KR20220111244A - 종양용해바이러스 및 이의 응용과 암 치료용 약물 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 종양용해바이러스 및 이의 응용과 암 치료용 약물을 제공하였고, 암치료 기술 분야에 관한 것이다. 본 발명에 제공된 종양용해바이러스에 있어서, 이의 게놈에는 제1 조절 요소 및 제2 조절 요소가 삽입되고; 제1 조절 요소는 암세포 특이적 프로모터 서열, 및 상기 암세포 특이적 프로모터에 의해 구동되어 암 세포에서 특이적 프로테아제를 발현하는 제1 핵산 서열을 포함하며; 제2 조절 요소는 세포외 견인 신호 펩타이드를 코딩하기 위한 제2 핵산 서열, 및 특이적 절단 위치를 코딩하기 위한 제3 핵산 서열을 포함한다. 상기 종양용해바이러스는 암 세포에서 강력한 복제 능력으로 복제되어 숙주 암세포를 죽일 수 있고, 비암세포에 대해서는 신뢰적인 안전성을 가질 수 있다.
Description
본 발명은 암 치료 기술 분야에 관한 것으로, 구체적으로, 종양용해바이러스 및 이의 응용과 암 치료용 약물에 관한 것이다.
최근, 암은 건강에 영향을 미치는 제1 킬러로 되었다. 중국은 암, 특히 폐암, 위암, 간암 및 직장암 발병률이 높은 지역이다. 통계에 따르면, 2016년 한 해에만 전국적으로 480만 건의 다양한 유형의 암 환자 사례가 새로 증가하였으며, 다양한 암으로 인해 230만 명의 환자가 사망하였다. 기술의 발전으로 다양한 새로운 치료 수단, 특히 바이오 약물이 임상에 지속적으로 적용되고 있다. 그러나 약물의 안전성과 유효성 및 환자의 생활의 질 등 측면의 수요를 만족시키기에는 아직 많이 부족하므로, 신약이나 치료제 개발이 시급한 실정이다.
1991년, Martuza 등은 《Science》 저널에 문장을 게재하여, 유전자 변형 단순헤르페스바이러스가 악성 신경교종의 치료에 일정한 효과가 있음을 증명하였다. 그 이후로, 암을 치료하기 위한 종양용해바이러스의 개발에 대한 관심이 날로 늘어났다. 종양용해바이러스의 암 치료 원리는 자연계에 존재하는 발병력이 비교적 약한 바이러스의 일부를 유전적으로 조작하여 종양 세포에서 선택적으로 복제하게 함으로써, 궁극적으로 종양을 파괴할 수 있도록 하는 것이다. 동시에, 면역 세포를 유인하여 잔류 암세포를 계속하여 죽이거나 면역 반응을 통해 전이한 암세포를 죽이도록 면역 반응을 일으킬 수 있다. 최근 수십 년 동안, 종양용해바이러스 관련 연구는 엄청난 발전을 이루었다.
사람들은 뉴캣슬병바이러스(new castle disease virus, NDV), 1형 단순헤르페스바이러스(herpes simplex virus-1, HSV-1), 레오바이러스(reovirus), 종양용해아데노바이러스(oncolytic adenovirus)를 사용하여 종양용해바이러스를 개발하였고, 동물 실험에 따르면 안전하고 효과적인 것으로 나타났다. 그러나 임상 효과는 기대에 훨씬 못미쳤다. 바람직하지 못한 임상 효과는 현재의 종양용해바이러스 설계 전략과 관련이 있다. 현재, 전통적인 종양용해바이러스는 주로 하나 이상의 바이러스 비필수 유전자를 제거하거나, 또는 하나 이상의 필수 유전자를 암 특이적 프로모터의 구동 하에서 발현되도록 배치하는 전략을 통해 종양용해바이러스가 암 세포에서 선택적으로 증식하는 목적을 구현한다. 그러나 비필수 유전자를 제거하거나 필수 유전자를 암 특이적 프로모터의 구동하에서 발현되도록 배치하는 것은 체내에서 모두 바이러스의 증식에 영향을 미친다. 다시 말해, 종양용해바이러스가 현재 임상에서 효과가 바람직하지 못한 원인은 기존의 설계 전략 때문이다. 종양용해바이러스의 유효성 및 응용의 광범성을 증가시키기 위해서는 종양용해바이러스 설계시, 시간에 따른 바이러스 유전자의 발현의 높은 조화성에 영향을 미치지 않으면서 바이러스 게놈의 완전성을 유지하는 것이 매우 중요하다.
본 발명의 일 양태는 종양용해바이러스를 제공하고, 상기 종양용해바이러스는 야생형 바이러스를 유전적으로 조작한 재조합 종양용해바이러스이고, 암세포에서 비교적 강력한 복제 능력으로 복제하여 숙주 세포를 죽일 수 있으며, 비암세포에 대해서는 신뢰적인 안전성을 가지고 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서는 상기 종양용해바이러스를 제조하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에서는 상기 핵산 분자를 함유하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에서는 상기 종양용해바이러를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에서는 암 치료에서의 상기 종양용해바이러스의 응용을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에서는 암을 치료하는 약물을 제공한다.
제1 양태에 있어서, 본 발명은 종양용해바이러스를 제공하고, 종양용해바이러스의 게놈에 제1 조절 요소가 삽입되며, 제1 조절 요소는 암세포 특이적 프로모터 서열 및 암세포 특이적 프로모터에 의해 구동되어 표적 암세포에서 특이적 프로테아제를 발현하는 제1 핵산 서열을 포함하고;
종양용해바이러스의 게놈에 제2 조절 요소가 더 삽입되며, 제2 조절 요소는 세포외 견인 신호 펩타이드(extracellular secretion signal peptide)를 코딩하기 위한 제2 핵산 서열 및 특이적 절단 위치(specific cleavage site)를 코딩하기 위한 제3 핵산 서열을 포함하고; 특이적 절단 위치는 특이적 프로테아제에 의해 식별되고 절단되며;
제2 조절 요소는 종양용해바이러스의 필수 유전자의 5'말단에 위치된다.
본 발명에 제공된 종양용해바이러스는 암세포 특이적 프로모터에 의해 조절되는데, 정상 세포와 같은 비암세포를 감염시키는 경우, 다운스트림의 특이적 프로테아제는 발현되지 않으므로, 세포외 견인 신호 펩타이드는 다운스트림의 필수 유전자 서열에 의해 발현된 바이러스 복제에 필수적인 단백질을 세포 외로 견인하여, 종양용해바이러스에 필요한 요소가 결핍되도록 함으로써, 비암세포에서 복제할 수 없게 되는 반면; 암세포를 감염시키는 경우, 상기 종양용해바이러스의 암세포 특이적 프로모터 구동에 의해 특이적 프로테아제를 발현하고, 특이적 프로테아제는 세포외 견인 신호 펩타이드와 상기 필수 유전자에 의해 발현되는 단백질 사이에 위치한 특이적 절단 위치를 절단하여, 바이러스 복제에 필요한 단백질이 암세포 내에 남게되어, 종양용해바이러스가 정상적으로 복제할 수 있게 함으로써, 복제를 통해 암세포를 죽일 수 있다.
본 발명에 제공된 재조합 종양용해바이러스는 원시적인 게놈에 존재하는 임의의 유전자(필수 유전자 또는 비필수 유전자)를 삭제하지 않아, 비교적 강력한 복제 능력으로 암세포를 죽일 수 있다.
본 발명의 이러한 양태에서 제공하는 종양용해바이러스의 게놈 구조 개략도는 도 1의A를 참조할 수 있다.
설명해야 할 점은, 제1 조절 요소의 삽입 위치는 종양용해바이러스의 2개의 유전자 사이(2개의 필수 유전자 사이일 수 있고, 2개의 비필수 유전자일 수도 있으며, 또한 하나의 필수 유전자와 하나의 비필수 유전자 사이 일 수도 있음)이므로, 유전자의 정상적인 기능에 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서, 특이적 프로테아제는 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제(human Rhinovirus 3C Protease), 트롬빈(thrombin), Xa인자 프로테아제, 담배식각바이러스 프로테아제(TEV 프로테아제, Tobacco etch virus protease) 또는 재조합 프리시션 프로테아제(recombinant PreScission protease)이다.
물론, 설명해야 할 점은, 본 발명의 특이적 프로테아제는 상술된 프로테아제에 한정되지 않으며, 다른 일부 실시예에서, 본 분야 당업자는 수요에 따라 적합한 프로테아제를 선택하여 본 발명에 적용할 수 있으며, 이는 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.
상응하게, 당업자는 수요에 따라, 특이적 프로테아제에 의해 식별되고 절단될 수 있는 적합한 특이적 절단 위치를 선택하여 본 발명에 적용할 수 있다. 예를 들어:
특이적 프로테아제가 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제인 경우, 특이적 절단 위치의 아미노산 서열은 LEVLFQGP이고;
특이적 프로테아제가 트롬빈인 경우, 특이적 절단 위치의 아미노산 서열은 LVPRGS이며;
특이적 프로테아제가 Xa인자 프로테아제인 경우, 특이적 절단 위치의 아미노산 서열은 IE/DGR(IEDGR 또는 IDGR)이고;
특이적 프로테아제가 담배식각바이러스 프로테아제인 경우, 특이적 절단 위치의 서열은 ENLYFQG이며;
특이적 프로테아제가 재조합 프리시션 프로테아제인 경우, 특이적 절단 위치의 서열은 LEVLFQGP이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서, 세포외 견인 신호 펩타이드는 인터페론α2, 인터루킨 2, 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 인간 면역글로불린의 중쇄 또는 해양 요각류 동물 유래 루시페라제 세포외 분비 신호 펩타이드(luciferase extracellular secretion signal peptides)이다.
물론, 설명해야 할 점은, 본 발명의 세포외 견인 신호 펩타이드는 상술된 유형에 한정되지 않는 것이며, 다른 일부 실시예에서, 당업자는 수요에 따라 적합한 세포외 견인 신호 펩타이드를 선택하여 본 발명의 기술 방안에 적용할 수 있으며, 이와 융합되는 단백질을 세포 외로 견일 수 있는 것이면 모두 가능하며, 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서, 제2 조절 요소는 종양용해바이러스의 필수 유전자의 오픈 리딩 프레임의 개시코돈(ATG)과 제2 트리플렛 코드 사이에 위치한다.
세포외 견인 신호 펩타이드와 필수 유전자가 발현는 경우, 세포외 견인 신호 펩타이드는 특이적 절단 위치 서열을 통해 필수 단백질과 융합되고(상기 필수 유전자에 의해 발현됨), 특이적 절단 위치 서열이 절단되지 않으면, 필수 단백질이 세포 외로 견인되어, 종양용해바이러스가 정상적으로 복제될 수 없다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서, 제1 조절 요소는 인핸서 서열을 더 포함하고, 인핸서 서열은 암세포 특이적 프로모터 서열과 특이적 프로테아제 코딩 서열 사이에 위치하며, 인핸서 서열은 특이적 프로테아제의 발현을 강화시키기 위한 것이다.
본 발명은 인핸서 서열의 구체적인 유형에 대해 한정하지 않고, 다운스트림 유전자 서열 발현을 강화할 수 있는 인핸서라면 모두 본 발명에 사용할 수 있다. 하나 이상의 실시양태에 있어서, 인핸서 서열은 CMV인핸서 서열 또는 SV40인핸서 서열이다. 물론, 본 발명의 다른 실시예에서, 당업자는 수요에 따라 적합한 인핸서 서열을 선택할 수 있고, 어떤 종류의 인핸서를 선택하든, 암세포, 특히 암세포 특이적 프로모터 전사 활성이 낮은 암세포에서 특이적 프로테아제의 발현 강화에 사용하는 것을 목적으로 하는 것이라면 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.
인핸서 도입을 통해 특이적 프로테아제의 발현 수준을 향상시킬 수 있고, 종양용해바이러스가 암세포를 감염할 때, 특이적 프로테아제는 대량으로 발현되어, 특이적 절단 위치를 고효율적으로 절단할 수 있어, 발현된 필수 단백질(상기 필수 유전자에 의해 발현됨)이 더 많이 세포 내에 남도록 하여, 종양용해바이러스의 복제 능력을 강화시켜, 암세포에 대한 살상 능력의 향상에 유리하다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서, 표적 암세포는 폐암 세포, 간암 세포, 유방암 세포, 위암 세포, 전립선암 세포, 뇌종양 세포, 인간 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 신장암 세포, 난소암 세포, 두경부암 세포, 흑색종 세포, 췌장암 세포 또는 식도암 세포이다.
설명해야 할 점은, 표적 암세포의 유형은 실제 상황에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 상응하게, 암세포 특이적 프로모터는 선택된 표적 암세포에서 특이적으로 발현되는 프로모터일 수 있고, 다양한 암세포에서 구동되어 발현되는(그러나 비암세포에서 구동되어 발현되는 것은 아님) 프로모터일 수도 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서, 암세포 특이적 프로모터 서열은 텔로머라아제 역전사효소(telomerase reverse transcriptase, hTERT) 프로모터, 인간 표피 성장 인자 수용체-2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2) 프로모터, E2F1프로모터, 오스테오칼신 프로모터(Osteocalcin promoter), 암배아 항원(carcinoembryonic antigen) 프로모터, 서바이빈(Survivin) 프로모터 및 세롤로플라스민 프로모터(ceruloplasmin promoter) 중의 하나이다.
물론, 본 발명의 암세포 특이적 프로모터 서열은 상술된 유형에 한정되지 않고, 다른 일부 실시예에서, 당업자는 수요에 따라 암세포에서 다운스트림 유전자 발현을 구현할 수 있는 적합한 프로모터를 선택할 수 있다. 어떤 종류의 암세포 특이적 프로모터를 선택하여 사용하든 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서, 종양용해바이러스는 단순헤르페스바이러스(herpes simplex virus)(예를 들어, 1형 단순헤르페스바이러스), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아바이러스(vaccinia virus), 뉴캣슬병바이러스(Newcastle disease virus), 폴리오바이러스(polio virus), 콕삭키바이러스(Coxsackie virus), 홍역바이러스(measles virus), 멈프스바이러스(mumps virus), 수포성구내염바이러스(vesicular stomatitis virus) 및 인플루엔자바이러스(influenza virus) 중의 하나로부터 선택된다.
설명해야 할 점은, 본 발명의 종양용해바이러스의 유형은 상술된 유형에 한정되지 않고, 다른 실시예에서, 당업자는 실제 상황에 따라 적합한 종양용해바이러스를 선택할 수 있고, 암세포를 감염시키고 암세포를 억제하거나 살상하는 능력이 있는 것이면 모두 본 발명의 종양용해바이러스로 사용 가능하다. 어떤 종류의 종양용해바이러스를 선택하여 사용하든 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다.
이 외에, 상이한 종양용해바이러스는 상이한 필수 유전자를 갖고, 당업자는 본 발명의 내용 및 실제 상황에 따라 적합한 종양용해바이러스와 필수 유전자을 선택할 수 있다.
예를 들어: 종양용해바이러스가 단순헤르페스바이러스인 경우, 필수 유전자는 외피 당단백질L(envelope glycoprotein L), 우라실-DNA글리코실라제(Uracil DNA Glycosylase), 캡시드 단백질(capsid protein), 헬리카제 전구효소 서브유닛(helicase proenzyme subunit), DNA 복제 개시 결합 헬리카제(DNA replication initiation binding unwindase), 미리스트산 유도체 단백질(derived protein of myristic acid), 데옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease), 코트 세린/트레오닌 단백질 키나아제(coat serine/threonine protein kinase), DNA 패키징 터미나아제 서브유닛 1(DNA packaging terminase subunit 1), 코트 프로틴L16(coat protein UL16), DNA 패키징 단백질UL17(DNA packaging protein UL17), 캡시드 트리플렉스 서브유닛2(capsid triplex subunit 2), 주요 캡시드 단백질(major capsid protein), 외피 단백질UL20(envelope glycoprotein UL20), 핵단백질UL24(nucleoprotein UL24), DNA 패키징 단백질UL25(DNA packaging protein UL25), 캡시드 성숙 프로테아제(capsid mature protease), 캡시드 단백질(capsid protein), 외피 당단백질B(envelope glycoprotein B), 단일 가닥 DNA 결합 단백질(single-strand DNA-binding protein), DNA 폴리머라제 캐탈리틱 서브유닛(DNA polymerase catalytic subunit), 핵 탈출층 단백질(nuclear egress layer protein), DNA 패키징 단백질UL32(DNA packaging protein UL32), DNA 패키징 단백질UL33(DNA packaging protein UL33), 핵 탈출막 단백질(nuclear egress membrane protein), 라지 캡시드 단백질(large capsid protein), 캡시드 트리플렉스 서브유닛1(capsid triplex subunit 1), 리보뉴클레오티드 환원효소 서브유닛1(Ribonucleotide reductase subunit1), 리보뉴클레오티드 환원효소 서브유닛2(Ribonucleotide reductase subunit 2), 캡슐 호스트 셧오프 단백질(capsule host shutoff protein), DNA 폴리머라제 프로세싱 서브유닛(DNA polymerase processing subunit), 막단백질 UL45(membrane protein UL45), 코트 프로틴VP13/14(coat protein VP13/14), 트랜스-활성화 단백질VP16(trans-activator protein VP16), 코트 프로틴VP22(coat protein VP22), 외피 당단백질N(envelope glycoprotein N), 코트 프로틴UL51(coat protein UL51), 헬리카제-프리메이즈 프리마제 서브유닛(unwindase-primaseprimase subunit), 외피 당단백질K(envelope glycoprotein K), ICP27, 핵단백질UL55(nucleoprotein UL55), 핵단백질UL56(nucleoprotein UL56), 전사조절인자ICP4(transcription regulation factor ICP4), 조절 단백질ICP22(regulatory protein ICP22), 외피 당단백질D(envelope glycoprotein D) 및 막단백질 US8A(membrane protein US8A) 중의 하나 이상으로부터 선택되고;
또는, 종양용해바이러스가 아데노바이러스인 경우, 필수 유전자는 초기 단백질1A(early protein 1A), 초기 단백질1B 19K(early protein 1B 19K), 초기 단백질1B 55K(early protein 1B 55K), 캡시드화 단백질Iva2(encapsidation protein Iva2), DNA폴리머라제(DNA polymerase),말단 단백질 전구체pTP(terminal protein precursor pTP), 캡시드화 단백질52K(encapsidation protein 52K), 캡시드 단백질 전구체pIIIa(capsid protein precursor pIIIa), 펜톤 기질(pentomer matrix), 코어 단백질pVII(core protein pVII), 코어 단백질 전구체pX(core protein precursor pX), 코어 단백질 전구체pVI(core protein precursor pVI), 헥손(hexonmer), 프로테아제(Protease), 단일 가닥 DNA 결합 단백질(single-stranded DNA-binding protein), 헥사머 어셈블리 단백질100K(hexamer assembly protein 100K), 단백질33K(protein 33K), 캡시드화 단백질22K(encapsidation protein 22K), 캡시드 단백질 전구체(capsid protein precursor), 단백질U(protein U), 피브린(fibrin), 조절단백질 E4 오픈 리딩 프레임6/7(open reading frame 6/7 of regulatory protein E4), 조절단백질 E4 34K(regulatory protein E4 34K), 조절단백질 E4오픈 리딩 프레임4(open reading frame 4 of regulatory protein E4), 조절단백질 E4오픈 리딩 프레임3(open reading frame 3 of regulatory protein E4), 조절단백질 E4오픈 리딩 프레임2(open reading frame 2 of regulatory protein E4), 및 조절단백질 E4오픈 리딩 프레임1(open reading frame 1 of regulatory protein E4) 중의 하나 이상으로부터 선택되며;
또는, 종양용해바이러스가 백시니아바이러스인 경우, 필수 유전자는 리보뉴클레오티드 환원효소 스몰 서브유닛(ribonucleotide reductase small-subunit), 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase), DNA 결합 바이러스 코어 단백질(DNA-binding viral core protein), 폴리머라제 라지 서브유닛(polymerase large-subunit), RNA폴리머라제 서브유닛(RNA polymerase subunit), DNA폴리머라제(DNA polymerase), 설프하이드릴 옥시다제(sulfhydryl oxidase), 가상 DNA-결합 바이러스 핵단백질(hypothetical DNA-binding viral nucleoprotein), DNA-결합 인단백질(DNA-binding phosphoprotein), 바이러스 코어 시스테인 프로테이나제(Viral Core cysteine proteinase), RNA헬리카제NPH-II(RNA helicase NPH-II), 가상 메탈로프로티나제(hypothetical metalloproteinase), 전사신장인자(transcription elongation factor), 글루타티온계 단백질(glutathione-type protein), RNA폴리머라제(RNA polymerase), 가상 바이러스 핵단백질(hypothetical viral nucleoprotein), 후기 전사인자VLTF-1(late transcription factor VLTF-1), DNA-결합 바이러스 핵단백질(DNA-binding viral nucleoprotein), 바이러스 캡시드 단백질(viral capsid protein), 폴리머라제 스몰 서브유닛(polymerase small-subunit), DNA-의존성 RNA 폴리머라제 서브유닛rpo22(RNA polymerase subunit rpo22 depending on DNA), DNA-의존성 RNA 폴리머라제 서브유닛rpo147(RNA polymerase subunit rpo147 depending on DNA), 세린/트레오닌 단백질 포스파타아제(serine/threonine protein phosphatase), IMV 헤파린 결합 표면단백질(IMV heparin-binding surface protein), DNA 의존성 RNA 폴리머라제(DNA-dependent RNA polymerase), 후기 전사인자VLTF-4(late transcription factor VLTF-4), Ⅰ형 DNA 토포이소머라아제(DNA topoisomerase type I), mRNA캡핑 효소 라지 서브유닛(mRNA capping enzyme large-subunit), 바이러스 코어 단백질107(viral core protein 107), 바이러스 코어 단백질108(viral core protein 108), 우라실-DNA글리코실라제(Uracil-DNA glycosylase), 트리포스파타아제(Triphosphatase), 초기 유전자 전사인자VETF의 70 kDa 스몰 서브유닛(70kDa small subunit of early gene transcription factor VETF), DNA-의존성 RNA 폴리머라제 서브유닛rpo18(RNA polymerase subunit rpo18 depending on DNA), 뉴클레오사이드 트리포스페이트 가수분해효소-I(nucleoside triphosphate hydrolase-I), mRNA캡핑 효소 스몰 서브유닛(mRNA capping enzyme small-subunit), 리팜피신 타겟(Rifampicin target), 후기 전사인자VLTF-2(late transcription factor VLTF-2), 후기 전사인자VLTF-3(late transcription factor VLTF-3), 이황화 결합 형성 경로(disulfide bond forming pathway), 코어 단백질4b 전구체p4b(precursor p4b of core protein 4b), 코어 단백질39kDa(core protein 39kDa), DNA-의존성 RNA 폴리머라제 서브유닛rpo19(RNA polymerase subunit rpo19 depending on DNA), 초기 유전자 전사인자VETF의 82kDa 라지 서브유닛(82kDa large subunit of early gene transcription factor VETF), 전사인자 VITF-3의 32kDa 스몰 서브유닛(32kDa small subunit of transcription factor VITF-3), IMV멤브레인 단백질 128(IMV membrane protein 128), 코어 단백질4a 전구체P4a(precursor P4a of core protein 4a), IMV 멤브레인 단백질131(IMV membrane protein 131), 인산화 IMV 멤브레인 단백질(phosphorylated IMV membrane protein), IMV 멤브레인 단백질 A17L(IMV membrane protein A17L), DNA헬리카제(DNA unwindase), 바이러스 DNA폴리머라제 가공인자(viral DNA polymerase processing factor), IMV멤브레인 단백질 A21L(IMV membrane protein A21L), 팔미토일 단백질(palmitoyl protein), 중간 유전자 전사인자 VITF-3의 45kDa 라지 서브유닛(45kDa large subunit of intermediate gene transcription factor VITF-3), DNA-의존성 RNA 폴리머라제 서브유닛rpo132(RNA polymerase subunit rpo132 depending on DNA), DNA 의존성 RNA폴리머라제rpo35(RNA polymerase rpo35 depending on DNA), IMV단백질A30L(IMV protein A30L), 가상적 ATP효소(hypothetical ATP enzyme), 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase), EEV 성숙 단백질(EEV mature protein), 팔미토일화된 EEV 멤브레인 당단백질(palmitoylated EEV membrane glycoprotein), IMV 표면단백질 A27L(IMV surface protein A27L), EEV멤브레인 포스포글라이코프로테인(EEV membrane phosphate glycoprotein), IEV 및 EEV 멤브레인 당단백질(IEV and EEV membrane glycoproteins), EEV 멤브레인 당단백질(EEV membrane glycoprotein), 이황화 결합 형성 경로단백질(disulfide bond forming pathway protein), 가상적 바이러스 핵단백질(hypothetical viral nucleoprotein), IMV멤브레인 단백질 I2L(IMV membrane protein I2L), 폭스바이러스 미리스토일단백질(poxvirus myristoyl protein), IMV멤브레인 단백질 L1R(IMV membrane protein L1R), 후기 16kDa 가상적 멤브레인 단백질(late 16kDa hypothetical membrane protein), 가상적 바이러스 멤브레인 단백질 H2R(hypothetical virus membrane protein H2R), IMV멤브레인 단백질 A21L(IMV membrane protein A21L), 케모카인 결합 단백질(chemokine-binding protein), 표피 성장 인자 유사 단백질(epidermal growth factor-like protein) 및 IL-18 결합 단백질(IL-18 binding protein) 중의 하나 이상으로부터 선택되고;
또는, 종양용해바이러스가 콕삭키바이러스인 경우, 필수 유전자는 단백질Vpg, 코어 단백질2A, 단백질2B, RNA헬리카제2C(RNA unwindase 2C), 단백질3A, 프로테아제3C(proteinase 3C), 역전사 효소3D(reverse transcriptase 3D), 코트 프로틴 Vp4(coat protein Vp4) 및 단백질Vp1 중의 하나 이상으로부터 선택되며;
또는, 종양용해바이러스가 홍역바이러스인 경우, 필수 유전자는 핵단백질N, 인단백질P, 매트릭스 단백질M(matrix protein M), 막횡단 당단백질F(transmembrane glycoprotein F), 막횡단 당단백질 H(transmembrane glycoprotein H) 및 RNA 의존성 RNA폴리머라제L(RNA-dependent RNA polymerase L) 중의 하나 이상으로부터 선택되고;
또는, 종양용해바이러스가 멈프스바이러스인 경우, 필수 유전자는 핵단백질N, 인단백질P, 융합 단백질F, RNA폴리머라제L(RNA polymerase L) 중의 하나 이상으로부터 선택되며;
또는, 종양용해바이러스가 수포성구내염바이러스인 경우, 필수 유전자는 당단백질G, 핵단백질N, 인단백질P 및 RNA폴리머라제L(RNA polymerase L) 중의 하나 이상으로부터 선택되고;
또는, 종양용해바이러스가 폴리오바이러스인 경우, 필수 유전자는 캡시드 단백질VP1(capsid protein VP1), 캡시드 단백질VP2(capsid protein VP2), 캡시드 단백질VP3(capsid protein VP3), 시스테인 프로테아제2A(cysteine protease 2A), 단백질2B, 단백질2C, 단백질 3A, 단백질 3B, 프로테아제3C, 단백질3D 및 RNA 매개 RNA폴리머라제(RNA-directed RNA polymerase) 중의 하나 이상으로부터 선택되며;
또는, 종양용해바이러스가 인플루엔자바이러스인 경우, 필수 유전자는 헤마글루티닌(hemagglutinin), 뉴라미니다아제(neuraminidase), 핵단백질(nucleoprotein), 멤브레인 단백질 M1(membrane protein M1), 멤브레인 단백질 M2(membrane protein M2), 폴리머라제PA(polymerase PA), 폴리머라제PB1-F2(polymerase PB1-F2) 및 폴리머라제PB2(polymerase PB2) 중의 하나 이상으로부터 선택된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서, 종양용해바이러스의 하나 이상의 필수 유전자의 오픈 리딩 프레임의 개시코돈ATG와 제2 트리플렛 코드(the first and second codons) 사이에 제2 조절 요소가 삽입된다.
다시 말해, 본 발명의 일부 실시예에서, 필수 유전자의 수량은 하나 이상일 수 있고, 다수 일 경우, 이러한 필수 유전자의 유형은 상이할 수 있고, 각각의 필수 유전자의 오픈 리딩 프레임 ATG와 제2 트리플렛 코드 사이에는 제2 조절 요소가 삽입되며, 이 외에, 제2 조절 요소의 카피수도 증가된다. 이 경우, 상기 종양용해바이러스가 비암세포를 감염할 때, 종양용해바이러스의 복제에 필수적인 필수 유전자에 의해 발현되는 다수의 단백질은 세포 외로 견인되고, 종양용해바이러스의 복제 능력이 크게 감소되어, 비암세포에 대한 안전성을 향상시킨다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서, 종양용해바이러스는 1형 단순헤르페스바이러스이고, 필수 유전자는 ICP27이며, 암세포 특이적 프로모터는 텔로머라아제 역전사효소 프로모터이고, 특이적 프로테아제는 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제이며, 세포외 견인 신호 펩타이드(extracellular secretion signal peptide)는 인터페론α2 신호 펩타이드이고, 특이적 절단 위치의 아미노산 서열은 LEVLFQGP이며; 제2 조절 요소는 필수 유전자의 오픈 리딩 프레임의 개시코돈ATG와 제2 트리플렛 코드 사이에 위치하고; 제1 조절 요소는 필수 유전자의 다운스트림에 위치한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서,
텔로머라아제 역전사효소 프로모터의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4로 표시되고;
인간 라이노바이러스 3C 프로테아제의 아미노산 서열은SEQ ID NO: 5로 표시되며;
인간 라이노바이러스 3C 프로테아제의 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열은SEQ ID NO: 6으로 표시되고;
인터페론α2 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7로 표시되며; 제2 핵산 서열(second nucleic acid sequence)의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 8로 표시되고;
제3 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시된다.
한편, 본 발명은 상기 실시양태 중의 어느 하나에 따른 종양용해바이러스를 제조하기 위한 핵산 분자를 제공하고, 핵산 분자는 종양용해바이러스 목표 위치에 삽입되는 삽입 서열을 갖고, 삽입 서열은 제1 조절 요소와 제2 조절 요소를 포함하며, 제1 조절 요소의 목표 위치는 재조합 종양용해바이러스의 2개의 유전자 사이에 위치하고, 제2 조절 요소는 종양용해바이러스의 필수 유전자의 개시코돈과 제2 트리플렛 코드 사이에 위치한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서, 삽입 서열의 5'말단은 목표 위치의 업스트림 서열과 상동성인 5' 말단 상동성 암(5' arms with sequences homologous to the sequences upstream) 서열을 갖고, 삽입 서열의 3'말단은 목표 위치의 다운스트림 서열과 상동성인 3' 말단 상동성 암(3' arms with sequences homologous to the sequences downstream) 서열을 갖는다.
상기 핵산 분자는 상동 재조합의 방식으로 삽입 서열을 야생형의 종양용해바이러스 게놈에 삽입하여, 본 발명의 종양용해바이러스를 얻을 수 있다.
한편, 본 발명은 상기와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
한편, 본 발명에서는 상기 실시양태 중의 어느 하나에 따른 종양용해바이러스의 제조 방법을 제공하였고, 상기 벡터를 모 바이러스(parental virus) 및 보완 숙주 세포(complementing cells)와 공동배양하여, 배양물로부터 재조합 종양용해바이러스를 수집하여 얻는 단계; 를 포함하며;
여기서, 모 바이러스의 게놈 서열은 야생형 바이러스의 게놈 서열과 비교할 때, 필수 유전자가 결실되고;
보완 숙주 세포는 필수 유전자를 발현하는 발현 서열을 포함한다.
한편, 본 발명에서는 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 종양용해바이러스의 암 치료 약물 제조에서의 응용을 제공한다.
한편, 본 발명에서는 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 종양용해바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 부형제(pharmaceutically acceptable excipients)를 포함하는 암을 치료하는 약물을 제공한다.
당업자는 수요에 따라 적합한 약학적으로 허용 가능한 부형제를 선택할 수 있고, 본 발명은 이에 대해 한정하지 않는다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 있어서, 약물은 유전자 치료 약물 또는 백신을 더 포함한다.
한편, 본 발명은 피험자 질환을 치료하는 방법을 제공하고,
피험자 또는 환자에게 본 공개에 제공된 약물을 투여하는 단계; 를 포함하며,
여기서, 질환은 폐암, 위암, 간암, 직장암, 유방암, 전립선암, 뇌종양, 결장암, 자궁경부암, 신장암, 난소암, 두경부암, 흑색종, 췌장암 또는 식도암이다.
본 발명 실시예의 기술 방안을 보다 명확하게 설명하기 위해, 이하에서 실시예에 사용되는 도면을 간략히 소개하고자 한다. 하기 도면은 본 발명의 일부 실시예만을 나타낼 뿐, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주하여서는 안되는 점을 이해해야 한다. 본 분야 통상의 기술자라면 창조적 노동이 없이 이러한 도면을 기반으로 다른 관련 도면을 얻을 수도 있다.
도 1: 본 발명에 제공되는 재조합 종양용해바이러스의 게놈 서열에 삽입되는 조절 요소의 구조 및 조절 관계 개략도이다. A: 본 발명에 제공되는 종양용해바이러스의 하나의 실시양태이고, 제1 조절 요소는 필수 유전자3'말단 비코딩 영역 앞에 위치하며, 제2 조절 요소는 필수 유전자오픈 리딩 프레임 개시코돈과 제2 트리플렛 코드 사이에 위치하고; B: A의 하나의 구체적인 실시양태이며, 바이러스는 HSV-1이고, 암세포 특이적 프로모터는 hTERT프로모터이며, 인핸서는 CMV인핸서이고, 특이적 프로테아제는 HRV-3C 프로테아제이며, 필수 유전자는 ICP27이고, 세포외 견인 신호 펩타이드는 인터페론α2 신호 펩타이드이며; 특이적 절단 위치는 HRV-3C 프로테아제에 의해 특이적으로 절단된다. 이에 따라 구축된 종양용해바이러스를 oHSV-BJS로 명명하였다.
도 2: 플라스미드pcDNA3.1-EGFP의 구조 개략도이다.
도 3: 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(Vero, 정상세포)에서의 재조합 바이러스oHSV-BJS처리군에서 ICP27 mRNA는 정상적으로 발현되는 반면, ICP27 단백질은 세포에 거의 축적되지 않는다. 당해 도면은 Vero세포를 3MOI(바이러스 수량/세포)의 HSV-1야생형 바이러스KOS 또는 종양용해바이러스oHSV-BJS로 감염시키고, 1일 후, 세포를 수집하여, RNA 분리하고 단백질을 추출하며, 역전사 결합 반정량적 PCR을 사용하여 ICP27 mRNA(도면의 A)를 검측하고, 웨스턴 블롯(Western blotting)으로 HSV ICP27에 의해 코딩된 단백질을 검측한 결과도이다(도면의 B).
도 4: HRV-3C mRNA는 4가지 암세포에서 쉽게 검측되는 수준으로 발현되었고, ICP27단백질은 재조합 바이러스oHSV-BJS와 야생형 바이러스KOS처리군에서 거의 차이가 없게 발현되었다. 도면에서, A: HRV-3C mRNA 발현 검측 결과이고, B: ICP27 단백직 발현 검측 결과이다.
도 5: 암세포에서 야생형 바이러스KOS 및 종양용해바이러스oHSV-BJS의 증식 동역학이다. 0.1MOI의 KOS 또는 oHSV-BJS로 다양한 암세포를 감염시키고, 상이한 일수 후, 세포와 배지를 수집하며, 세포에 남아있는 바이러스를 3회의 냉동-해동 사이클을 거쳐 배지로 방출시킨다. 바이러스로 보완 세포CICP27를 감염시키고, 플라크법(Plaque assay)으로 바이러스 역가(플라크 형성 단위/ml, PFU/ml)를 측정한다. 도면에서, A: 자궁경부암Hela세포; B: 자궁경부 편평세포암종siHa세포; C: 유방암SK-BR3세포; D: 유방암ME-180세포이다.
도 6: 재조합 종양용해바이러스oHSV-BJS는 동물 생체내에서 폐암, 위암, 간암 및 직장암 증식을 현저하게 억제한다. 인간 종양 마우스 동물 모델을 구축하였고, 모델 형성 후, 종양 내에 종양용해바이러스를 3일마다 1회씩, 총 3회 주사하였다. PBS(종양용해바이러스를 함유하지 않음)를 주사하는 군을 음성 대조로 하였다. 종양용해바이러스 주사 후, 매주 2회 종양 크기를 측정하였다. 음성 대조군 동물을 안락사시키면, 실험이 종료된다. 종양 크기에 따라 종양 성장 그라프를 작성하고(도면에서, A: 폐암; B: 위암; C: 직장암; D: 직장암), 시험이 끝나면, 종양 크기를 측정하여 음성 대조군과와 비교하고, 상대적 억제율을 분석하여 계산한다(도6의 E).
도 1: 본 발명에 제공되는 재조합 종양용해바이러스의 게놈 서열에 삽입되는 조절 요소의 구조 및 조절 관계 개략도이다. A: 본 발명에 제공되는 종양용해바이러스의 하나의 실시양태이고, 제1 조절 요소는 필수 유전자3'말단 비코딩 영역 앞에 위치하며, 제2 조절 요소는 필수 유전자오픈 리딩 프레임 개시코돈과 제2 트리플렛 코드 사이에 위치하고; B: A의 하나의 구체적인 실시양태이며, 바이러스는 HSV-1이고, 암세포 특이적 프로모터는 hTERT프로모터이며, 인핸서는 CMV인핸서이고, 특이적 프로테아제는 HRV-3C 프로테아제이며, 필수 유전자는 ICP27이고, 세포외 견인 신호 펩타이드는 인터페론α2 신호 펩타이드이며; 특이적 절단 위치는 HRV-3C 프로테아제에 의해 특이적으로 절단된다. 이에 따라 구축된 종양용해바이러스를 oHSV-BJS로 명명하였다.
도 2: 플라스미드pcDNA3.1-EGFP의 구조 개략도이다.
도 3: 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(Vero, 정상세포)에서의 재조합 바이러스oHSV-BJS처리군에서 ICP27 mRNA는 정상적으로 발현되는 반면, ICP27 단백질은 세포에 거의 축적되지 않는다. 당해 도면은 Vero세포를 3MOI(바이러스 수량/세포)의 HSV-1야생형 바이러스KOS 또는 종양용해바이러스oHSV-BJS로 감염시키고, 1일 후, 세포를 수집하여, RNA 분리하고 단백질을 추출하며, 역전사 결합 반정량적 PCR을 사용하여 ICP27 mRNA(도면의 A)를 검측하고, 웨스턴 블롯(Western blotting)으로 HSV ICP27에 의해 코딩된 단백질을 검측한 결과도이다(도면의 B).
도 4: HRV-3C mRNA는 4가지 암세포에서 쉽게 검측되는 수준으로 발현되었고, ICP27단백질은 재조합 바이러스oHSV-BJS와 야생형 바이러스KOS처리군에서 거의 차이가 없게 발현되었다. 도면에서, A: HRV-3C mRNA 발현 검측 결과이고, B: ICP27 단백직 발현 검측 결과이다.
도 5: 암세포에서 야생형 바이러스KOS 및 종양용해바이러스oHSV-BJS의 증식 동역학이다. 0.1MOI의 KOS 또는 oHSV-BJS로 다양한 암세포를 감염시키고, 상이한 일수 후, 세포와 배지를 수집하며, 세포에 남아있는 바이러스를 3회의 냉동-해동 사이클을 거쳐 배지로 방출시킨다. 바이러스로 보완 세포CICP27를 감염시키고, 플라크법(Plaque assay)으로 바이러스 역가(플라크 형성 단위/ml, PFU/ml)를 측정한다. 도면에서, A: 자궁경부암Hela세포; B: 자궁경부 편평세포암종siHa세포; C: 유방암SK-BR3세포; D: 유방암ME-180세포이다.
도 6: 재조합 종양용해바이러스oHSV-BJS는 동물 생체내에서 폐암, 위암, 간암 및 직장암 증식을 현저하게 억제한다. 인간 종양 마우스 동물 모델을 구축하였고, 모델 형성 후, 종양 내에 종양용해바이러스를 3일마다 1회씩, 총 3회 주사하였다. PBS(종양용해바이러스를 함유하지 않음)를 주사하는 군을 음성 대조로 하였다. 종양용해바이러스 주사 후, 매주 2회 종양 크기를 측정하였다. 음성 대조군 동물을 안락사시키면, 실험이 종료된다. 종양 크기에 따라 종양 성장 그라프를 작성하고(도면에서, A: 폐암; B: 위암; C: 직장암; D: 직장암), 시험이 끝나면, 종양 크기를 측정하여 음성 대조군과와 비교하고, 상대적 억제율을 분석하여 계산한다(도6의 E).
본 발명은 2019년 07월 16일 자로 중국 특허청에 제출된 출원번호가 2019106428044이고, 발명 명칭이 "종양용해바이러스 및 이의 응용과 암을 치료하는 약물"인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하는 바, 이의 전부 내용은 참조로서 본 출원에 포함된다.
본 발명 실시예의 목적, 기술방안 및 이점을 보다 명확하게 하기 위하여, 이하에서는 본 발명 실시예에서의 기술방안에 대해 더 명확하고 완전하게 설명한다. 실시예에 구체적인 조건이 명시되지 않은 경우, 통상적인 조건 또는 제조업체에서 건의하는 조건에 따라 수행한다. 제조사에 대한 표기가 없는 시약 또는 의기는 모두 시중에서 구입할 수 있는 통상적인 제품이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "염기 서열"은 "뉴클레오티드 서열"과 호환 사용될 수 있으며, 일반적으로 DNA 또는 RNA에서의 염기의 배열 순서를 의미한다.
용어 "프라이머"는 폴리뉴클레오티드 주형과 듀플렉스를 형성한 후, 핵산 합성의 출발점 역할을 수행할 수 있고, 주형을 따라3'말단으로부터 연장되어, 확장된 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있는 천연 또는 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 연장 과정에서 첨가된 뉴클레오티드 서열은 주형의 폴리뉴클레오티드의 서열에 의해 결정되고, 프라이머는 DNA폴리머라제을 통해 연장된다. 프라이머는 통상적으로 프라이머 연장 산물의 합성에서의 용도에 상용되는 길이를 가지며, 구체적인 길이는 온도, 프라이머 래원 및 실험 방법과 같은 많은 요인의 영향을 받는다.
용어 "프로모터"는 일반적으로 구조적 유전자5'말단 업스트림(upstream)에 위치된 RNA폴리머라제에 의해 특이적으로 식별될 수 있고 RNA폴리머라제를 활성화시킬 수 있는 DNA 서열을 의미한다.
용어 "인핸서(enhancer)"는 이와 연결된 유전자의 전사 빈도(transcription frequency)를 증가시키는 DNA 서열을 의미한다. 인핸서는 프로모터를 통해 전사를 증가시킨다. 효과적인 인핸서는 유전자의 5'말단에 위치할 수 있거나, 유전자의 3'말단에 위치할 수도 있으며, 일부는 유전자의 인트론에 위치할 수도 있다. 인핸서의 효과는 매우 현저하고, 일반적으로 유전자 전사 빈도를 10～200배 증가시킬 수 있으며, 일부는 수천 배까지 증가할 수 있다.
용어 "피험자" 및 "환자"는 본 발명에서 호환 사용 가능하며, 척추 동물을 의미하고, 바람직하게는 포유 동물이며, 가장 바람직하게는 인간이다. 포유 동물에는 마우스류, 유인원, 인간, 가축, 스포츠 동물 및 애완동물이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
이하 실시예에 결부하여 본 발명의 특징 및 성능에 대해 더욱 상세하게 설명할 것이다.
실시예1
본 실시예에 제공된 종양용해바이러스는 야생형의 1형 단순헤르페스바이러스KOS를 변형시켜 얻은 것이고, 상기 재조합 종양용해바이러스의 게놈은 하기와 같은 구조를 갖는다(도 1의 B를 참조할 수 있음):
(1)상기 재조합 종양용해바이러스의 필수 유전자 ICP27의 3'말단의 비코딩 영역 앞에 제1 조절 요소를 구비하고; 제1 조절 요소는 암세포 특이적 프로모터인 hTERT, 인핸서인 CMV인핸서, 코딩 특이적 프로테아제인 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제(HRV-3C 프로테아제)의 핵산 서열 및 BGH Poly(A)를 포함하며;
여기서, hTERT의 염기 서열은 SEQ ID NO: 4로 표시되고;
CMV인핸서의 염기 서열은 SEQ ID NO: 10으로 표시되며;
HRV-3C 프로테아제를 코딩하느 핵산 서열은 SEQ ID NO: 6으로 표시되고;
HRV-3C 프로테아제의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5로 표시된다.
(2)상기 재조합 종양용해바이러스는 필수 유전자 ICP27의 오픈 리딩 프레임의 개시코돈(ATG)과 제2 트리플렛 코드 사이(first and second codons of the open reading frame of the essential gene ICP27)에 제2 조절 요소를 구비하고; 상기 제2 조절 요소는 세포외 견인 신호 펩타이드인 인터페론α2 신호 펩타이드를 코딩하는 제2 핵산 서열 및 특이적 절단 위치 서열을 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함하며;
여기서, 인터페론α2 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7로 표시되고;
인터페론α2 신호 펩타이드를 코딩하는 제2 핵산 서열은 SEQ ID NO: 8로 표시되며;
특이적 절단 위치 서열의 아미노산 서열은 하기와 같다:
LEVLFQGP;
특이적 절단 위치 서열의 코딩 서열인 제3 핵산 서열은 하기와 같다:
TTAGAAGTTCTTTTTCAAGGTCCT.
ICP27이 발현되는 경우, 인터페론α2 세포외 견인 신호 펩타이드는 특이적 절단 위치 서열을 통해 ICP27 단백질의 N말단에 연결된다. 상기 종양용해바이러스가 정상세포를 감염시킬 때, HRV-3C 프로테아제는 발현되지 않으며, 특이적 절단 위치는 절단되지 않고, 인터페론α2 세포외 견인 신호가 ICP27 단백질을 유도하여 세포 외로 분비시켜, 종양용해바이러스 복제가 억제되거나 실패하여, 정상 세포는 살상되지 않고 안전하다. 상기 종양용해바이러스가 암세포를 감염시킬 때, HRV-3C 프로테아제는 hTERT의 구동 발현에 의해 특이적으로 발현되고, 특이적 절단 위치는 발현된 HRV-3C 프로테아제에 의해 식별되어 절단되며, ICP27 단백질은 암세포 내에서 정상적으로 영역에 따라 위치될 수 있고, 상기 종양용해바이러스는 정상적으로 복제되어, 표적 암세포를 살상할 수 있다.
이 외에, 본 실시예에 제공된 상기 재조합 종양용해바이러스의 제조 방법은 하기와 같다:
(1)ICP27을 발현하는 Vero세포주 구축;
(a)야생형 1형 헤르페스바이러스KOS의 DNA를 주형으로, PCR을 통해 ICP27 유전자의 코딩 영역을 증폭하고, 증폭된 단편을 항-네오마이신 유전자를 발현하는 플라스미드pcDNA3.1-EGFP(도 2 참조)의 HindIII 및 Xba 사이트 사이에 삽입하여 EGFP를 대체하였다. 상기 재조합 플라스미드를 ICP27 발현 플라스미드로 명명하고, ICP27 유전자는 CMV프로모터 구동 하에서 발현된다.
(b)상이한 농도의 G418로 Vero세포를 처리하고, G418이 포함된 배지를 3일마다 교체하며, 10일 후, 세포 사멸 상황을 관찰하여, 세포 사멸에 필요한 최소 G418농도를 결정하고, 이를 세포주 구축시 G418 사용 농도로 사용하였다.
(c)6웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 3.5Х105개의 Vero세포를 이식하고, 무-항생제 배지에서 밤새 배양한 후, 각 웰에 대해, 리포솜(Lipofectamine 2000)으로 단계 (a)에서 얻은 ICP27 발현 플라스미드 4μg를 형질도입시켰다. 24시간 후, 1:20, 1:40 및 1:60비율에 따라 희석하고, 플레이트로 옮겨 G418이 포함된 배양액에서 배양하면서, G418이 포함된 배양액을 3일에 한 번씩 교체하였다. 6-7회 액체 교체 후, 클론을 수집하고, 24웰 플레이트로부터 단계적으로 확장하였다. 다음, 단백질을 분리하고, 웨스턴 블롯법(Western blotting)으로 ICP27의 발현을 검측하였다. ICP27을 고도로 발현하는 클론 유래 세포를 선택하여, ICP27을 발현하는 Vero세포를 얻고, 보완 세포CICP27로 명명하였다.
상기 보완 세포는 2019년 4월 24일자로 우한시 우창 로고산 우한대학에 위치한 중국 생물자원센터(CCTCC)에 기탁되었고, 기탁 번호는 CCTCC NO: C201974이다.
(2)EGFP로 이의 ICP27를 대체하는 재조합 바이러스 구축;
모 바이러스 구축은 야생형 1형 헤르페스바이러스KOS를 기초 재료로 하며, EGFP로 ICP27을 대체하여 얻은 재조합 바이러스를 과도적 헤르페스 바이러스로 하였고, 모 바이러스로 명명하였다. 구체적인 방법은 하기와 같다:
(a) SEQ ID NO: 1로 표시되는 것과 같은 제1 핵산 서열 단편을 인공합성 하되, 업스트림부터 다운스트림(5'-3')으로 순차적으로, ICP27 5'말단 서열, CMV프로모터, Kozak 서열, EGFP 코딩 프레임, BGH Poly(A) 및 ICP27 3'말단 서열을 포함하고;
SEQ ID NO: 1에서:
제1-6번: 말단 길이를 증가하여 효소 절단에 유리하도록 하는 무관 서열이며;
제7-12번: Xho1사이트, C/TCGAG이고;
제13-575번: ICP27 5'말단 서열이며;
제576-1163번: CMV프로모터이고;
제1164-1174번: 스페이서 서열(spacer sequence)이며;
제1175-1180번: 단백질 발현을 증가시키도록 하는 Kozak 서열이고;
제1181-1900번: EGFP코딩 프레임이며;
제1901-2144번: BGH Poly(A)이고;
제2145-2667번: ICP27 3'말단 서열이며;
제2668-2673번: HindIII사이트A/AGCTT이고;
제2674-2679번: 말단 길이를 증가하여 효소 절단에 유리하도록 하는 무관 서열이다.
(b)XhoI 및 HindIII 효소로 제1 핵산 서열 단편을 절단하고, 이를 pcDNA3.1-EGFP플라스미드의 Xho1과 HindIII사이트에 연결하였다. 얻은 재조합 플라스미드를 EGFP 발현 플라스미드로 명명하였다.
(c)3.5Х105개/웰의 량으로, 상기 보완 세포CICP27를 6웰 세포 배양 플레이트에 이식하고, 무항생제 배지에서 밤새 배양하였다.
(d)각각 0.1MOI, 0.5MOI, 1MOI, 3MOI(바이러스/세포)의 야생형 바이러스KOS로 보완 세포CICP27을 감염시키고, 1시간 후, 리포솜(Lipofectamine 2000)으로 상기 EGFP발현 플라스미드(4μg DNA/웰)를 세포에 형질도입시켰다. 4시간 후, 완전 배지로 형질도입 용액을 대체하였다. 모든 세포가 감염된 후, 세포 및 배양액을 수집하고, 3회 냉동-해동(freeze and thaw)하며, 원심분리하여 상등액을 수집하였고, 상등액을 희석하여, 상기 보완 세포CICP27을 감염시켰다.
(e)플라크 분리 방법을 사용하여 바이러스를 분리하였다. 4-5일 후, 형광현미경으로 녹색 바이러스 플라크를 선별해낸 후, 얻은 바이러스 플라크(Viral Plaque)에 대해 2회 또는 3회 스크리닝하여 순수한 바이러스 플라크를 얻고, 바이러스를 확대 증식하여, EGFP로 ICP27를 대체한 재조합 바이러스를 얻었고, 바이러스HSV-EGFP로 명명하였다.
(3)제1 발현 조절 요소 및 제2 조절 요소를 포함하는 재조합 플라스미드 구축
(a)유전자 조작을 통해 TA플라스미드는 다중 클로닝 부위에 XhoI사이트만 포함하도록 유전자 조작되었으며, 사용을 위해 TA-XhoI플라스미드로 명명하였다.
(b) SEQ ID NO: 2로 표시되는 것과 같은 제2 핵산 단편을 인공합성 하되, 업스트림으로부터 다운스트림(5'-3')으로 순차적으로 하기와 같은 요소를 포함한다:
천연 ICP27프로모터 포함 ICP27 5'말단 비코딩 영역 서열, 인터페론α2세포외 견인 신호 펩타이드를 코딩하는 제2 핵산 서열, HRV-3C 프로테아제에 의해 절단되는 특이적 절단 위치 서열을 코딩하는 제3 핵산 서열, ICP27오픈 리딩 프레임 서열, SV40 Poly(A), ICP27 3'말단 비코딩 영역 서열을 포함하고, 여기서, SV40 Poly(A)와 ICP27 3'말단 비코딩 영역 서열 사이에 하나의 HindIII사이트가 있는데, 제1 조절 요소 구축 및 삽입에 사용되며;
SEQ ID NO: 2에서:
제1번-제6번: Xho 1사이트이고;
제7번-제677번: 천연 ICP27프로모터 포함 ICP27 5'말단 비코딩 영역 서열이며;
제678번-제746번: 인터페론α2 신호 펩타이드를 코딩하는 제2 핵산 서열이고;
제747번-제770번: HRV-3C 프로테아제에 의해 절단되는 특이적 절단 위치 서열을 코딩하는 제3 핵산 서열이며;
제771번-제2306번: ICP27오픈 리딩 프레임 서열(개시코돈ATG가 없음)이고;
제2307번-제2753번: SV40 Poly(A)이며;
제2754번-제2759번: HindIII사이트이고;
제2760번-3279번: ICP27 3'말단 비코딩 영역 서열이며;
제3280번-3285번: Xho 1사이트이다.
제2 핵산 단편을 Xho 1 로 효소 분해한 후, TA-XhoI플라스미드에 삽입하여 얻은 재조합 플라스미드를 TA-XhoI-S-ICP27플라스미드로 명명하여 준비된다.
(c) SEQ ID NO: 3으로 표시되는 것과 같은 제3 핵산 단편을 인공합성 하되, 업스트림으로부터 다운스트림(5'-3')으로 순차적으로, hTERT프로모터, CMV인핸서, Kozak 서열, HRV-3C 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열 및 SV40 Poly(A)를 포함하고;
제3 핵산 단편의 서열은 SEQ ID NO: 3으로 표시되며, 이에 포함되는 각각의 요소는 하기와 같다:
제1번-제6번: HindIII사이트이고;
제7번-제432번: hTERT프로모터이며;
제433번-제527번: CMV인핸서이고;
제528번-제539번: Kozak 서열이며;
제540번-제1088번: HRV-3C 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열이고;
제1089번-제1544번: SV40 Poly(A)이며;
제1545번-제1550번: HindIII사이트이다.
제3 핵산 단편을 HindIII으로 효소 분해하고, 동일한 효소로 절단된 TA-XhoI-S-ICP27플라스미드에 삽입하여 얻은 재조합 플라스미드를 TA-XhoI-S-ICP27-3C플라스미드로 명명하여 준비된다.
(4)재조합 종양용해 헤르페스바이러스의 구축
(a)3.5Х105개/웰의 량으로, 상기 보완 세포CICP27를 6웰 세포 배양 플레이트에 이식하여, 무항생제 배양액에서 밤새 배양하였다.
(b)각각 0.1MOI, 0.5MOI, 1MOI, 3MOI(바이러스/세포)의 모 바이러스HSV-EGFP로 보완 세포CICP27을 감염시키고, 1시간 후, 리포솜(Lipofectamine 2000)으로 상기 TA-XhoI-S-ICP27-3C플라스미드(4μg의 DNA/웰)를 세포에 형질도입시켰다. 4시간 후, 완전 배지로 형질도입 용액을 대체하였다. 모든 세포가 감염된 후, 세포 및 배양액을 수집하고, 3회 냉동-해동(freeze and thaw)하며, 원심분리하여 상등액을 수집하였고, 상등액을 희석하여, 상기 보완 세포CICP27을 감염시켰다. 플라크 분리 방법을 사용하여 바이러스를 분리하였다. 4-5일 후, 형광현미경으로 녹색 바이러스 플라크를 선별해낸 후, 얻은 바이러스 플라크(Viral Plaque)에 대해 2회 또는 3회 스크리닝하여 순수한 바이러스 플라크를 얻고, 바이러스를 확대 증식하여, 세포 감염 DNA를 분리하고, 특이적 프라이머를 사용하여, PCR방식으로 검측 단편을 확대하고 시퀀싱을 통해 입증하여 본 실시예의 재조합 종양용해바이러스를 얻었으며, oHSV-BJS로 명명하였다.
상기 재조합 종양용해바이러스oHSV-BJS는2019년 4월 24일자로 우한시 우창 로고산 우한대학에 위치한 중국 생물자원센터(CCTCC)에 기탁되었고, 기탁 번호는 CCTCC NO: V201920이다.
실험예1
정상세포 Vero에서의 실시예1의 재조합 종양용해 헤르페스바이러스oHSV-BJS의ICP27 발현 검측
방법: 야생형KOS와 재조합 종양용해바이러스oHSV-BJS로 각각 Vero(3MOI)를 감염시키고, 1일 후, 세포를 수집하여, RNA을 분리하고 단백질을 추출하며, 역전사 결합 반정량적 PCR(reverse transcription combined with semi-quantitative PCR)을 사용하여 ICP27 mRNA의 발현 수준을 검측하고, 웨스턴 블롯(Western blotting)으로 ICP27로 코딩된 단백질의 발현 수준을 검측하였다. mRNA 및 단백질 검측은 모두 β-액틴(β-actin)을 로딩 대조군(loading control)으로 사용하였다.
결과: 도 3의 A에 도시된 바와 같이, oHSV-BJS 및 KOS에 감염된 Vero세포에서, ICP27 mRNA 수준의 차이가 거의 없었다. 그러나, oHSV-BJS에 감염된 Vero세포에서, ICP27 단백질 량이 KOS에 감염된 Vero세포보다 현저하게 낮았다(도 3에서 B). 이는 상기 실시예1에 제공된 재조합 종양용해바이러스 oHSV-BJS가, 정상세포에서 ICP27이 발현된 후 인터페론α2 세포외 견인 신호 펩타이드 유도에 의해 세포 외로 분비되도록 함을 예시한다.
실험예2
암세포에서의 HRV-3C 프로테아제 및 ICP27 발현 검측
방법: 3MOI의 재조합 종양용해바이러스oHSV-BJS 또는 KOS로 4가지 상이한 암세포를 감염시키고, 24시간 후, 총 RNA와 단백질을 분리하였다. 반정량적 PCR로 HRV-3C mRNA 발현을 분석하고, 웨스턴 블롯법으로 ICP27 단백질량을 검측하였다. mRNA 및 단백질 검측은 모두 β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다.
결과, oHSV-BJS에 감염된 4가지 상이한 암세포에서, HRV-3C mRNA는 모두 검측 가능한 수준으로 발현된 것으로 나타났다(도 4의 A 참조). 재조합 종양용해바이러스oHSV-BJS에 감염된 4가지 상이한 암세포에서, ICP27 단백질은 모두 검측 가능한 수준으로 축적되었고, 종양용해바이러스 oHSV-BJS에 감염된 4가지 암세포에서, ICP27 단백질의 량은 KOS에 감염된 세포에 비해 모두 현저한 차이가 없는 것으로 나타났다(도 4에서 B 참조). 결과, HRV-3C는 암세포에서 특이적으로 발현되어, 특이적 절단 위치(LEVLFQGP)를 절단함으로써 ICP27 단백질이 세포 내에 남아 바이러스 증식을 지지하도록 하는 것으로 나타났다.
실험예3
재조합 종양용해 헤르페스바이러스oHSV-BJS의 증식 동역학(Replication kinetics)
방법: 0.1MOI의 KOS와 oHSV-BJS로 각각 상이한 암세포를 감염시키고, 상이한 일수 후, 세포와 배지를 수집하며, 세포에 남아있는 바이러스를 3회의 냉동-해동 사이클을 거쳐 배지로 방출시킨다. 다음, 바이러스로 보완 세포CICP27를 감염시키고, 플라크법(Plaque assay)으로 바이러스 역가(플라크 형성 단위/ml, PFU/ml)를 측정하였다.
결과: oHSV-BJS로 상이한 암세포를 감염시킬 때, 그 증식 차이가 크지만, 동일한 유형의 암세포의 경우, oHSV-BJS의 증식 동역학은 KOS에 비해 현저한 차이가 없는 것으로 나타났다(도 5에서 A-D 참조). 이는 암세포에서 oHSV-BJS의 증식 능력 또는 복제 능력이 야생형의 KOS와 비슷하거나 동일한 것을 나타내고, oHSV-BJS의 복제 능력이 감소되지 않았음을 나타냈다.
실험예4
재조합 종양용해 헤르페스바이러스oHSV-BJS의 암세포 사멸 능력
방법: 0.25MOI 또는 0.5MOI의 KOS 또는 oHSV-BJS로 각각 상이한 암세포를 감염시키고, 상이한 일수 후, 세포 생존율을 측정하였다. 결과는 표 1-4와 같다.
표1~4의 데이터를 참조하면, 0.25MOI 또는 0.5MOI의 oHSV-BJS가 상이한 암세포에 대한 사멸 능력이 상이하지만, 동일한 암세포의 경우, oHSV-BJS가 세포를 사멸시키는 효율은 KOS와 기본적으로 동일한 것을 알 수 있다(표 1-4). 이는 재조합 종양용해 헤르페스바이러스oHSV-BJS가 일정한 광범성을 갖고 KOS와 유사한 사멸 효율로 표적 암세포를 사멸할 수 있음을 나타냈다.
| 바이러스(MOI 0.25) | oHSV-BJS | KOS |
| 제1일 | 58±3.0 | 46±2.0 |
| 제2일 | 38±2.0 | 29±1.4 |
| 제3일 | 17±0.8 | 11±0.6 |
| 제4일 | 4±0.3 | 0 |
| 바이러스(MOI 0.5) | oHSV-BJS | KOS |
| 제1일 | 52±2.7 | 39±1.8 |
| 제2일 | 28±1.8 | 22±1.1 |
| 제3일 | 9±0.1 | 5±0.3 |
| 제4일 | 0 | 0 |
| 바이러스(MOI 0.25) | oHSV-BJS | KOS |
| 제1일 | 22±1.4 | 16±1.0 |
| 제2일 | 6±0.4 | 0 |
| 제3일 | 0 | 0 |
| 바이러스(MOI 0.5) | oHSV-BJS | KOS |
| 제1일 | 8±0.4 | 4±0.3 |
| 제2일 | 1±0.1 | 0 |
| 제3일 | 0 | 0 |
| 바이러스(MOI 0.25) | oHSV-BJS | KOS |
| 제1일 | 21±1.3 | 6±0.4 |
| 제2일 | 0 | 0 |
| 제3일 | 0 | 0 |
| 바이러스(MOI 0.5) | oHSV-BJS | KOS |
| 제1일 | 3±0.1 | 5±0.3 |
| 제2일 | 0 | 0 |
| 제3일 | 0 | 0 |
| 바이러스(MOI 0.25) | oHSV-BJS | KOS |
| 제1일 | 12±0.8 | 10±0.5 |
| 제2일 | 4±0.3 | 0 |
| 제3일 | 0 | 0 |
| 바이러스(MOI 0.5) | oHSV-BJS | KOS |
| 제1일 | 5±0.5 | 5±0.4 |
| 제2일 | 1±0.10 | 0 |
| 제3일 | 0 | 0 |
실험예5재조합 종양용해 헤르페스바이러스oHSV-BJS가 정상세포의 생존력에 미치는 영향
방법: 종양용해바이러스oHSV-BJS(2 MOI) 및 야생 바이러스KOS(0.5 MOI)로 Vero세포 또는1차 인간 각막 상피 세포(corneal epidermal cells)를 감염시켰다. oHSV-BJS 감염된 세포 및 무처리 세포는 3일 후 활성을 측정하고, 야생 바이러스KOS에 감염된 세포는 2일 후 활성을 측정하였다. KOS로 세포를 감염시킨 2일 후, Vero세포 또는1차 인간 각막 상피 세포는 모두 죽었지만, 종양용해바이러스oHSV-BJS에 감염된 세포 활력은 기본적으로 무처리군과 동일하였다(표5). 결과, 종양용해바이러스oHSV-BJS는 정상세포에 대해 안전한 것으로 나타났다.
| 바이러스 | oHSV-BJS | KOS | 무처리 |
| Vero세포 | 95±2 | 0 | 98±2 |
| 각막 상피 세포 | 97±2 | 0 | 97±1 |
실험예6재조합 종양용해 헤르페스바이러스oHSV-BJS의 생체 내 종양 억제 효과 검측
방법:
4~8주령이고 체중이14~16g인 웅성 마우스로 종양 모델을 구축하였다. 인간 폐암, 위암, 간암의 마우스 암 모델으로, 각각 체외에서 배양한 인간 비소세포폐암A549세포, 위암NCI-N87세포, 간암SK-HEP-1세포를 피하 주사한 BALb/c(폐암 및 위암) 또는 NPG마우스(간암)를 사용하였고, 종양이 일정한 크기로 증식되면, 종양을 취해 작은 조각으로 자르고 대응되는 마우스에 다시 이식하며, 종양이 40-120mm3로 자라면, 종양 내에 바이러스를 주사하기 시작하였다. 직장암 모델의 경우, 직접 BALb/c마우스에 직장암 세포주 HCT-8을 피하 접종하여 구축하였고, 종양이 40-120mm3로 자라면, 종양 내에 종양용해바이러스를 주사하기 시작하였다. 종양용해바이러스는 종양 내에 3일마다 1회 주사하고, 모두 3회 주사하며, 매회 2Х107개의 감염 단위(40μl의 PBS에 현탁됨)로 멀티 포인트 주사(multiple-point injection)하였다. 40μl의 PBS(종양용해바이러스를 함유하지 않음)를 주사한 것을 음성 대조군으로 하고, 실험군당 8마리 동물을 사용하였다. 종양용해바이러스 주사 후, 매주 종양 크기를 2회 측정하고(첫번째 주사시의 종양의 상대적 크기를 1로 정의함), 모두 17~32일(음성 대조군 동물을 안락사시키는 시기에 따라 결정함) 측정하였다. 종양 크기에 따라 종양 성장 곡선을 작성하였고, 시험 종료시 테스트군과 음성 대조군의 종양 크기를 비교 분석하여 상대 억제율을 계산하였다.
상대 억제율(%)=(음성 대조군의 종양 부피-실험군의 종양 부피)/ 음성 대조군의 종양 부피Х100%.
결과, oHSV-BJS는 상이한 정도로 폐암, 위암, 간암 및 직장암의 증식을 늦추는 것으로 나타났다(도 6의 A-D). 폐암, 위암, 간암 및 직장암에 대한 oHSV-BJS의 억제율은 각각 45%, 37%, 26% 및 49%이다(도 6에서 E). 결과, oHSV-BJS는 다양한 암의 증식을 광범위하게 억제할 수 있어, 광범성을 구비하는 것을 나타냈다.
이상의 설명은 본 발명의 전형적인 실시예일 뿐, 본 발명을 한정하지 않으며, 본 분야의 통상의 기술자에게 있어, 본 발명은 다양한 수정 및 변경을 가할 수 있다. 본 발명의 주지 및 원칙 내에서 이루어진 모든 수정, 동등 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호 범위 내에 포함된다.
산업상 이용 가능성
본 발명에 제공되는 종양용해바이러스는 산업적으로 배치 생산이 가능하고, 상기 종양용해바이러스는 원시적인 게놈에 존재하는 임의의 유전자(필수유전자 또는 비필수유전자)를 삭제하지 않고, 비교적 강력한 복제 능력으로 복제되어, 암세포를 죽일 수 있어 암치료에 사용되나, 비암세포에 대해서는 안전하다.
Sequence Listing
<110> ZETANG WU
<120> Oncolytic Virus and Application Thereof, and Drug for Treating Cancer
<130> OPI21301529KR
<150> CN201910642804.4
<151> 2019-07-16
<150> PCT/CN2020/094751
<151> 2020-06-05
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2679
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> The first nucleic acid fragment
<400> 1
aaataactcg agctgcgggc gctgttgttc catcatcctg tcgggcatcg caatgcgatt 60
gtgttatatc gccgtggtgg ccggggtggt gctcgtggcg cttcactacg agcaggagat 120
ccagaggcgc ctgtttgatg tatgacgtca catccaggcc ggcggaaacc ggaacggcat 180
atgcaaactg gaaactgtcc tgtcttgggg cccacccacc cgacgcgtca tatgtaaatg 240
aaaatcgttc ccccgaggcc atgtgtagcc tggatcccaa cgaccccgcc catgggtccc 300
aattggccgt cccgttacca agaccaaccc agccagcgta tccacccccg cccgggtccc 360
cgcggaagcg gaacggtgta tgtgatatgc taattaaata catgccacgt acttatggtg 420
tctgattggt ccttgtctgt gccggaggtg gggcgggggc cccgcccggg gggcggaact 480
aggaggggtt tgggagagcc ggccccggca ccacgggtat aaggacatcc accacccggc 540
cggtggtggt gtgcagccgt gttccaacca cggtcgttga cattgattat tgactagtta 600
ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 660
ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 720
aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 780
ggactattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 840
gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 900
cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 960
gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 1020
aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 1080
tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 1140
ggaggtctat ataagcagag ctctctggct aactgccacc atggtgagca agggcgagga 1200
gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 1260
gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt 1320
catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 1380
cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 1440
cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta 1500
caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 1560
gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa 1620
cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa 1680
gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 1740
ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc 1800
cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 1860
cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa cgggcctcga ctgtgccttc 1920
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 1980
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 2040
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 2100
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggtacaat aaaaacaaaa 2160
catttcaaac aaatcgcccc acgtgttgtc cttctttgct catggccggc ggggcgtggg 2220
tcacggcaga tggcgggggt gggcccggcg tacggcctgg gtgggcggag ggaactaacc 2280
caacgtataa atccgtcccc gctccaaggc cggtgtcata gtgcccttag gagcttcccg 2340
cccgggcgca tccccccttt tgcactatga cagcgacccc cctcaccaac ctgttcttac 2400
gggccccgga cataacccac gtggcccccc cttactgcct caacgccacc tggcaggccg 2460
aaacggccat gcacaccagc aaaacggact ccgcttgcgt ggccgtgcgg agttacctgg 2520
tccgcgcctc ctgtgagacc agcggcacaa tccactgctt tttctttgcg gtatacaagg 2580
acacccacca tacccctccg ctgattaccg agctccgcaa ctttgcggac ctggttaacc 2640
acccgccggt cctacgcgaa ctggtcgaag ctttttata 2679
<210> 2
<211> 3285
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> The second nucleic acid fragment
<400> 2
ctcgagctgc gggcgctgtt gttccatcat cctgtcgggc atcgcaatgc gattgtgtta 60
tatcgccgtg gtggccgggg tggtgctcgt ggcgcttcac tacgagcagg agatccagag 120
gcgcctgttt gatgtatgac gtcacatcca ggccggcgga aaccggaacg gcatatgcaa 180
actggaaact gtcctgtctt ggggcccacc cacccgacgc gtcatatgta aatgaaaatc 240
gttcccccga ggccatgtgt agcctggatc ccaacgaccc cgcccatggg tcccaattgg 300
ccgtcccgtt accaagacca acccagccag cgtatccacc cccgcccggg tccccgcgga 360
agcggaacgg tgtatgtgat atgctaatta aatacatgcc acgtacttat ggtgtctgat 420
tggtccttgt ctgtgccgga ggtggggcgg gggccccgcc cggggggcgg aactaggagg 480
ggtttgggag agccggcccc ggcaccacgg gtataaggac atccaccacc cggccggtgg 540
tggtgtgcag ccgtgttcca accacggtca cgcttcggtg cctctccccg attcgggccc 600
ggtcgcttgc taccggtgcg ccaccaccag aggccatatc cgacacccca gccccgacgg 660
cagccgacag cccggtcatg gccttgacct ttgctttact ggtggccctc ctggtgctca 720
gctgcaagtc aagctgctct gtgggcttag aagttctttt tcaaggtcct gcgactgaca 780
ttgatatgct aattgacctc ggcctggacc tctccgacag cgatctggac gaggaccccc 840
ccgagccggc ggagagccgc cgcgacgacc tggaatcgga cagcaacggg gagtgttcct 900
cgtcggacga ggacatggaa gacccccacg gagaggacgg accggagccg atactcgacg 960
ccgctcgccc ggcggtccgc ccgtctcgtc cagaagaccc cggcgtaccc agcacccaga 1020
cgcctcgtcc gacggagcgg cagggcccca acgatcctca accagcgccc cacagtgtgt 1080
ggtcgcgcct cggggcccgg cgaccgtctt gctcccccga gcggcacggg ggcaaggtgg 1140
cccgcctcca acccccaccg accaaagccc agcctgcccg cggcggacgc cgtgggcgtc 1200
gcaggggtcg gggtcgcggt ggtcccgggg ccgccgatgg tttgtcggac ccccgccggc 1260
gtgcccccag aaccaatcgc aacccggggg gaccccgccc cggggcgggg tggacggacg 1320
gccccggcgc cccccatggc gaggcgtggc gcggaagtga gcagcccgac ccacccggag 1380
gcccgcggac acggagcgtg cgccaagcac cccccccgct aatgacgctg gcgattgccc 1440
ccccgcccgc ggacccccgc gccccggccc cggagcgaaa ggcgcccgcc gccgacacca 1500
tcgacgccac cacgcggttg gtcctgcgct ccatctccga gcgcgcggcg gtcgaccgca 1560
tcagcgagag cttcggccgc agcgcacagg tcatgcacga cccctttggg gggcagccgt 1620
ttcccgccgc gaatagcccc tgggccccgg tgctggcggg ccaaggaggg ccctttgacg 1680
ccgagaccag acgggtctcc tgggaaacct tggtcgccca cggcccgagc ctctatcgca 1740
cttttgccgg caatcctcgg gccgcatcga ccgccaaggc catgcgcgac tgcgtgctgc 1800
gccaagaaaa tttcatcgag gcgctggcct ccgccgacga gacgctggcg tggtgcaaga 1860
tgtgcatcca ccacaacctg ccgctgcgcc cccaggaccc cattatcggg acggccgcgg 1920
cggtgctgga taacctcgcc acgcgcctgc ggccctttct ccagtgctac ctgaaggcgc 1980
gaggcctgtg cggcctggac gaactgtgtt cgcggcggcg tctggcggac attaaggaca 2040
ttgcatcctt cgtgtttgtc attctggcca ggctcgccaa ccgcgtcgag cgtggcgtcg 2100
cggagatcga ctacgcgacc cttggtgtcg gggtcggaga gaagatgcat ttctacctcc 2160
ccggggcctg catggcgggc ctgatcgaaa tcctagacac gcaccgccag gagtgttcga 2220
gtcgtgtctg cgagttgacg gccagtcaca tcgtcgcccc cccgtacgtg cacggcaaat 2280
atttttattg caactccctg ttttagtgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 2340
aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 2400
tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt 2460
tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg 2520
tatggctgat tatgatcctg caagcctcgt cgtcctggcc ggaccacgct atctgtgcaa 2580
ggtccccggc cccggacgcg cgctccatga gcagagcgcc cgccgccgag gcgaagactc 2640
gggcggcgcc ctgcccgtcc caccaggtca acaggcggta accggcctct tcatcgggaa 2700
tgcgcgcgac cttcagcatc gccggcatgt ccccctggcg gacgggaagt atcaagcttg 2760
tacaataaaa acaaaacatt tcaaacaaat cgccccacgt gttgtccttc tttgctcatg 2820
gccggcgggg cgtgggtcac ggcagatggc gggggtgggc ccggcgtacg gcctgggtgg 2880
gcggagggaa ctaacccaac gtataaatcc gtccccgctc caaggccggt gtcatagtgc 2940
ccttaggagc ttcccgcccg ggcgcatccc cccttttgca ctatgacagc gacccccctc 3000
accaacctgt tcttacgggc cccggacata acccacgtgg ccccccctta ctgcctcaac 3060
gccacctggc aggccgaaac ggccatgcac accagcaaaa cggactccgc ttgcgtggcc 3120
gtgcggagtt acctggtccg cgcctcctgt gagaccagcg gcacaatcca ctgctttttc 3180
tttgcggtat acaaggacac ccaccatacc cctccgctga ttaccgagct ccgcaacttt 3240
gcggacctgg ttaaccaccc gccggtccta cgcgaactgc tcgag 3285
<210> 3
<211> 1550
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> The third nucleic acid fragment
<400> 3
aagcttgaat tcatggcccc tccctcgggt taccccacag cctaggccga ttcgacctct 60
ctccgctggg gccctcgctg gcgtccctgc accctgggag cgcgagcggc gcgcgggcgg 120
ggaagcgcgg cccagacccc cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg ggccaggccg 180
ggctcccagt ggattcgcgg gcacagacgc ccaggaccgc gctccccacg tggcggaggg 240
actggggacc cgggcacccg tcctgcccct tcaccttcca gctccgcctc ctccgcgcgg 300
accccgcccc gtcccgaccc ctcccgggtc cccggcccag ccccctccgg gccctcccag 360
cccctcccct tcctttccgc ggccccgccc tctcctcgcg gcgcgagttt caggcagcgc 420
tgcgtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg gccccggcca cccccgcgta ggcgtgtacg 480
gtgggaggcc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagccacca 540
tgggaccaaa cacagaattt gcactatccc tgttaaggaa aaacataatg actataacaa 600
cctcaaaggg agagttcaca gggttaggca tacatgatcg tgtctgtgtg atacccacac 660
acgcacagcc tggtgatgat gtactagtga atggtcagaa aattagagtt aaggataagt 720
acaaattagt agatccagag aacattaatc tagagcttac agtgttgact ttagatagaa 780
atgaaaaatt cagagatatc aggggattta tatcagaaga tctagaaggt gtggatgcca 840
ctttggtagt acattcaaat aactttacca acactatctt agaagttggc cctgtaacaa 900
tggcaggact tattaatttg agtagcaccc ccactaacag aatgattcgt tatgattatg 960
caacaaaaac tgggcagtgt ggaggtgtgc tgtgtgctac tggtaagatc tttggtattc 1020
atgttggcgg taatggaaga caaggatttt cagctcaact taaaaaacaa tattttgtag 1080
agaaacaata gtaatgatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 1140
gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 1200
tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca 1260
gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtatggctga 1320
ttatgatcct gcaagcctcg tcgtcctggc cggaccacgc tatctgtgca aggtccccgg 1380
ccccggacgc gcgctccatg agcagagcgc ccgccgccga ggcgaagact cgggcggcgc 1440
cctgcccgtc ccaccaggtc aacaggcggt aaccggcctc ttcatcggga atgcgcgcga 1500
ccttcagcat cgccggcatg tccccctggc ggacgggaag tatcaagctt 1550
<210> 4
<211> 426
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> The nucleotide sequence of the telomerase reverse transcriptase promoter
<400> 4
gaattcatgg cccctccctc gggttacccc acagcctagg ccgattcgac ctctctccgc 60
tggggccctc gctggcgtcc ctgcaccctg ggagcgcgag cggcgcgcgg gcggggaagc 120
gcggcccaga cccccgggtc cgcccggagc agctgcgctg tcggggccag gccgggctcc 180
cagtggattc gcgggcacag acgcccagga ccgcgctccc cacgtggcgg agggactggg 240
gacccgggca cccgtcctgc cccttcacct tccagctccg cctcctccgc gcggaccccg 300
ccccgtcccg acccctcccg ggtccccggc ccagccccct ccgggccctc ccagcccctc 360
cccttccttt ccgcggcccc gccctctcct cgcggcgcga gtttcaggca gcgctgcgtc 420
ctgctg 426
<210> 5
<211> 182
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> The amino acid sequence of human rhinovirus 3C protease
<400> 5
Gly Pro Asn Thr Glu Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Lys Asn Ile Met
1 5 10 15
Thr Ile Thr Thr Ser Lys Gly Glu Phe Thr Gly Leu Gly Ile His Asp
20 25 30
Arg Val Cys Val Ile Pro Thr His Ala Gln Pro Gly Asp Asp Val Leu
35 40 45
Val Asn Gly Gln Lys Ile Arg Val Lys Asp Lys Tyr Lys Leu Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Asn Leu Glu Leu Thr Val Leu Thr Leu Asp Arg Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Arg Asp Ile Arg Gly Phe Ile Ser Glu Asp Leu Glu Gly
85 90 95
Val Asp Ala Thr Leu Val Val His Ser Asn Asn Phe Thr Asn Thr Ile
100 105 110
Leu Glu Val Gly Pro Val Thr Met Ala Gly Leu Ile Asn Leu Ser Ser
115 120 125
Thr Pro Thr Asn Arg Met Ile Arg Tyr Asp Tyr Ala Thr Lys Thr Gly
130 135 140
Gln Cys Gly Gly Val Leu Cys Ala Thr Gly Lys Ile Phe Gly Ile His
145 150 155 160
Val Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Ser Ala Gln Leu Lys Lys Gln
165 170 175
Tyr Phe Val Glu Lys Gln
180
<210> 6
<211> 552
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> The nucleotide sequence of the open reading frame of human rhinovirus 3C protease
<400> 6
atgggaccaa acacagaatt tgcactatcc ctgttaagga aaaacataat gactataaca 60
acctcaaagg gagagttcac agggttaggc atacatgatc gtgtctgtgt gatacccaca 120
cacgcacagc ctggtgatga tgtactagtg aatggtcaga aaattagagt taaggataag 180
tacaaattag tagatccaga gaacattaat ctagagctta cagtgttgac tttagataga 240
aatgaaaaat tcagagatat caggggattt atatcagaag atctagaagg tgtggatgcc 300
actttggtag tacattcaaa taactttacc aacactatct tagaagttgg ccctgtaaca 360
atggcaggac ttattaattt gagtagcacc cccactaaca gaatgattcg ttatgattat 420
gcaacaaaaa ctgggcagtg tggaggtgtg ctgtgtgcta ctggtaagat ctttggtatt 480
catgttggcg gtaatggaag acaaggattt tcagctcaac ttaaaaaaca atattttgta 540
gagaaacaat ag 552
<210> 7
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> The amino acid sequence of the interferon ┒2 signal peptide
<400> 7
Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly
20
<210> 8
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> The second nucleic acid encoding the interferon ┒2 signal peptide
<400> 8
atggccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60
tctgtgggc 69
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> The nucleotide sequence of the third nucleic acid sequence
<400> 9
ttagaagttc tttttcaagg tcct 24
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> The base sequence of the CMV enhancer
<400> 10
gtaggcgtgt acggtgggag gcctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 60
cctgga 66
Claims (21)
- 종양용해바이러스에 있어서,
상기 종양용해바이러스의 게놈에 제1 조절 요소가 삽입되고, 상기 제1 조절 요소는 암세포 특이적 프로모터 서열, 및 상기 암세포 특이적 프로모터에 의해 구동되어 표적 암세포에서 특이적 프로테아제를 발현하는 제1 핵산 서열을 포함하며;
상기 종양용해바이러스의 게놈에 제2 조절 요소가 더 삽입되고, 상기 제2 조절 요소는 세포외 견인 신호 펩타이드를 코딩하기 위한 제2 핵산 서열 및 특이적 절단 위치를 코딩하기 위한 제3 핵산 서열을 포함하며; 상기 특이적 절단 위치는 상기 특이적 프로테아제에 의해 식별되어 절단되며;
상기 제2 조절 요소는 상기 종양용해바이러스의 필수 유전자의 5'말단에 위치되는 종양용해바이러스. - 제1항에 있어서,
상기 특이적 프로테아제는 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제(human Rhinovirus 3C Protease), 트롬빈(thrombin), Xa인자 프로테아제(Factor Xa Protease), 담배식각바이러스 프로테아제(Tobacco etch virus protease) 또는 재조합 프리시션 프로테아제(recombinant PreScission protease)이고;
바람직하게, 상기 특이적 프로테아제가 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제인 경우, 상기 특이적 절단 위치의 아미노산 서열는 LEVLFQGP이며;
상기 특이적 프로테아제가 트롬빈인 경우, 상기 특이적 절단 위치의 아미노산 서열은 LVPRGS이고;
상기 특이적 프로테아제가 Xa인자 프로테아제인 경우, 상기 특이적 절단 위치의 아미노산 서열은 IE/DGR이며;
상기 특이적 프로테아제가 담배식각바이러스 프로테아제인 경우, 상기 특이적 절단 위치의 서열은 ENLYFQG이고;
상기 특이적 프로테아제가 재조합 프리시션 프로테아제인 경우, 상기 특이적 절단 위치의 서열은 LEVLFQGP인 종양용해바이러스. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 세포외 견인 신호 펩타이드는 인터페론α2, 인터루킨 2, 인간 혈청 알부민, 인간 면역글로불린의 중쇄 또는 해양 요각류 동물 유래 루시페라제 세포외 분비 신호 펩타이드인 종양용해바이러스. - 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 조절 요소는 상기 종양용해바이러스의 필수 유전자의 오픈 리딩 프레임의 개시코돈과 제2 트리플렛 코드 사이에 위치되는 종양용해바이러스. - 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 조절 요소는 인핸서 서열을 더 포함하고, 상기 인핸서 서열은 상기 암세포 특이적 프로모터 서열과 상기 특이적 프로테아제 코딩 서열 사이에 위치하며, 상기 인핸서 서열은 상기 특이적 프로테아제의 발현을 강화하고;
바람직하게, 상기 인핸서 서열은 CMV인핸서 또는 SV40인핸서 서열인 종양용해바이러스. - 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 암세포는 폐암 세포, 간암 세포, 유방암 세포, 위암 세포, 전립선암 세포, 뇌종양 세포, 인간 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 신장암 세포, 난소암 세포, 두경부암 세포, 흑색종 세포, 췌장암 세포 또는 식도암 세포인 종양용해바이러스. - 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 암세포 특이적 프로모터는 텔로머라아제 역전사효소 프로모터, 인간 표피 성장 인자 수용체-2프로모터, E2F1프로모터, 오스테오칼신 프로모터, 암배아 항원 프로모터, 서바이빈 프로모터 및 세롤로플라스민 프로모터 중의 하나로부터 선택되는 것인양용해바이러스. - 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 종양용해바이러스는 단순헤르페스바이러스(herpes simplex virus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아바이러스(vaccinia virus), 뉴캣슬병바이러스(Newcastle disease virus), 폴리오바이러스(polio virus), 콕삭키바이러스(Coxsackie virus), 홍역바이러스(measles virus), 멈프스바이러스(mumps virus), 수포성구내염바이러스(vesicular stomatitis virus) 및 인플루엔자바이러스(influenza virus) 중의 하나로부터 선택되고;
바람직하게, 상기 종양용해바이러스가 단순헤르페스바이러스인 경우, 필수 유전자는 외피 당단백질L(envelope glycoprotein L), 우라실-DNA글리코실라제(Uracil DNA Glycosylase), 캡시드 단백질(capsid protein), 헬리카제 전구효소 서브유닛(helicase proenzyme subunit), DNA 복제 개시 결합 헬리카제(DNA replication initiation binding unwindase), 미리스트산 유도체 단백질(derived protein of myristic acid), 데옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease), 코트 세린/트레오닌 단백질 키나아제(coat serine/threonine protein kinase), DNA 패키징 터미나아제 서브유닛 1(DNA packaging terminase subunit 1), 코트 프로틴L16(coat protein UL16), DNA 패키징 단백질UL17(DNA packaging protein UL17), 캡시드 트리플렉스 서브유닛2(capsid triplex subunit 2), 주요 캡시드 단백질(major capsid protein), 외피 단백질UL20(envelope glycoprotein UL20), 핵단백질UL24(nucleoprotein UL24), DNA 패키징 단백질UL25(DNA packaging protein UL25), 캡시드 성숙 프로테아제(capsid mature protease), 캡시드 단백질(capsid protein), 외피 당단백질B(envelope glycoprotein B), 단일 가닥 DNA 결합 단백질(single-strand DNA-binding protein), DNA 폴리머라제 캐탈리틱 서브유닛(DNA polymerase catalytic subunit), 핵 탈출층 단백질(nuclear egress layer protein), DNA 패키징 단백질UL32(DNA packaging protein UL32), DNA 패키징 단백질UL33(DNA packaging protein UL33), 핵 탈출막 단백질(nuclear egress membrane protein), 라지 캡시드 단백질(large capsid protein), 캡시드 트리플렉스 서브유닛1(capsid triplex subunit 1), 리보뉴클레오티드 환원효소 서브유닛1(Ribonucleotide reductase subunit1), 리보뉴클레오티드 환원효소 서브유닛2(Ribonucleotide reductase subunit 2), 캡슐 호스트 셧오프 단백질(capsule host shutoff protein), DNA 폴리머라제 프로세싱 서브유닛(DNA polymerase processing subunit), 막단백질 UL45(membrane protein UL45), 코트 프로틴VP13/14(coat protein VP13/14), 트랜스-활성화 단백질VP16(trans-activator protein VP16), 코트 프로틴VP22(coat protein VP22), 외피 당단백질N(envelope glycoprotein N), 코트 프로틴UL51(coat protein UL51), 헬리카제-프리메이즈 프리마제 서브유닛(unwindase-primaseprimase subunit), 외피 당단백질K(envelope glycoprotein K), ICP27, 핵단백질UL55(nucleoprotein UL55), 핵단백질UL56(nucleoprotein UL56), 전사조절인자ICP4(transcription regulation factor ICP4), 조절 단백질ICP22(regulatory protein ICP22), 외피 당단백질D(envelope glycoprotein D) 및 막단백질 US8A(membrane protein US8A) 중의 하나 또는 하나 이상으로부터 선택되고;
바람직하게, 상기 종양용해바이러스가 아데노바이러스인 경우, 필수 유전자는 초기 단백질1A(early protein 1A), 초기 단백질1B 19K(early protein 1B 19K), 초기 단백질1B 55K(early protein 1B 55K), 캡시드화 단백질Iva2(encapsidation protein Iva2), DNA폴리머라제(DNA polymerase),말단 단백질 전구체pTP(terminal protein precursor pTP), 캡시드화 단백질52K(encapsidation protein 52K), 캡시드 단백질 전구체pIIIa(capsid protein precursor pIIIa), 펜톤 기질(pentomer matrix), 코어 단백질pVII(core protein pVII), 코어 단백질 전구체pX(core protein precursor pX), 코어 단백질 전구체pVI(core protein precursor pVI), 헥손(hexonmer), 프로테아제(Protease), 단일 가닥 DNA 결합 단백질(single-stranded DNA-binding protein), 헥사머 어셈블리 단백질100K(hexamer assembly protein 100K), 단백질33K(protein 33K), 캡시드화 단백질22K(encapsidation protein 22K), 캡시드 단백질 전구체(capsid protein precursor), 단백질U(protein U), 피브린(fibrin), 조절단백질 E4 오픈 리딩 프레임6/7(open reading frame 6/7 of regulatory protein E4), 조절단백질 E4 34K(regulatory protein E4 34K), 조절단백질 E4오픈 리딩 프레임4(open reading frame 4 of regulatory protein E4), 조절단백질 E4오픈 리딩 프레임3(open reading frame 3 of regulatory protein E4), 조절단백질 E4오픈 리딩 프레임2(open reading frame 2 of regulatory protein E4), 및 조절단백질 E4오픈 리딩 프레임1(open reading frame 1 of regulatory protein E4) 중의 하나 또는 하나 이상으로부터 선택되며;
바람직하게, 상기 종양용해바이러스가 백시니아바이러스인 경우, 필수 유전자는 리보뉴클레오티드 환원효소 스몰 서브유닛(ribonucleotide reductase small-subunit), 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase), DNA 결합 바이러스 코어 단백질(DNA-binding viral core protein), 폴리머라제 라지 서브유닛(polymerase large-subunit), RNA폴리머라제 서브유닛(RNA polymerase subunit), DNA폴리머라제(DNA polymerase), 설프하이드릴 옥시다제(sulfhydryl oxidase), 가상 DNA-결합 바이러스 핵단백질(hypothetical DNA-binding viral nucleoprotein), DNA-결합 인단백질(DNA-binding phosphoprotein), 바이러스 코어 시스테인 프로테이나제(Viral Core cysteine proteinase), RNA헬리카제NPH-II(RNA helicase NPH-II), 가상 메탈로프로티나제(hypothetical metalloproteinase), 전사신장인자(transcription elongation factor), 글루타티온계 단백질(glutathione-type protein), RNA폴리머라제(RNA polymerase), 가상 바이러스 핵단백질(hypothetical viral nucleoprotein), 후기 전사인자VLTF-1(late transcription factor VLTF-1), DNA-결합 바이러스 핵단백질(DNA-binding viral nucleoprotein), 바이러스 캡시드 단백질(viral capsid protein), 폴리머라제 스몰 서브유닛(polymerase small-subunit), DNA-의존성 RNA 폴리머라제 서브유닛rpo22(RNA polymerase subunit rpo22 depending on DNA), DNA-의존성 RNA 폴리머라제 서브유닛rpo147(RNA polymerase subunit rpo147 depending on DNA), 세린/트레오닌 단백질 포스파타아제(serine/threonine protein phosphatase), IMV 헤파린 결합 표면단백질(IMV heparin-binding surface protein), DNA 의존성 RNA 폴리머라제(DNA-dependent RNA polymerase), 후기 전사인자VLTF-4(late transcription factor VLTF-4), °형 DNA 토포이소머라아제(DNA topoisomerase type I), mRNA캡핑 효소 라지 서브유닛(mRNA capping enzyme large-subunit), 바이러스 코어 단백질107(viral core protein 107), 바이러스 코어 단백질108(viral core protein 108), 우라실-DNA글리코실라제(Uracil-DNA glycosylase), 트리포스파타아제(Triphosphatase), 초기 유전자 전사인자VETF의 70 kDa 스몰 서브유닛(70kDa small subunit of early gene transcription factor VETF), DNA-의존성 RNA 폴리머라제 서브유닛rpo18(RNA polymerase subunit rpo18 depending on DNA), 뉴클레오사이드 트리포스페이트 가수분해효소-I(nucleoside triphosphate hydrolase-I), mRNA캡핑 효소 스몰 서브유닛(mRNA capping enzyme small-subunit), 리팜피신 타겟(Rifampicin target), 후기 전사인자VLTF-2(late transcription factor VLTF-2), 후기 전사인자VLTF-3(late transcription factor VLTF-3), 이황화 결합 형성 경로(disulfide bond forming pathway), 코어 단백질4b 전구체p4b(precursor p4b of core protein 4b), 코어 단백질39kDa(core protein 39kDa), DNA-의존성 RNA 폴리머라제 서브유닛rpo19(RNA polymerase subunit rpo19 depending on DNA), 초기 유전자 전사인자VETF의 82kDa 라지 서브유닛(82kDa large subunit of early gene transcription factor VETF), 전사인자 VITF-3의 32kDa 스몰 서브유닛(32kDa small subunit of transcription factor VITF-3), IMV멤브레인 단백질 128(IMV membrane protein 128), 코어 단백질4a 전구체P4a(precursor P4a of core protein 4a), IMV 멤브레인 단백질131(IMV membrane protein 131), 인산화 IMV 멤브레인 단백질(phosphorylated IMV membrane protein), IMV 멤브레인 단백질 A17L(IMV membrane protein A17L), DNA헬리카제(DNA unwindase), 바이러스 DNA폴리머라제 가공인자(viral DNA polymerase processing factor), IMV멤브레인 단백질 A21L(IMV membrane protein A21L), 팔미토일 단백질(palmitoyl protein), 중간 유전자 전사인자 VITF-3의 45kDa 라지 서브유닛(45kDa large subunit of intermediate gene transcription factor VITF-3), DNA-의존성 RNA 폴리머라제 서브유닛rpo132(RNA polymerase subunit rpo132 depending on DNA), DNA 의존성 RNA폴리머라제rpo35(RNA polymerase rpo35 depending on DNA), IMV단백질A30L(IMV protein A30L), 가상적 ATP효소(hypothetical ATP enzyme), 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase), EEV 성숙 단백질(EEV mature protein), 팔미토일화된 EEV 멤브레인 당단백질(palmitoylated EEV membrane glycoprotein), IMV 표면단백질 A27L(IMV surface protein A27L), EEV멤브레인 포스포글라이코프로테인(EEV membrane phosphate glycoprotein), IEV 및 EEV 멤브레인 당단백질(IEV and EEV membrane glycoproteins), EEV 멤브레인 당단백질(EEV membrane glycoprotein), 이황화 결합 형성 경로단백질(disulfide bond forming pathway protein), 가상적 바이러스 핵단백질(hypothetical viral nucleoprotein), IMV멤브레인 단백질 I2L(IMV membrane protein I2L), 폭스바이러스 미리스토일단백질(poxvirus myristoyl protein), IMV멤브레인 단백질 L1R(IMV membrane protein L1R), 후기 16kDa 가상적 멤브레인 단백질(late 16kDa hypothetical membrane protein), 가상적 바이러스 멤브레인 단백질 H2R(hypothetical virus membrane protein H2R), IMV멤브레인 단백질 A21L(IMV membrane protein A21L), 케모카인 결합 단백질(chemokine-binding protein), 표피 성장 인자 유사 단백질(epidermal growth factor-like protein) 및 IL-18 결합 단백질(IL-18 binding protein) 중의 하나 또는 하나 이상으로부터 선택되고;
바람직하게, 상기 종양용해바이러스가 콕삭키바이러스인 경우, 필수 유전자는 단백질Vpg, 코어 단백질2A, 단백질2B, RNA헬리카제2C(RNA unwindase 2C), 단백질3A, 프로테아제3C(proteinase 3C), 역전사 효소3D(reverse transcriptase 3D), 코트 프로틴 Vp4(coat protein Vp4) 및 단백질Vp1 중의 하나 또는 하나 이상으로부터 선택되며;
바람직하게, 상기 종양용해바이러스가 홍역바이러스인 경우, 필수 유전자는 핵단백질N, 인단백질P, 매트릭스 단백질M(matrix protein M), 막횡단 당단백질F(transmembrane glycoprotein F), 막횡단 당단백질 H(transmembrane glycoprotein H) 및 RNA 의존성 RNA폴리머라제L(RNA-dependent RNA polymerase L) 중의 하나 또는 하나 이상으로부터 선택되고;
바람직하게, 상기 종양용해바이러스가 멈프스바이러스인 경우, 필수 유전자는 핵단백질N, 인단백질P, 융합 단백질F, RNA폴리머라제L(RNA polymerase L) 중의 하나 또는 하나 이상으로부터 선택되며;
바람직하게, 상기 종양용해바이러스가 수포성구내염바이러스인 경우, 필수 유전자는 당단백질G, 핵단백질N, 인단백질P 및 RNA폴리머라제L(RNA polymerase L) 중의 하나 또는 하나 이상으로부터 선택되고;
바람직하게, 상기 종양용해바이러스가 폴리오바이러스인 경우, 필수 유전자는 캡시드 단백질VP1(capsid protein VP1), 캡시드 단백질VP2(capsid protein VP2), 캡시드 단백질VP3(capsid protein VP3), 시스테인 프로테아제2A(cysteine protease 2A), 단백질2B, 단백질2C, 단백질 3A, 단백질 3B, 프로테아제3C, 단백질3D 및 RNA 매개 RNA폴리머라제(RNA-directed RNA polymerase) 중의 하나 또는 하나 이상으로부터 선택되며;
바람직하게, 상기 종양용해바이러스가 인플루엔자바이러스인 경우, 필수 유전자는 헤마글루티닌(hemagglutinin), 뉴라미니다아제(neuraminidase), 핵단백질(nucleoprotein), 멤브레인 단백질 M1(membrane protein M1), 멤브레인 단백질 M2(membrane protein M2), 폴리머라제PA(polymerase PA), 폴리머라제PB1-F2(polymerase PB1-F2) 및 폴리머라제PB2(polymerase PB2) 중의 하나 또는 하나 이상으로부터 선택되는 종양용해바이러스. - 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 종양용해바이러스의 하나 또는 하나 이상의 필수 유전자의 5'말단에 상기 제2 조절 요소가 삽입되는 종양용해바이러스. - 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 종양용해바이러스는 1형 단순헤르페스바이러스이고, 필수 유전자는 ICP27이며, 상기 암세포 특이적 프로모터는 텔로머라아제 역전사효소 프로모터이고, 상기 특이적 프로테아제는 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제이며, 상기 세포외 견인 신호 펩타이드는 인터페론α2 신호 펩타이드이고, 상기 특이적 절단 위치의 아미노산 서열은 LEVLFQGP이며; 상기 제2 조절 요소는 상기 필수 유전자의 오픈 리딩 프레임의 개시코돈ATG와 제2 트리플렛 코드 사이에 위치되고; 상기 제1 조절 요소는 상기 필수 유전자의 다운스트림에 위치되는 종양용해바이러스. - 제10항에 있어서,
상기 텔로머라아제 역전사효소 프로모터의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 4로 표시되고;
상기 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5로 표시되며;
상기 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제의 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 6으로 표시되고;
상기 인터페론α2 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 7로 표시되며; 상기 제2 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 8로 표시되고;
상기 제3 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 9로 표시되는 종양용해바이러스. - 제1항에 있어서,
상기 제1 조절 요소의 삽입 위치는 상기 종양용해바이러스의 2개의 유전자 사이인 종양용해바이러스. - 제12항에 있어서,
2개의 유전자는 2개의 필수 유전자, 또는 2개의 비필수 유전자, 또는 하나가 필수 유전자이고 다른 하나가 비필수 유전자인 종양용해바이러스. - 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 종양용해바이러스 제조용 핵산 분자에 있어서,
상기 핵산 분자는 종양용해바이러스 목표 위치에 삽입되는 삽입 서열을 갖고, 상기 삽입 서열은 상기 제1 조절 요소와 상기 제2 조절 요소를 포함하며, 상기 제1 조절 요소의 목표 위치는 상기 종양용해바이러스의 2개의 유전자 사이에 위치하고, 상기 제2 조절 요소는 상기 종양용해바이러스의 필수 유전자의 5'말단에 위치하는 종양용해바이러스 제조용 핵산 분자. - 제14항에 있어서,
상기 삽입 서열의 5'말단은 상기 목표 위치의 업스트림 서열과 상동성인 5'말단 상동성 암 서열을 갖고, 상기 삽입 서열의 3'말단은 상기 목표 위치의 다운스트림 서열과 상동성인 3'말단 상동성 암 서열을 갖는 핵샌 분자. - 제14항 또는 제15항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
- 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 종양용해바이러스의 제조 방법에 있어서,
제16항에 따른 벡터를 모 바이러스 및 보완 숙주 세포와 공동배양하여, 배양물로부터 상기 종양용해바이러스를 수집하여 얻는 단계를 포함하며;
상기 모 바이러스의 게놈 서열은 야생형 바이러스의 게놈 서열과 비교할 때, 상기 필수 유전자가 결실되고;
상기 보완 숙주 세포는 상기 필수 유전자를 발현하는 발현 서열을 포함하는 종양용해바이러스의 제조 방법. - 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 종양용해바이러스의 암 치료용 약물 제조에서의 응용.
- 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따른 종양용해바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 암 치료용 약물.
- 제19항에 있어서,
유전자 치료 약물 또는 백신을 더 포함하는 암 치료용 약물. - 피험자 질환을 치료하는 방법에 있어서,
제19항 또는 제20항에 따른 약물을 상기 피험자에 투여하는 단계; 를 포함하고,
상기 질환은 폐암, 위암, 간암, 직장암, 유방암, 전립선암, 뇌종양, 결장암, 자궁경부암, 신장암, 난소암, 두경부암, 흑색종, 췌장암 또는 식도암인 피험자 질환을 치료하는 방법.
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| E902 | Notification of reason for refusal |