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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft das Gebiet von Vakzinen, die zur Krebstherapie
verwendet werden.
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Hintergrund
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Eine
Vakzine ist eine der wirksamsten und sichersten, nicht-toxischen
und wirtschaftlichen Waffen, um Erkrankungen vorzubeugen und die
Ausbreitung einer Erkrankung zu kontrollieren. Herkömmliche
Vakzinen sind eine Form von Immunprophylaxe, die verabreicht wird,
bevor eine Erkrankung auftritt, um Immunschutz durch Bildung eines
starken immunologischen Gedächtnisses
im Wirt gegen ein spezifisches Antigen zu gewähren. Das primäre Ziel
einer Impfung ist, die adaptive spezifische Immunantwort zu aktivieren,
primär
um B- und T-Lymphozyten gegen ein oder mehrere spezifische Antigene,
die mit der Erkrankung oder dem Krankheitserreger assoziiert sind,
zu bilden.
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Demähnlich zielen
Krebsvakzinen darauf ab, Immunantworten gegen mit Krebstumor assoziierte Antigene
zu bilden. Krebserkrankungen können
immunogen sein und Immunantworten im Wirt aktivieren, die in der
Lage sind, die Erkrankung zu bekämpfen
und Tumorrückbildung
zu bewirken. Krebs kann jedoch gleichzeitig spezifisch und nicht-spezifisch
immunsuppressiv wirken und kann sich dem Immunsystem des Wirts entziehen.
Zahlreiche Protein/Glykoprotein-Tumor-assoziierte Antigene wurden
bereits identifiziert und mit bestimmten Krebstypen in Verbindung
gebracht. MAGE-3, MAGE-1, gp100, TRP-2, Tyrosinase, MART-1, β-HCG, CEA,
Ras, B-Catenin, gp43, GAGE-1, BAGE-1, PSA, MUC-1, 2, 3 und HSP-70
sind nur einige wenige Beispiele hierfür.
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Zahlreiche
Ansätze
wurden im Rahmen der Immunisierung von Krebspatienten mit Tumor-assoziierten
Antigenen (TAAs) bewertet. Vakzinen in klinischer Verwendung fallen
in mehrere Kategorien, die durch ihre zellulären Komponenten bestimmt sind und
von ganzen Zellen bis zu immunogenen Peptiden reichen. Vakzinen
aus ganzen Zellen und Zelllysat-Vakzinen können je nach Ursprung der Krebszellen
im Wirt autologe oder allogene Vakzinen sein. Autologe Krebsvakzinen
sind im Allgemeinen klinisch nicht erfolgreich, außer sie
wurden modifiziert. Da sie Patienten-spezifisch sind, sind sie auch
kostspielig und auf jene Patienten eingeschränkt, von denen Krebszellen
in ausreichender Menge erhalten werden können, um eine Einzelzellen-Suspension
zu bilden. Darüber
hinaus ist die von Natur aus eingeschränkte Zahl an Zellen hinsichtlich
zahlreicher Impfungen problematisch und machen eine autologe Formulierung
zur Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen in frühen Stadien
unpraktisch. Manche dieser Probleme können mit allogenen Ganzzellen-Vakzinen
oder gentechnisch veränderten
Ganzzellen-Vakzinen gelöst
werden. Diese Verfahren können
jedoch mühsam
und zeitaufwändig
sein. Darüber hinaus
müssen
gentechnisch veränderte
Ganzzellen-Vakzinen auf Antigenität und Immunogenität getestet
werden. Aktuelle Tiertumormodelle sind für Krebstumoren in Menschen
nicht wirklich repräsentativ.
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Natürliche und
rekombinante Krebsprotein-Antigenvakzinen sind Untereinheits-Vakzinen.
Anders als Ganzzellen-Vakzinen enthalten diese Untereinheits-Vakzinen
definierte immunogene Antigene in standardisierten Konzentrationen.
Das zentrale Problem bei solchen Vakzinen ist es, das richtige Adjuvans
und Zufuhrsystems zu finden. Darüber
hinaus ist die Reinigung von natürlichen
oder rekombinanten Tumorantigenen mühsam und logistisch gesehen nicht
immer praktisch. Menschliche Krebsvakzinen erfordern das Kultivieren
von Tumorzellen, das Reinigen von Tumorantigenen oder die Herstellung
spezifischer Peptide oder rekombinanter Proteine. Weiters gibt es
Probleme in Verbindung mit Antigenpräsentation und Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC-)Polymorphismus
im Wirt.
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Vakzinen,
die für
die Tumorantigene kodierende Nucleinsäure umfassen, schaffen für einige dieser
Probleme eher Abhilfe als Vakzinen, die das Antigen selbst umfassen.
Die normalen (nicht blutbildenden) Zellen im Wirt können Tumorantigene
exprimieren und dem Immunsystem präsentieren. Im Allgemeinen werden
die viralen Proteine, wenn ein zytopathisches Virus eine normale
Zelle des Wirts infiziert, endogen verarbeitet und an der Zelloberfläche oder
in Fragmenten durch MHC-Moleküle
prä sentiert.
Fremde, definierte Nucleinsäure,
die in normale Zellen transfiziert und von diesen exprimiert wird, kann
virale Infektionen nachahmen.
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Erst
jüngst
erwiesen sich DNA-Vakzinen als viel versprechender Ansatz für die Immunisierung gegen
zahlreiche verschiedene Infektionskrankheiten. M.L. Michel et al.,
K. Huygen et al. und B. Wang et al. Die Zufuhr von nackter DNA,
die mikrobielle Antigen-Gene enthält, kann Antigen-spezifische
Immunantworten im Wirt induzieren. Die Induktion von Antigen-spezifischen
Immunantworten unter Verwendung von DNA-basierten Vakzinen zeigte
gewisse viel versprechende Wirkungen. J.A. Wolff et al. Jüngste Studien
zeigten die mögliche
Durchführbarkeit
von Immunisierung unter Verwendung einer DNA-vermittelten Vakzine
für CEA
und MUC-1. R. M. Corry et al. und R.A. Graham et al.
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Es
zeigte sich, dass DNA-basierte Impfung im Vergleich zu Lebendvirusimpfstoffen
einen höheren
Grad an Kontrolle über
Antigen-Expression, Toxizität
und Pathogenität
aufweist. Obwohl jedoch Arbeitvorschriften zu In-vivo-DNA-Impfung
erhältlich sind,
besteht Bedarf an Verbesserungen bei der In-vivo-Zufuhr und Transgen-Expression.
Beispielsweise resultiert das Einführen von DNA in spezifische
Zellen häufig
im Abbau der DNA durch Endosomen oder Lysosomen. Vakzinen, die das
Tumorantigen erfordern, um durch Tumorzellen exprimiert zu werden, können zu
Problemen wie beispielsweise Unterdrückung von Immunantworten oder
geänderten
physiologischen Funktionen führen,
die Antigen-Expression modifizieren, da Tumorzellen zahlreiche Regulationselemente
vom negativen Typ aufweisen. Aktuelle Ansätze von In-vivo-Zufuhr von
DNA mittels retroviraler oder adenoviraler Vektoren weisen Probleme
in Verbindung mit Wirksamkeit, viraler Genintegration, potenzieller
pathogener Aktivität
und Immunantwort auf für
viralen Vektor kodierende Proteine auf. Darüber hinaus kann die DNA in
DNA-Vakzinen in die DNA der Wirtszelle inkorporiert werden, was
es schwierig macht, Produktion des Tumorantigens anzuhalten, wenn
die Behandlung abgeschlossen ist. Manche Liposom-Zufuhrsysteme sind
nicht wünschenswert,
da sie in von blutbildenden Zellen abgeleitete Zellen, wie z.B.
Lymphozyten, inkorporiert werden können.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Immunisierung
gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen, zur Unterdrückung oder Verringerung
von Tumorwachstum und zur Behandlung von Krebs bereit. Die bereitgestellten
Verfahren und Zusammensetzungen können eine Antikörper-Reaktion
durch IgG-, IgM- oder IgA-Moleküle oder
eine zellvermittelte Reaktion durch CD4-, CD8- oder T-Zell-Untermengen
induzieren.
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Die
von der Erfindung bereitgestellten Zusammensetzungen bestehen aus
viralen Liposomen, die Nucleinsäure,
vorzugsweise RNA, die für
ein Tumor-assoziiertes Antigen kodiert, umfassen. Die viralen Liposomen
können
durch die Fusion von HVJ-Reagenzien
mit nichtviralen Reagenzien gebildet werden. Die Nucleinsäure kann
DNA oder RNA sein. Das Tumor-assoziierte Antigen kann jedes beliebige
Antigen sein, von dem bekannt ist, dass es mit Tumoren assoziiert
ist, z.B. MAGE-1, MAGE-3,
gp100, TRP-2, Tyrosinase, MART-1, β-HCG oder HSP-70. Die Zusammensetzungen
der Antigene können
Chimären mit
anderen Molekülen
sein, die Diphtherietoxin, andere immunogene Toxinpeptide oder Helfer-Antigenpeptide
umfassen können.
Die Zusammensetzungen können
andere Komponenten, wie z.B. HMG-1, umfassen, die die Nucleinsäure auf
eine bestimmte Stelle in der Zelle richten oder die Translation
des Tumor-assoziierten Antigens steuern.
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Die
von der Erfindung bereitgestellten Verfahren umfassen die Verabreichung
einer Vakzine, die aus viralen Liposomen besteht, die für ein Tumor-assoziiertes
Antigen kodierende Nucleinsäure umfassen.
Die Vakzine kann subkutan, intradermal, intramuskulär oder in
ein Organ verabreicht werden. Die Vakzine kann auf eine Weise verabreicht
werden, die Expression des Tumor-assoziierten Antigens aus einer
normalen Wirtszelle induziert.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die
Beschreibung dieses Patents enthält
zumindest eine Zeichnung in Farbe. Kopien von diesem Patent mit
Farbzeichnungen werden vom Patent and Trademark Office auf Anfrage
und Bezahlung der erforderlichen Gebühren zur Verfügung gestellt.
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1 ist
ein schematisches Diagramm von HVJ-Liposom plus Plasmid-RNA-Herstellung
und Immunisierung von Mäusen.
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2 ist
eine Analyse von Anti-MAGE-1-IgG (a) und Anti-MAGE-3-IgG (b) in
Seren durch Western-Blot. Die Spuren 1 und 2 zeigen die Resultate der
Analyse an nichtimmunisierten Mäusen.
Die Spuren 3 und 4 zeigen die Resultate der Analyse von Mäusen, die
dreimal in zweiwöchigen
Intervallen entweder mit MAGE-1- oder mit MAGE-3-Vakzine immunisiert
wurden.
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3 ist
eine Schautafel, die die Resultate von Affinitäts-ELISA mit rMAGE-1 zur Detektion
von IgG-Reaktionen bei 1:100-Verdünnung von Seren zeigt. Es wird
die mittlere Absorption in Dreifachversuchen +/- S.E. von allen
Mäusen
zu bestimmten Zeitpunkten gezeigt.
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4.
zeigt IacZ-RNA-Expression in BHK-21-Zellen bei 24 Stunden nach dem
Transfer durch virale Liposomen, die in-vitro-translatierte RNA (A)
oder TE-Puffer ohne RNA (B) enthalten.
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5 zeigt
IacZ-RNA-Expression in Skelettmuskeln von Mäusen an den Tagen 3 (A), 5
(B und C) und 9 (D) nach dem Transfer durch virale Liposomen, die
in-vitro-translatierte RNA enthalten. C ist eine Ansicht mit höherer Vergrößerung als
in B.
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6 zeigt
IacZ-RNA-Expression in Milz nach Injektion von in-vitro-synthetisierter
IacZ-RNA unter Verwendung von HVJ-DC-Liposomen.
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DEFINITIONEN
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HVJ
bedeutet japanisches hämagglutinierendes
Virus (Parainfluenzavirus I).
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Virales
Liposom bezeichnet einen Hybridvektor aus viralen und nichtviralen
Reagenzien. Anionische oder kationische Liposomen werden mit Virus,
vorzugsweise HVJ (Virusstamm der Paramyxovirusfamilie), fusioniert.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
Erfindung stellt neue wirksame Ansätze unter Verwendung eines
viralen Liposomensystems bereit, um Tumorantigen-Nucleinsäuren in
vivo zur Immunisierung des Wirts zuzuführen. Die Erfindung vermeidet
zahlreiche der mühsamen
Verfahren, die in die Vakzinenherstellung eingebunden sind. Qualitätskontrolle
und Reinheit von Plasmid-DNA oder -RNA können leichter überwacht
werden. Fusigene virale Liposomen können ein wirksames Vehikel
bereitstellen, um Nucleinsäure
zu verpacken, zuzuführen
und auf spezifische Ziele zu richten und gleichzeitig gegen Nucleinsäureabbauende
Enzyme in Körperflüssigkeiten
und zytoplasmatischen Organellen zu schützen. Tumorantigen wird im
Gegensatz zu einer Tumorzelle vor einem Hintergrund einer oder mehrerer
normaler Zellen exprimiert. Nucleinsäure-Impfung liefert eine Möglichkeit
zur molekularen immunophysiologischen Manipulation von Antigen-Expression, die ein
nützliches
Werkzeug im Entwurf von Krebsvakzinen darstellen kann. Die von dieser
Erfindung bereitgestellte Vakzine wird nicht in von blutbildenden
Zellen abgeleitete Zellen inkorporiert, wie dies für andere
Liposom-Zufuhrsysteme der Fall ist.
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Die
Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Immunisierung
gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen, zur Unterdrückung oder Verringerung
von Tumorwachstum und zur Behandlung von Krebs bereit. Die bereitgestellten
Verfahren und Zusammensetzungen können eine Antikörperreaktion
(IgG, IgM, IgA) oder eine zellvermittelte Reaktion durch CD4-, CD8-
oder T-Zellen induzieren.
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Die
durch die Erfindung bereitgestellten Zusammensetzungen bestehen
aus vitalen Liposomen, die Nucleinsäure, vorzugsweise RNA, umfassen,
die für
ein Tumorassoziiertes Antigen kodiert. Ein bevorzugtes Verfahren
zur Herstellung der vitalen Liposomen ist, anionische oder kationische
Liposomen mit einem inaktiven Virus, vorzugsweise HVJ, wie in Dzau
et al. und im US-Patent Nr. 5.631.237 beschrieben, zu fusionieren.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Herstellung viraler Liposomen
wird in Beispiel 5 nachstehend beschrieben. Ein schematisches Diagramm
der Herstellung von viralen Liposomen ist in 1 gezeigt.
HVJ-Proteine sind für
ihre Fusionseigenschaften an Zellmembranen von nicht blutbildenden,
zellkernhaltigen Zellen bekannt. Dieser Hybridvektor ermöglicht Targeting
auf normale, nicht blutbildende Zellen und Zufuhr von eingekapselter
Nucleinsäure
in das Zytoplasma von Zellen ohne Lysosom-Endosom-Abbau. Das virale
Liposomsystem kann auch Nucleinsäure
und Proteinmoleküle
zusammen zuführen.
Darüber
hinaus können
gereinigte oder rekombinante Fusionspolypeptide von HVJ anstatt
der gesamten Virushülle
verwendet werden.
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Jede
beliebige Anzahl und Kombination von Nucleinsäuresequenzen, die für TAAs kodieren,
kann in die Vakzine eingebunden werden. Die MAGE-Genfamilienmitglieder
sind Beispiele für
TAAs, die in der Erfindung nützlich
sein würden.
MAGE-1-, MAGE-2- und MAGE-3-Antigene wurden anfänglich in Verbindung mit Melanomen
beschrieben und später
in verschiedenen anderen Krebsarten nachgewiesen. MAGE-1- und MAGE-2-Gene
werden von mehr als 30 % der Melanome und Karzinome, wie z.B. Lungen-,
Brust-, Leber- und Magendarmkrebs, exprimiert, jedoch nicht in normalen
Geweben außer
in Testis. Die MAGE-1- und MAGE-3-Antigene erwiesen sich als immunogen,
exprimiert von zahlreichen verschiedenen Krebsarten beim Menschen,
jedoch nicht von normalen Geweben. Diese Faktoren sind im Gesamtentwurf
einer wirksamen Vakzine gegen zahlreiche Krebsarten von Bedeutung.
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Es
gibt andere MAGE-Genfamilienmitglieder mit ähnlichen Homologien. E. De
Plaen et al. Die Strategie der Verwendung von zwei dominanten immunogenen
MAGE-Familien-Antigenen kann darin von Vorteil sein, dass diese
Immunität
gegenüber
einer breiten Palette von MAGE-Antigenen hervorrufen können, die
von verschiedenen menschlichen Tumoren exprimiert werden. Impfung
mit MAGE-1 und MAGE-3 könnte
aufgrund der Kreuzreaktivität
zwischen MAGE-1 und MAGE-3 Immunantworten gegen Tumoren induzieren,
die eines der Antigene exprimieren. Diese Eigenschaft ist nützlich,
da MAGE-1 und MAGE-3 nicht immer in der-/denselben Tumorbiopsie
oder Tumorzelllinien co-exprimiert werden.
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Nucleinsäuresequenzen,
die für
zahlreiche andere TAAs kodieren, sind in den von der Erfindung bereitgestellten
Vakzinen nützlich.
B-Catenin, TRP-2, TRP-1, gp 100 p17 mel, MART-1, GAGE-1, BAGE-1, HSP-70,
gp43, β-HCG,
Ras-Mutation, MUC-1, -2 und -3, PSA, p53-Mutation, HMW, MUC-18,
HOJ-1, Tyrosinase und carcinoembryogenes Antigen (CEA) sind Beispiele
hierfür.
Im Allgemeinen kann jedes Antigen, für das eine Assoziation zu Krebstumoren
erkannt wird, verwendet werden. Siehe Gomella et al., Gerhard et
al., Zhang et al., Nollau et al., Mivechi et al., Ralhan et al.,
Yoshino et al., Shirasawa et al., Cheung et al., Sarantou et al.,
Doi et al., Hoon et al. (1997), Eynde et al., Hoon et al. (1996),
Takahashi et al., Kawakami et al., Wolfel et al., Vijayasaradhi
et al., Yokoyama et al., Kwon und Sensi et al.
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Mehrere
Gene können
in die Vakzine inkorporiert werden, um eine polyvalente DNA- oder RNA-Krebsvakzine
herzustellen. Wirksame Tumorimpfung kann eine polyvalente Antigen-Vakzine
erfordern, um menschliche Tumorprogression wirksam zu kontrollieren.
Nucleinsäuren,
die für
diese Antigene kodieren, können
in die von dieser Erfindung bereitgestellt Vakzine inkorporiert
werden.
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Für TAAs kodierende
RNA kann in den Vakzinen der Erfindung verwendet werden, wenn rasche, kurzfristige
Expression des Antigens erwünscht
ist. Da RNA nicht in die zellulären
Chromosomen inkorporiert wird, unterbindet die Verwendung von RNA-Vakzinen auch die
Möglichkeit,
dass Antigene weiterhin exprimiert werden, wenn die Behandlung nicht
länger
erwünscht
ist. RNA hat auch im Vergleich zu DNA eine stärker eingeschränkte biologische
Lebensdauer, was zu einer geringeren Gefahr von Virulenz gegenüber Wirtszellen
und zu mehr Kontrolle über
Expression führt.
Darüber
hinaus wird in RNA-Vakzinen das zu exprimierende Antigendirekt aus
der RNA translatiert, was die Unsicherheit ausräumt, die während der Transkription von
DNA zu DNA-Vakzinen auftritt.
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Ein
Wirkstoff-empfindliches Gen kann in den RNA-Vektor inkorporiert
werden, um Proteinexpression zu jedem beliebigen Zeitpunkt in vitro
abzustellen. Beispiele für
Wirkstoff-empfindliche Gene sind Tetracyclin, Amphicillin, Genomycin
usw.
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Eine
immunogene Determinante, wie z.B. Diphtherietoxin, kann auch als "Helfer"-Antigen in das TAA eingebunden werden,
um seine Wirksamkeit zu verbessern. Die COOH-terminale Region von Diphtherietoxin-B-Fragment
hat sich in Mäusen
als immunogen erwiesen. B. Autran et al. HSP70, teilweise oder als
Ganzes, sowie andere immunogene Peptide wie z.B. influenzavirus-
oder immunogenes Sequenzpeptid mit einem Ankermotiv zu HLA-Molekülen der
Klasse I und Klasse II können
auch in die Vakzinen der Erfindung eingebunden werden.
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Die
Zusammensetzungen können
andere Komponenten einbinden, die bestimmte Funktionen erfüllen, beispielsweise
das Richten der Nucleinsäure
auf eine bestimmte Stelle in der Zelle oder das Steuern von Transkription
des Tumor-assoziierten Antigens. Dies kann Zusammensetzungen zum Transport
des Nucleus umfassen, insbesondere Mitglieder der "High-Mobility-Group" (HMG), insbesondere
HMG-1, das ein Nicht-Histon-DNA-Bindungsprotein ist. In Kombination
mit Antisense-Molekülen können RNAsen
wie z.B. RNAseH verwendet werden, die DNA-RNA-Hybride abbauen. Andere
Proteine, die die Funktion des TAA unterstützen oder fördern, können eingebunden sein, wie
z.B. Peptidsequenzen, die Antigenverarbeitung, insbesondere HLA-Präsentation,
oder Bewegung im Zytoplasma steuern.
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Die
durch diese Erfindung bereitgestellte Vakzine kann subkutan, intramuskulär, intradermal oder
in ein Organ zugeführt
werden. Intramuskuläre Injektion
erwies sich in der Vergangenheit als eine wichtige Art der Verabreichung
zur Induktion von Immunität.
Skelettmuskelgewebe weist Eigenschaften wie z.B. intensive Gefäßausbildung
und Mehrfachverkernung auf. Darüber
hinaus ist es nicht-replizierend und in der Lage, rekombinante Proteine
zu exprimieren. Diese Eigenschaften sind für Gentherapie von Vorteil.
Eine Theorie zum Mechanismus, wie Muskel das Protein präsentiert
und Immunantwort induziert, ist, dass rekombinantes Protein produziert und
in das Gefäßnetz des
Muskels freigesetzt wird und schließlich durch professionelles
Antigen präsentierende
Zellen wie z.B. dendritische Zellen oder Makrophagen, die den Muskel
infiltrieren, präsentiert wird.
Ein anderer Vorschlag ist, dass die Muskelverletzung an der Injektionsstelle
Myoblastenproliferation und Aktivierung von infiltrierenden Makrophagen oder
dendritisch-ähnlichen
Zellen induziert und dass sie dann vorhandene Antigene durch MHC-Klasse-II-Antigen
präsentieren.
Somit wären
auch andere Gewebe mit ähnlichen
Eigenschaften gute Zufuhrstellen für die Vakzine.
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Der
zur Verabreichung ausgewählte
Weg hängt
von der Vakzinen-Zusammensetzung und dem Erkrankungsstadium der
Patienten ab. Relevante Überlegungen
umfassen die Typen von Immunzellen, die es zu aktivieren gilt, die
Dauer, die ein Antigen dem Immunsystem ausgesetzt wird, und den
Immunisierungsplan. Wenn auch zahlreiche Vakzinen nacheinander innerhalb
einer kurzen Zeitspanne verabreicht werden, kann die Ausdehnung
der Immunisierungen auf eine längere
Zeitspanne wirksame klinische und immunologische Reaktionen aufrechterhalten.
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Zur
Bestimmung des Immunisierungsplans für Krebs-Vakzinen sollten die
folgenden Fragen hinsichtlich der Individualisierung von Vakzinen-Arbeitsvorschriften
beachtet werden:
Sind mehrfache Immunisierungen über eine
kurze Zeitspanne hinweg besser geeignet als über eine lange Zeitspanne,
um langfristige wirksame Immunität zu
induzieren?
Sollte das Impfschema verändert werden, wenn sich beim
Patienten ein Neuerliches Auftreten des Tumors zeigt?
Induziert übermäßige Immunisierung
Immunsuppression oder Toleranz?
Sollten sich Immunisierungspläne für Personen
mit verschiedenen klinischen Erkrankungsstadien unterscheiden?
Ein
Beispiel für
einen Verabreichungsplan ist, Vakzinen durch Injektionen in den
Wochen 0, 2, 4, 8, 12, 16 und daraufhin alle vier Wochen 1 Jahr
lang zu verabreichen.
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Hiernach
wird den Patienten mehrere Jahre lang ein 3- bis 6-Monate-Impfschema
vorgeschrieben. Ein präventiver
Immunisierungsplan kann aus drei Immunisierungen, eine alle drei
bis vier Wochen, bestehen. Behandlung nach Entfernung eines Tumors
kann in wöchentlicher
Immunisierung ein Monat lang bestehen.
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Anders
als die meisten nicht-neoplastischen Erkrankungen, die mit Vakzinen
behandelt werden, ist ein aktiv wachsender Krebs eine dynamische
biologische Einheit, die sich in genetischer und phänotypischer
Hinsicht kontinuierlich entwickelt. Ein Tumor, der sich genetisch
und phänotypisch
entwickeln gelassen wird, kann schließlich vom Immunsystem des Wirts
nur noch schwieriger kontrolliert werden. Krebsvakzinen können jedoch
wirksamer sein, wenn sie mit anderen Adjuvans-Therapien wie etwa
Chemotherapien oder anderen Immuntherapien, wie z.B. mit monoklonalen
Antikörpern
und Zytokinen, kombiniert werden. Ein Ansatz einer aggressiveren
Behandlungsform in frühen
Stadien der Tumorentwicklung kann bei der Prävention der Entwicklung von
Abwehrmechanismen wirksamer sein. Eine aggressivere Behandlung kann
auch im Fall von Krebsarten erforderlich sein, die im Vergleich
zu relativ gutartigem Krebs mit geringem Risiko von neuerlichem
Auftreten stark bösartig
sind. Im Allgemeinen sollte, wenn der Wirt eine schwache Immunantwort
auf die Impfung zeigt, eine höhere
Dosis und eine häufigere
Impfung verabreicht werden.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
wiederholte Verabreichung der Vakzine, da Injektion von HVJ-Liposomen
Konzentrationen an Antikörper
produziert, die nicht ausreichen, um weitere Impfung durch HVJ-Liposomen
zu neutralisieren. Darüber
hinaus werden keine zytotoxischen T-Zellen gegen HVJ gebildet.
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BEISPIEL
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IMPFUNG VON MÄUSEN MIT
VIRALEN LIPOSOMEN, DIE MAGE-1- UND MAGE-3-DNA ENTHALTEN
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MAGE-1-Genplasmid
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MAGE-1-Gen
wurde wie von Hoon et al., J. Immunol. (1995), beschrieben kloniert
und isoliert. Das MAGE-1-Gen wurde in den pcDNA3-Plasmidvektor kloniert,
der für
Expression von Proteinen in eukaryotischen Zellen konstruiert wurde
(InVitrogen, San Diego, CA, USA). Der pcDNA3 weist eine Enhancer-Promotor-Sequenz
aus dem unmittelbar frühen
Gen des menschlichen Zytomegalievirus und eine Polyadenylierungssignal-
und Transkriptionsterminationssequenz aus dem Rinderwachstumshormon-Gen
auf. Das MAGE-1-Gen-Insert in pcDNA3 wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft. Das
den pcDNA3 enthaltende MAGE-1-Gen (pMAGE-1) wurde durch Gleichgewichtsultrazentrifugation
unter Verwendung eines CsCI-Ethidiumbromid-Gradienten gereinigt.
Gereinigte Plasmid-DNA wurde in 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,1 mM EDTA,
gelöst,
durch Spektralphotometrie ausgewertet und wies ein A260/A280-Verhältnis von
1,9 oder höher
auf. Weitere Analyse durch Gelelektrophorese wurde durchgeführt, um
die Reinheit des gereinigten Plasmids zu überprüfen.
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Expression und Reinigung
von rMAGE-1
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rMAGE-1
wurde wie von Hoon et al., J. Immunol. (1995), beschrieben exprimiert
und durch eine Affinitätssäule, die
Ni2+-NTA-Harz (Qiagen, Chatsworth, CA, USA)
enthielt, gereinigt. Das rMAGE-1-Konstrukt wurde für Affinitätsreinigung
und Affinitäts-ELISA am Amino-Terminalende
mit der Sequenz Gly-Ser-hexaHis markiert. Das rekombinante Protein
wurde durch Gel-Elektroelution und ein FPLC-System (Bio-Rad, Richmond
CA, USA) gereinigt. Rekombinante Proteine wurden in Laemmli 90 SDS-PAGE-Gel
unter reduzierten Bedingungen laufen gelassen.
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MAGE-3-Genplasmid
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cDNA
(942 bp), die für
Volllängen-MAGE-3 kodiert,
wurde durch PCR aus einer menschlichen Testis-Bibliothek (Clontech,
Palo Alto, CA, USA) amplifiziert. Das gewonnene PCR-cDNA-Produkt
wurde mit Restriktionsenzym verdaut, und das Fragment geeigneter
Größe wurde
in den Vektor pET30b (Novagen, Madison, WI, USA) mit hexaHis am
C-Terminus subkloniert, was ein Plasmid mit der Bezeichnung pSH007
ergab. Die Volllängen-MAGE-3-cDNA wurde
durch Didesoxynucleotid-Sequenzierungsverfahren unter Verwendung
von T7-DNA-Polymerase (USB, Cleveland, OH, USA) sequenziert. Plasmid pSH007
wurde durch EcoRV und Notl verdaut, und das EcoRV-Notl-Fragment,
das das MAGE-3-Gen enthielt, wurde dann in das pcDNA3-Plasmid insertiert.
Das pcDNA3-hältige
MAGE-3-Gen (pMAGE-3) wurde wie pMAGE-1 gereinigt und hergestellt.
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Expression und Reinigung
von rMAGE-3
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Ein
DNA-Fragment des MAGE-3-Gens mit der terminalen hexaHis-Affinitätsmarkierung
wurde aus pSH007 entfernt und in die Smal-Stelle von pGEX-2t (Promega,
Madison, WI, USA) insertiert. Dieses Expressionsplasmid wurde zu
E.-coli-Stamm-BL21-Zellen
transformiert. Rekombinantes Fusionsprotein wurde durch Isopropyl-D-thiogalactosid (IPTG)
induziert und aus bakteriellen Lysaten durch Affinitätschromatographie
unter Verwendung von Glutathion-Sepharose 4B (Pharmacia, Piscataway,
NJ, USA) gereinigt. Vor der Elution des Fusionsproteins wurde rMAGE-3
aus dem GST-Träger
durch Zusatz von Thrombin zum gebundenen Fusionsprotein gespalten
und herausgelöst.
Das FPLC-gereinigte rMAGE-3 wurde durch SDS-PAGE-Gel und Western-Blotting
unter Verwendung von Ni2+-NTA-Konjugat (Qiagen) überprüft und dann
für ELISA
und Western-Blotting verwendet.
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Herstellung
von HVJ-Liposomen
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Die
Erfinder stellten HVJ-Liposomen einkapselnde Plasmid-pcDNA3 her,
die MAGE-1 (pMAGE-1)
oder MAGE-3 (pMAGE-3) und HMG-1-Protein enthielten. Herstellung von
HVJ-Liposomen mit Plasmid-DNA wurde am Tag oder innerhalb von 24
Stunden von der Injektion in die Tiere durchgeführt. Die Ausgangsmenge an Plasmid-DNA, die
zur Liposomeneinkapselung verwendet wurde, betrug 100 μg pro Röhrchen.
Die Menge von eingekapselter Plasmid-DNA, die pro Tier injiziert
wurde, betrug etwa 7-10 μg. Diese
Dosis war die wirksamste Menge von HVJ-Liposomen-DNA-Komplex, die
für In-vivo-Genexpression
erforderlich war. Dies war auch die logistisch am besondersten realisierbare Dosis
an Vektor, um eine signifikante, rasche und gleichmäßige Immunantwort
auf die MAGE-Proteine hervorzurufen. Optimierung und Kontrollversuche
mit einzelnen Komponenten des fusigenen viralen Liposoms von Invivo-Zufuhr
von Genen werden in V.J. Dzau et al., I. Yanagihara et al. und Y.
Kaneda beschrieben.
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Kurz
zusammengefasst wird HVJ (Z-Stamm) aus Chorioallantois-Flüssigkeit
von virusinokulierten, embryonierten Hühnereiern hergestellt, und
die hämagglutinierenden
Einheiten (HAU) des Virustiter wurden durch Spektrometrie bestimmt.
Die Präparierung von
Liposomen umfasste das Vermischen von Rinderhirn-L-α-Phosphatidylserin-Natriumsalz
(Avanti Polar-lipids, Alabaster, AL, USA) Eidotter-L-α-Phosphatidylcholin
(Sigma, St. Louis, MO, USA) und Cholesterin (Sigma) in einem Glasröhrchen in
einem Gewichtsverhältnis
von 1:4, 8:2 mit Tetrahydrofuran (Nakarai, Kyoto, Japan). Das Röhrchen mit
Lipidgemisch wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei
400 mm Vakuumdruck eingedampft und in ein Wasserbad mit 45 °C eingetaucht. HMG-1-Protein
wurde aus Kälberthymus
wie von Y. Kaneda beschrieben gereinigt. 200 μg gereinigte Plasmid-DNA wurden
mit 65 μg
HMG-1 und BSS (137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,6) in
nucleasefreien Röhrchen
vermischt. Das Gemisch wurde in einem Wasserbad bei 20°C eine Stunde lang
inkubiert. Das HMG-1:DNA-Gemisch wurde dann zum Lipidgemisch zugesetzt
und intensiv durch Zentrifugieren, Wasserbadbeschallung und Inkubation
in einem Wasserbad mit 37 °C
acht Zyklen lang geschüttelt.
Ausgeglichene Salzlösung
(BSS, balanced salt solution) wurde der einschichtigen Liposomen:HMG-1:DNA
zugesetzt, in einem rüttelnden Wasserbad
bei 37 °C
inkubiert und dann in ein Eisbad gegeben. Gereinigtes HVJ wurde
mit UV-Strahlung 10 J/m2/s drei Minuten
lang deaktiviert.
-
Deaktiviertes
HVJ (30.000 HAU) wurde zur DNA:Liposom-Lösung zugesetzt, auf Eis 10
Minuten lang inkubiert und dann in einem rüttelnden Wasserbad bei 37 °C eine Stunde
lang inkubiert. Freies HVJ wurde dann aus HVJ-Liposomen durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation
entfernt. HVJ-Liposomen wurden dann sorgfältig aus dem Dichtegradienten
entfernt, gewaschen, durch Zentrifugation (27.000 g, 30 min) ausgefällt, in
steriler BSS plus 2 mM CaCl2 resuspendiert
und bis zur Verwendung auf Eis gelagert.
-
Immunisierungsschema
-
Das
HVJ wurde mit Detergens, Hitze und UV-Licht behandelt, wodurch jegliche
pathogene Wirkung im Wirt inaktiviert wurde. 6 bis 8 Wochen alte männliche
C57BL/6 Mäuse
in Gruppen zu drei oder vier Tieren wurden in jedem Experiment verwendet. Mäuse wurden
mit Etherdampf leicht anästhesiert, und
ihnen wurde HVJ-Liposomlösung
(150 μl)
in den Quadrizepsmuskel des rechten Hinterlaufs nur mit einer sterilen
26-Gauge-Nadelspritze injiziert. Immunisierung von Mäusen erfolgte
unmittelbar nach HVJ-Liposomenherstellung, um optimal Resultate
zu erzielen. Mittels Versuchen wurde ein optimaler Vakzinen-Immunisierungsplan
bestimmt. Tiere wurden gemäß verschiedenen
Plänen
immunisiert: dreimal zweiwöchentlich,
dreimal wöchentlich
oder zweimal zweiwöchentlich
und dann monatlich mehrere Male. Weder Nekrose noch Entzündung oder
sichtbare Verletzung wurde nach mehrfachen Injektionen an derselben
Stelle beobachtet. Gruppen von Tieren, denen Plasmid-DNA injiziert
wurde, wurden 12 Monate lang erhalten, und keinerlei sichtbare Verletzung oder
Veränderung
der körperlichen
Aktivität
wurde im Vergleich zu nicht-immunisierten Tieren beobachtet. Die
HVJ-Liposomenlösung
beeinflusste den Gesundheitszustand der Tiere oder die Hinterlaufsfunktion nicht.
Den Tieren wurde vor der Impfung und zu bestimmten Zeitpunkten Blut
abgenommen. Vor der Blutabnahme wurden die Tiere unter Verwendung von
Etherdampf anästhesiert,
woraufhin ihnen aus dem Bereich hinter der Orbita unter Verwendung
von sterilen geschliffenen Pasteur-Glaspipetten Blut abgenommen
wurde. Das Blut (etwa 250 μl)
wurde in 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen
gesammelt, bei 4 °C
koagulieren gelassen und bei 700 g 5 Minuten lang zentri fugiert.
Das Serum wurde sorgfältig
entfernt und in Aliquoten auf Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt und bis zur
Verwendung bei –30 °C gelagert.
-
PCR und Southern-Blot-Analyse
-
Muskelbiopsien
wurden nach ausgewählten Immunisierungsperioden
auf die Gegenwart und Expression von pcDNA3 und pMAGE-1 analysiert.
Gewebebiopsien an den Stellen der Vakzineninjektionen wurden ausgeschnitten
und Nucleinsäuren
extrahiert. Gesamt-RNA und -DNA aus den Gewebebiopsien wurden extrahiert,
isoliert und unter Verwendung der Tri-Reagent- (Molecular Research
Center, Cincinnati, OH, USA) Arbeitsvorschrift gemäß den Anweisungen
des Herstellers gereinigt. RNA- und DNA-Extraktion erfolgte in einer
ausgewählten
sterilen Laminarströmungsbox
mit RNase- und DNase-freien Laborgeräten. Gereinigte RNA und DNA wurden
quantifiziert, und die Reinheit wurde durch UV-Spektralphotometrie
bewertet.
-
RT-PCR
und DNA-PCR plus Southern-Blot-Analyse von MAGE-1 wurden wie von Hoon
et al., J. Clin. Oncol. (1995), beschrieben durchgeführt. PCR-cDNA-Produkte
von MAGE-1 wurden durch Gelelektrophorese an einem 2%igen Agarosegel
bewertet und durch Ethidiumbromidfärbung unter UV-Licht sichtbar
gemacht. Southern-Blot-Analyse
von PCR-cDNA-Produkt, das Gelelektrophorese unterzogen worden war,
erfolgte unter Verwendung einer MAGE-1-spezifischen cDNA-Sonde.
Die pcDNA3-, pMAGE-1- und MAGE-1-Geninsert-allein-PCR-cDNA-Produkte
waren 218 bp, 12.136 bp bzw. 920 bp lang. Die Sequenzen der Primer
lauteten wie folgt: pcDNA3: 5'-Primer war
5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' und der 3'-Primer war 5'-AGGGGCAAACAACAGATGGC-3', was ein 218-bp-cDNA-Produkt
für pcDNA3
alleine und ein 1.136-bp-cDNA-Produkt für pcDNA3 mit MAGE-1-Insert
ergab.
-
Muskelbiopsien
von Mäusen,
die mit pcDNA3 alleine immunisiert wurden, wurden 7, 14 und 28 Tage
nach erfolgter Immunisierung bewertet. Zwei Mäuse aus jeder Zeitperiode wurden
getötet und
ausgewertet. Ein 218-bp-RT-PCR- und ein DNA-PCRcDNA-Produkt wurden
in allen Tieren nachgewiesen, was auf die Gegenwart von pcDNA3 hinwies.
RT-PCR-Analyse von Muskelbiopsien von immunisierten Mäusen mit
MAGE-1-Vakzine wurde an den Tagen 7 (zwei Mäuse), 14 (drei Mäuse) und 28
(zwei Mäuse)
nach Immunisierung durchgeführt. Für alle untersuchten
Gewebe wurde gezeigt, dass sie spezifische MAGE-1-mRNA 7, 14 und
28 Tage nach Immunisierung exprimierten. MAGE-1-Genexpression wurde
weiter unter Verwendung eines separaten Sets spezifischer Primer
zu MAGE-1 (RT-PCR-cDNA-Produkt 920 bp) überprüft. RT-PCR-Analyse von Muskelbiopsien
an der Stelle der MAGE-1-Vakzineninjektion zeigte auch die Gegenwart
des pcDNA3-Plasmids alleine (218 bp). Dies kann eventuell auf unvollständige Transkription
des MAGE-1-Geninserts in pcDNA3 oder auf Verunreinigung von pcDNA3
ohne MAGE-1-Geninsert in Vektorpräparaten zurückzuführen sein. Dies wurde nur bei
einigen wenigen Tieren, denen unterschiedliche HVJ-Liposomen injiziert
wurden, beobachtet.
-
RNA
von normalem Muskel und anderen Körperorganen (Lunge, Niere,
Leber) von nicht-immunisierten Tieren derselben Geschlechts- und
Altersgruppe wurden durch RT-PCR und Southern-Blotting untersucht,
und es wurde gezeigt, dass sie MAGE-1-mRNA oder Plasmid-pcDNA3-DNA nicht exprimierten.
-
Western-Blotting
-
Um
die Induktion von Anti-MAGE-1- und Anti-MAGE-3-spezifischen Antikörperreaktionen
nach erfolgter Impfung zu bewerten, wurden 5 μg rekombinantes menschliches
MAGE-1 (rMAGE-1) und rekombinantes menschliches MAGE-3 (rMAGE-3)
wie zuvor beschrieben präpariert.
Western-Blotting wurde wie von Hoon et al., J. Immunol. (1995),
beschrieben durchgeführt.
Western-Blots mit rMAGE-1 und rMAGE-3 wurden mit Seren von Mäusen, die
zumindest zweimal immunisiert worden waren, durchgeführt, um
Spezifität
von Antikörperreaktionen
zu überprüfen. Die
Blots wurden mit SuperBlock-Blockierungspuffer (Pierce, Rockford,
IL, USA) über Nacht
bei Raumtemperatur blockiert. Die Blots wurden mit verschiedenen
Verdünnungen
von Mausserum in PBS getestet. Nach mehrmaligem Waschen wurden die
Blots mit mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-Anti-Maus-IgG
(γ-Ketten-spezifisch)
oder -IgM (μ-Ketten-spezifisch)
inkubiert (Caltag, San Francisco, CA, USA). Die Blots wurden gewaschen
und unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-1-phosphat und
Nitroblauterazolium (Promega) entwickelt. Negativkontrollen waren
Konjugate allein mit Entwicklungslösung, nicht-immunisierte Mausseren
(Alter und Geschlecht übereingestimmt)
und mit pcDNA3 allein immunisierte Mäuse.
-
Die
Resultate werden in 4 gezeigt. Keine Antikörper-(IgG-)Reaktionen
auf rMAGE-1 oder rMAGE-3 wurden in nicht-immunisierten Mäusen nachgewiesen.
Mäuse,
die mehrere Male mit HVJ-Liposomkomplex, der pcDNA3 ohne ein MAGE-1- oder MAGE-3-Insert
enthielt, immunisiert wurden, zeigten auch keine Antigen-spezifische
Antikörperreaktion. Nackte
DNA, die in vivo verabreicht und von den Zellen aufgenommen wurde,
wird in Lysosomen und Endosomen rasch abgebaut. Mäuse, die
mit MAGE-1-Vakzine dreimal zweiwöchentlich
immunisiert und sechs Wochen nach der Immunisierung ausgewertet
wurden, zeigten eine Induktion einer starken Antikörperreaktion
auf rMAGE-1. 2(a) (Spuren 3 und 4).
Dem ähnlich
zeigten Mäuse,
die mit MAGE-3-Vakzine dreimal zweiwöchentlich immunisiert und sechs
Wochen danach untersucht wurden, eine starke Antikörperreaktion
auf rMAGE-3. 2(b) (Spuren 3 und 4).
Diese Untersuchungen wiesen darauf hin, dass Antigen-spezifische
IgG-Reaktionen rasch induziert und zumindest acht Wochen nach erfolgter
Immunisierung aufrechterhalten werden konnten.
-
ELISA
-
Anti-MAGE-1-IgG-Antikörper wurden
nach Immunisierung zu verschiedenen Zeitpunkten durch einen MAGE-1-Affinitäts-ELISA
nachgewiesen. Ein Anti-rMAGE-1- oder
-3-Affinitäts-ELISA
wurde entwickelt, um Maus-Anti-MAGE-1- oder -3-Antikörper nachzuweisen.
Gereinigtes rMAGE-1 oder rMAGE-3 (4 μg pro Well) mit hexaHis-Markierung in 10
mM Tris-HCI plus 50 mM NaCl gepufferter Salzlösung pH 7,5 (TBS) wurde über Nacht
bei Raumtemperatur in Ni2+-Chelat-beschichteten
ELISA-Mikroplatten (Xenopore, Hawthorne, NJ, USA) inkubiert. Die
Mikroplatten wurden dreimal mit TBS gewaschen, mit 5 % SuperBlock
Blockierungspuffer zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert
und dreimal mit PBS gewaschen. Mausserum wurde in PBS verdünnt und zu
den Mikrowells zugesetzt, bei Raumtemperatur zwei Stunden lang inkubiert
und daraufhin dreimal mit PBS gewaschen. Ziege-Anti-Maus-IgG- (γ- Ketten-spezifisch)
Meerrettichperoxidase-Konjugat (Caltag, San Francisco, CA, USA)
wurde zugesetzt, und die Platten wurden zwei Stunden lang bei Raumtemperatur
inkubiert, fünfmal
mit PBS gewaschen und mit o-Phenylendiamin-Natriumcitratlösung plus
6 N HCl entwickelt. Die Platten wurden dann bei 490 nm unter Verwendung
eines ELISA-Lesegeräts
(Molecular Devices, Palo Alto, CA, USA) abgelesen, und die Daten
wurden unter Verwendung der Software für das Instrument analysiert.
-
Ein
repräsentativer
Versuch für
Antikörperreaktion
nach MAGE-1-Immunisierung ist in 3 gezeigt.
Mäuse wurden
an den Tagen 1, 7 und 14 immunisiert und dann neuerlich etwa ein
Jahr später
immunisiert. Die IgG-Antikörperkonzentrationen
waren 7 Tage nach der Boosterimmunisierung angestiegen und wurden
bis Tag 14 auf dem Niveau gehalten. Anti-MAGE-1-IgG-Antikörper wurde
induziert und konnte mit darauf folgenden Immunisierungen erhöht werden.
Immunisierte Mäuse
wurden auch mit verschiedenen Verdünnungen von Serum im Bereich
von 1:50 bis 1:800 ausgewertet. Im Allgemeinen betrugen nach zwei
Immunisierungen an Tag 14 IgG-Anti-MAGE-1-Antikörpertiter 1/200 bis 1/400.
Eine positive Antikörperverdünnung wurde
als solche erachtet, wenn der Wert 2 Standardabweichungen über dem negativen
Serumhintergrund bei einer Verdünnung von
1:100 betrug.
-
Ein
Jahr nach drei Immunisierungen fielen die Antikörperkonzentrationen wie erwartet
zurück auf
Hintergrundniveau. Die Tiere wurden nach vier Wochen neuerlich immunisiert
und ausgewertet. Es zeigte sich, dass Anti-MAGE-1-IgG-Reaktionen
auf die früheren
Immunisierungsniveaus geboostet waren. Diese Studien zeigten, dass
wiederholte Immunisierung mit dem HVJ-Liposomensystem keine signifikante
Inhibitions-Immunisierungsreaktion auf die HVJ-Liposomenkomponenten
oder den Plasmidvektor zur Unterbindung von Antigen-spezifischer
Immunisierung induzierte.
-
BEISPIEL 2
-
MAGE-1-DT-DNA-Immunisierung
-
Ein
Plasmid, das MAGE-1 plus Diphtherietoxinpeptid-DNA-Hybrid (MAGE-1
DT) enthielt, wurde konstruiert, um zu bestimmen, ob gentechnische
Veränderung
einer immunogenen Determinante zu MAGE-1-Genprodukt Antikörperreaktionen
auf MAGE-1 verstärken
würde.
Die komplementären
Oligonucleotidsequenzen (Sense: 5'-AGCTTACGCAACCATTTCTTCATGACGGGTATGCTGTCAGTTGGAACACTGTTG-3' (Seq.-ID Nr. 1);
Antisense: 5'-TCGACAACAGTGTTCCAACTGACAGCATACCCGTCATGAAGAAATGGTTGCGTA-3' (Seq.-ID Nr. 2)),
abgeleitet von Diphtherietoxin-Fragment-B-Nucleotidsequenz, entsprechend
den 16-Aminosäureresten
des C-terminalen
Endes Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr
Val (Seq.-ID Nr. 3), wurden synthetisiert. Die Sequenzen wurden
hybridisiert und in die Hindlll-Sall-Stellen von pBluescript insertiert.
cDNA, die für
die volle Länge
von MAGE-1 kodiert, wurde dann in BamHI-EcoRV-Stellen insertiert,
wodurch es an den N-Terminus der DT-Peptidnucleotidsequenz fusioniert
wurde. Der cDNA-Klone wurde durch das Didesoxynucleotidsequenz-Verfahren
unter Verwendung von T7-DNA-Polymerase
(USB) sequenziert. Das BamHI-Xhol-Fragment, das MAGE-1-DT-Gen enthielt,
wurde dann in das pcDNA3-Plasmid insertiert. Das Plasmid MAGE-1-DT
wurde wie in Beispiel 1 für
pMAGE-1 beschrieben gereinigt.
-
Mäuse wurden
dreimal mit MAGE-1-DT-Vakzine wie in Beispiel 1 beschrieben immunisiert.
-
Die
16mer-Diphtherie-toxin-(-DT-)Peptidsequenz wurde mit einer his-Markierung
markiert, um Peptid-Affinitäts-ELISA
durchführen
zu können.
Das C-terminale DT-Peptid
mit einer Vier-Histidin-Markierung Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly
Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val His His His His (Seq.-Id Nr. 4)
wurde von Research Genetics (Huntsville, AL, USA) synthetisiert.
Die Reinheit des his-markierten Peptids, das im Affinitäts-ELISA
verwendet wurde, lag über
oder bei 97 %. Das Peptid (100 pmol pro Well) wurde in Ni2+-Chelat-beschichtete ELISA-Mikroplatten
inkubiert. Verfahren für
ELISA wurden bereits in Beispiel 1 beschrieben. Kaninchen-Anti-DT-Peptid-Serum (1:104-Verdünnung)
wurde als positive Kontrolle für DT-his-Markierung-Peptid-Bindung
in den Affinitäts-ELISA-Platten
verwendet.
-
Die
Antikörperreaktion
auf rMAGE-1 wurde durch Western-Blot nach Immunisierung mit MAGE-1-DT-Vakzinenimmunisierung
bewertet. In der Bewertung von Mäusen, die
mit MAGE-1-DT immunisiert wurden, durch Affinitäts-ELISA gab es eine gewisse
Erhöhung
(nicht signifikant) der Antikörperreaktion
auf DT-Peptid im Vergleich zur Kontroll-MAGE-1-Vakzine. Insgesamt
zeigte der Zusatz einer zweiten immunogenen Determinante eine gewisse
Verbesserung der Antikörperreaktionen
auf rMAGE-1, die jedoch nicht signifikant war. Die Steigerung der
Länge der
Peptidsequenz jedoch sollte eine zelluläre Immunantwort hervorrufen.
Darüber
hinaus sollte der Zusatz einer Peptidsequenz mit einem Ankermotiv
zu HLA-Molekülen
diese Antwort verstärken.
Längere
anfängliche
Peptidsequenzen steigern Antikörperinduktion.
-
BEISPIEL 3
-
LACZ-RNA-EXPRESSION IN
BHK-21-ZELLEN NACH TRANSFER DURCH VIRALE LIPOSOMEN
-
BHK-21-Zellen
wurden mit viralen Liposomen, die in-vitro-transkribierte RNA für pSFV3-IacZ enthielten,
inkubiert. LacZ-RNA-Expression in den BHK-21-Zellen 24 Stunden nach
dem Transfer viraler Liposomen ist in 4(A) gezeigt.
Als Kontrolle wird RNA-Expression nach dem Transfer von TE-Puffer mit
RNA in 4(B) gezeigt. Mehr als 80 %
von BHK-21-Zellen wurden durch X-gal-Färbung blau gefärbt. 4(A). Keine Blaufärbung wurde im Kontrollversuch
erzielt. 4(B).
-
In-vitro-RNA-Synthese
durch pSFV-Expressionsvektor
-
pSFV3-IacZ-DNA
(10 μg)
(GIBCO BRL, Tokyo, Japan) wurde mit Spe I linearisiert, durch Ethanolfällung nach
Phenolextraktion gereinigt und in TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA,
pH 8,0) auf 0,6 μg/ml suspendiert.
Die folgenden Materialien wurden dann in einem 1,5-ml-Röhrchen zu
einem Gesamtvolumen von 50 μl
vermischt:
20 μl
NTP-Mischung (2,5 mM ATP, 2,5 mM CTP, 2,5 mM UTP, 1,25 mM GTP)
10 μl 5 × SP6-Puffer
5 μl 10 mM RNA
Capping-Analogon
5 μl
10 mM DTT (Mischung nach Zusatz)
5 μl RNase-Inhibitor (RNasin)
2,5 μl linearisierte
pSFV3-IacZ
2,5 μl
Sp6-RNA-Polymerase.
-
Die
Materialien stammten von GIBCO BRL, Tokyo, Japan, mit Ausnahme von
RNasin und SP6-RNA-Polymerase, die von Promega Corp., Madison, WI,
USA, stammten. Das Gemisch wurde bei 37 °C eine Stunde lang inkubiert.
In-vitro-transkribierte RNA wurde durch 0,5 % Agarose-Gelelektrophorese
untersucht. Die RNA wurde durch Isopropanolfällung gereinigt und in TE resuspendiert.
Die Menge wurde dann auf Grundlage der Absorption bei 260 nm geschätzt. Üblicherweise
wurden mehr als 20 μg RNA
in jeder Reaktion erhalten.
-
Transfer von RNA in BHK-21-Zellen
-
20 μg von in-vitro-transkribierter
RNA für
pSFV-IacZ wurden in Liposomen von Phosphatidylcholin, Cholesterin
und DC-Cholesterin inkorporiert. Y. Saeki et al. Die Liposomen wurden
mit UV-inaktivierten HVJ wie in Beispiel 1 fusioniert, um HVJ-kationische
Liposomen zu bilden. Nach 90-minütiger
Saccharose-Gradienten-Zentrifugation bei 62.800 g wurde ein Zehntel
der HVJ-Liposomensuspension zu BHK-21-Zellen in einer 100-mm-Schale
(60-70 % konfluent) zugesetzt. Die Zellen wurden mit der Liposomensuspension
in Gegenwart von Dulbecco's
Medium MEM, das 10 % fötales
Kälberserum
enthielt, 30 Minuten lang bei 37 °C
inkubiert. Das Kulturmedium wurde ausgetauscht und durch neues Kulturmedium
ersetzt. Die Zellen wurden 24 Stunden lang in einem 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C kultiviert und dann mit 1
% Glutaraldehyd fixiert. Die Zellen wurden mit X-gal-Lösung bei
37 °C 2-16
Stunden lang wie von Mercer et al. beschrieben gefärbt.
-
BEISPIEL 4
-
LACZ-RNA-EXPRESSION IN
MAUS-SKELETTMUSKEL NACH RNA-IMPFUNG DURCH VIRALE LIPOSOMEN
-
Virale
Liposomen, die in-vitro-transkribierte RNA für pSFV-IacZ enthielten, wurden
in Maus-Skelettmuskel an den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 injiziert. Expression
von IacZ-RNA an
Tag 3 wird in 5(A) gezeigt. RNA-Expression
an Tag 5 wird in den 5(B) und 5(C) gezeigt. RNA-Expression an Tag 9 wird
in 5(D) gezeigt.
-
In-vitro-RNA-Synthese
durch pSFV-Expressionsvektor
-
RNA
wurde in vitro wie in Beispiel 3 beschrieben synthetisiert.
-
Transfer von
RNA in Maus-Skelettmuskel
-
300 μg von in-vitro-transkribierter
RNA für pSFV3-IacZ
wurden in AVE-Liposomen wie in Y. Saeki et al. beschrieben inkorporiert.
Die Liposomen wurden mit UV-inaktiviertem HVJ wie in Beispiel 1
beschrieben fusioniert, um HVJ-AVE-Liposomen zu bilden. Nach 90-minütiger Saccharose-Gradienten-Zentrifugation
bei 62.800 g wurde die HVJ-AVE-Liposomensuspension viermal mit BSS (10
mM Tris, pH 7,5, 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl) verdünnt. Die Lösung wurde dann durch Zentrifugation bei
27.800 g 30 Minuten lang eingeengt. Das Pellet von HVJ-AVE-Liposomen
wurde in 300 μl
BSS, die 1 mM CaCl2 enthielt, resuspendiert.
15 μl von HVJ-AVE-Liposomensuspension
wurden in jede der vier Stellen des Hinterlaufmuskels der einzelnen, acht
Wochen alten männlichen
C57/BL6-Mäuse
injiziert, um eine Gesamtmenge von 60 μl Suspension zu erreichen. An
den Tagen 1, 3, 5, 7 und 9 wurden die Mäuse mit Pentobarbital anästhesiert,
und der Skelettmuskel rund um die Injektionsstellen wurde für histopathologische
Untersuchungen präpariert.
Die Probe wurde in 1 % Glutaraldehyd fixiert, in 20%ige Saccharoselösung eingetaucht
und in OCT-Fixierungsverbindung eingebettet. Ein gefrorener 10-μm-Gewebeschnitt
[Scheibe] des Muskels wurde präpariert
und in 0,1 %iger X-Gal-Lösung
bei 37 °C 16
Stunden lang wie in Beispiel 3 beschrieben gefärbt.
-
BEISPIEL 5
-
HERSTELLUNG VON AVE-LIPOSOMEN
(KÜNSTLICHE
VIRUSHÜLLE)
UND HVJ-DJ-LIPOSOM
-
AVE-Liposomen
(künstliche
Virushülle)
und kationische HVJ-Liposomen, die DC-Cholesterin (3β-[N',N'-Dimethylaminomethan)carbamoyl]cholesterin)
enthielten, wurden wie von Saeki und Kaneda, Protein-modified liposomes
(HVJ-liposomes) for the delivery of genes, oligonucleotides and
proteins. Cell biology, a laboratory handbook (2. Auflage), J.E.
Celis (Hrsg.); Academic Press Inc., San Diego, Bd. 4, 123-130 (1998),
beschrieben unter Berücksichtigung der
nachstehenden Modifikationen hergestellt.
-
Ein
Gemisch von positiv geladenem DC-Cholesterinliposom enthielt Cholesterin-Eiphosphatidylcholin
und DC-Chol in einem Molverhältnis von
4:%:1. Die Lipidzusammensetzung von AVE-Liposom war Phosphatidylserin
: Eiphosphatidylcholin Dioleoylphosphatidylethanolamin : Shingomyelin
: Cholesterin im Molverhältnis
10 13,3 : 13,3 : 13,3 : 50. Liposomen wurden durch Hydratisieren
und Schütteln
dieser Lipidgemische mit 200 ml ausgeglichener Salzlösung hergestellt.
Jedes Lipid wurde in Chloroform in einer Konzentration von 30 mM
gelöst. Lipidgemische
wurden durch Vermischen von Lipidlösungen in verschiedenen Kombinationen
hergestellt. 500 μl
(15 μmol)
von jedem Lipidgemisch wurden in ein Glasröhrchen transferiert und als
dünner Lipidfilm
durch Eindampfen getrocknet. Das getrocknete Lipidgemisch wurde
in 200 μl
ausgeglichener Salzlösung
(BSS; 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 100 mM Tris-HCI, pH 7,6), die DNA, RNA, Oligonucleotide
oder Protein enthielt, die durch Dispersion in der wässrigen
Phase bei 37 °C
eingefangen waren, hydratisiert. Das Gemisch wurde 30 Sekunden lang durch
Zentrifugieren intensiv durchmischt und dann 30 Sekunden lang stehen
gelassen. Dieses Verfahren wurde achtmal wiederholt. 800 μl BSS wurden dem
Röhrchen
zugesetzt, die Liposomensuspension wurde durch ein Celluloseacetat-Membranfilter
(Porengröße: 0,45 μm) extrudiert,
und die im Filter zurückgebliebenen
Liposomen wurden durch Extrudieren von 500 μl BSS gesammelt. Die 1,5 ml
Liposomenlösung
und dann 500 μl
BSS wurden durch ein anderes Membranfilter mit 0,20-μm-Poren extrudiert, um
der Größe nach
geordnete, einschichtige Liposomen (2 ml insgesamt) zu erhalten.
-
Die
zuvor hergestellte Liposomensuspension (2 ml, zusammengesetzt aus
15 μmol
Lipid) wurde mit 1 ml HVJ-Suspension [30.000 hämagglutinierende Einheiten
(HAU)] vermischt und bei 37 °C
eine Stunde lang unter Durchmischung (120U/min) in einem Wasserbad
inkubiert. Die HVJ-Liposomenkomplexe wurden dann aus freiem HVJ
durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation ausgelöst. Das Gemisch
wurde auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten (1 ml 50%ige
und 6,5 ml 30%ige Saccharose in BSS) geschichtet und bei 62.800
g bei 4 °C
1,5 Stunden lang in einem Schwingbecherrotor zentrifugiert. Dann
wurden die HVJ-Liposomen in einer Schicht zwischen BSS und 30%iger
Saccharoselösung
sichtbar gemacht, und freies HVJ wurde in einer Schicht zwischen
30%iger und 50%iger Saccharoselösung
sedimentiert. Die Erfinder sammelten HVJ-Liposomen unter Verwendung
einer Pasteur-Pipette in einem sterilisierten Röhrchen. Das Volumen von HVJ-Liposomen
betrug üblicherweise
etwa 0,5 ml, und das Gesamtvolumen wurde mit BSS auf 1 ml eingestellt.
-
BEISPIEL 6
-
LACZ-RNA-EXPRESSION
IN MAUSMILZ NACH RNA-IMPFUNG DURCH HVJ-DC-LIPOSOM
-
300
mg von LacZ-RNA, synthetisiert durch pSFV3-IacZ-Vektorsystem, wurden
in HVJ-DC-Liposom (kationischer Typ) inkorporiert. Ein Zehntel (50 μl) von HVJ-DC-Liposomenlösung (Gesamt
500 μl) wurde
direkt in die Milz von C57/BL6-Mäusen
injiziert. Die Mäuse
wurden an den Tagen 1, 3, 5 und 7 nach der Injektion getötet. Die
Milz wurde isoliert, mit PBS zweimal gewaschen und mit 300 μl Detergens-Lysepuffer
lysiert. 40 μl
von jedem Extrakt wurde unter Verwendung eines Luminecent betagal
Detection Kit II (Clontech) auf LacZ-Aktivität getestet. Das Signal wurde
durch ein Röhrchenluminometer (Lumat
LB 9507; Bertold) nachgewiesen. Jeder Wert in 6 ist
der Mittelwert von doppelt ausgeführten Proben.
-
Die
höchste
LacZ-Aktivität
wurde an den Tagen 1 und 3 erzielt, sank dann um 25 % vom höchsten Wert
ab, und an Tag 7 nach dem Transfer wurde schließlich keine Aktivität mehr nachgewiesen. 6.
-
Die
vorliegende Erfindung ist in ihrem Schutzumfang durch die beispielhaft
dargestellten Ausführungsformen,
die als Veranschaulichungen einzelner Aspekte der Erfindung beabsichtigt
sind, nicht eingeschränkt,
und Verfahren, die funktionell äquivalent sind,
liegen ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung. Verschiedene Modifikationen
der Erfindung, zusätzlich
zu jenen, die hierin beschrieben wurden, werden Fachleuten auf Grundlage
der obigen Beschreibung und der beiliegenden Zeichnungen möglich sein.
Solche Modifikationen sollen in den Schutzumfang der beiliegenden
Ansprüche
fallen.
-
Alle
im Rahmen der vorliegenden Beschreibung zitierten Verweise sind
in ihrer Gesamtheit hierin aufgenommen.
-
VERWEISE
-
- Autran, B., et al., "Monoclonal
B-cell Response to Diphtheria Toxoid:
- Evidence for Cross-Reactive Epitopes," Immunol. (1987); 60: 531-538.
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in Peripheral Blood and Bone Marrow: Utility as Tumor Marker for
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- Conry, R.M., et al. "Characterization
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