ES2238071T3 - Antigenos recombinantes de vih-2 derivados de adn sintetico. - Google Patents

Abstract

EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTA UN METODO PARA SINTETIZAR GENES QUE CODIFICAN PROTEINAS UNICAS ENVOLVENTES DEL VIH-2 Y SUS FRAGMENTOS, PERMITIENDO ASI LA SOBREEXPRESION DE ESTAS PROTEINAS EN E. COLI. LAS PROTEINAS ENVOLVENTES DEL VIH Y SUS FRAGMENTOS SE HAN EXPRESADO A ALTOS NIVELES COMO PROTEINAS INDIVIDUALES O EN FUSION CON OTRAS PROTEINAS. LAS PROTEINAS ENVOLVENTES DEL VIH ASI EXPRESADAS EN E. COLI SE PUEDEN UTILIZAR DE FORMA EFECTIVA PARA LA DETECCION DE UNA EXPOSICION AL VIH-2 ASI COMO PARA LA DISCRIMINACION DEL VIH-1 Y DEL VIH-2.

Description

Antígenos recombinantes de VIH-2 derivados de ADN sintético.

Antecedentes de la invención

La presente invención está relacionada con antígenos de VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana) recombinantes. Los antígenos recombinantes derivados del clonaje molecular y de la expresión en un sistema de expresión heterólogo de las secuencias sintéticas de ADN de los distintos antígenos del VIH pueden ser utilizados como reactivos para la detección de anticuerpos y antígeno en fluidos corporales de individuos expuestos a distintos aislados del VIH.

Ha sido determinada la secuencia nucleótida del genoma provírico para distintos aislados del VIH, incluyendo las cepas del VIH-1: VLTH-III (Ratner et al., Nature (1985) 313:277); ARV-2 (Sanchez-Pescador et al., Science (1985) 227:484); LAV (Wain-Hobson, et al., Cell (1985) 40:9); y CDC-451 (Desai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:8380). La secuencia nucleótida del aislado ROD del VIH-2 fue reportada por Guyader et al. (Nature (1987) 326:662).

Han sido obtenidos antígenos de VIH procedentes del virus cultivado en cultivo celular, o de un fragmento genómico clonado molecularmente expresado en huéspedes heterólogos, tales como el Escherichia coli. El virus derivado del cultivo celular implica el incómodo y a menudo difícil proceso de cultivar células infectadas con el virus en condiciones rigurosas de esterilidad. Además, el virus derivado de cultivo celular es infeccioso y, por lo tanto, es peligroso para la salud de los individuos involucrados en la propagación y purificación. La expresión de los fragmentos genómicos del VIH clonados molecularmente supera el problema de riesgo biológico. Por lo general, un fragmento genómico de VIH procedente de un único aislado de VIH con codones de mamíferos es expresado en un sistema heterólogo, como la bacteria o la levadura, y se encuentra limitado a la utilización de los sitios de restricción disponibles para la clonación y expresión presentes en el genoma vírico.

Ha sido complicado el obtener expresión en los sistemas heterólogos de algunas de las proteínas del VIH, como el antígeno envoltura gp41 del VIH-1. Varios investigadores han intentado la deleción de las regiones hidrofóbicas del gp41 del VIH-1 con el fin de incrementar los niveles de expresión. La Solicitud de Patente británica GB 2188639 revela una proteína génica gag/env del VLTH-III, en donde el fragmento env de la secuencia de ADN suprimió los codones correspondientes a la primera región hidrofóbica de la proteína gp41. La patente americana Nº 4.753.873 revela un fragmento de péptido que es codificado por una secuencia nucleótida, en donde son suprimidos los nucleótidos que codifican para una primera y una segunda región hidrofóbica del gp41 del VLTH-III.

Una expresión pobre puede ser el resultado de muchos factores, incluyendo la secuencia de ácido nucléico específica del gen a ser expresado, que los codones de mamífero de la secuencia génica a ser expresada pueden no estar eficientemente trascritos y traducidos en un sistema heterólogo determinado, y la estructura secundaria del ARN mensajero transcrito. La utilización de fragmentos sintéticos de ADN puede incrementar la expresión en sistemas heterólogos.

Resumen de la invención

Son proporcionados antígenos recombinantes, los cuales son derivados del clonaje molecular y de la expresión de secuencias sintéticas de ADN en huéspedes heterólogos. Son proporcionadas adicionalmente secuencias sintéticas de ADN que codifican para los antígenos recombinantes de la invención. Las secuencias sintéticas de ADN seleccionadas para la expresión de varios antígenos de VIH están basadas en la secuencia de aminoácido de un único aislado o de varios aislados, optimizada por expresión en Escherichia coli por medio de selección de codón específico. La secuencia sintética de ADN proporciona una mayor expresión del antígeno en particular codificado. Estos antígenos pueden ser substituídos por antígenos víricos derivados de cultivo de tejido para su utilización como reactivos diagnósticos y terapéuticos.

La presente invención puede ser utilizada para sintetizar el gen envoltura de transmembrana de longitud total del VIH utilizando codones bacterianos. Otro aspecto de la invención está relacionado con el ligado de secuencias, las cuales son expresadas pobremente como proteínas individuales, a secuencias que son expresadas con una alta eficiencia. Puede ser conseguida la combinación de la secuencia de la región codificadora completa de un gen de un virus con secuencias codificadoras de otro gen de un virus diferente, con el fin de producir una proteína de fusión. Las proteínas de fusión así expresadas poseen una ventaja única al poseer epítopes antigénicos de dos antígenos víricos.

La presente invención incluye genes sintéticos de longitud total (FSG) para la glucoproteína de transmembrana del VIH-2 (TMP).

Descripción de los dibujos

La Fig. 1 ilustra el ADN y la secuencia de aminoácido de la TMP del VIH-2 sintética de longitud total, indicando las enzimas de restricción utilizadas para el ensamblaje del gen, incluyendo secuencias ligando a ambos extremos con el fin de facilitar el clonaje.

La Fig. 2 ilustra los tres subfragmentos mayores utilizados para construir el gen de la TMP del VIH-2 sintético.

La Fig. 3 es un diagrama esquemático del ensamblaje de los subfragmentos mayores con el fin de formar la TMP del VIH-2 sintética de longitud total y su clonaje en pUC8 para generar pJC28.

La Fig. 4 es un diagrama esquemático del clonaje del fragmento A de la TMP del VIH-2 sintética en pUC19, con el fin de generar pJC22, y en pTB210 para generar pJC100.

La Fig. 5 es un diagrama esquemático del clonaje de la TMP del VIH-2 sintética en vectores de expresión lambda pL, con el fin de generar pSD306 y pSD307.

La Fig. 6 indica las secuencias de aminoácido específicas de los constructos pL pSD306 y pSD307, indicando todas las secuencias ligando, secuencias gag del VIH-1 y secuencias TMP del VIH-2.

La Fig. 7 ilustra los resultados del análisis de expresión del pSD306 en células de E. coli CAG456. A) gel teñido con Coomassie; B) Inmunoblot utilizando suero humano positivo al VIH-2.

La Fig. 8 ilustra los resultados del análisis de expresión del pSD307 en células E. coli pRK248.clts/RR1. A) gel teñido con Coomassie; B) Inmunoblot utilizando suero humano positivo al VIH-2.

Descripción detallada de la invención

Pueden ser sintetizados fragmentos sintéticos de ADN del genoma del VIH basándose en sus secuencias de aminoácido correspondientes. Comparando la región particular de interés entre distintos aislados, puede ser seleccionada una secuencia que sea diferente de cualquier secuencia existente en la naturaleza, al ser la secuencia una compilación de las secuencias de varios aislados.

Pueden ser incorporadas a la secuencia otras propiedades. Por ejemplo, los codones pueden ser cambiados para conseguir una expresión óptima en bacteria o levadura, pueden ser introducidos sitios de restricción específica, y pueden ser eliminados otros sitios de restricción. Adicionalmente, la secuencia debe poseer sitios de restricción específica en ambos extremos 5' y 3' del fragmento, con el fin de facilitar el clonaje en un vector particular. Pueden ser sintetizados fragmentos sintéticos de ADN como sigue: (1) selección de una única secuencia proteínica, (2) traducción reversa para determinar la secuencia complementaria de ADN, (3) optimización de los codones para la expresión en bacteria o levadura, e (4) introducción y/o eliminación de sitios de restricción específica.

Sesenta y un codones de nucleótido distintos codifican para 20 aminoácidos, dando lugar a la degeneración en el código genético. Los investigadores han reportado las frecuencias de codones utilizados en los ácidos nucléicos tanto para organismos eucarióticos como para organismos procarióticos. (Grantham et al., Nucleic Acids Res. [1980] 9:r43; Gouy et al., Nucleic Acids Res. [1982] 10:7055; Sharp et al., Nucleic Acids Res. [1986] 14:7737). Han sido analizadas secuencias procedentes del genoma completo de E. coli, con ejemplos de secuencias procedentes del cromosoma, de los transposones, y de los plásmidos. Estas secuencias codifican para proteínas estructurales, enzimas y proteínas reguladoras. Se ha mostrado que existe una correlación entre el grado de sesgo codónico dentro de un gen particular y el nivel de expresión génica.

Se prefiere que sea utilizado el mismo triplete codón para cada aminoácido particular de la secuencia sintética de ADN. Sin embargo, puede ser utilizado un codón(es) alternativo con el fin de añadir o eliminar un sitio de restricción particular. La secuencia debería incluir sitios de restricción únicos, los cuales pueden ser utilizados para eliminar un fragmento o secuencia específicos, o substituir una secuencia particular en caso de que exista un error en la síntesis original.

Los sistemas vectoriales que pueden ser utilizados incluyen los sistemas de expresión de planta, bacterianos, de levadura, de insecto, y de mamífero. Se prefiere que los codones se encuentren optimizados para la expresión en el sistema utilizado. Las proteínas y polipéptidos proporcionados por la invención, los cuales son clonados y expresados en sistemas heterólogos, según es descrito más arriba, pueden ser utilizados para propósitos diagnósticos y terapéuticos.

Un sistema de expresión preferido utiliza el sistema de vector pL lambda. Este sistema de expresión posee las siguientes características: (1) un promotor fuerte de pL lambda, (2) un terminador de traducción fuerte de tres marcos rrnBt1, y (3) inicios de traducción en un codón ATG, a ocho pares de bases del sitio de unión del ribosoma localizado dentro de un sitio de restricción Ncol accesible.

Otra ventaja del sistema de expresión de la presente invención es que se pueden hacer a medida los fragmentos sintéticos de ADN, de tal forma que contengan secuencias de ADN específicas, las cuales expresan proteínas con las secuencias de aminoácido deseadas y, además, nos permite la capacidad de añadir, tanto al extremo 5' como al 3', otras secuencias de ADN con el fin de facilitar la transferencia de fragmentos sintéticos en distintos vectores.

Adicionalmente, la utilización de sitios de restricción particulares a ambos extremos del fragmento puede facilitar también la incorporación del fragmento a otras secuencias para generar proteínas de fusión, las cuales pueden ser utilizadas también como reactivos diagnósticos y terapéuticos, los cuales pueden ser utilizados, por ejemplo, en un sistema de escrutinio de ensayo único, para la detección de ambos SIDAS y de la Hepatitis B en donantes de sangre potenciales. De forma alternativa, el ensayo puede ser utilizado para seguir el curso de la infección en un paciente.

Pueden ser utilizadas otras proteínas procedentes de cualquier fuente, incluida la bacteriana, de levadura, de insecto, de planta o de mamífero, junto con los fragmentos sintéticos de ADN de la invención, con el fin de producir proteínas de fusión. Son preferidas especialmente aquéllas que son expresadas eficientemente en sus respectivos sistemas de expresión, ya que pueden mejorar la expresión del fragmento sintético de la proteína de fusión.

Las secuencias sintéticas de ADN de la presente invención, derivadas de distintos aislados de VIH y optimizadas para su expresión en E. coli, proporcionan disponibilidad continua y uniformidad de los preparados de antígeno de VIH, los cuales reconocerán el suero control procedente de individuos expuestos a variantes de aislados de VIH distinguibles genéticamente. La expresión del antígeno recombinante es muy estable, ya que han sido utilizados para su síntesis codones de E. coli. Además, la inserción de sitios de restricción específica permite la inserción, supresión o substitución en epítopes antigénicos importantes en las secuencias codificadoras, una propiedad difícil de conseguir cuando son utilizadas para la expresión secuencias naturales de VIH. La construcción de genes sintéticos permite también la inclusión de secuencias proteínicas tanto en el extremo amino- como en el carboxil- del gen, permitiendo de esta forma el desarrollo de reactivos nuevos. Por ejemplo, la secuencia de ADN del antígeno core del VIH-1 puede ser fusionada con las secuencias gp41 del VIH-2, pudiendo ambas ser expresados a altos niveles en sistemas huésped heterólogos tales como el E. coli.

Una cepa de E. coli conteniendo un plásmido útil para constructos de la invención ha sido depositada en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, el 22 de Noviembre de 1988, bajo la acesión nº ATCC 67856 (pSD306/CAG456).

Los siguientes ejemplos describen más a fondo la invención. No se pretende que los ejemplos limiten la invención en ninguna manera.

Reactivos y enzimas

Fueron obtenidos medios de cultivo tales como el Luria-Bertani (LB) y el Superbroth II (Dri Form) de Gibco Laboratories Life Technologies, Inc., Madison, Wisconsin. Fueron comprados enzimas de restricción, fragmentos Klenow de la ADN polimerasa I, la ADN ligasa T4, la T4 polinucleótido quinasa, estándares de peso molecular de ácido nucléico, el sistema secuenciador M13, X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indonil-\beta-D-galactosida), IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactosida), glicerol, Ditiotreitol, 4-cloro-1-naftol, de Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana; o de New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts; o de Bethesda Research Laboratories Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. Estándares de peso molecular de proteína pretintada, acrilamida (cristalizada, grado electroforético >99%); N-N'-Metileno-bis-acrilamida (BIS); N,N,N',N',-Tetrametiletilenodiamina (TEMED) y dodecilsulfato sódico (SDS), fueron comprados de BioRad Laboratories, Richmond, California. La lisozima y la ampicilina fueron obtenidas de Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. Anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano picante (HRPO) fueron obtenidos de Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland. La agarosa Seaplaque (agarosa de bajo punto de fusión) fue comprada de FMC Bioproducts, Rockland, Maine.

T50E10 contenía 50 mM de Tris, pH 8,0, 10 mM de EDTA; TG 1X contenía 100 mM de Tris, pH 7,5, y glicerol 10%; tampón de carga SDS/PAGE 2X consistía en glicerol 15%, SDS 5%, 100 mM de Tris base, 1M de \beta-mercaptoetanol y tinte azul Bromofenol 0,8%; TBS contenía 50 mM de Tris, pH 8,0, y 150 mM de cloruro sódico; la solución bloqueadora consistía en leche descremada en polvo Carnation al 5% en TBS.

Cultivos de células huésped. Fuentes de ADN y vectores

Células JM103 de E. coli, vectores de clonaje pUC8, pUC18, pUC19 y M13, fueron comprados de Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, New Jersey; cepas competentes de Epicurean™ coli XL1-Azul y JM109 fueron compradas de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California. Células RR1 fueron obtenidas de Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut; y células CAG456 de E. coli lo fueron del Dr. Carol Gross, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin. El vector pRK248.clts fue obtenido del Dr. Donald R. Helinski, University of California, San Diego, California.

Métodos generales

Todas las digestiones de enzimas de restricción fueron llevadas a cabo conforme a las instrucciones de los proveedores. Fueron utilizadas al menos 5 unidades de enzima por microgramo de ADN, y se permitió la incubación suficiente para que pudieran completarse las digestiones de ADN. Fueron utilizados procedimientos estándar para el preparado de ADN lisado mini celular, extracción por fenol-cloroformo, precipitación de ADN con etanol, análisis de restricción de ADN en agarosa, y purificación en gel de agarosa de bajo punto de fusión de fragmentos de ADN (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor, 1982]). Para aislamientos de plásmido procedentes de cepas de E. coli utilizaron el procedimiento de lisis alcalina y el método de gradiente de densidad de cloruro de cesio-bromuro de etidio (Maniatis et al., supra). Fueron utilizados tampones estándar para la ADN ligasa T4 y la T4 polinucleótido quinasa (Maniatis et al., supra).

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis y clonaje de la TMP sintética del VIH-2 y de fragmento de la misma

La proteína de transmembrana completa del VIH-2 (TMP) fue sintetizada químicamente utilizando el método de reparación de rotura de la doble hebra dirigida por oligonucleótido, revelado en la Solicitud de Patente americana Serie Nº 883.242, inscrita el 8 de julio de 1986 por Mandecki (EPO 87109357.1), la cual es incorporada aquí como referencia. Los residuos aminoacídicos de la envuelta 502-858 del aislado ROD del VIH-2 (numeración por Guyader et al., supra) fueron sometidos a traducción inversa utilizando asignaciones de codón óptimas para la expresión en E. coli. Después de que los nucleótidos específicos fueran asignados a los nucleótidos ambiguos restantes, conforme es descrito previamente, fue generada la secuencia de longitud total de la TMP, según es indicado en la Fig. 1. El gen sintético fue ensamblado y clonado como tres subfragmentos separados, representados por el fragmento A -un fragmento HindIII-Ncol de 335 pb-, el fragmento B -un fragmento Ncol-BamHl de 309 pb (29 residuos de aminoácido hidrofóbico eliminados)-, y el fragmento C -un fragmento BamHI-HindIII de 362 pb-, conforme es representado en la Fig. 2. Un cuarto fragmento conteniendo los veintinueve residuos de aminoácido hidrofóbico eliminados fue clonado en el fragmento Ncol-BamHI de 309 pb, como un fragmento EcoRV-SnaBI (Fig. 2). Los tres subfragmentos mayores fueron clonados en vectores pUC, transformados en células JM109 y fueron confirmadas sus secuencias nucleótidas primarias, según es descrito previamente. A continuación, los fragmentos fueron purificados en gel y ligados juntos para formar la TMP sintétida de longitud total del VIH-2 de 1089 pb. Este fragmento HindIII de 1089 pb fue clonado en pUC8 y fue designado como pJC28 (Figura 3).

El fragmento A codificando el amino-terminal de 108 aminoácidos de la TMP del VIH-2 (desde Tyr 502 a Trp 609 [Guyader et al., supra]) fue clonado en los sitios HindIII-Sall del pUC19. Un clon, designado como pJC22, fue identificado por mapeo de restricción y fue confirmada su secuencia nucleótida primaria. El plásmido pJC22 fue digerido con HindIII-Asp718 para liberar un fragmento de 361 pb conteniendo el fragmento génico sintético de la TMP del VIH-2, el cual fue ligado a los sitios HindIII-Asp718 del plásmido pTB210 y fue transformado en células XL1 de E. coli. El plásmido pTB210 es revelado en una Solicitud de Patente americana con el título "CSK Method of Protein Synthesis", registrada al mismo tiempo por T. Bolling et al., la cual es un CIP de una solicitud anterior, Nº de Serie americana 167.067, registrada el 11 de marzo de 1988, la cual es incorporada aquí como referencia. Un clon, designado como pJC100 (Fig. 4), fue aislado y sometido a mapeo de restricción para identificar el gen híbrido de kdsB (codificando CKS) y el fragmento de la TMP del VIH-2.

Ejemplo 2 Clonaje de la TMP sintética del VIH-2 en vectores pL lambda

El fragmento HindIII de 1089 pb, conteniendo la TMP completa del VIH-2, fue aislado del pJC28, rellenado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I con el fin de producir extremos romos, y fue clonado directamente detrás de un codón de inicio ATG proporcionado por el sitio NcoI rellenado del pSD305 (pSDKR816) con clts insertados. El vector pSDKR816 contiene el promotor fuerte pL lambda y el gen represor termosensible cl descrito en Benard et al., Gene (1979) 5:59. Tal vector es un derivado del pBR322, conteniendo un promotor pL lambda y una secuencia sintética Shine-Dalgarno, seguido de un sitio de restricción utilizado para el clonaje de distintos genes de interés. Adicionalmente, este vector contiene el terminador de traducción fuerte de tres marcos rrnBt1. El vector pSDKR816 contiene un sitio de restricción Ncol, el cual proporciona un codón de inicio ATG espaciado óptimamente del inicio de transcripción. De forma similar, fue aislado del pJC28 un fragmento Sall-Asp718 de 1097 pb, conteniendo la TMP completa del VIH-2, fue rellenado con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I con el fin de producir extremos romos y fue clonado en el sitio Smal del pKRR955 (Vector conteniendo el promotor fuerte pL lambda y el gen represor termosensible cl descrito en Benard et al. Gene (1979) 5:59. Tal vector es un derivado del pBR322, conteniendo un promotor pL lambda y una secuencia sintética Shine-Dalgarno, seguido por un sitio de restricción utilizado para el clonaje de distintos genes de interés. Adicionalmente, este vector contiene el terminador de traducción fuerte de tres marcos rrnBt1, para producir una proteína de fusión gag del VIH-1/TMP del VIH-2. El clon conteniendo el gen de la TMP del VIH-2 bajo control del promotor pL lambda fue designado como pSD306, y el clon conteniendo la TMP del VIH-2 como una fusión con el gag del VIH-1 bajo control del promotor pL lambda fue designado como pSD307, conforme es esbozado en la Fig. 5. Después de la transformación del pSD306 en células CAG456 de E. coli (Baker, PNAS (1984) 81:6779) y del pSD307 en células pRK248.clts/RR1 de E. coli, clones de célula única fueron aislados y sometidos a mapeo de restricción para demostrar la presencia y orientación del gen de la TMP del VIH-2. Las secuencias de aminoácido específicas del pSD306 y del pSD307 son presentadas en la Fig. 6, indicando secuencias derivadas ligando, secuencias gag del VIH-1 y secuencias TMP del VIH-2. Las expresión del gen sintético de la TMP del VIH-2 fue inducida en estos cultivos por métodos de cambio de temperatura (las células fueron cultivadas en medio de cultivo Superbroth II a 30ºC, a un OD600 de 0,5, en cuyo momento los cultivos fueron pasados a 42ºC para inactivar el represor termosensible cl y, de esta forma, inducir la expresión del promotor pL lambda). Partes alícuotas de los cultivos, antes y después de la inducción, fueron sometidas a análisis SDS/PAGE tanto para teñido con azul Coomassie como para inmunoblotting, utilizando suero humano positivo al VIH-2, como sigue.

Las células fueron nodulizadas, a continuación resuspendidas en tampón TG 1X o en tampón T50E10. Fue añadido un volumen igual de tampón de carga SDS/PAGE 2X a las células suspendidas en TG 1X, con el fin de producir el lisado completo. La muestra resuspendida en T50E10 fue sonicada ocho veces durante 30 segundos cada vez, a una potencia de 10 vatios, utilizando el microtip proporcionado con el Sonicador Vibra-Cell (Sonics and Materials, Inc., Danbury, CT). La muestra sonicada fue centrifugada a continuación para eliminar la fracción no soluble, la cual fue resuspendida en el volumen de inicio original del T50E10. Fue añadido un volumen igual de tampón de carga SDS/PAGE 2X a ambas fracciones, la soluble sonicada y la no soluble, las cuales junto con el lisado celular completo, fueron hervidas durante 5 minutos, centrifugadas para eliminar cualquier material no soluble restante, y fueron separadas partes alícuotas (15 \mul) en geles duplicados SDS/PAGE al 12,5%. Las proteínas de uno de estos geles fueron transferidas electroforéticamente a nitrocelulosa para inmunoblotting con suero de pacientes con SIDA, conforme se describe previamente. El segundo gel fue fijado en una solución de metanol 50%, ácido acético 10%, durante veinte minutos a temperatura ambiente, y tintados a continuación con tinte azul de Coomassie 0,25%, en una solución de metanol 50%, ácido acético 10%, durante 30 minutos. El destintado fue llevado a cabo utilizando una solución de metanol 10%, ácido acético 7%, durante 3-4 horas, o hasta que fue obtenido un fondo claro.

Los lisados celulares completos y las fracciones solubles y no solubles sonicadas de los cultivos fueron analizados y son ilustrados en las figuras 7 y 8 para los constructos pSD306 y pSD307, respectivamente.

La Fig. 7 presenta la expresión del pSD306 con anterioridad a la inducción (T0) y dos horas después de la inducción (T2), analizado por tintado con azul de Coomassie (Fig. 7A) e inmunoblotting (Fig. 7B). Las muestras fueron: lisado celular completo T0 (banda 1); fracción soluble sonicada T0 (banda 2); fracción no soluble sonicada T0 (banda 3); lisado celular completo T2 (banda 4); fracción soluble sonicada T2 (banda 5); fracción no soluble sonicada T2 (banda 6); y marcadores de peso molecular pre-tintados Bio-Rad (banda M). La Fig. 7 demuestra que el pSD306 expresó una cantidad significativa de la TMP del VIH-2 en el tiempo T2, según es indicado por las flechas tanto por gel tintado con Coomassie como por inmunoblot. Esta proteína expresada es visible tanto en el lisado celular completo como en la fracción celular no soluble sonicada de estos cultivos.

De forma similar, la Fig. 8 presenta la expresión del pSD307 con anterioridad a la inducción (T0) y dos horas después de la inducción (T2), analizada por tintado con azul de Coomassie (Fig. 8A) e inmunoblotting (Fig. 8B). Las muestras fueron: pKRR955, lisado celular completo T2 (banda 1); pSD307, lisado celular completo T0 (banda 2), fracción soluble sonicada T0 (banda 3); fracción no soluble sonicada T0 (banda 4); lisado celular completo T2 (banda 5); fracción soluble sonicada T2 (banda 6); fracción no soluble sonicada T2 (banda 7); y marcadores de peso molecular pre-tintados Bio-Rad (banda M). La Fig. 8 demuestra que el pSD307 expresó una cantidad significativa de la proteína de fusión gag del VIH-1/TMP del VIH-2 en el tiempo T2, según es indicado por las flechas tanto por gel tintado con Coomassie como por inmunoblot. Esta proteína de fusión es visible también tanto en el lisado celular completo como en la fracción no soluble sonicada de estos cultivos. El compañero de fusión gag del VIH-1 (banda 1), aunque presente en niveles más altos que la proteína de fusión gag del VIH-1/TMP del VIH-2, mostró una inmunoreactividad inferior a los anticuerpos específicos del VIH-2.

Ejemplo 3 Utilidad diagnóstica de las proteínas del VIH derivadas de ADN sintético

Las proteínas específicas del VIH sobrexpresadas en E. coli fueron purificadas utilizando procedimientos conocidos en este campo. Las proteínas expresadas a niveles altos eran inmunogénicas y fueron reconocidas por anticuerpos producidos en individuos infectados con VIH (ver Figs. 7 y 8). Las proteínas específicas del VIH derivadas de E. coli pueden ser utilizadas en distintas configuraciones de inmunoensayo, conforme es descrito en la Solicitud CIP americana Nº de Serie 020.282, registrada el 27 de febrero de 1987 por Dawson et al., la cual es incorporada aquí como referencia. La solicitud principal es EPO 86116854.0 (4 de diciembre de 1986). En una configuración preferida, las proteínas específicas del VIH fueron recubiertas en soporte sólido e incubadas con muestras control. Los anticuerpos específicos del virus presentes en la muestra control reconocieron y se encontraban unidos a las proteínas del VIH en el soporte sólido. Los anticuerpos específicos del VIH fueron cuantificados por medio de la utilización de inmunoglobulina anti-humana de cabra conjugada con HRPO.

Los individuos expuestos al VIH-1 fueron detectados por medio de la utilización de proteínas específicas del VIH-1, tales como las proteínas gp41 del VIH-1 y p24 del VIH-1, derivadas por medio de técnicas de ADN recombinante, descritas en la Solicitud CIP Nº de Serie 020.282. Sin embargo, sólo del 70 al 90% de los individuos expuestos al VIH-2 fueron detectados utilizando estas proteínas específicas del VIH-1, debido a la reactividad cruzada entre las dos cepas. Los individuos expuestos al VIH-2, los cuales no fueron detectados utilizando estas proteínas específicas del VIH-1, fueron detectados utilizando proteínas del VIH-2 derivadas de ADN sintético.

Por ejemplo, el fragmento de la TMP del VIH-2 fusionado a CKS (pJC100) cuando es suplementado a las proteínas del VIH-1 recombinante en el soporte sólido descrito más arriba, incrementó de forma significativa la detección de muestras control conteniendo anticuerpos del VIH-2, conforme es ilustrado en la Tabla 1, mas abajo.

TABLA 1

1

De forma adicional, fueron sometidos a escrutinio 3.411 donantes de sangre normal, utilizando el ensayo recombinante VIH-1/VIH-2 descrito más arriba. El ensayo recombinante demostró una especificidad del 99,77%, con sólo ocho (0,23%) muestras reactivas iniciales y cuatro (0,12%) muestras reactivas de repetición.

Ejemplo 4 Diferenciación de infecciones de VIH-1 y VIH-2

Frecuentemente, individuos que han estado expuestos al VIH-2 poseen anticuerpos dirigidos contra epítopes de proteínas del VIH-2, los cuales se encuentran presentes también en proteínas del VIH-1. De igual forma, individuos que han estado expuestos al VIH-1 poseen anticuerpos que muestran reactividad cruzada con proteínas del VIH-2. Debido a que la mayoría de las reacciones cruzadas están relacionadas con los productos génicos gag, fueron utilizadas la proteína pJP100 y una proteína recombinante procedente de la proteína de envoltura del VIH-1 (descrita en la Solicitud CIP Nº de Serie 020.282) con el fin de diferenciar entre individuos infectados con el VIH-1 y el VIH-2.

Fueron desarrollados dos inmunoensayos ligados a enzima independientes. La prueba 1 utilizó proteínas recombinantes del VIH-1 recubiertas sobre una fase sólida. La prueba 2 utilizó la TMP del VIH-2 (pJP100) recubierta sobre una fase sólida. Fueron examinados los especímenes procedentes de individuos seropositivos de VIH procedentes de Estados Unidos, Portugal o África Occidental, con el fin de determinar los anticuerpos utilizando estas dos pruebas. Fueron determinados títulos endpoint por medio de la dilución de los especímenes en plasma humano normal y examinando las diluciones. Conforme es ilustrado en la Tabla 2 más abajo, pueden ser utilizadas de forma efectiva pruebas específicas utilizando proteínas recombinantes sintéticas para diferenciar infecciones de VIH-1 y VIH-2.

TABLA 2

2

Muestras biológicas, las cuales son fácilmente examinadas por medio de los métodos de la presente invención, incluyen fluidos corporales humanos y animales tales como sangre completa, suero, plasma, orina, saliva, heces, linfocito o preparados de cultivo celular, e inmunoglobulinas purificadas y parcialmente purificadas. Los polipéptidos y fragmentos descritos aquí pueden ser utilizados para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos para los antígenos del VIH-1 y del VIH-2 por medio de métodos de ensayo conocidos para aquéllos expertos en este campo, y para distinguir entre infecciones de VIH-1 y de VIH-2.

Uno de tales ensayos comprende:

a) el recubrimiento de un soporte sólido con los polipéptidos y fragmentos de polipéptido aquí revelados;

b) la puesta en contacto del soporte sólido recubierto con la muestra biológica, con el fin de formar un complejo de polipéptido anticuerpo;

c) la eliminación en el soporte sólido de la muestra biológica no unida;

d) la puesta en contacto del complejo en el soporte sólido con una inmunoglobulina marcada específica del anticuerpo; y

e) la detección del marcador para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos de VIH-2 en la muestra biológica.

Un segundo método de ensayo comprende:

a) el recubrimiento de un soporte sólido con los polipéptidos y fragmentos de polipéptido aquí revelados;

b) la puesta en contacto del soporte sólido recubierto con la muestra biológica y los polipéptidos homólogos conjugados con un marcador;

c) la eliminación de la muestra biológica no unida y del polipéptido marcado no unido; y

d) la detección del marcador para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos de VIH-2 en la muestra biológica.

Soportes sólidos que pueden ser utilizados en tales inmunoensayos incluyen pocillos de bandejas de reacción, tubos de ensayo, cápsulas, tiras, membranas, filtros, micropartículas u otros soportes sólidos, los cuales son de sobra conocidos para aquéllos expertos en este campo. Marcadores de partícula enzimáticos, radioisotópicos, fluorescentes, quimioluminiscentes, y coloidales pueden ser utilizados en los ensayos anteriormente mencionados. Adicionalmente, pueden ser utilizados en los ensayos de esta invención los sistemas hapteno/anti-hapteno marcado, tales como un sistema biotina/anti-biotina marcado. Tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales son útiles como reactivos, y los anticuerpos del VIH tanto de tipo IgG como de tipo IgM pueden ser utilizados como soporte sólido o reactivos marcados.

Resulta evidente por los ejemplos anteriores que una persona experta en este campo podría clonar juntos subfragmentos específicos de los genes sintéticos construídos para generar nuevos genes sintéticos que tendrían las mismas características que aquéllos aquí ilustrados. Por ejemplo, el subfragmento gp120 c-term, el BS2-10 y el subfragmento 413-1 pueden ser clonados juntos para producir productos génicos sintéticos útiles como reactivos diagnósticos y terapéuticos para el SIDA.

Claims (13)

1. Un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácido representada por lo siguiente:

3

2. Un fragmento de polipéptido del polipéptido de la Reivindicación 1, comprendiendo una secuencia de aminoácido representada por lo siguiente:

4

3. El polipéptido de las Reivindicaciones 1 o 2 producido por E. coli.

4. Un polipéptido de fusión comprendiendo un polipéptido como el de una de las Reivindicaciones 1-2, en el cual el polipéptido es fusionado a una proteína procariótica o eucariótica.

5. El polipéptido de fusión de la Reivindicación 4, en donde dicha proteína procariótica o eucariótica es la enzima CKS de E. coli.

6. Un gen sintético comprendiendo una secuencia de ADN representada por lo siguiente:

5

7. El gen sintético de la Reivindicación 6 codificando para el polipéptido de la Reivindicación 1.

8. Un gen sintético comprendiendo una secuencia de ADN representada por lo siguiente:

6

9. El gen sintético de la Reivindicación 8, codificando para el polipéptido de la Reivindicación 2.

10. Un polipéptido de fusión comprendiendo un polipéptido como en una de las Reivindicaciones 1-2, en el cual el polipéptido es fusionado a una proteína gag del VIH.

11. El polipéptido de fusión de la Reivindicación 10, en donde dicha proteína gag del VIH es una proteína gag del VIH-1 comprendiendo una secuencia de aminoácido representada por lo siguiente:

7

12. Un método de detección de anticuerpos para antígenos del VIH en un individuo, el cual comprende las fases de:

a)

obtención de una muestra de un fluido corporal, el cual ha sido obtenido del individuo;

b)

incubación de dicho fluido corporal con dicho polipéptido de las Reivindicaciones 1 o 2;

c)

incubación de dicho fluido corporal con un anticuerpo marcado de inmunoglobulina; y

d)

detección de dicho marcador y determinación partiendo del mismo de la presencia o ausencia de anticuerpos para antígenos del VIH.

13. Un método de detección de anticuerpos para antígenos del VIH en un individuo, el cual comprende las fases de:

a)

obtención de una muestra de un fluido corporal, el cual ha sido obtenido del individuo;

b)

incubación de dicho fluido corporal con dicho polipéptido de las Reivindicaciones 1 o 2;

c)

incubación de dicho fluido corporal con un antígeno marcado; y

d)

detección de dicho marcador y determinación partiendo del mismo de la presencia o ausencia de anticuerpos para antígenos del VIH.