JPS60244290A - レトロウイルスのゲノムの少なくとも一部を含む、真核生物細胞中のタンパク質のクロ−ニングと発見ウイルスベクトル、このベクトルによつて感染された真核生物細胞およびこのような細胞と得られたタンパク質の利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的に、真核生物細胞中の特定の細胞のコー
ド付けＤＮＡ配列のクローニングと発現ウィルスベクト
ル、この種のベクトルによって感染された真核生物細胞
、このような細胞を利用するタンパク質の生産方法、な
らびにこの方法を実施して得られたタン／ｅり質に関す
るものである。

さらに詳しく述べるならば、本発明は、真核生物細胞中
の特定のタンパク質のコード付けＤＮＡ配列のクローニ
ングと発現ウィルスベクトルの構築に関するものであり
、この種のベクトルはレトロウィルスのゲノムの少なく
とも一部を含み、特にゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤ
ＮＡの発現パンクの製造に利用される。

下記の説明において、便宜上、レトロウィルスに関連す
るすべてのものを指すため、“ウィルス”または“レト
ロウィルス”、“ウィルスの”または′°レトロウィル
スの”と言う表現を区別なしに使用する。

今日までクローニングと発現ベクトルの構築に際しては
、主としてシラスミドおよび／またはバクテリオファー
ジから誘導された自生レゾリコンが使用されていた。

このようなレプリコンは、原核生物界の研究、ならびに
この生物界に属する微生物、主としてバクテリヤおよび
酵素について行なわれる“遺伝子操作”に関しては貴重
な満足な手°段であることが明らかである。これらのレ
プリコンは、分子生物学の最近の進歩に対して、特に今
日ではいわば“古典的”となった。興味あるめる特性を
有する供与体生物のＤＮＡの断片を宿主生物のゲノムの
中に挿入することによってゲノムを交雑する技術の確立
に大きく貢献した。

しかしこのような原核生物系における利点がどのようで
あれ、これらのレプリコンは、真核生物、特に咄乳動物
の細胞における、遺伝子の接合または複雑な調節現象な
ど、生体内または試験管内に介入する複雑な現象の研究
においては不十分である。

この観点から、ウィルスベクトルは第１級の工具である
。研究された多くのウィルスが使用可能であることが実
証された。ＳＶ４０、ポリオーム、Ｂ　ＰＶ、アデノウ
ィルス、Ｈ８■、ワクチンウィルス、レトロウィルスな
どである（　ｒｅ”ｆ　、　３６　）。

これらの各ウィルスはその生物学的特性と複製サイクル
に応じて、若干の制約を課する。即ち稲の特異性、ゲノ
ムのサイズ、全体的にまたは部分的に分校または配列さ
れるゲノム、溶菌感染、エピゾーム複製、組込みプロウ
ィルスの形の組込み（ｒｅｆ、　３７　）。

故に、特定の真核生物遺伝子のベクトル構築に利用され
るウィルス型の選択は任意ではない。

レトロウィルスは、その複製サイクルが逆転写段階を含
むすべてのウィルスを含む科を成す。そのゲノムは、Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）によって
プロウィルスＤＮＡに転写される一本鎖ＲＮＡから成り
、５０００〜９０００塩基の二本鎖ＤＮＡが感染された
宿主細胞のゲノムの中に組込まれる（　ｒｅｆ、　４５
．５３　）。

真核生物遺伝子ベクトルとしてのレトロウィルスの主た
る利点は、その特殊の生物学的サイクルから誘導される
。即ち強力なプロモータ、宿主ゲノム中にプロウィルス
の形で安定的に組込まれること、非溶萌性感染、高滴定
濃度ウィルスの生産、スピーシズパリャでないことであ
る。

この故に本発明は、真核生物細胞中の特定のタンノぞり
質のコード付けＤＮＡ配列のクローニングと発現ウィル
スベクトルにおいて、少なくとも、−レトロウィルスの
ゲノムの一部を含み、前記ゲノム部分は少なくともゾロ
モータ区域とつ′イルスゲツムの複製、プロウィルスの
形での組込み、包膜およびウィルスメツセージＲＮＡの
接合を保証する要素を含み、 −また前記ゾロモータ区域の下流に位置するユニーク制
限部位を有して、この部位に分枝される特定タンＡり質
のコード付けＤＮＡ配列がこのゾロモータ区域の制御下
におかれるようにしたウィルスベクトルに関するもので
ある。

さらに詳しく述べるならば、本発明によるウィルスベク
ターは、 少な（とも、 一第１ＬＴＲ配列と、 一接合供与体および受容体コンセンサス配列によって包
囲された“リーダ配列と、 −第２ＬＴＲ配列とを順次に含み、またこれらのＬＴＲ
配列および“リーダ配列に隣接したウィルスＤＮＡ配列
を含むレトロウィルスのゲノム部分を含むものである。

事実、感染される宿主細胞のゲノム中に合体されうるよ
うな義務的ライ化ス形状のプロウィルスは、ウィルスゲ
ノムを包囲する２つの反復配列ＬＴＲかｌ−＞成る。こ
のウィルスゲノムは、順次に配置されたウィルスの生物
学的サイクルに必要な各椎タンパク質、たとえばヴイリ
オンの構成タンノぞり質、エンペローゾの糖タン・ξり
質、酵素、のコード付は遺伝子列から成る。

ウィルスプロモータは配列ＬＴＲ５’の中に含まれ、ま
た配列ＬＴＲ５’の下流に位置する“リーダ配列が、プ
ロウィルスから成る母型から合成されるゲノムＲＮＡの
包膜を制御することは確認されている。

また２つのＬＴＲ配列は、感染後の宿主ゲノム中のプロ
ウィルスの組込み安定性を保証するととも知られている
。

ゲノムＲＮＡの複製、プロウィルスの形での組込み、お
よび包膜と１．ウィルスメツセージＲＮＡの成熟とに必
要なウィルスゲノム区域は、ＬＴＲ配列と、リーグ配列
、ならびにその隣接配列に対応するものと思われる。

本発明の好ましい実施態様によれば、ベクトルの構築に
利用されるレトロウィルスは白血病ウィルス、特にモロ
ネーのネズミウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）である。実際
に、Ｍｏ−ＭｕＬＶ　のゾロモータは、公知の真核生物
ゾロモータの最も強力なものの１つである。

本発明の他の実施態様によれば、本発明のウィルスベク
トルは２つの反復配列ＬＴＲの間に、ウィルスメツセ−
ジの糖タンパク質コード付ケ°遺伝子ｅｎｖ　と、ウィ
ルスＭｏ−ＭｕＬＶの制御部位ＰｓｔＩ　とを含む。

クローニングベクトルの構築に際して常に見られる関心
事は、対応の制限酵素のいずれかによって消化されたの
ちに単一の制限断片が得られ、分枝（ｃｌｏｎｅｒ　）
　Ｌ／ようとする遺伝子との結合ののちに、特定の遺伝
子を特定の部位に組込んだ単−型の組替ベクトルが回収
されるように、１つまたは複数のユニーク制限部位をう
ろことにある。

この故に、本発明の目的を成すベクトルは、ウィルスゲ
ノムから由来するプロモータ区域の制御のもとに、分枝
、発現および／または生産しようとする特定のタンパク
質のコード付けＤＮＡ配列を配置するため、このプロモ
ータ区域の下流に位置する少なくとも１つのユニーク制
限部位を含む。

好ましくはこのユニーク制限部位はファージＭ１３Ｍｐ
８　（Ｂｉｏｌａｂａ）　由来のＤＮＡ断片によって運
搬される。

本発明の１実施態様によれば、ベクトルは前記のほか、
バクテリヤシラスミドのＤＮＡの全部または一部を含み
、このバクテリヤプラスミドはウィルスＤＮＡを包囲す
る２配列ＬＴＲの外部に結合される。

特にプラスミドｐＢＲ３２２またはその突然変異体の１
つを使用する。このようにして本発明によるウィルスベ
クトルｐＢ６　が調製される。

これらのベクトルの有効性を、優性選択標識遺伝子：Ｔ
ＫおよびＮｅＯＲと、生理学的興味のある遺伝子：ヒト
の肝炎Ｂウィルスの遺伝子ＨＢＳとをもってテストした
。

プラスミドｐＢＲ３２２の突然変異体として、好ましく
はアンピシリン抵抗をコード付ける遺伝子中にＰｇｔＩ
制限部位を含まない突然変異体を選ぶ。

このような突然変異体の選択は同時に、ウィルスゲノム
由来の制限部位ＰｓｔＩをユニーク制限部位として保存
することができ、このようにしてこのベクトルに補助的
分枝部位を与え、またアノピシリン抵抗遺伝子は、アン
ピシリン含有培地上での培養によって組替ベクトルのみ
を“スクリーニング”する可能性を与える。このように
して、本発明によるウィルスベクトルｐＵＲｐＢ６が調
製される。

本発明の他の実施態様によれば、ベクトルはさらにファ
ージのＤＮＡの全部または一部を含み、プラスミドイン
サートを含みまたは含まないウィルスＤＮＡを包囲する
２配列ＬＴＨの外部に、前記のファージＤＮＡ断片が結
合される。

そのため、好ましくはファージλＬ　４７．１を使用す
る。このようにして本発明によるベクトルλｐ６４７が
構築される。

好ましくは、本発明によるベクトルはウィルス由来のプ
ロモータ区域の下流に位置するそのユニーク制限部位の
１つに分枝された特定タンパク質の少なくとも１つのコ
ード付けＤＮＡ配列を含む。

特にヒトの肝炎Ｂ　（Ｈ’ＢＨ）の表面抗原（ＨＢＳ）
のコード付けＤＮＡ配列の分枝を実施する。

本発明の他の目的は、ユニーク制限部位の１つに分枝さ
れた特定タンＡり質コード付けＤＮＡ配列を含み、また
は含まない本発明によるウィルスベクトルによって感染
された真核生物細胞、特に高等真核生物細胞、たとえば
哺乳類細胞にある。

最後に本発明は、本発明によるベクトルを感染された真
核生物細胞を適当培地上で培養し、生産されたタンパク
質を分離するタンパク質の製造方法に関するものである
。

好ましくは、この生産されたタノ・ξり質はヒトの肝炎
Ｂの表面抗原である。

培養培地の組成は当業者には公知である。生産されたタ
ンパク質の分離は、タンノξり質が外分泌されない場合
に細胞の破裂後に任意の方法で実施することができる。

以下本発明を図面に示す実施例について説明する。

実施例１−材料と方法 当業者に公知の技術全部を想起すれば他の材料と方法を
考えることもできるが、本発明の好ましい実施態様によ
り下記の技術を使用しよう。

特に本来の意味のレトロウィルスベクトルの構築に関連
する下記実施例の説明を分り易くするため、これらの技
術を下記に列挙する。

細胞系譜 −８，ルセツテイによって提供されたＮＩＨ−３Ｔ３（
ＮＩＨペテスダ） 長期全面培養後に自生する２重要特性：・高感染能力 ・形質転換中心の出現の欠如 によって形質転換実験に際してＤＮＡを受容するマウス
Ｎ１．Ｉ（の繊維芽細胞。この評価基漁はｌＯ〜１５継
代後には有効でなくなる。その場合、細胞はサブクロー
ニングされなければならない。　−Ｒ、アクセル（コロ
ンビア、ＮＹ）によって提供されたＬＴＫ”−（ｒｅｆ
、　２６）チミジン・キナーゼ活性の欠失したマウスの
繊維芽細胞。５０μｇ／ｉｎｌジアミノ２−６プリン（
シグマ）の選択圧のもとに培養保存。

−少女の横絞筋肉腫からマクアリスターによって分離さ
れたＲＤ　（ｒｅｆ、１）。この系譜は、ＮＩＨ−３Ｔ
３細胞（ｒｅｆ、４と５）の形質転換によって検出され
たＮ−Ｒａｇ癌遺伝子を発現する。

−〇、パーナート（セントルイス）によって提供され分
離された７８Ａ１　（ｒｅｆ　、２　）。モロネーのウ
ィルスコンプレックスによって形質転換されたラットの
繊維芽細胞。

−Ｗ　Ｄ　ＣおよびＭＡＰＩ Ｗ、Ｄ、カレー（セントルイス）によって節腫転移体か
ら分離されたヒト黒色腫の２系譜 −ＮＨＫ、ラットの腎臓の繊維芽細胞。この種の細胞は
モロネー型のマウス肉腫ウィルスによって感染されるこ
とができ、相同内圧性ウィルスを保有しない利点がある
。

−Ｍ　、バルパシド（ＭＣＩベテスダ）によって提供さ
れ、Ｓ、アーロンンン（ＮＩＨペテセダ）によって確立
されたヒト癌腫の３系譜（ｒｅｆ、３）。

結腸癌腫Ａ２２３３ 肺臓癌腫Ａ２１８２ 膀胱癌腫Ａ１６０４ これらの系譜は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の形質変換によっ
て検出された癌遺伝子Ｋ１−Ｒａ５を発現する。

これらすべての系譜は、あらかじめ補体除去゛（５６℃
で３０′）され、１０％ＳＦＶを補給され、デニルベコ
によって変性されたイーグル培地中において、３７℃、
５１　ＣＯ２−で培養される。

菌株 −ＨＢＩＯＩ、使用されるシラスミドの宿主、Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ　ＲｅｃＡ−５ｕｐＥ菌株ＬＡＩＯＩ、ファージ
λＬ４７．１とその組換え体の宿主 一塩化ルピジウム形質転換技術において使用されるＥ、
　ｃｏｌｉ　ＲｅｃＡ７５ｕｐＥのＤＨＩ菌株プラスミ
ド ｐＢＲ３２２ｆｒｅｆ、９） −ｐＭｏｖ３　（ｒｅｆ、８）、ジエニシュによって提
供されたプラスミド。ｐ　Ｂ　Ｒ３２２のＥｅｏＲＩ部
位にＭｏ　−Ｍｕ　ＬＶウィルスを組込みプロウィルス
の形で含む。

−Ｂｌｕｒ　８　（ｒｅｆ・１０）　、Ｄ、シュミット
により提供構築されたもの。ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ　
［部位におけるクローニンゲイ／サート。通常の交雑条
件ではマウスにおいて検出されないヒトの反復配列に対
応する。　。

ｐｃｐ　１０　（ｒｅｆ、１１）　Ｐ、　Ｔｉｏｌｌａ
ｉｓ提供。

１）ＢＲ３２２（７）　ＥｃｏＲＩ部位においてヒトＨ
ＢＶの完全ゲノムを含むもの。

ｐＵＲ２２２（ｒｅｆ　、　１２　）、Ｊ、Ｆｅｕｎｔ
ｅｎ　（ＩＲ８Ｃ％Ｖｉｌｌｅｊｕｉｆ　）　によって
変性されたｐＢＲ３２２誘導体。ＰａｔＩ部位も、″′
毒性”配列も有しない（ｒｅｆ、１３）。

−ｐＡＧｏ　（ｒｅｆ　、　＋５　）、Ｈ８Ｖの遺伝子
を発現。

−ＩＰＢＩ　（ｒｅｆ　、１６　）、Ｒ，Ａｘｅｌによ
って提供。

）（ＳＶの遺伝子ＴＫＯプロモータの制御のもとにＥ、
　Ｃｏ１１−のトランスポゾンＴｎ５のバクテリヤ遺伝
子を発現し、ジエネテシーヌ（Ｇ４１８　スルフアート
Ｇｉｂｃｏｌに対する抵抗力を与える。

バクテリオファージ− Ｗ、　Ａ、　Ｌｏｅｗｅｎ記述のλＬ４７．１　（ｒｅ
ｆ、３０　）レトロウィルスの生産は、培養の上澄みの
逆転写酵素活性の定量によって研究された（　ｒｅｆ、
５）。

細胞を４℃ＰＢＳで３回洗浄し、ドクターで剥離し、４
°Ｃで５’　、２０００　ｒｐｍで遠心分離し、細胞沈
殿物に対して、各２゜５ｍ１体積あたり５倍量の：５Ｍ
グアニ・ジウム　イソチオシアナート、５ｍＭクエン酸
ナトリウム、０．１Ｍβ−メルヵプトーエタメール、５
０ｍＭ　）リスｐＨ＝８．１０ｍＭのＥＤＴＡｐＨ＝８
．０．５％のサルコシル、次に１ｇの塩化セシウムを加
える。５．７Ｍ塩化セシウム、０．１ＭＥＤＴＡ　ｐＨ
＝　８のクッション上で１２時間、１０℃で３５００Ｏ
ｒｐｍ遠心分離する。０．０５　Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ
＝５．２．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．５　’Ｉｙ　Ｓ
　Ｄ　Ｓの中でＲＮＡ沈殿物を回収し、等量のフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５−２４
−１）を添加し、６０℃で５′加熱し、水中で冷却し、
再抽出し、７０％アルコールで０．１Ｍ酢酸ナトリウム
ｐＨ＝　５．２を沈殿させる。

強塩濃度（ＮａＣ１Ｏ，５Ｍ）のオリサｄＴセルローズ
カラＡ　（Ｂｉｏｓｕｌ）上でのポリＡ　ＲＮＡの特異
定着によるＫｒ１ｔｏｓｅｃｈ技術を使用する。２連続
継代が必要である。

真核生物ＤＮＡの精製（ｒｅｆ、　７　）１７５　ａｍ
２のフラスコの中で、トリプシンの作用で剥離された細
胞を４℃のＰＢＳで２回洗浄し、８ｍｌの緩衝液：１０
ｍＭ）リスｐＨ＝＝　８．１０　ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍ
Ｍ　ＮａＣ１，０，５％　ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌゾ
ロテイナーゼＫによって溶解させた。１２ｈ、３７℃で
培養、フェノール／クロロホルムで２回抽出、ＮＴＥに
対して５日間透析、７０％アルコールで０．１ＭＮａＣ
１沈殿、再蒸留水中に１γ／λの濃度で再融解。

プラスミドＤＮＡの精製 大量生産と微量調製はＢｉｒｆｏｉｍとＤｏｌｌｙの方
法で実施された（ｒｅｆ、３１）。

寒天ゲル上のＤＮＡ鴫気温気 溶離の断片が透析チューブの中に配ｔｔされ、強電圧（
１００Ｖ以上）のもとに電気溶離される。そこでＤＮＡ
は、イオン交換カラム（ホワットマン、ＤＥ５２セルロ
ーズ）上を通過させることによって精製される。

液体培地によるファージの培養とＤ　ＮＡ抽出１０ｍＭ
　トリスｐＨ＝　７．６．１０ｍＭ　Ｍギ１２の５ｍｌ
の中に、３７℃で、加′間、５．１０’フアージと５．
１０　バクテリア（６００ｎｍにおける１０Ｄは約４．
１０　バクテリヤに対応）の吸収。３７℃に予熱された
ＭＬＩｌを加える。強く攪拌しながら３７℃で１２時間
、保温する。翌日、バクテリヤ溶菌な完了するためクロ
ロホルムｌｏｍｌを添加し、残渣を除去するために１０
０００　ｒｐｍで１０′づつ２回遠心分離し、次にファ
ージを沈殿させるために４℃、１００００　ｒｐｍで１
２時間遠心分離する。２ｍｌのｉ。

ｍＭ　ＭｇＣｌ２の中に沈殿物を取り、順次密度＝１．
３；１．５および１．．７ｇ／ｌのＣＩ　Ｃｓの不連続
予形成グラジェントの頂点に配置する。１時間、３０．
００Ｏｒｐｍ　、　４℃で遠心分離する。ファージ粒子
の帯域が密度１．５の区域の中央部にマークされ、注射
針を用いて管を通して回収する。再び４℃、２４　ｈ　
、　３５０００　ｒ　ｐｍで、密度１．５ｇ／Ａ！のＣ
ｌＣｓ平衡グラジエ／トに遠心分離する。前記のように
してファージ帯域を回収する。１０ｍＭトリスｐＨ＝７
．５　、’１０　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１２に対して透析し、
−次に最終１０　ｍＭ十分量のＥＤＴＡを加える。フェ
ノール／クロロホルムで２回抽出し、再びＮＴＥに対し
て透析する。最後にＤＮＡをエタノールで沈殿させる。

ファージのＤＮＡの急速調製 前記のようにして１０８バクテリヤにｌＯ６フアージを
感染させ、ペトリ皿上の軟質ゲローゼ（０，７チパクト
アガール）の中に流し込んだ。１晩７０℃に保温する。

溶菌は完全でなければならない。５ｍｌの１０　ｍＭ　
Ｍｇ　Ｃ１２を加え、４℃で１２時間、ゲロースを通し
てファージ粒子を拡散させる。４００μｌを採取する。

ｌＯμｌの５ＤＳ１０％と、５０μｌのトリス　２Ｍ　
ｐＨ＝８．５と、５０μｌのＥＤＴＡＯ，５Ｍ　ｐＨ＝
８とを加える。７０℃で５分間加熱する。５０μｌの酢
酸カリウム５Ｍを加′、氷の中に加える。１５′間遠心
分離し、上澄み液を５℃のエタノールで沈殿させる。沈
殿物を遠心分離し、乾燥させ、適当な緩衝液中にＤＮＡ
を再溶解させる。

４２℃で２′間の熱衝撃によるＣａＣｌ２５０ｍＭ法を
使用する（スーパコイルプラスミドのｎｇ当り１０３コ
ロニーの効率）。

バクテリヤＤＨＩの形質転換：塩化ルビジウム法（ｒｅ
ｆ、３３および３４） 細胞ＤＨＩの新しい予培養体から３００　ｍｌの培地Ｓ
ＯＢ：２％バクトリプトン、０．５％酵素抽出物、１０
　ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１２，１０ｍＭ
　ＭｇＳＯ４，２，５ｍＭ　ＫＣＩに接種し、３７℃−
（−０Ｄ’＝　０．５０まで保温する。次にこれらの細
胞を水中で冷却し、５′間、４℃、５０００　ｒｐｍで
ペレット化し、緩衝液Ｔ　Ｆ、　Ｂ　：　ｌＯｍＭ（７
）Ｋ　−Ｍ　Ｅ　Ｓ、ｐＨ＝６．２．１００ｍＭのＲｂ
Ｃ１，４５ｍＭのＭｎ　Ｃｌ　２．１０ｍＭのＣａＣｌ
２．３’　ｍＭのＣｏ　Ｃｌ　２の中に初体積の約１を
懸濁させ、１５′間、４℃で氷上に置き、再びペレット
化し、再び初体積の約１／１２．５を懸濁させる。３．
５チまでの十分量のＤＭＳＯを加え、５′間、４℃に保
温する。７５ｍＭまでの十分量のＤＴＵを加え、ｌＯ′
間、４℃に保温する。最終７チに十分量のＤＭＳＯ用量
を加え、５′間、４℃に保温する。２１０μｌのアルコ
ートに対して、結合ＤＮＡ（＜１０μｌ）を加え、Ｉ′
間、４℃に保温し、９０′間、４２℃で熱ショックを加
え、水中に２′間冷却する。８００μｌのＳＯＣ（２０
ｍＭのグルコースを添加された培地５ＯＢ）を加え、１
時間、３７℃に保温する。ＳＯＢの必要量の中に希釈し
、ペトリ皿軟質寒天、即ち特定の抗性物質（アニビチリ
ン０．１　ｍｇ　／ｉｎｌ　、テトラサイクリン０．０
７５ｍｇ／ｌ）を含有するバクトアガール１．２％の上
に展張。

バクテリオファージλの試験管中包膜抽出物（ｒｅｆ、
３５） ゲノムの相異なる部分においてアンバー突然変異を有す
るファージについて２溶原醒株を使用する。

ｒｅｄ−Ｅａｍ　Ｓａｍファージに対する溶源菌ＢＨＢ
２６８８　ＲｅｃＡ−１ｒｅｄ−Ｄａｍ　Ｓａｍファー
ジに対する溶源菌Ｂ　ＨＢ　２６９０　ＲｅｃＡ−０各
歯株を予め、溶原性とＲｅｃＡ−特性とについてテスト
した（ＵＶ感度により）。

ＩＪゼー）ＦＴＬ（凍結融解溶菌液）菌株ＢＨＢ　２６
８８゜ 前日の予培養から、５００ｍ１のＭＬをもって０．１の
ＯＤまで接種し、ｏｍが０．３に達するまで３０’Ｃに
保温した。４５℃で誘導を実施し、２時間、３７℃の保
温を続ける。１００００　ｒｐｍ　、　１０’、４℃で
遠心分離し、３ｍｌの５０　ｍＭ　トリスｐＨ＝８．１
０％スクロースの中に沈殿物を懸濁させ次に１５０１の
２ｍｇ／ｒｎｌのリゾチーム、０．２５ＭのトリスｐＨ
＝８の中に懸濁させた。ただちに液体窒素中に浸漬し、
次に氷の中に溶解させる。１５０ノの包膜緩衝液を加え
、混合し、３５０００　ｒ　ｐｍ、　１時間、４℃で遠
心分離し、上澄液を７０トコートに分配し液体窒素中で
凍結させる。

一すゼートＳＥ（ソニケータ破壊抽出物）菌株Ｂ　ＨＢ
　２６９０゜ リゼートＦＴＥについてと同様に初期処理を成す。細胞
沈殿物を、３ｍｌの緩衝液＝２０ｍＭトリスｐ　Ｈ＝　
８．１　ｍＭ　ＥＤＴＡｌ　５ｍＭβ−メルカプトエタ
ノール中に溶解する。粘度が顕著に減少するまで、水中
で、５“の短周期でンニヶータ破壊を実施する。１０，
０００　ｒｐｍＸ１０’、４℃で遠心分離し、３　ｍｌ
の上澄液を回収り、、３ｍｌ　の包膜緩衝液を加え、液
体窒素中においてアリコートに凍結する（包膜緩衝液：
　６　ｍＭ　）リスｐＨ＝８．２Ｍ　トリスｐＨ＝８に
よって中和された５０ｍＭスペルミジン、５０ｍＭプト
レッシン、２０ｍｍＭｇ　Ｃｌ　２、ＬＭ　ＮａＯＨで
中和された３０　ｍＭ　ＡＴＰ　％３０ｍＭβ−トルカ
シトエタノール）。

−試験管中の包膜。

リゼートＳ　ＦＪｌ、５体積に対して１体積のリゼート
ＦＴＬを水中に溶解させ、０．２γ／λまで濃縮された
結合ＤＮＡを１０ｍＭトリスｐＨ＝８の中に加えて混合
し、１時間保温し、ｌｏｍＭ　ト＋）スｐＨ＝７．５．
１０　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃｌ　２の中に溶解し、クロロホル
ムを滴下し、（９）′遠心分離によって残留物を除去す
る。

グラハムとバンデルエルブによって採用されたＤＮＡと
リン酸カルシウムとの共沈技術−染色体ＤＮＡの感染、
ＮＩＨ−３Ｔ３　８Ｒ上の形質転換中心の誘導。

解氷されたばかりの細胞ＮＩＩ（−３Ｔ３　２回１づつ
継代培養し、次に直径６０ｍｍのペトリ皿当り７００　
、０００細胞の割合で接種した。無菌カーン管の中で下
記を混合する。５００μｌの感染緩衝液２　Ｘ　（０，
２８Ｍ　ＮａＣ１、０，０５ＭのＨｅｐｅｉ緩衝液、１
　、５ｍＭのＮ　ａ　２ＨＰ　Ｏ４、ｐＨは正確に７．
０４に調整される。緩衝液のｐＨはその効率の基本的要
素である）、クロロホルム４０μｇで無菌化された染色
体ＤＮＡ、最終１ｍｌと成す十分量の蒸留水、最終１２
５　ｍＭと成すに十分量の２Ｍ　ＣａＣｌ２゜常温で（
イ）分間沈殿させ、新しい培地と共に、予め洗浄された
細胞の上に流し込み、常温にに分間放置したのち、培地
を添加する。翌朝、１５％のグリセロールを含有する培
地と共に４’ＯＯ間細胞を保温することによってグリセ
ロールショックを与える。十分に洗浄する。翌朝、細胞
の５０チが死滅している。細胞の■を継代培養する。

培地を３日ごとに更新する。形質交換中心が細胞７８Ａ
１のＤＮＡと共に（これは感染の証拠となる）５〜７日
後に現われる。このＤＮＡは、感染された細胞の近傍ま
で伝播することのできる肉腫発生ウィルスを含有してい
るからであり、またこのＤＮＡは使用された感染緩衝液
の有効性をテストするのに役立つ（ＤＮＡ２０γ当り４
〜６中心）。

非ウィルス性癌遺伝子を発現する細胞のＤＮＡの場合に
は、形質転換中心は２〜３週間後に現われる。

一プラスミドの感染。

細胞を感染培地と共に４時間保温することで十分であり
グリセロールショックを省略できること以外は、技術は
同様である。不活性゛′キャリア”ＤＮＡをもって（９
）γまで補完されたスーＡコイルプラスミドｌｏｎｇ〜
ｌＯγを使用する（このＤＮＡはＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　
１０１　の染色体ＤＮＡであって、これはまた感染実験
における負の対照として役立つ）。

優性標識を発現する感染細胞の選択 感染の４８時間後に下記の薬剤を添加する。

−ゼネチシンｍｌ当りＮｅ０Ｒ４００γ、次にコロニー
が識別され次第（５〜７日）２００γ／ｍｌ（水中１０
０Ｘ調製）。

ＴＫ培地ＨＡＴ　：ヒポキサンチン１５１１ｇ／ｍｌ。

アミノプテリン１μｇ　／ｍｌ） ケミジン５μｇ／ｍｌ （０、０３Ｍ　ＮａＯＨ中に１００Ｘ調製）。

感染後にコロニーを個々に移植しようとする場合には、
ペトリ皿当り５〜１０コロニ一以上現われないような条
件にならなければならない。たとえば、遺伝子ＴＫを有
するプラスミドｌｏｎｇを、遺伝子Ｎｅｏ　を有するプ
ラスミド１，２μｇに対して感染させる。

細胞ＮＩＨ−３Ｔ３上の形質転換中心の分離ガラスシリ
ンダの中で、トリプシン滴によって細胞を解離させる方
法を用いる。

Ｎｅｏ　細胞とＴＫ　細胞のコロニーの分離トリプシン
滴を塗布した白金耳によって実施する。

断片転移による　Ｐの標識（ｒｅｆ、２１）沈殿性ＴＣ
Ａアリコート分画について見積られた２〜５．１０　ｃ
ｐｍ／μｇの特異活性が得られる。

サザン法によるＤＮＡの転移および交雑ｒ　ｅ　ｆ　（
２２１選択された制限酵素によって切断されたＤＮＡサ
ンプルにスクロースとブロモフェノールブルーを添加し
、０．８チ寒天ゲル上に置いた。次に１晩、このサンプ
ルに対して４０　ｍＡの電気泳動を加えた。ゲルを５′
間、水中に通し、１５′間０．５Ｍ）（ＣＩ　）中に通
し、１５′間水中に通し、１５′間０．５ＭＮａＯＨの
中に通し、３　Ｍ　ＮａＣ１０，５Ｍ　）リスＩ）Ｔ（
＝　Ｂの中に順次に３回通して中和させた。

ニトロセルローズ上に転移させ、次にかん水し、ぺ−）
ξを８０℃で２時間焼（。

１２時間、２５０μｌ／ａｍ２の下記の緩衝液を用いて
４２℃で予備交雑する： ５ＳＳ０１５デンハルト、ホルムアルデヒド５０チ、５
０ｍＭ緩衝液、リン酸塩、ｐＨ＝６．５超音波変性され
た２５０μｇ／ｍｌのＤＮＡ０次に、４体積の予備交雑
緩衝液と、１体積の５゜チ硫酸デキストランと、ｌ１０
６ｃｐ／緩衝液ｍｌの熱変性された放射性ゾンデとを含
む緩衝液１００μｌ／ｃ　ｍをもって、１２ｈ、４２℃
で交雑を実施した。

２ＳＳＣ，Ｑ、１％ＳＤＳを用いて５′づつ４回、０、
ｌ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳを用いて５０℃で１５’間づ
つ２回、洗浄した。

乾燥し、−７０℃で２枚の強化スクリーン間において、
コダックＸＯＭａｔフィルム上にオートラジオダラムを
とった。

ＲＮＡの転移と交雑 ＤＭＳＯ５０％、１Ｍグリオキサル（イオン交換樹脂Ａ
Ｇ　５０１Ｘ８　（０）　Ｂｉｏｒａｄ上でその場で脱
イオンされたもの）、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ＝
７．２から成る溶液の中で、５〜１０μｇのホリＡ＋Ｒ
Ｎ　Ａを変性した。５０°ＣでＩ′間間熱熱、次に、ｔ
ｏ　ｍＭ緩衝液ｐＨ＝　７．２の中で１．２５％寒天ゲ
ルを通して、５０ｍＡで５時間電気泳動させた。

ゲルを転移前に処理しなかったこと以外は、転移技術は
前記のものと同様である。交雑事実も同様である。

インシテユ交雑（溶菌部位とバクテリヤコロニー） 冷たいベトリ皿の上に、ニトロセルローズフィルタを置
き、５〜ｌＯ分放置する。次に、各操作後にランプで乾
燥させながら順次に下記の緩衝液滴の上に置いた。

加分間、常温で乾燥させ、２時間８０℃で焼き、２００
　ｍｌの６ＳＳＣ，２デンハートの中で１２時間、６８
°Ｃで予備交雑し、フィルタ当り１．５ｍｌの２ＳＳＣ
と、エデンハートと、０．５％ＳＤＳと、２ｍＭＥＤＴ
Ａ　と、　２５ｍＭ　ＮａＰＨ０４ｐＨ−７，２と、ａ
ｏｏ、ｏｏｏ　ｅｐｍの放射性ゾンデとの中で１２時間
、６８℃で交雑した。１デンハート、２ＳＳＣ，０゜１
チＳＤＳの中で、４回、４５′づつ、６８℃で洗浄した
。次に５０％ホルムアミド、２ＳＳＣ，０，５％ＳＤＳ
の中で１時間常温で洗浄した。最後に２ＳＳＣＯ中で３
回急速洗浄を実施する。

実施例１１−出発ウイルス：モロネーのネズミ白Ｍｏ　
−Ｍｕ　ＬＶ　ウィルスはそのプロウィルスの形で記述
される。

実際にこのウィルスが宿主細胞の中に進入したのちに、
ヴイリオンの１本鎖ＲＮＡが、このヴイリオンに組合わ
された逆転写酵素に上って、プロウィルスを構成する２
本鎖ＤＮＡに複写される（ｒｅｆ、４６．４７）。

プロウィルス（第１図）′はウィルスゲノムを包囲する
２反復配列ＬＴＲから成る。このウィルスゲノムはそれ
ぞれｇｈｇｚ　ｐＯ’　およびｅｎｖ　と名付られた３
個の遺伝子によって構成され、これらの遺伝子はそれぞ
れ、ヴイリオンの構成蛋白質、逆転写酵素およびエンベ
ロープの糖蛋白質のそれぞれのコードである。

ＬＴＲ配列（ロングターミナル　リピートまたは反復末
端配列）そのものは並置された３要素Ｕ３、ＲおよびＵ
５に分解される。これらの配列は、リボ核酸の転写に必
要なすべての信号を備え、宿主細胞の遺伝子ＤＮＡの中
にベクトルの組込みを可能にする。

このようなプロウィルスが宿主細胞のゲノムの中に組込
まれ、末端５′のＬＴＲ配列中に含まれるウィルスゾロ
モータの制御のもとにゲノムＲＮＡとサブゲノムＲＮＡ
　（ｍＲＮＡ）の合成の鋳型として役立つ。

これらのＲＮＡは“キャップ”を有しノリアデニル酸を
結合されている（ｒｅｆ、５５．５６）。

次にゲノムＲＮＡは、ウィルスＲＮＡにないＬＴＲ５’
下流の短い゛°リーダ配列の制御のもとに包膜される。

接合供与体（ｄｏｎ）−受容体（ａｃｃ）コンセンサス
配列により、ウィルスのメツセージＲＮＡの成熟が可能
となる（第１図）。

Ｎ　リーダ配列ならびに２つの反復配列ＬＴＲは、ウィ
ルスゲノムの複製、プロウィルスの形の組込みおよび包
膜にとって欠くことのできない要素を成している。

プロウィルスの合成プロセスに関しては、ジルボアとコ
フィンによって提案されたモデルを参照されたい（ｒｅ
ｆ、４８．４９）。

Ｍｏ−ＭｕＬＶ　ウィルスによる宿主細胞の感染の１日
〜２日後、定常状態が達成され、細胞が分裂しつづける
。その合成ポテンシャルの１〜２％がウィルスのために
使用される。レトロウィルスの複製サイクルは溶菌サイ
クルでなく、ヴイリオンは原形質膜の発芽によって連続
的に生産される。

ここで問題となるウィルスベクトルは、ジエニッシュに
よってｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に分枝された組込
みプロウィルスの形のモロネーウイルス（Ｍｏ　−Ｍｕ
　ＬＶ）からｇａｇ遺伝子とｐｏｌ遺伝子のコード付は
配列を完全に欠失することによって構築される。このベ
クトルは、ウィルスＲＮＡの接合、ウィルスゲノムＲＮ
Ａのプロウィルスの形での包膜、複製および組込みに必
要なすべての構造を保持している。

このウィルスベクトルの構造は第２図に図示されている
。

実施例■に述べたようなプロウィルスの形のＭｏ−Ｍｕ
ＬＶウィルスをｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に組込ま
れたシラスミドｐＭＯＶ３が制限酵素Ｂｇｌ■とＨｉｎ
ｄｌとによって消化される。

２断片、即ち２　、４　Ｋｂの断片Ｂｇｌ　ｌ　Ｂｇ、
ｌ−［と、４、ＯＫｂの断片Ｂｇｌ　Ｍ　Ｈ，ｉｎｄ　
Ｉとが分離され、遺伝子ｇａｇ　とｐｏｌ　は欠失され
る。

断片Ｂｇｌ　ＩＩＢｇｌ　［はＬＴＲ５’配列を含み、
ｐ　Ｂ　Ｒ３２２のＢａｍＨ１部位においてサブクロー
ニングされて、クロンＢ２を形成する。このクロンＢ２
から１．２Ｋｂの断片ＥｃｏＲＩ　Ｐｓｉ　ｌ　を分離
する。この断片がＰＢＲ３２２の部位ＥｃｏＲｉＢａｍ
ＨＩにサブクローニングされ、ファージＭ１３Ｍｐ　８
　（Ｂｉｏｌａｂｓ　）のスーパコイル形から分離され
た短い配列を付加される。このようにしてクロンＢ　２
　Ｍ　１３を作る。この−配列は１６のヌクレオチドか
ら成り、制限酵素部位Ｐａｔ　ｌ、Ｓａｌ　ｌおよびＢ
　ａ　ｍ　ＨＩを含む。この配列は、クローニング部位
として役立つ部位ＢａｍＨＩと５ａ４Ｉを有することと
、構造中にウィルスＭｏ−ＭｕＬＶ部位Ｐａｔ■（位置
５７０）を保存し、これが接合受容体配列の中に含まれ
る利点とを有する。

４、ＯＫｂの断片Ｂｇｌｌｌ　Ｈｉｎｄｕは、配列ＬＴ
Ｒ３′と、遺伝子ｅｎｖ　とを含む。この断片がｐＢＲ
３３２のＢａｍＨＩ　Ｈｉｎｄｌ　部位にサブクローニ
ングされてクローンＣ１を形成する。

最後に、Ｂ２Ｍ１３から断片ＥｃｏＲＩ　Ｓａｌ　ｉを
分離する。予めＳａｌ　１部位とＢｉｎｄ１部位を除去
されたｐＢＲ３２２（プラスミドｐＢｓ）の部位Ｅｃｏ
ＲＩＨｉｎｄ　ｌに対してこれら２つの断片を連結する
。

このようにしてプラスミドｐＢ６　が得られる。

ウィルスプロモータ（ＬＴＲ）の下流に６００ヌクレオ
チドが付加され、部位Ｐｓｔ（と５ａｉｌを短い配列を
成し、部位５ａｌｉのみがｐＢ６の中でユニークであっ
てクローニング部位として役立つ。故に、分枝された遺
伝子がウィルス遺伝子ｇａｇとｐｏｌの代替となる。

このベクトルの理論最大容量は６．７Ｋｂである。

実施例■−レトロウィルスベクトルに依存する優性選択
標識遺伝子、即ちＴＫとＮｅｏｒをもつウィルスベクト
ルｐＢ６の効果をテストする。遺伝子ＴＫ（チミジンキ
ナーゼ）はチミジンの不存在において細胞ＴＫ−を増殖
させることができ、遺伝子Ｎｅｏｒ（ホスホトランスフ
ェラーゼ）はゼネティシン（抗生物質Ｇ４１８　Ｇｉｂ
ｃｏ）の存在において細胞を生長させることができる。

故に、ウィルス遺伝子ｇａｇとｐｏｌの代わりに、これ
らの遺伝子ＴＫとＮｅｏｒのコード付は配列をウィルス
プロモータ（第３図）に依存させる。

そのため、 一固有のゾロモータを含ますＨ８Ｖの遺伝子ＴＫＯコー
ド付は部分を含むプラスミドｐＡＧｏの断片Ｂｇｌ　］
ｌ　ＢａｍＨｌ　（２，３Ｋｂ）と、−遺伝子ＴＫの固
有プロモータを含まず遺伝子Ｎｅｏｒのコード付は部分
を含むプラスミドＩＰＢＩの断片Ｂｇｌ　１１　Ｂａｍ
ＨＩ　（１，２Ｋｂ）とを使用する。

これらの各断片はクリーノフ酵素によって準備され、同
じくクリーノフ酵素によって予め処理されたプラスミド
ｐＢ６　の部位５ａｌＩに挿入される。

遺伝子の配向は、制限酵素のダイヤグラムの分析によっ
て決定される。

ｐＢ６　ＴＫ＋とｐＢ６Ｎｅｏ　においては、Ｍｏ−Ｍ
ｕＬＶと、ＴＫまたはＮｅｏｒコード付は配列との自然
転写方向が同一であり、これに対してｐＢ６ＴＫ−とｐ
Ｂ６　Ｎｅｏ−においては、この転写方向が逆である。

ウィルスベクトルに依存する遺伝子ＴＫの発現は、細胞
ＬＴ’に−（チミジン　キナーゼ活性を欠失）を感染さ
せ、次に遺伝子ＴＫＯ活性産物を生産する細胞を培地Ｈ
ＡＴにおいて選択す不ことによって分析される。

遺伝子Ｎｅｏｒの発現は、ＮＩＨ−３Ｔ３上において抗
生物質０４１８によって選択することによって分析され
る。

ｐＢ６　ＴＫ　またはｐＢ６　Ｎｅｏ　による感染後に
、薬剤に対する抵抗性コロニーが現われる（表１）。こ
れに反して、ｐＢ６　ＴＫ−またはｐＢ６Ｎｅｏ−を細
胞に感染させたのちには、コロニーが現われない。これ
は遺伝子ＴＫまたはＮｅｏｒがＭｏ−ＭｕＬＶのウィル
スプロモータの作用でよく発現されることを示している
。

表１ ヒトの肝炎Ｂのウィルδ（ＨＢｖ）は広く世界中に伝播
された３１００ｐｂの円形二重螺旋ＤＮＡウィルスであ
る。このウィルスは現実の公衆衛生上の問題を生じてい
る。。特に潜行性慢性肝炎および肝臓の初期価の傾向の
強い第３世界において深刻な問題を提起している。

感染された肝臓細胞は、２２ｎｍ直径のからのウィルス
エンベロープ（ＤＮＡを含有せず）を過剰に合成する。

慢性保菌者の血しよう中に存在するこの粒子がワクチン
ソースとして使用される。これは糖たんばく脂質複合体
であって、その抗原因子（ＨＢＳ）は遺伝子Ｓの生産物
によって保持される。肝炎Ｂのウィルスの区域Ｓは２部
分に分けられる。即ち本来の意味の遺伝子Ｓ（ヌクレオ
チド１５５〜８８３）と、これに先行する理論的には１
６３アミン化酸とコード付けされるプレＳ配列（ヌクレ
オチド２８４８〜１５７）とである。

２つの構築型が実施される（第４図）。

まず、遺伝子プレＳおよびＳのコード配列に対応するＨ
ＢＶ（７）Ｂｇｌｌｌ　Ｂｇｌ　１１断片をＭｏ−Ｍｕ
ＬＶのウィルスプロモータ（ＬＴＲ）の制御下に置く。

この断片をクローンＢ２Ｍ１３の部位ＢａｍＨＩにおい
て分枝する。Ｂ２Ｍ１３　Ｓ　においては、ＭＯ−Ｍｕ
ＬＶとプレＳ配列およびＳ配列の自然転写方向は同一で
ある。Ｂ２Ｍ１３　Ｓ−においては、この転写方向は逆
である。

第２型の構築においては、ＨＢｖの前記と同じ断片Ｂｇ
ｌ［ＢｇｌｌｌがウィルスベクトルｐＢ６の部位５ａｌ
Ｉに分枝される。

次に分枝されたＨＢＶ遺伝子の発現を研究する。

そのため、細胞ＬＴＫ−に、ｌＯｎｇのプラスミドｐＡ
Ｇｏと、２〜５γの組替えウィルスベクトル：Ｂ２Ｍ１
３　Ｓ＋、Ｂ２Ｍ１３　Ｓ−およびｐＢ６　Ｉ（ＢＳと
を同時感染させる。

７〜１０日後に現われたコロニーを２１日日間別個に移
殖し、大量生産する。培養上ｄ液中の粒子ＨＢＳの検出
はＲＩＡ　（アボット）によって実施され、ＨＢＳ粒子
は亀子顕微鏡においては、直径２２ｎｍの球形または卵
形粒子として観察される。

ＲＩＡ検出限度を２０　ｎ　ｇ　／柘ｌと仮定して、培
養上澄液の限界希釈により生産性を定量的に評価する。

得られた結果を表２に集める。このようにして、安定的
に多量の抗原Ｉ（ＢＳを発現する細胞系統が確立させた
。

表２ ルの構築 バクテリオファージλＬ４７．１の中に、先に述べたレ
トロウィルスベクトルを分枝する。バクテリオファージ
λＬ４７．１はラムドイドファージであって、大きな挿
入容量を有しく　２４．１　ｘｂ）、最小容量は８．６
　Ｋｂである。ウィルスベクトルは６．４Ｋｂ　シがな
いので、これに十分寸法のインサートを付加する必要が
ある。

ゲノム発現ベクトルλｐ６４７の構築を第５図に示す。

ｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲ４と旧ｎｄｌとによっ
て消化する。次に、Ｅ、ｃｏｌｉ　ポリトラーゼ（クリ
ーノフ酵素）と、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼとの作用により
、プラスミドｐＢＢをうろことができ、故にこのシラス
ミドは、ｐＢＲ３２２の部位ＥｃｏＲ（とＨｉｎｄｌと
を除去された形に対応している。

次に実施例■に述べられたように、Ｂ２Ｍ１３から断片
ＥｃｏＲＪ　ＢａｍＨＪを分離し、ＣＩから断片Ｅｃｏ
ＲＩ　５ａｌＩ　を分離する。これらの２断片をｐＢＥ
の部位ＢａｍＨＩと５ａｌ）に連結する。このようにし
てプラスミドｐＢλ６が得られる。

このプラスミドｐＢλ６　をＥｃｏＲＩ　（長さ１ｏ６
６Ｋｂ）の作用で線形化し、バクテリオファージλ４７
・１の中に置換する。

そのため７アージλＬ４７．１　を予めＥｃｏＲＩによ
って消化する。ファージのアームを分離し、断片Ｅｅｏ
Ｒ（ＥｃｏＲＩ　を除去する。プラスミドｐＢλ６　も
同じ（線形化し、ファージλＬ４７．１のアームと結合
する。この結合は、２個のプラスミドｐＢλ６の並列組
込みを最大限に防止するため、大余分量のファージアー
ムの存在において実施される。

試験管中で包膜したのち、下記の３段階で組替ファージ
λＰ６４７の分析が実施される。Ｍｏ−ＭｕＬＶの遺伝
子ｅｎｖ　の特異ゾンデによるインシテユ交雑、との組
替ファージがバクテリヤＲｅｅＡ７（）ＩＢＩＯＩ）上
に伝播不能性、制限マツピングの分析。

このようにして、真核生物ゲノム発現・９ンクの構築に
使用されうるレトロウィルスベクトルが構築される。ゲ
ノムバンクは、構築のＢａｍＨＩ部位において、ＰＢＥ
の複合インサートおよびＭｏ−ＭｕＬＶの遺伝子ｅｎｖ
の一部の代わりに、酵素Ｍｔｉｏｉまたは５ａｖ３Ａに
よってゲノムＤＮＡを部分消化することによって実施さ
れる。理論的最大容量は１７．ＩＫｂ　である。

プラスミドレトロウィルスベクトルの構築は次のように
実施される。

プラスミドｐ　ＵＲ２２２を予め５ａｌｉによって消化
する。

実施倒置に記載のようなプラスミドｐＢ６を同じ（Ｅｃ
ｏＲｉによって加水分解し、次に非常に慎重にＰｓｔ（
によって加水分解する。これによって５．２Ｋｂの断片
を分離することができる。この断片に対してＴ４ポリメ
ラーゼの作用を加えたのち、ｐＵＲ２２２の５ａｌｉ部
位にサブクローニングする。

このようにしてウィルスベクトルｐＢ６から誘導された
プラスミドｐＵＲｐＢ６　（第６図）が作られる。これ
は次の２点において異なっている。

ｅＤＮＡのクローニング部位として役立つユニークＰｓ
ｔｉ部位が位置５７０に存在すること、ｐＢＲ’３２２
の゛′毒性配列”の不存在。

ｃＤＮＡの発現パンクの構築は下記の２つの方法で実施
することができる。

−Ｐ　ｓ　ｔ　Ｔ部位においてｄＣ−ｄＧ”ティリング
することによってパンクを構築する方法。

５ａ１１部位において、箋リンカ’５ａｌｔを順次付加
することによってノ々ンクを構築する方法。

実施例■ 二色ソシと嘔！！ ベクトルｐＢ７は４クトル、Ｂ６からっ（られる。

、Ｂ６から断片Ｓａ目−１３ａｍＨＩをとる。この断片
は部位ＢａｍＨＩ　の上流に位置するｅｎＶ遺伝子の部
分５′とレトロウィルス遺伝子の内部の部位Ｓａｌ　ｌ
に挿入されたシラスミド−１３２２から誘導される短い
配列を有する。

この断片を取除かれたベクトル、Ｂ６はついで配列覧リ
ンカ−’　Ｓａ　ｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　と再連結され
てベクトル、Ｂ７を与える。

この構築は第７図に図示されている。

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ｅｒ、　Ｄ、及び５ａｅｎｉｓｃｈ＋　Ｒ，（１９８０
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ｅ２．９５１１．３゜１０、Ｒｕｂｉｎ、Ｃ，Ｈ，（１
９８０）、Ｎａｔｕｒｅ　８８Ｌ３７２−３７４゜ １１、　Ｇａ１ｉｂｅｒｔ、　Ｆ、他（１９７９）　、
Ｎａｔｕｒｅ　２８Ｌ６４６−６５０゜ １２、　Ｍｕｔｔｅｒ、　Ｈａｌｌ他（１９８１）、Ｎ
ｕｃ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。

９．４０８７−４０９８゜ １３、　Ｌｕ５ｋｙ＋　Ｍ、、及びＢｏｔｃｈａｍ、　
Ｍ、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２９３．　７９−８１ １４、Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，Ｃ，及びＢｅｒｇ、Ｐ、
（１９８１）。

ＰＮＡＳ　７８，２０７２−２０７６゜１５、　Ｇａｒ
ａｐｔｎ他（１９７６）　、　ＰＮＡＳ−ひ−、　３７
５７゜１６、　Ｒｏｔｈａｔｅｉｎ他（１９８０）　、
　Ｃｅ　ｌ　ｌ−リー、　７９５−８０５゜１９、　Ｇ
ｒａｈａｍ及びＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｒｂ　（１９７３）
。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２＋　４５６゜ ２０、Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｒｂ　（１
９７３）−Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５４＋　５３６−５３９
゜２１、　Ｒｉｇｂｙ他（１９７７）、Ｊ、Ｍ、Ｂ、　
１１３．２３７−２５１゜２２．５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｍ
−Ｅ、　（１９７５）　、Ｊ、Ｍ、Ｂ、９８＋５０３−
５０７゜ ２６、　Ｋｉｔｓ他（１９６３）、　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１
ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３Ｌ２９１−３１２゜ ２７．　Ｇ１１ｓｉｎ他（１９７４）、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　１３＋２６３３゜ ２８、　Ｕｌｒｉｃｈ他（１９７７）　、　５ｃｉｅｎ
ｃｅｓ　１９６．１３１３゜２９、　Ｋｒ１ｔｏｓｅｃ
ｈ＋　Ａ、＋　Ｃｏｕｔｍｏｎ＋　Ｍ、Ｌ、及びＫａｂ
ａｊ、Ｄ、（１９７５）、Ｊ、Ｂ、Ｃ，２５０，６０７
７゜３０、　Ｌｏｅｎｅｎ＋　Ｗ、Ａ、他（１９８０）
、　Ｇｅｎｅ　１０゜２４９−２５９゜ ３１、　Ｂｉｒｂｏｉｍ及びＤｏｌｌｙ　（１９７９）
、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌ　１５１
３゜ ３２、　Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ、及びＨｉｇａ、Ａ、（１９
７０）。

Ｊ、Ｍ、Ｂ、５３，１５４゜ ３３、Ｋｕａｈｎｅｒ＋　Ｓ、Ｒ，（１９７８）ｇｅｎ
ｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　（ｅｄ、　Ｈ，Ｂ、
　Ｂｏｙｅｒ及びＳ。

Ｎｉｃｏｇｉａ）Ｐ、１７　Ｅｌｓｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔ
ｈ　ＨｏｌｌａｎｄＡｍｓｔｅｒｄａｍ ３４、Ｄ、Ｈａｎａｈａｎ　（１９８３）Ｓｔｕｄｉｅ
ｓ　ｏｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅ、ｃ
ａｌｌ　ｗｉｔｈｐｌａｓｍｉｄｓ−ＪＭＢ　５ｏｕｓ
　ｐｒｅｓｓｅ０３５、　Ｈｏｈｎ、　Ｂ、及びＭｕｒ
ｒａｙ、　Ｋ、　１９７９）、　ＰＮＡ８７４．３２５
９゜ ３６、Ｒｉｇｂｙ、Ｐ、Ｎ、（１９８３）、Ｊ、Ｇｅｎ
、Ｖｉｒｏｌ。

６４．２５５゜ ３７、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔ
ｕｍｏｒ　ｖｉｒｕｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｅｄ。

（１９８２） ４５、Ｖａｒｍｕｓ＋　Ｈ，Ｅ、＋　Ｖｏｇｔ＋　Ｐ、
に、ｅ　Ｂ１５ｈｏｐ。

Ｊ、Ｍ、（１９７８）ＰＮＡＳ　７０．３０６７−３０
７１゜４６、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｄ、（１９７０）、
Ｎａｔｕｒｅ　２２Ｌ２０９ ４７、Ｂａｌｕｄａｗ　Ｍ、Ａ、、Ｎａｙａｋ　Ｄ、Ｐ
、（１９７０）。

ＰＮＡＳ　６６．３２９゜ ４８、　Ｇ１１ｂｏａ、　Ｅ、他（１９７９）、　Ｃｅ
１ｌ　１８．９３−００ ４９、Ｃｏｆｆ１ｎ、Ｊ、Ｍ、（１９７９）、Ｊ、Ｇｅ
ｎ、Ｖｉｒｏｌ。

４２．１−２６゜ ５５、Ｌａｉ、Ｍ、Ｍ、Ｃ，、Ｄｕｅｓｂｅｒｇ＋　Ｐ
、Ｈ，（１９７２）。

Ｎａｔｕｒｅ　２３５＋　３８３−３８６５６、Ｂｅｅ
ｍｏｎ、に、Ｌ、、Ｋｅｉｔｈ、Ｊ、Ｍ、（１９７６）
。

Ａｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇ）’＋　ｐ、９７．Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋Ｎ、Ｙ。

【図面の簡単な説明】

第１図はＭｏ−ＭｕＬＶのゲノムの略図および部分５′
の拡大図。 第２図はウィルスベクトルｐＢ６の構築法を示す図、 第３図はベクトルｐＢ６の有効性のテストに際してこの
ベクトルの中に標識ＴＫおよびＮＥＯｒのコード付は遺
伝子断片を挿入する方法を示す図、第４図はヒトの肝炎
Ｂウィルスの遺伝子プレＳとＳのコード付は配列をそれ
ぞれｐＢ６とＢ２Ｍ１３の中に挿入する方法を示す図、 第５図はウィルスベクトルλｐ６４７の構築を示す図、
また 第６図はウィルスベクトルｐＢ６を示す図であり、 第７図はベクトル、Ｂ６カ）ら誘導されたベクトル、Ｂ
７の構築を示す図である。 手続補正書は式） 昭和６０年６り／？日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １　事件の表示 昭和６０年　特許願　第１８４７１号 ２　発明の名称 レトロウィルスのゲノムの少なくとも一部を含む、真核
生物細胞中のタンパク質のクローニングヒ発現ウィルス
ベクトル、このベクトルによって感染された真核生物細
胞およびこのようなＳ胞と得られたタンパク質の利用方
法 ３　補正をする省 事件との関係　特許出願人 アンスティテユ、ナショナル、ド、う、サント、工、ド
、う、ルシエルシュ、 メゾイカルーア１ンセルム ４代理人 ＊＊ｆｉＢ−Ｆ［１％機Ｉδｉり県１式署昭和６０年５
月８日 （発送日　昭和６０年５月２８日） ６　補正の対象 Ｉｉ書の出願人の鞠、委任状、法人証明書、図メづｑ府
ご≧、ン　補正の内容 （１）　別紙の通り。 （２）　図面の浄書（内容に変更なし）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、真核生物細胞中の特定のタンノξり質のコード付け
   ＤＮＡ配列のクローニングと発現用ウィルスベクトルに
   おいて、少くとも 一レトロウィルスのゲノムの一部を含み、前記部分は、
   少なくともプロモータ区域と、ウィルスゲノムの複製、
   プロウィルスの形での組込み、包膜およびウィルスメツ
   セージＲＮＡの接合を保証する要素を含み、 −また前記プロモータ区域の下流に位置するユ二−り制
   限部位を有°シ、この部位に分枝される特定のタンパク
   質のコード付けＤＮＡ配列がこのゾロモータ区域の制御
   下に置かれるようにしたことを特徴とするレトロウィル
   スベクトル。 ２、前記のレトロウィルスのゲノムの部分は順次に、少
   なくとも 一第１ＬＴＲ配列、 一接合供与体一受容体コンセンサス配列によって包囲さ
   れた“リーダ配列、および −第２ＬＴＲ配列を順次に含み、 項によるウィルスベクトル。 ３、使用されるレトロウィルスは白血病ウィルス、特に
   Ｎｏ　−Ｍｕ　ＬＶウィルスであることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項または第２項によるウィルスベクト
   ル。 ４、さらに、２個の反復配列ＬＴＲの中間に、Ｍｏ　−
   Ｍｕ　ＬＶウィルスの遺伝子ｅｎｖ　と制限部位Ｐｓｔ
   　Ｉとを含むことを特徴とする特許請求の範囲第３項に
   よるウィルスベクトル。 ５．プロモータ区域の下流に位置するユニーク制限部位
   はファージＭ１３Ｍｐ８のＤＮＡ断片から生じることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか
   によるウィルスベクトル。 ６、サラニ、ウィルスＤＮＡを包囲する２つのＬＴＲ配
   列の外部に結合されたバクテリヤプラスミドのＤＮＡの
   全部または一部を含むことを特徴とする特許請求の範囲
   第１項乃至第５項のいずれかによるウィルスベクトル。 ７、バクテリヤプラスミドはｐＢＲ３２２またはその突
   然変異体の１つであることを特徴とする特許請求の範囲
   第６項によるウィルスベクトル。 ８、バクテリヤシラスミドは、アンピシリン抵抗をコー
   ド付ける遺伝子中に制限部位ＰｓｔＩを含まないｐＢＲ
   ３２２の突然変異体であることを特徴とする特許請求の
   範囲第７項によるウィルスベクトル。 ９、さらに、シラスミドインサートを含みまた含まない
   ウィルスＤＮＡを包囲する２つのＬＴＲ配列の外部に結
   合され゛たファージのｆ）Ｎａの全部または一部を含む
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第８項のい
   ずれかによるウィルスベクトル。 １０、前記ファージはλＬ４７．１であることを特徴と
   する特許請求の範囲第９項によるウィルスベクトル。 １１、　、Ｂ６であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項乃至第１０項のいずれかＫよるウィルスベクトル
   。 １２、　、ＵＲ，Ｂ６であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項乃至第１０項のいずれかによるウィルスベ
   クトル。 １３、λ、６４７　であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項乃至第１０項のいずれかによるウィルスベク
   トル。 １４、、Ｂ７であることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項乃至第１０項のいずれかによるウィルスベクトル。 １５、特定のタンノぞり質の少な（とも１つのコード付
   けＤＮＡ配列をユニーク制限部位に分枝された特許請求
   の範囲第１項乃至第１４項のいずれかによるウィルスベ
   クトル。 １６、前記のＤＮＡ配列はヒトの肝炎Ｂの表面抗原をコ
   ード付けることを特徴とする特許請求の範囲第１６項に
   よるウィルスベクトル。 １７特許請求の範囲第１項乃至第１４項のいずれかによ
   るウィルスベクトルによって感染された真核生物細胞。 １８特許請求の範囲第１，５項または第１６項によるウ
   ィルスベクトルによって感染された真核生物細胞。 １９％許請求の範囲第１８項により感染された真核生物
   細胞を適当培地上で培養させ、生産されたタンノぞり質
   を分離することを特徴とするタンパク質の生産方法。 ２０生産されたタン・ぞり質はヒトの肝炎Ｂの表面抗原
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１９項による
   方法。