ES2229745T3 - Composicionde adyuvante y vacuna que contienen monofosforil lipido a. - Google Patents
Composicionde adyuvante y vacuna que contienen monofosforil lipido a.Info
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Abstract
Composición liofilizada que comprende 3-O-desacil-4¿- monofosforil lípido A en una cantidad hasta del 5% en peso, más del 70% en peso de azúcar y entre 0 y 30% en peso de un tensioactivo amínico añadido.
Description
Composiciones de adyuvante y vacuna que contienen
monofosforil lípido A.
La presente invención se refiere a composiciones
mejoradas de adyuvante y vacuna, a los procedimientos para la
preparación de dichas composiciones mejoradas de adyuvante y vacuna
así como a los procedimientos de utilización de las composiciones
mejoradas.
Se han utilizado vacunas convencionales durante
muchos años para proteger al hombre y a los animales de una amplia
variedad de enfermedades infecciosas. Normalmente, estas vacunas
convencionales contienen uno o más antígenos que pueden comprender
un patógeno atenuado, un patógeno destruido o un componente
inmunógeno de un patógeno. En algunas vacunas, se pueden emplear un
antígeno o antígenos solos para producir respuestas inmunitarias
protectoras. En otras vacunas, el antígeno o antígenos se pueden
emplear junto con uno o más adyuvantes para potenciar la
inmunogenicidad de un antígeno. Uno de dichos adyuvantes conocido
en la técnica es el monofosforil lípido A, que procede del
lipopolisacárido de Salmonella minnesota R595. Es conocido
también en la técnica que el monofosforil lípido A es un material
lipídico que forma agregados espontáneamente consigo mismo en un
medio acuoso. Además, es conocido que el grado de agregación
presenta un efecto inmunoestimulante sobre la actividad de
monofosforil lípido A porque el monofosforil lípido A agregado es
menos estimulante.
El documento WO 98 01139 A describe una
preparación para inyectables que contiene un análogo del lípido A y
un procedimiento para su preparación disolviendo un análogo del
lípido A en una solución acuosa alcalina y añadiendo un tampón a
ésta.
El documento EP A 0812593 describe una
composición para vacuna que comprende un antígeno junto con
monofosforil lípido A (MPL)
3-O-desacilado en la que el tamaño
de partícula es pequeño y en general no excede de 120 nm cuando
está preparada.
El monofosforil lípido A se obtiene normalmente
como sal de trietilamina en forma de un polvo blanco liofilizado.
Al ser muy hidrófobo, el monofosforil lípido A liofilizado no forma
fácilmente una solución transparente cuando se vuelve a disolver
con agua sino que en su lugar da una mezcla turbia con partículas
blancas visibles de tamaño heterogéneo que sedimentan y además
forman agregados durante el reposo. Para preparar una preparación
acuosa aceptable de monofosforil lípido A se pone en suspensión la
sal de trietilamina del monofosforil lípido A liofilizado de 1 a 2
mg/ml (p/v) en agua, conteniendo 0,2% de trietilamina, se calienta
la suspensión a 65-70ºC y a continuación se somete
la mezcla a ultrasonidos. La preparación acuosa resultante,
ligeramente opalescente o transparente, es una suspensión acuosa
coloidal. La trietilamina ayuda a la solubilización del
monofosforil lípido A y se puede sustituir con cantidades similares
de trietanolamina. Cuando las preparaciones acuosas de monofosforil
lípido A, preparadas como se describió anteriormente en esta
memoria, se congelan y se descongelan a continuación los agregados
de monofosforil lípido A producen, sin embargo, una mezcla turbia
totalmente similar en aspecto a la mezcla turbia de monofosforil
lípido A antes del tratamiento con ultrasonidos. Asimismo, cuando
una preparación acuosa de monofosforil lípido A como la descrita
anteriormente en esta memoria se liofiliza y a continuación se
rehidrata, el resultado es también una mezcla turbia de monofosforil
lípido A agregado.
La presente invención proporciona a la técnica
una composición liofilizada que contiene monofosforil lípido A,
cuya composición presenta una característica de reconstitución
mejorada y que impide los problemas de sedimentación y formación de
agregados de la técnica anterior. En particular, la presente
invención proporciona una composición liofilizada que comprende
monofosforil lípido A, azúcar y, opcionalmente, un tensioactivo
amínico añadido y es capaz de redisolverse o rehidratarse con un
diluyente acuoso para formar, sin tratamiento de ultrasonidos
posterior, una solución coloidal de monofosforil lípido A que
presenta una transmisión de la luz de al menos el 88%, medida por
espectrofotometría. La composición liofilizada según la presente
invención comprende hasta aproximadamente el 5% en peso de
monofosforil lípido A, más de aproximadamente el 70% en peso de
azúcar y desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 30% en peso
opcionalmente de tensioactivo amínico añadido, dichos % en peso
referidos al total de los pesos de monofosforil lípido A, azúcar y,
si está presente, el tensioactivo amínico. Preferentemente, la
composición liofilizada según la presente invención comprende hasta
aproximadamente el 5% en peso de monofosforil lípido A, desde
aproximadamente 70 hasta aproximadamente 99,99% en peso de azúcar y
desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 28% en peso de
tensioactivo amínico opcionalmente añadido. Más preferentemente, la
composición liofilizada según la presente invención comprende hasta
aproximadamente el 4% en peso de monofosforil lípido A, desde
aproximadamente 75 hasta aproximadamente 99,99% en peso de azúcar y
desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 22% en peso de
tensioactivo amínico opcionalmente añadido. La composición
liofilizada puede comprender además una cantidad inmunológicamente
efectiva de un antígeno o antígenos. La composición liofilizada de
la presente invención se puede volver a poner en suspensión o
rehidratarse con un diluyente acuoso en concentraciones hasta de
aproximadamente 210 mg de composición liofilizada por ml de
diluyente acuoso, preferentemente desde aproximadamente 10 mg de
composición liofilizada por ml de diluyente acuoso hasta
aproximadamente 210 mg de composición liofilizada por ml de
diluyente acuoso, para formar, sin tratamiento de ultrasonidos
posterior, una suspensión acuosa coloidal.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento para la preparación de una suspensión coloidal acuosa
de monofosforil lípido A en el que la suspensión coloidal acuosa se
congela para su almacenamiento y a continuación se descongela para
su utilización sin los problemas de sedimentación y agregación
conocidos en la técnica anterior. Por este procedimiento, el
monofosforil lípido A se mezcla en un diluyente acuoso y
opcionalmente con un tensioactivo amínico y también opcionalmente
un antígeno o antígenos. Se forma una suspensión acuosa coloidal
por tratamiento con ultrasonidos, opcionalmente con calentamiento,
u otros procedimientos conocidos, como los descritos con mayor
detalle en esta memoria más adelante. Se añade azúcar, en una
cantidad de 10 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, ya sea antes o
después de la formación de una suspensión coloidal acuosa. El
azúcar puede estar en forma sólida o en forma de solución acuosa.
La suspensión acuosa coloidal resultante se puede congelar a
continuación. La descongelación de la suspensión coloidal acuosa
congelada da sin tratamiento por ultrasonidos posterior una
solución acuosa coloidal conteniendo monofosforil lípido A que
presenta una transmisión ligera mayor o igual a 88%, medida por
espectrofotometría. Se puede añadir un antígeno o antígenos,
definidos más adelante en esta memoria, a la suspensión acuosa
coloidal descongelada para formar una composición para vacuna que se
puede administrar a un vertebrado. Por otra parte, si la suspensión
acuosa coloidal contiene un antígeno antes de la congelación, la
composición para vacuna se puede descongelar y administrar a un
vertebrado.
Las suspensiones acuosas coloidales de la
presente invención son un tipo especial de suspensión líquida en la
que las partículas de monofosforil lípido A en suspensión están
presentes en forma dividida muy finamente pero no en forma
disuelta. Las suspensiones acuosas coloidales que contienen
monofosforil lípido A, azúcar y, opcionalmente, un tensioactivo
amínico según la presente invención son suspensiones verdaderas no
soluciones, y no tienen la propiedad, a diferencia de las
suspensiones ordinarias de monofosforil lípido A, de sedimentación
y formación de agregados. La presencia de suspensiones acuosas
coloidales de la presente invención se puede determinar por
transmisión de la luz. De este modo, una suspensión acuosa coloidal
que contiene monofosforil lípido A, azúcar y opcionalmente un
tensioactivo amínico según la presente invención es la que presenta
una transmisión de la luz mayor o igual a 88%, medida por
espectrofotometría.
La presente invención soluciona los problemas de
sedimentación y formación de agregados de la técnica anterior,
proporcionando la adición de azúcar a una suspensión acuosa
coloidal de monofosforil lípido A antes de la congelación o de la
liofilización. El azúcar se puede añadir bien antes o después de la
formación de la suspensión acuosa coloidal pero se debe añadir
antes de la congelación o liofilización de la suspensión. La
adición de azúcar a una suspensión acuosa coloidal de monofosforil
lípido A antes de la congelación o de la liofilización proporciona
una composición que, se puede descongelar después de la congelación
para dar una suspensión acuosa coloidal sin tratamiento por
ultrasonidos posterior o, como alternativa, se puede volver a poner
en suspensión, después de la liofilización, con un diluyente acuoso
adecuado y dar, sin tratamiento por ultrasonidos posterior, una
suspensión acuosa coloidal descrita en esta memoria anteriormente.
Los azúcares adecuados incluyen los monosacáridos, dextrosa,
manosa, galactosa y fructosa así como los disacáridos sacarosa,
lactosa, isomaltosa, maltosa y trehalosa. Se pueden emplear también
mezclas de azúcares, por ejemplo sacarosa y dextrosa. Ninguno de
estos azúcares son tóxicos y son farmacéuticamente aceptables. Se
prefieren sacarosa y dextrosa. El azúcar puede estar en forma
sólida o en forma de solución acuosa. Los diluyentes acuosos
adecuados incluyen agua o solución salina y pueden también incluir
un antígeno o antígenos y, pueden contener además conservantes o
adyuvantes adicionales, u otros aditivos, vehículos o excipientes
farmacéuticamente aceptables. Los tensioactivos de amina adecuados
incluyen trietilamina (TEA) y trietanolamina (TEM).
Otro aspecto de la invención es una suspensión
acuosa coloidal reconstituida o rehidratada que, a pesar de la
eliminación de la etapa del tratamiento con ultrasonidos posterior,
se obtiene durante la reconstitución de la composición liofilizada
descrita en esta memoria anteriormente con un diluyente acuoso.
Como se expuso en esta memoria anteriormente, antes de la presente
invención, era necesaria una etapa de tratamiento con ultrasonidos
para obtener una suspensión acuosa coloidal conteniendo
monofosforil lípido A. Sin embargo, se ha observado que cuando se
añade un diluyente acuoso a la composición liofilizada descrita en
esta memoria anteriormente, se obtiene una suspensión acuosa
coloidal que contiene monofosforil lípido A sin tratamiento con
ultrasonidos posterior. La suspensión acuosa coloidal reconstituida
obtenida de este modo presenta una transmisión de la luz mayor o
igual a 88%, cuando se mide por espectrofotometría.
Sorprendentemente, la suspensión acuosa coloidal preparada obtenida
de este modo es capaz de congelarse y, después descongelarse, de
nuevo volviendo a formar una suspensión acuosa coloidal que presenta
una transmisión de la luz mayor o igual a 88%. La suspensión acuosa
coloidal reconstituida de la presente invención comprende hasta
aproximadamente 2,5 mg de monofosforil lípido A por ml de diluyente
acuoso, de aproximadamente 10 a 200 mg de azúcar por ml de
diluyente acuoso y de aproximadamente 0 a aproximadamente 6 mg de
tensioactivo amínico por ml de diluyente acuoso. Preferentemente, la
suspensión acuosa coloidal reconstituida de la presente invención
comprende hasta aproximadamente 2,0 mg de monofosforil lípido A por
ml de diluyente acuoso, de aproximadamente 20 a 150 mg de azúcar
por ml de diluyente acuoso y de aproximadamente 0 a aproximadamente
3 mg de tensioactivo amínico por ml de diluyente acuoso. La
suspensión acuosa coloidal reconstituida puede comprender además
una cantidad inmunológicamente eficaz de un antígeno o antígenos.
Los azúcares adecuados, los tensioactivos amínicos y los diluyentes
acuosos son tal como se describieron en esta memoria
anteriormente.
Un aspecto adicional de la invención es una
composición para vacuna que comprende la composición liofilizada y
la suspensión acuosa coloidal preparada descrita en esta memoria
anteriormente en combinación con una cantidad inmunológicamente
eficaz de un antígeno o antígenos. La cantidad eficaz de un
antígeno o antígenos se puede proporcionar opcionalmente en el
diluyente acuoso. En particular, la composición para vacuna
comprende además una cantidad inmunológicamente eficaz de un
antígeno o antígenos procedente de o producida por una bacteria, un
virus, un parásito, una célula cancerosa o un alergeno. Una cantidad
eficaz de antígeno se define como la cantidad de antígeno que cuando
se administra a un animal o a una persona produce una respuesta
inmunitaria medida por la producción de anticuerpos específicos o
por mecanismos efectores mediados por células. Las cantidades
inmunológicamente eficaces de un antígeno o antígenos son en
general de aproximadamente 1 \mug o menos a 5 mg. Una cantidad
eficaz del adyuvante de monofosforil lípido A es la cantidad de
monofosforil lípido A que cuando se añade a una vacuna aumenta la
magnitud, calidad o duración de la respuesta inmunitaria al antígeno
o antígenos en la vacuna. Una cantidad eficaz del adyuvante
monofosforil lípido A es del orden de aproximadamente 1 \mug a
aproximadamente 1 mg.
Los antígenos adecuados para las composiciones de
vacuna de la presente invención incluyen cualquier entidad capaz de
producir un anticuerpo o respuesta inmunológica mediada por células
dirigida especialmente contra esta entidad en un vertebrado
expuesto al antígeno. Se pueden emplear uno o más antígenos. El
antígeno o antígenos pueden proceder de microorganismos patógenos
incluyendo virus, bacterias, micoplasmas, hongos, protozoos y otros
parásitos. Además, el antígeno o antígenos puede proceder de otras
fuentes distintas a microorganismos, por ejemplo, células
cancerosas o alergenos. El antígeno o antígenos pueden ser todo o
parte de un microorganismo patógeno, o todo o parte de una proteína,
glucoproteína, glucolípido, polisacárido o lipopolisacárido que
está asociado con el organismo o el antígeno o antígenos puede ser
un polipéptido u otra entidad que simula todo o parte de dicha
proteína, glucoproteína, glucolípido, polisacárido o
lipopolisacárido.
Los microorganismos patógenos a partir de los
cuales se pueden producir los antígenos o derivados con fines de
vacuna son bien conocidos en el campo de las enfermedades
infecciosas, relacionados, por ejemplo, en Medical
Microbiology, segunda edición, (1990) J.C. Sherris (ed.),
Elsevier Science Publishing Co., Inc., Nueva Cork, y Zinsser
Microbiology, 20ª edición (1992), W.K. Joklik et al.,
(eds.), Appleton & Lange Publishing Division of Prentice Hall,
Englewood Cliffs, Nueva Jersey. Ejemplos de organismos de interés
para las vacunas humanas incluyen Chlamydia, Haemophilus
influenzae no tipificable, Helicobacter pylori, Moraxella
catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis,
Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Streptococus del
grupo A, Streptococus del grupo B, virus del herpes común,
virus de inmunodeficiencia humana, virus de papiloma humano, gripe,
sarampión, paragripe, virus respiratorio del sincitio, rotavirus,
virus de Norwalk y otros.
El antígeno o antígenos pueden incluir
glucoconjugados que comprenden un antígeno o antígenos de
polisacáridos, por ejemplo, polisacárido capsular bacteriano o un
fragmento de éste, químicamente ligado a una molécula portadora de
proteína para aumentar la inmunogenicidad. Los procedimientos para
preparar conjugados de polisacáridos capsulares bacterianos y
moléculas portadoras de proteína son bien conocidos en la técnica y
se pueden encontrar, por ejemplo, en Dick y Burret, Contrib
Microbiol Immunol. 10:48-114 (Cruse J.M., Lewis
R.E. Jr., eds; Basel Kruger (1989). Los conjugados adecuados
incluyendo el glucoconjugado de neumococos, se describen con mayor
detalle en los documentos U.S. nº 4.673.574, U.S. nº 4.761.283,
U.S. nº 4.902.506, U.S. 5.097.020 y U.S. nº 5.360.897.
También se proporciona un procedimiento de
inmunización de un vertebrado mediante vacunación que comprende la
administración de una cantidad eficaz de una composición para
vacuna según la presente invención a dicho vertebrado.
También se proporciona un procedimiento para la
preparación de una composición liofilizada que comprende:
- a.
- poner en suspensión monofosforil lípido A en una cantidad de hasta aproximadamente 5 mg/ml y, opcionalmente, un tensioactivo amínico en una cantidad comprendida entre 0 y aproximadamente 6 mg/ml en un diluyente acuoso;
- b.
- formar una suspensión acuosa coloidal que presenta una transmisión de la luz mayor o igual a 88%, medida por espectrofotometría;
- c.
- añadir azúcar a razón de aproximadamente 10 a 200 mg/ml bien antes o después de formar la suspensión acuosa coloidal;
- d.
- liofilizar el azúcar que contiene la suspensión acuosa coloidal; y
- e.
- recuperar una composición liofilizada.
También se proporciona un procedimiento para
preparar una composición liofilizada que comprende:
- a.
- calentar el lipopolisacárido de la bacteria Salmonella minnesota R595 gram negativa en un ácido mineral de fuerza moderada durante un periodo de tiempo suficiente para obtener un derivado de monofosforilo;
- b.
- disolver el derivado de monofosforilo en un disolvente orgánico y secarlo;
- c.
- tratar el derivado de monofosforilo con álcali suave para eliminar una cadena de ácido graso de base débil en la posición 3 para dar monofosforil lípido A desacilado en 3.
- d.
- purificar el monofosforil lípido A desacilado en 3 por cromatografía líquida y recuperar el monofosforil lípido A;
- e.
- poner en suspensión el monofosforil lípido A en una cantidad de aproximadamente 5 mg/ml y, opcionalmente, un tensioactivo amínico en una cantidad de 0 a aproximadamente 6 mg/ml en un diluyente acuoso;
- f.
- formar una suspensión acuosa coloidal que tiene una transmisión de la luz mayor o igual a 88%, medida por espectrofotometría;
- g.
- añadir azúcar a razón de aproximadamente 10 a 200 mg/ml ya sea antes o después de formar la suspensión acuosa coloidal;
- h.
- liofilizar el azúcar que contiene la suspensión acuosa coloidal; e
- i.
- recuperar una composición liofilizada.
También se proporciona un procedimiento para la
preparación de una suspensión acuosa coloidal que contiene
monofosforil lípido A capaz de congelarse y descongelarse que
comprende:
- a.
- poner en suspensión monofosforil lípido A en una cantidad de hasta aproximadamente 5 mg/ml y, opcionalmente, un tensioactivo amínico en una cantidad de 0 a aproximadamente 6 mg/ml en un diluyente acuoso;
- b.
- formar una suspensión acuosa coloidal que tiene una transmisión de la luz mayor o igual a 88%, medida por espectrofotometría;
- c.
- añadir azúcar a razón de aproximadamente 10 a 200 mg/ml bien antes o después de formar la suspensión acuosa coloidal;
- d.
- congelar el azúcar que contiene la suspensión acuosa coloidal; y
- e.
- descongelar y recuperar la suspensión acuosa coloidal.
La preparación de monofosforil lípido A se
describe en la patente U.S. nº 4.912.094. En resumen, el
monofosforil lípido A se produce calentando a reflujo el
lipopolisacárido (o lípido A) obtenido a partir de mutantes sin
heptosa de bacterias gram negativas, Salmonella minnesota
R595, en soluciones de ácido mineral de fuerza moderada (p. ej.,
HCl 0,1 N) durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Los
ácido minerales adecuados incluyen clorhídrico, sulfúrico y
similares. Este tratamiento produce la pérdida del grupo fosfato en
la posición 1 del terminal reductor de la glucosamina. El
carbohidrato del núcleo se elimina en la posición 6' de la
glucosamina no reductora durante este tratamiento. El resultado es
un monofosforil derivado de lípido A. El monofosforil derivado de
lípido A se disuelve en disolvente orgánicos y se trata con álcali
muy suave que elimina la cadena de ácido graso
débil-base en la posición 3 para dar
3-O-desacil-4'-monofosforil
lípido A, indicando que la posición 3 del extremo reductor de la
glucosamina está des-O-acilado.
Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A
3-desacilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Los
disolventes orgánicos adecuados incluyen metanol (alcoholes),
sulfóxido de dimetilo, dimetilformamida, cloroformo, diclorometano
y similares, así como mezclas de los mismos. Se pueden emplear
asimismo combinaciones de agua y uno más de estos disolventes
orgánicos. Se pueden seleccionar bases alcalinas adecuadas de entre
varios hidróxidos, carbonatos, fosfatos y aminas. Las bases
ilustrativas incluyen las bases inorgánicas tales como el hidróxido
de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, carbonato de
potasio, bicarbonato de sodio, bicarbonato de potasio y similares,
y bases orgánicas tales como alquilaminas e incluyen, pero no se
limitan a dietilamina, trietilamina y similares. El
3-O-desacil-4'-monofosforil
lípido A se purifica por cromatografía líquida y se transforma en
la sal de trietilamina monobásica (trietilamonio).
El término monofosforil lípido A tal como se
utiliza en esta memoria significa
3-O-desacil-4'-monofosforil
lípido A como sal (trietilamonio) de trietilamina monobásica.
Para preparar la composición liofilizada de la
presente invención, se añade el monofosforil lípido A a un
diluyente acuoso, preferentemente agua, en cantidades de hasta 5 mg
de monofosforil lípido A por ml de diluyente acuoso,
preferentemente hasta 2,5 mg/ml y más preferentemente desde
aproximadamente 0,5 hasta 2,5 mg/ml. Opcionalmente, se emplea un
tensioactivo amínico añadido en una cantidad comprendida entre
aproximadamente 0 y aproximadamente 6 mg/ml, preferentemente entre
0 y 3 mg/ml.
Por tratamiento con ultrasonidos, opcionalmente
con calentamiento u otros procedimientos se forma una suspensión
acuosa coloidal que tiene una transmisión de la luz mayor o igual a
88%, medida por espectrofotometría. El calentamiento es opcional
pero preferido para facilitar la formación de la suspensión acuosa
coloidal de monofosforil lípido A. El equipo de tratamiento con
ultrasonidos incluye, por ejemplo, una sonda productora de
ultrasonidos (Vibracell VCX600; Sonica) conectada a sondas cuyas
dimensiones son apropiadas para el volumen que se trata o un baño
generador de ultrasonidos tal como el modelo nº G112SP1T adquirido
en Laboratory Supplies Co. Inc., (Hicksville, NY). Otro equipo
similar utilizado en la industria farmacéutica sería también
apropiado para tratamiento con ultrasonidos de monofosforil lípido
A.
La suspensión acuosa coloidal de monofosforil
lípido A se puede formar por otros procedimientos a parte de la
producción de ultrasonidos, por ejemplo, por fuerzas de
cizallamiento que serían generadas en un microfluidificador.
Se añade también azúcar, bien antes o después de
la formación de la suspensión acuosa coloidal, en cantidades de 10
a 200 mg de azúcar por ml de diluyente acuoso, preferentemente de
aproximadamente 20 a 150 mg/ml. La suspensión acuosa coloidal, que
contiene monofosforil lípido A, azúcar y opcionalmente un
tensioactivo amínico añadido y opcionalmente una cantidad
inmunológicamente eficaz de un antígeno o antígenos en las
cantidades relacionadas anteriormente en esta memoria, se liofiliza
para dar la composición liofilizada según la presente invención.
La suspensión acuosa coloidal, de monofosforil
lípido A, azúcar y, opcionalmente, un tensioactivo amínico de un
antígeno o antígenos se liofiliza para dar la composición
liofilizada según la presente invención. Como es sabido por los
expertos en la materia, la liofilización es un proceso de secado en
el cual el agua se sublima del producto después congelarlo,
aplicando vacío. Las propiedades de la liofilización o secado por
congelación se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences.
Capítulo 84, página 1565, 18ª edición, A.R. Gennaro, Editor, 1990,
Mack Publishing Company.
Se determina si se forma una suspensión acuosa
coloidal midiendo la transmisión de la luz. Se ha observado que las
composiciones que tienen una transmisión de la luz de al menos 88%
presentan las propiedades de las suspensiones coloidales. La
transmisión de la luz se mide utilizando un espectrofotómetro en el
cual se ilumina una muestra de líquido en una cubeta de vidrio,
cuarzo o plástico con un paso de luz de 1 centímetro. La luz puede
ser del espectro visible o invisible, pero para las mediciones de
la transmisión de la luz de este tipo puede utilizarse de forma
apropiada una longitud de onda de 650 nm. La cantidad de luz que
pasa a través de la muestra (es decir, que se transmite) se envía a
una cubeta del blanco que contiene el disolvente o diluyente en el
que se disuelve o se pone en suspensión el material. Las muestras
que no absorben o dispersan la luz presentarán una transmisión de la
luz del 100% mientras que aquellas que absorben o dispersan toda la
luz tendrán una trasmisión de luz del 0%.
Aunque no se desea estar ligado por ninguna
teoría, se cree que los resultados ventajosos de la invención se
obtienen porque la adición de azúcar ya sea antes o después de la
formación de una suspensión acuosa coloidal que contiene
monofosforil lípido A previene al monofosforil lípido A de la
formación de agregados, ya sea en el momento de la congelación o de
la descongelación de la suspensión acuosa coloidal o en el momento
de la liofilización de la suspensión acuosa coloidal y de la
preparación o rehidratación con un diluyente acuoso. Incluyendo
azúcar en una suspensión acuosa coloidal que contiene monofosforil
lípido A antes de la liofilización, se puede preparar la
composición liofilizada con un diluyente acuoso tal como agua o
solución salina sin el problema de una nueva formación de agregados
de monofosforil lípido A. Además, la congelación de la suspensión
coloidal reconstituida o de la composición para vacuna no da lugar
a que vuelva a ocurrir la formación de agregados. Asimismo,
incluyendo azúcar en una suspensión acuosa coloidal que contiene
monofosforil lípido A antes de la congelación, en el momento de la
descongelación, se obtiene de nuevo una suspensión acuosa coloidal
sin necesidad de producir más ultrasonidos. La capacidad del azúcar
para prevenir la formación de agregados de monofosforil lípido A es
evidente, independientemente de si la suspensión acuosa coloidal
que contiene monofosforil lípido A se prepara en agua sola o en
agua conteniendo trietilamina o trietanolamina.
Por lo tanto, la adición de azúcar a
composiciones acuosas que contienen monofosforil lípido A, ya sea
antes o después de formar una suspensión acuosa coloidal,
proporciona resultados sorprendentes e inesperados cuando dichas
suspensiones acuosas coloidales se congelan y descongelan o se
liofilizan y vuelven a poner en suspensión. Dichos resultados
permiten además la preparación ventajosa de composiciones de
vacuna.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para
ilustrar la invención.
Se pone en suspensión monofosforil lípido A (RIBI
ImmunoChem., Hamilton, MT) en 1 mg/ml (p/v) de agua formando una
mezcla turbia con partículas blancas visibles de dimensiones
homogéneas. Se coloca la mezcla turbia en un espectrofotómetro
UV-Visible Shimadzu UV-1601 y se
ilumina con luz de 650 nm de longitud de onda. La mezcla turbia
permite pasar el 3,3% de la luz incidente (es decir, % de
transmisión = 3,3). No se observa suspensión acuosa coloidal.
Se pone en suspensión en agua 1 mg/ml (p/v) de
monofosforil lípido A, conteniendo trietanolamina al 0,5% (v/v)
(5,62 mg/ml (p/v)) o trietilamina al 0,2% (v/v) (1,46 mg/ml (p/v)).
Se calientan las muestras a 56 a 65ºC durante 10 a 15 minutos y se
tratan con ultrasonidos utilizando bien una sonda productora de
ultrasonidos (Vibracell VCX600) ajustada al 30% de potencia
utilizando una microboquilla cónica o un baño generador de
ultrasonidos (modelo nº G112SP1T, Laboratory Supplies Co. Inc.,
Hicksville, NY) utilizada a toda potencia durante 2 a 3 minutos. Se
obtiene una suspensión transparente, se coloca en un
espectrofotómetro UV-Visible de Shimadzu
UV-1601 y se ilumina con luz de longitud de onda de
650 nm. Se mide el % de transmisión de la luz a =88% indicando la
formación de una suspensión acuosa coloidal.
Se forman suspensiones acuosas coloidales de
monofosforil lípido A poniendo en suspensión 1, 2 ó 5 mg/ml (p/v)
de monofosforil lípido A en agua o agua conteniendo 0,5% de
trietanolamina v/v (5,6 mg/ml p/v) ó 0,2% de trietilamina v/v (1,46
mg/ml p/v). Cada suspensión de monofosforil lípido A se calienta
durante 10 a 15 minutos entre 56ºC y 65ºC y a continuación se trata
con ultrasonidos durante un total de 2 a 3 minutos para obtener una
suspensión transparente sin ninguna prueba visual de partículas. Se
tratan las muestras (1 a 1,5 ml) con ultrasonidos utilizando bien
una sonda productora de ultrasonidos (Vibracell VCX600) ajustada a
30% de potencia utilizando una microboquilla cónica o un baño
generador de ultrasonidos (modelo nº G112 SP1T, Laboratory Supplies
Co. Inc., Hicksville, NY.) utilizada a toda potencia durante 2 a 3
minutos. Se diluyen alícuotas de las suspensiones acuosas coloidales
de monofosforil lípido A con una cantidad igual de agua o sacarosa
o de soluciones de dextrosa de concentraciones variables. Las
suspensiones acuosas coloidales resultantes incluyen monofosforil
lípido A a 0,5, 1,0 ó 2,5 mg/ml (p/v) y sacarosa en concentraciones
finales de 10, 50, 100 ó 200 mg/ml (p/v) o dextrosa a 10, 50, 100 ó
170 mg/ml (p/v) expresadas en la Tabla 1. Las preparaciones
contenían 2,81 ó 5,62 mg/ml de trietanolamina (TEM) o 0,73 mg/ml de
trietilamina (TEA) o sin tensioactivo amínico. Se coloca la mezcla
turbia en un espectrofotómetro UV-Visible Shimadzu
UV-1601 y se ilumina con luz de 650 nm de longitud
de onda. El % de transmisión de la luz, indicado en la Tabla 1,
oscila entre 90,0 y 99,9%, indicando la formación de una suspensión
acuosa coloidal.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las suspensiones acuosas coloidales indicadas en
la Tabla 1 se liofilizan congelando en primer lugar las muestras en
viales de vidrio o tubos de cultivo de polipropileno en perlas de
nieve carbónica durante al menos 30 minutos. Se transfieren a
continuación a recipientes grandes de liofilización (Labconco) y se
conectan a un liofilizador Virtus. Se liofilizan las muestras
durante 18 horas a un vacío de 250 militores a una temperatura del
condensador de -50ºC. En la Tabla 2 se presenta la composición de
las composiciones del adyuvante liofilizado.
Se vuelven a poner en suspensión las muestras
liofilizadas indicadas en la Tabla 2 bien con agua o con solución
salina normal (NaCl al 0,9% p/v), cuyo volumen era igual al volumen
de la suspensión acuosa coloidal antes de la liofilización. En la
Tabla 2 se muestran los datos que presentan el % de transmisión de
la luz de las muestras después de la reconstitución con diluyente
acuoso. Como se muestra en la Tabla 2, las composiciones
liofilizadas que contienen sacarosa o dextrosa que oscilan entre
valores mayores del 75% hasta el 99,4% de la composición en peso,
dieron lugar a suspensiones acuosas coloidales cuando se rehidratan
con agua o solución salina. Para las muestras 1 a 38 indicadas en
la Tabla 2, el % de transmisión después de la rehidratación osciló
entre 88,0% y 98,4% indicando la formación de una suspensión acuosa
coloidal. Se prepararon las muestras 15 y 16, que contenían 99% de
azúcar en peso después de la liofilización, sin adición de aminas
(trietilamina o trietanolamina) en el momento del tratamiento con
ultrasonidos. Cuando se rehidratan con agua o solución salina
normal, se miden los valores de % de transmisión a 96,1 y 93,6,
respectivamente, indicando la formación de una suspensión acuosa
coloidal. Estos datos demuestran que cuando una suspensión acuosa
coloidal de monofosforil lípido A preparada mediante tratamiento
con ultrasonidos se liofiliza con una cantidad eficaz de azúcar
tales como sacarosa o dextrosa se puede rehidratar con agua o
solución salina normal para volver a obtener una suspensión acuosa
coloidal.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Utilizando los procedimientos indicados en el
Ejemplo 3, se preparan las formulaciones que contienen monofosforil
lípido A, azúcar y amina en las cantidades indicadas en la Tabla 3.
Se mide la transmisión de la luz de estas formulaciones y como se
indica en la Tabla 3, el % de transmisión de la luz oscila entre
95,4 y 98,8% indicando la formación de una suspensión acuosa
coloidal.
Utilizando los procedimientos indicados en la
Tabla 3, se liofilizan y vuelven a poner en suspensión con agua o
solución salina las formulaciones de la Tabla 3 tal como se indica
en la Tabla 4.
Cuando se rehidratan las muestras liofilizadas
sin azúcares (muestras 39 a 43) con agua o solución salina la
preparación resultante es turbia con partículas en suspensión.
Estas muestras presentan un % de transmisión que oscila entre 22,0 y
58,6.
Resultados similares se obtienen cuando se
rehidratan con agua las muestras 44 a 47 que contienen 7,6% a 62,0%
de azúcar indicando que no se forma una suspensión acuosa
coloidal.
Se trata con ultrasonidos monofosforil lípido A
en agua que contiene 0,2% de trietilamina (v/v) y a continuación se
mezcla con un volumen igual de agua o con agua conteniendo sacarosa
añadida para dar una suspensión transparente que contiene 0,5 mg/ml
(p/v) de monofosforil lípido A sin sacarosa o conteniendo 100 mg/ml
de sacarosa p/v y trietilamina a una concentración final de 0,1% v/v
(0,73 mg/ml p/v). Se colocan las muestras (48 y 49) en un
espectrofotómetro UV-Visible, Shimadzu
UV-1601 y se iluminan con luz de 650 nm y cada una
dejó pasar el 98,8% de luz indicando de este modo la formación de
una suspensión acuosa coloidal. Se congelan y se descongelan a
continuación las suspensiones coloidales. En el momento de la
descongelación, la preparación de monofosforil lípido A sin
sacarosa (muestra 48) es turbia con partículas y tiene un % de
transmisión de la luz de 60,3% medido en un espectrofotómetro
UV-Visible, Shimadzu UV-1601 y se
iluminan con luz de longitud de onda de 650 nm indicando que no se
forma una suspensión acuosa coloidal. El monofosforil lípido A que
contiene sacarosa (muestra 49) permanece transparente después de la
congelación y descongelación y tiene un % de transmisión de la luz
de 97,8% medido en un espectrofotómetro UV-Visible,
Shimadzu UV-1601 y se iluminan con luz de longitud
de onda de 650 nm indicando la formación de una suspensión acuosa
coloidal. Estos datos se presentan en la Tabla 5.
Utilizando los procedimientos indicados en el
Ejemplo 3 anteriormente, se calienta y se trata con ultrasonidos
una mezcla de monofosforil lípido A en agua de aproximadamente 0,5
mg/ml y un tensioactivo amínico de trietanolamina a aproximadamente
2,8 mg/ml para dar una suspensión acuosa coloidal. Bien antes o
después del tratamiento con ultrasonidos, pero antes de la
congelación o de la liofilización, se añade sacarosa a una
concentración final entre aproximadamente 10 y 200 mg/ml. La
suspensión acuosa coloidal obtenida de este modo se puede congelar
y descongelar para utilizar en una composición para vacuna o
liofilizar y volver a poner en suspensión con un diluyente acuoso
para su utilización en una composición para vacuna.
Se congela la suspensión acuosa coloidal de
monofosforil lípido A, sacarosa y trietanolamina preparada
anteriormente como en (a). Se descongela a continuación y se
combina con un diluyente acuoso que contiene un antígeno, por
ejemplo, un glicoconjugado de neumococos preparado según la patente
U.S. nº 5.360.897, para obtener una composición para vacuna
conteniendo hasta aproximadamente 400 microgramos de monofosforil
lípido A por ml y hasta aproximadamente 200 microgramos de
glucoconjugado de neumococos por ml. Para obtener una composición
para vacuna que contiene 400 microgramos de monofosforil lípido A y
200 microgramos de glucoconjugado de neumococos, por ejemplo, se
pueden combinar 0,8 ml de la suspensión coloidal descongelada con
200 microgramos de glucoconjugado de neumococos en 0,2 ml de agua.
Esta composición para vacuna se puede administrar a continuación a
un vertebrado, preferentemente a un hombre, utilizando
aproximadamente 0,1 a 1,0 ml por dosis.
Se liofiliza la suspensión acuosa coloidal de
monofosforil lípido A, sacarosa y trietanolamina preparada
anteriormente en (a). Se vuelve a poner en suspensión a
continuación con un diluyente acuoso que contiene un antígeno, por
ejemplo, un gluco-conjugado de neumococos preparado
según la patente U.S. nº 5.360.897, para obtener una composición
para vacuna conteniendo hasta aproximadamente 400 microgramos de
monofosforil lípido A por ml y hasta aproximadamente 200
microgramos de glucoconjugado de neumococos por ml. Esta
composición para vacuna se puede administrar a continuación a un
vertebrado, preferentemente a un hombre, utilizando aproximadamente
entre 0,1 y 1,0 ml por dosis.
A la suspensión acuosa coloidal de monofosforil
lípido A, sacarosa y trietanolamina preparada anteriormente en (a)
se añade un antígeno, por ejemplo, un glucoconjugado de neumococos
preparado según la patente U.S. nº 5.360.897, para obtener una
composición para vacuna. Se congela a continuación la composición
para vacuna. Se ajustan las concentraciones de monofosforil lípido A
y glucoconjugado de neumococos mediante adición de un diluyente
acuoso, hasta aproximadamente 400 microgramos por ml y hasta
aproximadamente 200 microgramos por ml, respectivamente, bien antes
de la congelación o después de la congelación y descongelación, con
la condición de que la sacarosa se mantenga a una concentración de
aproximadamente 10 a 200 mg/ml antes de la congelación. Las
composiciones de vacuna congelada y descongelada se pueden
administrar a continuación a un vertebrado, preferentemente al
hombre, utilizando aproximadamente entre 0,1 y 1,0 ml por
dosis.
A la suspensión acuosa coloidal de monofosforil
lípido A, sacarosa y trietanolamina preparada anteriormente en (a)
se añade, por ejemplo, un gluco- conjugado de neumococos preparado
según la patente U.S. nº 5.360.897, para obtener una composición
para vacuna. El antígeno se puede añadir bien antes o después de
las etapas de calentamiento y de tratamiento con ultrasonidos. La
cantidad de glucoconjugado de neumococos añadida se calcula de modo
que, en el momento de la reconstitución posterior de la composición
para vacuna liofilizada, la mezcla acuosa contenga hasta
aproximadamente 400 microgramos de monofosforil lípido A por ml y
hasta aproximadamente 200 microgramos de glucoconjugado de
neumococos por ml. Se liofiliza a continuación la composición para
vacuna. Después de la liofilización, la composición se vuelve a
poner en suspensión con un diluyente acuoso. Esta composición para
vacuna acuosa reconstituida se puede administrar a continuación a
un vertebrado, preferentemente a un hombre, utilizando
aproximadamente 0,1 a 1,0 ml por dosis.
Claims (33)
1. Composición liofilizada que comprende
3-O-desacil-4'-monofosforil
lípido A en una cantidad hasta del 5% en peso, más del 70% en peso
de azúcar y entre 0 y 30% en peso de un tensioactivo amínico
añadido.
2. Composición liofilizada según la
reivindicación 1, que comprende
3-O-desacil-4'-monofosforil
lípido A en una cantidad hasta del 4% en peso, desde el 75% al
99,99% en peso de azúcar y entre 0 y 22% en peso de un tensioactivo
amínico.
3. Composición liofilizada según la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el azúcar
comprende dextrosa, manosa, galactosa, fructosa, sacarosa, lactosa,
isomaltosa, maltosa y trehalosa.
4. Composición liofilizada según la
reivindicación 3, en la que el azúcar es sacarosa o dextrosa.
5. Composición liofilizada según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en la que el tensioactivo amínico es
trietilamina o trietanolamina.
6. Composición liofilizada según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una cantidad
inmunológicamente eficaz de un antígeno o antígenos.
7. Composición para vacuna que comprende una
cantidad de una composición liofilizada según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 y una cantidad inmunológicamente eficaz de
un antígeno o antígenos.
8. Composición para vacuna según la
reivindicación 7, en la que el antígeno o antígenos proceden de o
son producidos por una bacteria, un virus, un parásito, una célula
canceroso un alergeno.
9. Composición para vacuna según la
reivindicación 7, en la que el antígeno es un antígeno de
Chlamydia, Haemophilus influenzae no tipificable,
Helicobacter pylori, Moraxella catarrhalis, Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi,
Streptococcus pneumoniae, Streptococus del grupo A,
Streptococus del grupo B, virus del herpes común, virus de la
inmunodeficiencia humana, virus del papiloma humano, gripe,
sarampión, paragripe, virus respiratorio del sincitio, rotavirus o
virus de Norwalk.
10. Composición para vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 9, en la que una cantidad eficaz de un
antígeno o antígenos está comprendida entre 1 \mug y 5 mg.
11. Composición para vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 9, en la que una cantidad eficaz de
3-O-desacil-4'-monofosforil
lípido A está comprendida entre 1 \mug y 1 mg.
12. Composición para vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 11, en la que el antígeno es un conjugado
que comprende el polisacárido capsular del Streptoccocus
pneumoniae unido por enlace covalente a la proteína.
13. Composición acuosa que comprende una
composición liofilizada según cualquier de las reivindicaciones 1 a
6 reconstituida con un diluyente acuoso en una cantidad de hasta
210 mg de la composición liofilizada por ml de diluyente acuoso,
presentando dicha composición acuosa en forma de suspensión coloidal
acuosa una transmisión de la luz mayor o igual al 88% medida por
espectrofotometría.
14. Composición acuosa según la reivindicación
13, que comprende por ml de diluyente acuoso hasta 2,5 de
3-O-desacil-4'-monofosforil
lípido A, de 10 a 200 mg de azúcar y de 0 a 6 mg de un tensioactivo
amínico opcionalmente añadido.
15. Composición acuosa según la reivindicación
13, que comprende por ml de diluyente acuoso desde 0,5 hasta 2,5 de
3-O-desacil-4'-monofosforil
lípido A, de 20 a 150 mg de azúcar y de 0 a 3 mg de un tensioactivo
amínico opcionalmente añadido.
16. Composición acuosa según las reivindicaciones
13 a 15, en la que dicho diluyente acuoso comprende agua o una
solución salina.
17. Composición acuosa según las reivindicaciones
13 a 16, en la que dicho diluyente acuoso comprende además un
antígeno o antígenos, un fosfato de aluminio u otro adyuvante o un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Composición para vacuna que comprende una
cantidad de una composición acuosa según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17 y una cantidad inmunológicamente eficaz
de un antígeno o antígenos.
19. Composición para vacuna según la
reivindicación 18, en la que el antígeno o antígenos proceden de o
son producidos por una bacteria, un virus, un parásito, una célula
cancerosa o un alergeno.
20. Composición para vacuna según la
reivindicación 18 o la reivindicación 19, en la que el antígeno es
un conjugado que comprende el polisacárido capsular del
Streptoccocus pneumoniae unido por enlace covalente a la
proteína.
21. Composición para vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 20, en la que el antígeno es un antígeno
de Chlamydia, Haemophilus influenzae no tipificable,
Helicobacter pylori, Moraxella catarrhalis, Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus
pneumoniae, Streptococus del grupo A, Streptococus del
grupo B, virus del herpes común, virus de la inmunodeficiencia
humana, virus del papiloma humano, gripe, sarampión, paragripe,
virus respiratorio del sincitio, rotavirus o virus de Norwalk.
22. Composición para vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 21, en la que la cantidad eficaz del
antígeno está comprendida entre 1 \mug y 5 mg.
23. Composición para vacuna según cualquiera de
las reivindicaciones 18 a 21, en la que la cantidad eficaz de
3-O-desacil-4'-monofosforil
lípido A está comprendida entre 1 \mug y 1 mg.
24. Procedimiento para la preparación de una
composición liofilizada según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 6, que comprende:
- a.
- poner en suspensión 3-O-desacetil-4'-monofosforil lípido A en una cantidad de hasta 5 mg/ml y un tensioactivo amínico en una cantidad de 0 a 6 mg/ml en un diluyente acuoso;
- b.
- formar una suspensión acuosa coloidal que presenta una transmisión de la luz mayor o igual a 88%, medida por espectrofotometría;
- c.
- añadir azúcar a razón de 10 a 200 mg/ml bien antes o después de formar la suspensión acuosa coloidal;
- d.
- liofilizar el azúcar que contiene la suspensión acuosa coloidal; y
- e.
- recuperar una composición liofilizada.
25. Procedimiento para preparar una composición
liofilizada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que
comprende:
- a.
- calentar el lipopolisacárido de la bacteria Salmonella minnesota R595 gram negativa en un ácido mineral de fuerza moderada durante un periodo de tiempo suficiente para obtener un derivado de monofosforilo;
- b.
- disolver el derivado de monofosforilo en un disolvente orgánico y secarlo;
- c.
- tratar el derivado de monofosforilo con álcali suave para eliminar una cadena de ácido graso de base débil en la posición 3 para dar 3-O-desacil-4'-monofosforil lípido A;
- d.
- purificar el 3-O-desacil-4'-monofosforil lípido A por cromatografía líquida y recuperar el monofosforil lípido A;
- e.
- poner en suspensión el 3-O-desacil-4'-monofosforil lípido A en una cantidad de aproximadamente 5 mg/ml y, un tensioactivo amínico en una cantidad comprendida entre 0 y 6 mg/ml en un diluyente acuoso;
- f.
- formar una suspensión acuosa coloidal que tiene una transmisión de la luz mayor o igual a 88%, medida por espectrofotometría;
- g.
- añadir azúcar a razón de 10 a 200 mg/ml ya sea antes o después de formar la suspensión acuosa coloidal;
- h.
- liofilizar el azúcar que contiene la suspensión acuosa coloidal; e
- i.
- recuperar una composición liofilizada.
26. Procedimiento para la preparación de una
suspensión acuosa coloidal según cualquiera de las reivindicaciones
13 a 17, que contiene
3-O-desacil-4'-monofosforil
lípido A que puede congelarse y descongelarse, que comprende:
- a.
- poner en suspensión monofosforil lípido A en una cantidad de hasta 5 mg/ml y un tensioactivo amínico en una cantidad de 0 a 6 mg/ml en un diluyente acuoso;
- b.
- formar una suspensión acuosa coloidal que presenta una transmisión de la luz mayor o igual a 88%, medida por espectrofotometría;
- c.
- añadir azúcar a razón de 10 a 200 mg/ml bien antes o después de formar la suspensión acuosa coloidal;
- d.
- congelar el azúcar que contiene la suspensión acuosa coloidal; y
- e.
- descongelar y recuperar la suspensión acuosa coloidal.
27. Procedimiento para la preparación de una
suspensión acuosa coloidal según cualquiera de las reivindicaciones
13 a 17, que contiene
3-O-desacil-4'-monofosforil
lípido A que puede liofilizarse y volver a ponerse en suspensión,
que comprende:
- a.
- poner en suspensión monofosforil lípido A 3-O-desacil-4'-monofosforil en una cantidad de hasta 5 mg/ml y, una base aminosurfactante en una cantidad de 0 a 6 mg/ml en diluyente acuoso;
- b.
- formar una suspensión acuosa coloidal que presenta una transmisión de la luz mayor o igual a 88%, medida por espectrofotometría;
- c.
- añadir azúcar a razón de 10 a 200 mg/ml bien antes o después de formar la suspensión acuosa coloidal;
- d.
- liolifizar el azúcar que contiene la suspensión acuosa coloidal; y
- e.
- volver a poner en suspensión y volver a formar una suspensión acuosa coloidal.
28. Procedimiento según la reivindicación 26 o la
reivindicación 27, en el que dicha suspensión acuosa liofilizada se
combina con un diluyente acuoso que contiene además un antígeno o
antígenos, un adyuvante de fosfato de aluminio o un conservante,
excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
29. Suspensión acuosa coloidal preparada según el
procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28.
30. Utilización de una composición liofilizada
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación
de una vacuna.
31. Utilización de una composición liofilizada
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación
de una composición acuosa según cualquiera de las reivindicaciones
13 a 17.
32. Utilización de una composición acuosa según
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, para la preparación de
una vacuna.
33. Utilización de una composición para vacuna
según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 ó 18 a 23, para la
preparación de un medicamento para la inmunización de un
vertebrado.
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