WO1998023640A1

WO1998023640A1 - Verfahren zur reinigung und rückfaltung von hpv-proteinen

Info

Publication number: WO1998023640A1
Application number: PCT/DE1997/002775
Authority: WO
Inventors: Wolfgang Meschede; Michael Pawlita
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1997-11-26
Publication date: 1998-06-04
Also published as: JP2001505565A; DE19649604C1; EP0942927A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Rückfaltung von HPV-Proteinen. Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte: (a) Extraktion von Proteinen aus Zellen, (b) Durchführung einer Kationenaustaucher-Chromatographie, (c) Durchführung einer Anionenaustaucher-Chromatographie, und (d) Rückfaltung der Proteinfraktionen in einem ein Detergenz und ein Phosphalipid enthaltenden Rückfaltungspuffer. Die erhaltenen HPV-Proteine eignen sich als Immunogene für Vakzinierungen, in ELISA zum Nachweis von HPV-Antikörpern, zur Kristallisierung und anschließenden Strukturaufklärung und zur funktionellen Untersuchung von HPV-Proteinen, insbesondere E6- und E7-Proteinen. Ferner können die HPV-Proteine zur Bestimmung von Substanzen verwendet werden, welche die Bindung zwischen den HPV-Proteinen und zellulären Proteinen inhibieren.

Description

Verfahren zur Reinigung und Rückfaltung von HPV-Proteinen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Rückfaltung von HPV-Proteinen und die Verwendung dieser Proteine.

Seit langem besteht das Problem, Proteine humaner Papillomviren (nachstehend mit HPV-Proteine bezeichnet) zu reinigen und in aktiver Form bereitzustellen.

Dies trifft insbesondere für frühe HPV-Proteine, z.B. HPV E6-Protein zu. Verfahren, in denen HPV-Proteine verwendet werden, z.B. zum Nachweis von HPV- Antikörpern, können daher auch nicht zufriedenstellend durchgeführt werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem HPV-Proteine gereinigt und in aktiver Form bereitgestellt werden können.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Reinigung und Rückfaltung von HPV-Proteinen. Ein solches Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:

(a) Extraktion von Proteinen aus Zellen,

(b) Durchführung einer Kationenaustauscher-Chromatographie,

(c) Durchführung einer Anionenaustauscher-Chromatographie, und (d) Verdünnung der Proteinfraktionen in einem ein Detergenz und ein Phospholipid enthaltenden Rückfaltungspuffer.

Die Extraktion von Proteinen aus Zellen kann durch Standardverfahren erfolgen.

Als Zellen können jegliche Zellen verwendet werden, die HPV enthalten können. Dies sind z.B. HPV-infizierte menschliche Zellen oder HPV-Expressionskulturen. Letztere können, wie z.B. in DE 1 9524347.1 beschrieben, erhalten werden. Extrahierte Proteine werden über eine Kationen- und eine Anionenaustauscher- säule gegeben werden, wobei die Reihenfolge der Chromatographien dem Fachmann überlassen bleibt. Welche Materialien für die Anionen. bzw. Kationen- austauschersäulen zu verwenden sind, ist dem Fachmann bekannt. In bevorzugter Weise eignet sich als Kationenaustauschermaterial S-Sepharose fast flow (Pharmacia, Freiburg), während als Anionenaustauschermaterial bevorzugt Q- Sepharose fast flow (Pharmacia, Freiburg) verwendet wird. Danach kann ggf. noch eine HIC-Chromatographie, bevorzugt mit Butyl-Sepharose, stattfinden. Die derart vorgereinigten Fraktionen, welche gewünschte HPV-Proteine enthalten, werden in einem Rückfaltungspuffer verdünnt, wodurch nach einer Zeit von 1 2 bis 24 Stunden native hochgereinigte HPV-Proteine erhalten werden. Der Rückfaltungspuffer zeichnet sich dadurch aus, daß er eine Kombination von einem Detergenz, z.B. Lauryl-Malatosid, und einem Phospholipid, z.B. Phosphatidylino- sitol, enthält. Günstig kann es sein, wenn er ferner ein Zinksalz und ein Reduktionsmittel enthält. In bevorzugter Weise umfaßt der Rückfaltungspuffer:

10-50 m HEPES/NaOH, pH 7,2

1 -1 0% Glycerin

0, 1 -5 mg/ml Lauryl-Malatosid

100-500 μg/ml Phosphatidylinositol

Besonders bevorzugt umfaßt der Rückfaltungspuffer:

25 mM HEPES/NaOH, pH 7,2 50 μM ZnCI₂ 2 mM DTT

5 % Glycerin

1 mg/ml Lauryl-Malatosid

350 μg/ml Phosphatidylinositol

Mit einem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, HPV-Proteine zu reinigen und in aktiver Form bereitzustellen. Dies trifft insbesondere für frühe HPV- Proteine, z.B. HPV E6-Protein, insbesondere von HPV 1 6 oder HPV 1 8, zu. Die HPV-Proteine können in Wildtyp-Sequenz oder veränderter Form vorliegen. Letzteres umfaßt HPV-Fusionsproteine, wie HPV-tag Fusionsproteine, z.B. mit 1 1 carboxyterminalen Aminosäuren des SV40 T-Antigens. Die erfindungsgemäß erhaltenen HPV-Proteine lassen sich bestens in immunologischen Nachweisver- fahren einsetzen, wo z.B. mittels eines Protein-ELISA Seren auf Antikörper gegen HPV-Proteine getestet werden können. Diese immunologischen Nachweisverfahren haben ihre Einsatzmöglichkeiten bei der Früherkennung von Zervixkar- zinomen und der Tumortherapie-Verlaufskontrolle. Dabei wird insbesondere an die Entwicklungsländer gedacht, wo keine zytologische Diagnostik durchgeführt werden kann. Außerdem lassen sich die erfindungsgemäß erhaltenen HPV-

Proteine als Immunogene für Vakzinierungen, zur Kristallisation und anschließenden Strukturaufklärung sowie zur Funktionsanalyse des HPV-Proteins verwenden. Desweiteren stellen sie ein Mittel dar, Inhibitoren der Bindung von HPV- Proteinen, insbesondere E6-Proteine, an zelluläre Proteine zu bestimmen. Sol- ches kann in einem üblichen Bindungstest erfolgen.

Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Figuren weiter beschrieben:

Fig. 1 : Silbergefärbte SDS-PAGE von gereinigten E6-tag-Proteinen 0,01 % der Proteine des Auftrags (A), des Durchflusses (F) und

0, 1 % ausgewählter Elutionsfraktionen ( 1 -28) werden im SDS-PAGE aufgetrennt und silbergefärbt. M = Größenmarker

Fig. 2: Funktionalität der E6-tag-Proteine im p53-Ubiquitinilierungstest ³⁵S-markiertes, in-vitro translatiertes p53, E6 assoziiertes Protein und Ubiquitin werden mit steigenden Mengen der erfindungsgemäß gereingten und rückgefalteten E6 tag-Proteine inkubiert. Funktioneil aktives E6-Protein katalysiert die p53-Ubiquitin-Komplex-Bildung, die nach SDS-Gelelektrophorese und Exposition auf dem Röntgen- film sichtbar wird. Ansatz ohne E6-Protein (-); Ansätze mit Überschuß von bakteriellem GST-E6-Fusionsprotein ( + ); Ansätze mit 5ng ( 1 ), 1 0ng (2), 1 5ng (3) und 20ng (4) gereinigtem E6-Protein, verdünnt in Rückfaltungspuffer (25 mM HEPES/NaOH, pH 7,2; 50 μM ZnCI₂, 2 mM DTT, 5% Glycerin, 1 mg/ml Lauryl-Malatosid und 350 μg/ml Phosphatidylinosit) .

Fig. 3: HPV 1 6 E6-tag-ELISA mit humanen Seren aus Mexiko und Tansania (CaCx- und Kontrollseren)

Reaktion von Western-Blot positiven Zervixkarzinom-Seren aus

Tansania (T91 /2/31 -T91 /9/23) und aus Mexiko (M279) sowie

Peptid-ELISA negativer Zervixkarzinom-Seren aus Mexiko (M 1 07- M 1 1 1 ) im HPV 1 6 E6-tag-Protein-ELISA; TC = Kontrollseren aus

Tansania

Fig. 4: HPV 1 8 E6-tag-ELISA mit humanen Seren aus Mexiko und Tansania (CaCx- und Kontrollseren) Reaktion von Western-Blot positiven Zervixkarzinom-Seren aus

Tansania (T91 /2/40-T91 /8/23) im HPV 1 8 E6-tag-Protein-ELISA; TC = Kontrollseren aus Tansania, MC = Kontrollseren aus Mexiko

Fig. 5: Prinzip eines direkten HPV-ELISA und eines Sandwich-HPV-tag-Pro- tein-ELISA

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter beschrieben:

BEISPIEL 1 Reinigung und Rückfaltung von HPV 1 6/1 8 E6-taq-Protein

Verwendete Puffer und Lösungen: Aufbrechpuffer: 25 mM HEPES, pH 7,4

Extraktionspuffer: 25 mM HEPES/NaOH, pH 8,8

1 mM DTT 8 M Harnstoff

Kationpuffer A: gleich mit Extraktionspuffer Kationpuffer B: 25 mM HEPES/NaOH, pH 7,8 1 mM DTT 8 M Harnstoff 1 M NaCI

Anionpuffer A: 50 mM Tris/Ac, pH 7,8 1 mM DTT 8 M Harnstoff

Anionpuffer B: 50 mM Tris/Ac, pH 7,8 1 mM DTT 8 M Harnstoff 1 M NaCI

HIC-Puffer A: 25 mM HEPES/NaOH, pH 7,2

1 mM DTT

8 M Harnstoff

1 ,5 M Ammoniumsulfat

HIC-Puffer B: 25 mM HEPES/NaOH, pH 7,2 1 mM DTT 8 M Harnstoff

Denaturierungspuffer: 25 mM HEPES/NaOH, pH 7,2 6 M Guanidin 50 mM DTT

Rückfaltungspuffer: 25 mM HEPES/NaOH, pH 7,2

50 μM ZnCI₂

2 mM DTT

5 % Glycerin

1 mg/ml Lauryl-Malatosid

350 μg/ml Phosphatidylinositol

Aufbrechen und Extraktion Eingefrorene resuspendierte Pellets von 2 x 1 Liter Schizosaccheromyces pombe

HPV 1 6/1 8 E6-tag Expressionskultur werden aufgetaut und 5 Min. in der Minifuge bei 6000 Upm und 4°C pelletiert. Die Pellets werden in je 50 ml vorgekühl- tem Aufbrechpuffer resuspendiert und nochmals 5 Min. in der Minifuge bei 6000 rpm und 4°C pelletiert. Die Pellets werden in insgesamt 30 ml vorgekühltem Aufbrechpuffer resuspendiert und mit 50 ml Glasbeads 10 x 1 Min. mit je 2 Min. Pause unter ständiger Kühlung im mittleren Aufbrechgefäß (70 ml) des Bead- Beaters (Biospec, Ohio, USA) aufgeknackt. Die Glasbeads werden mit etwa 200 ml vorgekühltem Aufbrechpuffer gewaschen und die Hefesuspension für 1 Std. in der Minifuge bei 6000 rpm und 4°C zentrifugiert. Die Pellets werden in 70 ml vorgekühltem Waschpuffer resuspendiert und für 2 Std. in der Ultrazentrifuge zentrifugiert (Rotor SW28, 4°C, 27.500 Upm (r_AV = 100.000g), 2 Gefäße ä 35 ml). Die Pellets werden in 140 ml Extrak00 ₀₀t₀o ₀ cionspuffer resuspendiert und für 1 Std. o o in der Ultrazentrifuge zentrifugiert (Rotor SW28, 1 2°C, 27.500 Upm (r_AV = 100.000 Upm), 4 Gefäße ä 35 ml). Die Ultrazentrifugen-Überstände werden mit Extraktionspuffer auf 200 ml aufgefüllt.

- Kationenaustauscher

5 ml S-Sepharose fast flow (Pharmacia, Freiburg) werden mit 2x je 50 ml 2 M NaCI aufgeschüttelt und absitzen gelassen. Die S-Sepharose wird danach in 1 5 ml Kationpuffer A aufgeschüttelt und in eine 1 ,5 cm Säule gegossen, absitzen gelassen und mit 2 x 20 ml Kationpuffer A gewaschen (ca. 1 ml/min.) . Die S- Sepharose-Säule wird mit dem Stempel luftblasenfrei (unter Pufferzulauf) an ein vorbereitetes BioRad Econo-System (FPLC) angeschlossen und so lange mit Kationpuffer A gewaschen bis sich der Gradientenmonitor auf 0% B eingependelt hat.

Programm: 0' C 200' A

230' L 230' 0% B

(6 S.V.) 50% B (30 S.V.) 100% B

410' 100% B (6 S.V.)

unfraktioniertes Volumen: 230 ml fraktioniertes Volumen: 41 0 ml 1 20 Fraktionen ä 1 ,5ml

Die Analyse des Auftrages, des Durchflußes, des Waschens und der aufgefangenen Fraktionen erfolgt im Western Blot mit Maus-anti-tag-Antikörper ( 1 :2000; Stock: 2mg/ml) und Ziege-anti-Maus-Antikörpern (Peroxidase-gekoppelt) ( 1 :5000; Dianova, Hamburg) sowie anschließender Enhanced Chemiluminesence (ECL) . Die HPV 1 6/1 8 E6-tag-haltigen Fraktionen werden vereinigt und 3x gegen das 20-fache Volumen Anionpuffer A mit vorbehandelten Dialyseschläuchen bei Raumtemperatur dialysiert ( 1 :8000; Pufferwechsel) und für den Anionenaus- tausch mit Anionpuffer A auf 1 00 ml aufgefüllt.

Anionenaustauscher 2 ml Q-Sepharose fast flow (Pharmacia, Freiburg) werden mit 2x je 50 ml 2 M NaCI aufgeschüttelt und absitzen gelassen. Die Q-Sepharose wird danach in 10 ml Anionpuffer A aufgeschüttelt und in eine 1 cm Säule gegossen, absitzen gelassen und mit 2 x 1 0 ml Anionpuffer A gewaschen (ca. 1 ml/min.). Die Q- Sepharose-Säule wird mit dem Stempel luftblasenfrei (unter Pufferzulauf) an ein vorbereitetes BioRad Econo-System (FPLC) angeschlossen und so lange mit Anionpuffer A gewaschen bis sich der Gradientenmonitor auf 0% B eingependelt hat.

Programm: 0' C

1 00' A

1 20' L 1 20' 0% B

( 1 0 S.V.) 1 80' 50% B (30 S.V.)

1 80' 1 00% B

200' 100% B (6 S.V.)

unfraktioniertes Volumen: 1 20 ml fraktioniertes Voll umen: 200 ml 80 Fraktionen ä 1 ml

Die Analyse des Auftrages (Lösung vor Auftrag auf die Säule), des Durchflußes (Lösung, die nicht an die Säule bindet), der Waschlösung und der aufgefangenen Fraktionen erfolgt im Western Blot mit Maus-anti-tag-Antikörper ( 1 :2000; Stock: 2mg/ml) und Ziege-anti-Maus-Antikörpern (Peroxidase-gekoppelt 1 : 5000; Dianova, Hamburg) sowie anschließender Enhanced Chemiluminesence (ECL). Die HPV E6 tag-haltigen Fraktionen werden vereinigt, jeweils getrennt für HPV 1 6 E6 und

HPV 1 8 E6.

Die derart gereinigten HPV 1 6 bzw. 1 8 E6-tag-Proteine werden ferner auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen, elektrophoretisch aufgetrennt und silberge- färbt. Als Kontrollen werden 0,01 % der Proteine des Auftrags (A) und des

Durchflußes (F) aufgetragen. Das Ergebnis dieser Gelelektrophorese ist in Fig. 1 gezeigt.

Hydrophobe Interaktions Chromatographie (HIC) Dieser zusätzliche Reinigungsschritt wird nur bei Bedarf durchgeführt.

2 ml Butyl-Sepharose (Pharmacia, Freiburg) werden mit 10 ml HIC-Puffer A aufgeschüttelt und in eine 1 cm Säule gegossen, absitzen gelassen und mit 2 x 1 0 ml HIC Puffer A gewaschen (ca. 1 ml/min.) . Die Butyl-Sepharose-Säule wird mit dem Stempel luftblasenfrei (unter Pufferzulauf) an ein vorbereitetes BioRad Econo-System (FPLC) angeschlossen und so lange mit HIC-Puffer A gewaschen bis sich der Gradientenmonitor auf 0% B eingependelt hat.

Programm: 0' C

100' A 1 20' L 120' 0% B

( 1 0 S.V.) 120' 100% B

150' 100% B (6 S.V.)

unfraktioniertes Volumen: 120 ml fraktioniertes Volumen: 1 50 ml 30 Frak- Die Analyse des Auftrages, des Durchflußes, des Waschens und der aufgefangenen Fraktionen erfolgt im Western Blot mit Maus-anti-tag-Antikörper ( 1 :2000; Stock: 2mg/ml) und Ziege-anti-Maus-Antikörpern (Peroxidase-gekoppelt 1 :5000; Dianova, Hamburg) sowie anschließender Enhanced Chemiluminesence (ECL). Die HPV 1 6 bzw. 1 8 E6-tag-haltigen Fraktionen werden vereinigt.

Rückfaltung Die vereinigten Anionenfraktionen (bzw. HIC-Fraktionen, falls HIC durchgeführt worden ist) werden mit Anionpuffer A (bzw. HIC-Puffer B) auf eine Proteinkon- zentration von 1 mg/ml verdünnt und zur vollständigen Denaturierung zunächst

3 x gegen das 1 0-fache Volumen Denaturierungspuffer dialysiert. Zur Rückfaltung werden die völlig denaturierten E6-tag-Proteine schlagartig 1 :400 bis 1 : 1 600 in Rückfaltungspuffer verdünnt und bei Raumtemperatur für 1 2 bis 24 Stunden stehengelassen.

BEISPIEL 2

Ubiquitinilierunqstest

³⁵S-markiertes, in-vitro translatiertes p53-Protein, HPV E6-assoziiertes Protein und Ubiquitin werden mit steigenden Mengen der gemäß Beispiel 1 gereinigten und rückgefalteten HPV E6-tag-Proteine inkubiert und eine SDS-Gelelektrophore- se wird durchgeführt. Nach Exposition werden auf dem Röntgenfilm Banden sichtbar, die eine p53-Ubiquitin-Komplex-Bildung anzeigen. Dies bedeutet, daß das in Beispiel 1 erhaltene E6-Protein funktionell aktiv (nativ) ist, da nur ein solches die Ubiquitin-Komplexbildung ermöglicht. Das Ergebnis des Ubiquitinilie- rungstests ist in Fig. 2 gezeigt. Aus Fig. 2 läßt sich die gesteigerte Menge funktioneilen E6-Proteins durch Verwendung des angegebenen Rückfaltungs- puffers, entnehmen.

BEISPIEL 3 {al ELISA mit einem HPV 1 6E7-Protein

Zur Durchführung eines ELISA wird analog zu Beispiel 1 gereinigtes und rückgefaltetes HPV 1 6 E7 Protein in einem Carbonatpuffer, pH 9,6, verdünnt. Zur Be- Schichtung einer 96-Loch-Platte werden pro Loch 1 00 ng des HPV-Proteins sowie einmal Carbonatpuffer als Leerkontrolle zugegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C schließen sich 6 kurze Waschschritte mit PBS, 0,05% Tween 20 an. Anschließend erfolgt die Blockierung freier Bindungsstellen des polymeren Trägers durch einstündige Inkubation mit einem irrelevanten Protein, z.B.

Schweinehaut-Gelatine, BSA oder Casein in PBS bei 37 °C. Seren von Patientinnen mit Cervix-Carcinomen und von Kontrollpersonen aus Tansania bzw. Mexiko werden in PBS ( 1 :50 Verdünnung) 1 Stunde bei 37 °C auf der Platte inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS, 0,05% Tween 20 wird ein allgemein erhältli- eher Peroxidase-gekoppelter Ziege anti-Mensch Antikörper (Zymed Laboratories,

CA, USA; Verdünnung nach Angabe des Herstellers) zugegeben. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C erfolgt ein erneutes Waschen und anschließend die Peroxidase-Nachweisreaktion mit TMB-Entwicklungslösung (50 mM Natrium- acetat, 0,4 mM 3,3',5,5'-Tetramethyl-benzidin-dihydrochlorid, 4,4 mM H₂O₂) innerhalb 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Abstoppen der Reaktion mit 1 M Schwefelsäure wird die Farbintensität photometrisch bei 450 nm bestimmt.

Es zeigt sich, daß durch ein erfindungsgemäß gereinigtes und rückgefaltetes HPV 1 6 E7-Protein HPV-spezifische Antikörper in Seren von Cervix-Carcinom-

Patientinnen nachgewiesen werden können. Das Prinzip des ELISA ist in Fig. 5 gezeigt.

ELISA mit einem HPV 1 6 E6- bzw. HPV 1 8 E6-Protein Zur Durchführung eines ELISA mit dem HPV 1 6 E6 tag-Protein bzw. HPV 1 8 E6 tag-Protein von Beispiel 1 wird eine 96-Loch-Platte mit 200 ng pro Loch des allgemein erhältlichen, gegen das tag Polypeptid gerichteten monoklonalen Maus- Antikörpers Mab tag (KT3) beschichtet. Hierzu wird die Platte mit dem in vorstehendem Carbonatpuffer gelösten Antikörper über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach 6 kurzen Waschschritten mit PBS, 0,05% Tween 20 wird das in vorstehendem Rückfaltungspuffer gelöste HPV 1 6 E6-tag-Protein bzw. HPV 1 8 E6- tag-Protein in einer Menge von 200 - 300 ng pro Loch zugegeben. Die weiteren Verfahrensschritte erfolgen wie in Beispiel 3(a) .

Es zeigt sich, daß durch ein erfindungsgemäß gereinigtes und rückgefaltetes HPV 1 6 E6-tag-Protein bzw. HPV 1 8 E6-tag-Protein HPV-spezifische Antikörper in Seren von Cervix-Carcinom-Patientinnen nachgewiesen werden können. Die Ergebnisse der ELISA sind in den Figuren 3 und 4 gezeigt. Das allgemeine Prinzip des Sandwich HPV-tag-Protein-ELISA ist in Fig. 5 gezeigt.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1 . Verfahren zur Reinigung und Rückfaltung von HPV-Proteinen, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Extraktion von Proteinen aus Zellen,

(b) Durchführung einer Kationenaustauscher-Chromatographie,

(c) Durchführung einer Anionenaustauscher-Chromatographie, und

(d) Verdünnung der Proteinfraktionen in einem ein Detergenz und ein Phospholipid enthaltenden Rückfaltungspuffer.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das HPV-Protein ein HPV E6- oder HPV E7-Protein ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das HPV-Protein von HPV 1 6 oder 1 8 stammt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, wobei der Rückfaltungspuffer ferner ein Reduktionsmittel und ein Zinksalz enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Rückfaltungspuffer folgendes umfaßt: 1 0-50 mM HEPES/NaOH, pH 7,2

1 0-100 μM ZnCI₂

1 -5 mM DTT

1 -1 0% Glycerin

0, 1 -5 mg/ml Lauryl-Malatosid 1 00-500 μg/ml Phosphatidylinositol

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5, wobei zwischen Schritt (c) und (d) ferner eine HIC-Chromatographie stattfindet.

7. Verwendung des nach einem der vorhergehenden Ansprüche erhaltenen HPV-Proteins in immunologischen Verfahren.

8. Verwendung des HPV-Proteins nach Anspruch 7 als Immunogen für Vakzinierungen.

9. Verwendung des HPV-Proteins nach Anspruch 7 in einem ELISA zum Nachweis von HPV-Antikörpern.

1 0. Verwendung des HPV-Proteins nach Anspruch 7 zur Bestimmung von die Bindung des HPV-Proteins an zelluläre Proteine inhibierenden Substanzen.