MXPA00012384A - Composiciones de adyuvante y vacuna que contienen lipido a de monofosforilo - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones de adyuvante y vacuna de lípido A monofosforilo, azúcar y de manera opcional un surfactante basado en amina, el cual cuando se congela y derrite o liofiliza y reconstituye reforma una suspensión coloidal que tiene una transmisión de luz de más de o igual a 88%como, se mide espectrofotométricamente.

Description

COMPOSICIONES DE ADYUVANTE Y VACUNA QUE CONTIENEN LIPIDO A DE MONOFOSFORILO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. Campo de la invención.

Esta invención se relaciona a composiciones de adyuvante y vacuna, métodos para la preparación de dichas composiciones de adyuvante y vacuna mejoradas, y métodos de uso de las composiciones mejoradas. 2. Descripción del Estado de la Técnica Previo Las vacunas convencionales se han usado durante varios años para proteger humanos y animales de una amplia variedad de enfermedades infecciosas. De manera tipica, estas vacunas convencionales contienen uno o más antigenos que pueden incluir un patógeno adecuado, patógeno muerto, o un componente inmunogénico de un patógeno. En algunas vacunas, el antigeno o antigenos se pueden emplear solos para producir respuestas inmunes protectoras. En otras vacunas, el antigeno o antigenos se pueden emplear junto con uno o más adyuvantes para mejorar la inmunogenicidad de un antigeno. Un adyuvante tal conocido en el estado de la técnica es lipido A monofosforilo, que se deriva del lipopolisacárido de Salmonella minnesota R595. También se conoce en el estado Ref. 125234 de la técnica que el lipido A monofosforilo es un material lipidico que se agrega de por si mismo manera espontánea en un ambiente acuoso. Más aún, se conoce que el grado de agregación tiene un efecto en la actividad del lipido A monofosforilo como un inmunoestimulante en que el lipido A monofosforilo es menos estimulante.

El lipido A monofosforilo típicamente se obtiene como la sal trietilamina en la forma de un polvo blanco liofilizado. Siendo muy hidrofóbico, el lipido A monofosforilo no forma fácilmente una solución clara cuando se reconstituye con agua sino en cambio produce una mezcla turbia con partículas blancas visibles de tamaño heterogéneo que se arreglan y además se agregan en vertical. Para hacer una preparación acuosa aceptable de lipido A monofosforilo se conoce el suspender la sal de trietilamina lipido A monofosforilo liofilizado en 1 a 2 mg/mL (p/v) en agua que contiene 0.2% de trietilamina, para calentar la suspensión a 65-70°C, y después para sonificar la mezcla, la preparación acuosa resultante, ligeramente opalescente o clara, es una suspensión coloidal acuosa. La trietilamina ayuda en la solubilización del lipido A monofosforilo y se puede-sustituir con cantidades similares de trietanolamina.

Aún cuando las preparaciones acuosas de lipido A monofosforilo como se describen antes se congelan y después se deshielan, sin embargo, los agregados de lipido A monofosforilo resultan en una mezcla turbia completamente similar en apariencia a la mezcla turbia del lipido A monofosforilo previo a la sonificación. De manera similar, cuando una preparación acuosa de lipido A monofosforilo como se describe antes se liofiliza y después se re-hidrata, el resultado es también una mezcla turbia de lipido A monofosforilo agregado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona al estado de la técnica una composición liofilizada que contiene lipido A de monofosforilo, cuya composición exhibe una característica de reconstitución mejorada y que evita los problemas de arreglo y agregación del estado de la técnica previo. En particular, la presente invención proporciona una composición liofilizada que comprende lipido A monofosforilo, azúcar y, de manera opcional, un surfactante basado en amina adicionada, y es capaz de ser reconstituida o re-hidratada con un diluyente acuoso para formar, sin sonificación adicional una suspensión coloidal acuosa de lipido A monofosforilo que tiene una transmisión de luz de al menos 88%, como se mide espectrofotométricamente . La composición liofilizada. de conformidad a la presente invención comprende arriba de alrededor de 5% en peso de lipido A monofosforilo, más de alrededor de 70% en peso de azúcar y de alrededor de 0% a alrededor de 30% en peso opcionalmente de surfactante basado en amina adicionada, dicho % en peso basado en el total de los pesos de lipido A monofosforilo, azúcar y, si se presenta, surfactante basado en amina. Preferentemente, la composición liofilizada de conformidad a la presente invención comprende arriba de alrededor de 5% en peso de lipido A monofosforilo, de alrededor de 70 a alrededor de 99.99% en peso de azúcar y de alrededor de 0 a alrededor de 28% en peso de surfactante basado en amina adicionada de manera opcional. Más preferentemente, la composición liofilizada de conformidad a la presente invención comprende arriba de alrededor de 4% en peso de lipido A monofosforilo, de alrededor de 75 a alrededor de 99.99% en peso de azúcar y de alrededor de 0 a alrededor de 22% en peso de surfactante basado en amina adicionada de manera opcional. La solución liofilizada puede además comprender una cantidad efectiva inmunológicamente de un antigeno o antigenos. La composición liofilizada de la presente invención se puede reconstituir o re-hidratar con un diluyente acuoso a concentraciones por arriba de alrededor de 210 mg de composición liofilizada por ml de diluyente acuoso, preferentemente de alrededor de 10 mg de composición liofilizada por ml de diluyente acuoso a alrededor de 210 mg de composición liofilizada por ml de diluyente acuoso, para formar, sin sonificación adicional, una suspensión coloidal acuosa.

Otro aspecto de la presente invención es un método de preparación de una suspensión coloidal acuosa de lipido a monofosforilo en la cual la suspensión coloidal acuosa se congela para almacenamiento y después se derrite para uso sin los problemas de arreglo y agregación conocidos en el estado de la técnica. Por medio de este método, el lipido A monofosforilo se mezcla en un diluyente acuoso y opcionalmente con un surfactante basado en amina y también de manera opcional un antigeno u antigenos. Una suspensión coloidal acuosa se forma por sonificación, opcionalmente con calentamiento u otros métodos conocidos, como se describe en gran detalle aqui posteriormente. El azúcar, en una cantidad de alrededor de 10 mg/ml a alrededor de 200 mg/ml, se adiciona a la mezcla tanto antes como después de la formación de una suspensión coloidal acuosa. El azúcar se puede encontrar en la forma de un sólido o en la forma de una solución acuosa. La suspensión coloidal acuosa resultante se puede congelar. El derretimiento de la suspensión coloidal acuosa congelada proporciona sin sonificación adicional una suspensión coloidal acuosa una suspensión coloidal acuosa que contiene lipido A monofosforilo que tiene una transmisión de luz de más de o igual a 88% como se mide espectrofotométricamente. Un antigeno u antigenos, como se define aqui después, se puede adiciona a la suspensión coloidal acuosa derretida para formar una composición de vacuna la cual se puede administrar a un vertebrado. De manera alternativa, si la suspensión coloidal acuosa contiene un antigeno antes del congelación, la composición de vacuna se puede derretir y administrar a un vertebrado.

Las suspensiones coloidales acuosas de la presente invención son un tipo especial de suspensión liquida en la cual las partículas de lipido A monofosforilo suspendido se presentan divididos muy finamente pero no en forma disuelta. La suspensión coloidal acuosa que contiene lipido A monofosforilo, azúcar y, de manera opcional un surfactante basado en amina de conformidad con la presente invención son verdaderas suspensiones no soluciones, y no tienen la propiedad, a diferencia de las suspensiones ordinarias de lipido A monofosforilo, de arreglo y agregación. La presencia de suspensiones coloidales acuosas de la presente invención se puede determinar por medio de transmisión de luz. Asi, una suspensión coloidal acuosa que contiene lipido A monofosforilo, azúcar y de manera opcional un surfactante basado en amina de conformidad a la presente invención es uno que exhibe una transmisión de luz de más de o igual a 88%, como se mide espectrofotométricamente.

La presente invención soluciona los problemas de arreglo y agregación del estado de la técnica previo por proporción de la adición de azúcar a una suspensión coloidal acuosa de lipido A monofosforilo previo para congelamiento o liofilización. El azúcar se puede adicionar tanto antes como después de 1 a formación de la suspensión coloidal acuosa pero se der;e adicionar antes del congelamiento o liofilización de la suspensión. La adición de azúcar a una suspensión coloidal acuosa de lipido A monofosforilo previo para congelamiento o liofilización proporciona una composición que, después de congelamiento se pueda derretir per¿ proporcionar una suspensión coloidal acuosa sin sonificación adicional o, de manera alternativa, después de la liofilización, se pueda reconstituir con un diluyente acuoso adecuado y permita sin sonificación adicional una suspensión coloidal acuosa como se describió antes. Los azúcares adecuados incluyen los monosacáridos, dextrosa, mañosa, galactosa y fructosa asi como los disacáridos sucrosa, lactosa, isomaltosa, maltosa y trehalosa. También se pueden emplear mezclas de azúcares, por ejemplo sucrosa y dextrosa. Estas azúcares son todas no tóxicas y aceptables farmacéuticamente. Se prefieren la sucrosa y dextrosa. El azúcar se puede encontrar en la forma de un sólido o en la forma de una solución acuosa. Los diluyentes acuosos adecuados incluyen agua o salina y pueden también incluir un antigeno o antigenos y, pueden adicionalmente contener preservativos o adyuvantes adicionales, u otros aditivos, vehículos u acarreadores aceptables farmacéuticamente. Los surfactantes basados en amina adecuados incluyen trietilamina (TEA) y trietanolamina (TEM) .

Un aspecto adicional de la invención es una suspensión coloidal acuosa re-hidratada o reconstituida que, a pesar de la eliminación de una etapa de sonificación adicional, se obtiene en reconstitución de la composición liofilizada descrita anteriormente, antes de la presente invención, fue necesaria una etapa de sonificación a fin de obtener una suspensión coloidal acuosa que contenga lipido A monofosforilo. Sin embargo, se ha encontrado ahora que cuando un diluyente acuoso se adiciona a la composición liofilizada descrita anteriormente, se obtiene una suspensión coloidal acuosa que contiene lipido A monofosforilo sin sonificación adicional. La suspensión coloidal acuosa reconstituida obtenida asi exhibe una transmisión de luz de más de o igual a 88%, cuando se mide espectrofotométricamente. De manera sorprendente, la suspensión coloidal acuosa reconstituida asi obtenida es capaz de ser congelada y, después derretida, reformando nuevamente una suspensión coloidal acuosa que exhibe una transmisión de luz de más de o igual a 88%. La suspensión coloidal acuosa reconstituida de la presente invención comprende arriba de alrededor de 2.5 mg de lipido A monofosforilo por ml de diluyente acuoso, de alrededor de 10 a 200 mg de azúcar por ml de diluyente acuoso, y de alrededor de 0 a 6 mg de surfactante basado en amina por ml de diluyente acuoso. Preferentemente, la suspensión coloidal acuosa reconstituida de la presente invención comprende arriba de alrededor de 2,0 mg de lipido A monofosforilo por ml de diluyente acuoso, - de alrededor de 20 a 150 mg de azúcar por ml del diluyente acuoso, y de alrededor de 0 a 3 mg de surfactante basado en amina por ml de diluyente. La suspensión coloidal acuosa reconstituida puede además comprender una cantidad efectiva inmunológicamente de un antigeno u antigenos. Las azúcares adecuadas, surfactantes basados en amina y diluyentes acuosos están como se describen aqui antes .

Un aspecto adicional de la invención es una composición de vacuna que comprende la composición liofilizada y la suspensión coloidal acuosa reconstituida descrita antes en combinación con una cantidad efectiva inmunológicamente de un antigeno u antigenos. La cantidad efectiva de un antigeno u antigenos se puede proporcionar en el diluyente acuoso de manera opcional. En particular, la composición de vacuna comprende además una cantidad efectiva inmunológicamente de un antigeno u antigenos derivados de o producidos por una bacteria, un virus, un parásito, una célula cancerosa o un alérgeno. Una cantidad efectiva de un antigeno se define como aquella cantidad de antigeno que cuando se administra a un animal o un humano evoca una respuesta inmune medida como la producción de anticuerpos específicos o mecanismos efectores mediados por células. Las cantidades inmunológicamente efectivas de un antigeno u antigenos son en general de alrededor de 1 µg o menos a 5 mg. Una cantidad efectiva de lipido A monofosforilo adyuvante es la cantidad de lipido A monofosforilo que cuando se adiciona a una vacuna mejorará la magnitud o calidad o duración de la respuesta inmune a un antigeno o antigenos en la vacuna. Una cantidad efectiva del adyuvante lipido A monofosforilo está en el rango de alrededor de 1 µg a alrededor de 1 mg. Los antigenos adecuados para las composiciones de vacuna de la presente invención incluyen cualquier entidad capaz de producir un anticuerpo o respuesta inmunológica mediada por célula dirigida de manera especifica contra aquella entidad en un vertebrado expuesto al antigeno. Se pueden emplear uno o más antigenos. El antigeno u antigenos se pueden derivar de microorganismos patógenos incluyendo virus, bacterias, micoplasmas, hongos, protozoarios y otros parásitos. Además, el antigeno un antigenos pueden derivar de fuentes diferentes a los microorganismos, por ejemplo, células cancerígenas o alérgenos. El antigeno u antigenos pueden ser todo o parte de un organismo patógeno, o todo o parte de una proteina, glicoproteina, glicolipido, polisacárido u lipopolisacárido los cuales se asocian con el organismo, o el antigeno u antigenos puede se un polipéptido u otra entidad que remede toda o parte de una proteina tal, glicoproteina, glicolipido, polisacárido u lipopolisacárido .

Los microorganismos patógenos de los cuales se puede producir o derivar el antigeno para propósitos de vacuna son bien conocidos en el campo de las enfermedades infecciosas, como se lista en, por ejemplo, Medical Microbiology, Segunda Edición, (1990) J. C. Sherris (ed.), Elsevier Science Publishing Co., INC., New York, y Zinsser Microbiology, 20 ava. Edición (1992), División of Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey. Ejemplos de un organismo de interés para vacunas humanas incluyen Chlamydia, Haemophilus influenzae no clasificable, Helicobacter pylori, Moraxella ca tarrhalis, Neisseria gonorrhoae, Neisseria meningi tidis, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus Grupo A, Streptococcus Grupo B, Virus Herpes Simplex, Virus de la Inmunodeficiencia Humana, Virus del Papiloma Humano, Influenza, Measles, Parainfluenza, Virus Sincitial Respiratorio, Rotavirus, Virus Norwalk, y otros.

El antigeno u antigenos pueden incluir glicoconjugados que comprenden el antigeno u antigenos polisacáridos, por ejemplo, la cápsula de lipopolisacárido bacteriana o fragmentos de esta, ligada de manera química a una molécula proteica acarreadora a fin de mejorar la inmunogenicidad. Los métodos para la preparación de conjugados de polisacárido capsular bacteriano y moléculas de proteina acarreadoras son bien conocidos en el estado de la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Dick y Burret, Contrib Microbiol . Inmunol . :48-114 (Cruse JM, Lewis RE Jr., eds; Basel Kruger (1989). Los conjugados adecuados, incluyendo en glicoconjugado neumocócico, se describe con mayor detalle en U.S. 4,673,574, U.S. 4,761,283, U.S. 4,902,506, U.S. 5,097,020 y U.S. 5,360,897 los contenidos ' de los cuales se incorporan aqui por referencia.

También se proporciona un método de inmunización de vertebrado a través de la vacunación que comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición de vacuna para dicho vertebrado de conformidad a la presente invención.

También se proporciona un método para la preparación de una composición liofilizada que comprende: a. suspensión de lipido A monofosforilo en una cantidad por arriba de alrededor de 5 mg/ml y, de manera opcional, un surfactante basado en amina en una cantidad de 0 a alrededor de 6 mg/ml en un diluyente acuoso; b. formación de una suspensión coloidal acuosa que tiene transmisión de luz mayor de o igual a 88%, como se mide espectrofotométricamente; c. adición de azúcar a alrededor de 10 a 200 mg/ml ya sea antes o después de la formación de la suspensión coloidal acuosa; d. liofilización del azúcar que contiene la suspensión coloidal acuosa; y e. recuperación de la composición liof lizada.

También se proporciona un método para la preparación de una composición liofilizada que comprende: a. calentamiento de lipopolisacári do de la bacteria gram negativa Salmonella minnesota R595 3/1 un ácido mineral débil durante un periodo suficiente de tiempo para obtener un derivado monofosforilo; b. disolución del derivado monofosforilo en un solvente orgánico y secado; c. tratamiento del derivado de monofosforilo con un álcali débil para remover una cadena de ácido graso lábil a base a la posición para formar lipido A monofosforilo 3-deacilado; d. purificación de lipido A monofosforilo 3-deacilado por medio de cromatografía liquida y recuperación de lípido A monofosforilo; e. suspensión del lipido A monofosforilo en una cantidad de arriba de alrededor de 5 mg/ml y, de manera opcional, un surfactante basado en amina en una cantidad de 0 a alrededor de 6 mg/ml en un diluyente acuoso; f. formación de una suspensión coloidal acuosa que tiene transmisión de luz mayor de o igual a 88%, como se mide espectrofotométricamente; g. adición de azúcar a alrededor de 10 a 200 mg/ml ya a antes o después de la formación de la suspensión coloidal acuosa; y i. recuperación de la composición liofilizada.

También se proporciona un método para la preparación de una suspensión coloidal acuosa que contiene lipido A monofosforilo capaz de ser congelado y derretido que comprende : a. suspensión de lipido A monofosforilo en una cantidad por arriba de alrededor de 5 mg/ml y, de manera opcional, un surfactante basado en amina en una cantidad de 0 a alrededor de 6 mg/ml en un diluyente acuoso; b. formación de una suspensión coloidal acuosa que tiene transmisión de luz mayor de o igual a 88%, como se mide espectrofotométricamente; c. adición de azúcar a alrededor de 10 a 200 mg/ml ya sea antes o después de la formación de la suspensión coloidal acuosa; d. congelación del -azúcar que contiene la suspensión coloidal acuosa; y e. derretimiento y recuperación de la suspensión coloidal acuosa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La preparación de lipido A monofosforilo se describe en la patente U.S. No. 4,912,094, los contenidos de los cuales se incorporan aqui por referencia. Brevemente, el lipido A monofosforilo se produce por reflujo de lipopolisacárido (o lipido A) obtenido de mutantes deficientes en heptosa de la bacteria gram negativa, Salmonella minnesota R595, en soluciones minerales acidas débiles (por ejemplo 0. ÍN de HCl) durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Los ácidos minerales adecuados incluyen ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y similares. Este tratamiento resulta en la pérdida de la porción fosfato en la posición 1 del final de reducción de glucosamina. El núcleo de carbohidrato se remueve de la posición 6' de la glucosamina no reducida durante este tratamiento. El resultado es un derivado monofosforilo de lipido A. El derivado monofosforilo de lipido A se disuelve en solventes orgánicos y se trata con álcali muy débil que remueve la cadena de ácido graso lábil a la base a la posición 3 para formar lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo, que indican que la posición 3 del final de reducción de glucosamina es da-O-acilado. Químicamente es una mezcla de lipido A monofosforilo 3-deacilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Los solventes orgánicos adecuados incluyen metanol (alcoholes), dimetil sulfoxido, dimetilformamida, cloroformo, diclorometano, y similares asi como mezclas de estos. También se pueden emplear las combinaciones de agua o uno o más de estos solventes orgánicos. Las bases alcalinas adecuadas se pueden escoger de entre varios hidróxidos, carbonatos, fosfatos y aminas. Las bases ilustrativas incluyen las bases inorgánicas tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, carbonato de potasio, bicarbonato de sodio, bicarbonato de potasio, y similares, y las bases orgánicas tal como aminas de alquilo e incluyen, pero no se limitan a, dietilamina, trietilamina y similares. El lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo se purifica por cromatografía liquida y se convierte a sal de trietilamina monobásica (trietilamonio) .

El término lipido A monofosforilo como se usa aqui significa lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo como la sal de trietilamina monobásica (trietilamonio) .

Para preparar la composición liofilizada de la presente invención, el lipido A monofosforilo se adiciona a un diluyente acuoso, preferentemente agua, en cantidades arriba de 5 mg de lipido A monofosforilo por ml de diluyente acuoso, preferentemente arriba de 2.5 mg/ml y más preferentemente de alrededor de 0.5 a 2.5 mg/ml. De manera opcional, se emplea un surfactante basado en amina adicionada en una cantidad de alrededor de 0 a 6 mg/ml, preferentemente de 0 a 3 mg/ml.

Una suspensión coloidal acuosa que tiene una transmisión de luz mayor de o igual a 88%, como se mide epectrofotométricamente se forma por sonificación, de manera opcional con calentamiento, u otros métodos. El calentamiento es opcional pero se prefiere para facilitar la formación de suspensión coloidal acuosa de lipido a monofosforilo. el equipo de sonificación adecuado incluye, por ejemplo, un sonificador de sonda (Vibracell VCX600; Sónica) unido a sondas cuyos tamaños son apropiados para el volumen a ser procesado o un sonificador de tina tal como el modelo No. G112SP1T obtenido de Laboratory Supplies Co. Inc., (Hicksville NY) . Otro equipo similar usado en la industria farmacéutica también seria apropiado par ala sonificación de lipido A monofosforilo.

La suspensión coloidal acuosa de lipido A monofosforilo se puede formar por medio de métodos diferentes de la sonificación, por ejemplo, por fuerzas de corte como las que se generarían en un microfluidizador.

El azúcar también se adiciona ya sea antes o después de la formación de la suspensión coloidal acuosa, en cantidades de 10 a 200 mg de azúcar por ml de diluyente acuoso, preferentemente de alrededor de 20 a 150 mg/ml. La suspensión coloidal acuosa, que contiene lipido A monofosforilo, azúcar y de manera opcional un surfactante basado en amina adicionada y opcionalmente una cantidad efectiva inmunológicamente de un antigeno u antigenos en las cantidades recitadas antes, se liofiliza para proporcionar la composición liofilizada de conformidad a la presente invención.

La suspensión coloidal acuosa de lipido A monofosforilo, azúcar y, de manera opcional, un surfactante basado en amina de un antigeno u antigenos se liofiliza para proporcionar la composición liofilizada de la presente invención. Como es conocido para aquellos habilitados en el estado de la técnica, la liofilización es un proceso de secado en el cual el agua se sublima del producto después de que este se congela, por medio de la aplicación de un vacio. Las especificaciones de la liofilización o congelación-secado se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences. Capitulo 84, página 1565, ldava. edición, A.R. Gennaro, Editor, 1990, Mack Publishing Company.

Si una suspensión coloidal acuosa es formada, se determina por medio de la medición de transmisión de luz.

Se ha encontrado que las composiciones que tienen una transmisión de luz de al menos 88% exhiben las propiedades de suspensiones coloidales. La transmisión de luz se mide usando un espectrofótometro en el cual se ilumina una mezcla de liquido en ?n tubo de vidrio, cuarzo u plástico con una trayeccoria de luz de 1 centímetro. La luz puede estar en el espectro visible o invisible, pero para mediciones de "cransiáision de luz de este tipo una longitud de onda de 650 nm se puede usar de manera apropiada. La cantidad de luz pasando a través de la muestra (por ejemplo, transmitida) es referida a un tubo liso que contiene el solvente o diluyente en el cual el material se disuelve o suspende. Las muestras que no absorben o dispersan la luz exhibirán 100% de transmisión de luz mientras que aquellas que absorban o dispersen toda la luz tendrán 0% de transmisión de luz.

En tanto no se anhele ser ligado por medio de la teoría, se cree que los resultados ventajosos de la invención se obtienen a causa de que la adición de azúcar ya sea antes o después de la formación de suspensión coloidal acuosa que contiene lipido A monofosforilo previene al lipido A monofosforilo de agregación ya sea en congelación o derretimiento de la suspensión coloidal acuosa o sobre la liofilización de la suspensión coloidal acuosa y reconstitución o rehidratación con un diluyente acuoso. Por medio de la inclusión de azúcar en una suspensión coloidal acuosa que contiene lipido A monofosforilo previo a la liofilización, la composición liofilizada se puede reconstituir con un diluyente acuoso tal como agua o solución salina sin el problema de re-agregación del lipido A monofosforilo. Además, la congelación de la suspensión coloidal reconstituida o composición de vacuna no causa reacontecimiento de agregación. De manera similar, por medio de la inclusión de azúcar en una suspensión coloidal acuosa que contiene lipido A monofosforilo previo a congelación, en el derretimiento de una suspensión coloidal acuosa congelada se obtiene nuevamente sin la necesidad de sonificación adicional. La habilidad del azúcar para prevenir la agregación de lipido A monofosforilo es evidente a pesar de si la suspensión coloidal acuosa que contiene lipido A monofosforilo se prepara en agua sola, o en agua que contiene trietilamina o trietanolamina.

Asi, La adición de azúcar a lipido A monofosforilo que contiene composiciones acuosas, ya sea antes o después de la formación de la suspensión coloidal acuosa, proporciona resultados sorpresivos e inesperados cuando tales suspensiones coloidales acuosas permiten la preparación ventajosa de composiciones de vacuna.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar la invención.

Ejemplo 1 Preparación de Mezcla Turbia y Medición de Transmisión de Luz El lipido A Monofosforilo (RIBI Inmuno Chem., Hamilton, MT) se suspende en agua a 1 mg/ml (w/v) formando una mezcla turbia con partículas visibles de tamaño heterogéneo. La mezcla turbia se coloca en un Espectrofotómetro UV-Visible Shimadzu UV-1601, y se iluminó con luz a longitud de onda de 650 nm. La mezcla turbia permite 3.3% de paso de luz incidente (por ejemplo % de transmisión = 3.3). No se encuentra una suspensión coloidal acuosa.

Ejemplo 2 Preparación de Suspensión Coloidal Acuosa y Medición de la Transmisión de Luz El lipido A Monofosforilo, a 1 mg/ml (p/v) se suspende en agua que contiene 5% de trietanolamina (v/v) (5.62 mg/mL (w/v)) o 0.2% de trietilamina (v/v) (1.46 mg/mL (w/v)).

Las muestras se calientan a 56-65°C durante 10-15 minutos y se sonifican usando ya sea un sonificador de sonda (Vibracell VCZ600) colocado a 30% de poder usando .una micropunta graduada o un sonificador de tina (Modelo No.

G112SP1T obtenido de Laboratory Supplies Co. Inc., Hicksville NY. ) usado a su máximo poder durante 2 o 3 minutos. Se obtiene una suspensión clara y se coloca en un Espectrofotómetro UV-Visible Shimadzu UV-1601, y se ilumina con luz de longitud de onda de 650 nm. El % de transmisión de luz se mide a > 88%, que indica la formación de una suspensión coloidal acuosa.

Ejemplo 3 Preparación de Suspensión Coloidal Acuosa de Lipido A Monofosforilo y Liofilización Las suspensiones coloidales acuosas de lipido A monofosforilo se forman por medio de la suspensión de lipido A monofosforilo, a l, 2 o 5 mg/mL (P/v) en agua o agua que contiene ya sea 0.5% de trietanolamina v/v (5.6 mg/mL p/v), o 0.2% de trietilamina v/v (1.46 mg/mL p/v). Cada suspensión de lipido A monofosforilo se calienta por 10-15 minutos a 56-65°C y después se sonifica durante un total de 2-3 minutos para obtener una suspensión clara sin evidencia visual de partículas, las muestras (1 a 1.5 ml) se sonifican usando ya sea un sonificador de prueba (Vibracell VCX600) colocado a 30% de poder usando una micropunta graduada o un sonicador de tina (Modelo No. G112SP1T obtenido de Laboratory Supplies Co . Inc., Hicksville NY.) usado a su máximo poder. Las alícuotas de las suspensiones coloidales acuosas de lipido A monofosforilo anteriores se diluyen con una cantidad igual de agua, o soluciones de sucrosa o dextrosa de varias concentraciones. Las suspensiones coloidales acuosas resultantes incluyen el lipido A monofosforilo a 0.5, 1.0 o 2.5 mg/mL (p/v) y sucrosa en concentraciones finales de 10, 50, 100 o 200 mg/mL (w/v) como se expresa en la Tabla 1. Las preparaciones contenían ya sea trietanolamina (TEM) a 2.81 o 5.62 mg/mL o trietilamina (TEA) a 0.73 mg/mL o surfactante no basado en amina. Las muestras se colocan en un Espectrofotómetro UV-Visible Shimadzu UV-1601, y se ilumina con luz de longitud de onda de 650 nm. El % de transmisión de luz, como se declara en la Tabla 1, va de 90.0 a 99.9%, que indica la formación de una suspensión coloidal acuosa.

TABLA 1. COMPOSICIÓN DE FORMULACIONES DE LÍPIDO A MONOFOSFORILO. TABLA 1. (CONTINUACIÓN) COMPOSICIÓN DE FORMULACIONES DE LÍPIDO A MONOFOSFORILO. Liofilización de Composiciones de Adyuvante de Lipido A Monofosforilo Las suspensiones coloidales acuosas declaradas en la Tabla 1 se liofilizan por medio de congelación de las muestras en matraces de vidrio o tubos de cultivo de polipropileno sobre bolitas de hielo seco durante al menos 30 minutos. Estos son transferidos después a vasos largos de congelación en seco (Labconco) y se conectan a un Secador en Congelación Virtus . Las muestras se liofilizan durante 18 horas a un vacio de 250 militores y la temperatura condensadora de -50 °C. La composición de las composiciones adyuvantes liofilizadas se muestra en la Tabla 2.

Reconstitución de las Composiciones Adyuvantes Liofilizadas Las muestras liofilizadas como se declaran en la Tabla 2 se reconstituyen ya sea con agua o solución salina normal (0.9% de NaCL p/v), el volumen de la cual fue igual al volumen de la suspensión coloidal acuosa previo a la liofilización. Los datos que muestran el % de transmisión de luz de las muestras después de la reconstitución con diluyente acuoso se presentan en la Tabla 2. Como se muestra en la Tabla 2, las composiciones liofilizadas, conteniendo sucrosa o dextrosa que van de más de 75% a arriba de 99.4% de la composición por peso, dan el surgimiento de suspensiones coloidales acuosas cuando se re-hidratan con agua o solución salina. Para las muestras 1-38 declaradas en la Tabla 2, el % de transmisión después de la rehidratación va de 88.0% a 98.4% indicando la formación de una suspensión coloidal acuosa. Las muestras 15 y 16, las cuales contuvieron 99% de azúcar por peso después de la liofilización, se preparan sin la adición de aminas (trietilamina o trietanolamina) al tiempo de la sonificación. Cuando se re-hidrata ya sea con agua o solución salina normal, los valores de % de transmisión se miden a 96.1 y 93.6, respectivamente, indicando la formación de una suspensión coloidal acuosa. Estos datos muestran que cuando una suspensión coloidal acuosa de lipido A monofosforilo preparado por sonificación se liofiliza con una cantidad efectiva de azúcar tal como sucrosa o dextrosa esta se puede re-hidratar con agua o solución salina normal para recobrar una suspensión coloidal acuosa.

TABLA 2. PROPIEDADES DE TRANSMISIÓN DE LUZ DE COMPOSICIONES DE LÍPIDO A MONOFOSFORILO LIOFILIZADAS DESPUÉS DE LA REHIDRATACIÓN CON AGUA O SOLUCIÓN SALINA TABLA 2. (CONTINUACIÓN) PROPIEDADES DE TRANSMISIÓN DE LUZ DE COMPOSICIONES DE LÍPIDO A MONOFOSFORILO LIOFILIZADAS DESPUÉS DE LA REHIDRATACIÓN CON AGUA O SOLUCIÓN SALINA TABLA 2. (CONTINUACIÓN) PROPIEDADES DE TRANSMISIÓN DE LUZ DE COMPOSICIONES DE LÍPIDO A MONOFOSFORILO' LIOFILIZADAS DESPUÉS DE LA REHIDRATACIÓN CON AGUA O SOLUCIÓN SALINA Ejemplo 4 Usando los procedimientos declarados en el Ejemplo 3, se preparan las formulaciones que contiene lipido A monofosforilo, azúcar y amina es las cantidades declaradas en el ejemplo 3. la transmisión de luz de estas formulaciones se mide y se declara en la Tabla 3, el % de transmisión va de 95.4 a 98.8% indicando la formación de una suspensión coloidal acuosa.

TABLA 3. COMPOSICIÓN DE FORMULACIONES DE LÍPIDO A MONOFOSFORILO Usando los procedimientos declarados en el ejemplo 3, las formulaciones de la Tabla 3 se liofilizan y reconstituyen con agua o solución salina como se declara en la Tabla 4.

TABLA 4. PROPIEDADES DE TRANSMISIÓN DE LUZ DE FORMULACIONES DE LÍPIDO A MONOFOSFORILO LIOFILIZADO DESPUÉS DE REHIDRATACIÓN CON AGUA O SOLUCIÓN SALINA Cuando las muestras se liofilizaron sin azúcares (muestras 39-43) se re-hidratan con agua o solución salina la preparación resultante es turbia con partículas suspendidas. Estas muestras exhiben un % de transmisión que va de 22.0 a 58.6.

Se obtiene resultados similares cuando las muestras 44- 47 que contiene 7.6% a 62.0% de azúcar se re-hidatan con agua indicando que no se forma una suspensión coloidal acuosa.

Ejemplo 5 Congelación y derretimiento de Lipido A Monofosforilo Sonificado en Trietilamina Acuosa en la Presencia de Sucrosa El lipido A monofosforilo se sonifica en agua que contiene 0.2% de trietilamina (v/v) y después se mezcla con un volumen igual de agua o agua que contiene sucrosa para producir una suspensión clara que contiene lipido A monofosforilo en 0.5 mg/mL (p/w) sin sucrosa o que contiene 100 mg/mL de sucrosa w/v y trietilamina en una concentración final de 0.1% v/v (0.73 mg/mL p/w). Las muestras (48 y 49) se colocaron en un Espectrofotómetro UV-Visible Shimadzu UV-1601, y se ilumina con luz de longitud de onda de 650 nm y cada una permitió 98.8% de paso de luz indicando asi la formación de una suspensión coloidal acuosa. Las suspensiones coloidales se congelan y después se derriten. En el derretimiento, la preparación de lipido A monofosforilo sin sucrosa (muestra 48) es turbia con partículas y tiene un % de transmisión de luz de 60.3% como se midió en un Espectrofotómetro UV-Visible Shimadzu UV-1601, y se ilumina con luz de longitud de onda de 650 nm indicando que no se forma una suspensión coloidal acuosa. El lipido A monofosforilo que contiene sucrosa (muestra 49) permanece clara después de la congelación y derretimiento y tiene un % de transmisión de luz de 97.8% como se midió en un Espectrofotómetro UV-Visible Shimadzu UV-1601, y se ilumina con luz de longitud de onda de 650 nm indicando la formación de una suspensión coloidal acuosa, estos datos se exhiben en la Tabla 5.

TABLA 5. PROPIEDADES DE TRANSMISIÓN DE LUZ ANTES Y DESPUÉS DE CONGELACIÓN Y DERRETIMIENTO DE LÍPIDO A 10 MONOFOSFORILO SONIFICADO CON TRIETILAMINA Y DILUIDO CON O SIN SUCROSA Ejemplo 6 - Preparación de Composiciones de Vacuna: 15 Preparación de suspensiones coloidales acuosas de lipido A monofosforilo Usando los procedimientos declarados en el ejemplo 3 arriba, una mezcla de lipido A monofosforilo en agua de alrededor de 0.5 mg/ml y una trietanolamina surfactante basado en amina en alrededor de 2.8 mg/ml se calienta y sonifica para dar una suspensión coloidal acuosa. Ya sea antes o después de la sonificación, pero previo a la congelación o liofilización, se agrega la sucrosa a una concentración final entre alrededor de 10 a 200 mg/ml. La suspensión coloidal acuosa asi obtenida puede ser tanto congelada como derretida para uso en composiciones de vacuna o liofilizada y reconstituida con un diluyente acuoso para uso en una composición de vacuna. b. Preparación de una composición de vacuna acuosa de composición de lipido A monofosforilo congelado Se congela la suspensión coloidal acuosa de lipido A monofosforilo, sucrosa o trietanolamina preparada en (a) anteriormente. Esta después se derrite y combina con un diluyente acuoso que contiene un antigeno, por ejemplo, un glicoconjugado neumocócico preparado de conformidad con la Patente U.S. 5,360,897, para obtener una composición de vacuna que contiene arriba de alrededor de 400 microgramos de lipido A monofosforilo por ml a arriba de alrededor de 200 microgramos de glicoconjugado neumocócico por ml . para obtener una composición de vacuna que contiene 400 microgramos de lipido A monofosforilo y 200 microgramos de glicoconjugado neumocócico, por ejemplo, 0.8 ml de la suspensión coloidal" derretida se pueden combinar con 200 microgramos de glicoconjugado neumocócico en 0.2 ml de agua. Esta composición de vacuna se puede entonces administrar a un vertebrado, preferentemente a un humano, usando alrededor de 0.1 a 1.0 ml por dosis. c. Preparación de una composición de vacuna acuosa de la composición de lipido A monofosforilo liofilizada Se liofiliza la suspensión coloidal acuosa de lipido A monofosforilo, sucrosa, y trietanolamina preparada en (a) anteriormente. Esta después se reconstituye con un diluyente acuoso que contiene un antigeno, por ejemplo, un glicoconjugado neumocócico preparado de conformidad con la Patente U.S. 5,360,897, para obtener una composición de vacuna que contiene arriba de alrededor de 400 microgramos de lipido A monofosforilo por ml a arriba de alrededor de 200 microgramos de glicoconjugado neumocócico por ml . Esta composición de vacuna se puede entonces administrar a un vertebrado, preferentemente a un humano, usando alrededor de 0.1 a 1.0 ml por dosis. d. Preparación de una composición de vacuna congelada A la suspensión coloidal acuosa de lipido A monofosforilo, sucrosa, y trietanolamina preparada en (a) anteriormente se le adiciona un antigeno, por ejemplo, un glicoconjugado neumocócico preparado de conformidad con la Patente U.S. 5,360,897, para obtener una composición de vacuna. La composición de vacuna se congela entonces.

Las concentraciones de lipido A nonofosforilo y glicoconjugado neumocócico se ajustan por la adición de un diluyente acuoso, arriba de alrededor de 400 microgramos por ml y arriba de alrededor de 200 microgramos por ml, respectivamente, ya sea antes de la congelación o después de la congelación y derretimiento, a condición de que la sucrosa s< mantenga en una concentración de alrededor de 10 a 200 mg/ml antes de la congelación. La composición de vacuna congelada y derretida se puede entonces administrar a un vertebrado, preferentemente a un humano, usando alrededor de 0.1 a 1.0 ml por dosis. e. Preparación de una composición de vacuna liofilizada A la suspensión coloidal acuosa de lipido A monofosforilo, sucrosa, y trietanolamina preparada en (a) anteriormente se le adiciona, por ejemplo, un glicoconjugado neumocócico preparado de conformidad con la Patente U.S. 5,360,897, para obtener una composición de vacuna. El antigeno se puede adicionar tanto antes como después de las etapas de calentamiento y sonificación. La cantidad de glicoconjugado neumocócico se adicionado se calcula tal que, en la reconstitución subsiguiente de la composición de vacuna liofilizada , la mezcla acuosa contendrá arriba de alrededor de 400 microgramos de lipido A monofosforilo por ml y arriba de alrededor de 200 microgramos de glicoconjugado neumocócico por ml . La composición de vacuna es entonces liofilizada. Siguiendo a la liofilización, la composición se reconstituye con un diluyente acuoso, esta composición de vacuna reconstituida se puede entonces administrar a un vertebrado, preferentemente a un humano, usando alrededor de 0.1 a 1.0 ml por dosis.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (33)

REIVINDICACIONES

1. Una composición liofilizada caracterizada porque comprende lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo en una cantidad de arriba de alrededor de 5% en peso, mayor de alrededor de 70% en peso de azúcar y alrededor de 0 a alrededor de 30% en peso de un surfactante basado en amina adicionada.

2. La composición liofilizada de conformidad con la Reivindicación 1 caracterizada porque comprende lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo en una cantidad de arriba de alrededor de 4% en peso, azúcar de alrededor de 75 a alrededor de 99.99% en peso y surfactante basado en amina de alrededor de 0 a alrededor de 22% en peso.

3. La composición liofilizada de conformidad con la Reivindicación 1 caracterizada porque el azúcar comprende dextrosa, mañosa, galactosa, fructosa, sucrosa, lactosa, isomaltosa, maltosa y trehalosa.

4. La composición liofilizada de conformidad con la Reivindicación 1 caracterizada porque el azúcar es sucrosa o dextrosa.

5. La composición liofilizada de conformidad a la Reivindicación 1 caracterizada porque el surfactante basado en amina es trietilamina o trietanolamina.

6. La composición liofilizada de conformidad a la Reivindicación 1 caracterizada porque comprende una cantidad efectiva inmunológicamente de un antigeno u antigenos.

7. Una composición de vacuna caracterizada porque comprende una cantidad de composición liofilizada de la Reivindicación 1 suficiente para proporcionar una cantidad efectiva de lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo y una cantidad efectiva inmunológicamente de un antigeno u antigenos.

8. La composición de vacuna de conformidad con la Reivindicación 7 caracterizado porque el antigeno u antigenos se derivan de o se producen por una bacteria, un virus, un parásito, una célula cancerosa o un alérgeno.

9. La composición de vacuna de conformidad con la Reivindicación 7 caracterizada porque el antigeno es un antigeno de Chlamydia, Haemophilus influenzae no clasificable, Helicobacter pylori, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoae, Neisseria meningi tidis, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus Grupo A, Streptococcus Grupo B, Virus Herpes Simplex, Virus de la Inmunodeficiencia Humana, Virus del Papiloma Humano, Influenza, Measles, Parainfluenza, Virus Sincitial Respiratorio, Rotavirus, o Virus Norwalk.

10. La composición de vacuna de conformidad con la Reivindicación 7 caracterizada porque la cantidad inmunológicamente efectiva de un antigeno u antigenos es alrededor de 1 µg a alrededor de 5 mg.

11. La composición de vacuna de conformidad con la Reivindicación 7 caracterizada porque la cantidad de lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo es de alrededor de 1 µg a alrededor de 1 mg.

12. La composición de vacuna de conformidad con la Reivindicación 7 caracterizada porque el antigeno es un conjugado que comprende polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a proteina.

13. Una catposicicn acuosa caracterizada porque catprende la otposicicn liofilizada de la Reivindicación 1 reconstituida con un diluyente acuoso en una cantidad arriba de alrededor de 210 mg de la composición liofilizada por ml de diluyente acuoso, dicha composición acuosa en la forma de una suspensión acuosa coloidal que tiene una transmisión de luz de más de o igual a 88% como se mide espectrofotométricamente .

14. La composición acuosa de la Reivindicación 13 caracterizada porque comprende por ml de diluyente acuoso arriba de alrededor de 2.5 mg de lipido A 3-0-desacil-4' - monofosforilo de alrededor de 10 a alrededor de 200 mg de azúcar, y de alrededor de 0 a alrededor de 6 mg de surfactante basado en amina adicionada.

15. La composición acuosa de conformidad con la Reivindicación 13 caracterizada porque comprende por ml de diluyente acuoso de alrededor de 0.5 a alrededor de 2.5 mg de lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo de alrededor de 20 a alrededor de 150 mg de azúcar, y de alrededor de 0 a alrededor de 3 mg de surfactante basado en amina adicionada.

16. La composición acuosa de conformidad con la Reivindicación 13 caracterizada porque dicha azúcar es sucrosa o dextrosa.

17. La composición acuosa de la Reivindicación 13 caracterizada porque dicho diluyente acuoso comprende agua o solución salina.

18. La composición acuosa de la reivindicación 13 caracterizada porque dicho diluyente acuoso comprende además un antigeno u antigenos, un aluminio fosfato u otro adyuvante, o un acarreador aceptable farmacéuticamente .

19. La composición acuosa de la reivindicación 13 caracterizada porque dicho surfactante basado en amina es trietilamina o trietanolamina.

20. Una composición de vacuna caracterizada porque comprende una cantidad de la comp< lición acuosa de la reivindicación 13 suficiente par¿ proporcionar una cantidad efectiva de lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo y una cantidad efectiva inmunológicamente de un antigeno u antigenos.

21. La composición de vacuna de conformidad con la Reivindicación 20 caracterizada porque el antigeno u antigenos se derivan de o se producen por una bacteria, un virus, un parásito, una célula cancerosa o un alérgeno.

22. La composición de vacuna de c nformidad con la Reivindicación 20 caracterizada porque el antigeno es un conjugado que comprende el polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteina .

23. La composición de vacuna de conformidad con la Reivindicación 20 caracterizada porque el antigeno es un antigeno de Chlamydia, Haemophilus influenzae no clasificable, Helicobacter pylori, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoae, Neisseria meningi tidis, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus Grupo A, Streptococcus Grupo B, Virus Herpes Simplex, Virus de la Inmunodeficiencia Humana, Virus del Papiloma Humano, Influenza, Measles, Parainfluenza, Virus Sincitial Respiratorio, Rotavirus, o Virus Norwalk.

24. La composición de vacuna de conformidad con la Reivindicación 20 caracterizada porque la cantidad inmunológicamente efectiva del antigeno es alrededor de 1 µg a alrededor de 5 mg.

25. La composición de vacuna de conformidad con la Reivindicación 20 caracterizada porque la cantidad efectiva de lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo es de alrededor de 1 µg a alrededor de 1 mg.

26. Un método de inmunización de un vertebrado a través de la vacunación caracterizado porque el método comprende la administración de una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 20 a un vertebrado.

27. Un método para la preparación de una composición-liofilizada caracterizado porque comprende: a. suspensión de lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo en una cantidad por arriba de alrededor de 5 mg/ml y un surfactante basado en amina en una cantidad de 0 a alrededor de 6 mg/ml en un diluyente acuoso; b. formación de una suspensión coloidal acuosa que tiene transmisión de luz mayor de o igual a 88%, como se mide espectrofotométricamente; c. adición de azúcar a alrededor de 10 a 200 mg/ml ya sea antes o después de la formación de la suspensión coloidal acuosa; d. liofilización del azúcar que contiene la suspensión coloidal acuosa; y e. recuperación de la composición liofilizada.

28. La composición liofilizada preparada de conformidad al método de la Reivindicación 27.

29. Un método para la preparación de una composición liofilizada caracterizado porque comprende: a. calentamiento de lipopolisacárido de la bacteria gram negativa Salmonella minnesota R595 en un ácido mineral débil durante un periodo suficiente de tiempo para obtener un derivado monofosforilo; b. disolución del derivado monofosforilo en un solvente orgánico y secado; c. tratamiento del derivado de monofosforilo con un álcali débil para remover una cadena de ácido graso lábil a base a la posición para formar lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo; d. purificación de lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo por medio de cromatografía liquida y recuperación de lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo; e. suspensión del lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo en una cantidad de arriba de alrededor de 5 mg/ml y, un surfactante basado en amina en una cantidad de 0 a alrededor de 6 mg/ml en un diluyente acuoso; f. formación de una suspensión coloidal acuosa que tiene transmisión de luz mayor de o igual a 88%, como se mide espectrofotométricamente; g. adición de azúcar a alrededor de 10 a 200 mg/ml ya a antes o después de la formación de la suspensión coloidal acuosa; y i. recuperación de la composición liofilizada.

30. Un método para la preparación de una suspensión coloidal acuosa que contiene lipido A 3-0-desacil-4' - monofosforilo capaz de ser congelado y derretido caracterizado porque comprende: a. suspensión de lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo en una cantidad por arriba de alrededor de 5 mg/ml y, un surfactante basado en amina en una cantidad de 0 a alrededor de 6 mg/ml en un diluyente acuoso; b. formación de una suspensión coloidal acuosa que tiene transmisión de luz mayor de o igual a 88%, como se mide espectrofotométricamente; c. adición de azúcar a alrededor de 10 a 200 mg/ml ya sea antes o después de la formación de la suspensión coloidal acuosa; d. congelación del azúcar que contiene la suspensión coloidal acuosa; y e. derretimiento y recuperación de la suspensión coloidal acuosa.

31. El método de la Reivindicación 30 caracterizado porque dicha suspensión coloidal acuosa derretida se combina con un diluyente acuoso que contiene adicionalmente un antigeno u antigenos, adyuvante de fosfato de aluminio o un preservativo, acarreador o vehículo aceptable farmacéuticamente.

32. Un método para la preparación de una suspensión coloidal acuosa que contiene lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo capaz de ser liofilizado y resuspendido caracterizado porque comprende: a. suspensión de lipido A 3-0-desacil-4' -monofosforilo en una cantidad por arriba de alrededor de 5 mg/ml y, un surfactante basado en amina en una cantidad de 0 a alrededor de 6 mg/ml en un diluyente acuoso; b. formación de una suspensión coloidal acuosa que tiene transmisión de luz mayor de o igual a 88%, como se mide espectrofotométricamente; c. adición de azúcar a alrededor de 10 a 200 mg/ml ya sea antes o después de la formación de la suspensión coloidal acuosa; d. liofilización del azúcar que contiene la suspensión coloidal acuosa; y e. resuspensión y reformación de una suspensión coloidal acuosa.

33. El método de la Reivindicaci n 32 caracterizado porque dicha suspensión coloidal acuosa se combina con un diluyente acuoso que contiene además un antigeno u antigenos, adyuvante de fosfato de aluminio o un preservativo, acarreador o vehículo aceptable farmacéuticamente .