ES2559060T3

ES2559060T3 - Composición de un conjugado multivalente de polisacárido neumocócico-proteína

Info

Publication number: ES2559060T3
Application number: ES07865465.4T
Authority: ES
Inventors: William P. Hausdorff; George Rainer Siber; Peter R. Paradiso; A. Krishna Prasad
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-10
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2027-12-10
Also published as: RU2009123449A; HUE028421T2; US20070184072A1; KR101511393B1; HK1215189A1; SI2094304T1; PT2094304E; KR20140130564A; JP2014065721A; RU2484846C2; AU2007337214B2; BRPI0721136B1; US9480736B2; PL2094304T3; EP2094304A1; BRPI0721136A2; KR20150129052A; KR20090094164A; CA2673558A1; BRPI0721136B8

Abstract

Un procedimiento para la elaboración de un conjugado inmunógeno que comprende un polisacárido de Streptococcus pneumoniae del serotipo 1 unido covalentemente a una proteína portadora, procedimiento que comprende: (a) hacer reaccionar un polisacárido del serotipo 1 purificado con un tampón de pH alcalino, dando como resultado un polisacárido del serotipo 1 parcialmente des-O-acetilado; (b) hacer reaccionar el polisacárido del serotipo 1 parcialmente des-O-acetilado con un ácido débil o con un ácido mineral de baja fuerza iónica, dando como resultado un polisacárido del serotipo 1 parcialmente des-O-acetilado neutralizado; (c) hacer reaccionar el polisacárido del serotipo 1 parcialmente des-O-acetilado neutralizado con un agente oxidante, dando como resultado un polisacárido del serotipo 1 activado; (d) combinar el polisacárido del serotipo 1 activado con una proteína portadora; (e) coliofilizar el combinado de polisacárido del serotipo 1 activado y la proteína portadora; (f) hacer reaccionar combinado de polisacárido del serotipo 1 activado y la proteína portadora con un agente reductor, dando como resultado un conjugado de polisacárido del serotipo 1:proteína portadora; y (g) proteger los aldehídos sin reaccionar del conjugado de polisacárido del serotipo 1:proteína portadora, dando como resultado un conjugado inmunógeno que comprende el polisacárido del serotipo 1 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína portadora.

Description

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para mejorar la eficacia de la composición incluyen, pero no se limitan a:

(1): sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.;

(2): formulaciones en emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos, tales como péptidos de muramilo (definidos a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo.

(a): MF59 (Publ. PCT Nº WO 90/14837), que contiene un 5 % de escualeno, un 0,5 % de Tween SG y un 0,5 % de Span 85 (que opcionalmente contiene diversas cantidades de MTP-PE (véase a continuación, aunque no es necesario)) formulado en partículas submicrométricas mediante el uso de un microfluidificador tal como el microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA).

(b): SAF, que contiene un 10 % de escualeno, un 0,4 % de Tween 80, un 5 % de polímero plurónico en bloque L121 y thr-MDP (véase a continuación) tanto microfluidificado en una emulsión submicrométrica como agitado vorticialmente para la generación de una emulsión con un tamaño de partícula mayor, y

(c): sistema coadyuvante Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) que contiene un 2 % de escualeno, un 0,2 % de Tween 80 y uno o más componentes de la pared celular bacteriana de entre el grupo que consiste en monofosforil lípido A 3-O-desailado (MPL™) descrito en la Patente de los Estados Unidos nº 4.912.094 (Corixa), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox™);

(3): pueden usarse coadyuvantes de saponina, tales como Quil A o STIMULON™ OS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Patente de los Estados Unidos nº 5.057.540) o las partículas generadas a partir de los mismos, tales como los ISCOMs (complejos inmunoestimulantes);

(4): lipopolisacáridos bacterianos, análogos sintéticos del lípido A tales como compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina (AGP), o derivados o análogos de los mismos, que están disponibles en Corixa y que se describen en la Patente de los Estados Unidos nº 6.113.918; uno de dichos AGP es 2-desoxi-4-O-fosfono-3O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranósido de 2[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etilo, que también se conoce como 529 (anteriormente conocido como RC529), que se formula en una forma acuosa o en forma de una emulsión estable, polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen motivo(s) CpG (Patente de los Estados Unidos nº 6.207.646);

(5): citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), el factor estimulante de las colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), el factor estimulante de las colonias de macrófagos (M-CSF), el factor de necrosis tumoral (TNF), las moléculas coestimulantes B7-1 y B7-2, etc.;

(6): mutantes destoxificados de una toxina bacteriana de ribosilación del ADP tal como una toxina del cólera (CT) tanto en una forma natural como mutante, por ejemplo, en la que el ácido glutámico en la posición del aminoácido 29 está sustituido por otro aminoácido, preferiblemente una histidina, de acuerdo con la solicitud de patente internacional publicada número WO 00/18434 (véase también el documento WO 02/098368 y el documento WO 02/098369), una toxina tosferínica (PT) o una toxina termolábil de E. coli (LT), particularmente la LT-K63, la LT-R72, la CT-S109, la PT-K9/G129 (véase, por ejemplo, el documento WO 93/13302 y el documento WO 92/19265); y

(7): otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la eficacia de la composición.

Algunos péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), Nacetil-normuramil-L-alanina-2-(1’-2’ dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Las formulaciones de vacuna de la presente invención pueden usarse para la protección o el tratamiento de un ser humano susceptible a una infección neumocócica, mediante la administración de la vacuna a través de una vía sistémica o mucosal. Estas administraciones pueden incluir la inyección a través de la vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o a través de una administración mucosal en el tracto oral / alimentario, respiratorio o genitourinario. En una forma de realización, se usa la administración intranasal para el tratamiento de la neumonía o de la otitis media (ya que puede prevenirse más eficazmente la introducción nasofaríngea de neumococos, atenuando por lo tanto la infección en su etapa más temprana).

La cantidad de conjugado en cada dosis de la vacuna se selecciona como una cantidad que induzca una respuesta inmunoprotectora sin unos efectos adversos significativos. Dicha cantidad puede variar dependiendo del serotipo neumocócico. Generalmente, cada dosis comprenderá entre 0,1 y 100 μg de polisacárido, particularmente entre 0,1 y 10 μg, y más particularmente entre 1 y 5 μg.

Las cantidades óptimas de los componentes de una vacuna en particular pueden ser averiguadas mediante los estudios habituales, que implican la observación de las respuestas inmunitarias apropiadas en los sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo separadas adecuadamente.

En una forma de realización en particular de la presente invención, la vacuna 13vPnC es una formulación líquida estéril de los polisacáridos neumocócicos capsulares de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6 A, 6 B, 7 F, 9 V, 14, 18 C, 19 A, 19 F y 23 F conjugados individualmente con la CRM197. Cada dosis de 0,5 ml está formulada para que contenga: 2 μg

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de cada sacárido, excepto para 6 B a 4 μg; aproximadamente 29 μg de la proteína portadora CRM197; 0,125 mg de coadyuvante de aluminio elemental (0,5 mg de fosfato de aluminio); y cloruro de sodio y tampón de succinato de sodio tampón como excipientes. El líquido se introduce en jeringas de dosis individuales sin ningún conservante. Después de agitar, la vacuna es una suspensión homogénea de color blanco lista para su administración intramuscular.

La elección del nivel de dosis para la vacuna 13vPnC es similar al de la vacuna comercializada 7vPnC (Prevnar). Se seleccionó el nivel de dosis de sacárido de 2 μg para todos los serotipos, excepto para 6 B, que es de 4 μg por dosis. La vacuna 7vPnC ha mostrado una deseable seguridad, inmunogenicidad y eficacia frente a la IPD en el nivel de dosis de sacárido de 2 μg para los serotipos 4, 9 V, 14, 18 C, 19 F y 23 F y a la dosis de 4 μg para 6 B.

El programa de inmunización puede seguir el diseñado para la vacuna 7vPnC. Por ejemplo, el programa rutinario para bebés y niños pequeños frente a la enfermedad invasiva causada por S. pneumoniae debida a los serotipos incluidos en la vacuna 13vPnC es de 2, 4, 6 y 12 -15 meses de edad. Las composiciones de esta invención también son adecuadas para su uso en niños más mayores, en adolescentes y en adultos.

Las composiciones de esta invención pueden incluir adicionalmente uno o más antígenos adicionales para su uso frente a la otitis media causada por una infección por otras bacterias. Dichas bacterias incluyen Haemophilus influenza no tipificable, Moraxella catarrhalis (anteriormente conocida como Branhamella catarrhalis) y Alloiococcus otitidis.

Algunos ejemplos de antígenos no tipificables de Haemophilus influenzae adecuados para su inclusión incluyen la proteína R4, también conocida como proteína "e" (Patente de los Estados Unidos nº 5.601.831; Solicitud de Patente Internacional WO03/078453), la proteína R6, también conocida como RAL o proteína RB0MR-1 (Patente de los Estados Unidos nº 5.110.908; Solicitud de Patente Internacional W00100790), la proteína R5 (Patente Reemitida de los Estados Unidos nº 37.741), la proteína de adhesión y de penetración de Haemophilus (Patentes de los Estados Unidos nº 6.245.337 y 6.676.948), la proteína adhesina de punta LKR (Patente de los Estados Unidos nº 5.643.725) y la proteína NucA (Patente de los Estados Unidos nº 6.221.365).

Algunos ejemplos de antígenos de Moraxella catarrhalis adecuados para su inclusión incluyen la proteína UspA2 (Patentes de los Estados Unidos nº 5.552.146, 6.310.190), la proteína GD (Patente de los Estados Unidos nº 5.725.862), la proteína E (Patente de los Estados Unidos nº 5.948.412) y la proteína de la membrana externa de 74 kilodalton (Patente de los Estados Unidos nº 6.899.885).

Algunos ejemplos de antígenos de Alloiococcus otitidis adecuados para su inclusión incluyen aquellos identificados en la Solicitud de Patente Internacional W003/048304.

Las composiciones de esta invención también pueden incluir una o más proteínas de Streptococcus pneumoniae. Algunos ejemplos de proteínas de Streptococcus pneumoniae adecuadas para su inclusión incluyen aquellas identificadas en las Solicitudes de Patente Internacional W002/083855, así como las descritas en la Solicitud de Patente Internacional W002/053761.

Las composiciones de esta invención pueden incluir adicionalmente una o más proteínas de Neisseria meningitidis de tipo B. Algunos ejemplos de proteínas de Neisseria meningitidis de tipo B adecuadas para su inclusión incluyen aquellas identificadas en las Solicitudes de Patente Internacional W003/063766, W02004/094596, W001/85772, W002/16612 y W001/87939.

Activación del polisacárido de S. pneumoniae del serotipo 1 para su conjugación

Se ha utilizado eficazmente la oxidación parcial de los carbohidratos de los polisacáridos para la generación de los grupos aldehído, que a continuación son acoplados a los residuos de lisina de las proteínas portadoras para generar conjugados inmunógenos (es decir, composiciones, tales como vacunas, útiles para estimular o desencadenar una respuesta inmunitaria especifica en un vertebrado). Un requisito previo general para la generación de los grupos aldehído es la presencia de grupos hidroxilo vecinales (adyacentes). En algunos polisacáridos, algunos de los grupos hidroxilo no están disponibles debido que están bloqueados por otras funcionalidades. En el caso de Pn 1, los grupos O-acetilo son un impedimento para una oxidación eficiente, y la eliminación selectiva de algunos de estos grupos (es decir, la introducción de una suave des-O-acetilación del polisacárido antes de la oxidación) facilita la oxidación y mejora la eficacia de la conjugación.

Con objeto de mantener la consistencia de la reacción de oxidación hasta el grado deseado, el polisacárido Pn 1 es en primer lugar parcialmente des-O-acetilado mediante una hidrólisis suave con un tampón de pH alcalino. Algunos ejemplos de tampones de pH alcalino incluyen, pero no se limitan a, un tampón de bicarbonato / carbonato (tal como bicarbonato / carbonato de sodio), glicina, imidazol y TRIS-EDTA. La des-O-acetilación está seguida por una neutralización mediante el uso de un ácido débil, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido carbónico, o de un ácido mineral de baja fuerza iónica (por ejemplo, ácido clorhídrico). La oxidación parcial para producir el polisacárido Pn 1 "activado" se lleva a cabo después de la neutralización mediante el uso de cantidades controladas de un agente oxidante. Puede usarse cualquier agente oxidante selectivo que oxide un grupo hidroxilo terminal a un aldehído, incluyendo oxidasas de azúcar específicas (por ejemplo, peryodato de sodio o de potasio). El polisacárido Pn 1

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apropiada de desoxicolato de sodio al 12 % estéril al cultivo para obtener una concentración del 0,12 % en el caldo, para lisar las células bacterianas y liberar el polisacárido asociado a las células. Después del lisado, el contenido del fermentador se mantuvo con agitación durante un intervalo de tiempo de entre 8 y 24 horas a una temperatura de entre 7 ºC y 13 ºC, para asegurar que se había producido una lisis celular completa y la liberación del polisacárido. La agitación durante este periodo de mantenimiento impedía que el sedimento de lisado se depositara en las paredes del fermentador y en la sonda de pH. Después, el pH del caldo de cultivo lisado se ajustó hasta aproximadamente un pH de 5,0 con ácido acético al 50 %. Después de un periodo de mantenimiento sin agitación, durante un intervalo de tiempo de entre 12 y 24 horas a una temperatura de entre 15 ºC y 25 ºC, una porción significativa de las proteínas previamente solubles goteó fuera de la solución en forma de un precipitado sólido con poca pérdida o degradación del polisacárido, que permanecía en la solución. La solución con el precipitado se clarificó después mediante una centrifugación de flujo continuo seguido de una filtración profunda y una microfiltración a 0,45 μm.

Purificación

La purificación del polisacárido neumocócico consistió en varias operaciones de concentración / diafiltración, de precipitación / elución, de cromatografías en columna y etapas de filtración profunda. Todos los procedimientos se llevaron a cabo a la temperatura ambiente, salvo que se especifique de otro modo.

Los caldos clarificados de los cultivos de S. pneumoniae del serotipo 1 del fermentador se concentraron y se diafiltraron mediante el uso de un filtro de 100 kDa de MWCO (peso molecular de corte en kilodalton). La diafiltración se llevó a cabo mediante el uso de un tampón de fosfato de sodio a pH neutro. La diafiltración eliminó los componentes del medio de peso molecular bajo de los biopolímeros de mayor peso molecular, tales como ácidos nucleicos, proteínas y polisacáridos.

El polisacárido se precipitó en la solución concentrada y diafiltrada mediante la adición de bromuro de hexadeciltrimetil amonio (MB) a partir de una solución madre, para dar una concentración final del 1 % de MB (p/v). El precipitado de polisacárido / HB se capturó en un filtro profundo y el filtrado se desechó. El precipitado de polisacárido se solubilizó de nuevo y se eluyó mediante la recirculación de una solución de cloruro de sodio a través del filtro profundo que contenía el precipitado. Después los filtros se aclararon con solución adicional de cloruro de sodio.

Se añadió yoduro de sodio (Nal) a la solución de polisacárido desde una solución madre de Nal para conseguir una concentración final del 0,5 % para precipitar el MB. El precipitado se eliminó mediante una filtración profunda. El filtrado contiene el polisacárido objetivo. El recipiente de precipitación y el filtro se aclararon con una solución de NaCl / Nal y el aclarado se combinó con la solución parcialmente purificada de polisacárido. El filtro se desechó. El polisacárido se filtró después a través de un filtro de 0,2 μm.

La solución de polisacárido se concentró con un ultrafiltro de 30 kDa de MWCO y se diafiltró con una solución de cloruro de sodio.

La solución de polisacárido parcialmente purificada se purificó adicionalmente mediante una filtración a través de un filtro profundo impregnado con carbón activo. Después de la filtración, el filtro de carbón se aclaró con una solución de cloruro de sodio. El aclarado se combinó con la solución de polisacárido, que después se filtró a través de un filtro de 0,2 μm.

La solución de polisacárido se concentró con un ultrafiltro de 30 kDa de MWCO y se ajustó con un tampón de fosfato de sodio 1 M para conseguir una concentración final de fosfato de sodio de 0,025 M. Se comprobó el pH y se ajustó a 7,0 ± 0,2.

La columna de hidroxiapatito cerámico (HA) se equilibró con tampón de fosfato de sodio que contiene cloruro de sodio para obtener la conductividad apropiada (< 15 μS). Después se cargó la solución de polisacárido en la columna. En estas condiciones, las impurezas unidas a la resina y el polisacárido se recuperaron a partir del flujo a través de la columna. La solución de polisacárido se filtró a través de filtros en línea de 0,2 μm ubicados antes y después de la columna.

La solución de polisacárido se concentró mediante el uso de un filtro de 30 kDa de MWCO. Después el concentrado se diafiltró con agua para inyección (WFI).

La solución de polisacárido diafiltrada se filtró a través de un filtro de membrana de 0,2 μm en frascos de polipropileno. Se tomaron muestras para las pruebas finales y el polisacárido purificado se almacenó congelado a 25 ± 5ºC.

Caracterización

Los datos de la RMN 1 H eran coherentes con la estructura química mediante la asignación de las señales asignadas a los protones de la molécula del polisacárido. El espectro de RMN 1 H mostraba una serie de señales bien resueltas (los protones del grupo metilo) para la cuantificación del grupo funcional O-acetilo del polisacárido.

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La identidad del polisacárido monovalente se confirmó mediante una inmunoelectroforesis a contracorriente mediante el uso de antisueros específicos.

Se usó una cromatografía de filtración en gel de alta resolución acoplada con detectores del índice de refracción y de la dispersión de la luz láser multiángulo (MALLS) junto con la concentración de la muestra para calcular el peso molecular.

Se usó medio de cromatografía de exclusión por tamaños (CL-4B) para el perfilado de la distribución relativa de pesos moleculares del polisacárido.

Ejemplo de referencia 2

Preparación del conjugado de sacárido neumocócico del serotipo 1 -CRM197

Activación y conjugación

Los recipientes con el polisacárido purificado se descongelaron y se combinaron en un recipiente de reacción. Al recipiente se añadió carbonato de sodio 0,2 M, a pH 9,0 para una desacetilación parcial (hidrolisis) durante 3 horas a 50 ºC. La reacción se enfrió hasta 20 ºC y se llevó a cabo una neutralización mediante ácido acético 0,2 M. Se llevó a cabo una oxidación en presencia de peryodato de sodio mediante una incubación a 2 -8 ºC, y la mezcla se agitó durante 15 -21 horas.

La mezcla de la reacción de activación se concentró y diafiltró 10x con NaCl al 0,9 % mediante el uso de una membrana de 30 K de MWCO. El retenido se filtró a 0,2 μm. El sacárido activado se introdujo en frascos de liofilización de vidrio de 100 ml y se congeló Shell a -75 ºC y se liofilizó.

La "congelación Shell" es un procedimiento para la preparación de muestras para su liofilización. Los matraces se rotan automáticamente mediante rodillos motorizados en un baño refrigerado que contiene alcohol o cualquier otro líquido apropiado. Se congela uniformemente un delgado recubrimiento de producto alrededor de la "cáscara" interior de un matraz, lo que permite procesar de forma segura un mayor volumen del material durante cada ciclo de liofilización. Estas unidades refrigeradas automáticas proporcionan un medio simple y eficaz de precongelar muchos matraces al mismo tiempo, produciendo los recubrimientos internos deseados y proporcionando un área superficial suficiente para una liofilización eficaz.

Los frascos del material liofilizado se llevaron hasta la temperatura ambiente y se resuspendieron en una solución de CRM197 a una proporción de sacárido / proteína de 2:1. A la mezcla de sacárido / proteína se añadió tampón de fosfato de sodio 1 M a una fuerza iónica final de 0,2 M y a un pH de 7,5, después se añadió cianoborhidruro de sodio. La reacción se incubó a 23 ºC durante 18 horas, seguido de una segunda incubación a 37 ºC durante 72 horas. Después de las incubaciones con cianoborhidruro, la mezcla de reacción se diluyó con solución salina fría seguido de la adición de carbonato de sodio 1 M para ajustar la mezcla de reacción a pH 9,0. Los aldehídos sin reaccionar se inactivaron mediante la adición de borhidruro de sodio mediante una incubación a 23 ºC durante 3 -6 horas.

La mezcla de reacción se diluyó 2 veces con solución salina y se transfirió a través de un prefiltro 0,45 -5 μm a un recipiente de retenido. La mezcla de reacción se diafiltró 30x con tampón de fosfato 0,15 M, a pH 6, y 20x con solución salina. El retenido se filtró a través de un filtro de 0,2 μm.

La solución de conjugado se diluyó hasta un objetivo de 0,5 mg/ml con solución salina al 0,9 % y después se filtró estéril en recipientes de concentrado final a granel (FSC) en una campana de clase 100. El conjugado se almacenó a 2 -8ºC.

Caracterización

Se usó medio de cromatografía de exclusión por tamaños (CL-4B) para el perfilado de la distribución relativa de pesos moleculares del conjugado.

La identidad del conjugado se confirmó mediante el ensayo de transferencia en ranura mediante el uso de antisueros específicos.

Las concentraciones del sacárido y de la proteína se determinaron mediante los ensayos del ácido urónico y de Lowry, respectivamente. La proporción entre el sacárido y la proteína en el complejo conjugado unido covalentemente se obtuvo mediante el cálculo:

μg/ml de sacárido

proporción = ------------------------

μg/ml de proteína

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obtuvo mediante el cálculo:

μg/ml de sacárido

proporción = ------------------------------

μg/ml de proteína

Ejemplo de referencia 5

Preparación del polisacárido capsular de S. Pneumoniae del serotipo 5

El S. pneumoniae del serotipo 5 se obtuvo del Dr. Gerald Schiffman de la State University de Nueva York, Brooklyn, Nueva York. Para la preparación del sistema de banco de células, véase el Ejemplo 1. Para la fermentación, la recogida, la purificación y la caracterización del polisacárido, véase el Ejemplo 1.

Procedimiento de fermentación alternativo

Se usaron los cultivos del banco de células de trabajo para inocular frascos de siembra 10 que contienen un medio basado en soja y una solución estéril de NaHCO3 10 mM. Los frascos se incubaron a 36 ºC ± 2 ºC sin agitación hasta que se cumplieron los requisitos de crecimiento. Se usó un frasco de siembra para inocular un fermentador de siembra que contenía un medio basado en soja y una solución estéril de NaHCO3 10 mM. Se mantuvo un pH de aproximadamente 7,0 con NaOH 3 N. Después de alcanzar la densidad óptica objetivo, se usó el fermentador de siembra para inocular el fermentador de producción que contenía un medio basado en soja con una concentración de NaHCO3 de 10 mM. El pH se mantuvo con NaOH 3 N. La fermentación finalizó después de cesar el crecimiento o cuando se hubo alcanzado el volumen de trabajo del fermentador. Se añadió una cantidad apropiada de desoxicolato de sodio al 12 % estéril al cultivo para obtener una concentración del 0,12 % en el caldo, para lisar las células bacterianas y liberar el polisacárido asociado a las células. Después del lisado, el contenido del fermentador se mantuvo, con agitación, durante un intervalo de tiempo de entre 8 y 24 horas a una temperatura de entre 7 ºC y 13 ºC para asegurar que se había producido una lisis celular completa y la liberación del polisacárido. La agitación durante este periodo de mantenimiento impedía que el sedimento de lisado se depositara en las paredes del fermentador y en la sonda de pH, permitiendo así el mantenimiento de la integridad de la sonda de pH. Después, el pH del caldo de cultivo lisado se ajustó hasta aproximadamente un pH de 4,5 con ácido acético al 50 %. Después de un periodo de mantenimiento sin agitación, durante un intervalo de tiempo de entre 12 y 24 horas a una temperatura de entre 15 ºC y 25 ºC, una porción significativa de las proteínas previamente solubles goteó fuera de la solución en forma de un precipitado sólido con poca pérdida o degradación del polisacárido, 30 que permanecía en la solución. La solución con el precipitado se clarificó después mediante una centrifugación de flujo continuo seguido de una filtración profunda y una microfiltración a 0,45 μm.

Ejemplo de referencia 6

Preparación del conjugado de sacárido neumocócico del serotipo 5 -CRM197

Activación y conjugación

Los recipientes de sacárido del serotipo 5 se descongelaron y se combinaron en un recipiente de reacción. Al recipiente se añadió acetato de sodio 0,1 M, a pH 4,7, seguido de una oxidación en presencia de peryodato de sodio mediante una incubación durante 16 -22 horas a 23 ºC.

La mezcla de la reacción de activación se concentró y se diafiltró 10x con WFI mediante el uso de una membrana de 100 K de MWCO. El retenido se filtró a través de un filtro de 0,2 μm.

El sacárido activado del serotipo 5 se combinó con la CRM197 en una proporción de 0,8:1. La solución combinada de sacárido / proteína se introdujo en frascos de liofilización de vidrio de 100 ml (llenado objetivo de 50 ml), se congelaron Shell a -75 ºC y se coliofilizaron.

Los frascos del material coliofilizado se llevaron hasta la temperatura ambiente y se resuspendieron en tampón de fosfato de sodio 0,1 M, a pH 7,5, y se añadió cianoborhidruro de sodio. La reacción se incubó a 30 ºC durante 72 horas, seguido de una segunda adición de cianoborhidruro y se incubó a 30 ºC durante 20 -28 horas.

Después de las incubaciones con cianoborhidruro, la mezcla de reacción se diluyó 2 veces con solución salina y se transfirió a través de un prefiltro de 0,45 -5 μm a un recipiente de retenido. La mezcla de reacción se diafiltró 30x con tampón de fosfato 0,01 M, a pH 8, 20x con tampón de fosfato 0,15 M a pH 6, y 20x con solución salina. El retenido se filtró a través de un filtro de 0,2 μm.

La solución de conjugado se diluyó hasta un objetivo de sacárido de 0,5 mg/ml y después se filtró estéril en recipientes de FBC en una campana de clase 100. El conjugado se almacenó a 2 -8 ºC.

Para la caracterización del conjugado, véase el Ejemplo 2.

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Ejemplo de referencia 7

Preparación del polisacárido capsular de S. Pneumoniae del serotipo 6 A

El S. pneumoniae del serotipo 6 A se obtuvo del Dr. Gerald Schiffman de la State University de Nueva York, Brooklyn, Nueva York. Para la preparación del sistema de banco de células, véase el Ejemplo 1. Para la fermentación, la recogida y la purificación del polisacárido, véase el Ejemplo 1, excepto porque durante la purificación, se omite la etapa de concentración de 30 kDa de MWCO, antes de la etapa de cromatografía.

Ejemplo de referencia 8

Preparación del conjugado de sacárido neumocócico del serotipo 6 A -CRM197

Activación y conjugación

El polisacárido del serotipo 6 A es un polímero de alto peso molecular cuyo tamaño tuvo que ser reducido antes de la oxidación. Los recipientes de sacárido del serotipo 6 A se descongelaron y se combinaron en un recipiente de reacción. Al recipiente se añadió ácido acético 2 M hasta una concentración final de 0,1 M para una hidrólisis durante 1,5 horas a 60 ºC. La reacción se enfrió hasta 23 ºC y la neutralización se llevó a cabo mediante el ajuste de la mezcla de reacción con NaOH 1 M hasta un pH de 6. La oxidación en presencia de peryodato de sodio se llevó a cabo mediante una incubación a 23 ºC durante 14 -22 horas.

El serotipo 6 A se combinó con sacarosa y se introdujo en frascos de liofilización de vidrio de 100 ml (llenado objetivo de 50 ml) y se congelaron Shell a -75 ºC y se liofilizaron.

Los frascos del material liofilizado se llevaron hasta la temperatura ambiente y se resuspendieron en dimetilsulfóxido (DMSO) en una proporción de sacárido / proteína de 1:1. Después de la adición de cianoborhidruro de sodio, la mezcla de reacción se incubó a 23 ºC durante 18 horas. Después de la incubación con cianoborhidruro, la mezcla de reacción se diluyó con solución salina fría. Los aldehídos sin reaccionar se inactivaron mediante la adición de borhidruro de sodio mediante una incubación a 23 ºC durante 3 -20 horas.

La mezcla de reacción diluida se transfirió a través de un prefiltro de 5 μm a un recipiente de retenido. La mezcla de reacción se diafiltró 10x con NaCl al 0,9 % y 30x con NaCl tamponado con succinato. El retenido se filtró a través de un filtro de 0,2 μm.

Para la caracterización del conjugado, véase el Ejemplo 2.

Ejemplo de referencia 9

Preparación del polisacárido capsular de S. Pneumoniae del serotipo 7 F

El S. pneumoniae del serotipo 7 F se obtuvo del Dr. Gerald Schiffman de la State University de Nueva York, Brooklyn, Nueva York. Para la preparación del sistema de banco de células y para la fermentación y la recogida del polisacárido, véase el Ejemplo 3. Para un procedimiento de fermentación y de recogida alternativo, véase el procedimiento alternativo descrito en el Ejemplo 1.

Purificación

La purificación del polisacárido neumocócico consistió en varias operaciones de concentración / diafiltración, de precipitación / elución, de cromatografía en columna y etapas de filtración profunda. Todos los procedimientos se llevaron a cabo a la temperatura ambiente salvo que se especifique de otro modo.

Los caldos clarificados de los cultivos de S. pneumoniae del serotipo 7 F del fermentador se concentraron y se diafiltraron mediante el uso de un filtro de 100 kDa de MWCO. La diafiltración se llevó a cabo mediante el uso de un tampón de fosfato de sodio a pH neutro. La diafiltración eliminó los componentes del medio de peso molecular bajo de los biopolímeros de mayor peso molecular, tales como ácidos nucleicos, proteínas y polisacáridos.

El serotipo 7 F no forma un precipitado con el HB. En su lugar, se precipitaron las impurezas a partir del concentrado y la solución diafiltrada mediante la adición del HB a partir de una solución madre hasta una concentración final del 1 % se HB. El precipitado se capturó en un filtro profundo y el filtrado se desechó. El polisacárido estaba contenido en el filtrado.

Se añadió yoduro de sodio (Nal) a la solución de polisacárido desde una solución madre de Nal para conseguir una concentración final del 0,5 % para precipitar el MB. El precipitado se eliminó mediante una filtración profunda. El

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Ejemplo de referencia 12

Preparación del conjugado de sacárido neumocócico del serotipo 19 A -CRM197

Activación y conjugación

Los recipientes del sacárido del serotipo 19 A se descongelaron y se combinaron en un recipiente de reacción. Se añadió acetato de sodio a 10 mM (pH 5,0) y se llevó a cabo la oxidación en presencia de peryodato de sodio mediante una incubación durante 16 -24 h a 23 ºC,

La mezcla de la reacción de activación se concentró y se diafiltró 10x con acetato 10 mM, a pH 5,0, mediante el uso de una membrana de 100 K de MWCO. El retenido se filtró a través de un filtro de 0,2 μm,

El sacárido activado se combinó con sacarosa seguido de la adición de la CRM197. La mezcla del sacárido activador del serotipo 19 A y la CRM197 (proporción de 0,8:1) se introdujo en frascos de liofilización de vidrio de 100 ml (llenado objetivo de 50 ml) y se congelaron Shell a -75 ºC y se liofilizaron,

Los frascos del material liofilizado se llevaron hasta la temperatura ambiente y se resuspendieron en DMSO. A la mezcla de sacárido / proteína se añadió cianoborhidruro de sodio (100 mg/ml) La reacción se incubó a 23 ºC durante 15 horas. Después de la incubación con cianoborhidruro, los aldehídos sin reaccionar se inactivaron mediante la adición de borhidruro de sodio mediante una incubación a 23 ºC durante 3 -20 horas,

La mezcla de reacción se diluyó 10 veces con solución salina fría y se transfirió a través de un prefiltro de 5 μm a un recipiente de retenido La mezcla de reacción se diafiltró 10x con NaCl al 0,9 %, se filtró a 0,45 μm y 30x con diafiltración mediante el uso de tampón de succinato 5 mM / NaCl al 0,9 %, a pH 6. El retenido se filtró a través de un filtro de 0,2 μm,

La solución del conjugado se diluyó hasta un objetivo de 0,5 mg/ml mediante el uso de succinato 5 mM / solución salina al 0,9 % y después se filtró estéril en recipientes de FBC en una campana de clase 100. El conjugado se almacenó a 2 -8 ºC.

Para la caracterización del conjugado, véase el Ejemplo 4.

Ejemplo de referencia 13

Preparación del polisacárido capsular de S. Pneumoniae del serotipos 4, 6 B, 9 V, 14, 18 C, 19 F y 23F

Preparación del cultivo de siembra de S. pneumoniae

Los serotipos de S. pneumoniae 4, 6 B, 9 V, 18 C, 19 F y 23 F se obtuvieron del Dr. Gerald Schiffman, State University de Nueva York, Brooklyn, Nueva York. El serotipo 14 de S. pneumoniae se obtuvo en la ATCC, cepa 6314,

Por separado, se usó un vial de cada uno de los serotipos deseados de Streptococcus pneumoniae para iniciar un lote de fermentación. Se ajustaron dos frascos que contienen medio basado en soja y rojo de fenol a un intervalo de pH de 7,4 ± 0,2 mediante el uso de carbonato de sodio, y después se añadió a los frascos el volumen requerido de la solución de dextrosa al 50 % / sulfato de magnesio al 1 %. Los dos frascos fueron inoculados con diferentes cantidades de siembra. Los frascos se incubaron a 36 ± 2 ºC hasta que el medio se volvió de color amarillo. Después de la incubación, se retiraron muestras de cada frasco y se ensayó su densidad óptica (DO) (entre 0,3 y 0,9) y su pH (entre 4,6 y 5,5). Se seleccionó uno de los dos frascos para la inoculación del fermentador de siembra.

El medio basado en soja se transfirió al fermentador de siembra y se esterilizó. Después se añadió al fermentador un volumen de solución de dextrosa al 50 % / sulfato de magnesio al 1 %. Se monitorizaron y se controlaron el pH y la agitación del fermentador de siembra (a un pH de entre 6,7 y 7,4). La temperatura se mantuvo a 36 ± 2 ºC. El inóculo de siembra (frasco) se conectó asépticamente al fermentador de siembra y se transfirió el inóculo. El fermentador se mantuvo en control de pH y periódicamente se extrajeron muestras y se ensayaron para comprobar la DO y el pH. Cuando se alcanzó la DO deseada de entre 0,5 y 600 nm, el fermentador intermedio se inoculó con el caldo de fermentación del fermentador de siembra.

El medio basado en soja se transfirió al fermentador intermedio y se esterilizó. Entonces se añadió al fermentador un volumen de una solución de dextrosa al 50 % / sulfato de magnesio al 1 %. Se monitorizaron y se controlaron el pH y la agitación del fermentador intermedio (a un pH de entre 6,7 y 7,4). La temperatura se mantuvo a 36 ± 2 ºC. El contenido del fermentador de siembra se transfirió al fermentador intermedio. El fermentador se mantuvo en control de pH y periódicamente se extrajeron muestras y se ensayaron para comprobar la DO y el pH. Cuando se alcanzó la DO deseada de entre 0,5 y 600 nm, el fermentador de producción se inoculó con el caldo de fermentación del fermentador intermedio.

El medio basado en soja se transfirió al fermentador de producción y se esterilizó. Después se añadió al fermentador un volumen de una solución de dextrosa al 50 % / sulfato de magnesio al 1 %. Se monitorizaron y se controlaron el

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•: 1 l de tampón por 16 -24 g de sacárido para el serotipo 4 y 9 V

•: 1 I de tampón por 6 -10 g de sacárido para el serotipo 14

La mezcla de reacción se incubó a 37 ± 2 ºC hasta su total disolución para el serotipo 9 V, y a 23 ± 2 ºC para los serotipos 4 y 14.

Para el serotipo 18 C, el sacárido liofilizado se reconstituyó en una solución de CRM197 en fosfato de sodio dibásico 1 M a una proporción típica de 0,11 l de fosfato de sodio por 1 l de solución de CRM197. La mezcla de reacción (concentración de sacárido de 8 -12 g/l) se incubó a 23 ± 2 ºC hasta su total disolución.

En esta etapa se ensayó el pH como control durante el proceso.

Etapa 2: reacción de conjugación

Para los serotipos 4 y 9 V, la reacción de conjugación se inició mediante la adición de una solución de cianoborhidruro de sodio (100 mg/ml) para conseguir 1,0 -1,4 moles cianoborhidruro de sodio por mol de sacárido. La mezcla de reacción se incubó durante 44 -52 horas a 37 ± 2 ºC. Después, la temperatura se redujo hasta 23 ± 2 ºC y se añadió cloruro de sodio al 0,9 % al reactor. Se añadió una solución de borhidruro de sodio (100 mg/ml) para conseguir 1,8 -2,2 equivalentes molares de borhidruro de sodio por mol sacárido. La mezcla se incubó durante 3 -6 horas a 23 ± 2 ºC. La mezcla se diluyó con cloruro de sodio al 0,9 % y se aclaró el reactor. La mezcla de conjugación diluida se filtró mediante el uso de un prefiltro de 1,2 μm en un recipiente de mantenimiento.

Para los serotipos 14 y 18 C, la reacción de conjugación se inició mediante la adición de la solución de cianoborhidruro (100 mg/ml) para conseguir 1,0 -1,4 moles de cianoborhidruro de sodio por mol de sacárido. La mezcla de reacción se incubó durante 12 -24 horas a 23 ± 2 ºC. La temperatura se aumentó hasta 37 ± 2 ºC y la reacción se incubó durante 72 -96 horas. Después, la temperatura se redujo hasta 23 ± 2 ºC y el reactor se añadió cloruro de sodio al 0,9 %. Se añadió una solución de borhidruro de sodio (100 mg/ml) para conseguir 1,8 -2,2 equivalentes molares de borhidruro de sodio por mol de sacárido. La mezcla se incubó durante 3 -6 horas a 23 ± 2 ºC. La mezcla se diluyó con cloruro de sodio al 0,9 % y se aclaró el reactor. La mezcla de conjugación diluida se filtró mediante el uso de un prefiltro de 1,2 μm en un recipiente de mantenimiento.

Etapa 3: ultrafiltración a 100 kDa

La mezcla de conjugación diluida se concentró y se diafiltró con un ultrafiltro de 100 kDa de MWCO, con un mínimo de 15 volúmenes (serotipo 4) o de 40 volúmenes (serotipos 9 V, 14 y 18 C) de cloruro de sodio al 0,9 %.

El permeado se desechó.

Para el serotipo 4, el retenido se filtró a través de un filtro de 0,45 μm.

En esta etapa se llevó a cabo un control durante el proceso (contenido en sacárido).

Etapa 4: purificación en columna de HA

Esta etapa se llevó a cabo únicamente para el serotipo 4 conjugado.

La columna de HA se neutralizó en primer lugar mediante el uso de tampón de fosfato de sodio 0,5 M (a pH 7,0 ± 0,3) y después se equilibró con cloruro de sodio al 0,9 %. El retenido filtrado (serotipo 4) se cargó en la columna a un caudal de 1,0 l/min. La columna se lavó con cloruro de sodio al 0,9 % a un caudal de < 2,0 l/min. El producto se eluyó después con tampón de fosfato de sodio 0,5 M a un caudal de < 2,0 l/min.

Después la fracción de HA se concentró y se diafiltró con una membrana de 100 kDa de MWCO con un mínimo de 20 volúmenes de cloruro de sodio al 0,9 %. El permeado se desechó.

Etapa 5: filtración estéril

El retenido después de la diafiltración de 100 kDa de MWCO se filtró a través de un filtro de 0,22 μm. Se llevaron a cabo controles durante el proceso en el producto filtrado (contenido en sacárido, en proteína libre, en sacárido libre y en cianuro). Los controles durante el proceso del retenido filtrado se llevaron a cabo para determinar si eran necesarias una concentración, una diafiltración y/o una dilución adicionales para cumplir los objetivos de FBC. Estos y otros ensayos adicionales se repitieron en las muestras de FBC.

Según fue necesario, el conjugado filtrado se diluyó con cloruro de sodio al 0,9 % con objeto de conseguir una concentración final de menos de 0,55 g/l. En esta etapa se llevaron a cabo los ensayos finales del contenido en sacárido, del contenido proteína y de la proporción de sacárido:proteína.

Finalmente, el conjugado se filtró (0,22 μm) y se introdujo en botes de acero inoxidable de 10 l en una cantidad típica de 2,64 g/bote. En esta etapa se llevaron a cabo controles durante el proceso del rendimiento, del contenido en sacárido, del contenido en proteína, del pH, de la proporción de sacárido:proteína y del contenido en lisina. En esta

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etapa se llevaron a cabo los ensayos finales (aspecto, proteína libre, sacárido libre, endotoxina, determinación del tamaño molecular, cianuro residual, identidad del sacárido, identidad de la CRM197).

Conjugación con DMSO

Etapa I: disolución

Los sacáridos activados liofilizados de los serotipos 6 B, 19 F, 23 F y la proteína portadora CRM197 liofilizada se equilibraron a la temperatura ambiente y se reconstituyeron en DMSO. La concentración de la disolución variaba normalmente entre 2 -3 gramos de sacárido (2 -2,5 g proteína) por litro de DMSO.

Etapa II: reacción de conjugación

El sacárido activado y la proteína portadora CRM197 se mezclaron durante 60 -75 minutos a 23 ± 2 ºC en un intervalo de proporciones de 0,6 g -1,0 g de sacárido / g de CRM197 para los serotipos 6 B y 19 F, o de entre 1,2 y 1,8 g de sacárido / g de CRM197 para el serotipo 23 F.

La reacción de conjugación se inició mediante la adición de una solución de cianoborhidruro de sodio (100 mg/ml) a una proporción de 0,8 -1,2 equivalentes molares de cianoborhidruro de sodio por un mol de sacárido activado. Se añadió WFI a la mezcla de reacción hasta un objetivo del 1 % (v/v) y la mezcla se incubó durante más de 40 horas a 23 ± 2ºC.

A la reacción se añadieron una solución de borhidruro de sodio, 100 mg/ml (típicos 1,8 -2,2 equivalentes molares de borhidruro de sodio por mol sacárido activado) y WFI (objetivo del 5 % v/v) y la mezcla se incubó durante 3 -6 horas a 23 ± 2 ºC. Este procedimiento redujo cualquier aldehído sin reaccionar presente en los sacáridos. A continuación, la mezcla de reacción se transfirió a un tanque de dilución que contenía cloruro de sodio al 0,9 % a < 15 ºC.

Etapa III: ultrafiltración a 100 kDa

La mezcla de conjugado diluido se filtró a través de un filtro de 1,2 μm y se concentró y se diafiltró con una membrana de 100 kDa de MWCO con un mínimo de 15 volúmenes de cloruro de sodio al 0,9 % (se usó un tampón fosfato de sodio 0,01 M / NaCl 0,05 M para el serotipo 23 F). El permeado se desechó. El retenido se filtró a través de un filtro de 0,45 μm. En esta etapa se tomó una muestra del contenido en sacárido durante el proceso.

Etapa IV: purificación en columna de DEAE

Esta etapa se llevó a cabo únicamente para el serotipo 23 F.

La columna de DEAE se equilibró con tampón de fosfato de sodio 0,01 M / cloruro de sodio 0,05 M. El retenido filtrado (serotipo 23 F) se cargó en la columna y se lavó con tampón fosfato de sodio 0,01 M / cloruro de sodio 0,05

M. Después, la columna se lavó con tampón de fosfato de sodio 0,01 M / NaCl al 0,9 %. El producto se eluyó después con un tampón de fosfato de sodio 0,01 M / cloruro de sodio 0,5 M.

Etapa V: ultrafiltración a 100 kDa

El retenido de 6 B y 19 F se concentró y se diafiltró con al menos 30 volúmenes de cloruro de sodio al 0,9 %. El permeado se desechó.

El eluido del serotipo 23 F se concentró y se diafiltró con un mínimo de 20 volúmenes de cloruro de sodio al 0,9 %. El permeado se desechó.

Etapa VI: filtración estéril

El retenido después de la diafiltración de 100 kDa de MWCO se filtró a través de un filtro de 0,22 μm. Se llevaron a cabo controles durante el proceso (contenido en sacárido, en proteína libre, en sacárido libre, en DMSO residual y en cianuro residual) sobre el producto filtrado. Se llevaron a cabo controles durante el proceso sobre el retenido filtrado para determinar si eran necesarias una concentración, una diafiltración y/o una dilución adicionales para cumplir los objetivos de FBC. Estos y otros ensayos adicionales se repitieron en las muestras de FBC.

Según fue necesario, el conjugado filtrado se diluyó con cloruro de sodio al 0,9 % para conseguir una concentración final de menos de 0,55 g/l. En esta etapa se llevaron a cabo los ensayos finales del contenido en sacárido, del contenido en proteína y de la proporción de sacárido:proteína.

Finalmente, el conjugado se filtró (0,22 μm) y se introdujo en botes de acero inoxidable de 10 l en una cantidad típica de 2,64 g/bote. En esta etapa se llevaron a cabo controles durante el proceso del rendimiento, del contenido en sacárido, del contenido en proteína, del pH, de la proporción de sacárido:proteína y del contenido en lisina. En esta etapa se llevaron a cabo los ensayos finales (aspecto, proteína libre, sacárido libre, endotoxina, determinación del tamaño molecular, cianuro residual, DMSO residual, identidad del sacárido e identidad de la CRM197)

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Ejemplo 15

Formulación de una vacuna conjugada neumocócica multivalente

Los concentrados a granel finales de los 13 conjugados contienen cloruro de sodio al 0,85 %. Los concentrados a granel de los tipos 3, 6 A, 7 F y 19 A también contienen tampón de succinato de sodio 5 mM a pH 5,8. Los volúmenes requeridos de los concentrados a granel se calcularon basándose en el volumen del lote y en las concentraciones del sacárido a granel. Después de añadir un 80 % del cloruro de sodio al 0,85 % (solución salina fisiológica) y la cantidad necesaria de tampón de succinato al recipiente de la formulación premarcado, se añadieron los concentrados a granel. Después la preparación se filtró estéril a través de una membrana de 0,22 μm en un segundo contenedor mediante el uso de una unidad de filtro de membrana Millipore Durapore. El primer contenedor se lavó con el 20 % restante del cloruro de sodio al 0,85 % y la solución se hizo pasar a través del mismo filtró y se recogió en el segundo contenedor. El formulado a granel se mezcló suavemente durante y después de la adición del volumen de fosfato de aluminio a granel. Se comprobó el pH y se ajustó si fue necesario. El producto a granel formulado se almacenó a 2 -8 ºC.

El producto a granel formulado se introdujo en jeringas de borosilicato de vidrio de tipo 1 obtenidas en Becton Dickinson. A intervalos regulares se monitorizó la turbidez de la vacuna para asegurar la uniformidad en la operación de llenado. La vacuna completa (Producto Final) se almacenó a 2 -8 ºC.

Ejemplo 16

Inmunogenicidad de la vacuna conjugada undecavalente

Hasta la fecha, los estudios preclínicos llevados a cabo con la vacuna 13vPnC se han realizado con conejos. Los estudios #HT01-0021 y #HT01-0036 fueron diseñados para examinar independientemente del efecto de la conjugación química de los polisacáridos capsulares (PSs) de S. pneumoniae con la CRM197 y el efecto del coadyuvante de fosfato de aluminio (AlPO4) sobre la respuesta inmunitaria a la vacuna 13vPnC en conejos. Estos efectos se caracterizaron mediante un ELISA específico de antígeno para las concentraciones séricas de IgG, y para la función de anticuerpo mediante un ensayo opsonofagocítico (OPA).

Estudio #HT01-0021

El estudio #HT01-0021 examinó la capacidad de la vacuna 13vPnC con coadyuvante de AlPO4 de desencadenar respuestas inmunitarias específicas de serotipo frente a la vacuna. Los serotipos neumocócicos representados en la 13vPnC incluyen los tipos 1, 3, 4, 5, 6 A, 6 B, 7 F, 9 V, 14, 18 C, 19 A, 19 F y 23 F. Los objetivos secundarios incluían una evaluación de la cinética y de la duración de la respuesta del anticuerpo. Se inmunizaron por vía intramuscular conejos blancos de Nueva Zelanda en la semana 0 y en la semana 2 con la dosis clínica planificada para seres humanos de cada polisacárido (2 μg de cada PS, excepto 4 μg de 6 B) formulada con o sin AlPO4 (100 μg/dosis). Se recogieron sueros en diversos puntos temporales. La IgG específica de serotipo se midió mediante un ELISA y la actividad funcional fue evaluada mediante un OPA.

La Tabla 3 muestra el título medio geométrico (GMT) conseguido en muestras séricas agrupadas, después de dos dosis de la vacuna 13vPnC. Se usó una proporción de los GMT de la IgG para comparar las respuestas desde la semana 4 hasta la semana 0. Estos datos demuestran que la inclusión de AlPO4 en la formulación de la 13vPnC desencadenaba unos mayores niveles de anticuerpo de IgG en comparación con la misma vacuna sin coadyuvante. Aunque las respuestas del anticuerpo eran mayores que cuando se incluía el AlPO4 en la formulación, estos aumentos no eran estadísticamente significativos.

También se evaluaron las respuestas funcionales del anticuerpo en conejos después de una inmunización con dos formulaciones de la 13vPnC (Tabla 4). Cuando se comparaban las formulaciones de vacuna con o sin coadyuvante, se observaron unos mayores GMT en el OPA en el grupo de tratamiento con la vacuna 13vPnC + AlPO4. Los títulos del OPA fueran detectados en los sueros agrupados de la semana 4 para todos los serotipos de la vacuna en ambos grupos. Para la mayoría de los serotipos, los títulos del OPA medidos en la semana 4 eran al menos 4 veces mayores que los de la semana 0 (momento inicial).

Se evaluaron las respuestas cinéticas de cada uno de los serotipos de la vacuna 13vPnC en los sueros agrupados de ambos grupos de tratamiento. Se midieron los títulos de IgG contra cada serotipo en las muestras sanguíneas de la semana 0 y de las semanas 1, 2, 3, 4, 8, 12, 26 y 39, y después se compararon. Con la excepción del serotipo 1, las repuestas del anticuerpo en los animales que recibían la vacuna coadyuvada eran superiores a las de aquellos que recibían la vacuna no coadyuvada, y presentaban un pico en la semana 2 del programa de inmunización (datos no mostrados).

Globalmente, los datos indican que la vacuna 13vPnC formulada con fosfato de aluminio es inmunógena en conejos, desencadenando unas sustanciales respuestas de anticuerpos contra los polisacáridos capsulares neumocócicos contenidos en la vacuna, y estas respuestas están asociadas con una actividad funcional. Las respuestas observadas contra los siete serotipos del núcleo después de la inmunización con 13vPnC + AlPO4 son coherentes con las respuestas históricas de los conejos a la formulación heptavalente.

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Claims

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