DE60109443T2 - Antigene zusammensetzung die ein polykationisches peptid und inosin und cytosin enthält - Google Patents

Antigene zusammensetzung die ein polykationisches peptid und inosin und cytosin enthält Download PDF

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Description

  • Ein Vakzin kann eine ganze Vielfalt verschiedener Antigene enthalten. Beispiele für Antigene sind ganze abgetötete Organismen, wie inaktivierte Viren oder Bakterien, Pilze, Protozoen oder selbst Krebszellen. Antigene können auch aus Sub-Fraktionen von diesen Organismen/Gewebe, von Proteinen oder, in ihrer einfachsten Form, von Peptiden, bestehen. Antigene können auch vom Immunsystem in Form glykosylierter Proteine oder Peptide erkannt werden und können auch Polysaccharide oder Lipide sein oder diese enthalten. Kurze Peptide können verwendet werden, da beispielsweise cytotoxische T-Zellen (CTL) Antigene in Form von kurzen, üblicherweise 8–11 Aminosäuren langen Peptiden in Verbindung mit dem Haupt-Histokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) erkennen (Rammensee et al., 1995).
  • Um anhaltende, Antigen-spezifische Immunantworten zu erhalten, müssen Adjuvanzien Immunkaskaden auslösen, an welchen alle notwendigen Zellen des Immunsystems teilnehmen. Adjuvanzien wirken vor allem auf sogenannte Antigen-präsentierende Zellen (antigen presenting cells, APCs), sind jedoch in ihrer Wirkungsweise nicht eingeschränkt, von welchen dendritische Zellen (dentritic cell – DC) die wirksamsten sind. Diese Zellen treffen im Allgemeinen zuerst auf das (die) Antigen(e), wonach prozessiertes oder unmodifiziertes Antigen den Immuneffektorzellen präsentiert wird. Intermediäre Zelltypen können ebenfalls eine Rolle spielen. Nur Effektorzellen mit der geeigneten Spezifität werden bei einer produktiven Immunantwort aktiviert. Die Adjuvanzien können lokal auch Antigene und co-injizierte andere Faktoren festhalten. Zusätzlich können die Adjuvanzien als Chemoattraktionsmittel für andere Immunzellen dienen oder lokal und/oder systemisch als Stimulationsmittel für das Immunsystem wirken.
  • Zellen des angeborenen Immunsystems erkennen Muster, die an ihren jeweiligen Zielen exprimiert sind. Beispiele sind Lipopolysaccharide (LPS) im Fall von Gram-negativen Bakterien, mykobakterielle Glykolipide, Lipoteichoinsäuren Gram-positiver Bakterien, Mannane von Hefe und doppelsträngige RNAs von Viren (Hoffmann et al., 1999). Außerdem können sie Muster, wie veränderte Glykosylierungen von Proteinen an Tumorzellen, erkennen.
  • Es zeigte sich, dass polykationische Polymere, beispielsweise die polykationischen Aminosäurepolymere Poly-L-Arginin und Poly-L-Lysin, eine sehr effiziente Ladung von APC mit Antigenen in vitro und in vivo aufweisen (Buschle et al., 1998, Buschle et al., 1997, Schmidt et al., 1997). Dies wird als Schlüsselereignis bei der Auslösung von Immunkaskaden angesehen, was schließlich zur Induktion von Antigen-spezifischen Immuneffektorzellen führt, die zur Zerstörung oder Neutralisierung von Zielen fähig sind. Es wurde vorhergehend gezeigt, dass eine Anzahl polykationischer Verbindungen Effekte auf Immunzellen (Buschle et al., 1998, Buschle et al., 1997) ausüben.
  • Die Co-Injektion einer Mischung von Poly-L-Arginin oder Poly-L-Lysin zusammen mit einem geeigneten Antigen als ein Vakzin schützt Tiere vor Tumorwachstum in verschiedenen Tier-Modellen (Buschle et al., 1998, Schmidt et al., 1997). Dieses chemisch definierte Vakzin ist zur Induzierung einer hohen Anzahl Antigen-spezifischer T-Zellen geeignet. Um Antigen-spezifische T-Zellen zu induzieren, müssen die Peptide von einem APC aufgenommen werden. Solche Peptid-geladenen APC induzieren eine Immunkaskade, was schließlich zur Induktion Antigen-spezifischer Immuneffektorzellen wie T-Zellen führt.
  • Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly-I:C) ist als starker Interferon-Typ 1-Inducer (Manetti et al., 1995) bekannt. Durch die schützenden Effekte für eine Anzahl tierischer Gattungen gegen ein breites Spektrum von sowohl RNA- als auch DNA-Viren (beispielsweise Herpes-Simplex-Virus, Tollwutvirus, Japan-B-Enzephalitis-Virus, Vaccinia-Virus, Enzephalomyocarditis-Virus), wird Poly-I:C oft in Virusinfektions-Modellen verwendet. Veränderungen, die sich als Antwort auf Poly-I:C ereignen, werden als repräsentativ für Veränderungen angesehen, die sich als Antwort auf eine Vielzahl verschiedener Viren ereignen. Es ist bekannt, dass Poly-I:C Makrophagen stimuliert damit sie Cytokine wie beispielsweise IL-1a und IL-12 (Manetti et al., 1995) herstellen, sie ist ein wirksamer Stimulator für natürliche Killer-Zellen (NK cell stimulator) (Cavanaugh et al., 1996) und es ist im Allgemeinen bekannt, dass diese Verbindung Thl-spezifische Immunantworten fördert. Durch diese Fähigkeiten wurde Poly-I:C oft als ein Immunmodulator bei verschiedenen klinischen Studien angewandt, wobei sie wenig oder keine Toxizität (Guggenheim et al., 1977, Simnaler et al., 1977) zeigte. Jedoch gab es keinen Nutzen für den Patienten. Es ist nicht klar, ob Poly-I:C selbst eine Adjuvansaktivität hat. Neueste Ergebnisse zeigen, dass Poly-I:C auch eine stabile Reifung von in vitro-kultivierten dendritischen Zellen induziert und dass solche dendritischen Zellen wirksame T-Zell-Stimulatoren in vitro (Cella et al., 1999; Verdijk et al., 1999) sind.
  • US 3 725 545 offenbart komplexe Substanzen umfassend u.a. Polyarginin oder Polylysin und ein Nukleinsäurepolymer, welches bei der Einbringung in Verbindung mit beispielsweise Maul- und Klauenseuche-Virusproteinen in einen tierischen Wirt die Herstellung von Antikörpern verbessern kann.
  • Salazar (Neurosurgery 38(6)(1996) offenbart, dass intramuskulär verabreichte Polyinosin-Polycytidylsäure, stabilisiert mit Polylysin und Carboxymethylzellulose (CMC), zur Breitspektrenstimulation der Wirtabwehr verwendet werden kann.
  • Harrington et al. (Infection and Immunity 24(1) (1979) (160–166) berichtet über den Adjuvanzieneffekt von poly(ICLC) (= Poly(I)·Poly(C)), stabilisiert mit Poly-1-Lysin und CMC) auf die Antikörperantwort von Affen auf das inaktivierte Venezolanische Pferde-Enzephalomyelitis-Virus-Vakzin.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein wirksames Vakzinsystem bereitzustellen, um eine wirksame Abgabe eines spezifischen Antigens an das Immunsystem von Mensch oder Tier zu ermöglichen, um eine wirksame Immunisierung gegen ein solches Antigen zu erreichen.
  • Dieses Ziel wird durch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein T-Zell-Epitop (d.h. ein Antigen, welches durch T-Zellen erkannt wird) gelöst, wobei das T-Zell-Epitop ein Peptid bestehend aus 6 bis 20 Aminosäureresten ist, oder Mischungen von T-Zell-Epitopen, ein polykationisches Peptid und eine Nuklein säure basierend auf Inosin und Cytosin aufweist.
  • Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass, obwohl polykationische Peptide und Nukleinsäuren basierend auf Inosin und Cytosin zuvor als effiziente Adjuvanssubstanzen bekannt waren, die Kombination aus beiden Substanzen mit einem T-Zell-Epitop synergistische Effekte bei der Immunstimulierung hat, die bei Weitem ihren additiven Beitrag überschreitet.
  • Ferner konnte durch die vorliegende Erfindung gezeigt werden, dass auf Ebene der T-Zellen Antigene in einem Vakzin, das eine effiziente T-Zell-Antwort bietet, bereitgestellt werden können, wohingegen in vorherigen Verwendungen polykationischer Peptide und/oder Nukleinsäuren basierend auf Inosin und Cytosin in Vakzinen nur große Antigene oder Ganzzellvakzine verwendet wurden (wo kein synergistischer Effekt der beiden Komponenten gesehen werden kann). Immunisierung mit großen Antigenen oder sogar ganzen Zellen führt zur Erzeugung von Antikörpern. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Erzeugung solcher Antikörper kein Ziel. Daher umfassen die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Antigene, bei denen B-Zellen-Epitope fehlen und die nur Antigene mit einem oder mehreren spezifischen T-Zell-Epitop(en) haben.
  • Tatsächlich könnte gezeigt werden, dass auch schwachimmunogene T-Zell-Epitope, die normalerweise keine T-Zell-Antwort geben („normalerweise" = entweder allein, mit Adjuvanzien gemäß dem Stand der Technik oder mit nur einer Immunstimulationssubstanz gemäß der vorliegenden Erfindung), durch Kombinieren dieser mit einem polykationischen Polypeptid und einer Nukleinsäure basierend auf Inosin oder Cytosin zu sehr effizienten T-Zell-Vakzinen formuliert werden können. Dadurch können Vakzine gemäß der vorliegenden Erfindung auch T-Zell-Epitope umfassen, die nicht zu einer ausreichenden T-Zell-Antwort unter „normalen" Bedingungen (d.h. die Vakzinzusammensetzungen gemäß dem Stand der Technik wie oben definiert) führen. Der Begriff „Antigen" betrifft im folgenden „T-Zell-Epitop(e)".
  • Besonders Antigene, die nicht zu einer ausreichenden Immunantwort führen, wenn sie mit Alum, dem Standard-Adjuvans (oder andere Adjuvanzien gemäß dem Stand der Technik sind offenbart, beispielsweise in Singh et al. (Nat. Biotechnol. 17 (1999), 1075–1081)) oder mit polykationischen Polypeptiden oder Nukleinsäuren basierend auf Inosin und Cytosin alleine aufgebracht werden, können in der vorliegenden Erfindung erfolgreich verwendet werden. Es wird als ausreichende Immunantwort angesehen, beispielsweise wenn sie zu mehr als 50, vorzugsweise mehr als 200, insbesonders mehr als 400 IFN-γ-Spots/106 ungetrennte Zellen in einem ELISPOT-Test sind.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure basierend auf Inosin und Cytosin ausgewählt aus Poly-I : Poly C, Poly-I:C, Poly-dC : Poly-dI und Poly-dIC. Natürlich sind auch alle anderen Kombinationen komplementärer Doppel-strangiger IC-Sequenzen wie auch chemisch modifizierter Nukleinsäuren bevorzugt, beispielsweise thiolierte Poly:IC wie in US 6 008 334 ; US 3 679 654 und US 3 725 545 beschrieben.
  • Polykationische Peptide, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, sind beispielsweise in WO97/30721 beschrieben. Bevorzugte polykationische Peptide sind Poly-Lysine, Poly-Arginine und Poly-Peptide enthaltend mehr als 50% basische Aminosäuren, insbesondere Arginin, oder Lysinreste, in einem Bereich von mehr als 5, insbesonders mehr als 8 Aminosäureresten oder Mischungen davon. Diese polykationischen Peptide können chemisch oder rekombinant hergestellt oder aus natürlichen Quellen stammen. Bevorzugte polykationische Peptide, welche aus natürlichen Quellen stammen, umfassen aus HIV-Rev oder HIV-Tat gewonnene kationische Peptide, Antennapedia Peptide, kationische antimikrobielle Peptide, Defensine, Chitosan (oder andere Chitinderivate) und andere Peptide, welche von diesen Peptiden oder Proteinen durch biochemische rekombinante Herstellung stammen. Vorzugsweise enthalten die polykationischen Peptide zwischen 10 und 1000 Reste, insbesondere zwischen 50 und 500 Reste. Vorzugsweise enthalten diese Peptide mehr als 70%, insbesondere mehr als 85% basische Aminosäurereste, wie Arginin, Lysin, Ornithin etc., und auch synthetische organische Polykatione (Polypeptid-ähnliche Substanzen), wie Polyethylenimin, Histone, Protamine, wie in WO97/30721 offenbart. Natürlich können auch Mischungen aus verschiedenen polykationischen Peptiden oder Polypeptiden verwendet werden.
  • Die in der vorliegenden Zusammensetzung zu verwendenden Antigene sind nicht von kritischer Bedeutung. Vorzugsweise werden Peptide, die von einem viralen oder bakteriellen Pathogen oder von Pilzen oder Parasiten stammen, als solche Antigene verwendet (einschließlich derivatisierter Antigene oder glykosylierter oder lipidisierter Antigene oder Polysaccharide oder Lipide). Bevorzugte Pathogene (Human-, Tier- und Pflanzen-) sind ausgewählt aus HIV, HBV, HCV, Influenza-Virus, Rotavirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Plasmodium sp. (Pl. falciparum, Pl. vivax, etc.), Aspergillus sp. oder Candida albicans. Der Derivatisierungsprozess kann die Reinigung eines spezifischen Proteins aus dem Pathogen, die Inaktivierung des Pathogens sowie die proteolytische oder chemische Derivatisierung oder Stabilisierung eines solchen Proteins inkludieren. Alternativ können auch Teile des Pathogens selbst als Antigen verwendet werden. Auf dieselbe Weise können auch Tumor-Antigene (Krebs-Vakzine) oder Autoimmun-Antigene in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Mit solchen Zusammensetzungen kann eine Tumor-Impfung oder eine Behandlung von Autoimmunerkrankungen durchgeführt werden. Antigene von Parasiten oder Pflanzen-Pathogene werden ebenfalls bevorzugt.
  • Das Antigen (T-Zell-Epitop) gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid bestehend aus 6 bis 20, vorzugsweise 7 bis 15, insbesondere 8 bis 11 Aminosäureresten. Antigene dieser Länge haben sich zur T-Zell-Aktivierung als besonders geeignet erwiesen.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Vakzins.
  • Die relativen Mengen der Ingredienzien in der vorliegenden Zusammensetzung hängen stark von den Notwendigkeiten der individuellen Zusammensetzung ab, beispielsweise von dem zu verwendenden polykationischen Peptid. Vorzugsweise werden zwischen 1 μg und 1 g Antigen, polykationisches Peptid und Nukleinsäure basierend auf Inosin und Cytosin angewendet. Im Fall von Poly-L-Arginin und Poly-L-Lysin liegen bevorzugte Mengen an Antigen/Poly-peptid/Nukleinsäure basierend auf Inosin und Cytosin im Bereich von 1–10000 μg Antigen pro Impfung und 0,1 bis 1000 μg Polypeptid. Die Menge an Poly-I:C kann vorzugsweise zwischen 1 bis 5000 μg/kg Körpergewicht (10 μg–500 mg) sein.
  • Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann weiters Hilfssubstanzen, wie Puffer, Salze, Stabilisatoren, Antioxidantien etc. oder andere effektive Wirksubstanzen, wie entzündungshemmende oder antinozizeptive Arzneistoffe enthalten.
  • Die vorliegenden Zusammensetzungen können einem Patienten, z.B. einem Impfkandidaten, in effizienten Mengen verabreicht werden, z.B. in wöchentlichen, zweiwöchigen oder monatlichen Intervallen. Die mit der vorliegenden Zusammensetzung zu behandelnden Patienten können auch wiederholt oder nur einmal geimpft werden. Eine bevorzugte Verwendung der vorliegenden Erfindung ist die aktive Immunisierung, insbesondere von Menschen oder Tieren ohne Schutz gegen das spezifische Antigen.
  • Der Weg der Verabreichung ist für die vorliegende Zusammensetzung nicht von kritischer Bedeutung, z.B. ist die subkutane, intramuskuläre, intradermale oder transdermale Injektion sowie auch die orale Aufnahme geeignet. Es ist auch möglich, die vorliegende Zusammensetzung getrennt zu verabreichen, z.B. durch Injektion der Nukleinsäure basierend auf Inosin und Cytosin getrennt von der Antigen/polykationischen Peptid-Zusammensetzung. Die vorliegende Erfindung ist daher auch auf ein Set gerichtet, welches eine Zusammensetzung, die das Antigen und das polykationische Peptid als eine Komponente und eine Zusammensetzung, welche die Nukleinsäure basierend auf Inosin und Cytosin als eine zweite Komponente enthält, aufweist. Die Komponenten können zur selben Zeit oder an der derselben Stelle verabreicht werden, es ist jedoch auch eine Anwendung an verschiedenen Stellen oder zu verschiedenen Zeitpunkten oder für eine verschiedene Zeitdauer möglich. Es ist auch möglich, die systemischen oder lokalen Anwendungen der Zusammensetzung bzw. der Komponenten zu variieren.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Vakzins, welches eine systemische Immunantwort induziert.
  • Details der vorliegenden Erfindung sind durch die folgenden Beispiele und die Figuren beschrieben, die Erfindung ist jedoch natürlich nicht auf diese beschränkt.
  • 1 zeigt die Immunantwort auf das von Ovalbumin stammende Peptid einer kombinierten Injektion von Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) und Poly-L-Arginin (pR); Mäusen wurden in die Pfotenballen subkutan Mischungen, wie angegeben, injiziert. Vier Tage später wurden dränierte Lymphknoten (LN) entnommen und die Lymphknotenzellen wurden entweder mit von einem OVA stammenden Peptid, pIC oder pR re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Lymphknotenzellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 2 zeigt die Immunantwort auf das von Ovalbumin stammende Peptid einer kombinierten Injektion von pIC und pR; Mäusen wurden in die Pfotenballen subkutan Mischungen, wie angegeben, injiziert. Vier Tage später wurden dränierte Lymphknoten (LN) entnommen und die Lymphknotenzellen wurden entweder mit von einem OVA stammenden Peptid, pIC oder pR re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Lymphknotenzellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 3 zeigt die Induktion von Ovalbumin-Peptid-spezifischen T-Zellen nach der kombinierten Injektion von pIC und pR; Mäusen wurden in die Pfotenballen subkutan Mischungen, wie angegeben, injiziert. Vier Tage später wurden dränierte Lymphknoten (LN) entnommen und die Lymphknotenzellen wurden entweder mit von einem OVA stammenden Peptid, pIC oder pR re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Lymphknotenzellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 4 zeigt die Immunantwort auf ein von einem TRP-2 stammenden Peptid nach kombinierter Injektion von pIC und pR; Mäusen wurden in die Pfotenballen subkutan Mischungen, wie angegeben, injiziert. Vier Tage später wurden dränierte Lymphknoten (LN) entnommen und die Lymphknotenzellen wurden entweder mit von einem TRP-2 stammenden Peptid, pIC oder pR re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Lymphknotenzellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 5 zeigt die Induktion von T-Zellen, die spezifisch für ein P1A (von einem Mastocytom stammenden) Peptid nach kombinierter Anwendung von pIC und pR sind; Mäusen wurden in die Pfotenballen subkutan Mischungen, wie angegeben, injiziert. Vier Tage später wurden dränierte Lymphknoten (LN) entnommen und die Lymphknotenzellen wurden entweder mit einem P1A-Peptid, pIC oder pR re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Lymphknotenzellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 6 zeigt die Induktion von T-Zellen, die spezifisch für ein von einem OVA stammendes Peptid nach kombinierter Anwendung von Oligo-dIC26 und pR sind; Mäusen wurden in die Pfotenballen subkutan Mischungen, wie angegeben, injiziert. Vier Tage später wurden dränierte Lymphknoten (LN) entnommen und die Lymphknotenzellen wurden entweder mit einem von einem OVA stammenden Peptid, Oligo-dIC26 oder pR re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Lymphknotenzellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 7 zeigt, dass die kombinierte Injektion von von einem OVA stammenden Peptid mit pR und pIC eine systemische Antigen-spezifische T-Zell-Antwort induziert; Mäusen wurden entweder in die Pfotenballen (A) oder in die Flanke (B) subkutan Mischungen, wie angegeben, injiziert. Am Tag 7 nach der Injektion wurde ein IFN-•-ELISPOT-Test mit peripheren Blutleukozyten (PBL's) durchgeführt, die mit einem OVA257-264-Peptid re-stimuliert wurden. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 PBL's ± Standardabweichung von Duplikaten ausgedrückt.
  • 8 zeigt, dass die kombinierte Anwendung von von einem OVA stammenden Peptid mit pIC und verschiedenen polykationischen Verbindungen die Induktion von Peptid-spezifischen T-Zellen stark verbessert. Mäusen wurden in die Pfotenballen subkutan Mischungen, wie angegeben, injiziert. Vier Tage später wurden dränierte Lymphknoten (LN) entnommen und die Lymphknotenzellen wurden entweder mit einem relevanten Peptid (OVA257-264-Peptid), einem irrelevanten Peptid (TRP-2181-188-Peptid), pIC oder der jeweiligen polykationischen Verbindung re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Lymphknotenzellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 9 zeigt, dass die kombinierte Verabreichung von Ovalbumin (OVA) mit pIC und pR die Induktion von OVA-spezifischen T-Zellen stark verbessert. Mäusen wurden in die Pfotenballen subkutan Mischungen, wie angegeben, injiziert. Vier Tage später wurden dränierte Lymphknoten (LN) entnommen und die Lymphknotenzellen wurden entweder mit MHC-Klasse I und II-eingeschränkten OVA-Peptiden oder OVA re-stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Lymphknotenzellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 10 zeigt, dass Poly-L-Arginin (pR) nicht die Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC)-induzierte in vitro Reifung von menschlichen dendritischen Zellen (DC) beeinflusst. Um die phänotypische Reifung zu bestimmen, wurde entweder pIC oder pR, pIC und pR oder, zu Kontrollzwecken, LPS und das Medium allein zu 6-Tage-kultivierten menschlichen dendritischen Zellen hinzugegeben. Eine umfassende phänotypische Analyse der Oberflächenantigene wurde nach 48 Stunden der Stimulation durchgeführt.
  • 11 zeigt, dass die kombinierte Anwendung von von einem OVA stammenden Peptid mit Oligo-dIC26-mer und pR zu einer systemischen, Antigen-spezifischen T-Zell-Antwort führt. Mäusen wurden in die Pfotenballen subkutan Mischungen, wie in der Figurenlegende angegeben, injiziert. Zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Injektion wurden Milzzellen (spleen cells, SC's) oder periphere Blutleukozyten (PBL's) isoliert und mit von OVA stammendem Peptid re-stimuliert. Die Anzahl IFN-γ-produzierender Zellen wurde 24 Stunden später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Duplikaten ausgedrückt.
  • 12 zeigt, dass die kombinierte Anwendung von Ovalbumin (OVA) mit Oligo-dIC26-mer und pR die Induktion von Ovalbumin (OVA)-spezifischen T-Zellen stark verbessert. A) Mäusen wurden in die Pfotenballen subkutan Mischungen, wie angegeben, injiziert. Vier Tage später wurden dränierte Lymphknoten (LN) entnommen und die Lymphknotenzellen wurden entweder mit MHC-Klasse I und II-eingeschränkten von OVA stammenden Epitopen oder OVA restimuliert. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Lymphknotenzellen ± Standard-abweichung von Triplikaten ausgedrückt. B) Zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Injektion wurden periphere Blutleukozyten (PBL's) isoliert und mit OVA257-264-Peptid restimuliert. Die Anzahl der IFN-γ-produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später unter Verwendung eines ELISPOT-Tests bestimmt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 PBL's ± Standardabweichung von Duplikaten ausgedrückt.
  • 13 zeigt, dass die kombinierte Anwendung von Ovalbumin (OVA) mit Oligo-dIC26-mer und pR die Herstellung von OVA spezifischen IgG-Antikörpern verbessert. Mäusen wurden in die Pfotenballen subkutan Mischungen, wie angegeben, injiziert. Am Tag 24 und 115 nach der Injektion wurden Seren entnommen und mittels ELISA auf OVA-spezifische IgG2a- (A) und IgG1- (B) Antikörper gescreent. Die Ergebnisse sind als Antikörpertiter gezeigt. BEISPIELE Beispiel 1 Die kombinierte Injektion von Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) und Poly-L-Arginin (pR) führt zu einer synergistischen Verstärkung der Immunantwort auf von Ovalbumin stammendes Peptid.
    Mäuse C57BL/6 (Harlan/Olac)
    Peptid OVA257-264-Peptid (SIINFEKL), ein MHC-Klasse I-(H-2Kb)-eingeschränktes Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991) wurde synthetisiert, wobei Standard-Festphasen-F-moc-Synthese verwendet wurde, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspek-troskopie auf Reinheit analysiert. Dosis: 300 μg/Maus
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 μg/Maus
    Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) Polyinosin-Polycytidylsäure (Sigma Chemicals, P-0913, Lot 125H4024) mit einem Molekulargewicht von 220 000 bis 460 000 Dosis: 100 μg/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. OVA257-264-Peptid + pIC + pR
    • 2. OVA257-264-Peptid + pIC
    • 3. OVA257-264-Peptid + pR
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Einzelne Zellsuspensionen wurden hergestellt, indem Lymphknoten durch ein 70 μm Zellsieb zerkleinert wurden. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit DMEM-Medium (Life Technologies), das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden in DMEM/5% FCS auf 107 Zellen/ml eingestellt. IFN-γ-ELISPOT-Tests wurden in Triplikaten, wie beschrieben, durchgeführt (Miyahira et al., 1995). Dieses Verfahren ist eine weitverbreitete Vorgangsweise zur Quantifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen. Lymphknotenzellen wurden in vitro entweder mit Ova-Peptid, Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC), Poly-L-Arginin (pR), Concanavalin A (Con A) oder dem Medium allein (Hintergrund) re-stimuliert. Jeder Spot stellt eine einzelne IFN-γ-produzierende T-Zelle dar. Die Spots wurden unter Verwendung eines Biosys-Lesegeräts (Biosys, Deutschland) gezählt. Die Anzahl der Hintergrund-Spots wurde von allen Proben subtrahiert. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 nicht-getrennte Zellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt. Nach Stimulation mit Con A wurden viele Spots nachgewiesen (Daten nicht gezeigt), was auf einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten hinweist. Wie in 1 gezeigt, konnten durch die Injektion von von einem OVA stammenden Peptid mit einer Kombination aus pIC und pR unter einer Million Lymphknotenzellen fast 800 Peptid-spezifische T-Zellen induziert werden. Im Gegensatz dazu führte die Injektionen von Peptid mit einer der Substanzen allein zu keiner Induzierung von Peptid-spezifischen T-Zellen (1). Beispiel 2 Die kombinierte Injektion von pIC und pR führt zu einer Verstärkung der Immunantwort auf von Ovalbumin stammendes Peptid auf Konzentrations-(pIC)-abhängige Weise.
    Mäuse C57BL/6 (Harlan/Olac)
    Peptid OVA257-264-Peptid (SIINFEKL), ein MHC-Klasse I-(H-2Kb)-eingeschränktes Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991) wurde synthetisiert, wobei Standard-Festphasen-F-moc-Synthese verwendet wurde, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert. Dosis: 300 μg/Maus
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 μg/Maus
    Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) Polyinosin-Polycytidylsäure (Sigma Chemicals, P-0913, Lot 125H4024) mit einem Molekulargewicht im Bereich von 220 000 bis 460 000 Dosis: 100, 50, 25 μg/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. OVA257-264-Peptid + pIC 100 μg + pR
    • 2. OVA257-264-Peptid + pIC 50 μg + pR
    • 3. OVA257-264-Peptid + pIC 25 μg + pR
    • 4. OVA257-264-Peptid + pIC 100 μg
    • 5. OVA257-264-Peptid + pR
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Lymphknotenzellsuspensionen wurden hergestellt und IFN-γ-ELISPOTs wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt. Selbst eine sehr geringe Dosis an pIC (25 μg/Maus), injiziert in einer Kombination mit pR plus Peptid führt zur Induktion von Antigen-spezifischen T-Zellen (2). Beispiel 3 Die kombinierte Injektion von pIC und pR führt zu einer Verstärkung der Induktion von Ovalbumin-Peptid-spezifischen T-Zellen auf eine Peptid-Konzentrations-abhängige Weise.
    Mäuse C57BL/6 (Harlan/Olac)
    Peptid OVA257-264-Peptid (SIINFEKL), ein MHC-Klasse I-(H-2Kb)-eingeschränktes Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991) wurde synthetisiert, wobei Standard-Festphasen-F-moc-Synthese verwendet wurde, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspek-troskopie auf Reinheit analysiert. Dosis: 300, 100, 50 μg/Maus
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 μg/Maus
    Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) Polyinosin-Polycytidylsäure (Sigma Chemicals, P-0913, Lot 125H4024) mit einem Molekulargewicht im Bereich von 220 000 bis 460 000 Dosis: 100 μg/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. OVA257-264-Peptid + 300 μg + pIC + pR
    • 2. OVA257-264-Peptid + 100 μg + pIC + pR
    • 3. OVA257-264-Peptid + 50 μg + pIC + pR
    • 4. OVA257-264-Peptid + 300 μg + pIC
    • 5. OVA257-264-Peptid + 300 μg + pR
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Lymphknotenzellsuspensionen wurden hergestellt und IFN-γ-ELISPOTs wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt. Wie in 3 gezeigt, kann eine vergleichsweise starke Immunantwort induziert werden, selbst wenn eine geringere Peptiddosis (100 μg statt 300 μg/Maus) für die Impfung verwendet wird. Beispiel 4 Die kombinierte Injektion von pIC und pR führt zu einer synergistischen Verstärkung der Immunantwort auf ein von einem TRP-2 (Maus-Tyrosinase-verwandtes Protein-2) stammendes Peptid.
    Mäuse C57BL/6 (Harlan/Olac)
    Peptid TRP-2-Peptid (VYDFFVWL), ein MHC-Klasse I-(H-2Kb)-eingeschränktes Epitop von Maus-Tyrosinase-verwandtem Protein-2 (Bloom et al., 1997) wurde synthetisiert, wobei Standard-Festphasen-F-moc-Synthese verwendet wurde, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert. Dosis: 100 μg/Maus
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 μg/Maus
    Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) Polyinosin-Polycytidylsäure (Sigma Chemicals, P-0913, Lot 125H4024) mit einem Molekulargewicht im Bereich von 220 000 bis 460 000 Dosis: 100 μg/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. TRP-2 + pIC + pR
    • 2. TRP-2 + pIC
    • 3. TRP-2 + pR
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Die Herstellung der Lymphknoten und IFN-γ-ELISPOTs wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt. Die Ergebnisse zeigen, dass sich pIC und pR auch synergistisch bei der Induzierung von TRP-2 Peptid-spezifischen T-Zellen (4) verhalten. Beispiel 5 Die kombinierte Anwendung von pIC und pR verstärkt sehr die Induktion von T-Zellen, die spezifisch für ein von einem Mastozytom stammendes Peptid sind.
    Mäuse DBA/2 (Harlan/Olac)
    Peptid Von Maus-Mastocytom P815 stammendes Peptid P1A (LPYLGWLVF), eingeschränkt auf MHC-Klasse I-(H2-Ld) (Lethe et al., 1992) wurde synthetisiert, wobei Standard-Festphasen-F-moc-Synthese verwendet wurde, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert. Dosis: 300 μg/Maus
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 μg/Maus
    Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) Polyinosin-Polycytidylsäure (Sigma Chemicals, P-0913, Lot 125H4024) mit einem Molekulargewicht im Bereich von 220 000 bis 460 000 Dosis: 100 μg/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. P1A-Peptid + pIC + pR
    • 2. P1A-Peptid + pIC
    • 3. P1A-Peptid + pR
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Die Herstellung der Lymphknoten und IFN-γ-ELISPOTs wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt. Wie in 5 gezeigt, induziert die kombinierte Anwendung von pIC und pR auch in einem anderen Maus-Stamm eine starke Antigen-spezifische Antwort. Beispiel 6 Die kombinierte Anwendung von Oligo-dIC26 und pR verstärkt synergistisch die Immunantwort auf von Ovalbumin stammendes Peptid.
    Mäuse C57BL/6 (Harlan/Olac)
    Peptid OVA257-264-Peptid (SIINFEKL), ein MHC-Klasse I-(H-2Kb)-eingeschränktes Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991) wurde synthetisiert, wobei Standard-Festphasen-F-moc-Synthese verwendet wurde, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspek-troskopie auf Reinheit analysiert. Dosis: 300 μg/Maus
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 μg/Maus
    Oligo-desoxy-IC, 26-mer (Oligo-dIC26) Oligo-dIC wurde mittels Standard-Phosphoamidid-Chemie in einer Menge von 4 μmol synthetisiert und mittels HPLC (NAPS Göttingen, Deutschland) gereinigt Dosis: 5 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. OVA257-264-Peptid + Oligo-dIC26 + pR
    • 2. OVA257-264-Peptid + Oligo-dIC26
    • 3. OVA257-264-Peptid + pR
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Die Herstellung der Lymphknoten und IFN-γ-ELISPOTs wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt. Wie in 6 gezeigt, induziert die kombinierte Anwendung von Oligo-dIC26 und pR eine starke Peptid-spezifische T-Zell-Antwort. Beispiel 7 Die Antigen-spezifische Immunantwort auf von Ovalbumin stammendes Peptid, welche durch kombinierte Injektion von Poly-L-Arginin (pR) und Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) induziert ist, ist systemisch.
    Mäuse C57BL/6 (Harlan/Olac)
    Peptid OVA257-264-Peptid (SIINFEKL), ein MHC-Klasse I-(H-2Kb)-eingeschränktes Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991) wurde synthetisiert, wobei Standard-Festphasen-F-moc-Synthese verwendet wurde, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspek-troskopie auf Reinheit analysiert. Dosis: 300 μg/Maus
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals, P-4663, Lot 68H5903; mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht (MW) von 10 000 Dosis: 100 μg/Maus
    Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) Polyinosin-Polycytidylsäure (Sigma Chemicals, P-0913, Lot 109H4037) mit einem Molekulargewicht zwischen 220 000 und 460 000 (durchschnittliche Länge: 500 bp) Dosis: 100 μg/Maus
  • Versuchsgruppen (8 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. OVA257-264-Peptid + pIC + pR
    • 2. OVA257-264-Peptid + pIC
    • 3. OVA257-264-Peptid + pR
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen oder in die Flanke ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen, 100 μl pro Flanke), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Vier Mäuse pro Gruppe wurden 4 Tage nach der Injektion getötet und dränierte Lymphknoten (popliteale und inguinale Lymphknoten für Pfotenballen- bzw. Flankeninjektion) wurden entnommen. Die Herstellung der Lymphknoten und IFN-γ-ELISPOTs wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
  • Wie bereits in vorherigen Beispielen gezeigt, konnte durch die Injektion von einem von OVA-stammenden Peptid in Kombination mit pIC und pR eine starke Peptid-spezifische T-Zell-Antwort am Tag 4 in den dränierten Lymphknoten induziert werden. Um zu untersuchen, ob die Immunantwort, welche durch eine einzige Injektion von Peptid mit pIC/pR induziert wird, systemisch ist, wurde den restlichen Tieren (vier pro Gruppe) Blut von der Schwanzvene zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Injektion entnommen, periphere Blutleukozyten (PBL's) isoliert, entweder mit dem relevanten Peptid, pIC, pR, Con A (positive Kontrolle) oder dem Medium allein (Hintergrund) re-stimuliert und durch die Verwendung eines ELISPOT-Tests die Anzahl an IFN-γ-•absondernden T-Lymphozyten ermittelt. Tests wurden zweifach durchgeführt. Jeder Spot stellt eine einzelne IFN-γ-produzierende T-Zelle dar. Die Spots wurden unter Verwendung eines Biosys-Lesegeräts (Biosys, Deutschland) gezählt. Die Anzahl der Hintergrund-Spots wurde von allen Proben subtrahiert. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Duplikaten ausgedrückt. Nach Stimulation der PBL's mit Con A wurden viele Spots nachgewiesen, was auf einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten hinweist. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Injektion von Peptid mit pIC/pR tatsächlich zu der systemischen Antwort führt, wie am Tag 7 im peripheren Blut (7A, B) beobachtet. Im Gegensatz dazu war am Tag 7, als den Mäusen Peptid und pR oder Peptid und pIC injiziert wurde, fast keine oder nur eine sehr geringe Peptid-spezifische Immunantwort ermittelbar. Die starke systemische Antwort, welche durch eine einzige Injektion von Peptid mit einer Kombination von pR/pIC induziert wurde, nahm innerhalb der nächsten 30 Tage rasant ab.
  • Um zu ermitteln, ob irgendeine der Komponenten des Vakzins eine unerwünschte Wirkung auf den Wirt hat, beispielsweise die Induzierung der systemischen Abgabe von entzündungsfördernden Cytokinen, wurden den Tieren in den Hinterpfotenballen eine der Zusammensetzungen wie vorher erwähnt injiziert, Serum der Mäuse eine Stunde nach der Injektion entnommen und mittels ELISA auf das Vorhandensein von TNF-• und IL-6 gescreent. Weder TNF-• noch IL-6 konnte im Serum einer der Mäuse gefunden werden, egal ob ihnen Peptid/pR, Peptid/pIC oder Peptid und die Kombination beider Substanzen injiziert worden war.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch Injektion von Peptidantigen mit einer Mischung bestehend aus pIC und pR induzierte Antwort systemisch ist. Beispiel 8 Die kombinierte Injektion von Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) und verschiedenen polykationischen Verbindungen verstärkt synergistisch die Immunantwort auf von Ovalbumin stammendes Peptid.
    Mäuse C57BL/6 (Harlan/Olac)
    Peptid OVA257-264-Peptid (SIINFEKL), ein MHC-Klasse I-(H-2Kb)-eingeschränktes Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991) wurde synthetisiert, wobei Standard-Festphasen-F-moc-Synthese verwendet wurde, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspek-troskopie auf Reinheit analysiert. Dosis: 300 μg/Maus
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals, P-4663, Lot 68H5903); mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht (MW) von 10 000 Dosis: 100 μg/Maus
    Poly-L-Lysin (pL) Poly-L-Lysin, Sigma Chemicals, P-6516, Lot 78H5910) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 9500 Dosis: 100 μg/Maus
    Poly-L-Ornithin (pO) Poly-L-Ornithin, Sigma Chemicals, P-4538, Lot 57H5515) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 10 000 Dosis: 100 μg/Maus
    Dieethylaminoethyl-Dextran (DEAE-Dextran) DEAE-Dextran, Chloridform, hergestellt aus Dextran mit durchschnittlichem Molekulargewicht von 500 000; SIGMA Chemicals, D-9885, Lot 39H1323 Dosis: 100 μg/Maus
    Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) Polyinosin-Polycytidylsäure (Amersham Pharmacia Biotech, 27-4732, Lot 6034732012) Dosis: 50 μg/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. OVA257-264-Peptid + pIC + pR
    • 2. OVA257-264-Peptid + pIC
    • 3. OVA257-264-Peptid + pR
    • 4. OVA257-264-Peptid
    • 5. OVA257-264-Peptid + pIC + pL
    • 6. OVA257-264-Peptid + pL
    • 7. OVA257-264-Peptid + pIC + pO
    • 8. OVA257-264-Peptid + pO
    • 9. OVA257-264-Peptid + pIC + DEAE-Dextran
    • 10. OVA257-264-Peptid + DEAE-Dextran
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Lymphknotenzellsuspensionen wurden hergestellt und IFN-γ-ELISPOTs wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt. Wie in 8 gezeigt, führt die Injektion von Peptid in Kombination mit pIC und jeder der oben angeführten polykationischen Verbindungen (pR, pL, pO, DEAE-Dextran) zu der starken Peptid-spezifischen Antwort. Im Gegensatz führte die Injektion von Peptid mit einer der Substanzen allein nicht zur Induzierung von Peptid-spezifischen T-Zellen. Interessanterweise muss eine 50- fach höhere Menge an DEAE-Dextran in Kombination mit pIC verwendet werden wie bei der Injektion von pIC mit jeder anderen der verwendeten polykationischen Verbindungen (pR, pL, pO) verwendet werden, um die selbe Anzahl an Peptid-spezifischen IFN-γ-produzierenden T-Zellen zu induzieren. Beispiel 9 Die kombinierte Injektion von Ovalbumin (OVA) mit Poly-L-Arginin (pR) und Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) verstärkt synergistisch die Ovalbumin-spezifische Immunantwort.
    Mäuse C57BL/6 (Harlan/Olac)
    Ovalbumin (OVA) Ovalbumin vom Hühnerei, Klasse V, SIGMA Chemicals, A-5503, Lot 54H7070 Dosis: 50 μg/Maus
    Peptide OVA257-264-Peptid (SIINFEKL), ein MHC-Klasse I-(H-2Kb)-eingeschränktes dominantes Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991), OVA265-280-Peptid (TEWTSSNVMEERKIKV), ein MHC-Klasse II-(H-2Ab)-eingeschränktes Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991) wurden synthetisiert, wobei Standard-Festphasen-F-moc-Synthese verwendet wurde, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert. Dosis zur Re-Stimulierung von Lymphknotenzellen: 10 μg/ml
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals, P-4663, Lot 68H5903) Dosis: 100 μg/Maus
    Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) Polyinosin-Polycytidylsäure (Amersham Pharmacia Biotech, 27-4732, Lot 6034732012) Dosis: 50 μg/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. OVA + pIC + pR
    • 2. OVA + pIC
    • 3. OVA + pR
    • 4. OVA
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Lymphknotenzellsuspensionen wurden hergestellt und IFN-γ-ELISPOTs wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt. Wie in 9 gezeigt, führt die Injektion von Ovalbumin (OVA) mit entweder pIC oder pR verglichen mit der Injektion von OVA allein zu der Antigen-spezifischen Immunantwort. Wenn jedoch OVA mit einer Mischung von pIC und pR injiziert wird, kann der synergisierende Effekt beider Substanzen beobachtet werden, was zu einer verbesserten Antigen-spezifischen T-Zell-Antwort führt. Es ist wesentlich, dass die IFN-γ-Produktion nicht nur bei Re-Stimulierung mit dem ganzen OVA-Protein nachgewiesen wurde, sondern auch mit beiden, MHC-Klasse I- (OVA257-264) – und II (OVA265-280)-eingeschränkten von OVA stammenden Epitopen (9). Diese Daten zeigen, dass durch die Verwendung der Kombination von pIC und pR nicht nur Peptide sondern auch ganze Proteine als ein Antigen für die Vakzinzusammensetzung verwendet werden können. Beispiel 10 Poly-L-Arginin beeinflusst nicht die Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC)-induzierte in vitro Reifung von dendritischen Zellen.
    Lipopolysaccharid (LPS) Lipopolysaccharid von Escherichia coli; Serotyp 055:B5 (SIGMA Chemicals) Dosis: 1 μg/ml
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals, P-4663, Lot 68H5903 Dosis: 10 μg/ml
    Polyinosin-Polycytidylsäure (pIC) Polyinosin-Polycytidylsäure (Amersham Pharmacia Biotech, 27-4732, Lot 6034732012) Dosis: 10 μg/ml
  • Versuchsgruppen
    • 1. Medium
    • 2. LPS
    • 3. pR
    • 4. pIC
    • 5. pR + pIC
  • Es wurde vorhergehend beschrieben, dass pIC, ähnlich wie bei der Influenza-Virusinfektion, die Reifung humaner dendritischer Zellen (DC) in vitro (Cella et al, 1999; Verdijk et al., 1999) auslöst. Von Human-Monozyten stammende dendritische Zellen (DC) wurden verwendet, um zu untersuchen, wie Poly-L-Arginin diese pIC-induzierte DC-Reifung beeinflusst. Humane dendritische Zellen wurden aus Monozyten erzeugt. Kurz gesagt wurden periphere Blutleukozyten (PBL's) durch Ficoll-Gradient-Zentrifugieren von Buffy Coats gesunder Freiwilliger isoliert. Monozyten wurden aus PBL's unter Verwendung von CD14-beschichteten Magnetkügelchen (Miltenyi Biotec Inc., Deutschland) isoliert, die gemäß den Herstellerinstruktionen aufgebracht wurden. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden > 95% CD14+-Zellen erhalten, wie durch die Durchflusscytometrie ermittelt. Diese CD14+-Monozyten wurden in einem RPMI 1640 Medium unter Zugabe von 10% fötalem Kälberserum (FCS) (PAA Laboratories, Linz, Österreich), nichtessentiellen Aminosäuren, L-Glutamin, Gentamyzin, Natriumpyruvat, 100 ng/ml Human GM-CSF und 500 E/ml Human IL-4 in 6-Well-Gewebeplatten 6 bis 7 Tage lang kultiviert. Zu diesem Zweck enthielten die Kulturen > 80% MHC-Klasse II+/CD1a+-Zellen (= dendritische Zellen).
  • Um die phänotypische Reifung zu ermitteln, wurden 6-Tage-kultivierte dendritische Zellen entweder mit pIC, pR oder mit einer Kombination aus beiden Substanzen 48 Stunden lang stimuliert und auf Expression mehrerer Oberflächenmoleküle durch Durchflusscytometrie analysiert. Zu Kontrollzwecken wurden dendritische Zellen auch mit LPS stimuliert oder unbehandelt gelassen. Wie in 10 gezeigt, induzierte pIC eine Hinauf-Regulierung von HLA-DR, -DQ und HLA-I Molekülen, der co-stimulierenden Moleküle wie CD40, CD54, CD80, der de-novo-Expression von CD86 und der Reifungsmarker CD83 sowie eine Hinunter-Regulierung der CD1a-Moleküle, verglichen zu den unbehandelten dendritischen Zellen. Der Reifungseffekt von pIC war in allen Fällen vergleichbar zu jenem, der durch LPS induziert wurde. Zusätzlich zeigte diese Analyse eine leichte Up-Regulierung von CD11a-, CD11c-, CD13-, CD25-, CD29- und CD50-Antigenen auf dendritischen Zellen bei pIC-Stimulierung. Keine der oben beschriebenen phänotypischen Veränderungen konnte beobachtet werden, wenn die dendritischen Zellen mit pR allein inkubiert wurden. Der Phänotyp dendritischer Zellen, die mit einer Mischung aus pIC und pR stimuliert wurden, war ähnlich demjenigen, der durch pIC allein (10) induziert wurde.
  • Daher hat pIC die Fähigkeit zur Induzierung der Reifung humaner dendritischer Zellen in vitro und pR beeinflusst dieses pIC-induzierte Differenzierungsverfahren nicht. Beispiel 11 Die Antigen-spezifische Immunantwort, welche durch die kombinierte Anwendung von Antigen mit Oligo-desoxyIC26-mer und Poly-L-Arginin (pR) induziert wird, ist systemisch.
    Mäuse C57BL/6 (Harlan/Olac)
    Peptid OVA257-264-Peptid (SIINFEKL), ein MHC-Klasse I-(H-2Kb)-eingeschränktes Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991), wurde synthetisiert, wobei Standard-Festphasen-F-moc-Synthese verwendet wurde, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspek-troskopie auf Reinheit analysiert. Dosis: 300 μg/Maus
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals Dosis: 100 μg/Maus
    Oligo-desoxy-IC, 26-mer (Oligo-dIC26-mer) Oligo-dIC26-mer wurde mittels Standard-Phosphoamidid-Chemie in einer Menge von 4 μmol synthetisiert und mittels HPLC (NAPS Göttingen, Deutschland) gereinigt Dosis: 5 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (8 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. OVA257-264-Peptid + Oligo-dIC26-mer + pR
    • 2. OVA257-264-Peptid + Oligo-dIC26-mer
    • 3. OVA257-264-Peptid + pR
    • 4. OVA257-264-Peptid
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Die Tiere (vier Mäuse/Gruppe) wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Lymphknotenzellsuspensionen wurden hergestellt und IFN-γ-ELISPOTs wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
  • Wie bereits vorher gezeigt, induzierte die kombinierte Anwendung von Peptid mit Oligo-dIC26-mer und pR eine starke Antigen-spezifische Antwort auf von OVA stammendes Peptid am Tag 4 in den dränierten Lymphknotenzellen. Um zu ermitteln, ob die durch eine einzelne Injektion von Peptid mit Oligo-dIC/pR induzierte Immunantwort systemisch ist, wurden die restlichen Mäuse (4 Mäuse/Gruppe) zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Injektion auf die Anwesenheit von Peptid-spezifischen IFN-γ-produzierenden T-Zellen in der Milz oder im peripheren Blut unter Verwendung eines IFN-γ-ELISPOT-Tests untersucht. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Duplikaten ausgedrückt. 11 zeigt, dass die durch die Injektion von von OVA stammendem Peptid mit Oligo-dIC/pR induzierte Antwort systemisch ist und wenigstens bis zum Tag 59 nach der einzigen Injektion (der späteste Zeitpunkt der Untersuchung) anhält. Im Gegensatz dazu konnte die lokale oder systemische Antwort nicht beobachtet werden, wenn das Peptid allein, mit Oligo-dIC26-mer oder pR injiziert wurde.
  • Um zu ermitteln, ob irgendeine Komponente des Vakzins unerwünschte Wirkungen für den Wirt haben könnte, beispielsweise die Induzierung der systemischen Abgabe entzündungsfördernder Cytokine, wurde den Tieren in die Pfotenballen oben erwähnte Kombinationen injiziert, eine Stunde nach Injektion Seren der Mäuse gesammelt und auf TNF-• und IL-6 mittels eines ELISA-Tests gescreent. Weder TNF-• noch IL-6 konnte in dem Serum einer der Mäuse gefunden werden, irrelevant davon, ob ihnen Peptid/pR, Peptid/Oligo-dIC oder Peptid und der Kombination beider Substanzen injiziert worden war.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch Injektion von Peptid-Antigen mit einer Mischung bestehend aus Oligo-dIC und pR induzierte Antwort systemisch ist. Beispiel 12 Die kombinierte Anwendung von Oligo-desoxyIC26-mer und Poly-L-Arginin (pR) verstärkt die Ovalbumin (OVA)-spezifische T-Zellantwort.
    Mäuse C57BL/6 (Harlan/Olac)
    Ovalbumin (OVA) Ovalbumin vom Hühnerei, Klasse V, SIGMA Chemicals, A-5503, Lot 54H7070 Dosis: 50 μg/Maus
    Peptide OVA257-264-Peptid (SIINFEKL), ein MHC-Klasse I-(H-2Kb)-eingeschränktes dominantes Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991), OVA265-280-Peptid (TEWTSSNVMEERKIKV), ein MHC-Klasse II-(H-2Ab)-eingeschränktes Epitop von Hühner-Ovalbumin (Rotzschke et al., 1991) wurden synthetisiert, wobei Standard-Festphasen-F-moc-Synthese verwendet wurde, mittels HPLC gereinigt und mittels Massenspektroskopie auf Reinheit analysiert. Dosis zur Re-Stimulierung von Zellen: 10 μg/ml
    Poly-L-Arginin (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals, P-4663, Lot 68H5903 Dosis: 100 μg/Maus
    Oligo-desoxy-IC, 26-mer (Oligo-dIC26-mer) Oligo-dIC26-mer wurde mittels Standard-Phosphoamidid-Chemie in einer Menge von 4 μmol synthetisiert und mittels HPLC (NAPS Göttingen, Deutschland) gereinigt Dosis: 5 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (8 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. OVA + Oligo-dIC26-mer + pR
    • 2. OVA + Oligo-dIC26-mer
    • 3. OVA + pR
    • 4. OVA
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Injektion getötet, und die poplitealen Lymphknoten wurden entnommen. Lymphknotenzellsuspensionen wurden hergestellt und IFN-γ-ELISPOTs wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt. Wie in 12A gezeigt, führt die Injektion von Ovalbumin (OVA) mit einer Mischung aus Oligo-dIC und pR zu einer verstärkten Antigen-spezifischen T-Zell-Antwort.
  • Es ist wesentlich, dass die IFN-γ-Produktion nicht nur bei Re-Stimulierung mit dem ganzen OVA-Protein nachgewiesen wurde, sondern auch mit beiden, MHC-Klasse I- (OVA257-264) – und II (OVA265-280)-eingeschränkte von OVA stammenden Epitopen (12A).
  • Um des weiteren zu untersuchen, ob die durch eine einzelne Injektion von OVA-Protein mit Oligo-dIC/pR induzierte Immunantwort systemisch ist, wurden die restlichen Mäuse (4 Mäuse/Gruppe) zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Injektion auf die Anwe-senheit von Peptid-spezifischen IFN-γ-produzierenden T-Zellen im peripheren Blut unter Verwendung eines IFN-γ-ELISPOT-Tests untersucht. Die Ergebnisse sind als Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen ± Standardabweichung von Duplikaten ausgedrückt. 12B zeigt, dass die durch die Injektion von OVA mit Oligo-dIC/pR induzierte Antwort systemisch ist und wenigstens bis zum Tag 97 nach Injektion (der späteste Zeitpunkt der Untersuchung) anhält. Im Gegensatz dazu konnte die lokale oder systemische Antwort nicht ermittelt werden, wenn OVA allein, mit Oligo-dIC26-mer oder pR injiziert wurde.
  • Diese Daten zeigen, dass durch Verwendung der Kombination von Oligo-dIC und pR nicht nur Peptide sondern auch ganze Proteine als ein Antigen für die Vakzinzusammensetzung verwendet werden können und dass die durch Injektion von Protein-Antigen mit einer Mischung bestehend aus Oligo-dIC und pR induzierte Antwort systemisch und länger anhaltend ist. Beispiel 13 Die kombinierte Anwendung von Oligo-desoxyIC26-mer und Poly-L-Arginin (pR) verstärkt die Ovalbumin (OVA)-spezifische humorale Antwort.
    Mäuse C57BL/6 (Harlan/Olac)
    Ovalbumin (OVA) Ovalbumin vom Hühnerei, Klasse V, SIGMA Chemicals, A-5503, Lot 54H7070 Dosis: 50 μg/Maus
    Poly-L-Arginin 60 (pR) Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 60 Arginin-Resten; SIGMA Chemicals, P-4663, Lot 68H5903 Dosis: 100 μg/Maus
    Oligo-desoxy-IC, 26-mer (Oligo-dIC26-mer) Oligo-dIC26-mer wurde mittels Standard-Phosphoamidid-Chemie in einer Menge von 4 μmol synthetisiert und mittels HPLC (NAPS Göttingen, Deutschland) gereinigt Dosis: 5 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. OVA + Oligo-dIC26-mer + pR
    • 2. OVA + Oligo-dIC26-mer
    • 3. OVA + pR
    • 4. OVA
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in jeden Hinterpfotenballen ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfotenballen), das die oben erwähnten Verbindungen enthielt, injiziert. Am Tag 24 nach der Injektion wurde Serum entnommen und mittels ELISA auf das Vorhandensein von OVA-spezifischen Antikörpern gescreent. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Injektion von OVA in Kombination mit Oligo-dIC und pR die Produktion von OVA-spezifischen IgG-Antikörpern im Vergleich zur Injektion von OVA mit jeder der Substanzen allein (13A, B) verbesserte. Interessanterweise nahmen die Titer von sowohl IgG2a als auch von IgG1 nach einer einzigen Injektion von OVA mit Oligo-dIC/pR zu, was darauf hindeutet, dass sowohl Th1- als auch Th2-Zellen beteiligt waren. Nach 115 Tagen waren jedoch nur noch die erhöhten IgG2a-Mengen in den Seren von Mäusen, welchen OVA und Oligo-dIC/pR injiziert worden war, detektierbar.
  • Diese Daten zeigen, dass die kombinierte Injektion von OVA mit Oligo-dIC und pR die OVA-spezifische humorale Antwort verstärkt. Diese Antwort ist durch die Produktion von sowohl Th1- als auch Th2-induzierten Antikörper-Isotypen in der frühen Phase, jedoch später hauptsächlich durch Th1-induzierte Antikörper gekennzeichnet.
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Claims (14)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend – ein T-Zell-Epitop, wobei das T-Zell-Epitop ein Peptid ist, das aus 6 bis 20 Aminosäureresten besteht, oder eine Mischung solcher T-Zell-Epitope, – ein polykationisches Peptid, und – eine Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin ausgewählt ist aus Poly-I : Poly-C, Poly-I:C, Poly-dC : poly-dI und Poly-dIC.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das polykationische Peptid ausgewählt ist aus Polyarginin und Polylysin oder einem Polypeptid enthaltend zumindest 50% basische Aminosäure-Reste, insbesondere Arginin- oder Lysin-Reste.
  4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das polykationische Peptid mehr als 5 Reste, vorzugsweise zwischen 10 und 1000, insbesondere zwischen 50 und 500 Reste enthält.
  5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Zell-Epitop von einem Human-, Tier- oder Pflanzen-Pathogen stammt.
  6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Zell-Epitop von einem viralen oder bakteriellen Pathogen stammt.
  7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Zell-Epitop von Pflanzen-Pathogenen stammt.
  8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Zell-Epitop von Parasiten stammt.
  9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das T-Zell-Epitop ein Peptid ist, das aus 7 bis 15, insbesondere 8 bis 11 Aminosäureresten besteht.
  10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie – 1 ng–1 g, insbesondere 1–10 000 μg, T-Zell-Epitop (Peptid), – 1 ng–1 g, insbesondere 0,1–1000 μg, polykationisches Peptid, und – 1 ng–1 g, insbesondere 10 μg–300 mg, Nukleinsäure auf. Basis von Inosin und Cytosin enthält.
  11. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Vakzins.
  12. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Vakzins, das eine systemische Immunantwort induziert.
  13. Set zur Impfung, umfassend eine Komponente, die ein T-Zell-Epitop, wobei das T-Zell-Epitop ein Peptid ist, welches aus 6 bis 20 Aminosäureresten besteht oder eine Mischung solcher T-Zell-Epitopen und ein polykationisches Peptid enthält, und eine Komponente, die eine Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin enthält.
  14. Verwendung eines polykationischen Peptids und einer Nukleinsäure auf Basis von Inosin und Cytosin zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats, welches weiters ein T-Zell-Epitop, wobei das T-Zell-Epitop ein Peptid ist, das aus 6 bis 20 Aminosäureresten besteht, oder eine Mischung solcher T-Zell-Epitope enthält, zum Hervorrufen einer Epitop-spezifischen T-Zell-Antwort gegen das T-Zell-Epitop oder die Mischung solcher T-Zell-Epitope.
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