DE69920915T2

DE69920915T2 - Monophosphoryllipid a enthaltende adjuvans- und impfstoffzusammensetzungen

Info

Publication number: DE69920915T2
Application number: DE69920915T
Authority: DE
Inventors: James Vincent LAPOSTA; Hayward John ELDRIDGE
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 1998-07-14
Filing date: 1999-07-13
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2019-07-14
Also published as: CA2333578C; CA2333578A1; ES2229745T3; EP1096954A2; CN1307483A; AU763770B2; WO2000003744A2; IL140890A0; DK1096954T3; WO2000003744A3; BR9912067A; DE69920915D1; KR100586804B1; CN1247262C; AU5101899A; KR20010071637A; JP2002520373A; EP1096954B1; ATE278420T1; PT1096954E

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft verbesserte Adjuvans und Impfstoffzusammensetzungen, Verfahren zum Herstellen besagter verbesserter Adjuvans und Impfstoffzusammensetzungen und Verfahren zum Verwenden der verbesserten Zusammensetzungen.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Herkömmliche Impfstoffe sind seit vielen Jahren verwendet worden, um Menschen und Tiere vor einer großen Vielfalt an infektiösen Erkrankungen zu schützen. Typischerweise enthalten diese herkömmlichen Impfstoffe ein oder mehrere Antigene, welche ein abgeschwächtes Pathogen, getötetes Pathogen oder einen immunogenen Bestandteil eines Pathogens einschließen können. In einigen Impfstoffen können das Antigen oder die Antigene allein eingesetzt werden, um schützende Immunresponses auszulösen. In anderen Impfstoffen können das Antigen oder die Antigene zusammen mit einem oder mehreren Adjuvanzien eingesetzt werden, um die Immunogenizität eines Antigens zu verstärken. Ein solches nach Stand der Technik bekanntes Adjuvans ist Monophosphoryl-Lipid-A, welches vom Lipopolysaccharid von Salmonella minnesota R595 abgeleitet wird. Es ist ebenfalls nach Stand der Technik bekannt, dass Monophosphoryl-Lipid-A eine Lipidmaterial ist, welches in einer wässerigen Umgebung spontan mit sich selbst aggregiert. Darüber hinaus ist es bekannt, dass der Grad der Aggregation eine Wirkung auf die Wirksamkeit von Monophosphoryl-Lipid-A als Immunstimulanz insofern hat, als dass das aggregierte Monophosphoryl-Lipid-A weniger stimulierend ist.
WO-9801139-A offenbart ein Präparat zur Injektion, welches ein Lipid-A Analog enthält, und ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Lösen eines Lipid-A Analogs in einer alkalischen wässerigen Lösung und Zugeben eines Puffers dazu.
EP-A-0812593 offenbart eine Impfstoffzusammensetzung, welche ein Antigen in Verbindung mit 3-O-entacyliertem Monophosphoryl-Lipid-A (MPL) umfasst, worin die Partikelgröße klein ist und bei der Herstellung im Allgemeinen 120 nm nicht überschreitet.
Monophosphoryl-Lipid-A wird typischerweise als das Triethylaminsalz in Form eines gefriergetrockneten weißen Pulvers erhalten. Da es sehr hydrophob ist, bildet das gefriergetrocknete Monophosphoryl-Lipid-A nicht leicht eine klare Lösung, wenn es mit Wasser rekonstituiert wird, sondern ergibt stattdessen ein trübes Gemisch mit sichtbaren weißen Teilchen von heterogener Größe, die beim Stehenlassen ausfällen und weiter aggregieren. Um ein annehmbares wässeriges Präparat aus Monophosphoryl-Lipid-A herzustellen, ist es bekannt, das gefriergetrocknete Monophosphoryl-Lipid-A Triethylaminsalz bei 1 bis 2 mg/ml (Gew./Vol.) in 0,2% Triethylamin enthaltendem Wasser zu suspendieren, die Suspension bei 65–70°C zu erhitzen und das Gemisch dann zu beschallen. Das sich ergebende wässerige, leicht opake oder klare Präparat ist eine wässerige, kolloidale Suspension. Das Triethylamin hilft beim Löslichmachen des Monophosphoryl-Lipid-A und kann mit ähnlichen Mengen Triethanolamin substituiert werden.
Wenn wie hierin oben beschrieben hergestellte, wässerige Präparate aus Monophosphoryl-Lipid-A gefroren und dann getaut werden, aggregiert das Monophosphoryl-Lipid-A jedoch, was ein trübes Gemisch ergibt, welches dem trüben Gemisch aus Monophosphoryl-Lipid-A vor der Beschallung in der Erscheinung ähnelt. Ähnlich ist das Ergebnis, wenn ein wässeriges Präparat von Monophosphoryl-Lipid-A wie hierin oben beschrieben gefriergetrocknet und dann rehydriert wird, ebenfalls ein trübes Gemisch aus aggregiertem Monophosphoryl-Lipid-A.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht zum Stand der Technik eine gefriergetrocknete Zusammensetzung vor, welche Monophosphoryl-Lipid-A enthält, welche Zusammensetzung ein verbessertes Rekonstitutionsmerkmal aufweist und welche die Ausfällungs- und Aggregationsprobleme nach Stand der Technik vermeidet. Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung eine gefriergetrocknete Zusammensetzung vor, welche Monophosphoryl-Lipid-A, Zucker und gegebenenfalls einen zugegebenen Amin-basierten Surfactanten umfasst und in der Lage ist, mit einem wässerigen Verdünnungsmittel rekonstituiert oder rehydriert zu werden, um ohne weitere Beschallung eine wässerige, kolloidale Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A mit einer Lichtdurchlässigkeit von mindestens 88% zu bilden, wie spektrophotometrisch gemessen. Die gefriergetrocknete Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst bis zu etwa 5 Gew.-% Monophosphoryl-Lipid-A, mehr als etwa 70 Gew.-% Zucker und von etwa 0 bis etwa 30 Gew.-% gegebenenfalls zugegebenen Amin-basierten Surfactanten, wobei besagte Gew.-% auf den Gesamtgewichten von Monophosphoryl-Lipid-A, Zucker und, falls vorhanden, Amin-basiertem Surfactanten basieren. Vorzugsweise umfasst die gefriergetrocknete Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung bis zu etwa 5 Gew.-% Monophosphoryl-Lipid-A; von etwa 70 bis etwa 99,99 Gew.-% Zucker und von etwa 0 bis etwa 28 Gew.-% gegebenenfalls zugegebenen Amin-basierten Surfactanten. Bevorzugter umfasst die gefriergetrocknete Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung bis zu etwa 4 Gew.-% Monophosphoryl-Lipid-A, von etwa 75 bis etwa 99,99 Gew.-% Zucker und von etwa 0 bis etwa 22 Gew.-% gegebenenfalls zugegebenen Amin-basierten Surfactanten. Die gefriergetrocknete Zusammensetzung kann ferner eine immunologisch wirksame Menge von einem Antigen oder Antigenen umfassen. Die gefriergetrocknete Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann mit einem wässerigen Verdünnungsmittel bei Konzentrationen bis zu etwa 210 mg gefriergetrocknete Zusammensetzung pro ml wässerigem Verdünnungsmittel, vorzugsweise von etwa 10 mg gefriergetrocknete Zusammensetzung pro ml wässerigem Verdünnungsmittel bis etwa 210 mg gefriergetrocknete Zusammensetzung pro ml wässerigem Verdünnungsmittel rekonstituiert oder rehydriert werden, um ohne weitere Beschallung eine wässerige, kolloidale Suspension zu bilden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen einer wässerigen, kolloidalen Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A, wobei die wässerige, kolloidale Suspension zur Lagerung gefroren wird und dann ohne nach Stand der Technik bekannte Probleme von Ausfällen und Aggregation zur Verwendung getaut werden kann. Durch dieses Verfahren wird das Monophosphoryl-Lipid-A in einem wässerigen Verdünnungsmittel und gegebenenfalls mit einem Amin-basierten Surfactanten und auch gegebenenfalls einem Antigen oder Antigenen gemischt. Eine wässerige, kolloidale Suspension wird durch Beschallen, gegebenenfalls mit Erhitzen oder andere bekannte Verfahren gebildet, wie detaillierter hiernach beschrieben. Zucker wird in einer Menge von etwa 10 mg/ml bis etwa 200 mg/ml entweder vor oder nach der Bildung einer wässerigen, kolloidalen Suspension zum Gemisch zugegeben. Der Zucker kann die Form eines Feststoffs oder die Form einer wässerigen Lösung haben. Die sich ergebende wässerige, kolloidale Suspension kann dann gefroren werden. Tauen der gefrorenen, wässerigen, kolloidalen Suspension ergibt ohne weitere Beschallung eine wässerige, kolloidale Suspension, welche Monophosphoryl-Lipid-A mit einer Lichtdurchlässigkeit von mehr als oder gleich 88% enthält, wie spektrophotometrisch gemessen. Ein Antigen oder Antigene, wie hiernach definiert, kann zur getauten, wässerigen, kolloidalen Suspension zugegeben werden, um eine Impfstoffzusammensetzung zu bilden, welche einem Wirbeltier verabreicht werden kann. Alternativ, falls die wässerige, kolloidale Suspension ein Antigen vor dem Gefrieren enthält, kann die Impfstoffzusammensetzung getaut und einem Wirbeltier verabreicht werden.
Die wässerigen, kolloidalen Suspensionen der vorliegenden Erfindung sind eine besondere Art der flüssigen Suspension, in welcher die Partikel von suspendiertem Monophosphoryl-Lipid-A in einer sehr fein geteilten, aber nicht in gelöster Form vorhanden sind. Die wässerigen kolloidalen Suspensionen, welche Monophosphoryl-Lipid-A, Zucker und gegebenenfalls einen Amin-basierten Surfactanten enthalten, gemäß der vorliegenden Erfindung, sind echte Suspensionen, keine Lösungen, und haben nicht die Eigenschaft, anders als gewöhnliche Suspensionen von Monophosphoryl-Lipid-A, auszufällen und zu aggregieren. Das Vorhandensein der wässerigen, kolloidalen Suspensionen der vorliegenden Erfindung kann durch Lichtdurchlässigkeit bestimmt werden. So ist eine wässerige, kolloidale Suspension, welche Monophosphoryl-Lipid-A, Zucker und gegebenenfalls einen Amin-basierten Surfactanten gemäß der vorliegenden Erfindung enthält eine, welche eine Lichtdurchlässigkeit von mehr als oder gleich 88% aufweist, wie spektrophotometrisch gemessen.
Die vorliegende Erfindung löst die Ausfällungs- und Aggregationsprobleme des Standes der Technik durch Vorsehen der Zugabe von Zucker zu einer wässerigen, kolloidalen Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A vor Gefrieren oder Gefriertrocknung. Der Zucker kann entweder vor oder nach Bildung der wässerigen, kolloidalen Suspension zugegeben werden, aber muss vor Gefrieren oder Gefriertrocknung der Suspension zugegeben werden. Die Zugabe von Zucker zu einer wässerigen, kolloidalen Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A vor Gefrieren oder Gefriertrocknung sieht eine Zusammensetzung vor, welche nach dem Gefrieren getaut werden kann, um eine wässerige, kolloidale Suspension ohne weitere Beschallung zu bilden, oder welche alternativ nach Gefriertrockung mit einem geeigneten wässerigen Verdünnungsmittel rekonstituiert und ohne weitere Beschallung eine wässerige, kolloidale Suspension ergeben kann, wie hierin oben beschrieben. Geeignete Zucker schließen die Monosaccharide Dextrose, Mannose, Galactose und Fructose, als auch die Disaccharide Sucrose, Lactose, Isomaltose, Maltose und Trehalose ein. Gemische aus Zuckern, zum Beispiel Sucrose und Dextrose, können ebenfalls eingesetzt werden. Diese Zucker sind alle nicht toxisch und pharmazeutisch annehmbar. Sucrose und Dextrose werden bevorzugt. Der Zucker kann die Form eines Feststoffes oder die Form einer wässerigen Lösung haben. Geeignete wässerige Verdünnungsmittel schließen Wasser oder Kochsalzlösung ein und können auch ein Antigen oder Antigene einschließen und können zusätzlich Konservierungsmittel oder zusätzliche Adjuvanzien oder weitere pharmazeutisch annehmbare Zusatzstoffe, Vehikel oder Träger enthalten. Geeignete Amin-basierte Surfactanten schließen Triethylamin (TEA) und Triethanolamin (TEM) ein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine rekonstituierte oder rehydrierte wässerige, kolloidale Suspension, welche, trotz der Eliminierung eines weiteren Beschallungsschritts, durch Rekonstituierung der hierin oben beschriebenen gefriergetrockneten Zusammensetzung mit einem wässerigen Verdünnungsmittel erhalten wird. Wie hierin oben diskutiert war vor der vorliegenden Erfindung ein Beschallungsschritt notwendig, um eine wässerige, kolloidale Suspension zu erhalten, welche Monophosphoryl-Lipid-A enthält. Jedoch ist nun herausgefunden worden, dass wenn ein wässeriges Verdünnungsmittel zu der hierin oben beschriebenen gefriergetrockneten Zusammensetzung zugegeben wird, eine wässerige, kolloidale Suspension, welche Monophosphoryl-Lipid-A enthält, ohne weitere Beschallung erhalten wird. Die so erhaltene rekonstituierte, wässerige, kolloidale Suspension weist eine Lichtdurchlässigkeit von mehr als oder gleich 88% auf, wenn spektrophotometrisch gemessen. Überraschend ist die so erhaltene, rekonstituierte, wässerige, kolloidale Suspension in der Lage, gefroren und, nach Tauen, wieder zu einer wässerigen, kolloidalen Suspension gebildet zu werden, welche eine Lichtdurchlässigkeit von größer als oder gleich 88% aufweist. Die rekonstituierte, wässerige, kolloidale Suspension der vorliegenden Erfindung umfasst bis zu etwa 2,5 mg Monophosphoryl-Lipid-A pro ml wässerigem Verdünnungsmittel, von etwa 10 bis 200 mg Zucker pro ml wässerigem Verdünnungsmittel, von etwa 0 bis etwa 6 mg Aminbasierten Surfactanten pro ml wässerigem Verdünnungsmittel. Vorzugsweise umfasst die rekonstituierte, wässerige, kolloidale Suspension der vorliegenden Erfindung bis zu etwa 2,0 mg Monophosphoryl-Lipid-A pro ml wässerigem Verdünnungsmittel, von etwa 20 bis 150 mg Zucker pro ml wässerigem Verdünnungsmittel und von etwa 0 bis etwa 3 mg Amin-basierten Surfactanten pro ml Verdünnungsmittel. Die rekonstituierte, wässerige, kolloidale Suspension kann ferner eine immunologisch wirksame Menge von einem Antigen oder Antigenen umfassen. Geeignete Zucker, Amin-basierte Surfactanten und wässerige Verdünnungsmittel sind wie hierin oben beschrieben.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Impfstoffzusammensetzung, welche die hierin beschriebene gefriergetrocknete Zusammensetzung und die rekonstituierte, wässerige, kolloidale Suspension in Kombination mit einer immunologisch wirksamen Menge von einem Antigen oder Antigenen umfasst. Die wirksame Menge von einem Antigen oder Antigenen kann gegebenenfalls in dem wässerigen Verdünnungsmittel vorgesehen werden. Insbesondere umfasst die Impfstoffzusammensetzung ferner eine immunologisch wirksame Menge von einem Antigen oder Antigenen, welche aus einem Bakterium, einem Virus, einem Parasiten, einer Krebszelle oder einem Allergen abgeleitet oder hergestellt wird. Eine wirksame Menge Antigen wird als die Menge an Antigen definiert, die, wenn sie an ein Tier oder einen Menschen verabreicht wird, eine Immunresponse hervorruft, wie durch Produktion von spezifischen Antikörpern oder Zell-vermittelten Effektormechanismen gemessen. Immunologisch wirksame Mengen von einem Antigen oder Antigenen betragen im Allgemeinen von etwa 1 μg oder weniger bis 5 mg. Eine wirksame Menge des Monophosphoryl-Lipid-A Adjuvans ist die Menge an Monophosphoryl-Lipid-A, die, wenn sie zu einem Impfstoff zugegeben wird, die Größe oder Qualität oder Dauer der Immunresponse gegenüber dem Antigen oder Antigenen in dem Impfstoff verstärken wird. Eine wirksame Menge des Adjuvans Monophosphoryl-Lipid-A liegt im Bereich von etwa 1 μg bis etwa 1 mg.
Geeignete Antigene für die Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen jede Einheit ein, welche in der Lage ist, eine Antikörper oder Zell-vermittelte immunologische Response in einem diesem Antigen ausgesetzten Wirbeltier zu erzeugen, welche speziell gegen diese Einheit gerichtet ist. Es können ein oder mehrere Antigene eingesetzt werden. Das Antigen oder die Antigene können von pathogenen Mikroorganismen einschließlich Viren, Bakterien, Mykoplasmen, Pilzen, Protozoen und anderen Parasiten abgeleitet werden. Ferner kann das Antigen oder die Antigene von anderen Quellen als Mikroorganismen abgeleitet werden, zum Beispiel Krebszellen oder Allergenen. Das Antigen oder die Antigene können das Ganze oder Teil eines pathogenen Mikroorganismus sein, oder das Ganze oder Teil eines Proteins, Glycoproteins, Glycolipids, Polysaccharids oder Lipopolysaccharids sein, welches mit dem Organismus in Verbindung gebracht wird, oder das Antigen oder die Antigene können ein Polypeptid oder eine andere Einheit sein, welche das Ganze oder Teil eines solchen Proteins, Glycoproteins, Glycolipids, Polysaccharids oder Lipopolysaccharids nachahmt.
Pathogene Mikroorganismen, aus welchen Antigene zu Impfzwecken hergestellt oder abgeleitet werden können, sind im Bereich der Infektionskrankheiten gut bekannt, wie zum Beispiel in Medical Microbiology, 2. Auflage, (1990) J. C. Sherris (Hrsg.), Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York und Zinsser Microbiology, 20. Auflage (1992), W. K. Joklik et al. (Hrsg.), Appleton & Lange Publishing Division of Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey aufgeführt. Beispiele für Organismen von Interesse für humane Impfstoffe schließen Chlamydia, Nontypeable Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Gruppe A Streptococcus, Gruppe B Streptococcus, Herpes simplex Virus, humanes Immunschwächevirus, humanes Papillomavirus, Influenza, Masern, Parainfluenza, Respiratory Syncytial Virus, Rotavirus, Norwalk Virus und weitere ein.
Das Antigen oder die Antigene können Glycokonjugate enthalten, welche Polysaccharid-Antigen oder Antigene enthalten, zum Beispiel bakterielles, kapselförmiges Polysaccharid oder Fragment davon, welches an ein Protein-Trägermolekül chemisch gebunden ist, um Immunogenizität zu verstärken. Verfahren zum Herstellen von Konjugaten aus bakteriellem, kapselförmigen Polysaccharid und Protein-Trägermolekülen sind nach Stand der Technik gut bekannt und können zum Beispiel in Dick und Burret, Contrib. Microbiol. Immunol. 10: 48–114 (Cruse JM, Lewis RE Jr., Hrsg.; Basel Kruger (1989) gefunden werden. Geeignete Konjugate, einschließlich Pneumokokken-Glycokonjugat, werden detaillierter in US-4673574, US-4761283, US-4902506, US-5097020 und US-5360897 beschrieben.
Auch wird ein Verfahren zum Immunisieren eines Wirbeltiers durch Impfung vorgesehen, welches Verabreichen einer wirksamen Menge einer Impfstoffzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung an besagtes Wirbeltier umfasst.
Auch wird ein Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten Zusammensetzung vorgesehen, welches umfasst:

a. Suspendieren von Monophosphoryl-Lipid-A in einer Menge bis zu etwa 5 mg/ml und gegebenenfalls einen Amin-basierten Surfactanten in einer Menge von 0 bis etwa 6 mg/ml in einem wässerigen Verdünnungsmittel;
b. Bilden einer wässerigen, kolloidalen Suspension mit einer Lichtdurchlässigkeit größer als oder gleich 88%, wie spektrophotometrisch gemessen;
c. Zugeben von Zucker bei etwa 10 bis 200 mg/ml entweder vor oder nach Bilden der wässerigen, kolloidalen Suspension;
d. Gefriertrocknen der Zucker enthaltenden, wässerigen, kolloidalen Suspension; und
e. Gewinnen einer gefriergetrockneten Zusammensetzung.

Auch wird ein Verfahren zum Herstellen einer gefriergetrockneten Zusammensetzung vorgesehen, welches umfasst:

a. Erhitzen von Lipopolysaccharid von gram-negativ Bakterien Salmonella minnesota R595 in einer Mineralsäure von moderater Stärke für einen ausreichenden Zeitraum, um ein Monophosphorylderivat zu erhalten;
b. Lösen des Monophosphorylderivats in einem organischen Lösungsmittel und Trocknen;
c. Behandeln des Monophosphorylderivats mit mildem Alkali, um eine Base-labile Fettsäurekette an der 3-Position zu entfernen, um 3-entacyliertes Monophosphoryl-Lipid-A zu erhalten;
d. Reinigen des 3-entacylierten Monophosphoryl-Lipid-A durch Flüssigkeitschromatographie und Gewinnen von Monophosphoryl-Lipid-A;
e. Suspendieren von Monophosphoryl-Lipid-A in einer Menge bis zu etwa 5 mg/ml und gegebenenfalls einen Amin-basierten Surfactanten in einer Menge von 0 bis etwa 6 mg/ml in einem wässerigen Verdünnungsmittel;
f. Bilden einer wässerigen, kolloidalen Suspension mit einer Lichtdurchlässigkeit größer als oder gleich 88%, wie spektrophotometrisch gemessen;
g. Zugeben von Zucker bei etwa 10 bis 200 mg/ml entweder vor oder nach Bilden der wässerigen, kolloidalen Suspension;
h. Gefriertrocknen der Zucker enthaltenden, wässerigen, kolloidalen Suspension; und
i. Gewinnen einer gefriergetrockneten Zusammensetzung.

Auch wird ein Verfahren zur Herstellung einer wässerigen, kolloidalen, Monophosphoryl-Lipid-A enthaltenden Suspension vorgesehen, welche in der Lage ist, gefroren und getaut zu werden, welches umfasst:

a. Suspendieren von Monophosphoryl-Lipid-A in einer Menge bis zu etwa 5 mg/ml und gegebenenfalls einen Amin-basierten Surfactanten in einer Menge von 0 bis etwa 6 mg/ml in einem wässerigen Verdünnungsmittel;
b. Bilden einer wässerigen, kolloidalen Suspension mit einer Lichtdurchlässigkeit größer als oder gleich 88%, wie spektrophotometrisch gemessen;
c. Zugeben von Zucker bei etwa 10 bis 200 mg/ml entweder vor oder nach Bilden der wässerigen, kolloidalen Suspension;
d. Gefrieren der Zucker enthaltenden, wässerigen, kolloidalen Suspension; und
e. Tauen und Rückgewinnen der wässerigen, kolloidalen Suspension.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Herstellung von Monophosphoryl-Lipid-A wird in US-Patent Nr. 4912094 beschrieben. Kurz: Monophosphoryl-Lipid-A wird durch Refluxieren von Lipopolysaccharid (oder Lipid A), erhalten von heptoselosen Mutanten von gram-negativen Bakterien, Salmonella minnesota R595, in Mineralsäurelösungen von moderater Stärke (z.B. 0,1 N HCl) für einen Zeitraum von etwa 30 Minuten hergestellt. Geeignete Mineralsäuren schließen Salzsäure, Schwefelsäure und Ähnliche ein. Diese Behandlung ergibt den Verlust der Phosphat-Komponente an Position 1 des Reduktions-End-Glucosamins. Das Kern-Kohlenhydrat wird während dieser Behandlung von der 6'-Position des Nicht-Reduktions-Glucosamins entfernt. Das Ergebnis ist ein Monophosphorylderivat von Lipid A. Das Monophosphorylderivat von Lipid A wird in organischen Lösungsmitteln gelöst und mit sehr mildem Alkali behandelt, welches die Baselabile Fettsäurekette an der 3-Position entfernt, um 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A zu ergeben, was anzeigt, dass Position 3 des Reduktions-End-Glucosamins de-O-acyliert ist. Chemisch ist es ein Gemisch aus 3-entacyliertem Monophosphoryl-Lipid-A mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten. Geeignete organische Lösungsmittel schließen Methanol (Alkohole), Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Chloroform, Dichlormethan und Ähnliche ein, als auch Gemische daraus. Kombinationen aus Wasser und einem oder mehreren dieser organischen Lösungsmittel können ebenfalls eingesetzt werden. Geeignete alkalische Basen können aus verschiedenen Hydroxiden, Carbonaten, Phosphaten und Aminen ausgewählt werden. Veranschaulichende Basen schließen die anorganischen Basen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbicarbonat und Ähnliche ein und organische Basen wie Alkylamine und schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Diethylamin, Triethylamin und Ähnliche. Das 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A wird durch Flüssigkeitschromatographie gereinigt und in das monobasische Triethylamin-(Triethylammonium)salz umgewandelt.
Der Begriff Monophosphoryl-Lipid-A, wie hierin verwendet, bedeutet 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A als das monobasische Triethylamin-(Triethylammonium)salz.
Um die gefriergetrocknete Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird das Monophosphoryl-Lipid-A zu einem wässerigen Verdünnungsmittel, vorzugsweise Wasser, in Mengen bis zu 5 mg Monophosphoryl-Lipid-A pro ml wässerigem Verdünnungsmittel, vorzugsweise bis zu 2,5 mg/ml und bevorzugter von etwa 0,5 bis 2,5 mg/ml zugegeben. Gegebenenfalls wird ein zugegebener Amin-basierter Surfactant in einer Menge von etwa 0 bis etwa 6 mg/ml, vorzugsweise 0 bis 3 mg/ml eingesetzt.
Eine wässerige, kolloidale Suspension mit einer Lichtdurchlässigkeit von mehr als oder gleich 88%, wie spektrophotometrisch gemessen, wird durch Beschallung, gegebenenfalls mit Erhitzen oder andere Verfahren gebildet. Erhitzen ist optional, wird aber bevorzugt, um die Bildung der wässerigen, kolloidalen Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A zu erleichtern. Eine geeignete Beschallungsausrüstung schließt zum Beispiel einen Sondenbeschaller (Vibracell VCX600; Sonica), befestigt an Sonden ein, deren Größen für das zu verarbeitende Volumen angemessen sind, oder einen Badbeschaller wie das Modell Nr. G112SP1T, erhalten von Laboratory Supplies Co. Inc., (Hicksville, NY). Weitere ähnliche Ausrüstung, welche in der pharmazeutischen Industrie verwendet wird, wäre für die Beschallung von Monophosphoryl-Lipid-A ebenfalls angemessen.
Die wässerige, kolloidale Suspension von Monophosphoryl-Lipid-A kann durch andere Verfahren als Beschallung gebildet werden, zum Beispiel durch Scherkräfte, wie sie in einem Mikrofluidifizierer erzeugt würden.
Zucker wird entweder vor oder nach Bildung des wässerigen, kolloidalen Suspension in Mengen von 10 bis 200 mg Zucker pro ml wässerigem Verdünnungsmittel, vorzugsweise von etwa 20 bis 150 mg/ml ebenfalls zugegeben. Die wässerige, kolloidale Suspension, welche Monophosphoryl-Lipid-A, Zucker und gegebenenfalls einen zugegebenen Amin-basierten Surfactanten und gegebenenfalls eine immunologisch wirksame Menge von einem Antigen oder Antigenen in den hierin oben angeführten Mengen enthält, wird gefriergetrocknet, um die gefriergetrocknete Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zu ergeben.
Die wässerige, kolloidale Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A, Zucker und gegebenenfalls einem Amin-basierten Surfactanten von einem Antigen oder Antigenen wird gefriergetrocknet, um die gefriergetrocknete Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zu ergeben. Wie den Fachleuten bekannt ist, ist Gefriertrocknen ein Trocknungsverfahren, bei welchem Wasser durch Anwenden eines Vakuums aus dem Produkt nachdem es gefroren ist sublimiert wird. Spezifizierungen für Lyophilisierung oder Gefriertrocknen werden in Remingtons's Pharmaceutical Sciences, Kapitel 84, Seite 1565, 18. Auflage, A. R. Gennaro, Herausgeber, 1990, Mack Publishing Company beschrieben.
Ob eine wässerige, kolloidale Suspension gebildet wird, wird durch Messen der Lichtdurchlässigkeit bestimmt. Es ist herausgefunden worden, dass Zusammensetzungen mit einer Lichtdurchlässigkeit von mindestens 88% die Eigenschaften von kolloidalen Suspensionen aufweisen. Die Lichtdurchlässigkeit wird unter Ver wendung eines Spektrophotometers gemessen, in welchem eine flüssige Probe in einer Glas-, Quartz- oder Kunststoffküvette mit einem Lichtweg von 1 Zentimeter beleuchtet wird. Das Licht kann das sichtbare oder unsichtbare Spektrum haben, aber für Messungen von Lichtdurchlässigkeit dieser Art kann eine Wellenlänge von 650 nm angemessen verwendet werden. Die Menge an Licht, welche durch die Probe passiert (also durchgelassen wird), wird auf eine Blind-Küvette bezogen, welche das Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel enthält, worin das Material gelöst oder suspendiert ist. Proben, die das Licht nicht absorbieren oder streuen, werden 100% Lichtdurchlässigkeit aufweisen, während jene, die das gesamte Licht absorbieren oder streuen, 0% Lichtdurchlässigkeit haben werden.
Ohne Wunsch, durch Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die vorteilhaften Ergebnisse der Erfindung erhalten werden, weil die Zugabe von Zucker entweder vor oder nach der Bildung einer wässerigen, kolloidalen Suspension, welche Monophosphoryl-Lipid-A enthält, das Monophosphoryl-Lipid-A von Aggregation entweder beim Gefrieren oder Tauen der wässerigen, kolloidalen Suspension oder beim Gefriertrocknen der wässerigen, kolloidalen Suspension und Rekonstitution oder Rehydration mit einem wässerigen Verdünnungsmittel abhält. Durch Einschließen von Zucker in eine wässerige, kolloidale Suspension, welche Monophosphoryl-Lipid-A enthält, vor der Gefriertrocknung, kann die gefriergetrocknete Zusammensetzung mit einem wässerigen Verdünnungsmittel wie Wasser oder Kochsalzlösung ohne das Problem von Reaggregation des Monophosphoryl-Lipid-A rekonstituiert werden. Zusätzlich verursacht Gefrieren der rekonstituierten, kolloidalen Suspension oder Impfstoffzusammensetzung kein erneutes Auftreten von Aggregation. Ähnlich wird durch Einschließen von Zucker in eine wässerige, kolloidale Suspension, welche Monophosphoryl-Lipid-A enthält, vor dem Gefrieren, bei Tauen wieder eine gefrorene, wässerige, kolloidale Suspension ohne Bedarf an weiterer Beschallung erhalten. Die Fähigkeit von Zucker, Aggregation des Monophosphoryl-Lipid-A zu verhindern, ist offensichtlich, unabhängig davon, ob die wässerige, kolloidale Suspension, welche Monophosphoryl-Lipid-A enthält, in Wasser allein hergestellt wird, oder in Wasser, welches Triethylamin oder Triethanolamin enthält.
Somit sieht die Zugabe von Zucker zu Monophosphoryl-Lipid-A enthaltenden, wässerigen Zusammensetzungen entweder vor oder nach Bilden einer wässerigen, kolloidalen Suspension überraschende und unerwartete Ergebnisse vor, wenn solche wässerigen, kolloidalen Suspensionen entweder gefroren und getaut oder gefriergetrocknet und rekonstituiert werden. Solche Ergebnisse erlauben ferner die vorteilhafte Herstellung von Impfstoffzusammensetzungen.
Die folgenden Beispiele werden vorgesehen, um die Erfindung zu veranschaulichen.
Beispiel 1
Herstellung eines trüben Gemisches und Messung von Lichtdurchlässigkeit
Monophosphoryl-Lipid-A (RIBI ImmunoChem., Hamilton, MT) wird in Wasser bei 1 mg/ml (Gew./Vol.) suspendiert, wodurch ein trübes Gemisch mit sichtbaren weißen Teilchen von heterogener Größe gebildet wird. Das trübe Gemisch wird in einen Shimadzu UV-1601, UV-Visible Spektrophotometer platziert und mit Licht von einer Wellenlänge von 650 nm beleuchtet. Das trübe Gemisch erlaubt 3,3% des Einfallslichts zu passieren (also %-Durchlässigkeit = 3,3). Es wird keine wässerige, kolloidale Suspension gefunden.
Beispiel 2
Herstellung von wässeriger, kolloidaler Suspension und Messung von Lichtdurchlässigkeit
Monophosphoryl-Lipid-A wird bei 1 mg/ml (Gew./Vol.) in Wasser suspendiert, welches 0,5% Triethanolamin (Vol./Vol.) (5,62 mg/ml (Gew./Vol.)) oder 0,2% Triethylamin (Vol./Vol.) (1,46 mg/ml (Gew./Vol.)) enthält. Die Proben werden bei 56–65°C für 10–15 Minuten erhitzt und unter Verwendung von entweder einem Sondenbeschaller (Vibracell VCX600), eingestellt bei 30% Stärke unter Verwendung einer zugespitzten Mikrospitze, oder eines Badbeschallers (Modell Nr. G112SP1T, Laboratory Supplies Co. Inc., Hicksville, NY), verwendet bei voller Stärke für 2 bis 3 Minuten beschallt. Eine klare Suspension wird erhalten und in einen Shimadzu UV-1601, UV-Visible Spektrophotometer platziert und mit Licht von einer Wellenlänge von 650 nm beleuchtet. Die %-Lichtdurchlässigkeit wird bei ≥ 88% gemessen, was die Bildung einer wässerigen, kolloidalen Suspension anzeigt.
Beispiel 3
Herstellung von wässeriger, kolloidaler Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A und Gefriertrocknen
Wässerige, kolloidale Suspensionen aus Monophosphoryl-Lipid-A werden durch Suspendieren von Monophosphoryl-Lipid-A bei 1, 2 oder 5 mg/ml (Gew./Vol.) in Wasser oder Wasser, welches entweder 0,5% Triethanolamin Vol./Vol. (5,6 mg/ml Gew./Vol.) oder 0,2% Triethylamin Vol./Vol. (1,46 mg/ml Gew./Vol.) enthält, gebildet. Jede Monophosphoryl-Lipid-A Suspension wird für 10–15 Minuten bei 56°C bis 65°C erhitzt und dann für insgesamt 2–3 Minuten beschallt, um eine klare Suspension ohne sichtbaren Nachweis von Teilchen zu erhalten. Die Proben (1 bis 1,5 ml) werden unter Verwendung von entweder einem Sondenbeschaller (Vibracell VCX600), eingestellt bei 30% Stärke unter Verwendung einer zugespitzten Mikrospitze, oder eines Badbeschallers (Modell Nr. G112SP1T, Laboratory Supplies Co. Inc., Hicksville, NY), verwendet bei voller Stärke für 2 bis 3 Minuten beschallt. Aliquoten der Monophosphoryl-Lipid-A wässerigen, kolloidalen Suspensionen oben werden mit einer gleichen Menge Wasser oder Sucrose- oder Dextroselösungen mit variierenden Konzentrationen verdünnt. Die sich ergebenden wässerigen, kolloidalen Suspensionen schließen Monophosphoryl-Lipid-A bei 0,5, 1,0 oder 2,5 mg/ml (Gew./Vol.) und Sucrose bei Endkonzentrationen von 10, 50, 100 oder 200 mg/ml (Gew./Vol.) oder Dextrose bei 10, 50, 100 oder 170 mg/ml (Gew./Vol.) ein, wie in Tabelle 1 ausgedrückt. Die Präparate enthielten entweder Triethanolamin (TEM) bei 2,81 oder 5,62 mg/ml oder Triethylamin (TEA) bei 0,73 mg/ml oder keinen Amin-basierten Surfactanten. Die Proben werden in einen Shimadzu UV-1601, UV-Visible Spektrophotometer platziert und mit Licht von einer Wellenlänge von 650 nm beleuchtet. Die %-Lichtdurchlässigkeit, wie in Tabelle 1 dargestellt, reicht von 90,0 bis 99,9%, was die Bildung einer wässerigen, kolloidalen Suspension anzeigt.
Tabelle 1: Zusammensetzungen aus Monophosphoryl-Lipid-A Formulierungen
Gefriertrocknen von Monophosphoryl-Lipid-A Adjuvans-Zusammensetzungen
Die in Tabelle 1 dargestellten wässerigen, kolloidalen Suspensionen werden gefriergetrocknet durch zuerst Gefrieren der Proben in Glasvialen oder Polypropylen-Kulturröhren auf Trockeneis-Pellets für mindestens 30 Minuten. Sie werden dann auf große Gefriertrocknungsgefäße (Labconco) übertragen und an einen Virtus Freeze Dryer angeschlossen. Die Proben werden für 18 Stunden bei einem Vakuum von 250 Millitor und der Kondensatortemperatur von –50°C gefriergetrocknet. Die Zusammensetzung der gefriergetrockneten Adjuvans-Zusammensetzungen wird in Tabelle 2 gezeigt.
Rekonstitution von gefriergetrockneten Adjuvans-Zusammensetzungen
Die wie in Tabelle 2 dargestellten gefriergetrockneten Proben werden mit entweder Wasser oder normaler Kochsalzlösung (0,9% NaCl Gew./Vol.) rekonstituiert, deren Volumen gleich dem Volumen der wässerigen, kolloidalen Suspension vor der Gefriertrocknung ist. Die Daten, welche die %-Lichtdurchlässigkeit der Proben nach der Rekonstitution mit wässerigem Verdünnungsmittel zeigen, werden in Tabelle 2 präsentiert. Wie in Tabelle 2 ge zeigt, führten die gefriergetrockneten Zusammensetzungen, welche Sucrose oder Dextrose in einem Bereich von mehr als 75% bis 99,4% der Zusammensetzung nach Gewicht enthielten, zu wässerigen, kolloidalen Suspensionen, wenn sie mit Wasser oder Kochsalzlösung rehydriert wurden. Für die in Tabelle 2 dargestellten Proben 1–38 reichte die %-Durchlässigkeit nach Rehydrierung von 88,0 bis 98,4%, was die Bildung einer wässerigen, kolloidalen Suspension anzeigt. Proben 15 und 16, welche 99 Gew.-% Zucker nach Gefriertrocknen enthielten, wurden ohne die Zugabe von Aminen (Triethylamin oder Triethanolamin) zur Zeit der Beschallung hergestellt. Als sie mit entweder Wasser oder normaler Kochsalzlösung rehydriert wurden, wurden %-Durchlässigkeitswerte bei 96,1 bzw. 93,6 gemessen, was die Bildung einer wässerigen, kolloidalen Suspension anzeigt. Diese Daten zeigen, dass wenn eine durch Beschallung hergestellte, wässerige, kolloidale Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A mit einer wirksamen Menge an Zucker wie Sucrose oder Dextrose gefriergetrocknet wird, sie mit Wasser oder normaler Kochsalzlösung rehydriert werden kann, um eine wässerige, kolloidale Suspension wiederzugewinnen.
Tabelle 2: Lichtdurchlässigkeitseigenschaften von gefriergetrockneten Monophosphoryl-Lipid-A Zusammensetzungen nach Rehydrierung mit Wasser oder normaler Kochsalzlösung.
Beispiel 4
Unter Verwendung der in Beispiel 3 dargestellten Verfahren werden Formulierungen hergestellt, welche Monophosphoryl-Lipid-A, Zucker und Amin in den in Tabelle 3 dargestellten Mengen enthalten. Die Lichtdurchlässigkeit dieser Formulierungen wird wie in Tabelle 3 dargestellt gemessen, wobei die %-Lichtdurchlässigkeit von 95,4 bis 98,8 reicht, was die Bildung einer wässerigen, kolloidalen Suspension anzeigt.
Tabelle 3: Zusammensetzung von Monophosphoryl-Lipid-A Formulierungen
Unter Verwendung der in Beispiel 3 dargestellten Verfahren werden die Formulierungen von Tabelle 3 gefriergetrocknet und mit Wasser oder Kochsalzlösung rekonstituiert, wie in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4: Lichtdurchlässigkeitseigenschaften von gefriergetrockneten Monophosphoryl-Lipid-A Formulierungen nach Rehydrierung mit Wasser oder normaler Kochsalzlösung
Wenn ohne Zucker gefriergetrocknete Proben (Proben 39–43) mit Wasser oder Kochsalzlösung rehydriert werden, ist das sich ergebende Präparat trübe mit suspendierten Teilchen. Diese Proben weisen eine %-Lichtdurchlässigkeit im Bereich von 22,0 bis 58,6 auf.
Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn Proben 44–47, welche 7,6% bis 62,0 Zucker enthalten, mit Wasser rehydriert werden, was anzeigt, dass keine wässerige, kolloidale Suspension gebildet wird.
Beispiel 5
Gefrieren und Tauen von Monophosphoryl-Lipid-A, beschallt in wässerigem Triethylamin in Gegenwart von Sucrose
Monophosphoryl-Lipid-A wird in Wasser beschallt, welches 0,2% Triethylamin (Vol./Vol.) enthält, und dann mit einem gleichen Volumen Wasser oder mit Wasser, welches zugegebene Sucrose enthält, zusammengemischt, um eine klare Suspension zu ergeben, welche Monophosphoryl-Lipid-A bei 0,5 mg/ml (Gew./Vol.) ohne Sucrose oder 100 mg/ml Sucrose Gew./Vol. und Triethylamin bei einer Endkonzentration von 0,1% Vol./Vol. (0,73 mg/ml Gew./Vol.) enthält. Die Proben (48 und 49) werden in einen Shimadzu IV-1601 UV-Visible Spektrophotometer platziert und mit Licht von 650 nm beleuchtet und jede erlaubte 98.89% des Lichts zu passieren, was somit die Bildung einer wässerigen, kolloidalen Suspension anzeigte. Die kolloidalen Suspensionen werden gefroren und dann getaut. Nach Tauen ist das Monophosphoryl-Lipid-A Präparat ohne Sucrose (Probe 48) trübe mit Teilchen und hat eine %-Lichtdurchlässigkeit von 60,3%, wie in einem Shimadzu IV-1601 UV-Visible Spektrophotometer gemessen und mit Licht von einer Wellenlänge von 650 nm beleuchtet, was anzeigt, dass keine wässerige, kolloidale Suspension gebildet wird. Das Sucrose enthaltende Monophosphoryl-Lipid-A (Probe 49) bleibt nach Gefrieren und Tauen klar und hat eine % Lichtdurchlässigkeit von 97,8, wie in einem Shimadzu UV-1601 UV-Visible Spektrophotometer gemessen und mit Licht von einer Wellenlänge von 650 nm beleuchtet, was die Bildung einer wässerigen, kolloidalen Suspension anzeigt. Diese Daten werden in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5: Lichtdurchlässigkeitseigenschaften vor und nach Gefrieren und Tauen von Monophosphoryl-Lipid-A, beschallt mit Triethylamin und mit oder ohne Sucrose verdünnt
Beispiel 6
Herstellung von Impfstoffzusammensetzungen
a. Herstellung von wässerigen, kolloidalen Suspensionen aus Monophosphoryl-Lipid-A
Unter Verwendung der in Beispiel 3 oben dargestellten Verfahren wird ein Gemisch aus Monophosphoryl-Lipid-A in Wasser von etwa 0,5 mg/ml und ein Amin-basierter Surfactant Triethanolamin bei etwa 2,8 mg/ml erhitzt und beschallt, um eine wässerige, kolloidale Suspension zu ergeben. Entweder vor oder nach der Beschallung aber vor Gefrieren oder Gefriertrocknen wird Sucrose bei einer Endkonzentration zwischen etwa 10 bis 200 mg/ml zugegeben. Die so erhaltene wässerige, kolloidale Suspension kann entweder zur Verwendung in einer Impfstoffzusammensetzung gefro ren und getaut werden, oder mit einem wässerigen Verdünnungsmittel zur Verwendung in einer Impfstoffzusammensetzung gefriergetrocknet und rekonstituiert werden.
b. Herstellung einer wässerigen Impfstoffzusammensetzung aus gefrorener Monophosphoryl-Lipid-A Zusammensetzung
Die wie in (a) oben hergestellte wässerige, kolloidale Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A, Sucrose und Triethanolamin wird gefroren. Sie wird dann getaut und mit einem wässerigen Verdünnungsmittel vereinigt, welches ein Antigen enthält, z.B. ein gemäß US-Patent 5360897 hergestelltes Pneumokokken-Glycokonjugat, um eine Impfstoffzusammensetzung zu erhalten, welche bis zu etwa 400 Mikrogramm Monophosphoryl-Lipid-A pro ml und bis zu etwa 200 Mikrogramm Pneumokokken-Glycokonjugat pro ml enthält. Um eine Impfstoffzusammensetzung zu erhalten, welche 400 Mikrogramm Monophosphoryl-Lipid-A und 200 Mikrogramm Pneumokokken-Glycokonjugat enthält, können zum Beispiel 0,8 ml der getauten kolloidalen Suspension mit 204 Mikrogramm Pneumokokken-Glycokonjugat in 0,2 ml Wasser vereinigt werden. Diese Impfstoffzusammensetzung kann dann an Wirbeltiere, vorzugsweise einen Menschen, unter Verwendung von etwa 0,1 bis 1,0 ml pro Dosis verabreicht werden.
c. Herstellung einer wässerigen Impfstoffzusammensetzung aus gefriergetrockneter Monophosphoryl-Lipid-A Zusammensetzung
Die in (a) oben hergestellte wässerige, kolloidale Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A, Sucrose und Triethanolamin wird gefriergetrocknet. Sie wird dann mit einem wässerigen Verdünnungsmittel rekonstituiert, welches ein Antigen enthält, zum Beispiel ein Pneumokokken-Glycokonjugat, hergestellt gemäß US-Patent 5360897, um eine Impfstoffzusammensetzung zu erhalten, welche bis zu etwa 400 Mikrogramm Monophosphoryl-Lipid-A pro ml und bis zu etwa 200 Mikrogramm Pneumokokken-Glycokonjugat pro ml enthält. Diese Impfstoffzusammensetzung kann dann an ein Wirbeltier, vorzugsweise einen Menschen, unter Verwendung von etwa 0,1 bis 1,0 ml pro Dosis verabreicht werden.
d. Herstellung einer gefrorenen, wässerigen Impfstoffzusammensetzung
Zu der in (a) oben hergestellten wässerigen, kolloidalen Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A, Sucrose und Triethanolamin, wird ein Antigen zugegeben, zum Beispiel ein gemäß US-Patent 5360897 hergestelltes Pneumokokken-Glycokonjugat, um eine Impfstoffzusammensetzung zu erhalten. Die Impfstoffzusammensetzung wird dann gefroren. Die Konzentrationen an Monophosphoryl-Lipid-A und Pneumokokken-Glycokonjugat werden durch Zugabe eines wässerigen Verdünnungsmittels auf bis zu etwa 400 Mikrogramm pro ml, bzw. bis zu etwa 200 Mikrogramm pro ml entweder vor Gefrieren oder nach Gefrieren und Tauen angepasst, unter der Maßgabe, dass die Sucrose bei einer Konzentration von etwa 10 bis 200 mg/ml vor dem Gefrieren gehalten wird. Die gefrorene und getaute Impfstoffzusammensetzung kann dann an ein Wirbeltier, vorzugsweise einen Menschen, unter Verwendung von etwa 0,1 bis 1,0 ml pro Dosis verabreicht werden.
e. Herstellung einer gefriergetrockneten Impfstoffzusammensetzung
Zur in (a) oben hergestellten wässerigen, kolloidalen Suspension aus Monophosphoryl-Lipid-A, Sucrose und Triethanolamin wird zum Beispiel ein gemäß US-Patent 5360897 hergestelltes Pneumokokken-Glycokonjugat zugegeben, um eine Impfstoffzusammensetzung zu erhalten. Das Antigen kann entweder vor oder nach den Erhitzungs- und Beschallungsschritten zugegeben werden. Die Menge an zugegebenem Pneumokokken-Glycokonjugat wird so berechnet, dass bei nachfolgender Rekonstitution der gefriergetrockneten Impfstoffzusammensetzung das wässerige Gemisch bis zu etwa 400 Mikrogramm Monophosphoryl-Lipid-A pro ml und bis zu etwa 200 Mikrogramm Pneumokokken-Glycokonjugat pro ml enthalten wird. Die Impfstoffzusammensetzung wird dann gefriergetrocknet. Nach Gefriertrocknung wird die Zusammensetzung mit einem wässerigen Verdünnungsmittel rekonstituiert. Diese rekonstituierte wässerige Impfstoffzusammensetzung kann dann an ein Wirbeltier, vorzugsweise einen Menschen, unter Verwendung von etwa 0,1 bis 1,0 ml pro Dosis verabreicht werden.

Claims

Gefriergetrocknete Zusammensetzung, welche 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A in einer Menge bis zu 5 Gew.-%, mehr als 70 Gew.-% Zucker und 0 bis 30 Gew.-% eines zugegebenen, Amin-basierten Surfactanten umfasst.
Gefriergetrocknete Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, welche 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A in einer Menge bis zu 4 Gew.-%, Zucker von 75 bis 99,99 Gew.-% und Aminbasierten Surfactanten von 0 bis 22 Gew.-% umfasst.
Gefriergetrocknete Zusammensetzung wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, wobei der Zucker Dextrose, Mannose, Galactose, Fructose, Sucrose, Lactose, Isomaltose, Maltose oder Trehalose umfasst.
Gefriergetrocknete Zusammensetzung wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei der Zucker Sucrose oder Dextrose ist.
Gefriergetrocknete Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, wobei der Amin-basierte Surfactant Triethylamin oder Triethanolamin ist.
Gefriergetrocknete Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, welche ferner eine immunologisch wirksame Menge von einem Antigen oder Antigenen umfasst.
Impfstoffzusammensetzung, welche eine Menge einer gefriergetrockneten Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht und eine immunologisch wirksame Menge von einem Antigen oder Antigenen umfasst.
Impfstoffzusammensetzung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei das Antigen oder die Antigene von einem Bakterium, einem Virus, einem Parasiten, einer Krebszelle oder einem Allergen abgeleitet oder produziert werden.
Impfstoffzusammensetzung wie in Anspruch 7 beansprucht, wobei das Antigen ein Chlamydia, Nontypeable Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Gruppe A Streptococci, Gruppe B Streptococcus, Herpes simplex Virus, humanes Immunschwächevirus, humanes Papillomavirus, Influenza, Masern, Parainfluenza, Respiratory Syncytial Virus, Rotavirus oder Norwalk Virus Antigen ist.
Impfstoffzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 7 bis 9 beansprucht, wobei die immunologisch wirksame Menge von einem Antigen oder Antigenen 1 μg bis 5 mg ist.
Impfstoffzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 7 bis 9 beansprucht, wobei eine wirksame Menge von 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A 1 μg bis 1 mg ist.
Impfstoffzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 7 bis 11 beansprucht, wobei das Antigen ein Konjugat ist, welches kapselförmiges Polysaccharid von Streptococcus pneumoniae, kovalent an Protein gebunden, umfasst.
Wässerige Zusammensetzung, welche eine gefriergetrocknete Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, rekonstituiert mit einem wässerigen Verdünnungsmittel bei einer Menge von bis zu 210 mg der gefriergetrockneten Zusammensetzung pro ml wässerigem Verdünnungsmittel umfasst, wobei besagte wässerige Zusammensetzung in Form einer wässerigen kolloidalen Suspension eine Lichtdurchlässigkeit größer als oder gleich 88% hat, wie spektrophotometrisch gemessen.
Wässerige Zusammensetzung wie in Anspruch 13 beansprucht, welche pro ml wässerigem Verdünnungsmittel bis zu 2,5 mg 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A, von 10 bis 200 mg Zucker und 0 bis 6 mg eines gegebenenfalls zugegebenen Amin-basierten Surfactanten umfasst.
Wässerige Zusammensetzung wie in Anspruch 13 beansprucht, welche pro ml wässerigem Verdünnungsmittel von 0,5 bis 2,5 mg 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A, von 20 bis 150 mg Zucker und von 0 bis 3 mg gegebenenfalls zugegebenen Amin-basierten Surfactanten umfasst.
Wässerige Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 13 bis 15 beansprucht, wobei besagtes wässeriges Verdünnungsmittel Wasser oder physiologische Kochsalzlösung umfasst.
Wässerige Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 13 bis 16 beansprucht, wobei besagtes wässeriges Verdünnungsmittel ferner ein Antigen oder Antigene, ein Aluminiumphosphat oder anderes Adjuvans oder einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Impfstoffzusammensetzung, welche eine Menge einer wässerigen Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 13 bis 17 beansprucht und eine immunologisch wirksame Menge von einem Antigen oder An tigenen umfasst.
Impfstoffzusammensetzung wie in Anspruch 18 beansprucht, wobei das Antigen oder die Antigene durch ein Bakterium, ein Virus, einen Parasiten, eine Krebszelle oder ein Allergen abgeleitet oder produziert werden.
Impfstoffzusammensetzung wie in Anspruch 18 oder Anspruch 19 beansprucht, wobei das Antigen ein Konjugat ist, welches kapselförmiges Polysaccharid von Streptococcus pneumoniae, kovalent an Protein gebunden, umfasst.
Impfstoffzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 18 bis 20 beansprucht, wobei das Antigen ein Chlamydia, Nontypeable Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Gruppe A Streptococci, Gruppe B Streptococcus, Herpes simplex Virus, humanes Immunschwächevirus, humanes Papillomavirus, Influenza, Masern, Parainfluenza, Respiratory Syncytial Virus, Rotavirus oder Norwalk Virus Antigen ist.
Impfstoffzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 18 bis 21 beansprucht, wobei die wirksame Menge des Antigens 1 μg bis 5 mg beträgt.
Impfstoffzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 18 bis 21 beansprucht, wobei die wirksame Menge von 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A 1 μg bis 1 mg ist.
Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten Zusammensetzung wie in Ansprüchen 1–6 definiert, welches umfasst: a. Suspendieren von 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A in einer Menge bis zu 5 mg/ml und einen Amin-basierten Surfactanten in einer Menge von 0 bis 6 mg/ml in einem wässerigen Verdünnungsmittel; b. Bilden einer wässerigen, kolloidalen Suspension mit einer Lichtdurchlässigkeit größer als oder gleich 88%, wie spektrophotometrisch gemessen; c. Zugeben von Zucker bei 10 bis 200 mg/ml entweder vor oder nach Bilden der wässerigen, kolloidalen Suspension; d. Gefriertrocknen der Zucker enthaltenden, wässerigen, kolloidalen Suspension; und e. Gewinnen einer gefriergetrockneten Zusammensetzung.
Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten Zusammensetzung wie in Ansprüchen 1–6 definiert, welches umfasst: a. Erhitzen von Lipopolysaccharid von gram-negativen Bakterien Salmonella minnesota R595 in einer Mineralsäure von moderater Stärke für einen ausreichenden Zeitraum, um ein Monophosphorylderivat zu erhalten; b. Lösen des Monophosphorylderivats in einem organischen Lösungsmittel und Trocknen; c. Behandeln des Monophosphorylderivats mit mildem Alkali, um eine Base-labile Fettsäurekette an der 3-Position zu entfernen, um 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A zu erhalten; d. Reinigen des 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A durch Flüssigkeitschromatographie und Gewinnen von Monophosphoryl-Lipid-A; e. Suspendieren von 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A in einer Menge bis zu 5 mg/ml und einen Amin-basierten Surfactant in einer Menge von 0 bis 6 mg/ml in einem wässerigen Verdünnungsmittel; f. Bilden einer wässerigen, kolloidalen Suspension mit einer Lichtdurchlässigkeit größer als oder gleich 88%, wie spektrophotometrisch gemessen; g. Zugeben von Zucker bei 10 bis 200 mg/ml entweder vor oder nach Bilden der wässerigen, kolloidalen Suspension; h. Gefriertrocknen der Zucker enthaltenden, wässerigen, kolloidalen Suspension; und i. Gewinnen einer gefriergetrockneten Zusammensetzung.
Verfahren zur Herstellung einer wässerigen, kolloidalen Suspension wie in Ansprüchen 13–17 definiert, welche 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A enthält, welche in der Lage ist, gefroren und getaut zu werden, welches umfasst: a. Suspendieren von Monophosphoryl-Lipid-A in einer Menge bis zu 5 mg/ml und einen Amin-basierten Surfactanten in einer Menge von 0 bis 6 mg/ml in einem wässerigen Verdünnungsmittel; b. Bilden einer wässerigen, kolloidalen Suspension mit einer Lichtdurchlässigkeit größer als oder gleich 88%, wie spektrophotometrisch gemessen; c. Zugeben von Zucker bei 10 bis 200 mg/ml entweder vor oder nach Bilden der wässerigen, kolloidalen Suspension; d. Gefrieren der Zucker enthaltenden, wässerigen, kolloidalen Suspension; und e. Tauen und Rückgewinnen der wässerigen, kolloidalen Sus pension.
Verfahren zur Herstellung einer wässerigen, kolloidalen Suspension wie in Ansprüchen 13–17 definiert, welche 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A enthält, welche in der Lage ist, gefriergetrocknet und resuspendiert zu werden, welches umfasst: a. Suspendieren von 3-O-Desacyl-4'-monophosphoryl-Lipid-A in einer Menge bis zu etwa 5 mg/ml und einen Amin-basierten Surfactanten in einer Menge von 0 bis etwa 6 mg/ml in einem wässerigen Verdünnungsmittel; b. Bilden einer wässerigen, kolloidalen Suspension mit einer Lichtdurchlässigkeit größer als oder gleich 88%, wie spektrophotometrisch gemessen; c. Zugeben von Zucker bei etwa 10 bis 200 mg/ml entweder vor oder nach Bilden der wässerigen, kolloidalen Suspension; d. Gefriertrocknen der Zucker enthaltenden, wässerigen, kolloidalen Suspension; und e. Resuspendieren und Umbilden einer wässerigen, kolloidalen Suspension.
Verfahren wie in Anspruch 26 oder Anspruch 27 beansprucht, wobei besagte gefriergetrocknete wässerige, kolloidale Suspension mit einem wässerigen Verdünnungsmittel vereinigt wird, welches ferner ein Antigen oder Antigene, Aluminiumphosphat-Adjuvans oder ein pharmazeutisch annehmbares Konservierungsmittel, Träger oder Vehikel enthält.
Wässerige, kolloidale Suspension, hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28.
Verwendung von gefriergetrockneter Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, bei der Herstellung eines Impfstoffs.
Verwendung von gefriergetrockneter Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, bei der Herstellung einer wässerigen Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 13 bis 17 beansprucht.
Verwendung einer wässerigen Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 13 bis 17 beansprucht, bei der Herstellung eines Impfstoffs.
Verwendung einer Impfstoffzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 7 bis 12 oder 18 bis 23 beansprucht, bei der Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines Wirbeltiers.