JPH11313671A - 合成ｈｉｖ経膜タンパク質およびそれをコ―ドする合成遺伝子 - Google Patents
合成ｈｉｖ経膜タンパク質およびそれをコ―ドする合成遺伝子Info
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- JPH11313671A JPH11313671A JP11048111A JP4811199A JPH11313671A JP H11313671 A JPH11313671 A JP H11313671A JP 11048111 A JP11048111 A JP 11048111A JP 4811199 A JP4811199 A JP 4811199A JP H11313671 A JPH11313671 A JP H11313671A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2740/00011—Details
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- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 異種発現系で効率よく発現させることが可能
な合成ＨＩＶ経膜抗原タンパク質および該たんぱく質を
コードする合成遺伝子を提供する。 【解決手段】 下記アミノ酸配列を有するＨＩＶ経膜抗
原ポリペプチド。 【化１】
な合成ＨＩＶ経膜抗原タンパク質および該たんぱく質を
コードする合成遺伝子を提供する。 【解決手段】 下記アミノ酸配列を有するＨＩＶ経膜抗
原ポリペプチド。 【化１】
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換えＨＩＶ(ヒ
ト免疫不全ウイルス)抗原および該抗原を用いたＨＩＶ
に対する抗体の検出方法に関する。ＨＩＶ抗原の合成Ｄ
ＮＡ配列のモレキュラークローニングおよび異種発現系
での発現から得られた組換え抗原は、種々のＨＩＶ単離
物に暴露された個体から採取した体液中の抗体および抗
原を検出するための試薬として用いることができる。
ト免疫不全ウイルス)抗原および該抗原を用いたＨＩＶ
に対する抗体の検出方法に関する。ＨＩＶ抗原の合成Ｄ
ＮＡ配列のモレキュラークローニングおよび異種発現系
での発現から得られた組換え抗原は、種々のＨＩＶ単離
物に暴露された個体から採取した体液中の抗体および抗
原を検出するための試薬として用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】幾つかのＨＩＶ単離物についてプロウイ
ルスゲノムのヌクレオチド配列が決定されている。たと
えば、ＨＩＶ−１株ＨＴＬＶ−III(ラットナー(Ｒatne
r)ら、Ｎature(１９８５)３１３:２２７);ＡＲＶ−２
(サンチェス−ペスカドール(Ｓanchez−Ｐescador)ら、
Ｓcience(１９８５)２２７:４８４);ＬＡＶ(ウエインー
ホブソン(Ｗain−Ｈobson)ら、Ｃell(１９８５)４０:
９);およびＣＤＣ−４５１(デサイ(Ｄesai)ら、Ｐroc.
Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ(１９８６)８３:８３８０)な
どである。ＨＩＶ−２ ＲＯＤ単離物のヌクレオチド配
列は、ギアダー(Ｇuyader)ら(Ｎature(１９８７)３２
６:６６２)によって報告された。
ルスゲノムのヌクレオチド配列が決定されている。たと
えば、ＨＩＶ−１株ＨＴＬＶ−III(ラットナー(Ｒatne
r)ら、Ｎature(１９８５)３１３:２２７);ＡＲＶ−２
(サンチェス−ペスカドール(Ｓanchez−Ｐescador)ら、
Ｓcience(１９８５)２２７:４８４);ＬＡＶ(ウエインー
ホブソン(Ｗain−Ｈobson)ら、Ｃell(１９８５)４０:
９);およびＣＤＣ−４５１(デサイ(Ｄesai)ら、Ｐroc.
Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ(１９８６)８３:８３８０)な
どである。ＨＩＶ−２ ＲＯＤ単離物のヌクレオチド配
列は、ギアダー(Ｇuyader)ら(Ｎature(１９８７)３２
６:６６２)によって報告された。
【０００３】ＨＩＶ抗原は、組織培養中に増殖したウイ
ルスから、またはモレキュラークローニングし大腸菌の
ような異種宿主中で発現させたゲノム断片から得られて
いる。組織培養由来ウイルスの場合は、ウイルス感染細
胞を増殖させるために、厳重な滅菌条件下での面倒でし
ばしば困難な工程が含まれる。さらに、組織培養由来ウ
イルスは感染性であり、従って増殖および精製に携わる
者の健康にとって有害で危険である。モレキュラークロ
ーニングしたＨＩＶゲノム断片を発現させることによ
り、このような生物学的危険の問題が回避される。一般
に、哺乳動物コドンを有する単一のＨＩＶ単離物からの
ＨＩＶゲノム断片は細菌や酵母などの異種発現系で発現
され、クローニングおよび発現させるために、ウイルス
ゲノム中に存在する利用可能な制限部位を使用すること
に限定される。
ルスから、またはモレキュラークローニングし大腸菌の
ような異種宿主中で発現させたゲノム断片から得られて
いる。組織培養由来ウイルスの場合は、ウイルス感染細
胞を増殖させるために、厳重な滅菌条件下での面倒でし
ばしば困難な工程が含まれる。さらに、組織培養由来ウ
イルスは感染性であり、従って増殖および精製に携わる
者の健康にとって有害で危険である。モレキュラークロ
ーニングしたＨＩＶゲノム断片を発現させることによ
り、このような生物学的危険の問題が回避される。一般
に、哺乳動物コドンを有する単一のＨＩＶ単離物からの
ＨＩＶゲノム断片は細菌や酵母などの異種発現系で発現
され、クローニングおよび発現させるために、ウイルス
ゲノム中に存在する利用可能な制限部位を使用すること
に限定される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ある種のＨＩＶタンパ
ク質、たとえばＨＩＶ−１エンベロープ抗原gp４１を異
種発現系で発現させることは困難であった。幾人かの研
究者は、発現レベルを増加させるためにＨＩＶ−１ gp
４１の疎水性領域を欠失させることを試みている。英国
特許出願ＧＢ２１８８６３９号明細書はＨＴＬＶ−III
gag／env遺伝子タンパク質を開示しており、該ＤＮＡ配
列のenv断片は、gp４１タンパク質の第一の疎水性領域
に対応するコドンが欠失している。米国特許第４,７５
３,８７３号明細書にはヌクレオチド配列によりコード
されたペプチド断片が開示されており、この場合、ＨＴ
ＬＶ−III gp４１の第一および第二の疎水性領域をコー
ドするヌクレオチドは欠失している。
ク質、たとえばＨＩＶ−１エンベロープ抗原gp４１を異
種発現系で発現させることは困難であった。幾人かの研
究者は、発現レベルを増加させるためにＨＩＶ−１ gp
４１の疎水性領域を欠失させることを試みている。英国
特許出願ＧＢ２１８８６３９号明細書はＨＴＬＶ−III
gag／env遺伝子タンパク質を開示しており、該ＤＮＡ配
列のenv断片は、gp４１タンパク質の第一の疎水性領域
に対応するコドンが欠失している。米国特許第４,７５
３,８７３号明細書にはヌクレオチド配列によりコード
されたペプチド断片が開示されており、この場合、ＨＴ
ＬＶ−III gp４１の第一および第二の疎水性領域をコー
ドするヌクレオチドは欠失している。
【０００５】多くの要因、たとえば発現させようとする
遺伝子の特定の核酸配列、発現させようとする遺伝子配
列の哺乳動物コドンは特定の異種発現系では効率よく転
写および翻訳されないこと、および転写したメッセンジ
ャーＲＮＡの二次構造などのために発現がうまくいかな
いことがある。合成ＤＮＡ断片を用いることにより異種
発現系での発現を増大させることができる。
遺伝子の特定の核酸配列、発現させようとする遺伝子配
列の哺乳動物コドンは特定の異種発現系では効率よく転
写および翻訳されないこと、および転写したメッセンジ
ャーＲＮＡの二次構造などのために発現がうまくいかな
いことがある。合成ＤＮＡ断片を用いることにより異種
発現系での発現を増大させることができる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明により、モレキュ
ラークローニングおよび異種宿主中での合成ＤＮＡ配列
の発現により得られた組換え抗原が提供される。さらに
本発明により、本発明の組換え抗原をコードする合成Ｄ
ＮＡ配列が提供される。種々のＨＩＶ抗原の発現のため
に選択した合成ＤＮＡ配列は、単一の単離物かまたは幾
つかの単離物のアミノ酸配列に基づいており、特定のコ
ドンを選択することにより大腸菌中での発現を最適化さ
せる。本発明の合成ＤＮＡ配列により、コードされた特
定の抗原の一層高い発現が得られる。これらの抗原は、
診断試薬および治療試薬として、組織培養から得られた
ウイルス性抗原の代わりに用いることができる。
ラークローニングおよび異種宿主中での合成ＤＮＡ配列
の発現により得られた組換え抗原が提供される。さらに
本発明により、本発明の組換え抗原をコードする合成Ｄ
ＮＡ配列が提供される。種々のＨＩＶ抗原の発現のため
に選択した合成ＤＮＡ配列は、単一の単離物かまたは幾
つかの単離物のアミノ酸配列に基づいており、特定のコ
ドンを選択することにより大腸菌中での発現を最適化さ
せる。本発明の合成ＤＮＡ配列により、コードされた特
定の抗原の一層高い発現が得られる。これらの抗原は、
診断試薬および治療試薬として、組織培養から得られた
ウイルス性抗原の代わりに用いることができる。
【０００７】本発明は、細菌コドンを用い、全長ＨＩＶ
経膜エンベロープ遺伝子を合成するために利用すること
ができる。本発明の他の態様には、個々のタンパク質と
してはほとんど発現されない配列を、高効率で発現され
る配列に連結することが含まれる。ある一つのウイルス
の遺伝子の全コード領域の配列を、異なるウイルスの別
の遺伝子のコード配列と組み合わせて融合タンパク質を
生成することができる。こうして発現した融合タンパク
質は、２つのウイルス抗原の抗原エピトープの素晴しい
利点を有する。本発明は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２
経膜糖タンパク質(ＴＭＰ)のための完全長合成遺伝子
(ＦＳＧ)を含む。
経膜エンベロープ遺伝子を合成するために利用すること
ができる。本発明の他の態様には、個々のタンパク質と
してはほとんど発現されない配列を、高効率で発現され
る配列に連結することが含まれる。ある一つのウイルス
の遺伝子の全コード領域の配列を、異なるウイルスの別
の遺伝子のコード配列と組み合わせて融合タンパク質を
生成することができる。こうして発現した融合タンパク
質は、２つのウイルス抗原の抗原エピトープの素晴しい
利点を有する。本発明は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２
経膜糖タンパク質(ＴＭＰ)のための完全長合成遺伝子
(ＦＳＧ)を含む。
【０００８】以下、本発明をさらに詳しく説明する。Ｈ
ＩＶゲノムの合成ＤＮＡ断片は、対応するアミノ酸配列
に基づいて合成することができる。異なる単離物の間で
特定の領域を比較することにより、天然に存在するいか
なる配列とも異なる配列を選択することができる。なぜ
なら、そのような配列は種々の単離物からの配列の寄せ
集めであるからである。たとえば、実施例１に記載した
合成ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、４つの異な
るＨＩＶ−１単離物、すなわちＨＴＬＶ−IIIＢ、ＬＡ
Ｖ−１、ＡＲＶ−２およびＣＤＣ−４５１のアミノ酸配
列に基づいている。
ＩＶゲノムの合成ＤＮＡ断片は、対応するアミノ酸配列
に基づいて合成することができる。異なる単離物の間で
特定の領域を比較することにより、天然に存在するいか
なる配列とも異なる配列を選択することができる。なぜ
なら、そのような配列は種々の単離物からの配列の寄せ
集めであるからである。たとえば、実施例１に記載した
合成ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、４つの異な
るＨＩＶ−１単離物、すなわちＨＴＬＶ−IIIＢ、ＬＡ
Ｖ−１、ＡＲＶ−２およびＣＤＣ−４５１のアミノ酸配
列に基づいている。
【０００９】他の性質を配列中に組み入れることもでき
る。たとえば、細菌または酵母での発現が最適となるよ
うにコドンを切り換えたり、特定の制限部位を導入した
り、他の制限部位を取り除いたりすることができる。加
えて、特定のベクター中でのクローニングを容易にする
ために、断片の５'と３'の両末端に特定の制限部位を有
していなければならない。合成ＤＮＡ断片はつぎのよう
にして合成することができる。 (１)独特のタンパク質配列を選択する。 (２)逆転写して相補的ＤＮＡ配列を決定する。 (３)細菌または酵母発現のためにコドンを最適化する。 (４)および、特定の制限部位を導入および／または除去
する。
る。たとえば、細菌または酵母での発現が最適となるよ
うにコドンを切り換えたり、特定の制限部位を導入した
り、他の制限部位を取り除いたりすることができる。加
えて、特定のベクター中でのクローニングを容易にする
ために、断片の５'と３'の両末端に特定の制限部位を有
していなければならない。合成ＤＮＡ断片はつぎのよう
にして合成することができる。 (１)独特のタンパク質配列を選択する。 (２)逆転写して相補的ＤＮＡ配列を決定する。 (３)細菌または酵母発現のためにコドンを最適化する。 (４)および、特定の制限部位を導入および／または除去
する。
【００１０】６１個の別個のヌクレオチドコドンが２０
個のアミノ酸をコードしており、遺伝子コードにおける
退縮を生じさせている。研究者らは、真核生物および原
核生物の両方において核酸に用いられるコドンの頻度を
報告している(グランサム(Ｇrantham)ら、Ｎucleic Ａc
ids Ｒes.[１９８０]９:r４３;ギー(Ｇouy)ら、Ｎuclei
c Ａcids Ｒes.[１９８２]１０:７０５５;シャープ(Ｓh
arp)ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.[１９８６]１４:７７３
７)。染色体、トランスポゾンおよびプラスミドからの
配列を例として、全大腸菌ゲノムからの配列が解析され
ている。これらの配列は、構造タンパク質、酵素および
調節タンパク質をコードしている。特定の遺伝子内での
コドンの偏りの度合と遺伝子発現レベルとの間に相関関
係が示されている。
個のアミノ酸をコードしており、遺伝子コードにおける
退縮を生じさせている。研究者らは、真核生物および原
核生物の両方において核酸に用いられるコドンの頻度を
報告している(グランサム(Ｇrantham)ら、Ｎucleic Ａc
ids Ｒes.[１９８０]９:r４３;ギー(Ｇouy)ら、Ｎuclei
c Ａcids Ｒes.[１９８２]１０:７０５５;シャープ(Ｓh
arp)ら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.[１９８６]１４:７７３
７)。染色体、トランスポゾンおよびプラスミドからの
配列を例として、全大腸菌ゲノムからの配列が解析され
ている。これらの配列は、構造タンパク質、酵素および
調節タンパク質をコードしている。特定の遺伝子内での
コドンの偏りの度合と遺伝子発現レベルとの間に相関関
係が示されている。
【００１１】合成ＤＮＡ配列の各特定のアミノ酸に対し
ては同じコドントリプレットを用いるのが好ましい。し
かしながら、特定の制限部位を付加したり欠失させたり
するために別のコドンを用いることもできる。配列には
また、特定の断片または配列を欠失させたり、最初の合
成にエラーがあった場合に特定の配列を置換させるため
に用いることのできる独特の制限部位が含まれていなけ
ればならない。
ては同じコドントリプレットを用いるのが好ましい。し
かしながら、特定の制限部位を付加したり欠失させたり
するために別のコドンを用いることもできる。配列には
また、特定の断片または配列を欠失させたり、最初の合
成にエラーがあった場合に特定の配列を置換させるため
に用いることのできる独特の制限部位が含まれていなけ
ればならない。
【００１２】本発明の用いることのできるベクター系と
しては、植物、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物の発現
系が挙げられる。用いた系での発現のためにコドンを最
適化するのが好ましい。上記のように異種発現系でクロ
ーニングし発現させた本発明のタンパク質およびポリペ
プチドは、診断および治療の目的のために用いることが
できる。
しては、植物、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物の発現
系が挙げられる。用いた系での発現のためにコドンを最
適化するのが好ましい。上記のように異種発現系でクロ
ーニングし発現させた本発明のタンパク質およびポリペ
プチドは、診断および治療の目的のために用いることが
できる。
【００１３】好ましい発現系にはλpＬベクター系を利
用する。この発現系はつぎのような特徴を有する。 (１)強力なλpＬプロモーター (２)強力な３フレーム翻訳ターミネーターrrnＢt１およ
び (３)利用できる(accessible)ＮcoＩ制限部位内に位置す
るリボソーム結合部位から８塩基対にあるＡＴＧコドン
での翻訳開始。
用する。この発現系はつぎのような特徴を有する。 (１)強力なλpＬプロモーター (２)強力な３フレーム翻訳ターミネーターrrnＢt１およ
び (３)利用できる(accessible)ＮcoＩ制限部位内に位置す
るリボソーム結合部位から８塩基対にあるＡＴＧコドン
での翻訳開始。
【００１４】本発明の発現系の他の利点は、所望のアミ
ノ酸配列を有するタンパク質を発現する特定のＤＮＡ配
列が含まれるように合成ＤＮＡ断片をあつらえることが
できること、さらに、合成断片を種々のベクター中に移
すのを容易にするために、５'かまたは３'部位に他のＤ
ＮＡ配列を付加することができることである。
ノ酸配列を有するタンパク質を発現する特定のＤＮＡ配
列が含まれるように合成ＤＮＡ断片をあつらえることが
できること、さらに、合成断片を種々のベクター中に移
すのを容易にするために、５'かまたは３'部位に他のＤ
ＮＡ配列を付加することができることである。
【００１５】加えて、断片の両末端にある特定の制限部
位を使用することにより、該断片を他の配列中に組み込
んで融合タンパク質を生成させるこもでき、このような
融合タンパク質もまた診断および治療試薬として用いる
ことができる。たとえば、ＨＩＶ−１gp４１配列をＢ型
肝炎ウイルス配列のコア／表面抗原の内部または末端に
組み込んで融合タンパク質を生成させ、このような融合
タンパク質を、感染の可能性のある血液提供者における
ＡＩＤＳおよびＢ型肝炎の両方を検出するための単一ア
ッセイスクリーニングシステムに用いることができる。
別のやり方として、患者の感染の経過を追跡するために
アッセイを用いることができる。
位を使用することにより、該断片を他の配列中に組み込
んで融合タンパク質を生成させるこもでき、このような
融合タンパク質もまた診断および治療試薬として用いる
ことができる。たとえば、ＨＩＶ−１gp４１配列をＢ型
肝炎ウイルス配列のコア／表面抗原の内部または末端に
組み込んで融合タンパク質を生成させ、このような融合
タンパク質を、感染の可能性のある血液提供者における
ＡＩＤＳおよびＢ型肝炎の両方を検出するための単一ア
ッセイスクリーニングシステムに用いることができる。
別のやり方として、患者の感染の経過を追跡するために
アッセイを用いることができる。
【００１６】融合タンパク質を生成させるために、細
菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物を含むあらゆる採
取源からの他のタンパク質を本発明の合成ＤＮＡ断片と
ともに用いることができる。それぞれの発現系において
効率よく発現されるタンパク質は、融合タンパク質の合
成断片の発現を高めるので特に好ましい。
菌、酵母、昆虫、植物または哺乳動物を含むあらゆる採
取源からの他のタンパク質を本発明の合成ＤＮＡ断片と
ともに用いることができる。それぞれの発現系において
効率よく発現されるタンパク質は、融合タンパク質の合
成断片の発現を高めるので特に好ましい。
【００１７】幾つかのＨＩＶ単離物から得られ大腸菌で
の発現を最適化した本発明の合成ＤＮＡ配列により、遺
伝学的に識別可能な種々のＨＩＶ単離物に暴露された個
人からの被験血清を認識する、連続的に利用可能で均一
なＨＩＶ抗原調製物が提供される。組換え抗原の合成に
は大腸菌コドンを用いるので、その発現は非常に安定で
ある。さらに、特定の制限部位を挿入することにより、
コード配列中の重要な抗原エピトープにおいて付加、欠
失または置換をさせることができるが、このような性質
は、天然に存在するＨＩＶ配列を用いて発現させた場合
には達成するのが困難なものである。合成遺伝子を構築
することにより遺伝子のアミノ末端かまたはカルボキシ
末端にタンパク質配列を付加することが可能になり、そ
うすることにより新規な試薬を開発することも可能にな
る。たとえば、ＨＩＶ−１コア抗原遺伝子とＨＩＶ−１
エンベロープ合成遺伝子との間で融合させた融合遺伝子
を製造することができる。さらに詳しくは、エンベロー
プ合成遺伝子は、カルボキシ末端ＨＩＶ−１ gp１２０
配列および全長ＨＩＶ−１ gp４１からなる。同様に、
ＨＩＶ−１コア抗原ＤＮＡ配列をＨＩＶ−２ gp４１配
列に融合させることができ、両者ともに大腸菌のような
異種宿主系において高レベルで発現することができる。
の発現を最適化した本発明の合成ＤＮＡ配列により、遺
伝学的に識別可能な種々のＨＩＶ単離物に暴露された個
人からの被験血清を認識する、連続的に利用可能で均一
なＨＩＶ抗原調製物が提供される。組換え抗原の合成に
は大腸菌コドンを用いるので、その発現は非常に安定で
ある。さらに、特定の制限部位を挿入することにより、
コード配列中の重要な抗原エピトープにおいて付加、欠
失または置換をさせることができるが、このような性質
は、天然に存在するＨＩＶ配列を用いて発現させた場合
には達成するのが困難なものである。合成遺伝子を構築
することにより遺伝子のアミノ末端かまたはカルボキシ
末端にタンパク質配列を付加することが可能になり、そ
うすることにより新規な試薬を開発することも可能にな
る。たとえば、ＨＩＶ−１コア抗原遺伝子とＨＩＶ−１
エンベロープ合成遺伝子との間で融合させた融合遺伝子
を製造することができる。さらに詳しくは、エンベロー
プ合成遺伝子は、カルボキシ末端ＨＩＶ−１ gp１２０
配列および全長ＨＩＶ−１ gp４１からなる。同様に、
ＨＩＶ−１コア抗原ＤＮＡ配列をＨＩＶ−２ gp４１配
列に融合させることができ、両者ともに大腸菌のような
異種宿主系において高レベルで発現することができる。
【００１８】本発明に有用なプラスミドを含有する大腸
菌株は、１９８８年１１月２２日にアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(ロックビル、メリーラン
ド)に受託番号ＡＴＣＣ６７８５５(pＳＤ３０１／ＲＲ
１／pＲＫ２４８.clts)およびＡＴＣＣ６７８５６(pＳ
Ｄ３０６／ＣＡＧ４５６)にて寄託してある。
菌株は、１９８８年１１月２２日にアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(ロックビル、メリーラン
ド)に受託番号ＡＴＣＣ６７８５５(pＳＤ３０１／ＲＲ
１／pＲＫ２４８.clts)およびＡＴＣＣ６７８５６(pＳ
Ｄ３０６／ＣＡＧ４５６)にて寄託してある。
【００１９】試薬および酵素 ルリア−ベルターニ(Ｌuria−Ｂertani;ＬＢ)およびス
ーパーブロス(Ｓuperbroth)II(乾燥形)のような培地
は、ギブコ・ラボラトリーズ・ライフ・テクノロジーズ
(Ｇibco Ｌaboratories Ｌife Ｔechnologies,Ｉnc.)
(マジソン、ウイスコンシン)から入手した。制限酵素、
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、核酸分子量標
準、Ｍ１３シークエンシングシステム、Ｘ−gal(５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドニル−β−Ｄ−ガラクト
シド)、ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
シド)、グリセロール、ジチオスレイトール、４−クロ
ロ−１−ナフトールは、ベーリンガー・マンハイム・バ
イオケミカルズ(Ｂoehringer Ｍannheim Ｂiochemical
s)(インディアナポリス、インディアナ);またはニュー
・イングランド・バイオラブズ(Ｎew Ｅngland Ｂiolab
s,Ｉnc.)(ビバーリー、マサチューセッツ);またはベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ・ライフ・テクノロジ
ーズ(Ｂethesda Ｒesearch Ｌaboratories Ｌife Ｔech
nologies,Ｉnc.)(ガイサーバーグ(Ｇaitherburg)、メリ
ーランド)から購入した。前以て染色したタンパク質分
子量標準、アクリルアミド(結晶、電気泳動グレード＞
９９％);Ｎ−Ｎ'−メチレン−ビス−アクリルアミド(Ｂ
ＩＳ);Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン
(ＴＥＭＥＤ)およびドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)
は、バイオラド・ラボラトリーズ(ＢioＲad Ｌaborator
ies)(リッチモンド、カリフォルニア)から購入した。リ
ゾチームおよびアンピシリンは、シグマ・ケミカル(Ｓi
gma Ｃhemical Ｃo.)(セントルイス、ミズーリ)から購
入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)標識第
二抗体は、キルケガール・アンド・ペリー・ラボラトリ
ーズ(Ｋirkegaard＆Ｐerry Ｌaboratories,Ｉnc.)(ガイ
サーバーグ、メリーランド)から購入した。シープラー
ク(Ｓeaplaque)アガロース(低融アガロース)は、ＦＭＣ
バイオプロダクツ(Ｂioproducts)(ロックランド、メイ
ン)から購入した。
ーパーブロス(Ｓuperbroth)II(乾燥形)のような培地
は、ギブコ・ラボラトリーズ・ライフ・テクノロジーズ
(Ｇibco Ｌaboratories Ｌife Ｔechnologies,Ｉnc.)
(マジソン、ウイスコンシン)から入手した。制限酵素、
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、核酸分子量標
準、Ｍ１３シークエンシングシステム、Ｘ−gal(５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドニル−β−Ｄ−ガラクト
シド)、ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
シド)、グリセロール、ジチオスレイトール、４−クロ
ロ−１−ナフトールは、ベーリンガー・マンハイム・バ
イオケミカルズ(Ｂoehringer Ｍannheim Ｂiochemical
s)(インディアナポリス、インディアナ);またはニュー
・イングランド・バイオラブズ(Ｎew Ｅngland Ｂiolab
s,Ｉnc.)(ビバーリー、マサチューセッツ);またはベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリーズ・ライフ・テクノロジ
ーズ(Ｂethesda Ｒesearch Ｌaboratories Ｌife Ｔech
nologies,Ｉnc.)(ガイサーバーグ(Ｇaitherburg)、メリ
ーランド)から購入した。前以て染色したタンパク質分
子量標準、アクリルアミド(結晶、電気泳動グレード＞
９９％);Ｎ−Ｎ'−メチレン−ビス−アクリルアミド(Ｂ
ＩＳ);Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン
(ＴＥＭＥＤ)およびドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)
は、バイオラド・ラボラトリーズ(ＢioＲad Ｌaborator
ies)(リッチモンド、カリフォルニア)から購入した。リ
ゾチームおよびアンピシリンは、シグマ・ケミカル(Ｓi
gma Ｃhemical Ｃo.)(セントルイス、ミズーリ)から購
入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)標識第
二抗体は、キルケガール・アンド・ペリー・ラボラトリ
ーズ(Ｋirkegaard＆Ｐerry Ｌaboratories,Ｉnc.)(ガイ
サーバーグ、メリーランド)から購入した。シープラー
ク(Ｓeaplaque)アガロース(低融アガロース)は、ＦＭＣ
バイオプロダクツ(Ｂioproducts)(ロックランド、メイ
ン)から購入した。
【００２０】Ｔ５０Ｅ１０は５０mＭトリス、pＨ８.
０、１０mＭ ＥＤＴＡを含んでいた。１×ＴＧは１００
mＭトリス、pＨ７.５および１０％グリセロールを含ん
でいた。２×ＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷バッファーは１５％
グリセロール、５％ＳＤＳ、１００mＭトリス塩基、１
Ｍ β−メルカプトエタノールおよび０.８％ブロモフェ
ノール青色色素からなっていた。ＴＢＳは５０mＭトリ
ス、pＨ８.０および１５０mＭ塩化ナトリウムを含んで
いた。ブロッキング溶液はＴＢＳ中の５％カーネーショ
ン(Ｃarnation)脱脂粉乳からなっていた。
０、１０mＭ ＥＤＴＡを含んでいた。１×ＴＧは１００
mＭトリス、pＨ７.５および１０％グリセロールを含ん
でいた。２×ＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷バッファーは１５％
グリセロール、５％ＳＤＳ、１００mＭトリス塩基、１
Ｍ β−メルカプトエタノールおよび０.８％ブロモフェ
ノール青色色素からなっていた。ＴＢＳは５０mＭトリ
ス、pＨ８.０および１５０mＭ塩化ナトリウムを含んで
いた。ブロッキング溶液はＴＢＳ中の５％カーネーショ
ン(Ｃarnation)脱脂粉乳からなっていた。
【００２１】宿主細胞培養、ＤＮＡ源およびベクター 大腸菌ＪＭ１０３細胞、pＵＣ８、pＵＣ１８、pＵＣ１
９およびＭ１３クローニングベクターをファルマシア・
ＬＫＢ・バイオテクノロジー(Ｐharmacia ＬＫＢ Ｂiot
echnology,Ｉnc.)(ピスカタウエー、ニュージャージー)
から購入した。コンピテントなエピキュリアン・コリ
(Ｅpicurean coli)株ＸＬ１−ＢlueおよびＪＭ１０９を
ストラタジーン・クローニング・システムズ(Ｓtratage
ne Ｃloning Ｓystems)(ラジョラ(Ｌa Ｊolla)、カリフ
ォルニア)から購入した。ＲＲ１細胞は、コリ・ジェネ
ティック・ストック・センター(Ｃoli Ｇenetic Ｓtock
Ｃenter)(イェール・ユニバーシティー、ニューヘブ
ン、コネチカット)から入手した。大腸菌ＣＡＧ４５６
細胞は、カロル・グロス(Ｃarol Ｇross)博士(ユニバー
シティー・オブ・ウイスコンシン(Ｕniversity of Ｗisc
onsin)、マジソン、ウイスコンシン)から入手した。ベ
クターpＲＫ２４８.cltsは、ドナルド・アール・ヘリン
スキー(Ｄonald Ｒ.Ｈelinski)博士(ユニバーシティー
・オブ・カリフォルニア(Ｕniversity of Ｃaliforni
a)、サンジエゴ、カリフォルニア)から入手した。
９およびＭ１３クローニングベクターをファルマシア・
ＬＫＢ・バイオテクノロジー(Ｐharmacia ＬＫＢ Ｂiot
echnology,Ｉnc.)(ピスカタウエー、ニュージャージー)
から購入した。コンピテントなエピキュリアン・コリ
(Ｅpicurean coli)株ＸＬ１−ＢlueおよびＪＭ１０９を
ストラタジーン・クローニング・システムズ(Ｓtratage
ne Ｃloning Ｓystems)(ラジョラ(Ｌa Ｊolla)、カリフ
ォルニア)から購入した。ＲＲ１細胞は、コリ・ジェネ
ティック・ストック・センター(Ｃoli Ｇenetic Ｓtock
Ｃenter)(イェール・ユニバーシティー、ニューヘブ
ン、コネチカット)から入手した。大腸菌ＣＡＧ４５６
細胞は、カロル・グロス(Ｃarol Ｇross)博士(ユニバー
シティー・オブ・ウイスコンシン(Ｕniversity of Ｗisc
onsin)、マジソン、ウイスコンシン)から入手した。ベ
クターpＲＫ２４８.cltsは、ドナルド・アール・ヘリン
スキー(Ｄonald Ｒ.Ｈelinski)博士(ユニバーシティー
・オブ・カリフォルニア(Ｕniversity of Ｃaliforni
a)、サンジエゴ、カリフォルニア)から入手した。
【００２２】一般的方法 すべての制限酵素消化は、供給者の指示に従って行っ
た。ＤＮＡ(１μg)当たり少なくとも５単位の酵素を用
い、ＤＮＡの消化を完了するため充分にインキュベート
した。標準的手順を用いてミニ細胞溶解物ＤＮＡ調製
物、フェノール−クロロホルム抽出、ＤＮＡのエタノー
ル沈澱、アガロース上でのＤＮＡの制限分析、およびＤ
ＮＡ断片の低融アガロースゲル精製を行った(マニアテ
ィス(Ｍaniatis)ら、モレキュラー・クローニング(Ｍol
ecular Ｃloning)、ア・ラボラトリーズ・マニュアル
(Ａ Ｌaboratory Ｍanual)[ニューヨーク:コールド・ス
プリング・ハーバー、１９８２])。大腸菌株からのプラ
スミドの単離には、アルカリ溶解法および塩化セシウム
−臭化エチジウム密度勾配法(マニアティスら、上掲書)
を用いた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼには標準バッファーを用いた(マニアティ
スら、上掲書)。
た。ＤＮＡ(１μg)当たり少なくとも５単位の酵素を用
い、ＤＮＡの消化を完了するため充分にインキュベート
した。標準的手順を用いてミニ細胞溶解物ＤＮＡ調製
物、フェノール−クロロホルム抽出、ＤＮＡのエタノー
ル沈澱、アガロース上でのＤＮＡの制限分析、およびＤ
ＮＡ断片の低融アガロースゲル精製を行った(マニアテ
ィス(Ｍaniatis)ら、モレキュラー・クローニング(Ｍol
ecular Ｃloning)、ア・ラボラトリーズ・マニュアル
(Ａ Ｌaboratory Ｍanual)[ニューヨーク:コールド・ス
プリング・ハーバー、１９８２])。大腸菌株からのプラ
スミドの単離には、アルカリ溶解法および塩化セシウム
−臭化エチジウム密度勾配法(マニアティスら、上掲書)
を用いた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼには標準バッファーを用いた(マニアティ
スら、上掲書)。
【００２３】
【実施例】つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１ コドン最適化合成ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の
クローニング法 ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質をコードする合成
遺伝子およびその断片を開発するため、ＨＴＬＶ−III
Ｂ(ＢＨ１０２)、ＬＡＶ−１(ＭＡＬ)、ＡＲＶ−２(Ｓ
Ｆ)およびＣＤＣ−４５１(ＣＤＣ４２)と称する４つの
独立したＨＩＶ−１ウイルス単離物のアミノ酸配列を比
較した。４つの単離物から独特のアミノ酸配列を選択し
(図１)、アミノ酸残基５５２−６６８(上掲ラットナー
による番号付け)を有する断片を得た。この断片は、Ｈ
ＴＬＶ−IIIＢ(ＢＨ１０２)単離物と比べて９つのアミ
ノ酸置換(８％)を含んでいた。大腸菌での高レベル発現
を容易にするために最適化したコドンを用い、このアミ
ノ酸配列を逆翻訳した。コドンの第二および／または第
三の塩基に残っているあいまいなヌクレオチドは、モレ
キュラークローニング、および配列の付加、置換または
欠失を容易にするために割り当てた。ついで、このＤＮ
Ａ配列を、直接特異的にアニールするための独特の６bp
突起(overhangs)を有する８つの二本鎖断片に再分し
た。製造業者により推奨された方法および試薬を用い、
アプライド・バイオシステム(Ａpplied Ｂiosystem)３
８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー上で１６の個別のオリゴ
ヌクレオチドを合成した。これらの精製オリゴヌクレオ
チドをアニールし、一緒に連結して全断片を組み立て、
ＢamＨＩおよびＳalＩで消化し、pＵＣ１８中に連結
し、大腸菌ＪＭ１０３細胞中に形質転換した。ＢＳ２−
１０と称するクローン(図２)を単離し、制限地図を作成
し、サンガー(Ｓanger)のジデオキシ鎖終止法(サンガー
ら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.(１９８２)１６２:７２９)を用いて
ＤＮＡ配列を確認した。
く説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１ コドン最適化合成ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の
クローニング法 ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質をコードする合成
遺伝子およびその断片を開発するため、ＨＴＬＶ−III
Ｂ(ＢＨ１０２)、ＬＡＶ−１(ＭＡＬ)、ＡＲＶ−２(Ｓ
Ｆ)およびＣＤＣ−４５１(ＣＤＣ４２)と称する４つの
独立したＨＩＶ−１ウイルス単離物のアミノ酸配列を比
較した。４つの単離物から独特のアミノ酸配列を選択し
(図１)、アミノ酸残基５５２−６６８(上掲ラットナー
による番号付け)を有する断片を得た。この断片は、Ｈ
ＴＬＶ−IIIＢ(ＢＨ１０２)単離物と比べて９つのアミ
ノ酸置換(８％)を含んでいた。大腸菌での高レベル発現
を容易にするために最適化したコドンを用い、このアミ
ノ酸配列を逆翻訳した。コドンの第二および／または第
三の塩基に残っているあいまいなヌクレオチドは、モレ
キュラークローニング、および配列の付加、置換または
欠失を容易にするために割り当てた。ついで、このＤＮ
Ａ配列を、直接特異的にアニールするための独特の６bp
突起(overhangs)を有する８つの二本鎖断片に再分し
た。製造業者により推奨された方法および試薬を用い、
アプライド・バイオシステム(Ａpplied Ｂiosystem)３
８０Ａ ＤＮＡシンセサイザー上で１６の個別のオリゴ
ヌクレオチドを合成した。これらの精製オリゴヌクレオ
チドをアニールし、一緒に連結して全断片を組み立て、
ＢamＨＩおよびＳalＩで消化し、pＵＣ１８中に連結
し、大腸菌ＪＭ１０３細胞中に形質転換した。ＢＳ２−
１０と称するクローン(図２)を単離し、制限地図を作成
し、サンガー(Ｓanger)のジデオキシ鎖終止法(サンガー
ら、Ｊ.Ｍol.Ｂiol.(１９８２)１６２:７２９)を用いて
ＤＮＡ配列を確認した。
【００２４】クローンＢＳ２−１０がこの独特のＨＩＶ
−１経膜タンパク質(ＴＭＰ)断片を発現することを確立
するため、ＢＳ２−１０／ＪＭ１０３培養を２５０ml容
エルレンマイエルフラスコ中、ルリアブロス(５０ml)中
で３７℃にて増殖させた。培養液のＯＤ６００が０.３
〜０.５に達したとき、ＩＰＴＧを最終濃度が１mＭにな
るように加えて発現を引き起こした。試料(１.５ml)を
１時間間隔で除き、細胞をペレット化し、２×ＳＤＳ／
ＰＡＧＥ負荷バッファー中にＯＤ６００が１０.０にな
るまで再懸濁した。調製試料のアリコート(１５μl)を
１５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上に負荷し、タンパク質を
分離し、ついでイムノブロッティングのためにニトロセ
ルロースへ電気泳動的に移動させた。移動タンパク質を
含むニトロセルロースシートをブロッキング溶液ととも
に１時間インキュベートし、５％大腸菌ＪＭ１０３溶解
液を含有するＴＢＳ中に希釈したエイズ患者血清ととも
に４℃で一夜インキュベートした。このニトロセルロー
スシートをＴＢＳ中で３回洗浄し、ついでＨＲＰＯ−標
識ヤギ抗ヒトＩgＧ(１０％仔ウシ血清を含むＴＢＳ中で
希釈)とともにインキュベートした。このニトロセルロ
ースをＴＢＳで３回洗浄し、４−クロロ−１−ナフトー
ル(２mg／ml)、０.０２％過酸化水素および１７％メタ
ノールを含有するＴＢＳ中で発色させた。クローンＢＳ
２−１０はエイズ患者の血清と強く免疫応答するバンド
を示し、このことは合成ＨＩＶ−１ ＴＭＰ断片が大腸
菌中で発現したことを示している。gp１２０の最大カル
ボキシ末端３７アミノ酸とともに全長ＨＩＶ−１経膜タ
ンパク質を組み立てるために、上記４つの単離物のアミ
ノ酸配列を互いに比較し、この遺伝子のために独特のア
ミノ酸配列を得た。大腸菌発現のために最適化したコド
ンを用いてこの独特のアミノ酸配列を逆翻訳した後、あ
いまいなヌクレオチドは上記のように割り当てた。全長
合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子(ＦＳＧ)をさらに６
つの再断片に分割した。ＦＳＧの完全なＤＮＡおよびア
ミノ酸配列を図３、図４および図５に示す(組み立てに
用いた制限部位および再断片を示す)。図６〜図１４
は、合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を開発するのに
用いたアミノ酸配列を、ロスアラモスＨＩＶデータバン
ク中に報告された１３の独立した単離物の公知のアミノ
酸配列(マイヤーズ(Ｍeyers)ら、Ｈuman Ｒetroviruses
and ＡＩＤＳ(１９８７)、ロス・アラモス・ナショナ
ル・ラボラトリー(Ｌos Ａlamos Ｎational Ｌaborator
y))と比較したものである。インテリジェネティックス
(Ｉntelligenetics)のゲナリン(Ｇenalign)プログラム
を用いてこれらの配列を整列させ、整列させたものによ
り、他の公知の単離物と比較してＦＳＧ(図６〜図１４
においてＳＹＮＧＥＮＥと示してある)が実質的に全配
列相同性を保持していることが示された。個々の配列の
整列パラメーターおよび整列スコアも示してある。
−１経膜タンパク質(ＴＭＰ)断片を発現することを確立
するため、ＢＳ２−１０／ＪＭ１０３培養を２５０ml容
エルレンマイエルフラスコ中、ルリアブロス(５０ml)中
で３７℃にて増殖させた。培養液のＯＤ６００が０.３
〜０.５に達したとき、ＩＰＴＧを最終濃度が１mＭにな
るように加えて発現を引き起こした。試料(１.５ml)を
１時間間隔で除き、細胞をペレット化し、２×ＳＤＳ／
ＰＡＧＥ負荷バッファー中にＯＤ６００が１０.０にな
るまで再懸濁した。調製試料のアリコート(１５μl)を
１５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上に負荷し、タンパク質を
分離し、ついでイムノブロッティングのためにニトロセ
ルロースへ電気泳動的に移動させた。移動タンパク質を
含むニトロセルロースシートをブロッキング溶液ととも
に１時間インキュベートし、５％大腸菌ＪＭ１０３溶解
液を含有するＴＢＳ中に希釈したエイズ患者血清ととも
に４℃で一夜インキュベートした。このニトロセルロー
スシートをＴＢＳ中で３回洗浄し、ついでＨＲＰＯ−標
識ヤギ抗ヒトＩgＧ(１０％仔ウシ血清を含むＴＢＳ中で
希釈)とともにインキュベートした。このニトロセルロ
ースをＴＢＳで３回洗浄し、４−クロロ−１−ナフトー
ル(２mg／ml)、０.０２％過酸化水素および１７％メタ
ノールを含有するＴＢＳ中で発色させた。クローンＢＳ
２−１０はエイズ患者の血清と強く免疫応答するバンド
を示し、このことは合成ＨＩＶ−１ ＴＭＰ断片が大腸
菌中で発現したことを示している。gp１２０の最大カル
ボキシ末端３７アミノ酸とともに全長ＨＩＶ−１経膜タ
ンパク質を組み立てるために、上記４つの単離物のアミ
ノ酸配列を互いに比較し、この遺伝子のために独特のア
ミノ酸配列を得た。大腸菌発現のために最適化したコド
ンを用いてこの独特のアミノ酸配列を逆翻訳した後、あ
いまいなヌクレオチドは上記のように割り当てた。全長
合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子(ＦＳＧ)をさらに６
つの再断片に分割した。ＦＳＧの完全なＤＮＡおよびア
ミノ酸配列を図３、図４および図５に示す(組み立てに
用いた制限部位および再断片を示す)。図６〜図１４
は、合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を開発するのに
用いたアミノ酸配列を、ロスアラモスＨＩＶデータバン
ク中に報告された１３の独立した単離物の公知のアミノ
酸配列(マイヤーズ(Ｍeyers)ら、Ｈuman Ｒetroviruses
and ＡＩＤＳ(１９８７)、ロス・アラモス・ナショナ
ル・ラボラトリー(Ｌos Ａlamos Ｎational Ｌaborator
y))と比較したものである。インテリジェネティックス
(Ｉntelligenetics)のゲナリン(Ｇenalign)プログラム
を用いてこれらの配列を整列させ、整列させたものによ
り、他の公知の単離物と比較してＦＳＧ(図６〜図１４
においてＳＹＮＧＥＮＥと示してある)が実質的に全配
列相同性を保持していることが示された。個々の配列の
整列パラメーターおよび整列スコアも示してある。
【００２５】再断片の合成およびクローニング ＢＳ２−１０の下流に位置する再断片(４１３−１〜４
１３−４と称する)を、個々のモレキュラークローニン
グおよびＤＮＡ配列決定を容易にするため、５'末端に
ＢamＨＩ制限部位を有し３'末端にＨindIII制限部位を
有する配列とともに合成した。ＢＳ２−１０の上流に位
置する再断片もまた、クローニングおよびＤＮＡ配列分
析に有用な制限部位を有する配列とともに合成した。カ
ルボキシ末端gp１２０アミノ酸配列をコードする再断片
(c−末端gp１２０と称する)は、５'末端にＥcoＲＩおよ
びＢamＨＩ制限部位を、３'末端にＢglIIおよびＳmaＩ
制限部位を有していた。同様に、再断片４１５は５'末
端にＢglII制限部位を、３'末端にＢglIIおよびＢamＨ
Ｉ制限部位を含んでいた。c−末端gp１２０再断片を例
外として(この場合はＢＳ２−１０について記載したよ
うにして両方の鎖を合成)、ＦＳＧの残りの再断片はＤ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いた方法により
合成した。この方法では、特定の再断片とは反対の鎖か
らなるオリゴヌクレオチド(１０個の相補的な塩基を含
有)を合成しアニールした。ついで、ＤＮＡシークエン
シングについてサンガーら(上掲)により記載されたのと
同様の方法により、４個のデオキシヌクレオチドの存在
下にＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片により第二の
相補的鎖を充填した。ついで、得られた二本鎖再断片を
適当な制限酵素で消化し、上記のようにしてpＵＣベク
ター中にクローニングしＤＮＡ配列を確認した。再断片
４１３−１〜４１３−４を、すべてに共通するＢamＨＩ
およびＨindIII制限部位を用いてpＵＣ１８中にクロー
ニングした。再断片c−末端gp１２０を、ＥcoＲＩおよ
びＳmaＩ制限部位を用いてpＵＣ８中にクローニングし
た。再断片４１５を、c−末端gp１２０を含むプラスミ
ド中にＢglII制限部位にてクローニングし、制限マッピ
ングにより適当な方向性についてスクリーニングした。
すべての再断片についてプラスミドＤＮＡを塩化セシウ
ム浮上密度勾配法により調製し、個々のＤＮＡ配列を二
本鎖鋳型から直接確認した(ハットリ(Ｈattori)ら、Ｎu
cl.Ａcid Ｒes.(１９８５)１３:７８１３)。
１３−４と称する)を、個々のモレキュラークローニン
グおよびＤＮＡ配列決定を容易にするため、５'末端に
ＢamＨＩ制限部位を有し３'末端にＨindIII制限部位を
有する配列とともに合成した。ＢＳ２−１０の上流に位
置する再断片もまた、クローニングおよびＤＮＡ配列分
析に有用な制限部位を有する配列とともに合成した。カ
ルボキシ末端gp１２０アミノ酸配列をコードする再断片
(c−末端gp１２０と称する)は、５'末端にＥcoＲＩおよ
びＢamＨＩ制限部位を、３'末端にＢglIIおよびＳmaＩ
制限部位を有していた。同様に、再断片４１５は５'末
端にＢglII制限部位を、３'末端にＢglIIおよびＢamＨ
Ｉ制限部位を含んでいた。c−末端gp１２０再断片を例
外として(この場合はＢＳ２−１０について記載したよ
うにして両方の鎖を合成)、ＦＳＧの残りの再断片はＤ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いた方法により
合成した。この方法では、特定の再断片とは反対の鎖か
らなるオリゴヌクレオチド(１０個の相補的な塩基を含
有)を合成しアニールした。ついで、ＤＮＡシークエン
シングについてサンガーら(上掲)により記載されたのと
同様の方法により、４個のデオキシヌクレオチドの存在
下にＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片により第二の
相補的鎖を充填した。ついで、得られた二本鎖再断片を
適当な制限酵素で消化し、上記のようにしてpＵＣベク
ター中にクローニングしＤＮＡ配列を確認した。再断片
４１３−１〜４１３−４を、すべてに共通するＢamＨＩ
およびＨindIII制限部位を用いてpＵＣ１８中にクロー
ニングした。再断片c−末端gp１２０を、ＥcoＲＩおよ
びＳmaＩ制限部位を用いてpＵＣ８中にクローニングし
た。再断片４１５を、c−末端gp１２０を含むプラスミ
ド中にＢglII制限部位にてクローニングし、制限マッピ
ングにより適当な方向性についてスクリーニングした。
すべての再断片についてプラスミドＤＮＡを塩化セシウ
ム浮上密度勾配法により調製し、個々のＤＮＡ配列を二
本鎖鋳型から直接確認した(ハットリ(Ｈattori)ら、Ｎu
cl.Ａcid Ｒes.(１９８５)１３:７８１３)。
【００２６】ＦＳＧの組み立ておよびクローニング ＢＳ２−１０の下流に位置する再断片を、５'末端の独
特の内部制限部位および３'末端の共通のＨindIII制限
部位を用いて段階的にクローニングした。たとえば、再
断片４１３−１はＳalＩおよびＨindIII制限部位にてＢ
Ｓ２−１０中にクローニングしてクローンＢＳ２−１０
Ａを生成させ、その中にＨpaＩおよびＨindIII制限部位
にて４１３−２を挿入してクローンＢＳ２−１０Ｂを生
成させた。同様に、それぞれ独特のＥcoＲＶおよびＳna
ＢＩ制限部位を用いて再断片４１３−３および４１３−
４を付加した。クローンＢＳ２−１０の上流に位置する
２つの再断片(pＵＣ８中に一緒にクローニング)をＢam
ＨＩ断片としてＢＳ２−１０に連結した。図１５は、合
成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子をpＵＣ１８中に組み
立てるのに使用したクローニング法を示す。最終的なク
ローン(ＦＳＧと称する)を制限マッピングしてＢamＨＩ
−ＢamＨＩ断片の適当な方向性を確認した。
特の内部制限部位および３'末端の共通のＨindIII制限
部位を用いて段階的にクローニングした。たとえば、再
断片４１３−１はＳalＩおよびＨindIII制限部位にてＢ
Ｓ２−１０中にクローニングしてクローンＢＳ２−１０
Ａを生成させ、その中にＨpaＩおよびＨindIII制限部位
にて４１３−２を挿入してクローンＢＳ２−１０Ｂを生
成させた。同様に、それぞれ独特のＥcoＲＶおよびＳna
ＢＩ制限部位を用いて再断片４１３−３および４１３−
４を付加した。クローンＢＳ２−１０の上流に位置する
２つの再断片(pＵＣ８中に一緒にクローニング)をＢam
ＨＩ断片としてＢＳ２−１０に連結した。図１５は、合
成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子をpＵＣ１８中に組み
立てるのに使用したクローニング法を示す。最終的なク
ローン(ＦＳＧと称する)を制限マッピングしてＢamＨＩ
−ＢamＨＩ断片の適当な方向性を確認した。
【００２７】実施例２ λpＬベクター系でのＦＳＧのクローニングおよび発現 強力なλpＬプロモーターおよび温度感受性cl抑制遺伝
子を用いたベクター系でＦＳＧの発現分析を行った(ベ
ナール(Ｂenard)ら、Ｇene(１９７９)５:５９)。これら
の分析に用いた特別のベクターはpＢＲ３２２の誘導体
であり、λ pＬプロモーターおよび合成シャイン−ダル
ガーノ配列とそれらに続いて対象とする種々の遺伝子を
クローニングするのに用いる制限部位を含んでいる。加
えて、これらのベクターは強力な３フレーム翻訳ターミ
ネーターrrnＢt１を含んでいる。ベクターpＳＤＫＲ８
１６は、ＮcoＩ制限部位を含んでおり、これにより転写
開始部から最適の距離にあるＡＴＧ開始コドンが提供さ
れる。図１６は、ＦＳＧをpＳＤＫＲ８１６中にクロー
ニングすることによるクローンpＳＤ３０１の生成を模
式的に示したものである。簡単に説明すると、ＦＳＧを
ＨindIIIよびＳmaＩで消化し、該末端にＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノー断片を充填して平滑末端にし、１２０
９bp断片を精製し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断
片を充填したＮcoＩ部位にてpＳＤＫＲ８１６中に連結
した。適合性のベクターpＲＫ２４８上にclts遺伝子を
含む大腸菌ＲＲ１細胞中に形質転換した後、適当な方向
性でＦＳＧを有するクローンを制限マッピングにより単
離し、pＳＤ３０１とした。pＳＤ３０１によりコードさ
れる特別のアミノ酸配列を図１７および図１８に示す。
図１７および図１８は、すべてのリンカー由来配列(＋)
および刊行された配列では未だ同定されていないＨＩＶ
−１エンベロープ内のすべてのアミノ酸置換(＊)を示し
ている。
子を用いたベクター系でＦＳＧの発現分析を行った(ベ
ナール(Ｂenard)ら、Ｇene(１９７９)５:５９)。これら
の分析に用いた特別のベクターはpＢＲ３２２の誘導体
であり、λ pＬプロモーターおよび合成シャイン−ダル
ガーノ配列とそれらに続いて対象とする種々の遺伝子を
クローニングするのに用いる制限部位を含んでいる。加
えて、これらのベクターは強力な３フレーム翻訳ターミ
ネーターrrnＢt１を含んでいる。ベクターpＳＤＫＲ８
１６は、ＮcoＩ制限部位を含んでおり、これにより転写
開始部から最適の距離にあるＡＴＧ開始コドンが提供さ
れる。図１６は、ＦＳＧをpＳＤＫＲ８１６中にクロー
ニングすることによるクローンpＳＤ３０１の生成を模
式的に示したものである。簡単に説明すると、ＦＳＧを
ＨindIIIよびＳmaＩで消化し、該末端にＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノー断片を充填して平滑末端にし、１２０
９bp断片を精製し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断
片を充填したＮcoＩ部位にてpＳＤＫＲ８１６中に連結
した。適合性のベクターpＲＫ２４８上にclts遺伝子を
含む大腸菌ＲＲ１細胞中に形質転換した後、適当な方向
性でＦＳＧを有するクローンを制限マッピングにより単
離し、pＳＤ３０１とした。pＳＤ３０１によりコードさ
れる特別のアミノ酸配列を図１７および図１８に示す。
図１７および図１８は、すべてのリンカー由来配列(＋)
および刊行された配列では未だ同定されていないＨＩＶ
−１エンベロープ内のすべてのアミノ酸置換(＊)を示し
ている。
【００２８】加えて、λpＬプロモーターの制御下で発
現性の高いＨＩＶ−１gagタンパク質(アミノ酸残基番号
１２１〜４０７、ラットナー(上掲)の番号付けによる)
に融合させてＦＳＧをベクターpＫＲＲ９５５中にクロ
ーニングした。ＦＳＧをＡvaＩで消化し、該末端にＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノー断片を充填して平滑末端に
し、１１９９bp断片を精製し、ＳmaＩ制限部位にてpＫ
ＲＲ９５５中に連結してＨＩＶ−１gag／合成env融合タ
ンパク質を生成した(図１６)。大腸菌pＲＫ２４８.clts
／ＲＲ１細胞中に形質転換した後、適当な方向性でＦＳ
Ｇを有するクローンを制限マッピングにより単離し、p
ＳＤ３０２とした。この融合タンパク質の特別のアミノ
酸配列を図１７および図１８に示す。図１７および図１
８は、すべてのリンカー由来配列、ＨＩＶ−１gag配
列、上記のようなＨＩＶ−１エンベロープ配列を示して
いる。
現性の高いＨＩＶ−１gagタンパク質(アミノ酸残基番号
１２１〜４０７、ラットナー(上掲)の番号付けによる)
に融合させてＦＳＧをベクターpＫＲＲ９５５中にクロ
ーニングした。ＦＳＧをＡvaＩで消化し、該末端にＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノー断片を充填して平滑末端に
し、１１９９bp断片を精製し、ＳmaＩ制限部位にてpＫ
ＲＲ９５５中に連結してＨＩＶ−１gag／合成env融合タ
ンパク質を生成した(図１６)。大腸菌pＲＫ２４８.clts
／ＲＲ１細胞中に形質転換した後、適当な方向性でＦＳ
Ｇを有するクローンを制限マッピングにより単離し、p
ＳＤ３０２とした。この融合タンパク質の特別のアミノ
酸配列を図１７および図１８に示す。図１７および図１
８は、すべてのリンカー由来配列、ＨＩＶ−１gag配
列、上記のようなＨＩＶ−１エンベロープ配列を示して
いる。
【００２９】大腸菌pＲＫ２４８.clts／ＲＲ１細胞中の
pＳＤ３０１およびpＳＤ３０２の培養液(５０ml)をスー
パーブロスII培地中で３０℃にてＯＤ６００が０.５と
なるまで増殖させ、この時点で培養液を４２℃にシフト
させて温度感受性clリプレッサーを不活化し、λpＬプ
ロモーターから発現を誘導させた。２つの試料(各２.０
ml)を１時間間隔で除いた。試料の調製は以下のようで
あった。
pＳＤ３０１およびpＳＤ３０２の培養液(５０ml)をスー
パーブロスII培地中で３０℃にてＯＤ６００が０.５と
なるまで増殖させ、この時点で培養液を４２℃にシフト
させて温度感受性clリプレッサーを不活化し、λpＬプ
ロモーターから発現を誘導させた。２つの試料(各２.０
ml)を１時間間隔で除いた。試料の調製は以下のようで
あった。
【００３０】細胞をペレット化し、ついで１×ＴＧバッ
ファーかまたはＴ５０Ｅ１０バッファー中に再懸濁し
た。等容量の２×ＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷バッファーをこ
の１×ＴＧ懸濁細胞に加えて完全溶解液を得た。ビブラ
セルソニケーター(Ｖibra Ｃell Ｓonicator)(ソニック
ス・アンド・マテリアルズ(Ｓonics and Ｍaterials,Ｉ
nc.)、ダンベリー,ＣＴ)を備えたマイクロチップ(micro
tip)を用い、出力１０ワットにセットして、Ｔ５０Ｅ１
０中に再懸濁した試料を各３０秒ずつ８回超音波処理し
た。ついで超音波処理した試料を遠心分離にかけて不溶
性の画分を除き、これを最初の容量のＴ５０Ｅ１０中に
再懸濁した。等容量の２×ＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷バッフ
ァーを超音波処理した可溶性画分および不溶性画分の両
方に加え、これを完全細胞溶解液とともに５分間沸騰さ
せ、遠心分離して残留するすべての不溶性物質を除き、
アリコート(１５μl)を２つの１２.５％ＳＤＳ／ＰＡＧ
Ｅゲル上で分離した。上記のようにエイズ患者血清とイ
ムノブロッティングするため、そのようなゲルの一方か
らのタンパク質を電気泳動的にニトロセルロースに移し
た。第二のゲルを室温にて５０％メタノール、１０％酢
酸の溶液中に２０分間固定し、ついで５０％メタノー
ル、１０％酢酸の溶液中の０.２５％クマシーブルー染
料で３０分間染色した。１０％メタノール、７％酢酸の
溶液を用い、脱染色を３〜４時間、または透明なバック
グラウンドが得られるまで行った。
ファーかまたはＴ５０Ｅ１０バッファー中に再懸濁し
た。等容量の２×ＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷バッファーをこ
の１×ＴＧ懸濁細胞に加えて完全溶解液を得た。ビブラ
セルソニケーター(Ｖibra Ｃell Ｓonicator)(ソニック
ス・アンド・マテリアルズ(Ｓonics and Ｍaterials,Ｉ
nc.)、ダンベリー,ＣＴ)を備えたマイクロチップ(micro
tip)を用い、出力１０ワットにセットして、Ｔ５０Ｅ１
０中に再懸濁した試料を各３０秒ずつ８回超音波処理し
た。ついで超音波処理した試料を遠心分離にかけて不溶
性の画分を除き、これを最初の容量のＴ５０Ｅ１０中に
再懸濁した。等容量の２×ＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷バッフ
ァーを超音波処理した可溶性画分および不溶性画分の両
方に加え、これを完全細胞溶解液とともに５分間沸騰さ
せ、遠心分離して残留するすべての不溶性物質を除き、
アリコート(１５μl)を２つの１２.５％ＳＤＳ／ＰＡＧ
Ｅゲル上で分離した。上記のようにエイズ患者血清とイ
ムノブロッティングするため、そのようなゲルの一方か
らのタンパク質を電気泳動的にニトロセルロースに移し
た。第二のゲルを室温にて５０％メタノール、１０％酢
酸の溶液中に２０分間固定し、ついで５０％メタノー
ル、１０％酢酸の溶液中の０.２５％クマシーブルー染
料で３０分間染色した。１０％メタノール、７％酢酸の
溶液を用い、脱染色を３〜４時間、または透明なバック
グラウンドが得られるまで行った。
【００３１】図１９は、クマシーブルー染色(図１９Ａ)
およびイムノブロッティング(図１９Ｂ)により分析した
誘導前(Ｔ０)および誘導４時間後(Ｔ４)のpＳＤ３０１
およびpＳＤ３０２の発現を示す。試料は、pＫＲＲ９５
５(Ｔ０完全細胞溶解液[レーン１]、Ｔ４完全細胞溶解
液[レーン２]);pＳＤ３０１(Ｔ０完全細胞溶解液[レー
ン３]、Ｔ４完全細胞溶解液[レーン４]、Ｔ４超音波処
理可溶性画分[レーン５]、およびＴ４超音波処理不溶性
画分[レーン６]);およびpＳＤ３０２(Ｔ０完全細胞溶解
液[レーン７]、Ｔ４完全細胞溶解液[レーン８]、Ｔ４超
音波処理可溶性画分[レーン９]、およびＴ４超音波処理
不溶性画分[レーン１０])であった。分子量標準はレー
ン１１で行った。矢印は、クマシーブルー染色により完
全細胞溶解液および超音波処理不溶性細胞画分の両方で
明らかに視覚化された誘導タンパク質の位置を示す(図
１９Ａ)。レーン２は、pＫＲＲ９５５がＨＩＶ−１gag
タンパク質を全細胞タンパク質の２５％以上のレベルで
発現したことを示しており、レーン４は、pＳＤ３０１
が合成ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を全細胞タン
パク質の約１２％のレベルで発現したことを示してお
り、レーン８は、pＳＤ３０２がＨＩＶ−１gag／合成en
v融合タンパク質を全細胞タンパク質の約５％のレベル
で発現したことを示している。ＦＳＧを用いて得られた
発現レベルは、同様のpＬベクター系で対応する天然ウ
イルスＤＮＡ配列を用いて得られた発現レベルよりも有
為に高かった。３つのすべての組換えタンパク質は、エ
イズ患者血清と高度に反応性であった(図１９Ｂ)。この
データは、経膜タンパク質の疎水性領域を含む合成ＨＩ
Ｖ−１エンベロープ遺伝子を大腸菌内において効率よく
発現させることができ、また発現したタンパク質は高度
に免疫反応性であることを示している。
およびイムノブロッティング(図１９Ｂ)により分析した
誘導前(Ｔ０)および誘導４時間後(Ｔ４)のpＳＤ３０１
およびpＳＤ３０２の発現を示す。試料は、pＫＲＲ９５
５(Ｔ０完全細胞溶解液[レーン１]、Ｔ４完全細胞溶解
液[レーン２]);pＳＤ３０１(Ｔ０完全細胞溶解液[レー
ン３]、Ｔ４完全細胞溶解液[レーン４]、Ｔ４超音波処
理可溶性画分[レーン５]、およびＴ４超音波処理不溶性
画分[レーン６]);およびpＳＤ３０２(Ｔ０完全細胞溶解
液[レーン７]、Ｔ４完全細胞溶解液[レーン８]、Ｔ４超
音波処理可溶性画分[レーン９]、およびＴ４超音波処理
不溶性画分[レーン１０])であった。分子量標準はレー
ン１１で行った。矢印は、クマシーブルー染色により完
全細胞溶解液および超音波処理不溶性細胞画分の両方で
明らかに視覚化された誘導タンパク質の位置を示す(図
１９Ａ)。レーン２は、pＫＲＲ９５５がＨＩＶ−１gag
タンパク質を全細胞タンパク質の２５％以上のレベルで
発現したことを示しており、レーン４は、pＳＤ３０１
が合成ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を全細胞タン
パク質の約１２％のレベルで発現したことを示してお
り、レーン８は、pＳＤ３０２がＨＩＶ−１gag／合成en
v融合タンパク質を全細胞タンパク質の約５％のレベル
で発現したことを示している。ＦＳＧを用いて得られた
発現レベルは、同様のpＬベクター系で対応する天然ウ
イルスＤＮＡ配列を用いて得られた発現レベルよりも有
為に高かった。３つのすべての組換えタンパク質は、エ
イズ患者血清と高度に反応性であった(図１９Ｂ)。この
データは、経膜タンパク質の疎水性領域を含む合成ＨＩ
Ｖ−１エンベロープ遺伝子を大腸菌内において効率よく
発現させることができ、また発現したタンパク質は高度
に免疫反応性であることを示している。
【００３２】実施例３ 合成ＨＩＶ−２ＴＭＰおよびその断片の合成およびクロ
ーニング マンデツキ(Ｍandecki)の米国特許出願第８８３,２４２
号明細書(１９８６年７月８日出願、ＥＰＯ８７１０９
３５７.１)に開示されたオリゴヌクレオチドでの二本鎖
切断修復法を用い、全ＨＩＶ−２経膜タンパク質(ＴＭ
Ｐ)を化学的に合成した。大腸菌での発現に最適なコド
ン割り当てを用い、ＨＩＶ−２ＲＯＤ単離物のエンベロ
ープアミノ酸残基５０２〜８５８(番号付けは上掲のギ
アダーらによる)を逆翻訳した。上記のようにして特別
のヌクレオチドを残りのあいまいなヌクレオチドに割り
当てた後、図２０、図２１および図２２に示すように全
長ＴＭＰ配列を生成した。この合成遺伝子を、図２３に
示すように、断片Ａ(３３５bp ＨindIII−ＮcoＩ断
片)、断片Ｂ(３０９bp ＮcoＩ−ＢamＨＩ断片、２９の
疎水性アミノ酸残基を欠失させてある)、および断片Ｃ
(３６２bp ＢamＨＩ−ＨindIII断片)により示される３
つの別々の再断片として組み立てクローニングした。欠
失させた２９の疎水性アミノ酸残基を含む第四の断片を
３０９bp ＮcoＩ−ＢamＨＩ断片中にＥcoＲＶ−ＳnaＢ
Ｉ断片としてクローニングした(図２３)。上記のように
して、この３つの主要な再断片をpＵＣベクター中にク
ローニングし、ＪＭ１０９細胞中に形質転換し、その主
要なヌクレオチド配列を確認した。ついで、この断片を
ゲル精製し、一緒に連結して１０８９bpの完全長合成Ｈ
ＩＶ−２ＴＭＰを生成した。この１０８９bp ＨindIII
断片をpＵＣ８中にクローニングし、pＪＣ２８とした
(図２４)。
ーニング マンデツキ(Ｍandecki)の米国特許出願第８８３,２４２
号明細書(１９８６年７月８日出願、ＥＰＯ８７１０９
３５７.１)に開示されたオリゴヌクレオチドでの二本鎖
切断修復法を用い、全ＨＩＶ−２経膜タンパク質(ＴＭ
Ｐ)を化学的に合成した。大腸菌での発現に最適なコド
ン割り当てを用い、ＨＩＶ−２ＲＯＤ単離物のエンベロ
ープアミノ酸残基５０２〜８５８(番号付けは上掲のギ
アダーらによる)を逆翻訳した。上記のようにして特別
のヌクレオチドを残りのあいまいなヌクレオチドに割り
当てた後、図２０、図２１および図２２に示すように全
長ＴＭＰ配列を生成した。この合成遺伝子を、図２３に
示すように、断片Ａ(３３５bp ＨindIII−ＮcoＩ断
片)、断片Ｂ(３０９bp ＮcoＩ−ＢamＨＩ断片、２９の
疎水性アミノ酸残基を欠失させてある)、および断片Ｃ
(３６２bp ＢamＨＩ−ＨindIII断片)により示される３
つの別々の再断片として組み立てクローニングした。欠
失させた２９の疎水性アミノ酸残基を含む第四の断片を
３０９bp ＮcoＩ−ＢamＨＩ断片中にＥcoＲＶ−ＳnaＢ
Ｉ断片としてクローニングした(図２３)。上記のように
して、この３つの主要な再断片をpＵＣベクター中にク
ローニングし、ＪＭ１０９細胞中に形質転換し、その主
要なヌクレオチド配列を確認した。ついで、この断片を
ゲル精製し、一緒に連結して１０８９bpの完全長合成Ｈ
ＩＶ−２ＴＭＰを生成した。この１０８９bp ＨindIII
断片をpＵＣ８中にクローニングし、pＪＣ２８とした
(図２４)。
【００３３】ＨＩＶ−２ＴＭＰのアミノ末端１０８アミ
ノ酸(Ｔyr５０２からＴrp６０９[ギアダーら、上掲])を
コードする断片ＡをpＵＣ１９のＨindIII−ＳalＩ部位
にクローニングした。pＪＣ２２と称するクローンを制
限マッピングにより同定し、その主要なヌクレオチド配
列を確認した。プラスミドpＪＣ２２をＨindIII−Ａsp
７１８で消化して合成ＨＩＶ−２ＴＭＰ遺伝子断片を含
む３６１bp断片を放出させ、これをプラスミドpＴＢ２
１０のＨindIII−Ａsp７１８部位に連結し、大腸菌ＸＬ
１細胞中に形質転換した。プラスミドpＴＢ２１０は、
ボリング(Ｔ.Ｂolling)らによって出願された米国特許
出願(発明の名称「タンパク質合成のＣＫＳ法」;１９８８
年３月１１日に出願された米国特許出願第１６７,０６
７号のＣＩＰ出願)明細書に開示されている。pＪＣ１０
０と称するクローン(図２５)を単離し、制限マッピング
してkdsＢ(ＣＫＳをコードする)とＨＩＶ−２ＴＭＰ断
片とのハイブリッド遺伝子を同定した。
ノ酸(Ｔyr５０２からＴrp６０９[ギアダーら、上掲])を
コードする断片ＡをpＵＣ１９のＨindIII−ＳalＩ部位
にクローニングした。pＪＣ２２と称するクローンを制
限マッピングにより同定し、その主要なヌクレオチド配
列を確認した。プラスミドpＪＣ２２をＨindIII−Ａsp
７１８で消化して合成ＨＩＶ−２ＴＭＰ遺伝子断片を含
む３６１bp断片を放出させ、これをプラスミドpＴＢ２
１０のＨindIII−Ａsp７１８部位に連結し、大腸菌ＸＬ
１細胞中に形質転換した。プラスミドpＴＢ２１０は、
ボリング(Ｔ.Ｂolling)らによって出願された米国特許
出願(発明の名称「タンパク質合成のＣＫＳ法」;１９８８
年３月１１日に出願された米国特許出願第１６７,０６
７号のＣＩＰ出願)明細書に開示されている。pＪＣ１０
０と称するクローン(図２５)を単離し、制限マッピング
してkdsＢ(ＣＫＳをコードする)とＨＩＶ−２ＴＭＰ断
片とのハイブリッド遺伝子を同定した。
【００３４】実施例４ λpＬベクター中での合成ＨＩＶ−２ＴＭＰのクローニ
ング 全ＨＩＶ−２ＴＭＰを含む１０８９bp ＨindIII断片をp
ＪＣ２８から単離し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー
断片で充填して平滑末端を生成させ、pＳＤ３０５(clts
を挿入した上記pＳＤＫＲ８１６)の充填ＮcoＩ部位によ
り供されるＡＴＧ開始コドンのすぐ後方にクローニング
した。同様に、全ＨＩＶ−２ＴＭＰを含む１０９７bp
ＳalＩ−Ａsp７１８断片をpＪＣ２８から単離し、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノー断片で充填して平滑末端を
生成させ、pＫＲＲ９５５(上記)のＳmaＩ部位にクロー
ニングしてＨＩＶ−１gag／ＨＩＶ−２ＴＭＰ融合タン
パク質を生成させた。図２６に示すように、λpＬプロ
モーターの制御下にＨＩＶ−２ＴＭＰ遺伝子を含むクロ
ーンをpＳＤ３０６と称し、λpＬプロモーターの制御下
にＨＩＶ−１gagに融合したＨＩＶ−２ＴＭＰを含むク
ローンをpＳＤ３０７と称した。pＳＤ３０６を大腸菌Ｃ
ＡＧ４５６細胞(ベーカー(Ｂaker)、ＰＮＡＳ(１９８
４)８１:６７７９)中へ、pＳＤ３０７を大腸菌pＲＫ２
４８.clts／ＲＲ１細胞中へ形質転換した後、単一細胞
クローンを単離し、制限マッピングをしてＨＩＶ−２Ｔ
ＭＰ遺伝子の存在および方向性を示した。pＳＤ３０６
およびpＳＤ３０７の特別のアミノ酸配列を図２７およ
び図２８に示してある。図２７および図２８は、リンカ
ー由来配列、ＨＩＶ−１gag配列、およびＨＩＶ−２Ｔ
ＭＰ配列を示している。合成ＨＩＶ−２ＴＭＰ遺伝子の
発現を、上記のようにして温度シフト法によりこれらの
培養中で誘導した。誘導の前後における培養液のアリコ
ートを、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子産物について記
載したようにして、クマシーブルー染色およびＨＩＶ−
２陽性ヒト血清を用いたイムノブロッティングの両方に
よるＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析に供した。培養液の全細胞溶
解液および超音波処理した可溶性および不溶性画分を分
析したが、それはpＳＤ３０６およびpＳＤ３０７構築物
についてそれぞれ図２９および図３０に示してある。
ング 全ＨＩＶ−２ＴＭＰを含む１０８９bp ＨindIII断片をp
ＪＣ２８から単離し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー
断片で充填して平滑末端を生成させ、pＳＤ３０５(clts
を挿入した上記pＳＤＫＲ８１６)の充填ＮcoＩ部位によ
り供されるＡＴＧ開始コドンのすぐ後方にクローニング
した。同様に、全ＨＩＶ−２ＴＭＰを含む１０９７bp
ＳalＩ−Ａsp７１８断片をpＪＣ２８から単離し、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノー断片で充填して平滑末端を
生成させ、pＫＲＲ９５５(上記)のＳmaＩ部位にクロー
ニングしてＨＩＶ−１gag／ＨＩＶ−２ＴＭＰ融合タン
パク質を生成させた。図２６に示すように、λpＬプロ
モーターの制御下にＨＩＶ−２ＴＭＰ遺伝子を含むクロ
ーンをpＳＤ３０６と称し、λpＬプロモーターの制御下
にＨＩＶ−１gagに融合したＨＩＶ−２ＴＭＰを含むク
ローンをpＳＤ３０７と称した。pＳＤ３０６を大腸菌Ｃ
ＡＧ４５６細胞(ベーカー(Ｂaker)、ＰＮＡＳ(１９８
４)８１:６７７９)中へ、pＳＤ３０７を大腸菌pＲＫ２
４８.clts／ＲＲ１細胞中へ形質転換した後、単一細胞
クローンを単離し、制限マッピングをしてＨＩＶ−２Ｔ
ＭＰ遺伝子の存在および方向性を示した。pＳＤ３０６
およびpＳＤ３０７の特別のアミノ酸配列を図２７およ
び図２８に示してある。図２７および図２８は、リンカ
ー由来配列、ＨＩＶ−１gag配列、およびＨＩＶ−２Ｔ
ＭＰ配列を示している。合成ＨＩＶ−２ＴＭＰ遺伝子の
発現を、上記のようにして温度シフト法によりこれらの
培養中で誘導した。誘導の前後における培養液のアリコ
ートを、ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子産物について記
載したようにして、クマシーブルー染色およびＨＩＶ−
２陽性ヒト血清を用いたイムノブロッティングの両方に
よるＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析に供した。培養液の全細胞溶
解液および超音波処理した可溶性および不溶性画分を分
析したが、それはpＳＤ３０６およびpＳＤ３０７構築物
についてそれぞれ図２９および図３０に示してある。
【００３５】図２９は、誘導前(Ｔ０)および誘導２時間
後(Ｔ２)におけるクマシーブルー染色(図２９Ａ)および
イムノブロッティング(図２９Ｂ)により分析したpＳＤ
３０６の発現を示している。試料は、Ｔ０全細胞溶解液
(レーン１);Ｔ０超音波処理可溶性画分(レーン２);Ｔ０
超音波処理不溶性画分(レーン３);Ｔ２全細胞溶解液(レ
ーン４);Ｔ２超音波処理可溶性画分(レーン５);Ｔ２超
音波処理不溶性画分(レーン６);およびバイオラドの前
染色分子量マーカー(レーンＭ)であった。図２９は、ク
マシーブルー染色ゲルおよびイムノブロットの両方に矢
印で示してあるように、pＳＤ３０６がＴ２の時点で有
為量のＨＩＶ−２ＴＭＰを発現したことを示している。
この発現タンパク質は、これらの培養液の全細胞溶解液
および超音波処理不溶性細胞画分の両方で目で見ること
ができる。
後(Ｔ２)におけるクマシーブルー染色(図２９Ａ)および
イムノブロッティング(図２９Ｂ)により分析したpＳＤ
３０６の発現を示している。試料は、Ｔ０全細胞溶解液
(レーン１);Ｔ０超音波処理可溶性画分(レーン２);Ｔ０
超音波処理不溶性画分(レーン３);Ｔ２全細胞溶解液(レ
ーン４);Ｔ２超音波処理可溶性画分(レーン５);Ｔ２超
音波処理不溶性画分(レーン６);およびバイオラドの前
染色分子量マーカー(レーンＭ)であった。図２９は、ク
マシーブルー染色ゲルおよびイムノブロットの両方に矢
印で示してあるように、pＳＤ３０６がＴ２の時点で有
為量のＨＩＶ−２ＴＭＰを発現したことを示している。
この発現タンパク質は、これらの培養液の全細胞溶解液
および超音波処理不溶性細胞画分の両方で目で見ること
ができる。
【００３６】同様に、図３０は、誘導前(Ｔ０)および誘
導２時間後(Ｔ２)におけるクマシーブルー(図３０Ａ)お
よびイムノブロッティング(図３０Ｂ)により分析したp
ＳＤ３０７の発現を示す。試料は、pＫＲＲ９５５、Ｔ
２全細胞溶解液(レーン１);pＳＤ３０７、Ｔ０全細胞溶
解液(レーン２)、Ｔ０超音波処理可溶性画分(レーン
３)、Ｔ０超音波処理不溶性画分(レーン４)、Ｔ２全細
胞溶解液(レーン５)、Ｔ２超音波処理可溶性画分(レー
ン６)、Ｔ２超音波処理不溶性画分(レーン７);およびバ
イオラドの前染色分子量マーカー(レーンＭ)であった。
図３０は、クマシーブルー染色ゲルおよびイムノブロッ
トの両方に矢印で示してあるように、pＳＤ３０７がＴ
２の時点で有為量のＨＩＶ−１gag／ＨＩＶ−２ＴＭＰ
融合タンパク質を発現したことを示している。この融合
タンパク質もまた、これらの培養液の全細胞溶解液およ
び超音波処理不溶性細胞画分の両方で目で見ることがで
きる。ＨＩＶ−１gag融合相手形(レーン１)はＨＩＶ−
１gag／ＨＩＶ−２ＴＭＰ融合タンパク質よりも高レベ
ルで存在したが、ＨＩＶ−２特異的抗体に対して低い免
疫反応性を示した。
導２時間後(Ｔ２)におけるクマシーブルー(図３０Ａ)お
よびイムノブロッティング(図３０Ｂ)により分析したp
ＳＤ３０７の発現を示す。試料は、pＫＲＲ９５５、Ｔ
２全細胞溶解液(レーン１);pＳＤ３０７、Ｔ０全細胞溶
解液(レーン２)、Ｔ０超音波処理可溶性画分(レーン
３)、Ｔ０超音波処理不溶性画分(レーン４)、Ｔ２全細
胞溶解液(レーン５)、Ｔ２超音波処理可溶性画分(レー
ン６)、Ｔ２超音波処理不溶性画分(レーン７);およびバ
イオラドの前染色分子量マーカー(レーンＭ)であった。
図３０は、クマシーブルー染色ゲルおよびイムノブロッ
トの両方に矢印で示してあるように、pＳＤ３０７がＴ
２の時点で有為量のＨＩＶ−１gag／ＨＩＶ−２ＴＭＰ
融合タンパク質を発現したことを示している。この融合
タンパク質もまた、これらの培養液の全細胞溶解液およ
び超音波処理不溶性細胞画分の両方で目で見ることがで
きる。ＨＩＶ−１gag融合相手形(レーン１)はＨＩＶ−
１gag／ＨＩＶ−２ＴＭＰ融合タンパク質よりも高レベ
ルで存在したが、ＨＩＶ−２特異的抗体に対して低い免
疫反応性を示した。
【００３７】実施例５ 合成ＤＮＡ由来ＨＩＶタンパク質の診断学的有用性 当該技術分野で公知の方法を用い、大腸菌中で過発現さ
れた(overexpressed)ＨＩＶ特異的タンパク質を精製し
た。高レベルで発現されたこのタンパク質は免疫原性で
あり、ＨＩＶ感染個体中で産生された抗体により認識さ
れた(図１９、図２９および図３０参照)。大腸菌から得
られたＨＩＶ特異的タンパク質は、ドーソン(Ｄawson)
らのＣＩＰ出願、米国特許出願第０２０,２８２号明細
書(１９８７年２月２７日出願)に記載されているように
幾つかのイムノアッセイ法に利用することができる。こ
の親出願はＥＰＯ ８６１１６８５４.０(１９８６年１
２月４日出願)である。好ましい態様において、ＨＩＶ
特異的タンパク質を固体支持体上にコーティングし、試
験試料とともにインキュベートした。試験試料中に存在
するウイルス特異的抗体は、固体支持体上のＨＩＶタン
パク質を認識し、結合した。このＨＩＶ特異的抗体を、
ＨＲＰＯに結合させたヤギ抗ヒト免疫グロブリンを用い
て定量した。
れた(overexpressed)ＨＩＶ特異的タンパク質を精製し
た。高レベルで発現されたこのタンパク質は免疫原性で
あり、ＨＩＶ感染個体中で産生された抗体により認識さ
れた(図１９、図２９および図３０参照)。大腸菌から得
られたＨＩＶ特異的タンパク質は、ドーソン(Ｄawson)
らのＣＩＰ出願、米国特許出願第０２０,２８２号明細
書(１９８７年２月２７日出願)に記載されているように
幾つかのイムノアッセイ法に利用することができる。こ
の親出願はＥＰＯ ８６１１６８５４.０(１９８６年１
２月４日出願)である。好ましい態様において、ＨＩＶ
特異的タンパク質を固体支持体上にコーティングし、試
験試料とともにインキュベートした。試験試料中に存在
するウイルス特異的抗体は、固体支持体上のＨＩＶタン
パク質を認識し、結合した。このＨＩＶ特異的抗体を、
ＨＲＰＯに結合させたヤギ抗ヒト免疫グロブリンを用い
て定量した。
【００３８】組換えＤＮＡ法により得たＨＩＶ−１gp４
１やＨＩＶ−１p２４のようなＨＩＶ−１特異的タンパ
ク質を用い、ＣＩＰ出願第０２０,２８２号明細書に記
載されたようにしてＨＩＶ−１暴露患者を検出した。し
かしながら、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との間の交差反応
性のため、これらＨＩＶ−１特異的タンパク質を用いた
場合はＨＩＶ−２に暴露した患者のわずかに７０〜９０
％が検出されたにとどまった。これらのＨＩＶ−１特異
的タンパク質を用いて検出されなかったＨＩＶ−２暴露
患者は、合成ＤＮＡより得られたＨＩＶ−２タンパク質
を用いて検出した。たとえば、ＣＳＫに融合したＨＩＶ
−２ＴＭＰ断片(pＪＣ１００)を上記固体支持体上の組
換えＨＩＶ−１タンパク質に追加したときは、下記表１
に示すようにＨＩＶ−２抗体を含む試験試料の検出を有
為に増大させた。
１やＨＩＶ−１p２４のようなＨＩＶ−１特異的タンパ
ク質を用い、ＣＩＰ出願第０２０,２８２号明細書に記
載されたようにしてＨＩＶ−１暴露患者を検出した。し
かしながら、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との間の交差反応
性のため、これらＨＩＶ−１特異的タンパク質を用いた
場合はＨＩＶ−２に暴露した患者のわずかに７０〜９０
％が検出されたにとどまった。これらのＨＩＶ−１特異
的タンパク質を用いて検出されなかったＨＩＶ−２暴露
患者は、合成ＤＮＡより得られたＨＩＶ−２タンパク質
を用いて検出した。たとえば、ＣＳＫに融合したＨＩＶ
−２ＴＭＰ断片(pＪＣ１００)を上記固体支持体上の組
換えＨＩＶ−１タンパク質に追加したときは、下記表１
に示すようにＨＩＶ−２抗体を含む試験試料の検出を有
為に増大させた。
【００３９】表１ (注)＊破砕ＨＩＶ−２ウイルスを用いたウエスタンブロ
ッティング分析により、１２７のすべての試料がＨＩＶ
−２抗体の存在について陽性であることが確認された。
ッティング分析により、１２７のすべての試料がＨＩＶ
−２抗体の存在について陽性であることが確認された。
【００４０】さらに、上記ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２組換
えアッセイを用いて３４１１人の正常血液提供者をスク
リーニングした。この組換えアッセイは９９.７７％の
特異性を示し、最初に反応性の試料はわずかに８つ(０.
２３％)、繰り返し反応性の試料は４つ(０.１２％)であ
った。
えアッセイを用いて３４１１人の正常血液提供者をスク
リーニングした。この組換えアッセイは９９.７７％の
特異性を示し、最初に反応性の試料はわずかに８つ(０.
２３％)、繰り返し反応性の試料は４つ(０.１２％)であ
った。
【００４１】実施例６ ＨＩＶ−１感染とＨＩＶ−２感染の識別 ＨＩＶ−２に暴露された患者は、ＨＩＶ−１タンパク質
上にも存在するＨＩＶ−２タンパク質上のエピトープに
対して向けられた抗体を有することがしばしばある。同
様に、ＨＩＶ−１に暴露された患者は、ＨＩＶ−２タン
パク質と交差反応する抗体を有している。交差反応性の
ほとんどはgag遺伝子産物と関連しているので、pＪＰ１
００タンパク質およびＨＩＶ−１エンベロープタンパク
質からの組換えタンパク質(ＣＩＰ出願第０２０,２８２
号明細書に記載)を用いてＨＩＶ−１に感染した患者と
ＨＩＶ−２に感染した患者との間の識別を行った。
上にも存在するＨＩＶ−２タンパク質上のエピトープに
対して向けられた抗体を有することがしばしばある。同
様に、ＨＩＶ−１に暴露された患者は、ＨＩＶ−２タン
パク質と交差反応する抗体を有している。交差反応性の
ほとんどはgag遺伝子産物と関連しているので、pＪＰ１
００タンパク質およびＨＩＶ−１エンベロープタンパク
質からの組換えタンパク質(ＣＩＰ出願第０２０,２８２
号明細書に記載)を用いてＨＩＶ−１に感染した患者と
ＨＩＶ−２に感染した患者との間の識別を行った。
【００４２】２つの独立した酵素結合イムノアッセイを
行った。試験１にはＨＩＶ−１組換えタンパク質を固相
上にコーティングして用いた。試験２にはＨＩＶ−２Ｔ
ＭＰ(pＪＰ１００)を固相上にコーティングして用い
た。米国、ポルトガルまたは西アフリカからのＨＩＶ陽
性血清個体から得た試料について、これら２つの試験を
用いて抗体を試験した。終点力価は、正常ヒト血漿で試
料を希釈し、これら希釈液を試験することにより決定し
た。下記表２から明らかなように、合成組換えタンパク
質を用いた特異的試験は、ＨＩＶ−１感染およびＨＩＶ
−２感染を識別するのに有効に用いることができる。
行った。試験１にはＨＩＶ−１組換えタンパク質を固相
上にコーティングして用いた。試験２にはＨＩＶ−２Ｔ
ＭＰ(pＪＰ１００)を固相上にコーティングして用い
た。米国、ポルトガルまたは西アフリカからのＨＩＶ陽
性血清個体から得た試料について、これら２つの試験を
用いて抗体を試験した。終点力価は、正常ヒト血漿で試
料を希釈し、これら希釈液を試験することにより決定し
た。下記表２から明らかなように、合成組換えタンパク
質を用いた特異的試験は、ＨＩＶ−１感染およびＨＩＶ
−２感染を識別するのに有効に用いることができる。
【００４３】表２
【００４４】本発明の方法により容易に試験することの
できる生物学的試料としては、全血、血清、血漿、尿、
だ液、大便、リンパ球もしくは細胞培養調製物などのヒ
トまたは動物の体液および精製および部分精製免疫グロ
ブリンが挙げられる。本明細書に記載したポリペプチド
およびその断片は、当業者によく知られたアッセイ法に
よりＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗原に対する抗体の存
在または不存在を決定するため、またはＨＩＶ−１感染
とＨＩＶ−２感染との間の識別を行うために用いること
ができる。
できる生物学的試料としては、全血、血清、血漿、尿、
だ液、大便、リンパ球もしくは細胞培養調製物などのヒ
トまたは動物の体液および精製および部分精製免疫グロ
ブリンが挙げられる。本明細書に記載したポリペプチド
およびその断片は、当業者によく知られたアッセイ法に
よりＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗原に対する抗体の存
在または不存在を決定するため、またはＨＩＶ−１感染
とＨＩＶ−２感染との間の識別を行うために用いること
ができる。
【００４５】そのようなアッセイ法には、(a)本明細書
中に開示したポリペプチドおよびポリペプチド断片で固
体支持体をコーティングし、(b)該コーティング固体支
持体を生物学的試料と接触させて抗体−ポリペプチド複
合体を生成させ、(c)未結合の生物学的試料を固体支持
体から除き、(d)固体支持体上の該複合体を該抗体に対
して特異的な標識免疫グロブリンと接触させ、ついで
(e)該標識を検出して生物学的試料中のＨＩＶ−１およ
び／またはＨＩＶ−２抗体の存在または不存在を決定す
る工程が含まれる。
中に開示したポリペプチドおよびポリペプチド断片で固
体支持体をコーティングし、(b)該コーティング固体支
持体を生物学的試料と接触させて抗体−ポリペプチド複
合体を生成させ、(c)未結合の生物学的試料を固体支持
体から除き、(d)固体支持体上の該複合体を該抗体に対
して特異的な標識免疫グロブリンと接触させ、ついで
(e)該標識を検出して生物学的試料中のＨＩＶ−１およ
び／またはＨＩＶ−２抗体の存在または不存在を決定す
る工程が含まれる。
【００４６】第二のアッセイ法には、(a)本明細書に開
示したポリペプチドおよびポリペプチド断片で固体支持
体をコーティングし、(b)該コーティング固体支持体を
生物学的試料および標識に結合させた対応ポリペプチド
と接触させ、(c)未結合生物学的試料および未結合標識
ポリペプチドを除き、ついで(d)該標識を検出して生物
学的試料中のＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２抗体
の存在または不存在を決定する工程が含まれる。
示したポリペプチドおよびポリペプチド断片で固体支持
体をコーティングし、(b)該コーティング固体支持体を
生物学的試料および標識に結合させた対応ポリペプチド
と接触させ、(c)未結合生物学的試料および未結合標識
ポリペプチドを除き、ついで(d)該標識を検出して生物
学的試料中のＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２抗体
の存在または不存在を決定する工程が含まれる。
【００４７】そのようなイムノアッセイに用いる固体支
持体としては、反応トレイのウエル、試験管、ビーズ、
ストリップ、膜、フィルター、微細粒子または当業者に
よく知られた他の固体支持体が挙げられる。上記アッセ
イには、酵素標識、放射性同位体標識、蛍光標識、化学
発光標識およびコロイド粒子標識を用いることができ
る。さらに、ビオチン／標識抗ビオチン系のようなハプ
テン／標識抗ハプテン系を本発明のアッセイに用いるこ
とができる。試薬としてはポリクローナル抗体とモノク
ローナル抗体との両方が有用であり、固体支持体または
標識試薬としてＩgＧおよびＩgＭクラスのＨＩＶ抗体を
用いることができる。
持体としては、反応トレイのウエル、試験管、ビーズ、
ストリップ、膜、フィルター、微細粒子または当業者に
よく知られた他の固体支持体が挙げられる。上記アッセ
イには、酵素標識、放射性同位体標識、蛍光標識、化学
発光標識およびコロイド粒子標識を用いることができ
る。さらに、ビオチン／標識抗ビオチン系のようなハプ
テン／標識抗ハプテン系を本発明のアッセイに用いるこ
とができる。試薬としてはポリクローナル抗体とモノク
ローナル抗体との両方が有用であり、固体支持体または
標識試薬としてＩgＧおよびＩgＭクラスのＨＩＶ抗体を
用いることができる。
【００４８】以上の実施例から明らかなように、構築し
た合成遺伝子の特別の再断片を一緒にクローニングして
上記と同じ特性を有する新規な合成遺伝子を生成させる
ことができることは明らかである。たとえば、c−末端g
p１２０再断片、ＢＳ２−１０および再断片４１３−１
を一緒にクローニングしてエイズの診断および治療試薬
として有用な合成遺伝子産物を生成させることができ
る。
た合成遺伝子の特別の再断片を一緒にクローニングして
上記と同じ特性を有する新規な合成遺伝子を生成させる
ことができることは明らかである。たとえば、c−末端g
p１２０再断片、ＢＳ２−１０および再断片４１３−１
を一緒にクローニングしてエイズの診断および治療試薬
として有用な合成遺伝子産物を生成させることができ
る。
【図１】 ＨＩＶ−１のアミノ酸残基５５２〜６６８を
コードするＴＭＰ断片を、ＢＳ２−１０のアミノ酸配列
を得るために用いた４つの異なる単離物の配列を用いて
整列させたものを示す模式図である。
コードするＴＭＰ断片を、ＢＳ２−１０のアミノ酸配列
を得るために用いた４つの異なる単離物の配列を用いて
整列させたものを示す模式図である。
【図２】 １６オリゴヌクレオチドを組み立てて図１の
合成ＴＭＰ断片を生成させ、該断片をpＵＣ１８中にク
ローニングしてＢＳ２−１０を生成させることを示した
模式図である。
合成ＴＭＰ断片を生成させ、該断片をpＵＣ１８中にク
ローニングしてＢＳ２−１０を生成させることを示した
模式図である。
【図３】 ＦＳＧのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を制
限部位および組み立てに用いた再断片とともに示した模
式図である。
限部位および組み立てに用いた再断片とともに示した模
式図である。
【図４】 ＦＳＧのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を制
限部位および組み立てに用いた再断片とともに示した模
式図である。
限部位および組み立てに用いた再断片とともに示した模
式図である。
【図５】 ＦＳＧのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を制
限部位および組み立てに用いた再断片とともに示した模
式図である。
限部位および組み立てに用いた再断片とともに示した模
式図である。
【図６】 合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を作製す
るのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配列
の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ
酸置換(＊)とともに示した模式図である。
るのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配列
の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ
酸置換(＊)とともに示した模式図である。
【図７】 合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を作製す
るのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配列
の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ
酸置換(＊)とともに示した模式図である。
るのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配列
の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ
酸置換(＊)とともに示した模式図である。
【図８】 合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を作製す
るのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配列
の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ
酸置換(＊)とともに示した模式図である。
るのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配列
の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ
酸置換(＊)とともに示した模式図である。
【図９】 合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を作製す
るのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配列
の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ
酸置換(＊)とともに示した模式図である。
るのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配列
の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ
酸置換(＊)とともに示した模式図である。
【図１０】 合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を作製
するのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配
列の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミ
ノ酸置換(＊)とともに示した模式図である。
するのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配
列の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミ
ノ酸置換(＊)とともに示した模式図である。
【図１１】 合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を作製
するのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配
列の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミ
ノ酸置換(＊)とともに示した模式図である。
するのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配
列の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミ
ノ酸置換(＊)とともに示した模式図である。
【図１２】 合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を作製
するのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配
列の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミ
ノ酸置換(＊)とともに示した模式図である。
するのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配
列の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミ
ノ酸置換(＊)とともに示した模式図である。
【図１３】 合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を作製
するのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配
列の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミ
ノ酸置換(＊)とともに示した模式図である。
するのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配
列の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミ
ノ酸置換(＊)とともに示した模式図である。
【図１４】 合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を作製
するのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配
列の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミ
ノ酸置換(＊)とともに示した模式図である。
するのに用いた１３の独立した単離物の公知アミノ酸配
列の比較を、すべてのリンカー由来配列(＋)およびアミ
ノ酸置換(＊)とともに示した模式図である。
【図１５】 pＵＣ１８中にＦＳＧを生成するための主
要な再断片の組み立ておよびクローニングを示す模式図
である。
要な再断片の組み立ておよびクローニングを示す模式図
である。
【図１６】 ＦＳＧをλpＬ発現ベクター中にクローニ
ングしてpＳＤ３０１およびpＳＤ３０２を生成すること
を示した模式図である。
ングしてpＳＤ３０１およびpＳＤ３０２を生成すること
を示した模式図である。
【図１７】 pＳＤ３０１およびpＳＤ３０２のアミノ酸
配列をすべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ酸置
換(＊)とともに示した模式図である。
配列をすべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ酸置
換(＊)とともに示した模式図である。
【図１８】 pＳＤ３０１およびpＳＤ３０２のアミノ酸
配列をすべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ酸置
換(＊)とともに示した模式図である。
配列をすべてのリンカー由来配列(＋)およびアミノ酸置
換(＊)とともに示した模式図である。
【図１９】 pＳＤ３０１およびpＳＤ３０２の発現分析
の結果を示す模式図である(Ａはクマシーブルー染色ゲ
ル、Ｂはエイズ患者血清を用いたイムノブロット)。
の結果を示す模式図である(Ａはクマシーブルー染色ゲ
ル、Ｂはエイズ患者血清を用いたイムノブロット)。
【図２０】 全長合成ＨＩＶ−２ＴＭＰのＤＮＡ配列お
よびアミノ酸配列を、クローニングを容易にするための
両末端リンカー配列を含む該遺伝子を組み立てるのに用
いた制限酵素とともに示す模式図である。
よびアミノ酸配列を、クローニングを容易にするための
両末端リンカー配列を含む該遺伝子を組み立てるのに用
いた制限酵素とともに示す模式図である。
【図２１】 全長合成ＨＩＶ−２ＴＭＰのＤＮＡ配列お
よびアミノ酸配列を、クローニングを容易にするための
両末端リンカー配列を含む該遺伝子を組み立てるのに用
いた制限酵素とともに示す模式図である。
よびアミノ酸配列を、クローニングを容易にするための
両末端リンカー配列を含む該遺伝子を組み立てるのに用
いた制限酵素とともに示す模式図である。
【図２２】 全長合成ＨＩＶ−２ＴＭＰのＤＮＡ配列お
よびアミノ酸配列を、クローニングを容易にするための
両末端リンカー配列を含む該遺伝子を組み立てるのに用
いた制限酵素とともに示す模式図である。
よびアミノ酸配列を、クローニングを容易にするための
両末端リンカー配列を含む該遺伝子を組み立てるのに用
いた制限酵素とともに示す模式図である。
【図２３】 合成ＨＩＶ−２ＴＭＰ遺伝子を構築するの
に用いた３つの主要な再断片を示す模式図である。
に用いた３つの主要な再断片を示す模式図である。
【図２４】 全長ＨＩＶ−２ＴＭＰを生成するための主
要な再断片の組み立ておよびそれをpＵＣ８中にクロー
ニングしてpＪＣ２８を生成させることを示す模式図で
ある。
要な再断片の組み立ておよびそれをpＵＣ８中にクロー
ニングしてpＪＣ２８を生成させることを示す模式図で
ある。
【図２５】 合成ＨＩＶ−２ＴＭＰ断片ＡをpＵＣ１９
中にクローニングしてpＪＣ２２を生成させ、これをpＴ
Ｂ２１０中にクローニングしてpＪＣ１００を生成させ
ることを示す模式図である。
中にクローニングしてpＪＣ２２を生成させ、これをpＴ
Ｂ２１０中にクローニングしてpＪＣ１００を生成させ
ることを示す模式図である。
【図２６】 合成ＨＩＶ−２ＴＭＰをλpＬ発現ベクタ
ー中にクローニングしてpＳＤ３０６およびpＳＤ３０７
を生成させることを示す模式図である。
ー中にクローニングしてpＳＤ３０６およびpＳＤ３０７
を生成させることを示す模式図である。
【図２７】 pＬ構築物pＳＤ３０６およびpＳＤ３０７
の一定のアミノ酸配列を、すべてのリンカー配列、ＨＩ
Ｖ−１gag配列、およびＨＩＶ−２ＴＭＰ配列とともに
示す模式図である。
の一定のアミノ酸配列を、すべてのリンカー配列、ＨＩ
Ｖ−１gag配列、およびＨＩＶ−２ＴＭＰ配列とともに
示す模式図である。
【図２８】 pＬ構築物pＳＤ３０６およびpＳＤ３０７
の一定のアミノ酸配列を、すべてのリンカー配列、ＨＩ
Ｖ−１gag配列、およびＨＩＶ−２ＴＭＰ配列とともに
示す模式図である。
の一定のアミノ酸配列を、すべてのリンカー配列、ＨＩ
Ｖ−１gag配列、およびＨＩＶ−２ＴＭＰ配列とともに
示す模式図である。
【図２９】 大腸菌ＣＡＧ４５６細胞中でのpＳＤ３０
６の発現分析の結果を示す模式図である(Ａはクマシー
ブルー染色ゲル、ＢはＨＩＶ−２陽性ヒト血清を用いた
イムノブロット)。
６の発現分析の結果を示す模式図である(Ａはクマシー
ブルー染色ゲル、ＢはＨＩＶ−２陽性ヒト血清を用いた
イムノブロット)。
【図３０】 大腸菌pＲＫ２４８.clts／ＲＲ１細胞中で
のpＳＤ３０７の発現分析の結果を示す模式図(Ａはクマ
シーブルー染色ゲル、ＢはＨＩＶ−２陽性ヒト血清を用
いたイムノブロット)である。
のpＳＤ３０７の発現分析の結果を示す模式図(Ａはクマ
シーブルー染色ゲル、ＢはＨＩＶ−２陽性ヒト血清を用
いたイムノブロット)である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジェームス・エム・キャシー アメリカ合衆国イリノイ60031、ガーニー、 マックルーア4567番 (72)発明者 スレッシュ・エム・デサイ アメリカ合衆国イリノイ60048、リバティ ービル、アミイ・レイン1408番
Claims (7)
- 【請求項１】 下記アミノ酸配列を有するＨＩＶ経膜抗
原ポリペプチド。 【化１】 - 【請求項２】 大腸菌により製造された請求項１記載の
ポリペプチド。 - 【請求項３】 下記アミノ酸配列を有する請求項１また
は２記載のポリペプチドのポリペプチド断片。 YSSAHGRHTRGVFVLGFLGFLATAGSAMGAASLTVSAQSRTLLAGIVQQQ
QQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQ
VCHTTVPW - 【請求項４】 下記ＤＮＡ配列を有し、ＨＩＶ経膜抗原
ポリペプチドをコードする合成遺伝子。 【化２】 - 【請求項５】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
る請求項４記載の合成遺伝子。 - 【請求項６】 下記ＤＮＡ配列を有し、ＨＩＶ経膜抗原
ポリペプチドをコードする合成遺伝子。 【化３】 - 【請求項７】 請求項３記載のポリペプチドをコードす
る請求項６記載の合成遺伝子。
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