DE19627031A1

DE19627031A1 - Nachweisverfahren für spezifische, gegen HPV-Proteine gerichtete Antikörper

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Publication number: DE19627031A1
Application number: DE1996127031
Authority: DE
Inventors: Hanswalter Dipl Biol Zentgraf; Manfred Dipl Chem Dr Frey; Iris Dipl Biol Dr Velhagen; Regina Martens; Wolfgang Z Dipl Biol Meschede; Michael Dr Pawlita; Joris A C J M Braspenning
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1995-07-04
Filing date: 1996-07-04
Publication date: 1997-01-09
Anticipated expiration: 2016-07-05
Also published as: WO1997002491A1; US6214541B1; DE19627031C2; EP0848822A1; JPH11508685A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von spezifischen, gegen HPV- Proteine gerichteten Antikörpern in Körperflüssigkeiten. Ferner betrifft die Erfin dung einen hierfür verwendbaren Kit. Desweiteren betrifft die Erfindung native HPV-Proteine, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen.

Es ist bekannt, daß viele Menschen an persistierenden Infektionen durch humane Papillomviren (nachstehend mit HPVs bezeichnet) leiden. Ferner ist bekannt, daß mehr als 95% aller Anogenitalkarzinome, insbesondere des Gebärmutterhalskrebs, und ein beachtlicher Prozentsatz der Karzinome im Mund/Rachenraum mit persi stierenden Infektionen durch HPVs assoziiert sind.

Desweiteren gibt es Hinweise, daß zur Entstehung von Karzinomen bei Zellen, die eine persistierende Infektion durch HPVs aufweisen, eine unkontrollierte Expression von HPV-Genen, insbesondere der Gene E6 und/oder E7, notwendig ist.

Der Nachweis einer solchen Expression könnte daher eine Möglichkeit sein, HPV- assoziierte Karzinome frühzeitig zu erkennen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die unkontrollierte Expression von HPV-Genen, insbeson dere der Gene E6 und/oder E7, nachgewiesen werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis von spezifischen, gegen HPV-Proteine gerichteten Antikörpern, das folgende Verfahrensschritte umfaßt:

(I) Inkubation eines nativen, Trägermaterial-gebundenen HPV-Proteins mit Körperflüssigkeiten, und
(II) Umsetzung von spezifischen, an das HPV-Protein gebundenen Anti körpern (a)
- mit markierten, gegen die Antikörper (a) gerichteten Antikörpern (b), oder
- mit unmarkierten Antikörpern (b) und letztere mit markierten, gegen die Antikörper (b) gerichteten Antikörpern (c).

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß oftmals in Menschen, in denen eine unkontrollierte Expression von HPV-Genen, insbesondere der Gene E6 und/oder E7, vorliegt, Antikörper existieren, die gegen die Expressionsprodukte dieser Gene gerichtet sind.

Der vorstehende Ausdruck "HPV-Protein" umfaßt jegliches Protein eines jeglichen HPV-Typs. Insbesondere betrifft der Ausdruck ein HPV-E6 und HPV-E7 Protein, ganz besonders von HPV 16 und HPV 18. Das HPV-Protein kann eine Wildtyp- Sequenz aufweisen. Auch kann es eine davon abweichende Sequenz haben, wobei sich die Abweichungen in Form von Additionen, Deletionen und/oder Substitutio nen von ein oder mehreren Aminosäuren darstellen können. Ferner kann das HPV- Protein Teil eines Fusionsproteins sein.

Zur Herstellung eines HPV-Proteins können übliche Verfahren verwendet werden. Günstig ist es, eine für ein HPV-Protein kodierende Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, in einen Expressionsvektor zu inserieren und diesen zur Transfektion bzw. Transformation von Wirtszellen zu verwenden.

Der Fachmann kennt eine für ein HPV-Protein kodierende Nukleinsäure (vgl. Schwarz, E., 443-466 in "Papilloma Viruses and Human Diseases", (1987), Springer-Verlag). Auch sind ihm hinsichtlich eines HPV-E6 und HPV-E7 Proteins, insbesondere von HPV 16 und HPV 18, folgendes bekannt: EMBL-Datenbank, AC K02718 für HPV 16; Swiss-Protein-Datenbank P03126 für HPV 16-E6; Swiss- Protein-Datenbank P03129 und Dürst, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, (1983), 3812-3815 für HPV 16-E7; EMBL-Datenbank, AC M20325 für HPV 18; Swiss-Protein-Datenbank, P06463 für HPV 18-E6; Swiss-Protein-Datenbank, P06788 für HPV 18-E7.

Ferner sind dem Fachmann Expressionsvektoren bekannt. Im Falle eines Expres sionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in Hefe sind dies z. B. pY100, Ycpad1 und pREP-L20, wobei letzterer bevorzugt ist. Für die Expression in tierischen Zellen sind z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 anzugeben, wäh rend sich für die Expression in Insektenzellen besonders der Baculovirus-Expres sionsvektor pAcSGHisNT-A eignet.

Desweiteren kennt der Fachmann Wirtszellen. Beispiele solcher Wirtszellen um fassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG1 3009, wobei letzterer bevorzugt ist, die Hefe-Stämme Saccharomyces cerevi siae und Saccharomvces Pombe, wobei letzterer Stamm bevorzugt ist, und die tierischen Zellen L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.

Darüberhinaus kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Wirtszellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, ein exprimiertes HPV- Protein zu isolieren und zu reinigen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können ein oder mehrere HPV-Proteine, ins besondere ein HPV-E6 und/oder HPV-E7 Protein, ganz besonders von HPV 16 und HPV 18, gleichzeitig oder nacheinander eingesetzt werden. Sie liegen in nativer Form vor. Damit werden alle natürlichen, auf den HPV-Proteinen liegenden Epitope spezifischer Antikörper bereitgestellt. Dies optimiert den Nachweis spezifischer Antikörper gegenüber HPV-Proteinen in denaturierter Form.

Zum Erhalt eines HPV-Proteins in nativer Form kann ein solches, wenn es in denaturierter Form vorliegt, durch übliche Verfahren rückgefaltet werden. Günstig ist es, das denaturierte Protein in einem Harnstoffpuffer, z. B. 10 mM Na-Phosphat, pH 7,4, 10% Glycerin, 2 mM DTT, 8 M Harnstoff, zu lösen, auf eine übliche Hydroxylapatit-Säule, z. B. HA Ultrogel, IBF Biotechnics, zu laden, mit einem üblichen Eluierungspuffer vorstehender Harnstoff-Molarität, z. B. 150 mM NaPi, pH 7,8, 10% Glycerin, 2 mM DTT, 1 M NaCl, 8 M Harnstoff, zu eluieren, gegen einen üblichen Dialysepuffer absteigender Harnstoff-Molarität, z. B. 50 mM Tris- HCl, pH 7,5, 0,1 mM ZnAc, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 4 M Harnstoff, zu dialysie ren, auf einen üblichen Anionenaustauscher, z. B. Q-Sepharose (Pharmacia) zu laden, mit einem üblichen Eluierungspuffer gleicher Harnstoff-Molarität wie vor stehender Dialyse-Harnstoffpuffer, z. B. 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM ZnAc, 1 mM DTT, 1 M NaCl, 4 M Harnstoff, zu eluieren, einem üblichen Sammlungs schritt, z. B. einer Gelfiltration, zu unterziehen und gegen einen üblichen Dialysepuf fer, z. B. 5 mM Hepes, 5% Glycerin, 1 mM DTT, 20 pM ZnAc, zu dialysieren.

Alternativ ist es günstig, das denaturierte Protein in einem Harnstoffpuffer, z. B. 100 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, 8 M Harnstoff, zu lösen und einer schrittweisen Dialyse gegen übliche Dialysepuffer, z. B. 50 mM Mops/NaOH, pH 7,8, 500 mM NaCl, 20% Glycerin, 5 mM DTT, 100 µM ZnCl₂, zu unterziehen. Die Dialysepuffer weisen absteigende Harnstoff-Molaritäten, z. B. 8 M, 3 M, IM bzw. OM auf. Die Dialysen erfolgen in üblicher Weise, z. B. jeweils innerhalb von 24 Stunden. Nach der letzten Dialyse wird ein rückgefaltetes HPV-Protein erhalten, das in üblicher Weise, z. B. durch Gelfiltration, insbesondere an Supordex 200 (Pharmacia), gesammelt wird. Ein HPV-Protein, das in vorstehender Weise rückgefaltet worden ist, ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Erfindungsgemäß wird ein HPV-Protein an ein Trägermaterial gebunden. Als solches kann jegliches zur Bindung von Proteinen geeignete Material, insbesondere Mikrotiterplatten, Röhrchen, Mikrokugeln und Objektträger, verwendet werden. Die Bindung zwischen dem HPV-Protein und dem Trägermaterial kann nach üblichen Verfahren erfolgen. Günstig ist es, wenn das HPV-Protein zusammen mit einem den C-Terminus, z. B. 11 Aminosäuren, von SV40t-Antigen bildenden tag Polypep tid als Fusionsprotein vorliegt, wodurch dieses über einen allgemein erhältlichen gegen das tag Polypeptid gerichteten Antikörper an das Trägermaterial gebunden werden kann.

Erfindungsgemäß wird ein an ein Trägermaterial gebundenes HPV-Protein mit Körperflüssigkeiten inkubiert. Als solche sind sämtliche Flüssigkeiten gemeint, die aus einem tierischen Körper, insbesondere einem Säugetier und ganz besonders einem Menschen erhalten werden können. Die Flüssigkeiten umfassen vorzugs weise Serum, Lymphe, Speichel, Sputum, Urin, Stuhl, Liquor, Galle und gastrointe stinale Sekrete. Ferner gehören zu ihnen auch Flüssigkeiten, die aus festen Gewe ben, wie Lunge, Gehirn und Knochenmark, Abstrichen und Biopsien sowie Tumo ren, z. B. Anogenitalkarzinome, isoliert werden können. Die Inkubation des HPV- Proteins mit den Körperflüssigkeiten kann nach üblichen Verfahren erfolgen.

Durch vorstehende Inkubation werden Antikörper, die spezifisch für ein HPV- Protein sind, an dieses gebunden. Solche Antikörper (nachstehend mit (a) bezeich net) werden dann

- mit markierten, gegen die Antikörper (a) gerichteten Antikörpern (b), oder
- mit unmarkierten Antikörpern (b) und letztere mit markierten, gegen die Antikörper (b) gerichteten Antikörpern (c) umgesetzt.

Die Markierung kann radioaktiv oder nicht-radioaktiv sein. Im letzteren Fall werden andere übliche Marker verwendet. Geeignet sind insbesondere Fluoreszenzfarb stoffe, wie z. B. Fluoresceinisothiocyanat, und Enzyme, wie alkalische Phosphatase oder Peroxidase. Als Verstärkersystem kann ein Biotin/Streptavidinkomplex einge setzt werden. Die Marker sind allgemein erhältlich. Die Konjugierung mit den Antikörpern (b) oder (c) erfolgt nach den Vorschriften des Herstellers. Auch sind bereits markierte Antikörper (b) und (c) allgemein erhältlich.

Die Wahl der geeigneten Antikörper (b), ob markiert oder unmarkiert, hängt davon ab, von welchem Tier bzw. welcher Tierart die verwendete Körperflüssigkeit stammt. Handelt es sich beispielsweise um eine Flüssigkeit aus einem Menschen, so werden als Antikörper (b) solche verwendet, die gegen humanes Immunglobulin gerichtet sind. In entsprechender Weise werden, sofern zusätzlich noch Antikörper (c) eingesetzt werden, diese bezüglich des Tieres oder der Tierart ausgewählt, aus der die Antikörper (b) stammen. Die Wahl geeigneter Antikörper ist dem Fachmann bekannt und kann ohne weiteres durchgeführt werden.

Die Umsetzung von gebundenen Antikörpern (a) mit markierten Antikörpern (b) bzw. mit unmarkierten Antikörpern (b) und dann mit markierten Antikörpern (c) kann in üblicher Weise erfolgen. Günstig ist es, die Umsetzung mit den Antikörpern (b) in beiden Alternativen innerhalb von 1 h bei 37°C erfolgen zu lassen. Nach mehreren Waschvorgängen wird dann in der ersten Alternative eine dem Marker entsprechende Substratlösung zur Entwicklung der Nachweisreaktion zugegeben. Dies erfolgt gemäß der Anleitung des Herstellers. In der zweiten Alternative werden nach den Waschvorgängen die Antikörper (c) zugegeben. Deren Umset zung und die Entwicklung der Nachweisreaktion erfolgen in entsprechender Weise.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine hohe Spezifität auf. Diese ist beson ders hoch, wenn im Verfahrensschritt (I) ein HPV-tag-Fusionsprotein verwendet wird. Ferner weist das erfindungsgemäße Verfahren eine hohe Sensitivität auf. Diese ist besonders hoch, wenn im Verfahrensschritt (II) auch die Antikörper (c) eingesetzt werden. Desweiteren ist es oftmals günstig, wenn im Verfahrensschritt (l) zusätzlich ein oder mehrere denaturierte HPV-Proteine und/oder ein oder mehre re Fragmente davon eingesetzt werden. Damit können spezifische Antikörper nachgewiesen werden, die z. B. gegen Abbauprodukte eines HPV-Proteins gerichtet sind. Die vorstehenden Ausführungen zum erfindungsgemäßen Verfahren, ins besondere zur Bindung eines nativen HPV-Proteins an Trägermaterial und zur Inkubation des Proteins mit Körperflüssigkeiten, gelten hier entsprechend.

Erfindungsgemäß wird auch ein Kit bereitgestellt, der zur Durchführung vorstehen den Verfahrens geeignet ist. Dieser Kit enthält vorzugsweise

- ein oder mehrere native, Trägermaterial-gebundene HPV-Proteine, gegeben enfalls ein oder mehrere denaturierte, Trägermaterial-gebundene HPV-Protei ne und/oder Fragmente davon, und markierte Antikörper (b) nach Anspruch 1 sowie übliche Waschpuffer und gegebenenfalls ein der Markierung ent sprechendes Substrat, oder
- ein oder mehrere native, Trägermaterial-gebundene HPV-Proteine, gegebe nenfalls ein oder mehrere denaturierte, Trägermaterial-gebundene HPV- Proteine und/oder Fragmente davon und unmarkierte Antikörper (b) und markierte Antikörper (c) nach Anspruch 1 sowie übliche Wachpuffer und gegebenenfalls ein der Markierung entsprechendes Substrat.

Vorstehende Ausführungen zum erfindungsgemäßen Verfahren gelten hier ent sprechend.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine unkontrollierte Expression von HPV-Genen, insbesondere der Gene E6 und/oder E7, nachzuweisen. Damit eignet sich die Erfindung, HPV-assoziierte Karzinome frühzeitig zu erkennen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung eines HPV 16-E7-Proteins und eines HPV 16-E7 tag Fusionsproteins (a) Herstellung eines HPV 16-E7 Proteins

Es wurde von der Original-DNA von HPV 16 ausgegangen (vgl. Dürst M. et al., vorstehend). Diese DNA wurde als Template für ein PCR-Verfahren verwendet. Als Primer-Paar wurde verwendet: 5′-TTTGGATCCATGCATGG AGATACACCTACATTG-3′ und 5′-TTTGTCGACTTATGGTTTCTGAGA-3′. Der PCR-Ansatz und die Bedingungen waren standardmäßig.

Die amplifizierte DNA wurde mit BamHI und SaII gespalten und in den mit BamHI und SaII geöffneten Hefe-Shuttle-Vektor pREP-L20 inseriert. Dieser Vektor entspricht pREP3 (vgl. Maundrell, K., Gene 123 (1993), 127-130), enthält aber die nachstehende "Multiple Cloning Site":

Es wurde das Expressionsplasmid pREP3-L20 HPV16-E7 erhalten. Dieses wurde zur Transfektion von Schizosaccharomyces Pombe LEU 1,32 (vgl. Bröker, M., Biotechniques, (1993), 119) verwendet. Die transfizierten Hefezellen wurden in einem üblichen "Pombe min"-Medium in Anwesenheit von Thiamin über Nacht kultiviert. Dadurch wurde der "no message thia min"-Promotor des vorstehenden Expressionsplasmids unterdrückt. Nach Wegwaschen des Thiamins und Kultivierung in Thiamin-freiem Medium wurde der Promotor angeschaltet und das HPV 16-E7 Gen exprimiert. Das HPV16-E7 Protein wurde nach mechanischem Aufbrechen der Hefezellen isoliert.

(b) Herstellung eines HPV 16-E7 tag Fusionsproteins

Es wurde von der Original-DNA von HPV 16 ausgegangen (vgl. Dürst, M. et al., vorstehend). Diese DNA wurde als Template für ein PCR-Verfahren verwendet. Als Primer-Paar wurde verwendet: 5′-TTTTCTAGAA GATCTATGCATGGAGATACACCT-3′ und 5′-TTTGGATCCTGGTTTCT- GAGAACA-3. Der PCR-Ansatz und die -Bedingungen waren standardmäßig.

Die amplifizierte DNA wurde mit BgIII and BamHI gespalten und in den mit BgIII und BamHI geöffneten, für ein tag-Polypeptid kodierenden Bluescript- Vektor pL441 inseriert. Das erhaltene DNA-Molekül wurde mit XbaI und SaII gespalten und die HPV 16-E7 tag DNA isoliert. Diese DNA wurde in den mit XbaI und SaII geöffneten Expressionvektor pREP-L20 (vgl. vorstehend) inseriert. Es wurde das Expressionsplasmid pREP-L20 HPV 16-E7 tag erhal ten. Dieses wurde zur Transfektion von Schizosaccharomyces Pombe Leu 1.32 (vgl. vorstehend) verwendet. Die Kultivierung der Hefezellen und die Expression des HPV 16-E7 tag Gens sowie die Isolierung des HPV 16-E7 tag Fusionsproteins erfolgten wie in 1(a) beschrieben.

Beispiel 2 Rückfaltung eines HPV 16-E7 Proteins und eines HPV 16-E7 Fusions proteins (a) Rückfaltung eines HPV 16-E7 Proteins

Das in Beispiel 1(a) erhaltene HPV 16-E7 Protein lag in unlöslicher, denatu rierter Form vor. Es wurde in einem Puffer, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10% Glycerin, 2 mM DTT, 6 M Guanidinhydrochlroid, 50 mM NaF, 0,1 mM Na-o- Yanadat, gelöst. Zu seiner Rückfaltung wurde es in einem Harnstoffpuffer, 10 mM Na-Phosphat, pH 7,4, 10% Glycerin, 2 mM DTT, 8 M Harnstoff, 1 : 12 verdünnt und auf eine Hydroxylapatit-Säule (HA Ultrogel, IBF Bio technics) geladen. Das HPV-Protein wurde mit einem Harnstoff-Eluierungs puffer, 150 mM NaPi, pH 7,8, 10% Glycerin, 2 mM DTT, 8 M Harnstoff, eluiert und gegen einen Harnstoff-Dialysepuffer, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM ZnAc, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 4 M Harnstoff, dialysiert. Das Dialysat wurde auf einen Anionenaustauscher, Q-Sepharose (Pharmacia), geladen und das HPV-Protein mit einem Harnstoff-Dialysepuffer, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM ZnAc, 1 mM DTT, 1 M NaCl, 4 M Harnstoff, eluiert. Das Eluat wurde einer üblichen Gelfiltration unterzogen und an schließend gegen einen Dialysepuffer, 5 mM Hepes, 5% Glycerin, 1 mM DTT, 20 pM ZnAc, dialysiert. Es wurde ein natives HPV 16-E7 Protein erhalten.

(b) Rückfaltung eines HPV 16-E7 tag Fusionsproteins

Die Rückfaltung des in Beispiel 1(b) erhaltenen, denaturierten HPV 16-E7 tag Fusionsproteins erfolgte wie in Beispiel 2(a) beschrieben. Es wurde ein natives HPV 16-E7 tag Fusionsprotein erhalten.

Beispiel 3 Nachweis von HPV spezifischen Antikörpern in Seren von Cervix- Carcinom-Patientinnen (a) ELISA mit einem HPV 16-E7 Protein

Zur Durchführung eines ELISA wurde die HPV 16-E7 Protein-Lösung von Beispiel 2(a) in einem Carbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt. Zur Beschichtung einer 96-Loch-Platte wurden pro Loch 100 ng des HPV Proteins sowie einmal Carbonatpuffer als Leerkontrolle zugegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C schlossen sich 6 kurze Waschschritte mit PBS, 0,05% Tween 20 an. Anschließend erfolgte die Blockierung freier Bindungsstellen des polymeren Trägers durch einstündige Inkubation mit einem irrelevanten Protein, z. B. Schweinehaut-Gelatine, BSA oder Casein, wobei letzteres bevorzugt ist, in PBS bei 37°C. Seren von Patientinnen mit Cervix-Carcinom und von Kontrollpersonen jeweils aus Mexiko wurden in PBS (1 : 50 Ver dünnung) 1 Stunde bei 37°C auf der Platte inkubiert. Nach erneutem Wa schen mit PBS, 0,05% Tween 20 wurde ein allgemein erhältlicher Per oxidase-gekoppelter Ziege Anti-Human Antikörper (Zymed Laboratories, CA, USA; Verdünnung nach Angabe des Herstellers) zugegeben. Nach einstündi ger Inkubation bei 37°C erfolgte ein erneutes Waschen und anschließend die Peroxidase-Nachweisreaktion mit TMB-Entwicklungslösung (50 mM Natriumacetat, 0,4 mM 3,3′,5,5′-Tetramethyl-benzidin-dihydrochlorid, 4,4 mM H₂O₂) innerhalb 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Abstoppen der Reaktion mit 1 M Schwefelsäure wurde die Farbintensität photometrisch bei 450 nm bestimmt.

Es zeigte sich, daß durch ein HPV 16-E7 Protein HPV-spezifische Antikörper in Seren von Cervix-Carcinom-Patientinnen nachgewiesen werden können.

(b) ELISA mit einem HPV 16-E7 tag Protein

Zur Durchführung eines ELISA mit dem HPV 16-E7 tag Protein von Beispiel 2(b) wurde eine 96-Loch-Platte mit 200 ng pro Loch des allgemein erhältli chen, gegen das tag Polypeptid gerichteten monoklonalen Maus-Antikörpers Mab tag (KT3) beschichtet. Hierzu wurde die Platte mit dem in vorstehen dem Carbonatpuffer gelösten Antikörper über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach sechs kurzen Waschschritten mit PBS, 0,05% Tween 20 wurde das in vorstehendem Carbonatpuffer gelöste HPV 16-E7 tag Protein in einer Menge von 100 ng pro Loch zugegeben. Die weiteren Verfahrensschritte erfolgten wie in Beispiel 3(a) beschrieben.

Es zeigte sich, daß durch ein HPV 16-E7 tag Protein HPV-spezifische Anti körper in Seren von Cervix-Carcinom-Patientinnen nachgewiesen werden können.

Beide Nachweise in Beispiel 3(a) und (b) waren spezifischer als ein Ver gleichs-ELISA, in dem ein HPV 16-E7-Fragment, d. h. kein natives Protein, verwendet wurde. Die Spezifität des Nachweises von 3(b) war dabei noch größer als jene des Nachweises von 3(a). In 3(a) wurden in 64 Kontroll werten 2 positive Beispiele erhalten, während in 3(b) all diese Kontrollwerte negativ waren. Ferner konnten in 3(b) 28 von 73 Seren der Cervix-Carci nom-Patientinnen als HPV-spezifisch erkannt werden, während es in 3(a) nur 20 waren.

Beispiel 4 Herstellung und Reinigung von HPV 16(18)-E6(E7) Proteinen (a) Herstellung und Reinigung eines HPV 16-E6 Proteins

Es wurde von dem Plasmid pGem-2/16 E6 ausgegangen, das eine für das E6 Protein von HPV 16 kodierende DNA enthält (vgl. Werness, B.A. et al., Science, Band 248, (1990), 76-79). Diese DNA wurde als Template für ein PCR-Verfahren verwendet. Als Primer-Paar wurde verwendet: 5′- CAGGGATCCGATGACGATGACAAAATGuTCAGGACCCACAGG-3′ und 5′-GGGAAGCTTATTACAGCTGGGTTTCTCTAC-3′. Der PCR-Ansatz bzw. die PCR-Bedingungen waren wie folgt:

PCR-Ansatz

Template DNA: 1 µl = 1 ng
Pfu-Polymerase 10×-Puffer: 10 µl = 1×
DMSO: 10 µl = 10%
dNTP′s: 1 µl = je 200 µM
Oligonukleotide, je 1,5 µl: 3 µl = je 150 ng
H₂O-bidest: ad 99 µl

PCR-Bedingungen

- 92°C = 5 min
- Zugabe von 1 µl Pfu-Polymerase (Stratagene) = 2,5 Einheiten
- Zugabe von Paraffin

PCR

Die amplifizierte DNA wurde mit BamHI und HindIII gespalten und in den mit BamHI und HindIII geöffneten Expressionsvektors pQE-8 (Diagen) inseriert. Es wurde das Expressionsplasmid pQ/16/E6 erhalten. Dieses kodiert für ein Fusionsprotein aus 6 Histidin-Resten und einer Enterokinase-Schnittstelle (N- Terminuspartner) sowie dem E6 Protein von HPV 16 (C-Terminuspartner). pQ/16/E6 wurde zur Transformation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwendet. Die Bakterien wurden in einem LB-Medium mit 1000 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamy cin kultiviert und 4 h mit 60 pM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wurde eine Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wurde mit dem Lysat eine Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der Angaben des Herstellers (Diagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Fusionsprotein wurde in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach seiner Neutralisierung wurde das Fusionsprotein einer 18% SDS-Polyacryla mid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J.Mol.Biol. 149 (1975), 709-733).

Es wurde ein reines HPV16-E6 Fusionsprotein (MG ca. 18 kD) erhalten. Dieses lag in denaturierter Form vor.

(b) Herstellung und Reinigung von HPV 16-E7 und HPV 18-E6 (E7) Proteinen

HPV 16-E7 und HPV 18-E6 (E7) Proteine wurden, wie in 4 (a) beschrieben, hergestellt und gereinigt. Folgende Abweichungen wurden durchgeführt:

Zur Herstellung von HPV 16-E7 wurde von dem Plasmid pWV 2916 ausge gangen, das eine für HPV 16 kodierende DNA enthält (vgl. Dürst, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 60, (1983), 3812-3815). Für das PCR- Verfahren wurde als Primer-Paar verwendet: 5′-CAGGGATCCATGCATG GAGATACACCTAC-3′ und 5′-GGGAAGCTTATTATGGTTTCTGAGAACA GATG-3′.

Nach Klonierung der amplifizierten DNA in pQE-8 (pQ/16/E7), wobei die DNA keine Enterokinase-Schnittstelle aufwies, und Expression in SG 13009 sowie Reinigung wurde ein reines HPV 16-E7 Fusionsprotein (MG ca. 12 kD) erhalten. Dieses lag in denaturierter Form vor.

Zur Herstellung von HPV 18-E6 wurde von dem Plasmid pGem-1/18 E6 ausgegangen, das eine für das HPV 18-E6 Protein kodierende DNA enthält (vgl. Werness, B.A. et al., vorstehend). Für das PCR-Verfahren wurde als Primer-Paar verwendet: 5′-CAGAGATCTGATGACGATGACAA AATGGCGCGCTTTGAGGATC-3′ und 5′-GGGAAGCTTATTA TACTTGTGTTTCTCTGCG-3′.

Nach Klonierung in pQE-8 (pQ/18/E6) und Expression in SG 13009 wurde ein reines HPV18-E6 Fusionsprotein (MG ca. 19 kD) erhalten. Dieses lag in denaturierter Form vor.

Zur Herstellung von HPV 18-E7 wurde von dem Plasmid pGEM 3/91 ausge gangen, das eine für HPV 18 kodierende DNA enthält (vgl. Roggenbuck, B. et al., J. Virol., Band 65, (1991), 5068-5072). Für das PCR-Verfahren wurde als Primer-Paar verwendet: 5′-CAGGGATCCATGCATGGACC TAAGGCAAC-3′ und 5′-GGGAAGCTTATTACTGCTGGGATGCACACC-3′.

Nach Klonierung der amplifizierten DNA in pQE-8 (pQ/18/E7), wobei die DNA keine Enterokinase-Schnittstelle aufwies, und Expression in SG 13009 wurde ein reines HPV 18-E7 Fusionsprotein (MG ca. 13 kD) erhalten. Dieses lag in denaturierter Form vor.

Beispiel 5 Rückfaltung von denaturierten HPV 16(18)-E6(E7) Proteinen (a) Rückfaltung eines HPV 16-E6 Proteins

Das in Beispiel 4(a) erhaltene HPV 16-E6-Protein wurde in einem Harnstoff- Puffer (100 mM Phosphatpuffer, 8 M Harnstoff, pH 8,0) gelöst und einer schrittweisen Dialyse unterworfen. Die Dialysepuffer enthielten 50 mM Mops/NaOH, pH 7,8, 500 mM NaCl, 20% Glycerin, 5 mM DTT, 100 pM ZnCl₂. Ferner wiesen sie 8 M, 3 M, 1 M bzw. 0 M Harnstoff auf. Die einzelnen Dialysen erfolgten jeweils innerhalb von 24 Stunden. Anschließend wurde eine Gelfiltration an Superdex 200 (Pharmacia) durchgeführt.

Es wurde ein HPV 16-E6 Protein in nativer Form erhalten.

(b) Rückfaltung von HPV 16-E7 und HPV 18-E6 (E7) Proteinen

Die in Beispiel 4(b) erhaltenen HPV 16-E7, HPV 18-E6 (E7) Proteine wur den, wie in 5(a) beschrieben, rückgefaltet. Es wurden entsprechende HPV- Proteine in nativer Form erhalten.

Beispiel 6 Nachweis von HPV-E6 und HPV-E7 spezifischen Antikörpern im Serum von Patienten

Zur Durchführung eines ELISA wurden HPV 16-E6 und HPV 16-E7 Proteine aus Beispiel 5 in Puffer (0,1 M NaH₂PO₄, pH 8,0) aufgenommen. Zur Beschichtung einer 96-Loch-Platte wurden pro Loch je 100 µl mit 20 ng bzw. 8 ng der HPV Proteine sowie einmal 1% BSA als Leerkontrolle einpipettiert. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C schlossen sich je 4 kurze Waschschritte mit PBS, 0,05% Tween 20 im Abstand von 5 min an. Anschließend erfolgte die Blockierung freier Bindungsstellen des polymeren Trägers durch über Nacht-Inkubation mit 1% BSA in PBS, 0,05% Tween 20 bei 4°C. Ein zu testendes Serum einer Patientin mit Gebärmutterhalskrebs wurde in 1 : 100 Verdünnung (PBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20) für 1 Stunde bei 37°C auf der Platte inkubiert ("Schachbrett-Titra tion"). Nach 4 kurzen Waschschritten mit PBS, 0,05% Tween 20 im Abstand von 5 min wurde ein allgemein erhältlicher Peroxidase-gekoppelter Ziege Anti-Human Antikörper (Verdünnung nach Angabe der Hersteller) zugegeben. Nach dreißigmi nütiger Inkubation bei 37°C folgten wieder 4 Waschschritte, wie vorstehend, und anschließend die Peroxidase-Nachweisreaktion mit TMB-Entwicklungslösung (50 mM Natriumacetat, 0,4 mM 3,3′, 5,5′-Tetramethyl-benzidin-dihydrochlorid, 4,4 mM H₂O₂) innerhalb 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Abstoppen der Reaktion mit 2 M HCl wurde die Farbintensität photometrisch bei 450 nm be stimmt. Absorbtionswerte des mehr als doppelten der BSA-Kontrolle wurden als positive Reaktion gewertet.

Es zeigte sich, daß HPV-E6 und HPV-E7 spezifische Antikörper im Serum einer Patienten mit Gebärmutterhalskrebs nachgewiesen werden können.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von spezifischen, gegen HPV-Proteine gerichteten Antikörpern in Körperflüssigkeiten, umfassend die folgenden Verfahrens schritte:

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrens schritt (I) ein HPV-tag Fusionsprotein verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Ver fahrensschritt (I) ferner ein oder mehrere denaturierte, Trägermaterial-gebun dene HPV-Proteine und/oder Fragmente davon verwendet werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das HPV-Protein ein HPV-E6 oder HPV-E7 Protein ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das HPV-Protein von HPV 16 oder HPV 18 stammt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt (1) mehrere native HPV-Proteine verwendet werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß das native HPV-Protein durch Rückfaltung eines entsprechenden denatu rierten Proteins erhalten ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückfaltung des denaturierten HPV-Proteins eine Lösung dieses Proteins in einem Harn stoffpuffer und eine Dialyse des gelösten Proteins in üblichen, absteigende Molaritäten von Harnstoff aufweisenden Puffern sowie eine Gelfiltration des dialysierten Proteins umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückfaltung des denaturierten HPV-Proteins ein Lösen des Proteins in einem üblichen Harnstoffpuffer, ein Aufbringen auf eine übliche Hydroxylapatit-Säule, ein Eluieren mit einem üblichen Eluierungspuffer vorstehender Harnstoff-Molari tät, ein Dialysieren gegen einen üblichen Dialysepuffer absteigender Harn stoff-Molarität, ein Aufbringen auf einen üblichen Anionenaustauscher, ein Eluieren mit einem üblichen Eluierungspuffer gleicher Harnstoff-Molarität wie vorstehender Dialysepuffer, eine Durchführung einer Gelfiltration, und ein Dialysieren gegen einen üblichen Dialysepuffer umfaßt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeiten Serum, Lymphe, Speichel, Sputum, Urin, Stuhl, Liquor, Galle, gastrointestinale Sekrete sowie aus festen Geweben und Tumoren erhaltene Flüssigkeiten umfassen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial Mikrotiterplatten, Röhrchen, Mikrokugeln und Objekt träger umfaßt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper (b) in der ersten Alternative und die Antikörper (c) in der zweiten Alternative mit einem Enzym markiert sind.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper (b) in der ersten Alternative und die Antikörper (c) in der zweiten Alternative mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper (b) in der ersten Alternative und die Antikörper (c) in der zweiten Alternative radioaktiv markiert sind.

15. Kit, enthaltend

- ein oder mehrere native, Trägermaterial-gebundene HPV-Proteine, gegebenenfalls ein oder mehrere denaturierte, Trägermaterial-gebun dene HPV-Proteine und/oder Fragmente davon, und markierte Anti körper (b) nach Anspruch 1 sowie übliche Waschpuffer und gegebe nenfalls ein der Markierung entsprechendes Substrat, oder
- ein oder mehrere native, Trägermaterial-gebundene HPV-Proteine, gegebenenfalls ein oder mehrere, denaturierte, Trägermaterial-gebun dene HPV-Proteine und/oder Fragmente davon, und unmarkierte Anti körper (b) und markierte Antikörper (c) nach Anspruch 1 sowie übli che Waschpuffer und gegebenenfalls ein der Markierung entsprechen des Substrat.

16. Native HPV-Proteine, erhalten durch das Verfahren nach einem der An sprüche 7-9.