WO2007129218A2 - Peptidos para detectar o inducir la produccion de anticuerpos anti el virus de papiloma humano, anti la proteina l1 o anti peptidos de esta proteina - Google Patents

Peptidos para detectar o inducir la produccion de anticuerpos anti el virus de papiloma humano, anti la proteina l1 o anti peptidos de esta proteina Download PDF

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    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Definitions

  • the invention relates to peptides useful for detecting human papillomavirus (HPV) infection by detecting specific antibody antigen compounds in immunoassays.
  • the immunoreactive peptide antigens are synthetically produced from the sequence of the L1 amino acid protein of the viral types VPH-16, VPH18, VPH-31 and HPV-58. More specifically, the invention covers three peptides. Peptide 1, defined by SEQ ID NOS.
  • the invention is also related to methods for detecting antibodies induced by the human papillomavirus, the L1 protein or peptides of this protein, particularly using peptides to detect HPV infection.
  • the human papillomavirus belongs to the group of DNA viruses, of the Papillomaviridae family; HPV is a non-enveloped, icosahedral virus consisting of circular double-stranded DNA with an approximate diameter of 52-55 nm.
  • the genome is made up of an average of 8,000 base pairs protected by a capsid, which consists of 360 copies of L1 organized in 72 pentamers and 7 icosahedral sides, with small inclusions of the minor protein of the L2 capsid.
  • the two proteins When the two proteins are expressed, they are incorporated into the capsid, in an L1 / L2 ratio of 5: 1, indicating that only one L2 molecule interacts with a pentamer of L1.
  • This union between these proteins has important characteristics for the encapsulation of the HPV viral genome (1).
  • the complete virion is excreted from the surface of the skin and mucous lesions of infected people. Additionally, this virus replicates and multiplies in the nucleus of epithelial cells (1) Genetic fragments with an open reading frame are located in a single strand of DNA, which are classified as early (E) and late (L) genes. ) according to the activation, DNA replication and RNA transcription during the evolution of the infection.
  • E genes encode the regulatory proteins (E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7 and E8) necessary for the replication, transcription and cyto-transformation processes, Furumoto, H. et al. J Med Invest. 49: 124-33 (2002).
  • E1 initiates DNA replication
  • E2 regulates the transcription and replication of DNA
  • E4 that encodes the late NS protein and apparently breaks the cytoskeleton
  • E5 acts as a transforming protein interacting with cell growth factors
  • E6 acts as a transforming protein by joining p53 delaying its degradation
  • E7 acts as a transforming protein by binding to pRb. From E3 and E8 a specific function is not yet known (2-3).
  • the L genes encode the major proteins of the viral capsid (L1 and L2) that assemble new virions in the upper skin layers (1).
  • the main protein of the capsid is L1, which comprises more than 90% of the virion proteins, is the main component of the virus surface, weighs 56 kDa and is able to associate forming virus-like particles.
  • HPVs produce squamous proliferative lesions of the skin and mucous membranes.
  • These viruses generate various diseases, such as: plantar warts (HPV types 1, 2, 4, 64), common warts (HPV types 1, 2, 4, 26, 27, 29, 41, 57, 65, 77), warty lesions of the upper and lower lips (type 2), conjunctival papillomas (types 6 and 11), accumulated condyloma (HPV types 6, 11, 30, 42, 42, 44, 45, 51), high-grade intraepithelial neoplasia (HPV types 6, 11, 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 42, 44, 45, 51, 52, 56, 58, 66), cervical cancer (HPV types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 66, 68, 70), lary
  • HPV Human papillomavirus
  • types HPV-16, HPV-18, HPV- 31, HPV-33, HPV-45 and HPV-58 which infect the epithelium of the genital region, cause a proliferative disease of the infected epithelium and are responsible for more than 90% of cervical cancers (2).
  • Papillomavirus is found in 50% of cancers of the anus, penis and vulva and in 10-20% of oral and pharyngeal carcinomas; Other sporadically associated carcinomas are: esophagus, stomach, colon, bladder and prostate (13-14).
  • Different HPV genotypes can be classified as high risk (types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 82) or low risk (HPV types 6, 11, 26, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 55, 62 and 66) according to their ability to induce histological changes of squamous carcinoma. While genotype 16 is most frequently associated in squamous cell carcinomas (6, 24, 25), genotype 18 is associated with adenocarcinomas (15).
  • vaginal cytology In most countries of the world, vaginal cytology is used, with exo-endocervix sampling for histopathological analysis of tissue abnormalities. Slight changes in cervical cells, such as acanthosis, poikilocytes, etc; they can suggest the presence of HPV infection generally in latent or chronic infections. Depending on the results, a Colposcopy study is performed, which allows visualizing the so-called epithelial atypia (abnormal-looking tissue); if present, a small sample of the tissue (biopsy) is taken for histological study and to determine in which category is the lesion caused by HPV.
  • epithelial atypia abnormal-looking tissue
  • cytology has two major drawbacks that have impeded greater efficacy in the detection of women at risk of developing cervical cancer; first the coverage that in the best case reaches only 20% and second the sensitivity is low (between 40 and 75%), which means that many women are not detected in time.
  • the detection of oncogenic HPV infection could be an effective way to identify cancer victims or those who are at high risk of developing the disease. This detection would facilitate early detection of cancer or cellular abnormalities suggestive of cancer at a point of time where there is a greater feasibility of cure.
  • People infected with high-risk HPV are prone to develop a carcinoma associated with these HPV; especially women who have a persistent infection with HPV in the cervix.
  • the rapid detection of persistent high-risk HPV infection in symptomatic or asymptomatic women allows prompt therapeutic action in order to seek resolution of the disease and prevention of cervical cancer.
  • Efforts have been made to develop an assay that complements cytology screening. Taking into account that HPV is the causative agent of cervical tumors, a screening test for women at risk of developing cervical cancer is the detection of HPV DNA (the most commonly used is the viral hybrid capture), with sensitivity between 97-100% and specificity is between 87-95% for the identification of the virus.
  • HPV DNA the most commonly used is the viral hybrid capture
  • the identification of the DNA of the virus has significantly increased the ability to identify women at risk of cervical cancer.
  • the majority of infected women will never develop the disease since in 80% of these women the infection will be transient and subsequently involve; The remaining 20% may suffer some degree of cervical intraepithelial neoplasia (CIN).
  • the inventors trying to find a solution to this problem where they have identified three peptides of the HPV-16 L1 protein that are specifically recognized by between 92 and 98% of the sera of women with cervical lesions (IAS I to IAS III) or invasive cervical cancer and only recognize among 3% of women with normal cytology.
  • the present invention contemplates the sequences and the use of three polypeptides; peptide 1, peptide 2 and peptide 3 (one of each of the columns of Table 1) for the detection of anti-HPV antibodies, according to the sequences reported in Table 1 and those sequences that by truncation or elongation are recognized by the antibodies that the peptides reported in Table 1.
  • amino acid sequence of the peptides of The present invention does not necessarily need to be identical to the amino acid sequence of the HPV L1 protein; but this invention contemplates peptides that contain part of the sequence reported in Table 1, that react with HPV-induced antibodies or that these peptides by immunization are capable of producing an antiserum containing antibodies that react with HPV L1 protein; These peptides contain less than 50 residue amino acid residues that contain at least one of the sequences reported above. Therefore, a peptide of the present invention can be subject to several changes such as insertions, omissions or substitutions (conservative or non-conservative), where such changes provide certain advantages of use present in human fluids.
  • Conservative substitutions are those where an amino acid residue is exchanged for another physicochemically similar residue.
  • the term "conservative substitution” also includes the use of modified amino acids.
  • the peptides of the present invention may contain an amino acid such as Cysteine, Usine, Tyrosine, Glutamic or Aspartic Acid in order to polymerize it or adhere it to a solid material or to a transport molecule. Taking into account that the antibodies recognize at least six amino acid residues of the peptide sequence the present invention contemplates peptides containing at least six amino acids of the sequence reported in Table 1.
  • the peptides of the present invention can be synthesized by some of the known techniques. In this particular case, the solid phase chemical synthesis is the preferred one for reasons of cost and purity.
  • the general formula of the peptides of the present invention is:
  • J represents a sequence of at least six amino acids of the peptides reported in the table;
  • B represents a Hydrogen, an acetyl radical or at least one amino acid residue and
  • O represents a Hydroxyl, an amide radical or at least one amino acid
  • Preferred peptides of the following invention come from the L1 protein sequences of high-risk HPV types 16, 18, 31, 33, 45 and 58.
  • the selection of peptide sequences of types other than 16 and 18 was carried out taking into account that the immunoreactive regions of these other viruses must be those that have homology and are located in Ia same relative region. In connection with this, it is not entirely obvious that the immunoreactive regions and the combination of these three increase the specificity of the test. The approach for the discovery of these regions has been very different from that previously used for the definition of B epitopes within HPV proteins. It should be emphasized that in no example of those presented here for the selection of the peptides of the present invention was any type of computer algorithm or other type of methods previously described used for the selection of immunodominant regions within the L1 I HPV protein .
  • Amino Acids All the amino acids mentioned in this document are in the native configuration L. The amino acids are mentioned with the standard abbreviations of a letter as it appears in Table 1.
  • Peptide designates molecules formed by linearly linked amino acid sequences that can be obtained by chemical synthesis, protein expression or genetic engineering
  • the detection system in Kit includes; a sufficient amount of one of the aforementioned peptides, which may be solid, in solution, adhered to a solid support; It also includes instructions for use.
  • the detection system also includes a "label” or “means” to detect the formation of the antibody antigen complex.
  • label or “means” to detect the formation of the antibody antigen complex.
  • brand or “medium” is meant atoms or molecules that are directly or indirectly involved in the generation of a signal that allows to detect the formation of the antibody antigen complex; for example an anti-immunoglobulin G antibody to which an enzyme such as peroxidase has been covalently bound.
  • Such "marks” or “means” are well known in the antibody detection chemistry, they are not part of this invention but are used as part of the mechanism of detection of the complexes formed by the peptides of the present invention and the antibodies.
  • Detection of anti-HPV antibodies Several methodologies can be used, in particular this invention contemplates an ELISA format to detect the presence of antibodies in a sample of body fluid such as serum, plasma, vaginal secretions or urine.
  • a sample of body fluid such as serum, plasma, vaginal secretions or urine.
  • the peptide (antigen) or the antibody immobilized on a solid support and an antibody enzyme or antigen enzyme conjugate is used to detect the antibody present in the sample
  • Peptide Synthesis The synthesis of solid phase peptides will be carried out by means of the t-Boc strategy.
  • the coupling of the amino acids will be carried out on the polymeric support, in the case of the first amino acid, or on the last one coupled for the following amino acids, using activated amino acids.
  • Activation of the carboxyl group is obtained by formation of an ester by treatment with activators such as dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1- Hydroxybenzotriazole (HOBt), phosphonium salts (BOP, PyBOP), uranium salts (TBTU, HATU, HBTU) or by combination of these.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • HOBt 1- Hydroxybenzotriazole
  • BOP phosphonium salts
  • uranium salts TBTU, HATU, HBTU
  • This activation and coupling process is carried out using solvents such as DCM, DMF, DMA and NMP.
  • the reaction control is carried out by means of the Ninhydrin test (53). Once the amino acid is coupled, it is necessary to remove the protective group from its ⁇ -amino end with reaction with TFA, to allow coupling of the next amino acid. When the synthesized sequence is already had and in the cases that are necessary, the coupling of the acetyl groups will be carried out.
  • the protective groups of the side chains will be removed using Hydrogen Fluoride (HF 25%) in DMS and the resin peptide with HF (95%) (54); the synthesized peptides will be characterized by reverse phase HPLC, in a LaChrom Merck Hitachi device and in analytical column C18, C8, C4, using acetonitrile and water as the mobile phase. Desalination of the peptides will be done in a column of Superdex-PeptideD (Amersham-Pharmacia), Quattricchi O. et al. Introduction to HPLC. Application and practice, Farro Graphics, Bueno Aires, Argentina (1992).
  • Each of the peptides from the L1 proteins will be adsorbed and incubated in 96-well ELISA boxes at a concentration of 10 ⁇ g / ml 1X PBS, the VLPs at a concentration of 5mg / ml in 1X PBS at 4 ° C throughout night. Once the incubation time is over, the peptide that has not adhered with a wash buffer (1% PBS-Tween 20) will be removed. Non-specific binding sites will be blocked with 200 ul / well of 1% PBS-1% BSA for 2H at 37 ° C.
  • Each of the peptides from the L1 protein (10 ⁇ g / ml) will be adsorbed and incubated in 96-well ELISA boxes. After the incubation time is over, the peptide that has not adhered with wash buffer (PBS-Tween 20) will be removed. To bite non-specific binding sites, they will be incubated with blocking buffer (4% skim milk in PBS-Tween). Parallel to this, the sera will be incubated for one hour with peptides or with VLPs. Then 100 ⁇ l of these sera will be incubated in the boxes already locked for 1 hour.
  • wash buffer PBS-Tween 20
  • blocking buffer 4% skim milk in PBS-Tween
  • the wells will be washed with wash buffer and incubated with the secondary antibody (peroxidase-labeled rabbit anti-lgG) diluted 1 : 5000 in blocking buffer. After this a new wash will be done and each well will be added developer (TMB MR ). To block the reaction, 1N phosphoric acid will be added. The anti-peptide activity will detect the optical density at 450 nm (57).
  • Antiseptic sera will be adsorbed and incubated in 96-well ELISA boxes at 4 ° C overnight. Once the incubation period is over, the serum that has not adhered with a wash buffer (PBS-Tween 20) will be removed. To bite non-specific binding sites, they will be incubated with blocking buffer (4% skim milk in PBS-Tween). It was then incubated with peptide dilutions for 1 hour at 37 ° C. At the end of the incubation time the wells will be washed with wash buffer and incubated with an enzyme-labeled antiseptic serum. After this a new wash will be done and each well will be added developer (TMB MR ). To block the reaction of adding 1 N phosphoric acid. The anti-peptide activity will detect the optical density at 450 nm (57).
  • TMB MR enzyme-labeled antiseptic serum
  • the sheets should be washed with PBS and covered with a solution (1: 1) of glycerol-PBS, covering each reaction well with foil. Once the procedure is finished, the fluorescence of each well will be detected with the use of the fluorescence microscope. All incubations were performed in a humid chamber.
  • peptides 18283, 18294 and 18301 were chosen to be tested against 313 sera from patients with normal cytology, intraepithelial neoplasia I, II, III or cervical cancer; taking into account that they presented the greatest reactivity with the pool of sera of patients with IAS ll / lll.
  • the ELISA results obtained with the peptides 18283, 18294 and 18301 and using as controls the 18295 peptide and virus-like particles assembled from the L1 protein are shown in Figure 3.
  • seropositive those sera that present a value of optical density greater than the average of the optical densities obtained with the sera of women with normal cytology plus two standard and seronegative deviations those that give less than this value, is the following: 2.4%, 3.6%, 6.0% and 1.8% of the sera of women with normal cytology are seropositive using peptides 18283, 18294, 18301 and VLPs and more than 71% of the sera of women with cervical injury or cervical cancer They are seropositive (Table 2).
  • the sensitivity and specificity of each of the peptides and the VLPs were determined to discriminate between sick women (I-lll and cervical cancer) and healthy women (women with normal cytology).
  • the sensitivity for each of the three peptides is greater than 90%, and the specificity is greater than 89%, comparable with the sensitivity and specificity obtained using VLPs (Table 3).
  • Table 3 ELISA for detecting risk of developing cervical lesion associated with HPV or cervical cancer
  • cervical cell samples were obtained from the 313 women included in the study (from which blood samples were obtained); 104 of women with cervical injury or cervical cancer and 141 of women with normal cytology.
  • HPV type 16 DNA was found in the samples of 23 women; 19 of which belong to the group of women with cervical lesion (LC) or cervical cancer and 4 to the normal cytology group.
  • 21 and 20 were seropositive with peptides 18283, 18294 and 18301, respectively; of which 2, 3 and 3 of the seropositive with peptides 18283, 18294 and 18301, respectively, belong to the group of women with normal cytology.
  • HPV type 18 was found in two women, one diagnosed with cervical cancer and who became seropositive with the three peptides and the other with normal cytology that gave seronegative with the three peptides. Ten women infected with other types of HPV were found, all of the group of women with normal cytology; All were seronegative. Additionally, 60 women were detected with HPV DNA but were not typed; of these 47, 45 and 46 were seropositive with peptides 18283, 18294 and 18301, all belonging to the group of women with cervical injury or cervical cancer. The others were seronegative and belonging to the group of women of normal cytology (Table 4).
  • Peptides 18283, 18294, 18301 and VLPs were immunized in New Zealand rabbits; sera obtained after the third immunization were tested by ELISA against the antigen that was immunized and against VLPs.
  • these peptides are immunogenic, inducing high antibody titers comparable to those obtained with VLPs (greater than 102,000); additionally, antibodies induced by these peptides recognize type 16 VLPs and antibodies induced by VLPs recognize these peptides although with low titers (about 5,600).
  • FIG. 1 Accessible surface area of the L1 protein peptides. This area was calculated using the GETAREA program, based on the coordinates of the L1 protein (Protein Data Bank access number 1 DZL).
  • FIG. 1 ELISA results of L1 peptides.
  • the L1 peptides were tested in ELISA assay against two sera pools; one formed by serum of women with IAS ll / lll (black bars) and the other by serum of women with normal cytology (white bars). The results are given at optical densities using a serum dilution of 1: 100. VLPs were used as a positive control.
  • FIG. 3 ELISA results for peptides 18283, 18294 and 18301 against 313 patient sera, 165 patients with normal cytology (NORMAL), 23 with intracervical neoplasia I (IAS I), 14 with IAS II, 41 IAS III and 70 with invasive cervical carcinoma (ICC). Each patient serum was tested in ELISA against peptides 18283, 18294 and 18301; VLPs-16 were used as a positive control and peptide 18295 as a negative control.
  • the points represent the optical density (OD), obtained from the ELISA of sera with cervical lesion or from patients with cervical cancer (black dots) or using patient sera of normal cytology (gray dots).
  • Each serum was analyzed in triplicate and the average value is represented in this figure, the standard deviation was always lower than 10% of the average value.
  • On the X axis the sera were organized according to the ODs from the lowest to the highest value.
  • FIG. 4 Results of average ELISA using peptides 18283, 18294, 18295 and 18301 and VLPs.
  • the graph shows the average and standard deviation of the results using the 313 sera mentioned above; 165 patients with normal cytology (NORMAL), 23 with cervical intraepithelial neoplasia I (NIC I), 14 with cervical intraepithelial neoplasia II, 41 with cervical intraepithelial neoplasia III (NIC III) and 70 with cervical cancer.
  • NNMAL normal cytology
  • NIC I cervical intraepithelial neoplasia I
  • NIC III cervical intraepithelial neoplasia III
  • FIG. 5 ELISA results using sera from New Zealand rabbits immunized with peptides 18283, 18294, 18301 or VLPs. Each rabbit was immunized with an antigen; rabbits 393 and 398 immunized with peptide 18283, rabbits 399 and 400 with peptide 18294, rabbit 391 with peptide 18301 and rabbit 439 with VLPs type 16. Pl is the serum of the respective rabbit obtained before the first immunization . On the X axis, the serum dilutions used in the ELISA are shown and on the Y axis the optical densities obtained.

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Abstract

La invenciòn se refiere a peptidos ùtiles para detectar infecciòn por papiloma virus humano (VPH) detectando compuestos antfgeno anticuerpos especfficos en inmunoensayos. Los antfgenos peptfdicos inmunorreactivos son producidos sinteticamente de Ia secuencia de Ia protefna de aminoacidos L1 de los tipos virales VPH-16, VPH18, VPH-31 y VPH-58. Mas especificamente Ia invenciòn cubre tres peptidos. Peptido 1, definido por SEQ ID NOS. 18283-16, 18283-31, 18283-33, 18283-58, 18283-18 o 18293-45; Peptido 2, definido por 18294-16a, 18294-31, 18294-33, 18294-58, 18294-18, 18294-45 o 18294-16b; El peptido 3, definido por SEQ ID NOS. 18301-16a, 18301-31, 18301 -33, 18301 -58, 18301- 18, 18301 -45 o 18301 -16b; o peptidos que contengan parte de estas secuencias que reaccionen con anticuerpos inducidos por VPH, Ia protefna L1 de VPH o peptidos derivados de Ia protefna L1 de VPH. La invenciòn tambien esta relacionada a metodos para detectar anticuerpos inducidos por el papiloma virus humano, Ia protefna L1 o peptidos de esta protefna, particularmente usando peptidos para detectar infecciòn por VPH.

Description

Titulo de Ia invención: Péptidos para detectar o inducir Ia producción de anticuerpos anti el virus de papiloma humano, anti Ia proteína L1 o anti péptidos de esta proteína.
Breve descripción de Ia invención
La invención se refiere a péptidos útiles para detectar infección por papiloma virus humano (VPH) detectando compuestos antígeno anticuerpos específicos en inmunoensayos. Los antígenos peptídicos inmunorreactivos son producidos sintéticamente de Ia secuencia de Ia proteína de aminoácidos L1 de los tipos virales VPH-16, VPH18, VPH-31 y VPH-58. Más específicamente Ia invención cubre tres péptidos. Péptido 1 , definido por SEQ ID NOS. 18283-16, 18283-31 , 18283-33, 18283-58, 18283-18 o 18293-45; Péptido 2, definido por 18294-16a, 18294-31 , 18294-33, 18294-58, 18294-18, 18294-45 o 18294-16b; El péptido 3, definido por SEQ ID NOS. 18301 -16a, 18301-31 , 18301-33, 18301-58, 18301- 18, 18301-45 o 18301 -16b; o péptidos que contengan parte de estas secuencias que reaccionen con anticuerpos inducidos por VPH, Ia proteína L1 de VPH o péptidos derivados de Ia proteína L1 de VPH. La invención también esta relacionada a métodos para detectar anticuerpos inducidos por el papiloma virus humano, Ia proteína L1 o péptidos de ésta proteína, particularmente usando pétidos para detectar infección por VPH. EL virus del papiloma humano pertenece al grupo de los virus ADN, de Ia familia Papillomaviridae; el VPH es un virus sin envoltura, icosahédrico constituido por ADN circular de doble cadena y diámetro aproximado de 52-55 nm. El genoma esta conformado por un promedio de 8.000 pares de bases protegido por una cápside, Ia cual consiste de 360 copias de L1 organizadas en 72 pentámeros y 7 lados icosahédricos, con pequeñas inclusiones de Ia proteína menor de Ia cápside L2. Cuando las dos proteínas son expresadas, se incorporan en Ia cápside, en una relación L1/L2 de 5:1 , indicando que solo una molécula L2 interactúa con un pentámero de L1. Esta unión entre estas proteínas posee importantes características para Ia encapsulación del genoma viral del VPH (1). El virión completo es excretado de Ia superficie de las lesiones cutáneas y mucosas de las personas infectadas. Adicionalmente, este virus se replica y multiplica en el núcleo de las células epiteliales (1) Los fragmentos genéticos de con marco de lectura abierta se localizan en una sola cadena del ADN, las cuales se clasifican como genes tempranos (E) y tardíos (L) de acuerdo a Ia activación, replicación de ADN y trascripción a ARN durante Ia evolución de Ia infección. Los genes E codifican las proteínas reguladoras (E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7 y E8) necesarias para los procesos de replicación, trascripción y cito-transformación, Furumoto, H. et al. J Med Invest. 49:124-33 (2002). E1 inicia la replicación de ADN, E2 regula Ia trascripción y Ia replicación del ADN, E4 que codifica Ia proteína tardía NS y aparentemente rompe el citoesqueleto, E5 actúa como proteína transformante interactuando con los factores de crecimiento celular, E6 actúa como proteína transformante uniéndose a p53 retardando su degradación y E7 actúa como proteína transformante uniéndose a pRb. De E3 y E8 no se conoce aun una función específica (2-3).
Los genes L codifican las proteínas mayores de Ia cápside viral (L1 y L2) que ensamblan nuevos viriones en las capas cutáneas superiores (1). La proteína principal de Ia cápside es L1 , que comprende más de 90% de las proteínas del virión, es el principal componente de Ia superficie del virus, pesa 56 kDa y es capaz de asociarse formando partículas similares al virus.
Los VPHs producen lesiones proliferativas escamosas de Ia piel y las mucosas. Existen más de 150 tipos humanos, clasificados mediante Ia comparación de las secuencias de nucleótidos de regiones de replicación temprana (E) y tardía (L), (4). Estos virus generan diversas enfermedades, así: verrugas plantares (VPH tipos 1, 2, 4, 64), verrugas comunes (VPH tipos 1, 2, 4, 26, 27, 29, 41 , 57, 65, 77), lesiones verrugosas de los labios superior e inferior (tipo 2), papilomas conjuntivales (tipos 6 y 11), condiloma acuminado (VPH tipos 6, 11, 30, 42, 42, 44, 45, 51), neoplasia intraepitelial de alto grado (VPH tipos 6, 11, 16, 18, 31 , 33, 34, 35, 39, 42, 44, 45, 51 , 52, 56, 58, 66), cáncer cervical (VPH tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 66, 68, 70), papilomas laríngeos y enfermedad respiratoria crónicas en neonatos (VPH tipos 6 y 11), hiperplasia local de Heck (VPH tipos 13 y 32) y papilomas conjuntivales (VPH tipos 6, 11 , 16) (5-11). Los virus de papiloma humano (VPH), tipos VPH-16, VPH-18, VPH- 31 , VPH-33, VPH-45 y VPH-58, que infectan el epitelio de Ia región genital, causan una enfermedad proliferativa del epitelio infectado y son los responsables de mas del 90% de los cánceres de cuello uterino (2). En inmunodeficientes y trasplantados las lesiones son mas numerosas y complejas, por ejemplo: en pacientes VIH+ inducen clínica similar a pitirlasis versicolor, identificándose ADN de papiloma virus, adicionalmente Epidermo Displasia Verruciforme (una rara enfermedad autosómica recesiva caracterizada por pobre respuesta inmune contra papiloma virus), y aumento en Ia incidencia de cáncer de cuello uterino, vagina y ano, este ultimo principalmente en pacientes VIH+ homosexuales (12). Los papiloma virus tipo 5 y 8 inducen cáncer de piel en áreas expuestas al sol. Los papiloma virus se encuentran en el 50% de los canceres de ano, pene y vulva y en 10-20% de carcinomas orales y faríngeos; otros carcinomas esporádicamente asociados son: esófago, estomago, colon, vejiga y próstata (13-14). Los diferentes genotipos del VPH puede clasificarse como de alto riesgo ( tipos 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 82) o de bajo riesgo (VPH tipos 6, 11, 26, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 55, 62 y 66) según su capacidad de inducir cambios histológicos de carcinoma escamoso. Mientras el genotipo 16 se asocia con mayor frecuencia en carcinomas escamocélulares (6, 24, 25), el genotipo 18 se asocia a adenocarcinomas (15).
La construcción de una respuesta neutralizante de anticuerpos contra el VPH de alto riesgo en Ia sangre parece proteger a Ia mujer de adquirir las lesiones NIC (24). Solamente un 20% de las mujeres con infección con VPH de alto riesgo desarrollarán lesiones NIC y la gran mayoría de estas también eliminarán el virus, Io cual subsecuentemente resulta en Ia desaparición de Ia lesión, (5-11). De hecho, el dominio externo de Ia proteína L1 es el blanco de anticuerpos neutralizantes, capaces de inhibir el proceso de invasión del virus; ya que esta proteína esta implicada en Ia invasión del virus a las células epiteliales (16, 19); Ia inducción de anticuerpos contra esta proteína en muchos casos esta correlacionada con protección contra Ia infección en el modelo animal (16-19) y en humanos; de hecho las vacunas profilácticas en fase de desarrollo son basadas en esta proteína (para una revisión ver ref. 20). La mayoría de mujeres infectadas con VPH montan una respuesta de anticuerpos, principalmente dirigidas contra epítopes de Ia proteína L1, (16-19). Entre las mujeres con infección incidente con VPH entre 50 y el 70% se seroconvierten dentro de los 18 meses siguientes a Ia detección de ADN de VPH. El tiempo medio de seroconversión desde Ia detección de ADN es de 11.8 meses para VPH 16 y para VPH 18 12.6 meses, pocas seroconversiones ocurren después de 18 meses después de detectado el ADN (21-25); Ia positividad de anticuerpos refleja Ia persistencia de Ia infección viral que puede incrementar el riesgo de progresión maligna de cuello uterino; 70% de los pacientes que presentan una infección persistente muestran una serología positiva, ya que hay una probabilidad mayor de que las proteínas de cápside interactúen con el sistema inmune, (21-25). Se ha reportado que alrededor del 60% de las mujeres infectadas con VPH determinado por PCR, el 75% de los sueros de mujeres con displasias severas, el 56% de los pacientes con cáncer cervical, el 39% de las pacientes con lesiones preinvasivas, el 6% de los sueros de las pacientes no infectadas y un 9% de las mujeres infectadas con virus de bajo riesgo (VPH6, 11) presentan anticuerpos específicos contra VLPs tipo 16. En general, después de desaparecer Ia infección, se observa que Ia reactividad de los anticuerpos contra VLPs disminuye (23); se ha reportado que los niveles de anticuerpos contra las proteínas E6 y E7 del VPH se incrementan en los sueros de pacientes con estados avanzados de cáncer cervical y están correlacionados con el estado clínico de Ia enfermedad, (23). Los datos demuestran una asociación entre Ia presencia de anticuerpos anti-VPH y el incremento en el riesgo de cáncer cervical (26).
En Ia mayoría de los países del mundo se utiliza Ia citología vaginal, con muestreo de exo-endocervix para análisis histopatológico de las anormalidades tisulares. Leves cambios en las células cervicales, como Ia acantosis, los poiquilocitos, etc; pueden sugerir Ia presencia de infección por VPH generalmente en las infecciones latentes o crónicas. Dependiendo de los resultados, se realiza un estudio de Colposcopia, el cual permite visualizar las llamadas atipias epiteliales (tejido de aspecto anormal); de estar presente, se toma una pequeña muestra del tejido (biopsia) para su estudio histológico y determinar dentro de qué categoría se encuentra Ia lesión causada por el VPH. Sin embargo, Ia citología presenta dos grandes inconvenientes que han impedido una mayor eficacia en Ia detección de mujeres en riesgo de desarrollar cáncer de cuello uterino; primero Ia cobertura que en el mejor de los casos alcanza apenas el 20% y segundo Ia sensibilidad es baja (entre 40 y 75%) Io que hace que muchas mujeres no sean detectadas a tiempo. Hay un consenso entre Ia comunidad médica que Ia detección de infección por VPH oncogénicos podría ser una forma efectiva para identificar victimas de cáncer o aquellas personas que están en alto riesgo de desarrollar Ia enfermedad. Esta detección facilitaría una detección temprana de cáncer o anormalidades celulares sugestivas de cáncer en un punto del tiempo donde existe una mayor factibilidad de cura. Las personas infectadas con VPH de alto riesgo están propensas a desarrollar un carcinoma asociado a estos VPH; en especial las mujeres que presentan una infección persistente con VPH en el cuello del útero. La rápida detección de infección persistente por VPH de alto riesgo, en las mujeres sintomáticas o asintomáticas, permite una pronta acción terapéutica con el fin de buscar Ia resolución de Ia enfermedad y Ia prevención de cáncer de cuello uterino.
Se han hechos esfuerzos para desarrollar un ensayo que complemente Ia tamización por citología. Teniendo en cuenta que el VPH es el agente causal de los tumores del cuello uterino una prueba de tamización de las mujeres en riesgo de desarrollar cáncer de cuello uterino es Ia detección del ADN del VPH (el mas usado es Ia captura híbrida viral), con sensibilidad entre 97-100% y especificidad esta entre el 87-95% para Ia identificación del virus. La identificación del ADN del virus ha incrementado significativamente Ia capacidad de identificar mujeres en riesgo de contraer cáncer de cuello uterino. Sin embargo, Ia mayoría de las mujeres infectadas nunca desarrollarán Ia enfermedad ya que en el 80% de estas mujeres Ia infección será transitoria y posteriormente involucionará; el 20 % restante puede sufrir algún grado de neoplasia intraepitelial cervical (NIC). Esto hace que Ia detección de ADN del VPH no cuente con el poder epidemiológico deseado para una prueba de tamización masiva. Diversos investigadores han reportado variación entre Ia sensibilidad y especificidad de los resultados obtenidos entre el 80-90%. Esta prueba es más sensible que Ia citología (sensibilidad de 97-100% con una especificidad del 87-95%), pero tiene una más baja especificidad especialmente en mujeres jóvenes y no está al alcance de procedimientos corrientemente utilizados en laboratorios clínicos. Adicionalmente, dado que las lesiones están generalmente focalizadas, sufre de los mismos errores de muestreo que Ia citología . La falta de especificidad y los altos costos de estas técnicas hacen que no estén disponibles para Ia mayoría de Ia población en el mundo.
Otra alternativa es Ia detección de anticuerpos anti-VPH, Ia cual permite identificar mujeres con infecciones crónicas activas, asociadas con Ia presencia de lesiones cervicales y de riesgo de contraer cáncer cervical ya que Ia mayoría de las infecciones con VPH potencialmente oncogénicas son persistentes, de tiempo largo e inducen una respuesta de anticuerpos contra las proteínas del virus que puede ser detectada mediante un ensayo de ELISA; además, existe evidencia que un estudio serológico puede ser usado como una prueba de tamización complementario a Ia citología. De hecho, se ha reportado que mujeres seropositivas para el VPH-16 presentan un riesgo más alto de desarrollar carcinoma cervical que las mujeres seronegativas; también se ha reportado que Ia mayoría de mujeres infectadas por VPH generan respuesta inmune humoral con anticuerpos IgG contra la proteína L1 de Ia cápside viral. Un número de estudios han demostrado que los sueros humanos reaccionan con VLPs (28-39). Usando un ensayo de ELISA con VLPs del tipo 16 en mujeres colegialas sexualmente activas, se encontró una seroprevalencia del 46% en las mujeres infectadas con VPH16 y un 30% en las infectadas con otros tipos. La respuesta a anticuerpos es significativamente mas alta entre las mujeres con alta carga viral que entre las con baja carga viral (valor de densidad óptica media 0.84 vs 0.14), Ia seroreactividad esta significativamente asociada con una edad entre 25 - 30 años, con 3 - 4 compañeros sexuales durante su vida y Ia historia de enfermedades sexualmente transmitidas diferentes a VPH (40-42). La seroconversión ocurre más frecuentemente con los tipos 16.
Los ensayos serológicos son de más fácil manipulación, no requieren equipo especial y podrían ser realizados por muchos laboratorios clínicos y podrían ayudar a identificar las mujeres en riesgo de desarrollar cáncer de cuello uterino, siendo de menor costo que un estudio de ADN. Teniendo en cuenta que los estudios epidemiológicos no muestran diferencias en el riesgo para adquirir cáncer cervical para los diferentes tipos de VPH-AR, una prueba que detecte todos los diferentes tipos de alto riesgo es suficiente. Existe una asociación entre la presencia de anticuerpos anti-VLP y Ia persistencia de VPH16, ya que es más alta Ia frecuencia de seropositividad en pacientes que han progresado a NIC III, que en aquellos pacientes con NIC I o Il ,(40-42). Nonnenmacher mostró una alta frecuencia de positividad IgG contra VLPs en el grupo NIC III en España y Colombia. Lehtinen mostró que Ia reactividad IgG contra VLPs tiene un valor predictivo para el desarrollo del cáncer cervical (41). En un estudio realizado en Colombia con una población de 147 mujeres con cáncer invasivo cervical y 147 mujeres con citología normal y negativas para ADN de VPH, se determinó que 82% de las pacientes con cáncer tienen anticuerpos contra VLPs de diferentes tipos virales; los tipos 16, 31 , 33, 58 y el 18, 45, 59 presentan reacción cruzada entre ellos; no hay reacción cruzada entre tipos 16 y 18; el tipo más común en Colombia es el 16, seguido del 58 y entre el 17 y el 21% de mujeres con citología normal presentan anticuerpos contra los tipos 16, 18, 39, 58 y un 9% de los tipos 33 y 59 (43-44).
Otros estudios serológicos han mostrado que entre el 20-50% de las mujeres con lesiones asociadas a VPH o con presencia de ADN de VPH no presentan niveles detectables de anticuerpos anti VLPs (45-48), y que Ia reactividad de estos anticuerpos es específica del tipo de virus, esto disminuye Ia sensibilidad de un ELISA basado en VLPs de VPH-16 y limita en parte su uso como prueba diagnóstica, a pesar de tener una adecuada especificidad. Recientemente, se describió que en parte Ia falla en Ia detección por ELISA de infección por VPH es debido a Ia falta de optimización del ensayo (49-50). Utilizando diferentes estrategias para Ia elección del punto de corte, se encontró una sensibilidad de 93% y una especificidad de 98.5% para discriminar entre sueros control positivos y negativo (50). Otros de los aspectos en contra del uso de VLPs en un ensayo serológico son los costos de producción y Ia baja estabilidad que presentan estas partículas.
Se han tratado de identificar regiones inmunodominantes dentro de Ia proteína L1 que reaccionen específicamente con sueros de pacientes con lesión cervical e infección persistente por VPH. En uno de estos estudios, utilizando péptidos de Ia proteína L1, se encontró que el péptido GLKAKPKFTLGKKATPTTS es específicamente reconocido por los sueros del 91% de los pacientes cuyas biopsias contienen ADN tipo 16, del 24% de los niños y 66% de otros pacientes NIC negativos para VPH16 (51). Recientemente, fue reportado un nonapeptido de L1 que discrimina entre pacientes con lesión de bajo grado ocasionada por VPH de alto riesgo de las ocasionadas por VPH de bajo riesgo (52).
Los inventores tratando de encontrar una solución a este problema en donde han identificado tres péptidos de Ia proteína L1 de VPH-16 que son reconocidos específicamente por entre 92 y el 98% de los sueros de mujeres con lesión cervical (NIC I a NIC III) o cáncer invasivo de cérvix y solo reconocen entre el 3% de las mujeres con citología normal. Más de 300 sueros entre mujeres con citología normal, pacientes con neoplasia intraepitelial cervical tipos I al III y pacientes con cáncer cervical, fueron probados mostrando una altísima sensibilidad (entre 94.5% y 97.2%) y una extremadamente alta especificidad (entre Parte de estas secuencias han sido reportadas en otras patentes (WO 90/04790, WO 91/18294, US005932412, US005629146A, US005989548A, EU0375555), sin embargo el estado del arte previo no han divulgado los péptido reivindicados en Ia presente invención ni han mostrado las múltiples combinaciones de complejos antígeno anticuerpos las cuales podrían ser tenidas en cuenta para detectar mujeres en riesgo de desarrollar cáncer cervical teniendo una gran sensibilidad y especificidad. Uno de los objetos de Ia invención es proveer un método más fácil y más barato para detectar mujeres en riesgo de desarrollar cáncer cervical.
Descripción detallada de Ia invención
La presente invención contempla las secuencias y el uso de tres polipéptidos; péptido 1 , péptido 2 y péptido 3 (uno de cada uno de las columnas de Ia Tabla 1) para Ia detección de anticuerpos anti-VPH, de acuerdo a las secuencias reportadas en Ia Tabla 1 y aquellas secuencias que por truncación o elongación sean reconocidas por los anticuerpos que los péptidos reportados en Ia Tabla 1. Debería ser entendido que Ia secuencia de aminoácidos de los péptidos de Ia presente invención no necesariamente necesitan ser idénticos a Ia secuencia de amino ácidos de Ia proteína L1 de VPH; pero esta invención contempla péptidos que contienen parte de Ia secuencia reportada en Ia Tabla 1 , que reaccionan con los anticuerpos inducidos por el VPH o que estos péptidos mediante inmunización son capaces de producir un antisuero que contiene anticuerpos que reaccionan con Ia proteína L1 del VPH; estos péptidos contienen menos de 50 residuos de aminoácidos residuos que contiene al menos una de las secuencias reportadas anteriormente. Por consiguiente un péptido de Ia presente invención puede ser sujeto a varios cambios tales como inserciones, omisiones o sustituciones (conservativas o no conservativas), donde tales cambios proveen ciertas ventajas de uso presentes en fluidos humanos. Las sustituciones conservativas son aquellas donde un residuo de aminoácido es cambiado por otro residuo fisicoquimicamente similar. El término "sustitución conservativa" también incluye el uso de aminoácidos modificados. Los péptidos de Ia presente invención pueden contener un aminoácido como Ia Cisteina, Ia Usina, Ia Tirosina, el ácido Glutámico o Aspártico con el fin de polimerizarlo o adherirlo a un material sólido o a una molécula transportadora. Teniendo en cuenta que los anticuerpos reconocen al menos seis residuos de aminoácidos de Ia secuencia del péptido Ia presente invención contempla péptidos que contengan al menos seis aminoácidos de Ia secuencia reportada en Ia Tabla 1.
Los péptidos de Ia presente invención pueden ser sintetizados por algunas de las técnicas conocidas. En este caso particular Ia síntesis química en fase sólida es Ia preferida por razones de costo y pureza. La formula general de los péptidos de Ia presente invención es:
BJO; en donde J representa una secuencia de al menos seis aminoácidos de los péptidos reportados en Ia tabla; B representa un Hidrógeno, un radical acetilo o al menos un residuo de aminoácido y O representa un Hidroxilo, un radical amida o al menos un aminoácido
Los péptidos de Ia siguiente invención preferidos provienen de las secuencias de Ia proteína L1 de los tipos de VPH de alto riesgo 16, 18, 31, 33, 45 y 58. La selección de las secuencias peptídicas de los tipos diferentes al 16 y 18 fue realizada teniendo en cuenta que las regiones inmunoreactivas de estos otros virus deben ser aquellas que presentan homología y que están situadas en Ia misma región relativa. En conexión con esto no es del todo obvio que las regiones inmunoreactivas y Ia combinación de estas tres aumente Ia especificidad de Ia prueba. La aproximación para el descubrimiento de estas regiones ha sido muy diferente al utilizado anteriormente para Ia definición de epitopes B dentro de las proteínas de VPH. Debe ser enfatizado que en ningún ejemplo de los presentados aquí para Ia selección de los péptidos de Ia presente invención fue usado algún tipo de algoritmo de computador u otro tipo de métodos previamente descritos para Ia selección de regiones inmunodominantes dentro de Ia proteína L1 de I VPH.
Definiciones
Aminoácidos: Todos los aminoácidos mencionados en este documento están en Ia configuración nativa L. Los aminoácidos son mencionados con las abreviaciones estándar de una letra como aparece en Ia Tabla 1.
Tabla 1. Abreviaciones de los aminoácidos usados en esta patente
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Péptido: designa moléculas formadas por secuencias de aminoácidos unidos linealmente que pueden ser obtenidos por síntesis química, expresión de proteínas o ingeniería genética
Sistema de detección: El sistema de detección en Kit incluye; una cantidad suficiente de uno de los péptidos mencionados anteriormente, que puede ser sólido, en solución, adherido a un soporte sólido; incluye también instrucciones para su uso. El sistema de detección también incluye una "marca" o "medios" para detectar Ia formación del complejo antígeno anticuerpo. Por "marca" o "medio" se entiende átomos o moléculas que están directa o indirectamente involucrados en Ia generación de una señal que permita detectar ia formación del complejo antígeno anticuerpo; por ejemplo un anticuerpo anti inmunoglobulina G al que se Ie a unido covalentemente una enzima como Ia peroxidasa. Tales "marcas" o "medios" son bien conocidos en Ia química de detección de anticuerpos, no son parte de esta invención sino que son usados como parte del mecanismo de detección de los complejos formados por los péptidos de Ia presente invención y los anticuerpos.
Detección de anticuerpos anti VPH: Pueden ser usadas varias metodologías, en particular esta invención contempla un formato de ELISA para detectar Ia presencia de anticuerpos en una muestra de fluido corporal tal como suero, plasma, secreciones vaginales u orina. En este método se emplea el péptido (antígeno) o el anticuerpo inmovilizado sobre un soporte sólido y un conjugado de enzima anticuerpo o enzima antígeno para detectar el anticuerpo presente en Ia muestra
Síntesis de Péptidos: La síntesis de péptidos en fase sólida se realizará mediante Ia estrategia t-Boc. El acople de los aminoácidos se realizará sobre el soporte polimérico, para el caso del primer aminoácido, ó sobre el último acoplado para los aminoácidos siguientes, utilizando aminoácidos activados. La activación del grupo carboxilo se obtiene por formación de un éster por tratamiento con activadores como diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1- Hidroxibenzotriazol (HOBt), sales de fosfonio (BOP, PyBOP), sales de uranio (TBTU, HATU, HBTU) ó por combinación de éstos. Este proceso de activación y acople se lleva a cabo utilizando solventes como DCM, DMF, DMA y NMP. El control de Ia reacción se realiza por medio de Ia prueba de Ninhidrina (53). Una vez acoplado el aminoácido es necesario retirar el grupo protector de su extremo α-amino con reacción con TFA, para permitir el acople del siguiente aminoácido. Cuando se tiene ya Ia secuencia sintetizada y en los casos que sea necesario, se realizará el acople de los grupos acetilo. Finalizado el proceso de síntesis química se procederá a Ia remoción de los grupos protectores de las cadenas laterales usando Fluoruro de Hidrógeno (HF 25%) en DMS y del péptido de Ia resina con HF (95%) (54); los péptidos sintetizados se caracterizarán por HPLC en fase reversa, en un equipo LaChrom Merck Hitachi y en columna analítica C18, C8, C4, usando como fase móvil acetonitrilo y agua. La desalínización de los péptidos se hará en una columna de Superdex-PeptideD (Amersham- Pharmacia), Quattricchi O. et al.. Introducción a Ia HPLC. Aplicación y practica, Gráficas Farro, Bueno Aires, Argentina (1992). La purificación de los péptidos se hará por HPLC en fase reversa, utilizando las condiciones anteriormente descritas, usando una columna preparativa C18, C8, o C4. Para Ia caracterización de los péptidos por espectrometría de masas se utilizará un espectrómetro de masas Bruker Protein MALDI-TOF, usando como matrices ácido D-ciano-4-hidroxicinámico (CCA), ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB) y ácido 3,5-dimetoxi-4- hidroxicinamico (SA) (54).
Inmunización de conejos para producir antisuero policlonal anti péptido: Conejos Nueva Zelanda serán inmunizados subcutáneamente con 0.5 mg/ml de solución de péptidos, por duplicado. La primera inmunización se realizará con adyuvante completo de Freund (día 0) y los tres refuerzos siguientes con adyuvante Incompleto de Freund (día 20, 40, 53). Al iniciar el esquema de inmunización se obtiene una sangría pre-inmune, luego se obtienen sangrías posteriores a Ia segunda y tercera dosis. Paralelo a cada una de las inmunizaciones se inoculará un conejo con VLPs, el cual se utilizará como control positivo (55). Inmunoensavo Enzimático en Fase Sólida (ELISA): El ELISA es una de varias variantes de ¡nmunoensayos que existen y también el método más simple y más práctico para probar sueros a gran escala
Directa:
Cada uno de los péptidos provenientes de las proteínas L1 se adsorberán e incubarán en cajas para ELISA de 96 pozos a una concentración de 10 μg/ml PBS 1X, las VLPs a una concentración de 5mg/ml en PBS 1X a 4°C toda Ia noche. Terminado el tiempo de incubación se retirará el péptido que no se haya adherido con buffer de lavado (PBS-Tween 20 al 1%). Los sitios de unión no específica se bloquearán con 200 ul/pozo de PBS 1X- BSA 1% durante 2H a 37°C. Luego se incubará con una dilución de 1/100 en PBS 2.5X-BSA 1%- TWEEN 2% durante 1 H a 45°C. Al finalizar el tiempo de incubación los pozos se lavarán con buffer de lavado y se incubarán con el anticuerpo secundario (anti-lgG de humano marcado con peroxidasa), diluido 1/1000 en PBS 2.5X- BSA 1%-TWEEN 2% durante 1 H a 45°C. Después de esto se hará un nuevo lavado y a cada pozo se Ie agregará revelador (TMBMR). Para bloquear Ia reacción de adicionará ácido fosfórico 1 N. La actividad anti-péptido, se detectará Ia densidad óptica a 450nm (56).
Competitiva:
Cada uno de los péptidos provenientes de Ia proteína L1 (10 μg/ml) se adsorberán e incubarán en cajas para ELISA de 96 pozos. Terminado el tiempo de incubación se retirará el péptido que no se haya adherido con buffer de lavado (PBS-Tween 20). Para boquear los sitios de unión no específica se incubarán con buffer bloqueador (leche descremada 4% en PBS-Tween). Paralelo a ello los sueros serán incubados por una hora con péptidos o con VLPs. Luego 100 μl de estos sueros se incubarán en las cajas ya bloqueadas durante 1 hora, Al finalizar el tiempo de incubación los pozos se lavarán con buffer de lavado y se incubarán con el anticuerpo secundario (anti-lgG de conejo marcado con peroxidasa) diluido 1 :5000 en buffer bloqueador. Después de esto se hará un nuevo lavado y a cada pozo se Ie agregará revelador (TMBMR). Para bloquear Ia reacción de adicionará ácido fosfórico 1N. La actividad anti-péptido, se detectará Ia densidad óptica a 450nm (57).
Sandwich
Sueros antipéptido se adsorberán e incubarán en cajas para ELISA de 96 pozos a 4°C toda noche. Terminado el tiempo de incubación se retirará el suero que no se haya adherido con buffer de lavado (PBS-Tween 20). Para boquear los sitios de unión no específica se incubarán con buffer bloqueador (leche descremada 4% en PBS-Tween). Luego se incubara con diluciones de péptido durante 1 hora a 37°C. Al finalizar el tiempo de incubación los pozos se lavarán con buffer de lavado y se incubarán con suero antipéptido marcado con una enzima. Después de esto se hará un nuevo lavado y a cada pozo se Ie agregará revelador (TMBMR). Para bloquear Ia reacción de adicionará ácido fosfórico 1 N. La actividad anti-péptido, se detectará Ia densidad óptica a 450nm (57).
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI).
Se incubaran 10 μl de las células HeLa (4 x 103) en láminas de inmunofluorescencia durante toda Ia noche a temperatura ambiente, transcurrido el tiempo cada pozo se fijará con 10 μl de acetona fría durante 10 minutos. Posteriormente las láminas se bloquearan con PBS-Leche 5%, y se incubará durante 30 minutos a 37° C, a continuación, las láminas se lavaran con PBS (6 veces, cada lavado de 5 min) y cada pozo se incubará durante 60 minutos a 37° C con 10 μL del mAb 72A1 (20 μg/ml); transcurrido el tiempo, las láminas se lavaran e incubaran, durante 60 minutos a 37° C, con 10 μl del anticuerpo secundario IgG F(ab)2 anti-conejo marcado con FITC (Isotiocianato de fluoresceína) (1/50) (VECTOR) y 1/80 de azul de Evans. Finalmente las láminas se lavaran con PBS y se cubrieran con una solución (1:1) de glicerol- PBS, cubriendo cada pozo de reacción con laminilla. Una vez terminado el procedimiento, Ia fluorescencia de cada pozo se detectará con el uso del microscopio de fluorescencia. Todas las incubaciones se realizaron en cámara húmeda.
Resultados de investigaciones clínicas La identificación de las posibles regiones de Ia proteína L1 de VPH que pueden interactuar con los anticuerpos fue determinada mediante el análisis de Ia estructura tridimensional de Ia proteína L1 y del modelo del pentámero de L1. A partir de estas estructuras determinamos cuales son las áreas expuestas al solvente utilizando el programa GETAREA (http://www.scsb.utmb.edu/cgi- bin/qet a form.tcl); estas áreas expuestas son las que en teoría están mas accesibles a los anticuerpos. De acuerdo a este análisis las secuencias de los péptidos 18285, 18288, 18290, 18291 y 18296 está en alrededor del 80% inaccesible al solvente es muy probable que estos péptidos no puedan interactuar con los anticuerpos (Figura 1).
De los restantes péptidos solo se encuentran expuestos en Ia superficie del pentámero los siguientes: 18283, 18286, 18287, 18289, 18294, 18297 y 18301 ; las demás secuencias se encuentran interactuando para formar el pentámero o hacia el interior del virion.
Todos los péptidos que se encuentran expuestos en el pentámero junto con los que no están expuestos fueron probados en un ensayo de ELISA usando un pool de 10 sueros de pacientes con neoplasia intraepitelial de alto grado (NIC ll/lll) y un pool de 10 sueros de mujeres con citología normal. Los péptidos 18283, 18286, 18294 y 18301 fueron reconocidos específicamente por el pool de sueros de los pacientes con NICII/lll y no por los anticuerpos presentes en los sueros de mujeres con citología normal (Figura 2). Parte de estos resultados han sido previamente publicados (26). Los péptidos reconocidos por estos péptidos pertenecen al grupo de secuencias expuestas en Ia estructura del pentámero. De estos péptidos se eligieron los péptidos 18283, 18294 y 18301 para ser probados contra 313 sueros de pacientes con citología normal, neoplasia intraepitelial I, II, III o cáncer de cuello uterino; teniendo en cuenta que presentaron Ia mayor reactividad con el pool de sueros de pacientes con NIC ll/lll.
Los resultados de ELISA obtenidos con los péptidos 18283, 18294 y 18301 y usando como controles el péptido 18295 y partículas parecidas a virus ensambladas a partir de Ia proteína L1 se muestran en Ia Figura 3. Las densidades ópticas obtenidas en ELISA para cada suero, ordenadas en forma creciente, muestran que los valores son significativamente para los sueros de las pacientes con cáncer o lesión cervical (NIC I, II, III) que para los sueros de mujeres con citología normal, usando los péptidos 18283, 18294 y 18301 y VLPs.
Los valores promedio de densidad óptica y las desviaciones estándar se muestran en Ia Figura 4; allí se observa claramente una diferencia significativa en los valores de densidad óptica entre Ia respuesta de las mujeres con citología normal y las pacientes con lesión cervical o cáncer de cuello uterino; no se observa diferencia significativa en las densidades ópticas en los diferentes estadios de desarrollo de Ia enfermedad ni entre los diferentes péptidos.
Considerando como seropositivos aquellos sueros que presenten un valor de densidad óptica mayores que el promedio de las densidades ópticas obtenidas con los sueros de las mujeres con citología normal mas dos desviaciones estándar y seronegativos los que den menor de este valor, se encuentra Io siguiente: El 2.4%, 3.6%, 6.0% y 1.8% de los sueros de mujeres con citología normal son seropositivos utilizando los péptidos 18283, 18294, 18301 y VLPs y mas del 71% de los sueros de las mujeres con lesión cervical o cáncer de cuello uterino son seropositivos (Tabla 2).
Tabla 2. Seropositividad de los péptidos 18283, 18294 y 18301 con respecto al reporte de colposcopia y biopsia.
# Respuesta positiva (%)
Diagnóstico
Peptido 18283 Péptido 18294 Péptido 18301 VLP-16
Normal (n=165) 4(2.4) 6(3.6) 10(6.0) 3(1.8)
N)C I (n=23) 22(96) 21(91) 22(96) 23(100)
NIC Il (n=14) 14(100) 10(71) 13(93) 14(100)
NIC III (n=41) 37(90) 34(83) 38(93) 40(97)
CCI (n=70) 69(99) 69(99) 68(97) 70(100)
A partir de los resultados de ELISA y seleccionando diferentes puntos de cortes se determinó Ia sensibilidad y especificidad de cada uno de los péptidos y de las VLPs para discriminar entre mujeres enfermas (NIC l-lll y cáncer de cuello uterino) y mujeres sanas (mujeres con citología normal). La sensibilidad para cada uno de los tres péptidos es superior al 90%, y Ia especificidad es superior al 89%, comparable con Ia sensibilidad y especificidad obtenida utilizando VLPs (Tabla 3). Tabla 3. ELISA para detectar mu¡eres enriesgo de desarrollar de lesión cervical asociada a VPH o cáncer cervical
Sensibilidad Especificidad
Punto de corle Péptldo Péptido Péptido Péptido Péptido Péptido
VLP-16 VLP-16 18283 18294 18301 18283 18294 18301
Promedio + 2 DS 97.30 92.57 95.95 99.32 94.55 95.15 93.33 91.52 Percentil 90 99.32 95.27 95.95 99.32 89.70 89.70 90.30 90.30 Percentll 95 97.30 91.89 92.57 97.97 95.15 95.15 95.15 95.15
De 241 mujeres se obtuvieron muestras de células cervicales de las 313 mujeres incluidas en el estudio (de las cuales se obtuvieron las muestras de sangre); 104 de mujeres con lesión cervical o cáncer de cuello uterino y 141 de mujeres con citología normal. El ADN del VPH tipo 16 fue encontrado en las muestras de 23 mujeres; 19 de las cuales pertenecen al grupo de mujeres con lesión cervical (LC) o cáncer de cuello uterino y 4 al grupo de citología normal. De estas 23 mujeres 19, 21 y 20 fueron seropositivas con los péptidos 18283, 18294 y 18301, respectivamente; de las cuales 2, 3 y 3 de las seropositivas con los péptidos 18283, 18294 y 18301 , respectivamente, pertenecen al grupo de mujeres con citología normal. El VPH tipo 18 fue encontrado en dos mujeres, una diagnosticada con cáncer de cuello uterino y que dio seropositiva con los tres péptidos y Ia otra con citología normal que dio seronegativa con los tres péptidos. Se encontraron 10 mujeres infectadas con otros tipos de VPH, todas del grupo de mujeres con citología normal; todas fueron seronegativas. Adicionalmente, a 60 mujeres se les detecto el ADN del VPH pero no fueron tipificadas; de estas 47, 45 y 46 fueron seropositivas con los péptidos 18283, 18294 y 18301, todas pertenecientes al grupo de mujeres con lesión cervical o cáncer de cuello uterino. Las demás fueron seronegativas y pertenecientes al grupo de mujeres de citología normal (Tabla 4).
Tabla 4. Seropositividad de los Péptidos 18283, 18294 y 18301 en pacientes infectados con diferentes tipos de VPH
N ° de Mujeres seropositivas
Pacientes con Lesión Cervical Mujeres con Citología Normal
Tipo de ADN detectado (n)
Péptido Péptido Péptido Péptido Péptido Péptido
VLP-16 VLP-16
18283 18294 18301 18283 18294 18301
VPH-16 (n=23) (LC=19)(N=4) 17 18 17 19 2 3 3 4
VPH-18 (n=2) (LC=1)(N=1) 1 1 1 1 0 0 0 1
VPH-51 (n=1) 0 0 0 0 0 0 0 0
VPH-52 (n=1) 0 0 0 0 0 0 0 0
VPH-54 (n=2) (N=2) 0 0 0 0 0 0 0 1
VPH-56 (n=1) 0 0 0 0 0 0 0 0
VPH-59 (n=1) 0 0 0 0 0 0 0 0
VPH-67 (n=1) 0 0 0 0 0 0 0 0
VPH-81 (n=1) 0 0 0 0 0 0 0 0
VPH-90 (n=2) (N=2) 0 0 0 0 0 0 0 0
VPH-X (n=60) (LC48 -N12) 47 45 46 47 0 0 0 0
Negativo (π=153) (LC=32)(N=121) 31 28 31 32 0 1 5 4 Adicionalmente, se recolectaron 221 muestras de sangre de mujeres que asisten a citología como control para Ia detección de mujeres en riesgo de desarrollar cáncer de cuello uterino. El 6% de estas mujeres presentó una citología anormal en el último año. Estos sueros fueron ensayados contra los péptidos 18283, 18294, 18301 y VLPs; 34.4%, 26.2%, 32.6% y 50.7% fueron seropositivos, respectivamente. Si consideramos como seropositivos solo aquellos sueros que sean positivos con los tres péptidos encontramos que Ia seropositividad se reduce a 22.2%. Es importante resaltar que más del 95% de las mujeres con citología anormal se encuentra en el grupo de seropositivas. Esto implica un aumento en Ia especificidad para detectar mujeres en riesgo de desarrollar cáncer de cuello uterino sin afectar significativamente Ia sensibilidad.
Los péptidos 18283, 18294, 18301 y las VLPs fueron inmunizadas en conejos Nueva Zelanda; los sueros obtenidos después de Ia tercera inmunización fueron probados mediante ELISA contra el antígeno que se inmunizó y contra VLPs. Como se ve Ia Figura 5 estos péptidos son inmunogénicos induciendo altos títulos de anticuerpos comparables con los que se obtienen con VLPs (mayores a 102.000); adicionalmente, los anticuerpos inducidos por estos péptidos reconocen las VLPs tipo 16 y los anticuerpos inducidos por las VLPs reconocen estos péptidos aunque con títulos bajos (alrededor de 5.600).
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Descripción de los dibujos e ilustraciones
Figura 1. Área superficial accesible de los péptidos de Ia proteína L1. Esta área fue calculada usando el programa GETAREA, a partir de las coordenadas de Ia proteína L1 (Protein Data Bank numero de acceso 1 DZL).
Figura 2. Resultados de ELISA de los péptidos de L1. Los péptidos de L1 fueron probados en ensayo de ELISA contra dos pooles de sueros; uno formado por suero de mujeres con NIC ll/lll (barras negras) y el otro por el suero de mujeres con citología normal (barras blancas). Los resultados están dados en densidades ópticas utilizando una dilución de suero de 1:100. Las VLPs fueron usadas como control positivo.
Figura 3. Resultados de ELISA para los péptidos 18283, 18294 y 18301 contra 313 sueros del pacientes, 165 pacientes con citología normal (NORMAL), 23 con neoplasia intracervical I (NIC I), 14 con NIC II, 41 NIC III y 70 con carcinoma cervical invasivo (CCI). Cada suero de pacientes fue probado en ELISA contra los péptidos 18283, 18294 y 18301; Las VLPs-16 fueron usadas como control positivo y el péptido 18295 como control negativo. En el eje Y los puntos representan Ia Densidad óptica (DO), obtenidos de Ia ELISA de los sueros con lesión cervical o de pacientes con cáncer cervical (puntos negros) o usando sueros pacientes de Ia citología normal (puntos grises). Cada suero fue analizado por triplicado y el valor de Ia media esta representado en esta figura, Ia desviación estándar fue siempre mas baja que el 10% del valor del promedio. En el eje X los sueros fueron organizados de acuerdo a las DOs desde el valor más bajo al más alto.
Figura 4. Resultados de ELISA promedio usando los péptidos 18283, 18294, 18295 y 18301 y VLPs. En el gráfico aparecen el promedio y Ia desviación estándar de los resultados usando los 313 sueros mencionados anteriormente; 165 pacientes con citología normal (NORMAL), 23 con neoplasia intraepitelial cervical I (NIC I), 14 con neoplasia intraepitelial cervical II, 41 con neoplasia intraepitelial cervical III (NIC III) y 70 con cáncer de cuello uterino.
Figura 5. Resultados de ELISA usando los sueros de conejos Nueva Zelanda inmunizados con los péptidos 18283, 18294, 18301 o VLPs. Cada conejo fue inmunizado con un antígeno; los conejos 393 y 398 inmunizados con el péptido 18283, los conejos 399 y 400 con el péptido 18294, el conejo 391 con el péptido 18301 y el conejo 439 con VLPs tipo 16. Pl es el suero del respectivo conejo obtenido antes de Ia primera inmunización. En el eje de las X se muestra las diluciones del suero utilizadas en el ELISA y en el eje de las Y las densidades ópticas obtenidas.

Claims

Reivindicaciones
1. El péptido 1 , definido por SEQ ID NOS. 18283-16, 18283-31 , 18283-33, 18283-58, 18283-18 o 18283-45; o péptidos que contengan parte de estas secuencias que reaccionen con anticuerpos inducidos por VPH, Ia proteína L1 de VPH o péptidos derivados de Ia proteína L1 de VPH.
2. El péptido 2, definido por SEQ ID NOS. 18294-16a, 18294-31 , 18294-33, 18294-58, 18294-18, 18294-45 o 18294-16b; o péptidos que contengan parte de estas secuencias que reaccionen con anticuerpos inducidos por VPH, Ia proteína L1 de VPH o péptidos derivados de Ia proteína L1 de VPH.
3. El péptido 3, definido por SEQ ID NOS. 18301 -16a, 18301-31 , 18301-33, 18301-58, 18301-18, 18301-45 o 18301 -16b; o péptidos que contengan parte de estas secuencias que reaccionen con anticuerpos inducidos por VPH, Ia proteína L1 de VPH o péptidos derivados de Ia proteína L1 de VPH.
4. Un método para detectar Ia presencia de infección latente con papiloma virus en un sujeto humano, que comprende los siguientes pasos: a) Obtención de Ia muestra biológica de dicho sujeto b) Formación de una mezcla de inmunoreacción, que incluye un agente seleccionado por uno o Ia combinación de los péptidos citados en las reivindicaciones 1 , 2 y 3. c) Mantener dicha mezcla de inmunoreacción bajo condiciones biológicas de ensayo por un periodo de tiempo suficiente para que los anticuerpos anti Ia proteína L1 de VPH presentes en dicha muestra se unan específicamente a dicho péptido y formen el producto de inmunoreacción d) Determinación de Ia presencia del producto de inmunoreacción.
5. El método reivindicado en Ia reivindicación 4, donde antes de formar dicha mezcla de inmunorreacción citada en el paso (b), dicho agente es fijado a una matriz sólida.
6. El método reivindicado en Ia reivindicación 4, donde docho producto de inmunorreacción es marcado antes del paso (d),
7. El método reivindicado en Ia reivindicación 4, donde el paso c emplea anticuerpos IgG.
8. El método reivindicado en Ia reivindicación 4, donde Ia presencia de anticuerpos es detectado mediante un inmunoensayo.
9. El método reivindicado en Ia reivindicación 8, donde el inmunoensayo es una prueba de ELISA.
10. El método reivindicado en Ia reivindicación 8, donde el inmunoensayo es una prueba de inmunoinfluorescencia.
11. El método reivindicado en Ia reivindicación 8, donde el inmunoensayo es una prueba de inmunohistoquímica.
12. un kit de diagnóstico para identificar Ia presencia de anticuerpos anti Ia proteína L1 de VPH en una muestra de fluido corporal el cual incluye uno o una combinación de los péptidos citados en Ia reivindicaciones 1, 2 y 3.
13. El kit de diagnóstico reivindicado en Ia reivindicación 12 donde dichos péptidos son fijados a una matriz sólida.
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