Pro Glu Leu Ser Leu Pro Asn Gly Gly Thr Leu 1475 1480 1485 Thr Phe Trp Val Cys Ala Gln Asp Ala Asn Tyr Ala Ser Glu His Tyr 1490 1495 1500 Ala Val Tyr Ala Ser Ser Thr Gly Asn Asp Ala Ser Asn Phe Ala Asn 1505 1510 1515 1520 Ala Leu Leu Glu Glu Val Leu Thr Ala Lys Thr Val Val Thr Ala Pro 1525 1530 1535 Glu Ala Ile Arg Gly Thr Arg Val Gln Gly Thr Trp Tyr Gln Lys Thr 1540 1545 1550 Val Gln Leu Pro Ala Gly Thr Lys Tyr Val Ala Phe Arg His Phe Gly 1555 1560 1565 Cys Thr Asp Phe Phe Trp Ile Asn Leu Asp Asp Val Glu Ile Lys Ala 1570 1575 1580 Asn Gly Lys Arg Ala Asp Phe Thr Glu Thr Phe Glu Ser Ser Thr His 1585 1590 1595 1600 Gly Glu Ala Pro Ala Glu Trp Thr Thr Ile Asp Ala Asp Gly Asp Gly 1605 1610 1615 Gln Gly Trp Leu Cys Leu Ser Ser Gly Gln Leu Gly Trp Leu Thr Ala 1620 1625 1630 His Gly Gly Thr Asn Val Val Ala Ser Phe Ser Trp Asn Gly Met Ala 1635 1640 1645 Leu Asn Pro Asp Asn Tyr Leu Ile Ser Lys Asp Val Thr Gly Ala Thr 1650 1655 1660 Lys Val Lys Tyr Tyr Tyr Ala Val Asn Asp Gly Phe Pro Gly Asp His 1665 1670 1675 1680 Tyr Ala Val Met Ile Ser Lys Thr Gly Thr Asn Ala Gly Asp Phe Thr 1685 1690 1695 Val Val Phe Glu Glu Thr Pro Asn Gly Ile Asn Lys Gly Gly Ala Arg 1700 1705 1710 Phe Gly Leu Ser Thr Glu Ala Asn Gly Ala Lys Pro Gln Ser Val Trp 1715 1720 1725 Ile Glu Arg Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly Thr Lys Tyr Val Ala Phe 1730 1735 1740 Arg His Tyr Asn Cys Ser Asp Leu Asn Tyr Ile Leu Leu Asp Asp Ile 1745 1750 1755 1760 Gln Phe Thr Met Gly Gly Ser Pro Thr Pro Thr Asp Tyr Thr Tyr Thr 1765 1770 1775 Val Tyr Arg Asp Gly Thr Lys Ile Lys Glu Gly Leu Thr Glu Thr Thr 1780 1785 1790 Phe Glu Glu Asp Gly Val Ala Thr Gly Asn His Glu Tyr Cys Val Glu 1795 1800 1805 Val Lys Tyr Thr Ala Gly Val Ser Pro Lys Glu Cys Val Asn Val Thr 1810 1815 1820 Ile Asn Pro Thr Gln Phe Asn Pro Val Gln Asn Leu Thr Ala Glu Gln 1825 1830 1835 1840 Ala Pro Asn Ser Met Asp Ala Ile Leu Lys Trp Asn Ala Pro Ala Ser 1845 1850 1855 Lys Arg Ala Glu Val Leu Asn Glu Asp Phe Glu Asn Gly Ile Pro Ala 1860 1865 1870 Ser Trp Lys Thr Ile Asp Ala Asp Gly Asp Gly Asn Asn Trp Thr Thr 1875 1880 1885 Thr Pro Pro Pro Gly Gly Ser Ser Phe Ala Gly His Asn Ser Ala Ile 1890 1895 1900 Cys Val Ser Ser Ala Ser Tyr Ile Asn Phe Glu Gly Pro Gln Asn Pro 1905 1910 1915 1920 Asp Asn Tyr Leu Val Thr Pro Glu Leu Ser Leu Pro Gly Gly Gly Thr 1925 1930 1935 Leu Thr Phe Trp Val Cys Ala Gln Asp Ala Asn Tyr Ala Ser Glu His 1940 1945 1950 Tyr Ala Val Tyr Ala Ser Ser Thr Gly Asn Asp Ala Ser Asn Phe Ala 1955 1960 1965 Asn Ala Leu Leu Glu Glu Val Leu Thr Ala Lys Thr Val Val Thr Ala 1970 1975 1980 Pro Glu Ala Ile Arg Gly Thr Arg Val Gln Gly Thr Trp Tyr Gln Lys 1985 1990 1995 2000 Thr Val Gln Leu Pro Ala Gly Thr Lys Tyr Val Ala Phe Arg His Phe 2005 2010 2015 Gly Cys Thr Asp Phe Phe Trp Ile Asn Leu Asp Asp Val Val Ile Thr 2020 2025 2030 Ser Gly Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Tyr Thr Ile Tyr Arg Asn Asn Thr 2035 2040 2045 Gln Ile Ala Ser Gly Val Thr Glu Thr Thr Tyr Arg Asp Pro Asp Leu 2050 2055 2060 Ala Thr Gly Phe Tyr Thr Tyr Gly Val Lys Val Val Tyr Pro Asn Gly 2065 2070 2075 2080 Glu Ser Ala Ile Glu Thr Ala Thr Leu Asn Ile Thr Ser Leu Ala Asp 2085 2090 2095 Val Thr Ala Gln Lys Pro Tyr Thr Leu Thr Val Val Gly Lys Thr Ile 2100 2105 2110 Thr Val Thr Cys Gln Gly Glu Ala Met Ile Tyr Asp Met Asn Gly Arg 2115 2120 2125 Arg Leu Ala Ala Gly Arg Asn Thr Val Val Tyr Thr Ala Gln Gly Gly 2130 2135 2140 His Tyr Ala Val Met Val Val Val Asp Gly Lys Ser Tyr Val Glu Lys 2145 2150 2155 2160 Leu Ala Val Lys <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> X can be either S or Y <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> X can be either Y or S <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> X can be either P or S <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> X can be either K or Q <220> <221> VARIANT <222> (8) <223> X can be either I or V <400> 64 Asp Xaa Xaa Trp Asn Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 65 Asn Ser Tyr Trp Gly Glu Asp 1 5 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> X can be either V or I <400> 66 Ile Gly Asn Xaa Thr His Ile Gly Ala His Tyr 1 5 10 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 67 Glu Gly Gly Pro Ser Ala Asp Asn 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> X can be either N or D <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> X can be either S or Y <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> X can be either S or P <400> 68 Xaa Gln Xaa Trp Ala Xaa Pro 1 5 <210> 69 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Ile Leu Lys Trp Asn Ala Pro 20 <210> 75 <211> 24 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 75 Pro Val Gln Asn Leu Thr Gln Trp Ser Val Ser Gly Gln Thr Val Thr 1 5 10 15 Leu Thr Trp Gln Ala Pro Ala Ser 20 <210> 76 <211> 27 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 76 Tyr Thr Tyr Thr Val Tyr Arg Asp Gly Thr Lys Ile Lys Glu Gly Leu 1 5 10 15 Thr Glu Thr Thr Phe Glu Glu Asp Gly Val Ala 20 25 <210> 77 <211> 27 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 77 Tyr Thr Tyr Thr Val Tyr Arg Asp Asn Val Val Ile Ala Gln Asn Leu 1 5 10 15 Thr Ala Thr Thr Phe Asn Gln Glu Asn Val Ala 20 25 <210> 78 <211> 28 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 78 Tyr Thr Tyr Thr Val Tyr Arg Asp Gly Thr Lys Ile Lys Glu Gly Leu 1 5 10 15 Thr Ala Glu Thr Thr Phe Glu Glu Asp Gly Val Ala 20 25 <210> 79 <211> 16 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <220> <221> VARIANT <222> (6)..(7) <223> X can be NP or NPNP or NPNPNP or NPNPNPNP or NPNPNPNPNP or NPNPNPNPNPNP <400> 79 Pro Asn Gly Thr Pro Xaa Xaa Gly Thr Thr Thr Leu Ser Glu Ser Phe 1 5 10 15 <210> 80 <211> 325 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 80 Gly Gly Pro Lys Thr Ala Pro Ser Val Thr His Gln Ala Val Gln Lys 1 5 10 15 Gly Ile Arg Thr Ser Lys Ala Lys Asp Leu Arg Asp Pro Ile Pro Ala 20 25 30 Gly Met Ala Arg Ile Ile Leu Glu Ala His Asp Val Trp Glu Asp Gly 35 40 45 Thr Gly Tyr Gln Met Leu Trp Asp Ala Asp His Asn Gln Tyr Gly Ala 50 55 60 Ser Ile Pro Glu Glu Ser Phe Trp Phe Ala Asn Gly Thr Ile Pro Ala 65 70 75 80 Gly Leu Tyr Asp Pro Phe Glu Tyr Lys Val Pro Val Asn Ala Asp Ala 85 90 95 Ser Phe Ser Pro Thr Asn Phe Val Leu Asp Gly Thr Ala Ser Ala Asp 100 105 110 Ile Pro Ala Gly Thr Tyr Asp Tyr Val Ile Ile Asn Pro Asn Pro Gly 115 120 125 Ile Ile Tyr Ile Val Gly Glu Gly Val Ser Lys Gly Asn Asp Tyr Val 130 135 140 Val Glu Ala Gly Lys Thr Tyr His Phe Thr Val Gln Arg Gln Gly Pro 145 150 155 160 Gly Asp Ala Ala Ser Val Val Val Thr Gly Glu Gly Gly Asn Glu Phe 165 170 175 Ala Pro Val Gln Asn Leu Gln Trp Ser Val Ser Gly Gln Thr Val Thr 180 185 190 Leu Thr Trp Gln Ala Pro Ala Ser Asp Lys Arg Thr Tyr Val Leu Asn 195 200 205 Glu Ser Phe Asp Thr Gln Thr Leu Pro Asn Gly Trp Thr Met Ile Asp 210 215 220 Ala Asp Gly Asp Gly His Asn Trp Leu Ser Thr Ile Asn Val Tyr Asn 225 230 235 240 Thr Ala Thr His Thr Gly Asp Gly Ala Met Phe Ser Lys Ser Trp Thr 245 250 255 Ala Ser Ser Gly Ala Lys Ile Asp Leu Ser Pro Asp Asn Tyr Leu Val 260 265 270 Thr Pro Lys Phe Thr Val Pro Glu Asn Gly Lys Leu Ser Tyr Trp Val 275 280 285 Ser Ser Gln Glu Pro Trp Thr Asn Glu His Tyr Gly Val Phe Leu Ser 290 295 300 Thr Thr Gly Asn Glu Ala Ala Asn Phe Thr Ile Lys Leu Leu Glu Glu 305 310 315 320 Thr Leu Gly Ser Gly 325 <210> 81 <211> 260 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 81 Ala Pro Ala Pro Tyr Gln Glu Arg Thr Ile Asp Leu Ser Ala Tyr Ala 1 5 10 15 Gly Gln Gln Val Tyr Leu Ala Phe Arg His Phe Gly Cys Thr Gly Ile 20 25 30 Phe Arg Leu Tyr Leu Asp Asp Val Ala Val Ser Gly Glu Gly Ser Ser 35 40 45 Asn Asp Tyr Thr Tyr Thr Val Tyr Arg Asp Asn Val Val Ile Ala Gln 50 55 60 Asn Leu Thr Ala Thr Thr Phe Asn Gln Glu Asn Val Ala Pro Gly Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Tyr Cys Val Glu Val Lys Tyr Thr Ala Gly Val Ser Pro Lys 85 90 95 Val Cys Lys Asp Val Thr Val Glu Gly Ser Asn Glu Phe Ala Pro Val 100 105 110 Gln Asn Leu Thr Gly Ser Ala Val Gly Gln Lys Val Thr Leu Lys Trp 115 120 125 Asp Ala Pro Asn Gly Thr Pro Asn Pro Asn Pro Gly Thr Thr Thr Leu 130 135 140 Ser Glu Ser Phe Glu Asn Gly Ile Pro Ala Ser Trp Lys Thr Ile Asp 145 150 155 160 Ala Asp Gly Asp Gly Asn Asn Trp Thr Thr Thr Pro Pro Pro Gly Gly 165 170 175 Ser Ser Phe Ala Gly His Asn Ser Ala Ile Cys Val Ser Ser Ala Ser 180 185 190 Tyr Ile Asn Phe Glu Gly Pro Gln Asn Pro Asp Asn Tyr Leu Val Thr 195 200 205 Pro Glu Leu Ser Leu Pro Asn Gly Gly Thr Leu Thr Phe Trp Val Cys 210 215 220 Ala Gln Asp Ala Asn Tyr Ala Ser Glu His Tyr Ala Val Tyr Ala Ser 225 230 235 240 Ser Thr Gly Asn Asp Ala Ser Asn Phe Ala Asn Ala Leu Leu Glu Glu 245 250 255 Val Leu Thr Ala 260 <210> 82 <211> 258 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 82 Pro Gln Ser Val Trp Ile Glu Arg Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly Thr 1 5 10 15 Lys Tyr Val Ala Phe Arg His Tyr Asn Cys Ser Asp Leu Asn Tyr Ile 20 25 30 Leu Leu Asp Asp Ile Gln Phe Thr Met Gly Gly Ser Pro Thr Pro Thr 35 40 45 Asp Tyr Thr Tyr Thr Val Tyr Arg Asp Gly Thr Lys Ile Lys Glu Gly 50 55 60 Leu Thr Glu Thr Thr Phe Glu Glu Asp Gly Val Ala Thr Gly Asn His 65 70 75 80 Glu Tyr Cys Val Glu Val Lys Tyr Thr Ala Gly Val Ser Pro Lys Glu 85 90 95 Cys Val Asn Val Thr Val Asp Pro Val Gln Phe Asn Pro Val Gln Asn 100 105 110 Leu Thr Gly Ser Ala Val Gly Gln Lys Val Thr Leu Lys Trp Asp Ala 115 120 125 Pro Asn Gly Thr Pro Asn Pro Asn Pro Gly Thr Thr Thr Leu Ser Glu 130 135 140 Ser Phe Glu Asn Gly Ile Pro Ala Ser Trp Lys Thr Ile Asp Ala Asp 145 150 155 160 Gly Asp Gly Asn Asn Trp Thr Thr Thr Pro Pro Pro Gly Gly Thr Ser 165 170 175 Phe Ala Gly His Asn Ser Ala Ile Cys Val Ser Ser Ala Ser Tyr Ile 180 185 190 Asn Phe Glu Gly Pro Gln Asn Pro Asp Asn Tyr Leu Val Thr Pro Glu 195 200 205 Leu Ser Leu Pro Asn Gly Gly Thr Leu Thr Phe Trp Val Cys Ala Gln 210 215 220 Asp Ala Asn Tyr Ala Ser Glu His Tyr Ala Val Tyr Ala Ser Ser Thr 225 230 235 240 Gly Asn Asp Ala Ser Asn Phe Ala Asn Ala Leu Leu Glu Glu Val Leu 245 250 255 Thr Ala <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 83 Pro Tyr Gln Pro Val Ser Asn Leu Thr Ala Thr Thr Gln Gly Gln 1 5 10 15 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 84 Glu Gly Leu Thr Ala Thr Thr Phe Glu Glu Asp Gly Val Ala Ala 1 5 10 15 <210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 85 Gly Thr Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Asn Pro Gly 1 5 10 15 Thr <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 86 Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe 1 5 10 <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> bos taurus <400> 87 Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile 1 5 10 15 Val <210> 88 <211> 29 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 88 Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr 1 5 10 15 Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu 20 25 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> bos taurus <400> 89 Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe 1 5 10 <210> 90 <211> 21 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 90 Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser 1 5 10 15 Thr Pro Thr Thr Glu 20

Claims

P. 진지발리스(P. gingivalis)에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원을 포함하는, 개체의 구강 조직에서 P. 진지발리스의 존재와 관련된 치주병(periodontal disease) 치료를 위한 약학적 조성물로서,
상기 면역원은 P. 진지발리스 세포, 이의 단편, 이의 대사물질(metabolite) 또는 P. 진지발리스로부터 유도된 재조합 생성물이고;
상기 개체는 개체의 구강 조직(oral tissue)의 염증을 억제하기 위한 항염증제(anti-inflammatory agent) 및 개체의 구강 조직에서 미생물을 제거하기 위한 항미생물제(antimicrobial agent)로부터 선택되는 제제에 의해 미리 처리되는 것에 의해 면역원 투여 이전에 개체의 구강 조직에서 염증이 감소되게 함으로써, 상기 면역원에 대한 Th2 면역 반응을 형성하도록 조절되어 있는, 약학적 조성물.
P. 진지발리스(P. gingivalis)에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원을 포함하는, 개체의 구강 조직에서 P. 진지발리스의 존재와 관련된 치주병 치료를 위한 약학적 조성물로서,
상기 면역원은 P. 진지발리스 세포, 이의 단편, 이의 대사물질 또는 P. 진지발리스로부터 유도된 재조합 생성물이고;
상기 치료는 개체의 구강 조직의 염증을 억제하기 위한 항염증제 및 개체의 구강 조직에서 미생물을 제거하기 위한 항미생물제로부터 선택되는 제제 이후에 상기 면역원을 투여하는 것을 포함하는, 약학적 조성물.
개체의 구강 조직에서 P. 진지발리스의 존재와 관련된 치주병 치료를 위한 약학적 조성물로서,
(i) P. 진지발리스(P. gingivalis)에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원, 여기서 상기 면역원은 P. 진지발리스 세포, 이의 단편, 이의 대사물질 또는 P. 진지발리스로부터 유도된 재조합 생성물임; 및
(ii) 개체의 구강 조직의 염증을 억제하기 위한 항염증제 및 개체의 구강 조직에서 미생물을 제거하기 위한 항미생물제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제;를 포함하고,
상기 치료는 상기 제제 투여 이후에 상기 면역원을 투여하는 것을 포함하는,
약학적 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원의 투여는 상기 제제를 투여한 지 1 내지 2 주후인 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원의 투여는 개체의 구강 조직에 염증이 없는 경우인 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원의 투여는 주로 Th2 반응인 항체 반응을 유도하는 것인 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 추가적으로 치과 절차(dental procedure)에 처리되는 것을 포함하는 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 치과 절차는 변연 절제술(debridement), 스케일링 및 치근면활택술(root planning)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치주병은 P. 진지발리스 (P. gingivalis)의 감염과 관련된 것인 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 항염증제인 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 항미생물제인 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 항미생물제는 푸마레이트 환원효소(fumarate reductase)의 억제제인 조성물.
제 12항에 있어서, 상기 항미생물제는 옥산텔(oxantel), 모란텔(morantel) 및 티아벤다졸(thiabendazole)로부터 선택되는 것인 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원은 P. 진지발리스 세포, 이의 단편, 또는 P. 진지발리스로부터 유도된 재조합 생성물인 조성물.
제 14항에 있어서, P. 진지발리스로부터 유도된 상기 재조합 생성물은 키메라(chimeric) 또는 융합 단백질인 조성물.
제 15항에 있어서, 상기 P. 진지발리스 키메라 또는 융합 단백질은 KAS1-KsA1 및 KAS2-KLA1으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원 또는 제제, 또는 면역원 및 제제가 전신적(systemically)으로 투여되는 조성물.
제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원 또는 제제, 또는 면역원 및 제제가 구강 조직에 직접적으로 투여되는 조성물.
제 18항에 있어서, 상기 구강 조직은 구강 점막(oral mucosa)인 조성물.
P. 진지발리스에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원을 포함하는 조성물을 포함하는, 개체의 구강 조직에서 P. 진지발리스의 존재와 관련된 치주병 치료를 위한 약학적 키트로서,
상기 면역원은 P. 진지발리스 세포, 이의 단편, 이의 대사물질 또는 P. 진지발리스로부터 유도된 재조합 생성물이고;
상기 개체는 개체의 구강 조직의 염증을 억제하기 위한 항염증제 및 개체의 구강 조직에서 미생물을 제거하기 위한 항미생물제로부터 선택되는 제제에 의해 미리 처리되는 것에 의해 면역원 투여 이전에 개체의 구강 조직에서 염증이 감소되게 함으로써, 상기 면역원에 대한 Th2 면역 반응을 형성하도록 조절되어 있는, 약학적 키트.
P. 진지발리스(P. gingivalis)에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원을 포함하는 조성물을 포함하는, 개체의 구강 조직에서 P. 진지발리스의 존재와 관련된 치주병 치료를 위한 약학적 키트로서,
상기 면역원은 P. 진지발리스 세포, 이의 단편, 이의 대사물질 또는 P. 진지발리스로부터 유도된 재조합 생성물이고;
상기 치료는 개체의 구강 조직의 염증을 억제하기 위한 항염증제 및 개체의 구강 조직에서 미생물을 제거하기 위한 항미생물제로부터 선택되는 제제 이후에 상기 면역원을 투여하는 것을 포함하는, 약학적 키트.
개체의 구강 조직에서 P. 진지발리스의 존재와 관련된 치주병 치료를 위한 약학적 키트로서,
(i) P. 진지발리스(P. gingivalis)에 대한 면역 반응을 유도하는 면역원을 포함하는 조성물, 여기서 상기 면역원은 P. 진지발리스 세포, 이의 단편, 이의 대사물질 또는 P. 진지발리스로부터 유도된 재조합 생성물임; 및
(ii) 개체의 구강 조직의 염증을 억제하기 위한 항염증제 및 개체의 구강 조직에서 미생물을 제거하기 위한 항미생물제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 포함하는 조성물을 포함하고,
상기 치료는 상기 제제 투여 이후에 상기 면역원을 투여하는 것을 포함하는,
약학적 키트.
제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 투여한지 1 내지 2 주 후에 면역원을 투여하는 설명서를 더 포함하는 키트.
제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 개체의 구강 조직에 염증이 없는 경우에 면역원을 투여하는 설명서를 더 포함하는 키트.
제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원의 투여는 주로 Th2 반응인 항체 반응을 유도하는 것인 키트.
제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에 치과 절차(dental procedure)를 추가적으로 수행하는 설명서를 더 포함하는 것인 키트.
제 26항에 있어서, 상기 치과 절차는 변연 절제술(debridement), 스케일링 및 치근면활택술(root planning)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 키트.
제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치주병은 P. 진지발리스 (P. gingivalis)의 감염과 관련된 것인 키트.
제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 항염증제인 키트.
제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 항미생물제인 키트.
제 30항에 있어서, 상기 항미생물제는 푸마레이트 환원효소(fumarate reductase)의 억제제인 키트.
제 31항에 있어서, 상기 항미생물제는 옥산텔(oxantel), 모란텔(morantel) 및 티아벤다졸(thiabendazole)로부터 선택되는 것인 키트.
제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원은 P. 진지발리스 세포, 이의 단편 또는 이로부터 유도된 재조합 생성물인 키트.
제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, P. 진지발리스로부터 유도된 상기 재조합 생성물은 키메라(chimeric) 또는 융합 단백질인 키트.
제 34항에 있어서, 상기 P. 진지발리스 키메라 또는 융합 단백질은 KAS1-KsA1 및 KAS2-KLA1으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 키트.
제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원 또는 제제, 또는 면역원 및 제제가 전신적(systemically)으로 투여되는 것인 키트.
제 20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원 또는 제제, 또는 면역원 및 제제가 구강 조직에 직접적으로 투여되는 것인 키트.
제 37항에 있어서, 상기 구강 조직은 구강 점막(oral mucosa)인 키트.