ES2831375T3 - Composición de conjugados neumocócicos de polisacárido-proteína multivalente - Google Patents

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Abstract

Composición inmunogénica multivalente, que comprende: 13 conjugados distintos de polisacárido-proteína, junto con un vehículo fisiológicamente aceptable, en la que cada uno de los conjugados de polisacárido- proteína comprende un polisacárido capsular de un serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado con la proteína portadora CRM197, y los polisacáridos capsulares se preparan a partir de 12 serotipos seleccionados del grupo que consiste en 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F, y el serotipo 2 o 9N.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición de conjugados neumocócicos de polisacárido-proteína multivalente
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición inmunogénica multivalente que comprende: 13 conjugados distintos de polisacárido-proteína preparados por la conjugación de polisacáridos capsulares derivados de 12 serotipos Streptococcus pneumoniae, 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F y serotipo de Streptococcus pneumoniae 2 o 9N con la proteína portadora CRM197. La presente invención se refiere en general al campo de la medicina, y específicamente a la microbiología, inmunología, vacunas y la prevención de la enfermedad neumocócica en lactantes, niños y adultos mediante inmunización.
Antecedentes de la técnica
Streptococcus pneumoniae es la causa principal de neumonía. Según la Tendencia de mortalidad por causa del 2010 publicada por la Oficina nacional de estadística, la neumonía fue una de las 10 causas principales de muerte, con 14,9 muertes por 100.000 personas, lo que representa un aumento del 82,9 % desde el año 2000. La Organización mundial de la salud (OMS) también estimó en 2012 que, globalmente, 476.000 niños negativos para VIH de 5 años de edad o menos murieron a causa de la infección por Streptococcus pneumoniae, lo que representa el 5 % de la mortalidad infantil por todas las causas para los niños menores de 5 años.
En 1977, el Dr. Robert Austrian desarrolló una vacuna de polisacáridos neumocócicos 14-valente con el fin de prevenir la enfermedad neumocócica y luego la vacuna evolucionó a una vacuna de polisacáridos 23-valente. Las vacunas de polisacáridos neumocócicos multivalentes han demostrado ser valiosas en la prevención de la enfermedad neumocócica en adultos ancianos y pacientes de alto riesgo. Sin embargo, los lactantes y los niños pequeños responden mal a la mayoría de los polisacáridos neumocócicos debido a una respuesta inmunitaria independiente de células T. La vacuna de conjugados neumocócicos 7-valente (7VPNC, Prevnar®) contiene polisacáridos capsulares de los siete serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F más prevalentes. Desde su aprobación en los EE.UU. en 2000, se ha demostrado que Prevnar es altamente inmunogénica y eficaz contra la enfermedad invasiva y otitis media en lactantes y niños pequeños. Esta vacuna está aprobada ahora en aproximadamente 80 países de todo el mundo. Prevnar cubre aproximadamente el 80-90 %, el 60-80 % y el 40-80 % de la enfermedad neumocócica invasiva (IPD) en los EE.UU., Europa y otras regiones del mundo, respectivamente. Tal como se esperaba, los datos de vigilancia recopilados en los años posteriores a la introducción de Prevnar han demostrado claramente una reducción de la enfermedad neumocócica invasiva provocada por los serotipos cubiertos por Prevnar en los EE. UU. Sin embargo, la cobertura de los serotipos estaba limitada en algunas regiones y las enfermedades neumocócicas invasivas provocadas por los serotipos que no están cubiertos por Prevnar, en particular 19A, han aumentado.
El Comité asesor de prácticas de inmunización (ACIP) anunció en febrero de 2010 su recomendación de una vacuna de conjugados neumocócicos 13-valente (PCV-13) recién aprobada para la vacunación. PCV-13 es una vacuna de conjugados neumocócicos que comprende seis serotipos adicionales (1, 3, 5, 6A, 7F, 19A) además de los siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) comprendidos en Prevnar. Según la vigilancia del núcleo bacteriano activo (ABC) de los EE. UU., un total del 64 % de los casos de IPD conocidos como serotipos patógenos entre niños de 5 años o menos está cubierto por PCV-13. En 2007, solo 70 casos de los 4600 casos de IPD en niños de 5 años de edad o menos estaban cubiertos por PCV7, mientras que 2900 casos estaban cubiertos por PCV-13, lo que representa la mayoría. Ahora, está en desarrollo una vacuna de conjugados neumocócicos 15-valente que cubre serotipos adicionales cuya incidencia aumenta con el reemplazo de serotipos.
También las publicaciones de patente tales como US 2007/184072 A1, US 2009/010959 A1, WO 2007/071707 A2, US 2007/231340 A1, US 2006/228380 A1 y WO 2007/116028 A2 describen composiciones inmunogénicas que contienen diferentes tipos de polisacáridos neumocócicos. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de composiciones de vacuna eficaces con propiedades inmunogénicas mejoradas.
Descripción detallada de la invención
Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición inmunogénica multivalente para la prevención de la enfermedad neumocócica en lactantes, niños y adultos, que comprende polisacáridos de la cápsula derivados de 13 serotipos neumocócicos incluyendo el serotipo 2 o 9N. Específicamente, la presente invención proporciona una composición de conjugados neumocócicos 13-valente (PCV-13) que comprende el serotipo 2 o 9N, y los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F.
Solución técnica
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición inmunogénica multivalente, que comprende 13 conjugados de polisacárido-proteína distintivos junto con un vehículo fisiológicamente aceptable, en el que cada uno de los conjugados comprende un polisacárido capsular derivado de un serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado con una proteína portadora, y los polisacáridos capsulares se preparan a partir de 12 serotipos seleccionados del grupo que consiste en 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F, y el serotipo 2 o 9A.
En la composición inmunogénica multivalente según la presente invención, la proteína portadora es CRM197. La composición inmunogénica multivalente según la presente invención puede comprender además un adyuvante, por ejemplo, un adyuvante que comprende un adyuvante a base de aluminio. El adyuvante puede seleccionarse del grupo que consiste en fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidróxido de aluminio, y preferiblemente, fosfato de aluminio.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmunitaria frente a un conjugado de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de dicha composición inmunogénica.
En una realización, la composición farmacéutica puede ser una composición inmunogénica formulada para contener: 2 |ig de polisacárido de cada serotipo, excepto por 6B a 4 |ig; aproximadamente 34 |ig de proteína portadora CRM197; 0,125 mg de adyuvante de aluminio elemental (0,5 mg de fosfato de aluminio); y tampón cloruro de sodio y succinato de sodio como excipientes.
Efecto técnico
La composición multivalente-inmunogénica según la presente invención comprende polisacáridos capsulares derivados de 13 serotipos neumocócicos distintivos incluyendo el serotipo 2 o 9N, conduciendo de ese modo a un elevado título de IgG en suero y actividad de anticuerpos funcionales. Por tanto, la composición inmunogénica multivalente según la presente invención puede usarse ventajosamente para la prevención de la enfermedad neumocócica en lactantes, niños y adultos.
Modo de la invención
Se ha realizado el reemplazo de serotipos por algunos serotipos con resistencia a antibióticos y resistencia a múltiples fármacos. Además, las diferencias regionales en la distribución de serotipos han conducido a diferencias en la cobertura de Prevnar por región (Harboe ZB, Benfield TL, Valentiner-Branth P, et al. Temporal Trends in Invasive Pneumococcal Disease and Pneumococcal Serotypes over 7 Decades. Clin Infect Dis 2010; 50:329-37). Por tanto, no hay motivo para eliminar ninguno de los serotipos en las vacunas de conjugados neumocócicos existentes. Más bien, existe la necesidad de expandir adicionalmente la cobertura mediante la adición de serotipos.
En 2008, el Pneumococcal Global Serotype Project (GSP) anunció un informe basándose en datos de IPD recogidos entre 1980 y 2007, que muestra que, tras el serotipo 18C, el serotipo 2 era el undécimo serotipo de mayor incidencia entre los 20 primeros serotipos globales. Además, Samir K. Saha et al. notificaron que el serotipo 2 puede convertirse en una amenaza porque el serotipo 2 tiene una alta probabilidad de provocar meningitis neumocócica en Bangladesh, pero no está incluido en ninguna vacuna de conjugados neumocócicos (Saha SK, AI Emran HM, Hossain B, Darmstadt GL, Saha S, et al. (2012) Streptococcus pneumoniae Serotype-2 Childhood Meningitis in Bangladesh: A Newly Recognized Pneumococcal Infection Threat. PLoS ONE 2012; 7(3): e32134). Por tanto, si se incluye el serotipo 2 en las vacunas de conjugados neumocócicos, el número de enfermedades neumocócicas puede reducirse y además prepararse para el reemplazo de serotipos que puede producirse con la vacunación por PCV-13.
Los serotipos neumocócicos muestran diferentes patrones de distribución por edad de un sujeto. En particular, se ha encontrado que el serotipo 9N es relativamente importante en lactantes de 0 a 23 meses, que se someten a vacunación con una vacuna de conjugados neumocócicos, en comparación con niños de 24 a 59 meses de edad. El serotipo 9N fue el decimocuarto serotipo más común después de los 13 serotipos incluidos en PCV-13. Esto indica que la inclusión del serotipo 9N contribuirá a reducir la incidencia de enfermedades neumocócicas, en particular entre los lactantes.
La presente invención proporciona una composición inmunogénica multivalente que comprende 13 polisacáridos capsulares incluidos en Prevenar 13, uno de los cuales se reemplaza por el serotipo 2 o 9N. Específicamente, la presente invención proporciona una composición inmunogénica multivalente, que comprende: 13 conjugados distintos de polisacárido-proteína, junto con un vehículo fisiológicamente aceptable, en el que cada uno de los conjugados comprende un polisacárido capsular de un serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado con una proteína portadora CRM197, y los polisacáridos capsulares se preparan a partir de 12 serotipos seleccionados del grupo que consiste en los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19f y 23F, y el serotipo 2 o 9N.
Los polisacáridos capsulares pueden prepararse mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos habituales en la técnica. Los polisacáridos capsulares pueden reducirse en tamaño con el fin de disminuir la viscosidad o aumentar la solubilidad de los polisacáridos capsulares activados. En la presente invención, los polisacáridos capsulares se preparan a partir de 12 serotipos seleccionados del grupo que consisten en los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de Streptococcus pneumoniae, y el serotipo 2 o 9N de Streptococcus pneumoniae. Estos conjugados neumocócicos se preparan por procesos separados y se formulan para dar una sola formulación de dosificación. Por ejemplo, se hace crecer Streptococcus pneumoniae de cada serotipo en un medio a base de soja y luego cada serotipo de polisacárido neumocócico se purifica mediante centrifugación, precipitación y ultrafiltración.
Las proteínas portadoras son preferiblemente proteínas que no son tóxicas y no son reactogénicas y pueden obtenerse en cantidad y pureza suficientes. Las proteínas portadoras deben ser susceptibles de procedimientos de conjugación convencionales. En la composición inmunogénica multivalente de la presente invención, la proteína portadora es CRM 197. CRM197 es una variante no tóxica (es decir, toxoide) de la toxina diftérica aislada de cultivos de Corynebacterium diphteria cepa C7 (P197) hecha crecer sobre un medio a base de casaminoácidos y extracto de levadura. CRM197 se purifica a través de ultrafiltración, precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio iónico. Alternativamente, CRM197 se prepara de manera recombinante según la patente estadounidense n.° 5.614.382.
Con el fin de preparar polisacáridos para la reacción con una proteína portadora, los polisacáridos purificados se activan químicamente. Una vez activado, cada polisacárido capsular se conjuga por separado con una proteína portadora para formar un glicoconjugado. En una realización, cada polisacárido capsular se conjuga con la misma proteína portadora. La activación química de los polisacáridos y la conjugación posterior con la proteína portadora se logran por medios convencionales (por ejemplo, patentes estadounidenses n.os 4.673.574 y 4.902.506). Los grupos hidroxilo en los polisacáridos se oxidan a grupos aldehído mediante agentes oxidantes tales como peryodatos (incluyendo peryodato de sodio, peryodato de potasio, peryodato de calcio o ácido peryódico). La activación química conduce a degradación oxidativa irregular de grupos hidroxilo adyacentes. La conjugación se logra por aminación reductora. Por ejemplo, los polisacáridos capsulares activados y la proteína portadora se hacen reaccionar en presencia de un agente reductor tal como cianoborohidruro de sodio. Los grupos aldehído que no han reaccionado pueden eliminarse mediante la adición de un agente oxidante fuerte.
Después de la conjugación del polisacárido capsular con la proteína portadora, los conjugados de polisacáridoproteína pueden purificarse (enriquecerse con respecto al conjugado de polisacárido-proteína) mediante una variedad de técnicas. Estas técnicas incluyen concentración/diafiltración, cromatografía en columna y filtración en profundidad. Los conjugados de polisacárido-proteína purificados se mezclan para formular la composición inmunogénica de la presente invención, que puede usarse como vacuna. La formulación de la composición inmunogénica de la presente invención puede conseguirse usando métodos reconocidos en la técnica correspondiente. Por ejemplo, los 13 conjugados neumocócicos individuales pueden formularse con un vehículo fisiológicamente aceptable para preparar la composición. Los ejemplos de tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y disoluciones de dextrosa.
En una realización, la composición inmunogénica de la presente invención puede comprender uno o más adyuvantes. Tal como se define en el presente documento, un “adyuvante” se refiere a una sustancia que sirve para potenciar la inmunogenicidad de una composición inmunogénica de la presente invención. Por tanto, a menudo se proporcionan adyuvantes para aumentar la respuesta inmunitaria y los conocen bien los expertos habituales en la técnica. Los adyuvantes adecuados para potenciar la eficacia de la composición incluyen, pero no se limitan a:
(1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.
(2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos como péptidos de muramilo (tal como se definen a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como, (a) MF59 (documento WO 90/14837), que contiene el 5 % de escualeno, el 0,5 % de Tween 80 y el 0,5 % de Span 85 (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE (véase a continuación, aunque no se requiere), formulados para dar partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene el 10 % de escualeno, el 0,4 % de Tween 80, el 5 % de polímero plurónico bloqueado L121 y thr-MDp (véase a continuación), o bien microfluidizado para dar una emulsión submicrométrica o bien agitado con vórtex para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande, y (c) sistema de adyuvantes Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) que contiene el 2 % de escualeno, el 0,2 % de Tween 80 y uno o más componentes de la pared celular bacteriana seleccionados del grupo que consiste en monofosforil lípido A 3-O-desailado A (MPL™) descrito en la patente estadounidense n.° 4.912.094 (Corixa), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS), preferiblemente MPL CWS (Detox™);
(3) adyuvantes de saponina, tales como Quil A o STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (patente estadounidense n.° 5.057.540) o partículas generadas a partir de los mismos, tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes);
(4) lipopolisacáridos bacterianos, homólogos sintéticos de lípido A, tales como compuestos de fosfato de aminoalquilglucosamina (AGP), o derivados u homólogos de los mismos, que están disponibles de Corixa, y que se describen en la patente estadounidense n.° 6.113.918; uno de tales AGP es 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil-2-desoxi-4-0-fosfono-3-0-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranósido 529 (anteriormente conocido como RC529), que está formulado como una forma acuosa o como una emulsión estable,
(5) polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen motivos de CpG (patente estadounidense n.° 6.207.646);
(6) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), moléculas coestimuladoras B7-1 y B7-2, etc.;
(7) mutantes detoxificados de una toxina bacteriana ADP-ribosilante, tal como una toxina del cólera (TC), o bien en una forma silvestre o mutante, por ejemplo, en donde el ácido glutámico en la posición de aminoácido 29 se reemplaza por otro aminoácido, preferiblemente una histidina, según el documento WO 00/18434 (véanse también los documentos WO 02/098368 y WO 02/098369), una toxina pertussis (PT), o una toxina termolábil de E. coli (LT), en particular LT-K63, LT-R72, CTS109, PT-K9/G129 (véanse, por ejemplo, los documentos WO 93/13302 y WO 92/19265); y
(8) componentes del complemento tales como el trímero del componente del complemento C3d.
Los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) y N-acetil-normuramil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE).
En una realización específica, se usa una sal de aluminio como adyuvante. Un adyuvante de sal de aluminio puede ser una vacuna precipitada por alumbre o una vacuna adsorbida por alumbre. Las sales de aluminio incluyen, pero no se limitan a, alúmina hidratada, trihidrato de alúmina (ATH), hidrato de aluminio, trihidrato de aluminio, Alhydrogel, Superfos, Amphojel, hidróxido de aluminio (III), sulfato de hidroxifosfato de aluminio (adyuvante de fosfato de aluminio (APA)) y alúmina amorfa. APA es una suspensión de hidroxifosfato de aluminio. Si se mezclan cloruro de aluminio y fosfato de sodio en una razón de 1:1, se precipita sulfato de hidroxifosfato de aluminio. Los precipitados se dimensionan a 2-8 |im usando una mezcladora de alta cizalladura y se dializan con solución salina fisiológica, seguido por esterilización. En una realización, se usa Al(OH)3 disponible comercialmente (por ejemplo, Alhydrogel o Superfos) para adsorber proteínas. Pueden adsorberse 50-200 g de proteína por 1 mg de hidróxido de aluminio, y esta razón depende del punto isoeléctrico (pi) de las proteínas y el pH de los disolventes. Las proteínas de bajo pi se adsorben fuertemente en comparación con las proteínas de alto pi. Las sales de aluminio forman un depósito de antígenos que libera lentamente antígenos a lo largo de 2 a 3 semanas, activando de manera no específica fagocitos, complementos y el sistema inmunitario congénito.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica (por ejemplo, una formulación de vacuna) para inducir una respuesta inmunitaria frente a conjugados de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición inmunogénica.
La formulación de vacuna de la presente invención puede usarse para proteger o tratar a un ser humano susceptible a la infección neumocócica, mediante la administración de la vacuna por medio de una vía sistémica o mucosa. Tal como se define en el presente documento, el término “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad requerida para inducir anticuerpos a un nivel suficiente para reducir significativamente la probabilidad de infección por Streptococcus pneumoniae o la gravedad de la misma. Estas administraciones pueden incluir inyección por medio de las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o administración mucosa a los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario.
En una realización, se usa administración intranasal para el tratamiento de neumonía u otitis media dado que el transporte nasofaríngeo de neumococos puede prevenirse más eficazmente, atenuando así la infección en su fase inicial. La cantidad de conjugados en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos adversos significativos. Una cantidad de este tipo puede variar dependiendo del serotipo neumocócico. En general, cada dosis comprenderá de 0,1 a 100 |ig de polisacárido, particularmente de 0,1 a 10 |ig y más particularmente de 1 a 5 |ig. Las cantidades óptimas de componentes para una vacuna en particular pueden determinarse mediante estudios convencionales que implican la observación de respuestas inmunitarias adecuadas en los sujetos. Por ejemplo, la cantidad de vacunación de un sujeto humano puede determinarse extrapolando el resultado de la prueba en animales. Además, la dosificación puede determinarse empíricamente.
En una realización particular de la presente invención, la composición de vacuna es una formulación líquida estéril de polisacáridos capsulares neumocócicos de 12 serotipos seleccionados del grupo que consiste en los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F, y el serotipo 2 o 9N, individualmente conjugados con CRM197. Cada dosis de 0,5 ml puede formularse para contener: 2 |ig de polisacárido de cada serotipo, excepto por 6B a 4 |ig; aproximadamente 34 |ig de proteína portadora CRM197; 0,125 mg de adyuvante de aluminio elemental (0,5 mg de fosfato de aluminio); y tampón cloruro de sodio y succinato de sodio como excipientes. El líquido puede cargarse en una jeringa de una sola dosis sin ningún conservante. Tras agitar, el líquido se convierte en una vacuna de una suspensión homogénea, blanca lista para administración intramuscular.
En una realización adicional, la composición de la presente invención puede administrarse en una sola administración.
Por ejemplo, la composición de vacuna de la presente invención puede administrarse 2, 3, 4 o más veces a intervalos adecuadamente espaciados, tales como un intervalo de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses o una combinación de los mismos. El calendario de inmunización puede seguir el designado para la vacuna Prevnar. Por ejemplo, el calendario de rutina para lactantes y lactantes mayores contra la enfermedad invasiva provocada por S. neumoniae es a los 2, 4, 6 y 12­ 15 meses de edad. Por tanto, en este aspecto, la composición se administra 4 veces, es decir, a los 2, 4, 6 y 12-15 meses de edad.
Las composiciones de la presente invención también pueden incluir una o más proteínas de Streptococcus pneumoniae. Los ejemplos de proteínas Streptococcus pneumoniae adecuadas para su inclusión en la composición incluyen las identificadas en la solicitud de patente internacional WO02/083855, así como las descritas en la solicitud de patente internacional WO02/053761.
La composición de la presente invención puede administrarse a un sujeto por medio de una o más vías de administración conocidas por un experto habitual en la técnica tales como una vía parenteral, transdérmica, transmucosa, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intracutánea, intravenosa o subcutánea y puede formularse en consecuencia. En una realización, la composición de la presente invención puede administrarse como una formulación líquida mediante inyección intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, intravenosa, intraarterial o transdérmica o inyección en la mucosa respiratoria. La formulación líquida para inyección puede incluir una disolución o similar.
La composición de la presente invención puede formularse en forma de un vial de dosis unitaria, vial de múltiples dosis o jeringa precargada. Un portador farmacéuticamente aceptable para una formulación líquida incluye disolvente acuoso o no acuoso, suspensión, emulsión o aceite. Los ejemplos de un disolvente no acuoso incluyen propilenglicol, polietilenglicol y oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, disolvente de alcohol/acuoso, emulsión o suspensión, solución salina fisiológica y solución tampón. Los ejemplos de aceite incluyen aceite vegetal o animal, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de hígado, aceite sintético tal como aceite marino y lípidos obtenidos de la leche o los huevos. La composición farmacéutica puede ser isotónica, hipertónica o hipotónica. Sin embargo, es preferible que la composición farmacéutica para perfusión o inyección sea básicamente isotónica. Por tanto, la isotonicidad o hipertonicidad puede ser ventajosa para el almacenamiento de la composición. Cuando la composición farmacéutica es hipertónica, la composición puede diluirse hasta la isotonicidad antes de la administración. Un agente de tonicidad puede ser un agente de tonicidad iónico tal como sal o un agente de tonicidad no iónico tal como hidrato de carbono. El agente de tonicidad iónico incluye cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de potasio y cloruro de magnesio, pero no se limita a los mismos. El agente de tonicidad no iónico incluye sorbitol y glicerol, pero no se limita a los mismos. Preferiblemente, se incluye al menos un tampón farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, cuando la composición farmacéutica es una infusión o inyección, es preferible que se formule en un tampón con una capacidad de tamponamiento a pH de 4 a 10, tal como pH 5-9 o 6-8. El tampón puede seleccionarse del grupo que consiste en TRIS, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartrato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, histidina, glicina, succinato y solución tampón de trietanolamina.
En particular, si la composición farmacéutica es para administración parenteral, puede seleccionarse un tampón entre los aceptables para la Farmacopea de los Estados Unidos (USP). Por ejemplo, el tampón puede seleccionarse del grupo que consiste en ácido monobásico, tal como ácido acético, ácido benzoico, ácido glucónico, ácido glicérico y ácido láctico; ácido dibásico tal como ácido aconítico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido carbónico, ácido glutámico, ácido málico, ácido succínico y ácido tartárico; ácido polibásico, tal como ácido cítrico y ácido fosfórico; y base tal como amoníaco, dietanolamina, glicina, trietanolamina y TRIS. Para administración parenteral, los vehículos (para inyección subcutánea, intravenosa, intraarticular e intramuscular) incluyen disolución de cloruro de sodio, disolución de dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, disolución de Ringer con lactato y aceites fijos. Los vehículos para administración intravenosa incluyen disolución de dextrosa de Ringer o una disolución de infusión similar a base de dextrosa, suplementos nutricionales y suplementos electrolíticos. El ejemplo incluye un líquido estéril tal como agua y aceite, con o sin un agente tensioactivo y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Generalmente, agua, solución salina fisiológica, disolución de dextrosa, disolución de azúcar relacionada y glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol, en particular polisorbato 80, son adecuados para una inyección. Los ejemplos de aceite incluyen aceite animal y vegetal, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de hígado, aceite sintético tal como aceite marino y lípidos de la leche o los huevos.
La formulación de la presente invención puede comprender agentes tensioactivos. Preferiblemente, éster de polioxietilensorbitano (generalmente denominados Tweens), en particular, polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros (tales como DOWFAX™) de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), óxido de butileno (BO); octoxinoles con un número diferente de repeticiones del grupo etoxi(oxi-1,2-etanodiilo), en particular, octoxinol-9 (Triton-100); etilfenoxipolietiletoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípido tal como lecitina; etoxilato de nonilfenol tal como la serie Tergitol™ NP; éter graso de polioxietileno derivado de alcohol laurílico, cetílico, estearílico, oleílico (tensioactivo Brij), en particular, monolauril éter de trietilenglicol (Brij 30); éter de sorbitano conocido como SPAN, en particular trioleato de sorbitano (span 85) y monolaurato de sorbitano, pero sin limitación a los mismos. Preferiblemente, Tween 80 está comprendido en una emulsión.
Pueden usarse mezclas de agentes tensioactivos tales como Tween 80/Span 85. También es adecuada una combinación de éster de polioxietilensorbitano tal como Tween 80 y octoxinol tal como Triton X-100. Una combinación de lauril éter 9 y Tween y/o octoxinol también es adecuada. Preferiblemente, la cantidad de éster de polioxietilensorbitano (tal como Tween 80) incluida es del 0,01 % al 1 % (p/v), en particular el 0,1 %; la cantidad de octilfenoxipolioxietanol o nonilfenoxipolioxietanol (tal como Triton X-100) incluida es del 0,001 % al 0,1 % (p/v), en particular del 0,005 % al 0,02 %; y la cantidad de éter de polioxietileno (como lauril éter 9) incluida es del 0,1 % al 20 % (p/v), posiblemente del 0,1 % al 10 %, en particular del 0,1 % al 1 % o aproximadamente el 0,5 %. En una realización, la composición farmacéutica se suministra por medio de un sistema de control de la liberación. Por ejemplo, pueden usarse infusión intravenosa, parche transdérmico, liposoma u otras vías para la administración. En un aspecto, pueden usarse macromoléculas tales como microesferas o implantes.
La divulgación anterior describe en general la presente invención. Puede obtenerse una comprensión más completa mediante referencia a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1. Preparación de polisacárido capsular de S. pneumoniae
El cultivo de S. pneumoniae y la purificación de polisacáridos capsulares se realizaron tal como conoce un experto habitual en la técnica. Se obtuvieron serotipos de S. pneumoniae de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC). Se caracterizó S. pneumoniae por cápsulas e inmovilidad, Gram-positividad, diplococos en forma de lanceta y hemólisis alfa en un medio de agar sangre. Los serotipos se identificaron mediante la prueba Quelling usando antisueros específicos (patente estadounidense n.° 5.847.112).
Preparación de bancos de células
Se generaron varias generaciones de reservas de semillas con el fin de expandir la cepa y eliminar componentes de origen animal (generaciones F1, F2 y F3). Se produjeron dos generaciones adicionales de reservas de semillas. La primera generación adicional se realizó a partir de un vial F3, y la generación posterior se realizó a partir de un vial de la primera generación adicional. Los viales de semillas se almacenaron congelados (<-70°C) con glicerol sintético como crioconservante. Para la preparación de bancos de células, todos los cultivos se hicieron crecer en un medio a base de soja. Antes de la congelación, se concentraron las células por centrifugación, se retiró el medio gastado y los sedimentos celulares se resuspendieron en un medio nuevo que contenía un crioconservante (tal como glicerol sintético).
Inoculación
Se usaron cultivos del banco de células de trabajo para inocular frascos de semillas que contenían un medio a base de soja. El frasco de semillas se usó para inocular un fermentador de semillas que contenía un medio a base de soja.
Fermentación de semillas
Se realizó la fermentación de semillas en un fermentador de semillas con la temperatura y el pH controlados. Después de que se alcanzara la densidad óptica objetivo, se usó el fermentador de semillas para inocular el fermentador de producción que contenía el medio a base de soja.
Fermentación de producción
La fermentación de producción es la última etapa en la fermentación. Se controlaron la temperatura, el pH y la velocidad de agitación.
Inactivación
Cuando se detuvo el crecimiento, la fermentación se terminó mediante la adición de un inactivador. Después de la inactivación, se enfrió el contenido en el fermentador y se ajustó el pH del mismo.
Purificación
El caldo del fermentador se centrifugó y se filtró para eliminar los residuos celulares bacterianos. Se usaron varias rondas de operaciones de concentración/diafiltración, precipitación/elución y filtración en profundidad para eliminar contaminantes y purificar polisacáridos capsulares.
Ejemplo 2. Preparación de conjugado de polisacáridos capsulares de S. pneumon/ae-CRMw
Se activaron polisacáridos de diferentes serotipos siguiendo diferentes rutas y luego se conjugaron con CRM197. El proceso de activación comprende la reducción del tamaño de los polisacáridos capsulares hasta los pesos moleculares objetivo, la activación química y el intercambio de tampón por medio de ultrafiltración. Se conjuga CRM197 purificada con polisacáridos capsulares activados, y los conjugados se purifican usando ultrafiltración y finalmente se filtran a través de un filtro de 0,22 |im. Los parámetros del proceso tales como pH, temperatura, concentración y tiempo son los siguientes.
(1) Activación
Etapa 1
Se diluyeron polisacáridos de cada serotipo con agua para inyección, acetato de sodio y fosfato de sodio hasta una concentración final en un intervalo de 1,0 a 2,0 mg/ml. Para el serotipo 1, se añadió hidróxido de sodio (concentración final de base 0,05 M) y la disolución se incubó a 50°C±2°C. Entonces, se enfrió la disolución hasta de 21 a 25°C y se detuvo la hidrólisis añadiendo HCI 1 M hasta alcanzar un pH objetivo de 6,0±0,1. Para el serotipo 3, se añadió HCI (concentración final de ácido 0,01 M) y se incubó la disolución a 50°C±2°C. Entonces, se enfrió la disolución hasta de 21 a 25°C y se detuvo la hidrólisis añadiendo fosfato de sodio 1 M hasta alcanzar un pH objetivo de 6,0±0,1. Para el serotipo 4, se añadió HCI (concentración final de ácido 0,1 M) y se incubó la disolución a 45°C±2°C. Entonces, se enfrió la disolución hasta de 21 a 25°C y se detuvo la hidrólisis añadiendo fosfato de sodio 1 M hasta alcanzar un pH objetivo de 6,0±0,1. Para el serotipo 6A, se añadió ácido acético glacial (concentración final de ácido 0,2 M) y se incubó la disolución a 60°C±2°C. Entonces, se enfrió la disolución hasta de 21 a 25°C y se detuvo la hidrólisis añadiendo hidróxido de sodio 1 M hasta alcanzar un pH objetivo de 6,0±0,1. Para los serotipos 14 y 18C, se añadió ácido acético glacial (concentración final de ácido 0,2 M) y se incubó la disolución a 94°C±2°C. Entonces, se enfrió la disolución hasta de 21 a 25°C y se detuvo la hidrólisis añadiendo fosfato de sodio 1 M hasta alcanzar un pH objetivo de 6,0±0,1.
Etapa 2: Reacción con peryodato
Los equivalentes molares de peryodato de sodio requeridos para la activación de sacáridos neumocócicos se determinaron usando el contenido total de sacáridos. Con mezclado concienzudo, se permitió que la reacción de oxidación procediera durante entre 16 y 20 horas a 21 - 25°C para todos los serotipos excepto 1, 7F y 19F, para los cuales la temperatura era <10°C.
Etapa 3: Ultrafiltración
El sacárido oxidado se concentró y diafiltró con agua para inyección (WFI) en un ultrafiltro de MWCO de 100 kDa (ultrafiltro de 30 kDa para el serotipo 1 y ultrafiltro de 5 kDa para el serotipo 18C). Se logró la diafiltración usando cloruro de sodio al 0,9 % para el serotipo 1, tampón acetato de sodio 0,01 M (pH 4,5) para el serotipo 7F y tampón fosfato de sodio 0,01 M (pH 6,0) para el serotipo 19F. Se desechó el permeado y se filtró el material retenido a través de un filtro de 0,22 |im.
Etapa 4: Liofilización
Para los serotipos 3, 4, 5, 9N, 9V y 14, los sacáridos concentrados se mezclaron con proteínas portadoras CRM197, se cargaron en frascos de cristal, se liofilizaron y luego se almacenaron a -25° ± 5°C.
Para los serotipos 2, 6A, 6B, 7F, 19A, 19F y 23F, se añadió una cantidad especificada de sacarosa que se calculó para lograr una concentración de sacarosa del 5 % ± 3 % en la mezcla de reacción de conjugación. Los serotipos 1 y 18C no requirieron adición de sacarosa. El sacárido concentrado se cargó entonces en frascos de cristal, se liofilizó y luego se almacenó a -25° ± 5°C.
(2) Proceso de conjugación
Se realizó conjugación acuosa para los serotipos 1, 3, 4, 5, 9N, 9V, 14 y 18C, y se realizó conjugación en DMSO para los serotipos 2, 6A, 6B, 7F, 19A, 19F y 23F.
Etapa 1: Disolución
Conjugación acuosa
Para los serotipos 3, 4, 5, 9N, 9V y 14, la mezcla de sacárido-CRMw activada liofilizada se descongeló y equilibró a temperatura ambiente. El sacárido-CRMw activado liofilizado se reconstituyó entonces en un tampón fosfato de sodio 0,1 M en una razón típica para cada serotipo. Para los serotipos 1 y 18C, el sacárido liofilizado se reconstituyó en una disolución de CRM197 en fosfato de sodio dibásico 1 M a una razón típica de 0,11 l de fosfato de sodio por 1 l de disolución de CRM197.
Conjugación en dimetilsulfóxido (DMSO)
Los sacáridos activados liofilizados de los serotipos 2, 6A, 6B, 7F, 19A, 19F, 23F y la proteína portadora liofilizada CRM197 se equilibraron a temperatura ambiente y se reconstituyeron en DMSO.
Etapa 2: Reacción de conjugación
Conjugación acuosa
Para los serotipos 1, 3, 4, 5, 9N, 9V, 14 y 18C, la reacción de conjugación se inició añadiendo disolución de cianoborohidruro de sodio (100 mg/ml) para lograr 1,0 -1,2 moles de cianoborohidruro de sodio por mol de sacárido. La mezcla de reacción se incubó durante 44 - 96 horas a de 23°C a 37°C. La temperatura y el tiempo de reacción se ajustaron por serotipo. La temperatura se redujo entonces hasta a 23° ± 2°C y se añadió cloruro de sodio al 0,9 % al reactor. Se añadió disolución de borohidruro de sodio (100 mg/ml) para lograr 1,8 - 2,2 equivalentes molares de borohidruro de sodio por mol de sacárido. La mezcla se incubó durante 3 - 6 horas a 23° ± 2°C. Este procedimiento condujo a la reducción de cualquier aldehido sin reaccionar presente en los sacáridos. Se diluyó la mezcla con cloruro de sodio al 0,9 % y se filtró la mezcla de conjugación diluida usando un prefiltro de 1,2 |im en un recipiente de retención.
Conjugación en DMSO
Para los serotipos 2, 6A, 6B, 7F, 19A, 19F y 23F, el sacárido activado y la proteína portadora CRM197 se mezclaron en una razón en un intervalo de 0,8 g -1,25 g de sacárido/g de CRM197. La reacción de conjugación se inició añadiendo la disolución de cianoborohidruro de sodio (100 mg/ml) en una razón de 0,8 - 1,2 equivalentes molares de cianoborohidruro de sodio con respecto a un mol de sacárido activado. Se añadió WFI a la mezcla de reacción hasta un objetivo del 1 % (v/v), y la mezcla se incubó durante 11 - 27 horas a 23° ± 2°C. Se añadieron disolución de borohidruro de sodio, 100 mg/ml (1,8 - 2,2 equivalentes molares típicos de borohidruro de sodio por mol de sacárido activado) y WFI (objetivo el 5 % v/v) a la reacción y se incubó la mezcla durante 3 - 6 horas a 23° ± 2°C. Este procedimiento condujo a la reducción de cualquier aldehido sin reaccionar presente en los sacáridos. Luego, la mezcla de reacción se diluyó con cloruro de sodio al 0,9 %, y la mezcla de conjugación diluida se filtró usando un prefiltro de 1,2 |im en un recipiente de retención.
Etapa 3: Ultrafiltración
La mezcla de conjugados diluida se concentró y diafiltró en un filtro de ultrafiltración de MWCO de 100 kDa con un mínimo de 20 volúmenes de tampón o cloruro de sodio al 0,9 %. Se desechó el permeado.
Etapa 4: Filtración estéril
El material retenido después de la diafiltración con MWCO de 100 kDa se filtró a través de un filtro de 0,22 |im. Se realizaron controles en proceso (contenido de sacáridos, proteína libre, sacárido libre y cianuro residual; y en el caso de la conjugación en DMSO, se verifica adicionalmente el DMSO residual) sobre el producto filtrado. Los controles en proceso del material retenido filtrado se realizaron para determinar si se necesitaban concentración, diafiltración y/o dilución adicionales. Según fuera necesario, se diluyó el conjugado filtrado con cloruro de sodio al 0,9 % para lograr una concentración final de menos de 0,55 g/l. Se realizaron pruebas de liberación para el contenido de sacáridos, contenido de proteína y razón de sacárido:proteína en esta etapa. Finalmente, se filtró el conjugado (0,22 |im) y se realizó una prueba de liberación (aspecto, proteína libre, sacárido libre, endotoxina, determinación del tamaño molecular, cianuro residual, DMSO residual, identidad de sacáridos e identidad de CRM197). La disolución concentrada a granel final se almacenó a 2-8°C.
Ejemplo 3. Formulación de una vacuna de conjugados neumocócicos multivalente
Los volúmenes requerido de los concentrados finales a granel se calcularon basándose en el volumen del lote y las concentraciones de sacáridos a granel. Después de añadir las cantidades requeridas del cloruro de sodio al 0,85 % (solución salina fisiológica), polisorbato 80 y tampón succinato al recipiente de formulación preetiquetado, se añadieron concentrados a granel. La preparación se mezcló entonces concienzudamente y se esterilizó por filtración a través de una membrana de 0,22 |im. El volumen formulado se mezcló suavemente durante y después de la adición de fosfato de aluminio a granel. Se comprobó el pH y se ajustó en caso necesario. El producto a granel formulado se almacenó a 2-8°C. El producto contenía, en un volumen de 0,5 ml, 2 |ig de polisacárido de cada serotipo, excepto por 6B a 4 |ig; aproximadamente 32 |ig de proteína portadora CRM197; 0,125 mg de adyuvante de aluminio elemental (0,5 mg de fosfato de aluminio); aproximadamente 4,25 mg de cloruro de sodio; aproximadamente 295 |ig de tampón succinato de sodio; y aproximadamente 100 |ig de polisorbato 80.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Composición inmunogénica multivalente, que comprende: 13 conjugados distintos de polisacárido-proteína, junto con un vehículo fisiológicamente aceptable, en la que cada uno de los conjugados de polisacáridoproteína comprende un polisacárido capsular de un serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado con la proteína portadora CRM197, y los polisacáridos capsulares se preparan a partir de 12 serotipos seleccionados del grupo que consiste en 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F, y el serotipo 2 o 9N.
2. Composición inmunogénica multivalente según la reivindicación 1, que comprende además un adyuvante.
3. Composición inmunogénica multivalente según la reivindicación 2, en la que el adyuvante es un adyuvante a base de aluminio.
4. Composición inmunogénica multivalente según la reivindicación 3, en la que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidróxido de aluminio.
5. Composición inmunogénica multivalente según la reivindicación 4, en la que el adyuvante es fosfato de aluminio.
6. Composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición inmunogénica multivalente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en un método de protección o tratamiento de un humano susceptible a la infección neumocócica induciendo una respuesta inmunitaria frente a conjugados de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae.
7. Composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 6, en la que la composición inmunogénica multivalente es una dosis individual de 0,5 ml formulada para contener:
2 |ig de polisacárido de cada serotipo, excepto por 6B a 4 |ig;
aproximadamente 34 |ig de la proteína portadora CRM197;
0,125 mg de adyuvante de aluminio elemental (0,5 mg de fosfato de aluminio); y
tampón cloruro de sodio y succinato de sodio como excipientes.
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