JPH02273187A - Ｈｉｖエンベロープタンパク質およびそれを用いたｈｉｖ抗原に対する抗体の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、組換えＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）抗原
および該抗原を用いたＨＩＶに対する抗体の検出方法に
関する。ＨＩＶ抗原の合成りＮＡ配列のモレキュラーク
ローニングおよび異種発現系での発現から得られた組換
え抗原は、種々のＨＴＶ単離物に暴露された個体から採
取した体液中の抗体および抗原を検出するための試薬と
して用いることができる。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）幾つ
かのＨＩＶ単離物についてプロウィルスゲノムのヌクレ
オチド配列が決定されている。たとえば、ＨＩＶ−１株
ＨＴＬＶ−ＩＩＩ（ラットナー（Ｒａｔｎｅｒ）ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ（１９８５）３１３　：２２７）：ＡＲＶ−
２（サンチェスーペスカドール（Ｓ　ａｎｃｈｅｚ　−
Ｐ　ｅｓｃａｄｏｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８５）
２２７　：４８４）；ＬＡＶ（ウエインーホブソン（Ｗ
ａｉｎ　−Ｈｏｂｓｏｎ）ら、Ｃａ１ｌ（１９８５）４
０　：９）；およびＣＤＣ−４５１（プサイ（Ｄｅｓａ
ｉ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ（１９８６）８３　：８３８０）などである。

ＨＩＶ−２ＲＯＤ単離物のヌクレオチド配列は、ギアグ
ー（Ｑ　ｕｙａｄｅｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）
３２６：６６２）によって報告された。

ＨＩＶ抗原は、組織培養中に増殖したウィルスから、ま
たはモレキュラークローニングし大腸菌のような異種宿
主中で発現させたゲノム断片から得られている。組織培
養由来ウィルスの場合は、ウィルス感染細胞を増殖させ
るために、厳重な滅菌条件下での面倒でしばしば困難な
工程が含まれる。さらに、組織培養由来ウィルスは感染
性であり、従って増殖および精製に携わる者の健康にと
って有害で危険である。モレキュラークローニングした
ＨＩＶゲノム断片を発現させることにより、このような
生物学的危険の問題が回避される。−般に、哺乳動物コ
ドンを有する単一のＨＩＶ単離物からのＨＩＶゲノム断
片は細菌や酵母などの異種発現系で発現され、クローニ
ングおよび発現させるために、ウィルスゲノム中に存在
する利用可能な制限部位を使用することに限定される。

ある種のＨＩＶタンパク質、たとえばＨＩＶ−【エンベ
ロープ抗原ｇｐ４１を異種発現系で発現させることは困
難であった。焼入かの研究者は、発現レベルを増加させ
るためにＨＩＶ−１ｇｐ４１の疎水性領域を欠失させる
ことを試みている。英国特許出願ＣＢ２１８８６３９号
明細書はＨＴＬＶ　−ｍ　ｇａｇ／ｅｎｖ遺伝子タンパ
ク質を開示しており、該ＤＮＡ配列のｅｎｖ断片は、ｇ
ｐ４１タンパク質の第一の疎水性領域に対応するコドン
が欠失している。米国特許第４，７５３，８７３号明細
書にはヌクレオチド配列によりコードされたペプチド断
片が開示されており、この場合、ＨＴＬＶ−ＩＩＩｇｐ
４１の第一および第二の疎水性領域をコードするヌクレ
オチドは欠失している。

多くの要因、たとえば発現させようとする遺伝子の特定
の核酸配列、発現させようとする遺伝子配列の哺乳動物
コドンは特定の異種発現系では効率よく転写および翻訳
されないこと、および転写したメツセンジャーＲＮＡの
二次構造などのために発現がうまくいかないことがある
。合成りＮＡ断片を用いることにより異種発現系での発
現を増大させることができる。

（課題を解決するための手段） 本発明により、モレキュラークローニングおよび異種宿
主中での合成りＮＡ配列の発現により得られた組換え抗
原が提供される。さらに本発明により、本発明の組換え
抗原をコードする合成りＮＡ配列が提供される。種々の
ＨＩＶ抗原の発現のために選択した合成りＮＡ配列は、
単一の単離物かまたは幾つかの単離物のアミノ酸配列に
基づいており゛、特定のコドンを選択することにより大
腸菌中での発現を最適化させる。本発明の合成りＮＡ配
列により、コードされた特定の抗原の一眉高い発現が得
られる。これらの抗原は、診断試薬および治療試薬とし
て、組織培養から得られたウィルス性抗原の代わりに用
いることができる。

本発明は、細菌コドンを用い、全長ＨＩＶ経膜エンベロ
ープ遺伝子を合成するために利用することができる。本
発明の他の態様には、個々のタンパク質としてはほとん
ど発現されない配列を、高効率で発現される配列に連結
することが含まれる。

ある一つのウィルスの遺伝子の全コード領域の配列を、
異なるウィルスの別の遺伝子のコード配列と組み合わせ
て融合タンパク質を生成することができる。こうして発
現した融合タンパク質は、２つのウィルス抗原の抗原エ
ピトープの素晴しい利点を有する。

本発明は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２経膜糖タンパク
質（ＴＭＰ）のための完全長合成遺伝子（ＦＳＧ）を含
む。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

ＨＩＶゲノムの合成りＮＡ断片は、対応するアミノ酸配
列に基づいて合成することができる。異なる単離物の間
で特定の領域を比較することにより、天然に存在するい
かなる配列とも異なる配列を選択することができる。な
ぜなら、そのような配列は種々の単離物からの配列の寄
せ集めであるからである。たとえば、実施例１に記載し
た合成Ｈ（Ｖ−１エンベロープタンパク質は、４つの異
なるＨＩＶ−１単離物、すなわちＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ。

ＬＡＶ−１、ＡＲＶ−２およびＣＤＣ−４５１のアミノ
酸配列に基づいている。

他の性質を配列中に組み入れることもできる。

たとえば、細菌または酵母での発現が最適となるように
コドンを切り換えたり、特定の制限部位を導入したり、
他の制限部位を取り除いたりすることができる。加えて
、特定のベクター中でのクローニングを容易にするため
に、断片の５゛と３′の両末端に特定の制限部位を有し
ていなければならない。合成りＮＡ断片はつぎのように
して合成することができる。

（＋）独特のタンパク質配列を選択する。

（２）逆転写して相補的ＤＮＡ配列を決定する。

（３）細菌または酵母発現のためにコドンを最適化する
。

（４）および、特定の制限部位を導入および／または除
去する。

６１個の別個のヌクレオチドコドンが２０個のアミノ酸
をコードしており、遺伝子コードにおける退縮を生じさ
せている。研究者らは、真横生物および原核生物の両方
において核酸に用いられるコドンの頻度を報告している
（グランサム（Ｇ　ｒａｎｔｈａｍ）ら、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、［１９８０］９　：ｒ４３；
ギー（Ｇ　ｏｕｙ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、［１９８２コｌｏニア０５５；シャープ（Ｓｈ
ａｒｐ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、［
Ｉ　９８６］１４　ニア　７３７）。

染色体、トランスボゾンおよびプラスミドからの配列を
例として、全大腸菌ゲノムからの配列が解析されている
。これらの配列は、構造タンパク質、酵素および調節タ
ンパク質をコードしている。特定の遺伝子内でのコドン
の偏りの度合と遺伝子発現レベルとの間に相関関係が示
されている。

合成りＮＡ配列の各特定のアミノ酸に対しては同じコド
ントリプレットを用いるのが好ましい。

しかしながら、特定の制限部位を付加したり欠失させた
りするために別のコドンを用いることもできる。配列に
はまた、特定の断片または配列を欠失させたり、最初の
合成にエラーがあった場合に特定の配列を置換させるた
めに用いることのできる独特の制限部位が含まれていな
ければならない。

本発明の用いることのできるベクター系としては、植物
、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物の発現系が挙げられ
る。用いた系での発現のためにコドンを最適化するのが
好ましい。上記のように異種発現系でクローニングし発
現させた本発明のタンパク質およびポリペプチドは、診
断および治療の目的のために用いることができる。

好ましい発現系にはλｐＬベクター系を利用する。この
発現系はっぎのような特徴を有する。

（１）強力なλＩ）Ｌプロモーター （２）強力な３フレーム翻訳ターミネータ−ｒｒｎＢ　
ｔｌおよび （３）利用できる（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）Ｎｃｏ　Ｉ
制限部位内に位置するリポソーム結合部位から８塩基対
にあるＡＴＧコドンでの翻訳開始。

本発明の発現系の他の利点は、所望のアミノ酸配列を有
するタンパク質を発現する特定のＤＮＡ配列が含まれる
ように合成りＮＡ断片をあつらえることかできること、
さらに、合成断片を種々のベクター中に移すのを容易に
するために、５°かまたは３′部位に他のＤＮＡ配列を
付加することができることである。

加えて、断片の両末端にある特定の制限部位を使用する
ことにより、該断片を他の配列中に組み込んで融合タン
パク質を生成させるこもでき、このような融合タンパク
質もまた診断および治療試薬として用いることができる
。たとえば、ＨＩ　Ｖ−Ｉｇ＋）４１配列をＢ型肝炎ウ
ィルス配列のコア／表面抗原の内部または末端に組み込
んで融合タンパク質を生成させ、このような融合タンパ
ク質を、感染の可能性のある血液提供者におけるＡＩＤ
ＳおよびＢ型肝炎の両方を検出するための単一アッセイ
スクリーニングシステムに用いることができる。別のや
り方として、患者の感染の経過を追跡するためにアッセ
イを用いることができる。

融合タンパク質を生成させるために、細菌、酵母、昆虫
、植物または哺乳動物を含むあらゆる採取源からの他の
タンパク質を本発明の合成りＮＡ断片とともに用いるこ
とができる。それぞれの発現系において効率よく発現さ
れるタンパク質は、融合タンパク質の合成断片の発現を
高めるので特に好ましい。

幾つかのＨＩＶ単離物から得られ大腸菌での発現を最適
化した本発明の合成りＮＡ配列により、遺伝学的に識別
可能な種々のＨＩＶ単離物に暴露された個人からの被験
血清を認識する、連続的に利用可能で均一なＨＩＶ抗原
調製物が提供される。

組換え抗原の合成には大腸菌コドンを用いるので、その
発現は非常に安定である。さらに、特定の制限部位を挿
入することにより、コード配列中の重要な抗原エピトー
プにおいて付加、欠失または置換をさせることができる
が、このような性質は、天然に存在するＨＩＶ配列を用
いて発現させた場合には達成するのが困難なものである
。合成遺伝子を構築することにより遺伝子のアミノ末端
かまたはカルボキシ末端にタンパク質配列を付加するこ
とが可能になり、そうすることにより新規な試薬を開発
することも可能になる。たとえば、ＨｌＶ−１コア抗原
遺伝子とＨＩＶ−１工ンベロープ合成遺伝子との間で融
合させた融合遺伝子を製造することができる。さらに詳
しくは、エンベロープ合成遺伝子は、カルボキシ末端Ｈ
（Ｖ−１ｇｐ１２０配列および全長ＨＩＶ−１ｇｐ４１
からなる。同様に、ＨＩＶ−１コア抗原ＤＮＡ配列をＨ
ＩＶ−２ｇＰ４１配列に融合させることができ、両者と
もに大腸菌のような異種宿主系において高レベルで発現
することができる。

本発明に有用なプラスミドを含有する大腸菌株は、１９
８８年１１月２２日にアミリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ロックビル、メリーランド）に受託番
号ＡＴＣＣ６７８５５（＋）ＳＤＳ０１／ＲＲＩ／ｐＲ
Ｋ２４Ｂ、ｃｌｔｓ）およびＡＴＣＣ６７８５６（ｐＳ
Ｄ３０６／ＣＡＧ４５６）にて寄託しである。

試薬および酵素 ルリアーベルタ一二（Ｌ　ｕｒｉａ　−Ｂ　ｅｒｔａｎ
ｉ　；　Ｌ　Ｂ　）およびスーパーブロス（Ｓ　ｕｐｅ
ｒｂｒｏｔｈ）　ＩＩ　（乾燥形）のような培地は、ギ
ブコ・ラボラトリーズ・ライフ・チクノロシーズ（Ｇｉ
ｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｉｔｅ　Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　ｌ　ｎｃ、）（マジソン、ライ
スコンシン）から入手した。制限酵素、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ、核酸分子量標準、Ｍ１３シーク
エンシングシステム、Ｘ　−ｇａｌ（５−ブロモ−４−
’２０ロー３−インドニルーβ−Ｄ−ガラクトシド）、
ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）
、グリセロール、ジチオスレイトール、４−クロロ−１
−ナフトールは、べ一リンガー・マンハイム・バイオケ
ミカルズ（Ｂ。

ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂ　１ｏｃｈｅ
ａ＋１ｃａｌｓＸインデイアナポリス、インデイアナ）
；または二ニー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。

Ｉ　ｎｃ、）（ビバーリー、マサチューセッツ）；また
はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・ライフ・チク
ノロシーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ
ａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ　Ｌ　：ｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　
Ｉ　ｎｃ、）（ガイサーバーグ（Ｇ　ａｉｔｈｅｒｂｕ
ｒｇ）、メリーランド）から購入した。

前以て染色したタンパク質分子量標準、アクリルアミド
（結晶、電気泳動グレード〉９９％）：Ｎ　−Ｎｏ−メ
チレン−ビス−アクリルアミド（Ｂ　Ｉ　Ｓ）；Ｎ、Ｎ
、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエ・チレンジアミン（ＴＥ
ＭＥＤ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、
バイオラド・ラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅａＸリッチモンド、カリフォルニア）か
ら購入した。リゾデームおよびアンピシリンは、ジグ？
−ケミカル（Ｓｉｇａａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）
（セントルイス、ミズーリ）から購入した。西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識第二抗体は、キルケ
ガール・アンド・ベリー・ラボラトリーズ（Ｋｉｒｋｅ
ｇａａｒｄ＆　Ｐ　ｅｒｒｙ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、　Ｉ　ｎｃ、）（ガイサーバーグ、メリーランド
）から購入した。ジ−プラーク（Ｓ　ｅａｐｌａｑｕｅ
）アガロース（低融アガロース）は、ＰＭＣバイオプロ
ダクツ（Ｂ　１ｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ロックランド、
メイン）から購入した。

Ｔ５０Ｅ１０は５０ｍＭ）リス、ｐ［（８゜０、ｌＯｍ
ＭＥＤＴＡを含んでいた。Ｉ　ＸＴＧは１００ｍＭ）リ
ス、ｐＨ７，５および１０％グリセロールを含んでいた
。２ＸＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷バッファ−は１５％グリセ
ロール、５％５ＤＳＳ　１００ｍＭトリス塩基、１Ｍβ
−メルカプトエタノールおよび０．８％ブロモフェノー
ル青色色素からなっていた。ＴＢＳは５０ｍＭ）リス、
ｐＨ８，０および１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含んでい
た。ブロッキング溶液はＴＢＳ中の５％カーネーション
（Ｃａｒｎａｔ　１ｏｎ）脱脂粉乳からなっていた。

宿主細胞培養、ＤＮＡ源およびベクター大腸菌ＪＭ１０
３細胞、ｐＵＣ８、Ｉ）ＵＣｌ３、ＰＵＣ１９およびＭ
１３クローニングベクターをファルマシア・ＬＫＢ・バ
イオテクノロジー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌ　Ｋ　Ｂ　
Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　ｒ　ｎｃ、）（ピス
カタウエー、ニューシャーシー）から購入した。コンピ
テントなエピキュリアン・コリ（Ｅｐｉｃｕｒｅａｎｃ
ｏｌ　ｉ）株ＸＬＩ−ＢｌｕｅおよびＪＭ１０９をスト
ラタジーン・クローニング・システムズ（Ｓ　ｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ラジ
ョラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア）から購入
した。ＲＲＩ細胞は、コリ・ジエネティック・ストック
・センター（Ｃ。

１ｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　ＣｅｎｔｅｒＸイ
ヱール・ユニバージティー、ニューヘブン、コネチカッ
ト）から入手した。大腸菌ＣＡ０４５６細胞は、カロル
・グロス（Ｃａｒｏｌ　Ｇｒｏｓｓ）博士（ユニバージ
ティー・才ブ・ライスコンシン（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
　ｏｒ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、マジソン、ライスコン
シン）から入手した。

ベクターｐＲＫ　２４　Ｂ　、ｃｌｔｓは、ドナルド・
アール・ヘリンスキー（Ｄｏｎａｌｄ　Ｒ，Ｈｅ１ｉｎ
ｓｋｉ）博士（ユニバージティー・オブ・カリフォルニ
ア（ｔＪ　ｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒ
ｎｉａ）、サンジエゴ、カリフォルニア）から入手した
。

一般的方法 すべての制限酵素消化は、供給者の指示に従って行った
。ＤＮＡ（１μｇ）当たり少なくとも５単位の酵素を用
い、ＤＮＡの消化を完了するため充分にインキュベート
した。標準的手順を用いてミニ細胞溶解物ＤＮＡＣＦ４
製物、フェノール−クロロホルム抽出、ＤＮＡのエタノ
ール沈澱、アガロース上でのＤＮＡの制限分析、および
ＤＮＡ断片の低融アガロースゲル精製を行った（マニア
ナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ア・
ラボラトリーズ・マニュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）［ニューヨーク：コールド・スプ
リング・ハーバ−１１９８２］）。大腸菌株からのプラ
スミドの単離には、アルカリ溶解法および塩化セシウム
−臭化エチジウム密度勾配法（マニアナイスら、上掲書
）を用いた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼには標準バッファーを用いた（マニアナ
イスら、上掲書）。

つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１ ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質をコードする合成
遺伝子およびその断片を開発するため、ＨＴＬＶ−Ｉ［
ＩＢ（ＢＨｌ　０２）、ＬＡＶ−１（ＭＡＬ）、ＡＲＶ
−２（ＳＦ）およびＣＤＣ−４５１（ＣＤＣ４２）と称
する４つの独立したＨ　Ｉ　Ｖ−１ウイルス単離物のア
ミノ酸配列を比較した。４つの単離物から独特のアミノ
酸配列を選択しく第１図）、アミノ酸残基５５２−６６
８（上掲うットナーによる番号付け）を有する断片を得
た。この断片は、ＨＴＬＶ−１’ｎＢ（ＢＨＩ　Ｏ２）
単離物と比べて９つのアミノ酸置換（８％）を含んでい
た。大腸菌での高レベル発現を容易にするために最適化
したコドンを用い、このアミノ酸配列を逆翻訳した。コ
ドンの第二および／または第三の塩基に残っているあい
まいなヌクレオチドは、モレキュラークローニング、お
よび配列の付加、置換または欠失を容易にするために割
り当てた。ついで、このＤＮＡ配列を、直接特異的にア
ニールするための独特のｅｂｐ突起（ｏｖｅｒｈａｎｇ
ｓ）を有する８つの二本鎖断片に再分した。製造業者に
より推奨された方法および試薬を用い、アプライド・バ
イオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍ
）　３　Ｂ　ＯＡ　Ｄ　Ｎ　Ａシンセサイザー上で１６
の個別のオリゴヌクレオチドを合成した。これらの精製
オリゴヌクレオチドをアニールし、−緒に連結して全断
片を組み立て、ＢａｍＨＩおよび５ａｌｔで消化し、ｐ
Ｕｃ１８中に連結し、大腸菌ＪＭ１０３細胞中に形質転
換した。Ｂ５２−１０と称するクローン（第２図）を単
離し、制限地図を作成し、サンガー（Ｓ　ａｎｇｅｒ）
のジデオキシ鎖終止法（サンガーら、Ｊ　、Ｍｏ１．Ｂ
　ｉｏｌ、（１９８２）１Ｇ２ニア２９）を用いてＤＮ
Ａ配列を確認した。

りｏ−ンｎ５２−１０がコノ独特＋７）ＨＩＶ−１経膜
タンパク質（ＴＭＰ）断片を発現することを確立するた
め、Ｂ５２−１０／ＪＭ１０３培養を２５０ＲＩ２容エ
ルレンマイエルフラスコ中、ルリアブロス（５０１Ｑ）
中で３７℃にて増殖させた。培養液の０Ｄ６００が０．
３〜０．５に達したとき、ＩＰＴＧを最終濃度がｌＩＩ
ＩＭになるように加えて発現を引き起こした。試料（１
、５１１２）を１時間間隔で除き、細胞をペレット化し
、２ｘＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷バツフアー中に０Ｄ６００
が１０．０になるまで再懸濁した。調製試料のアリコー
ト（１５μＱ）を１５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上に負荷
し、タンパク質を分離し、ついでイムノプロッティング
のためにニトロセルロースへ電気泳動的に移動させた。

移動タンパク質を含むニトロセルロースシートをブロッ
キング溶液とともに１時間インキエベートし、５％大腸
菌ＪＭ１０３溶解液を含有するＴＢＳ中に希釈したエイ
ズ患者血清とともに４℃で一夜インキエベートした。こ
のニトロセルロースシートをＴＢＳ中で３回洗浄し、つ
いでＨＲＰ〇−標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１０％仔ウシ血
清を含むＴＢＳ中で希釈）とともにインキエベートした
。このニトロセルロースをＴＢＳで３回洗浄し、４−ク
ロロ−１−ナフトール（２１１ｇ／ｊＩｅ）、０．０２
％過酸化水素および１７％メタノールを含有するＴＢＳ
中で発色させた。クローンＢ５２−１０はエイズ患者の
血清と強く免疫応答するバンドを示し、このことは合成
ＨＩＶ−Ｉ　　ＴＭＰ断片が大腸菌中で発現したことを
示している。ｇｐ１２０の最大カルボキシ末端３７アミ
ノ酸とともに全長ＨＩＶ−１経膜タンパク質を組み立て
るために、上記４つの単離物のアミノ酸配列を互いに比
較し、この遺伝子のために独特のアミノ酸配列を得た。

大腸菌発現のために最適化したコドンを用いてこの独特
のアミノ酸配列を逆翻訳した後、あいまいなヌクレオチ
ドは上記のように割り当てた。全長合成ＨＩ　Ｖ　−１
エンベロープ遺伝子（Ｆ　Ｓ　Ｇ）をさらに６つの再断
片に分割した。ＦＳＧの完全なりＮＡおよびアミノ酸配
列を第３図に示す（組み立てに用いた制限部位および再
断片を示す）。第４図は、合成ＨＩＶ−１エンベロープ
遺伝子を開発するのに用いたアミノ酸配列を、ロスアラ
モスＨ！■データバンク中に報告された１３の独立した
単離物の公知のアミノ酸配列（マイヤーズ（Ｍｅｙｅｒ
Ｓ）ら、Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎ
ｄ　Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　（１９８７）、ロス・アラモス・
ナショナル・ラボラトリ−（Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））と比較した
ものである。インテリジエネティックス（Ｉ　ｎｔｅｌ
ｌ　ｉｇｅｎｅｔ　１ｃｓ）のゲナリ・ン（Ｇｅｎａｌ
ｉｇｎ）プログラムを用いてこれらの配列を整列させ、
整列させたものにより、他の公知の単離物と比較してＥ
ＳＣ（第４図において５ＹＮＧＥＮＥと示しである）が
実質的に全配列相同性を保持していることが示された。

個々の配列の整列パラメーターお上び整列スコアも示し
である。

再断片の合成およびクローニング Ｂ５２−１０の下流に位置する再断片（４１３−１〜４
１３−４と称する）を、個々のモレキュラークローニン
グおよびＤＮＡ配列決定を容易にするため、５°末端に
Ｂａｇ＋ＨＩ制限部位を有し３゜末端にＨｉｎｄｌＩＩ
制限部位を有する配列とともに合成した。Ｂ５２−１０
の上流に位置する再断片もまた、クローニングおよびＤ
ＮＡ配列分析に有用な制限部位を有する配列とともに合
成した。カルボキシ末端ｇ９１２０アミノ酸配列をコー
ドする再断片（Ｃ−末端ｇｐ１２０と称する）は、５°
末端にＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を、３°末
端にＢｇｔｎおよびＳ　ｍａ　１制限部位を有していた
。同様に、再断片４１５は５°末端にＢｇｌ■制限部位
を、３゜末端にＢｇｌｌｌおよびＢａｍ１ｌＴ制限部位
を含んでいた。Ｃ−末端ｇｐｔ２ｏ再断片を例外として
（この場合はＢ５２−１ｏについて記載したようにして
両方の鎖を合成）、ＦＳＧの残りの再断片はＤＮＡポリ
メラーゼ■のクレノー断片を用いた方法により合成した
。この方法では、特定の再断片とは反対の鎖からなるオ
リゴヌクレオヂド（１０個の相捕的な塩基を含有）を合
成しアニールした。ついで、ＤＮＡシーク」−ンシング
１こついてザンプｊ−ら（上掲）により記載されたのと
同様の方法により、４個のデオキンヌクレオチドの存在
下にＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片により第二の
相浦的鎖を充填した。ついで、得られた二本鎖再断片を
適当な制限酵素で消化し、上記のようにしてｐ（ＪＣベ
クター中にクローニングしＤＮＡ配列を確認した。再断
片４１３−１〜４１３−４を、すべてに共通するＢａＩ
ＩＩＩ（ＩおよびＨｉｎｄＩＩ［制限部位を用いてｐＵ
ｃＩ８中にクローニングした。再断片Ｃ末端ｇｐ！２０
を、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａｒ制限部位を用いてｐＵＣ
８中にクローニングした。再断片４！５を、Ｃ−末端ｇ
ｐ１２０を含むプラスミド中にＢｇｌ［［制限部位にて
クローニングし、制限マツピングにより適当な方向性に
ついてスクリーニングした。すべての再断片についてプ
ラスミドＤＮＡを塩化セシウム浮上密度勾配法により調
製し、個々のＤＮＡ配列を二本鎖鋳型から直接確認した
（ハラトリ（ＩＩ　ａｔ　Ｌｏｒ　ｉ）ら、Ｎｕｃｌ、
Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、（１９８５）１３ニア８１３）。

ＰＳＧの組み立ておよびクローニング ｎ５２−１０の下流に位置する再断片を、５末端の独特
の内部制限部位および３°末端の共通のＨｉｎｄｌｌｌ
制限部位を用いて段階的にクローニングした。たとえば
、再断片４１３−１は５ａｌｒおよびＨｉｎｄＩ［Ｉ制
限部位にてＢ５２−１ｏ中にクローニングしてクローン
ＢＳ　２−１０Ａを生成させ、その中にＨｐａｌおよび
ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にて４１３−２を挿入してクロ
ーンＢ５２−１０Ｂを生成させた。同様に、それぞれ独
特のＥｃｏＲＶおよび５ｎａＢＩ制限部位を用いて再断
片４１３−３および４１３−４を付加した。クローンＢ
Ｓ　２−１０の上流に位置する２つの再断片（ｐＵＣＢ
中に一緒にクローニング）をＢａｌ１ｌｄ−ＩＩ断片と
してＢ５２１Ｏに連結した。第５図は、合成Ｈｒ　Ｖ　
−１エンベロープ遺伝子をｐＵ０１Ｂ中に組み立てるの
に使用したクローニング法を示す。最終的なりローン（
ＦＳＧと称する）を制限マツピングしてＢａｍＨＩ−Ｂ
ａｍ）冒断片の適当な方向性を確認した。

実施例２ λｐＬベクター系でのＦ’ＳＧのクローニングおよび発
現 強力なλｐＬプロモーターおよび温度感受性ｃｌ抑制遺
伝子を用いたベクター系でＰＳＧの発現分析を行った（
ベナール（［３ｅｎａｒｄ）ら、Ｇｅｎｅ（１９７９）
５：５９）。これらの分析に用いた特別、のベクターは
Ｉ）ＢＲ３２２の誘導体であり、λｐｌ、プロモーター
および合成シャインーダルガーノ配列とそれらに続いて
対象とする種々の遺伝子をクローニングするのに用いる
制限部位を含んでいる。加えて、これらのベクターは強
力な３フレーム翻訳ターミネータ−ｒｒｎＢ　Ｌ　１を
含んでいる。ベクターｐｓＤＫＲ８１６は、Ｎｃｏｌ制
限部位を含んでおり、これにより転写開始部から最適の
距離にあるＡＴＧ開始コドンが提供される。第６図は、
ＦＳＧをｐｓＤＫＲ８１６中にクローニングすることに
よるクローンｐＳＤ３０１の生成を模式的に示したもの
である。簡単に説明すると、ＦＳＧをＨｉｎｄＩＩＩお
よびＳｍａＩで消化し、該末端にＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノー断片を充填して平滑末端にし、１２０９ｂｐ
断片を精製し、ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片を
充填したＮｃｏＬ部位にてｐｓＤＫＲ８１６中に連結し
た。適合性のベクターＰＲＫ２４８上にｃｌＬｓ遺伝子
を含む大腸菌ＲＲ１細胞中に形質転換した後、適当な方
向性でＦＳＧを有するクローンを制限マツピングにより
単離し、ｐｓＤ３０１とした。ｐｓＤ３ｏｉによりコー
ドされる特別のアミノ酸配列を第７図に示す。第７図は
、すべてのリンカ−由来配列（＋）および刊行された配
列では未だ同定されていないＨＩ　Ｖ　−１エンベロー
プ内のすべてのアミノ酸置換（＊）を示している。

加えて、λｐＬプロモーターの制御下で発現性の高いＨ
ＩＶ−１ｇａｇタンパク質（アミノ酸残基番号１２１〜
４０７、ラットナー（上掲）の番号付けによる）に融合
させてＦＳＧをベクターｐＫＲＲ９５５中にクローニン
グした。ＦＳＧをＡｖａｌで消化し、該末端にＤＮＡポ
リメラーゼ■のクレノー断片を充填して平滑末端にし、
Ｉ＋９９ｈｐ断片を精製し、Ｓ　ｍａ　Ｉ制限部位にて
ｐＫＲＲ９５５中に連結してＨＩ　Ｖ　−１ｇａｇ／合
成ｅｎｖ融合タンパク質を生成した（第６図）。大腸菌
ｐＲＫ　２４８　、ｃｌｔｓ／ＲＲＩ細胞中に形質転換
した後、適当な方向性でＦＳＧを有するクローンを制限
マツピングにより単離し、９ＳＤ３０２とした。この融
合タンパク質の特別のアミノ酸配列を第７図に示す。第
７図は、すべてのリンカ−由来配列、ＨＩＶ−１ｇａｇ
配列、上記のようなＨＩ　Ｖ　−１工ンベロープ配列を
示している。　大腸菌ＰＲＫ　２４　Ｂ　、ｅｆｔｓ／
　ｎ　Ｒ１細胞中のｐｓＤ３０１およびｐｓＤ３０２の
培養液（５０１１２）をスーパーブロス■培地中で３０
℃にて０Ｄ６００が０．５となるまで増殖させ、この時
点で培養液を４２℃にシフトさせて温度感受性ｃｌリプ
レッサーを不活化し、λｐＬプロモーターから発現を誘
導させた。２つの試料（各２　、　ＯｙｔＱ）を１時間
間隔で除いた。試料の調製は以下のようであった。

細胞をベレット化し、ついでＩ　ＸＴＧバッファーかま
たはＴ５０ＥＩＯバッファー中に再懸濁した。等容量の
２ＸＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷バツフアーをこのＩＸ’ｒＧ
懸濁細胞に加えて完全溶解液を得た。ビブラセルソニケ
ーター（Ｖｉｂｒａ　Ｃｅ１ｌ　５ｏｎｉｃａｔｏｒＸ
ソニツクス・アンド・マテリアルズ（Ｓｏｎｉｃｓ　ａ
ｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、　１　ｎｃ、）、ダンベリ
ー、ＣＴ）を備えたマイクロデツプ（ｍｉｃｒｏＬｉｐ
）を用い、出力ｌＯクワットセットして、Ｔ５０Ｅ　ｌ
　Ｏ中に再懸濁した試料を各３０秒ずつ８回超音波処理
した。

ついで超音波処理した試料を遠心分離にかけて不溶性の
両分を除き、これを最初の容量の７５０Ｅ１θ中に再懸
濁した。等容量の２ＸＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷バツフアー
を超音波処理した可溶性画分および不溶性画分の両方に
加え、これを完全細胞溶解液とともに５分間沸騰させ、
遠心分離して残留するすべての不溶性物質を除き、アリ
コート（１５μＱ）を２つの１２．５％ＳＤＳ／ＰＡＧ
Ｅゲル上で分離した。上記のようにエイズ患者血清とイ
ムノブロッティングするため、そのようなゲルの一方か
らのタンパク質を電気泳動的にニトロセルロースに移し
た。第二のゲルを室温にて５０％メタノール、１０％酢
酸の溶液中に２０分間固定し、ついで５０％メタノール
、１０％酢酸の溶液中の０．２５％クマシーブルー染料
で３０分間染色した。１０％メタノール、７％酢酸の溶
液を用い、脱染色を３〜４時間、または透明なバックグ
ラウンドが得られるまで行った。

第８図は、クマシーブルー染色（第８Ａ図）およびイム
ノブロッティング（第８Ｂ図）により分析した誘導前（
ＴＯ）および誘導４時間後（Ｔ４）のｐＳＤ３０１およ
びｐｓＤ３０２の発現を示す。試料は、ＰＫｒ（Ｒ９５
５（ＴＯ完全細胞溶解液［レーンｌ］、Ｔ４完全細胞溶
解液［レーン２　］）；ｐｓ　Ｄ　３　Ｑｌ　（Ｔ　Ｏ
完全細胞溶解液［レーン３］、Ｔ４完全細胞溶解液［レ
ーン４］、Ｔ４超音波処理可溶性画分［レーン５コ、お
よびＴ４超音波処理不溶性画分［レーン６コ）；および
ｐＳＤ３０２（Ｔｏ完全細胞溶解液［レーン７］、Ｔ４
完全細胞溶解液［レーン８］、Ｔ４超音波処理可溶性画
分［レーン９］、およびＴ４超音波処理不溶性画分［レ
ーンｌＯ］）であった。

分子量標準はレーン１１で行つた。矢印は、クマシーブ
ルー染色により完全細胞溶解液および超音波処理不溶性
細胞画分の両方で明らかに視覚化された誘導タンパク質
の位置を示す（第８Ａ図）。レーン２は、ｐＫＲＲ９５
５がＨＩＶ−１ｇａｇタンパク質を全細胞タンパク質の
２５％以上のレベルで発現したことを示しており、レー
ン４は、ｐＳＤ３０１が合成ＨＩＶ−１エンベロープタ
ンパク質を全細胞タンパク質の約１２％のレベルで発現
したことを示しており、レーン８は、ｐｓＤ３０２がＨ
ＩＶ−１ｇａｇ／合成ｅｎｖ融合タンパク質を全細胞タ
ンパク質の約５％のレベルで発現したことを示している
。ＦＳＧを用いて得られた発現レベルは、同様のｐｔ、
ベクター系で対応する天然ウィルスＤＮＡ配列を用いて
得られた発現レベルよりも有為に高かった。３つのすべ
ての組換えタンパク質は、エイズ患者血清と高度に反応
性であった（第８Ｂ図）。このデータは、経膜タンパク
質の疎水性領域を含む合成ＨｒＶ−１エンベロープ遺伝
子を大腸菌内において効率よく発現させることができ、
また発現したタンパク質は高度に免疫反応性であること
を示している。

びクローニング マンデツキ（Ｍａｎｄｅｃｋｉ）の米国特許出願第８８
３．２４２号明細書（１９８６年７月８日出願、ＥＰＯ
８７１０９３５７，１）に開示されたオリゴヌクレオチ
ドでの二本鎖切断修復法を用い、全ＨＩＶ−２経膜タン
パク質（Ｔ　Ｍ　Ｐ　）を化学的に合成した。大腸菌で
の発現に最適なコドン割り当てを用い、ＨＩＶ−２ＲＯ
Ｄ単離物のエンベロープアミノ酸残基５０２〜８５８（
番号付けは玉揚のギアグーらによる）を逆翻訳した。上
記のようにして特別のヌクレオチドを残りのあいまいな
ヌクレオチドに割り当てた後、第９図）こ示すように全
長ＴＭＰ配列を生成した。この合成遺伝子を、第１０図
に示すように、断片Δ（３３５ｂｐ　Ｈ１ｎｄＩＩＩ　
−Ｎｃｏ■断片）、断片Ｂ（３０９ｂｐ　Ｎｃｏｌ　−
Ｂａａ＋ＨＩ断片、２９の疎水性アミノ酸残基を欠失さ
せである）、および断片Ｃ（３６２ｂｐ　ＢａｍＨＩ　
−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片）により示される３つの別々の再
断片として組み立てクローニングした。欠失させた２９
の疎水性アミノ酸残基を含む第四の断片を３０９ｂｐＮ
ｃｏｆ−Ｂａａ＋ＨＩ断片中にＥｃｏｌｌＶ−ＳｎａＢ
Ｉ断片としてクローニングした（第１Ｏ図）。上記のよ
うにして、この３つの主要な再断片をｐＵｃベクター中
にクローニングし、ＪＭ１０９細胞中に形質転換し、そ
の主要なヌクレオチド配列を確認した。

ついで、この断片をゲル精製し、−緒に連結して１０８
９ｂｐ（７）完全長合成ＨＩＶ−２ＴＭＰを生成した。

この１０８９ｂｐ　Ｈｉｎｄｌ［［断片をｐＵｃＢ中に
クローニングし、ｐＪ　Ｃ２Ｂとした（第１１図）。

ＨＩＶ−２ＴＭＰの７ミノ末端１０８７ミノ酸（Ｔｙｒ
５０２からＴｒｐ６０９［ギアグーら、玉揚］）をコー
ドする断片ＡをｐＵｃ１９のＨ１ｎｄＩ［Ｉ　−Ｓ　ａ
ｌ■部位にクローニングした。ｐＪＣ２２と称するクロ
ーンを制限マツピングにより同定し、その主要なヌクレ
オチド配列を確認した。プラスミドｐＪＣ２２をＨｉｎ
ｄｎｌ−Ａｓｐ７１８で消化して合成ＨＩＶ−２ＴＭＰ
遺伝子断片を含む３６１ｂ＋）断片を放出させ、これを
プラスミドｐＴＩ３２１０のＨｉｎｄｌｌｌ−Ａｓｐ７
１８部位に連結し、大腸菌ＸＬＩ細胞中に形質転換した
。プラスミドｐＴＢ２１０は、ボリング（Ｔ、Ｂｏｌｌ
ｉｎｇ）らによって出願された米国特許出願（発明の名
称「タンパク質合成のＣＫＳ法Ｊ、１９８８年３月１１
日に出願された米国特許出願第１６７．０６７号のＣＩ
Ｐ出願）明細書に開示されている。ｐＪ　Ｃ１００と称
するクローン（第１２図）を単離し、制限マツピングし
てｋｄｓＢ（ＣＫＳをコードする）とＨＩＶ−２ＴＭＰ
断片とのハイブリッド遺伝子を同定した。

実施例４ λｐＬベクター中での合成ＨＩＶ−２’ｒＭＰのクロー
ニング 全ＨＩＶ−２ＴＭＰを含む１０８９ｂｐ　Ｈｉｎｄｌ［
断片をｐＪ　０２８から単離し、ＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノー断片で充填して平滑末端を生成させ、ｐＳ　
Ｄ　３０５　（ｃｌｔｓを挿入した上記ｐＳＤＫＲ８Ｉ
６）の充填Ｎｃｏ１部位により供されるＡＴＧ開始コド
ンのすぐ後方にクローニングした。同様に、全ＨＴＶ−
２ＴＭＰを含む１０９７ｂｐ　５ａ１１−Ａｓｐ７１８
断片をｐＪ　０２８から単離し、ＤＮＡポリメラーゼ■
のクレノー断片で充填して平滑末端を生成させ、ｐＫＲ
Ｒ９５５（上記）のＳｍａ■部位にクローニングしてＨ
ＩＶ−１ｇａｇ／ＨＩＶ−２ＴＭＰ融合タンパク質を生
成させた。第１３図に示すように、λＩ）Ｌプロモータ
ーの制御下にＨＩＶ−２ＴＭＰ遺伝子を含むクローンを
ｐＳＤ３０６と称し、λｐｔ、プロモーターの制御下に
１−１１　Ｖ　−１ｇａｇｅ：融合したＨＩＶ−２ＴＭ
Ｐを含むクローンをｐｓＤ３０７と称した。ｐｓＤｓｏ
ｓを大腸菌ＣＡＧ４５６細胞（ベーカ−（Ｂ　ａｋｅｒ
）、ＰＮＡＳ（１９８４）８１　：６７７９）中へ、ｐ
ＳＤ３０７を大腸菌ｐＲＫ　２４８　、ｅｆｔｓ／ＲＲ
１細胞中へ形質転換した後、単一細胞クローンを単離し
、制限マツピングをしてＨＩＶ−２ＴＭＰ遺伝子の存在
および方向性を示した。ｐｓＤ３０６およびｐＳＤ３０
７の特別のアミノ酸配列を第１４図に示しである。第１
４図は、リンカ−由来配列、ＨＩＶ　−１ｇａｇ配列、
およびＨＩＶ−２ＴＭＰ配列を示している。合成ＨＩＶ
−２ＴＭＰ遺伝子の発現を、上記のようにして温度シフ
ト法によりこれらの培養中で誘導した。誘導の前後にお
ける培養液のアリコートを、ｔＴ　Ｔ　Ｖ　−１エンベ
ロープ遺伝子産物について記載したようにして、クマシ
ーブルー染色およびＨＩＶ−２陽性ヒト血清を用いたイ
ムノブロッティングの両方によるＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析
に供した。培養液の全細胞溶解液および超音波処理した
可溶性および不溶性画分を分析したが、それはｐｓＤ３
０ＢおよびｐｓＤ３０７構築物についてそれぞれ第１５
図および第１６図に示しである。

第１５図は、誘導前（ＴＯ）および誘導２時間後（Ｔ２
）におけるクマシーブルー染色（第１５Ａ図）およびイ
ムノブロッティング（第１５Ｂ図）により分析したｐｓ
Ｄ３０６の発現を示している。試料は、Ｔｏ全細胞溶解
液（レーン１）、ＴＯ超音波処理可溶性画分（レーン２
）：ＴＯ超音波処理不溶性画分（レーン３）、Ｔ２全細
胞溶解液（レーン４）；Ｔ２超音波処理可溶性画分（レ
ーン５）；Ｔ２超音波処理不溶性画分（レーン６）；お
よびバイオラドの前染色分子量マーカー（レーンＭ）で
あった。第１５図は、クマシーブルー染色ゲルおよびイ
ムノプロットの両方に矢印で示しであるように、ｐＳＤ
３０６がＴ２の時点で有為ｆｆｉ＋７）ＨＩＶ−２ＴＭ
Ｐを発現したことを示している。この発現タンパク質は
、これらの培養液の全細胞溶解液および超音波処理不溶
性細胞画分の両方で目で見ることができる。

同様に、第１６図は、誘導前（ＴＯ）および誘導２時間
後（Ｔ２）におけるクマシーブルー（第１６Ａ図）およ
びイムノブロッティング（第１６Ｂ図）により分析した
ｐｓＤ３０７の発現を示す。試料は、ＰＫＲＲ９５５、
Ｔ２全細胞溶解液（レーンｌ）、ｐＳＤ３０７、Ｔｏ全
細胞溶解液（レーン２）、ＴＯ超音波処理可溶性画分（
レーン３）、ＴＯ超音波処理不溶性画分（レーン４）、
Ｔ２全細胞溶解液（レーン５）、Ｔ・２超音波処理可溶
性画分（レーン６）、Ｔ２超音波処理不溶性画分（レー
ン７）；およびバイオラドの前染色分子量マーカー（レ
ーンＭ）であった。第１６図は、クマシーブルー染色ゲ
ルおよびイムノプロットの両方に矢印で示しであるよう
に、ｐｓＤ３０７がＴ２（７）時点で有為１１（７）Ｈ
ＩＶ−１ｇａｇ／ＨＩＶ−２ＴＭＰ融合タンパク質を発
現したことを示している。この融合タンパク質もまた、
これらの培養液の全細胞溶解液および超音波処理不溶性
細胞画分の両方で目で見ることができる。

ＨＩＶ−１ｇａｇ融合相手形（レーンｌ）はＨＩＶ−Ｉ
ｇａｇ／ＨＩ　Ｖ　−２ＴＭＰｌｋ合タンパク質よりも
高レベルで存在したが、ＨＩＶ−２特異的抗体に対して
低い免疫反応性を示した。

性 当該技術分野で公知の方法を用い、大腸菌中で過発現さ
れた（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）ＨＩ　Ｖ特異的タ
ンパク質を精製した。高レベルで発現されたこのタンパ
ク質は免疫原性であり、ＨＩＶ感染個体中で産生された
抗体により認識された（第８図、第１５図および第１６
図参照）。大腸菌から得られたＨＩＶ特異的タンパク質
は、ドーソン（Ｄ　ａｗｓｏｎ）らのＣＩＰ出願、米国
特許出願第０２０，２８２号明細書（１９８７年２月２
７日出願）に記載されているように幾つかのイムノアッ
セイ法に利用することができる。この親出願はＥＰＯ８
６１１６８５４，０（１９８６年１２月４日出願）であ
る。

好ましい態様において、）（ＩＶ特異的タンパク質を固
体支持体上にコーティングし、試験試料とともにインキ
エベートした。試験試料中に存在するウィルス特異的抗
体は、固体支持体上のＩ（Ｉ　Ｖタンパク質を認識し、
結合した。このＨＩ　Ｖ特異的抗体を、ＨＲＰＯに結合
させたヤギ抗ヒト免疫グロブリンを用いて定量した。

組換えＤＮＡ法により得たＨｒＶ−１ｇｐ４１やＨＩＶ
−１ｐ２４のようなＨＩＶ−１特異的タンパク質を用い
、ＣＩＰ出願第０２０．２８２号明細書に記載されたよ
うにしてＨＩＶ−１ｆｉｉ患者を検出した。しかしなが
ら、ＨＩＶ−１とＩＩＶ−２との間の交差反応性のため
、これらＩ−Ｉ　Ｅ　Ｖ　−１特異的タンパク質を用い
た場合はＨＩ　Ｖ　−２にｎ露した患者のわずかに７０
〜９０％が検出されたにとどまった。これらのＨＩ　Ｖ
　−１特異的タンパク質を用いて検出されなかったＩ（
Ｉ　Ｖ　−２暴露患者は、合成りＮＡより得られたＨ　
Ｉ　Ｖ　−２タンパク質を用いて検出した。

たとえば、Ｃ９Ｋに融合したＨＩＶ−２？ＭＰ断片（ｐ
Ｊｃｌｏｏ）を上記固体支持体上の組換え１−Ｉ　Ｉ　
Ｖ　−１タンパク質に追加したときは、下記第１表に示
すように）（ＩＶ−２抗体を含む試験試料の検出を有為
に増大させた。

皿上表 試料がＨＩＶ−２抗体の存在について陽性であることが
確認された。

さらに、上記ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２組換え７ツセイを
用いて３４１１人の正常血液提供者をスクリーニングし
た。この組換えアッセイは９９．７７％の特異性を示し
、最初に反応性の試料はわずかに８つ（０，２３％）、
繰り返し反応性の試料は４つ（０，１２％）であった。

実施例６ ＨＩＶ−１感染とＨＩＶ−２感染の識別）１１Ｖ−２？
、−暴露された患者は、ＨＩＶ−１タンパク買上にも存
在するＨＩＶ−２タンパク質上のエピトープに対して向
けられた抗体を有することがしばしばある。同様に、Ｈ
ＩＶ−１に暴露された患者は、ＨＩＶ−２タンパク質と
交差反応する抗体を有している。交差反応性のほとんど
はｇａｇ遺伝子産物と関連しているので、ｐＪＰ１００
タンパク質お上びＨ［Ｖ−１エンベロープタンパク質か
らの組換えタンパク質（ＣＩ　Ｐ出願第０２０゜２８２
号明細書に記載）を用いてＨＩＶ−１に感染した患者と
ＨＩＶ−２に感染した患者との間の識別を行った。

２つの独立した酵素結合イムノアッセイを行った。試験
１にはＨＩＶ−１組換えタンパク質を固相−ヒにコーテ
ィングして用いた。試験２にはＩ（ＴＶ−２？ＭＰ（ｐ
ＪＰ　１００）を固相上にコーティングして用いた。米
国、ポルトガルまたは西アフリカからのＨＩＶ陽性血清
個体から得た試料について、これら２つの試験を用いて
抗体を試験した。

終点力価は、正常ヒト血漿で試料を希釈し、これら希釈
液を試験することにより決定した。下記第２表から明ら
かなように、合成組換えタンパク質を用いた特異的試験
は、ＨＩＶ−１感染およびＨＩＶ−２感染を識別するの
に有効に用いることができる。

（以下余白） 第２表 本発明の方法により容易に試験することのできる生物学
的試料としては、全血、血清、血漿、尿、だ液、大便、
リンパ球もしくは細胞培養調製物などのヒトまたは動物
の体液および精製および部分精製免疫グロブリンが挙げ
られる。本明細書に記載したポリペプチドおよびその断
片は、当業者によく知られたアッセイ法によりＨＩＶ−
１およびＨＩＶ−２抗原に対する抗体の存在または不存
在を決定するため、またはＨＩ　Ｖ　−１感染とＨＩＶ
−２感染との間の識別を行うために用いることができる
。

そのようなアッセイ法には、 （ａ）本明細書中に開示したポリペプチドおよびポリペ
プチド断片で固体支持体をコーティングし、（ｂ）該コ
ーティング固体支持体を生物学的試料と接触させて抗体
−ポリペプチド複合体を生成させ、（ｃ）未結合の生物
学的試料を固体支持体から除き、（ｄ）固体支持体上の
該複合体を該抗体に対して特異的な標識免疫グロブリン
と接触させ、ついで（ｅ）該標識を検出して生物学的試
料中のＨＩ　Ｖ　−１および／またはＨＩＶ−２抗体の
存在または不存在を決定する 工程が含まれる。

第二のアッセイ法には、 （ａ）本明細書に開示したポリペプチドおよびポリペプ
チド断片で固体支持体をコーティングし、（ｂ）該コー
ティング固体支持体を生物学的試料および標識に結合さ
せた対応ポリペプチドと接触させ、 （ｃ）未結合生物学的試料および未結合標識ポリペプチ
ドを除き、ついで （ｄ）該標識を検出して生物学的試料中のＨＩＶ−１お
よび／またはＨＩＶ−２抗体の存在または不存在を決定
する 工程が含まれる。

そのようなイムノアッセイに用いる固体支持体としては
、反応トレイのウェル、試験管、ビーズ、ストリップ、
膜、フィルター、微細粒子または当業者によく知られた
他の固体支持体が挙げられる。

上記アッセイには、酵素標識、放射性同位体標識、蛍光
標識、化学発光標識およびコロイド粒子標識を用いるこ
とができる。さらに、ビオヂン／標識抗ビオチン系のよ
うなハプテン／標識抗ハプテン系を本発明のアッセイに
用いることができる。試薬としてはポリクローナル抗体
とモノクローナル抗体との両方が有用であり、固体支持
体または標識試薬としてＩｇＧおよび１ｇＭクラスのＨ
ＩＶ抗体を用いることができる。

以上の実施例から明らかなように、構築した合成遺伝子
の特別の再断片を一緒にクローニングして上記と同じ特
性を有する新規な合成遺伝子を生成させることができる
ことは明らかである。たとえば、Ｃ−末端ｇＰ１２０再
断片、Ｂ５２−１０および再断片４１３−１を一緒にク
ローニングしてエイズの診断および治療試薬として有用
な合成遺伝子産物を生成させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＩＶ−１のアミノ酸残基５５２〜６６８を
コードするＴＭＰ断片を、Ｂ５２−１０のアミノ酸配列
を得るために用いた４つの異なる単離物の配列を用いて
整列させたものを示す模式第２図は、１６オリゴヌクレ
オチドを組み立てて第１図の合成ＴＭＰ断片を生成させ
、該断片をｐＵＣ１Ｂ中にクローニングしてＢ５２−１
０を生成させることを示した模式図、 第３図は、ＦＳＧｃ）ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を
制限部位および組み立てに用いた再断片とともに示した
模式図、 第４図は、合成ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を作製す
るのに用いた【３の独立した単離物の公知アミノ酸配列
の比較を、すべてのリンカ−由来配列（＋）およびアミ
ノ酸置換（＊）とともに示した模式図、 第５図は、ｐＵｃ１８中にＦＳＧを生成するための主要
な再断片の組み立ておよびクローニングを示す模式図、 第６図は、ＦＳＧをλｐＬ発現ベクター中にクローニン
グしてｐｓｏａｏ＋およびｐｓＤ３０２を生成すること
を示した模式図、 第７図は、ｐｓＤ３０１およびｐｓＤ３０２のアミノ酸
配列をすべてのリンカ−由来配列（＋）およびアミノ酸
置換（＊）とともに示した模式図、第８図は、ｐｓＤ３
０１およびｐｓＤ３０２の発現分析の結果を示す模式図
（Ａはクマシーブルー染色ゲル、Ｂはエイズ患者血清を
用いたイムノプロット） 第９図は、全長合成Ｈｒ　Ｖ　−２ＴＭＰノＤ　ＮＡ配
列およびアミノ酸配列を、クローニングを容易にするた
めの両末端リンカ−配列を含む該遺伝子を組み立てるの
に用いた制限酵素とともに示す模式図、 第１θ図は、合成ＩＩＮ／−２ＴＭＰ遺伝子を構築する
のに用いた３つの主要な再断片を示す模式第１１図は、
全長ＨＩＶ−２ＴＭＰを生成するための主要な再断片の
組み立ておよびそれをｐｕＣ８中にクローニングしてｐ
ＪＣ２８を生成させることを示す模式図、 第１２図は、合成ＨＩＶ−２ＴＭＰ断片ＡをｐＵＣ１９
中にクローニングしてｐＪＣ２２を生成させ、これをｐ
ＴＢ２１０中にクローニングしてｐＪＣｌｏｏを生成さ
せることを示す模式図、第１３図は、合成ＨＩＶ−２Ｔ
ＭＰをλｐＬ発現ベクター中にクローニングしてｐｓＤ
３ｏｓおよびｐｓＤ３０７を生成させることを示す模式
図、第１４図は、ｐＬ構築物ｐｓＤ３０６およびｐｓＤ
３０７の一定のアミノ酸配列を、すべてのリンカ−配列
、ＨＩＶ−１ｇａｇ配列、およびＨＩＶ−２ＴＭＰ配列
とともに示す模式図、 第１５図は、大腸菌ＣＡＧ４５６細胞中でのｐＳＤ３０
６の発現分析の結果を示す模式図（Ａはクマシーブルー
染色ゲル、ＢはＨＩＶ−２陽性ヒト血清を用いたイムノ
プロット）、および第１６図は、大腸菌ｐＲＫ　２４８
　、ｃｌｔｓ／　ＲＲ１細胞中でのｐｓＤ３０７の発現
分析の結果を示す模式図（Ａはクマシーブルー染色ゲル
、ＢはＨＩＶ−２陽性ヒト血清を用いたイムノプロット
）である。 特許出願人　アボット・ラボラトリーズ化　理　人　弁
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Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記アミノ酸配列を有するポリペプチド。 【アミノ酸配列があります】
2. （２）大腸菌により製造された請求項（１）記載のポリ
   ペプチド。
3. （３）下記アミノ酸配列を有するポリペプチド。 【アミノ酸配列があります】
4. （４）大腸菌により製造された請求項（３）記載のポリ
   ペプチド。
5. （５）下記アミノ酸配列を有する請求項（３）または（
   ４）記載のポリペプチドのポリペプチド断片。 【アミノ酸配列があります】
6. （６）原核生物もしくは真核生物タンパク質に請求項（
   １）ないし（５）記載のポリペプチドが融合した融合ポ
   リペプチド。
7. （７）原核生物もしくは真核生物タンパク質が大腸菌酵
   素ＣＫＳである請求項（６）記載の融合ポリペプチド。
8. （８）下記ＤＮＡ配列を有する合成遺伝子。 【アミノ酸配列があります】
9. （９）請求項（１）記載のポリペプチドをコードする請
   求項（８）記載の合成遺伝子。
10. （１０）下記ＤＮＡ配列を有する合成遺伝子。 【遺伝子配列があります】
11. （１１）請求項（３）記載のポリペプチドをコードする
    請求項（１０）記載の合成遺伝子。
12. （１２）下記ＤＮＡ配列を有する合成遺伝子。 【遺伝子配列があります】
13. （１３）請求項（５）記載のポリペプチドをコードする
    請求項（１２）記載の合成遺伝子。
14. （１４）請求項（１）ないし（５）記載のポリペプチド
    がＨＩＶｇａｇタンパク質に融合した融合ポリペプチド
    。
15. （１５）ＨＩＶｇａｇタンパク質が、下記アミノ酸配列
    を有するＨＩＶ−１ｇａｇタンパク質である請求項（１
    ４）記載の融合ポリペプチド。 【アミノ酸配列があります】
16. （１６）個体においてＨＩＶ抗原に対する抗体を検出す
    る方法であって、 （ａ）該個体から体液試料を採取し、 （ｂ）該体液を請求項（１）、（２）、（３）、（４）
    または（５）記載のポリペプチドとともにインキュベー
    トし、 （ｃ）該体液を免疫グロブリンに対する標識抗体ととも
    にインキュベートし、ついで （ｄ）該標識を検出してＨＩＶ抗原に対する抗体の存在
    または不存在を決定する ことを特徴とする方法。
17. （１７）個体においてＨＩＶ抗原に対する抗体を検出す
    る方法であって、 （ａ）該個体から体液試料を採取し、 （ｂ）該体液を請求項（１）、（２）、（３）、（４）
    または（５）記載のポリペプチドとともにインキュベー
    トし、 （ｃ）該体液を標識抗原とともにインキュベートし、つ
    いで （ｄ）該標識を検出してＨＩＶ抗原に対する抗体の存在
    または不存在を決定する ことを特徴とする方法。