CN1179470A - 用于基因治疗的含杂交启动子的核酸构建体 - Google Patents

Abstract

用于基因治疗和基因操作的含杂交启动子的核酸构建体。本发明涉及用于在宿主细胞中精确调节基因表达之核酸构建体,这种构建体显示出至少一种抑制所表达的基因正常表达的突变,并且显示出至少另一种消除由第一突变产生的抑制作用的第二突变;本发明还涉及一种分离的细胞,这种细胞含有所述的核酸构建体;本发明也涉及这种核酸构建体在制备药物和治疗具有过量细胞增殖疾病上的用途。

Description

用于基因治疗的含杂交启动子的核酸构建体

本申请涉及可以用于基因操作，特别是用于疾病预防或治疗(下文称为基因治疗)的核酸构建体。在基因治疗中，有待在有机体中表达的基因被引入到有机体中。这些基因表达的调节对基因治疗的预防和治疗效果有重要意义。

专利申请PCT/GB95/02000、PCT/EP95/03370、PCT/EP95/03371、PCT/EP95/03368和PCT/EP95/03339描述了基因表达的调节物。这些调节物包括激活物序列，其功能是，例如，细胞特异性或病毒特异性地激活基础转录。此激活物序列的DNA序列通过其3′末端和启动子组件的5′末端连接。接着结构基因通过其5′末端和此启动子组件的3′末端连接。

启动子组件由结合CDF和CHF家族或E2F和CHF家族之转录因子的核酸序列组成。在细胞周期的G0和G1期，这种结合导致上游激活物序列的抑制，结果使位于下游(即在转录方向上)的结构基因抑制或者转录。

在细胞分裂的G0和G1期，细胞含有的DNA以二倍体状态存在。在G0期，细胞处于静止状态，而在G1期，其细胞周期进程受到抑制。G1期之后是S期，此期发生DNA合成并且基因组复制。然后是G2期，此期细胞处于四倍体状态。G2期之后是细胞分裂期(有丝分裂＝M期)。然后子代细胞进入G0状态和G1状态。

在G0和G1期，细胞特异性或者病毒特异性的激活物序列和抑制激活物序列的启动子组件组合使以细胞特异性或者病毒特异性以及细胞周期特异性(即局限于S和G2期)的方式调节结构基因的表达成为可能。

激活物序列和启动子组件的组合体被称为嵌合启动子。嵌合启动子在基因治疗上有很多可能的应用，但由子其缺点也有很多限制：

这些限制的例子是：

—引起结构基因极低水平转录的弱激活物序列，

—在完全依靠细胞周期的方式中，不能被选择的启动子组件抑制的激活物序列的使用，

—对两种结构基因转录调节物(例如细胞特异性或病毒特异性和细胞周期特异性)的限制，

—已经导入细胞中的结构基因之转录产物的不充分胞内运输。

本发明通过提供本发明的核酸构建体，克服了利用已知嵌合启动子表达外源基因的这些弱点，这些核酸构建体使得可以在宿主细胞中调节外源基因的表达。

本发明的目的是使得可以获得能够在宿主细胞中以精确的方式调节外源基因(转基因)表达的核酸构建体。因此，本发明涉及核酸构建体，其中通过至少一种显示出第一突变(这种突变抑制转基因的正常表达)的核酸序列来完成转基因的精确调节，另外，其中至少另一种核酸序列显示出第二突变，这种突变消除(abolish)第一核酸序列(S)中由于突变而产生的抑制作用。

具体地说，本发明的核酸构建体通过利用可变(alternative)构建体调节宿主细胞中的转基因表达。当含有第一突变的核酸序列是转基因(b)(这种转基因包含抑制所说的转基因转录和/或翻译或者抑制药理活性化合物功能的突变)时，这种核酸构建体还包含定位于转基因5′末端的第一启动子或增强子序列(a)；或者，当含有第一突变的核酸序列是第一启动子或增强子序列(a′)(其包含抑制第一启动子功能的突变)时，核酸构建体还包含编码药理活性化合物的转基因(b′)。另外，至少一种包含第二突变的核酸序列消除由于第一突变而引起的抑制作用。

这些核苷酸序列在相同或不同启动子序列控制之下，因此转基因只有在所有启动子序列都被激活的情况下才能表达。

优选的是，新核酸构建体在5′末端至3′末端方向的阅读框架中，包含至少下列组件：

第一(I)启动子或者增强子序列(a)，其是非特异性的、细胞特异性或病毒特异性的，或者其可以被四环素或代谢性地和/或细胞周期特异性地激活，其激活转基因的转录并且包含抑制此启动子功能的突变(a′)，

作为结构基因的转基因(b′)，这种转基因编码活性化合物并且可能包含终止结构基因转录和/或翻译或者抑制结构基因产物功能的突变，

第二(II)启动子或者增强子序列(C)或(C′)，这种序列是非特异性的、细胞特异性或者病毒特异性的，或者其可以被代谢性地和/或细胞周期特异性地激活，其激活组件(d)或(d′)的基础转录并且包含抑制此启动子功能的突变，

用于消除(relieve)一种或多种启动子或者转基因中的突变的tRNA(抑制基因tRNA)或者调节蛋白质(d)或者(d′)的基因。

第一(I)启动子序列或者增强子序列(a)和第二(II)启动子序列或者增强子序列(c)可以相同或不同，并且组件a)和c)至少一种可以是可非特异性地、细胞特异性地或者病毒特异性地激活的，可由四环素或者代谢性地(特别是由氧不足)或细胞周期特异性地激活的。

本发明也涉及核酸构建体，其中所说的组件b)显示出核保留信号，这种核保留信号的cDNA在其5′末端直接或间接地和结构基因的3′末端连接，并且其中所说的核保留信号的转录产物显示出结合核输出因子的结构。

本发明也涉及核酸构建体，除组件a)和d)之外，其还含有下列组件：

—另一种激活核输出因子基础转录的启动子或增强子序列(i)，和

—编码核输出因子(k)的核酸，所说的核输出因子和核保留信号(h)的转录产物结合，进而介导转基因的转录产物从细胞核向细胞质的转运。

在本发明的上下文中，启动子序列或增强子序列a)和c)至少一种可以是嵌合启动子，其中启动子组件CDE-CHR或E2FBS-CHR和上游激活物序列(此激活物序列是可细胞特异性、病毒特异性或代谢性地激活的)相互作用，进而影响，特别是抑制下游基因的表达。

组件a)和c)也可以是激活物响应启动子单位。这种构建体也具有下列组件：

—至少一种启动子或增强子序列(e)，这种序列可以被非特异性地、病毒特异性地、代谢性地、由四环素或者细胞特异性地和/或细胞周期特异性地激活，

—至少一种激活物亚单位(f)，其位于启动子或者增强子序列(e)的下游，并且其转录由所述启动子或增强子序列(e)激活，

—激活物响应启动子(g)，其由(f)中描述的激活物亚单位或者几种相同或不同激活物亚单位(f′)的表达产物激活。

在本发明的另一个实施方案中，所述核酸构建体是这种一种核酸构建体，其中启动子序列或者增强子序列(a)和/或(c)和/或(i)和/或激活物响应启动子(g)是嵌合启动子，并且激活物亚单位(f)是至少一种激活激活物响应启动子(g)之嵌合启动子的转录因子。

本发明也涉及包含由两种激活物亚单位(f，f′)激活的激活物响应启动子(g)的核酸构建体，例如和SV40启动子结合的LexA操纵子(单体或多体)。激活物亚单位f)包括LexA DNA结合蛋白的cDNA，这种cDNA编码氨基酸1-81或1-202，其3′末端和Ga180蛋白质(氨基酸1-435)之cDNA的5′末端连接。第二激活物亚单位(f′)包含Ga14蛋白质的Ga180结合域之cDNA，这种cDNA编码氨基酸851-881，其3′末端和SV40大T抗原之cDNA(编码氨基酸126-132，其3′末端和HSV-1 VP16的反式激活域之cDNA(编码氨基酸406-488)的5′末端连接)的5′末端连接。

在另一个由两种激活物亚单位(f，f′)激活的激活物响应启动子(g)的例子中，上述的Lex A操纵基因由Ga14结合域(单个或多个连续排列)替代，而LexA DNA结合蛋白质之基因由Ga14蛋白质的DNA结合域(AA1至147)替代。

本发明也涉及核酸构建体，这种核酸构建体作为激活物响应启动子(g)，包含Ga14结合蛋白质之结合序列的单体和多体；激活物亚单位(f)包含SV40的核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；PKKKRKV，SEQ ID NO.：1)、HSV-1 VP16(氨基酸406-488)的酸反式激活域(TAD)和CDA糖蛋白(氨基酸397-435)之细胞质部分的cDNA；激活物亚单位(f)包含SV40的核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；PKKKRKV)、Ga14蛋白质(氨基酸1-147)之DNA结合域的cDNA、p56 Ick蛋白质(氨基酸1-71)之CD-4结合序列的cDNA。

在另一个激活物响应启动子单位的例子中，其中激活物的响应启动子(g)的例子是Ga14结合序列，激活物亚单位(f)的Ga180蛋白质(氨基酸1-435)之cDNA由CD4糖蛋白(氨基酸397-437；Simpson等，癌基因4：1141(1989)；Maddon等，细胞42：93(1985))之细胞质部分的cDNA替代，激活物亚单位(f)之Ga14蛋白质的Ga180结合域的cDNA(编码氨基酸851-881)由p56 Ick蛋白质的CD4结合序列之cDNA替代(氨基酸1-71；Shaw等，细胞59：627(1989)；Turner等，细胞60：755(1990)；Perfmutter等，细胞生物化学杂志38：117(1988))。

在另一个优选的实施方案中，新核酸构建体可以显示出核保留信号(NRS)，此NRS在阅读方向的下游(即通过其DNA的5′末端)和转基因(b)(即在转基因的3′末端)连接。

在另一个优选的实施方案中，核保留信号的转录产物具有结合核输出因子(NEF)的结构。核输出因子的cDNA优选通过其5′末端和另一个启动子序列或增强子序列(其与启动子序列a)和/或c)可以相同也可以不同)的3′末端连接。

核输出因子(k)优选的是选自由反转录病毒(如HIV-1或HIV-2病毒、Visna-maedi病毒、羊关节炎脑炎病毒、马传染性盆血病毒和猫免疫缺陷病毒或HTLV)的rev基因、或者hnRNP-A1蛋白质的基因、或者转录因子TFIII-A的基因组成的组。

通常，所述核酸是DNA，此新的核酸构建体惯例上用作载体，特别是质粒载体(非病毒)或病毒载体。

通常，所述的转基因是编码药理活性化合物的结构基因，这些化合物选自由细胞因子、生长因子、抗体或抗体片段、细胞因子或生长因子的受体、具有抗增殖或细胞抑制作用的蛋白质、酶、血管生成抑制剂、血栓形成诱导物质、凝结抑制剂、具有纤维蛋白溶解作用的蛋白质、血浆蛋白、补体激活蛋白、病毒包被蛋白、细菌抗原和寄生虫抗原、对血液循环具有作用的蛋白质、肽激素、核糖核酸(如核酶和反义RNA)组成的组。

在特定的实施方案中，转基因可以是编码一种蛋白质的结构基因，该蛋白质触发控制性细胞死亡。这些蛋白质的一个例子鞘磷脂酶。

在另一个实施方案中，转基因(b)可以是编码一种酶的结构基因，此酶切割药物前体形成药物。在特定的实施方案中，转基因可以是编码融合蛋白的结构基因，此蛋白由配位体和一种前述的蛋白或肽活性化合物组成。配位体可以是，例如抗原、抗原片段、细胞因子、生长因子、肽激素或者受体。在特定的实施方案中，结构基因可以编码配位体—酶融合蛋白，酶切割药物前体，进而形成药物，并且配位体结合在细胞表面，优选的是内皮细胞或肿瘤细胞的表面。

启动子序列、增强子序列或者激活物序列可以是选自由基因调节核苷酸序列组成的组，这些序列在内皮细胞、平滑机细胞、横纹肌细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞、肝脏细胞、白细胞和神经胶质细胞中激活，或者选自由HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV或HIV病毒启动子序列组成的组。

并且，激活物序列还可以是和相应抑制基因结合的四环素操纵基因。

本发明涉及包含新核酸构建体的病毒或非病毒载体，其局部或经口施用或注射到患者体内。另外，可以通过静脉内、动脉内施用新核酸构建体到体腔、器官或皮下。

本发明也涉及分离的细胞或细胞系，其含有新核酸构建体，并且局部施用或注射给患者。

这些细胞的例子是肿瘤细胞、免疫细胞(如巨噬细胞或淋巴细胞)或者内皮细胞。具有这种特性的细胞可以用于制备治疗疾病的药物，药物的制备包含将核酸构建体导入到靶细胞中。

新核酸构建体使得可以利用任何启动子、增强子或者激活物序列。

转基因(b)中或其上的新突变可以是一个或多个氨基酸的核酸序列的替代，这种替代的结果是表达的蛋白质不再具有功能。在这种情况下，组件d)是编码tRNA的核酸序列，这种tRNA，一方面通过其反密码子和转基因(b)中突变的核苷酸序列之mRNA结合，另一方面，携带给出(take up)正确氨基酸以消除转基因(b)的突变的末端基团。

然而，转基因(b)中或其上的新突变也可以是结构基因中的翻译终止密码子(这种密码子或者没有发现，或者只在哺乳动物细胞中很少地发现)，以便转基因不能被有效地翻译。在这种情况下，组件d)是一种核酸序列，一方面其编码具有反密码子的tRNA，这种反密码子和终止密码子互补，进而消除由于结构基因(b)中的翻译终止密码子引起的翻译抑制作用，另一方面，这种tRNA携带给出正确氨基酸的以消除转基因(b)的突变的末端基团。

在另一个实施方案中，转基因(b)中或其上的突变可以是启动子序列的TATA盒的突变，这种序列定位于结构基因5′末端的上游。此突变阻断结构基因转录的抑制作用。在这种情况下，组件d)是编码和突变的TATA盒结合之蛋白质进而使转录能够发生的核酸序列。

本发明还涉及通过使细胞和细胞增殖抑制量的核酸构建体接触来抑制细胞增殖的方法，所述构建体包含至少一种含有第一突变(此突变抑制转基因的正常表达)的核酸序列和至少一种含有第二突变(此突变消除由第一突变产生的抑制作用)的核酸序列。

本发明也涉及治疗患有和过量细胞增殖有关的疾病的患者的方法，其中所说的方法包括对患者施用细胞增殖抑制量的本发明的核酸构建体。核酸构建体特别有效的疾病是肿瘤及和血管中细胞增殖相关的心血管疾病。

另外，本发明涉及一种药物组合物，该组合物包含在药学上可接受的载体中的细胞增殖抑制量的核酸构建体。

附图中公开的核酸构建体只是优选实施方案的例子，无意于将本发明限制在本文公开的特定组件中。

图1A和1B描述了在可替换的方案中核酸构建体的单个组件的排列。

图2描述了激活物响应启动子单位单个组件的排列。

图3描述了核酸构建体中优选的激活物响应启动子单位。

图4描述了利用嵌合启动子构建体的激活物响应启动子。

图5A和5B描述了在可替换的方案中另一个核酸构建体的单个组件的排列。

图6描述了另一个核酸构建体中单个组件的排列。

图7描述了另一个核酸构建体中几种相同的抗肿瘤或抗炎症物质(A，A)或不同的抗肿瘤物质(A，B)之单个组件的排列。

图8描述了病毒物质A和抗病毒物质B之单个组件的排列。

图9描述了含有连接在一起的元件I和元件II的本发明杂交启动子。

图10描述了含有连接在一起的元件IIa、III及IV的本发明的杂交启动子。

图11描述了本发明优选的激活物响应启动子单位之一的核苷酸序列。

图12描述了激活物亚单位A的融合蛋白质。

图13描述了激活物亚单位B的融合蛋白质。

本发明涉及用于宿主细胞中调节转基因表达的核酸构建体，这种构建体包含至少一种含有第一突变(此突变抑制转基因的正常表达)的核酸序列，以及至少另一种含有第二突变(此突变消除第一核酸序列(S)中由突变产生的抑制作用)的核酸序列。

这些核苷酸序列在相同或不同启动子序列控制之下，因此只有在所有这些启动子序列全部被激活时，转基因才能表达。

优选的是，新的核酸构建体在5′至3′末端方向的阅读框架中包含至少下列组件：

—第一启动子或增强子序列(a)，这种序列激活转基因的转录，并且可以包含也可以不包含抑制第一启动子(a′)功能的突变，

—编码药理活性化合的的转基因(b′)，其可以包含也可以不包含突变(b)，这种突变终止转基因的转录和/或者翻译，或者抑制药理活性化合物的功能，

—第二启动子或者增强子序列(c)，此序列激活组件d)的基础转录，并且可以包含也可以不包含抑制第二启动子功能的突变，

—用于消除转基因(b)或启动子(a)或(c)至少一种中的突变的tRNA(抑制基因tRNA)或者调节蛋白质(d)的基因。

图1A和1B(方案A和B)以举例的方式描述了单个组件的排列。这些附图显示核酸构建体的可替换的实施方案。

在本发明的新核酸构建体中，组件a)或c)的启动子或增强子序列可以相同或不同，并且，组件c)和d)可以定位在组件a)和b)的上游或下游。

至少一种强启动子或者增强子序列(如来源于CMV(EP-A-0173177)或者SV40的)，或者和相应的阻遏物组合的四环素操纵基因，或者任何其它的启动子序列或者增强子序列(这些对技术人员来说都是熟悉的)优选地用作启动子或者增强子序列。

在优选的实施方案中，可以细胞特异性地、代谢性地(例如，由氧不足)、病毒特异性地或细胞周期特异性地激活新核酸构建体中至少一种启动子序列或增强子序列。

下列启动子或者增强子序列是特别优选的：

能够细胞特异性地激活内皮细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、造血细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞或肿瘤细胞的那些启动子序列或者增强子序列；和/或

HBV、HCV、HSV、HPV、CMV、EBV、HTLV或者HIV病毒的启动子或者增强子序列；和/或

可以被代谢性地激活的启动子或者增强子序列，例如氧不足可诱导的增强子(Semenza等，PNAS 88，5680(1991))或启动子(Mc Burney等，核酸研究19，5755，(1991)；WO95/21927)；和/或

可以被细胞周期特异地激活的启动子，如cdc25C基因、细胞周期蛋白A基因、cdc2基因的启动子(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995)，Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)，Zwicker等，核酸研究23，2833(1995)；B-myb基因启动子(Lam等，EMBO J.12，2705(1995)；DHFR基因启动子(Means等，分子细胞生物学12，1054(1992)和EI-1基因启动子(Johnson等，基因进展8，1514(1994)，Hsiao等，基因进展8，15256(1994))或者其它结合转录因子的序列(这种序列在细胞增殖期间出现或激活)。这些结合序列的例子是被称为Myc E盒的核苷酸序列的单体或多体(Blackwood和Eisenmam，科学251，1211(1991))。

还有可以由四环素激活的启动子(如和相应的阻遏物组合的四环素操纵基因(Gos sen等，TIBS 18，471(1993)，Dingermann等，EMBO J.11，1487(1992)，Gossen等，科学268，1766(1995)也是本发明范围内可以利用的。

在另一个优选的实施方案中，新核酸构建体中至少一种启动子序列或者增强子序列是嵌合启动子。在本发明中，嵌合启动子是上游激活序列(其可以被细胞特异性地、代谢性地或者病毒特异性地激活)和下游启动子组件的组合体。优选的是，该启动子组件包含含有CDEE-CHR元件或者E2FBS-(Bmyb)-CHR元件的核苷酸序列，因此能够在细胞周期的G0和G1期抑制上游激活物序列的激活(Lucibello等，EMBO J.14，132(1994)，PCT/GB95/02000；Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)；Zwicker等，科学271，1595(1996))。

在另一个优选的实施方案中，新核酸构建体中至少一种启动子序列或者增强子序列(组件a)或c))是激活物响应启动子单位。

对此部分来说，激活物响应启动子由下列组件组成：—一种或多种相同或不同启动子或者增强子序列(s)(e)，这种序列可以被，例如，细胞周期特异性地、代谢性地、细胞特异性地或病毒特异性地激活，或者可以被细胞周期特异性地与和代谢性地、细胞特异性地或病毒特异性地激活(所谓的嵌合启动子)，

—一种或几种相同或者不同的激活物亚单位(s)(f)，其在任何情况下都定位在启动子或者增强子序列的下游并且这些序列激活其基础转录；

—由一种或几种激活物亚单位(s)的表达产物激活的激活物响应启动子(g)。

附图2的方案C以举例的方式描述了激活物响应启动子之单个组件的排列。

附图3的方案D)以举例的方式描述了新核酸构建体中优选的激活物响应启动子的插入。

在激活物响应启动子单位最简单的形式中，其可以是，例如，如附图4的方案E所描述的嵌合启动子构建体。

在另一个实施方案中，按照本发明的激活物响应启动子可以是结合嵌合转录因子的序列，这些序列由DNA结合域、蛋白质和蛋白质相互作用域和反式激活域组成。作为药理活性化合物优选的结构基因是蛋白质和糖蛋白，这些蛋白质选自由细胞因子、生长因子、细胞因子或生长因子受体、抗体或抗体片段、配位体(如抗体或抗体片段)和细胞因子或者生长因子组成的融合蛋白质、具有抗增殖或细胞抑制作用的蛋白质、血管形成抑制因子、血栓形成诱导蛋白质、凝结抑制因子、血浆蛋白质、补体激活蛋白质、病毒包被物质和细菌包被物质。

按照本发明，在一个特定的实施方案中提供了具有突变(此突变阻止功能蛋白质(或肽)的表达)的结构基因(转基因-组件b))。

此突变可以由一个或几个氨基酸的核苷酸序列替代，替代的结果是表达的蛋白质不再具有功能(错义突变)，即不再产生任何活性化合物或任何功能酶。在结构基因(转基因-组件b))发生这种特性的突变时，组件d)是编码tRNA的核苷酸序列，这种tRNA一方面通过其反密码子和结构基因(组件b))之mRNA的突变位点结合，另一方面携带给出正确氨基酸以消除转基因(抑制基因tRNA)中的突变的末端基团。

在上下文中，正常情况下，只很少地用于哺乳动物细胞中的那些tRNA将，具体地说，突变成抑制基因tRNA，以使细胞总翻译效率的负结果最小化。

在另一个实施方案中，结构基因的突变是引入了一个或多个翻译终止密码子(无义突变)。已知mRNA中的核苷酸序列UAA、UGA和UAG是翻译终止密码子。这些终止密码子相应的DNA序列是DNA的TAA、TGA和TAG编码链。这些终止密码子之一作为突变优选地插入到结构基因(组件b))的DNA序列中。

基因结构基因(组件b))发生这种特异的突变时，组件d)是编码tRNA(抑制基因tRNA)的核酸序列，这种tRNA，一方面通过其反密码子和突变，即和结构基因(组件b))之mRNA的导入的终止密码子结合，另一方面，携带给出正确氨基酸(这些氨基酸在突变的位点上由原来的DNA序列编码)的末端基团，已经描述了大肠肝菌、酵母和植物细胞中这种特性的核酸序列(b)(Dingermann等，分子细胞生物学12，4038(1992)，EMBO J.11，1487(1992)；Gossen等TIBS 18，471(1993)；Gatz等，植物杂志2，397(1992))。按照本发明，正常情况下在哺乳动物中只很少使用的tRNAs，在这种情况下，也突变成抑制基因tRNAs。

这样，例如，可以选择下列组合体(Lewin编辑，基因IV，牛津大学出版1990，151页)：

          表1氨基酸  密码子终止突变  抑制基因tRNA  和抑制基因tRNA  基因座

       (密码子)     (反密码子)    联系的氨基酸Tyr       UAU  UAG         CUA           Tyr          sup F(su⁺3)Tyr       UAC  UAA         UUA           Tyr          sup C(su⁺4)Ser       UCG  UAG         CUA           Ser          sup D(su⁺1)Gln       CAG  UAG         CUA           Gln          sup E(su⁺2)Lys       AAA  UAA         UUA           Lys          sup G(su⁺5)Lys       AAG  UAG         UUA           Lys          sup G(su⁺5)TrP       UGG  UGA         UCA           Trp          sup U(su⁺7)Trp            UGG         UCA           Trp          sup U(su⁺7)

在另一个实施方案中，结构基因(组件b)中或其上的突变可以是位于结构基因5′末端上游之启动子序列(组件a))的TATA盒的突变。TATA盒(TATAAA)被认为是RNA聚合酶II和III的中央起始位点，这些聚合酶出现在细胞核中。通过和TATA盒结合蛋白质(TBP)的结合，转录在TATA盒起始，在实质性的方式中，TBP和出现在细胞核中的所有RNA聚合酶(I、II、III)的转录相关。严格依赖TATA盒的启动子的例子是U6基因的启动子，此基因通过RNA聚合酶III转录，并且该基因产物以实质性的方式和mRNA的剪接相关。

按照本发明，依赖于突变的TATA盒的启动子(组件a))定位于结构基因(组件b))的5′末端上游。这种变突的例子可以是TGTAA。突变的结果是不再能识别正常TBP的DNA结合位点，并且结构基因(b)不再有效地转录。在发生这种特性的突变时，组件d)是编码共突变的TBP的核酸序列。共突变的结果是，TBP和组件a)中突变的TATA盒(例如和TGTAAA)结合，结果引起结构基因(组件b))的有效转录。TBP基因的这种共突变已由，例如，Strubin和Struhl(细胞68，721(1992))和Heard等(EMBO J.12，3519(1993)描述。

在另一个优选的实施方案中，在合适的位点将核保留信号(NRS)(h)和核输出信号加入到新核酸构建体中，附图5的方案F)和G)描述了新核酸构建体中单个组件的排列。

在另一个优选的实施方案中，方案F)和G)描述的核酸构建体彼此组合。这种方式的组合能够包括另一个启动子(启动子IV，组件e))。附图6的方案H)通过举例的方式描述了这种组合中单个组件的排列。

核保留信号是阻止前信使RNA转运的核苷酸序列，前信使RNA通过核膜和其连接，但另一方面，前信使RNA组成结合输出蛋白质(被称为核输出因子)的结构。核输出因子(NEF)介导含有NRS的前信使或者信使RNA从细胞核向细胞质的转运。含有NRS的前信使或信使RNA通过和NEF结合，结果由细胞核分泌出(Fischer等，细胞82，475(1995))。

NRS(组件h))优选的是反转录病毒rev响应元件(RRE)序列。在HIV-1中RRE是env基因(malim等，自然338，254(1989)；kjems等，PNAS 88，683(1991))中的包含243个核苷酸(核基酸7362-7595；Muesing等，自然313，450(1985)的序列。然而，在本发明中，核保留信号(NRS)也可以是同源和/或功能相似(类似)的核苷酸序列，例如HBV病毒的RRE等同元件(Huang等，分子细胞生物学13，7476(1993))。

在新核酸构建体中，核输出因子(NEF，组件K)是编码结合NRS之mRNA蛋白质的核苷酸序列，并且介导包含NRS的前信使RNA或信使RNA从细胞核转运到细胞质(或者从细胞质到细胞核)。在本发明的上下文中，具体使用来源于反转录病毒的rev基因，特别是来源于HIV-1病毒或HIV-2病毒的基因(Daly等，自然342，816(1989)；Emerman等，细胞57，1155(1989)；Felber等，PNAS 86，1495(1989)；Fischer等，EMBO J.13，4105(1994))。

反转录病毒的rev基因之rev蛋白通过其N末端域(Zapp等，自然342，714(1989)；malim等，细胞65，241(1991))和前信使mRNA的RRE结合(Iwai等，核酸研究20，6465(1992))。RRE和rev蛋白质的结合使非剪接的前信使RNA以及任何其它含有RRE的RNA从细胞核转运到细胞质中(Fischer等，EMBO J.13，4105(1994)；Fischer等。细胞82，475(1995))，结果实质上是增加了翻译。

在本发明的上下文中，编码和HIV-1 rev蛋白质同源且功能相似之蛋白质(Bogerd等细胞82，485(1995)的核苷酸序列(如visna maedi病毒(VMV；Tiley等，病毒学杂志65，3877(19917)rev基因，或风湿性关节炎脑炎病毒(CAEV；Tiley等，病毒学杂志65，3877(19917)rev基因)也可以用作NEF。

然而，在本发明的上下文中，也可以利用那些编码和HIV-1 rev蛋白质功能相似之蛋白质(在该蛋白质和rev蛋白质只具有很少的同源性或没有同源性时)的基因。

这些基因的例子是HTLV-1 rex基因(Cullen，微生物学综述56，375(1992)、马传染性盆血病毒(EIAV)rev基因和猫免疫缺陷病毒(FIV)rev基因(manusco等，病毒学杂志68，1988(1994))。

在另一个实施方案中，NEF也可以是一种蛋白质的核苷酸序列，这种蛋白质引起RNA从细胞核中分泌，甚至细胞核中没有由NRS保留的这种RNA。这种蛋白质的例子是转录因子TFIIIA(Gaddat等，细胞60，619(1990)；Drew等，基因159，215(1995)或核内不均一核糖核蛋白复合体A1(hnRNPA1-蛋白质；Pinol-Roma等，自然355，730(1992))。

广义来讲，核转运蛋白质也包括热激蛋白70(hsc 70；mandell等，细胞生物学杂志111，1775(1990))和蛋白激酶抑制剂CPKI(Fantozzi等，生物化学杂志269，2676(1994)，Wen等，生物化学杂志269，32214(1994))。

NEF和其同源及相似蛋白质共有的特性是位于氨基末端用于单体蛋白质和NRS之RNA结合的域，以及大多数富含亮氨酸(hnRNPA1是一个例子)且对NEF运输功能是必需的域(Wen等，细胞82，463(1995)；Fischer等，细胞82，475(1995)；malim等，病毒学杂志65，4248(1991)；Venkatesh等，病毒学178，327(1990))。

NEF基因(组件k))的表达可能在启动子序列(组件i)＝启动子和增强子序列III)的控制之下，这种启动子序列位于NEF基因5’末端的上游。

可以选择如已经描述的用于启动子和增强子序列I和II(组件a)和c))的核酸序列之一可以选择来用作按照本发明的启动子和增强子序列III或IV(参见附图6的方案H)。

核酸构建体优选由DNA组成。术语“核酸构建体”被理解为指可以在靶细胞中转录的人工核酸结构。其最好是插入到载体中，特别优选的是非病毒载体、质粒载体或病毒载体。这些载体和药学上可接受的载体混合，以产生用于基因治疗的药物组合物。药学上可接受的载体对本领域的技术人员是公知的，并且含有核酸构建体的优选剂量可以通过方便的技术很容易确定。然后将药物组合物局部施用给患者，用于疾病的预防和治疗，或者注射或者通过静脉内、动脉内施用到体腔、器官或皮下。在治疗肿瘤时，将药物组合物直接注射到肿瘤中。然而，可以利用其它已知的通过合适载体的给药方法(例如以导管为基础的基因治疗)。

由于术语“治疗”涉及对患者施用包含本发明的核酸构建体之载体，其应当理解为包括对患者给药，以用于疾病的预防和改善。这些载体对过量细胞增殖的疾病特别有用。

新核酸构建体可以用于与结构基因一起细胞特异性地、或病毒特异性地、或在限定的代谢条件下或在暴露于四环素下后和细胞周期特异性地表达转基因(组件b))，所述结构基因优选的是编码药理活性化合物或其它切割非活性药物前体形成活性药物的酶的基因。可以选择结构基因，以便药理活性化合物或酶和配体一起作为融合蛋白质表达，这种配体和细胞(如增殖内皮细胞或肿瘤细胞)表面结合。

本发明也涉及含有新核酸构建体的酵母细胞或哺乳动物细胞。在特别优选的实施方案中，将核酸构建体导入到转染后可用作转基因表达的细胞系中。结果这些细胞可用作制备用于患者的药物，并且也局部施用给或注谢到患者体内，以便用于疾病的预防或治疗。

新核酸构建体实际上不能以这种形式出现，即活性化合物或酶或配体/酶融合蛋白质的转基因或结构基因不能天然地突变和不能天然地与消除这种突变的核酸序列组合；并且，其也不能天然地与核保留信号(NRS)组合，同时这两种序列都不能与启动子I(a)及启动子II(c)天然组合，这种组合体依次不能与由启动子III和核输出因子(NEF)组成的核苷酸序列天然组合。

作为应用的函数选择新核酸构建体的启动子I、II、III和IV以及活性化合物(或者酶)的结构基因。

根据核酸构建体计划的用途，可以选择下列实施方案：

1.通过抑制增殖的内皮、治疗肿瘤和慢性炎症

1.1a)在内皮细胞中激活的启动子或者增强子序列的选择

在本发明的上下文中，由启动子或者增强子组成的优选的启动子或者增强子序列包括那些基因调节序列和/或编码蛋白质的基因元件，所述蛋白质具体地说可以在内皮细胞中(或者在其它和增殖内皮细胞极接近的细胞中)检测到。

Borrow等(药物理论64，155(1994))和Plate等(脑病理学，4，207(1994))描述了这些蛋白的一部分。这些内皮细胞特异性蛋白质的特定例子是：

-人脑特异性，内皮葡萄糖-I-转运蛋白

 Murakami等(生物化学杂志267，9300(1992))描述了启动子序列。

-Endoglin

 Bellon等(欧洲免疫学杂志23，2340(1993)))和Ge等(基因138，

 201(1994))描述了启动子序列的一部分。

-VEGF受体

识别了两种不同的受体(Plate等，国际癌杂志(Int.J.Cancer)59，

520(1994))：

·VEGF受体-1(flt-1)

(de Vries等，科学255，989(1992)；Wakiya等血管研究杂志33，

105(1996))和

·VEGF受体-2：(flk-1，KDR)

(Terman等BBRC 187，1579(1992))。

这两种受体都只在内皮细胞中发现(Senger等，癌迁徒研究12，303(1993))。

-其它内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶

·til-1和til-2

(Partanen等，分子细胞生物学12，1698(1992)，Schniirch和

Risau，发育19，957；Dumont等，癌基因7，1471(1992))

·B61受体(Eck受体)

(Bartley等，自然368，558(1994)，Pandey等，科学268，

  567(1995)；van der Geer等，细胞生物学年度综述10，251(1994))

-B61

 B61分子是B61受体的配位体(Holzman等，美国肾学会杂志4，

 466(1993)；Bartley等，自然368，558(1994))

-特别是内皮

·内皮B

   Benatti等(临床研究杂志91，1149(1993))描述了启动子序列。

·内皮-1

   Wilson等(分子细胞生物学10，4654(1990))描述了启动子序列。

-内皮受体，特别是内皮B受体

(Webb等，分子病理学47，730(1995)；Haendler等，心血管病理

学杂志20，1(1992))。

-甘露糖-6-磷酸盐受体

Ludwig等(基因142，311(19949)；Oshima等，生物化学杂志263，

2553(1988))和Pohlmann等(PNAS US 84，5575(1987))描述了启动子

序列。

-von Willebrand因子

Jahroudi和Lynch(分子细胞生物学14，999(1994))、Ferreira等(生物化学杂志293，641(1993))和Aird等(PNAS US 92，4567(1995)))描述了启动子序列。

-IL-1α，IL-1β

Hangen等(分子致癌物质2，68(1986))、Terner等(免疫学杂志143，3556(1989))、Fenton等(免疫学杂志138，3972(1987))、Bensi等(细胞生长分化1，491(1990))、Hiscott等(分子细胞生物学13，6231(1993))和Mori等(血液84，1688(1994))描述了启动子序列。

-IL-1受体

Ye等(PNAS US 90，2295(1993))描述了启动子序列。

-血管细胞附着分子(VCAM-1)

Neish等(分子细胞生物学15，2558(1995))、Ahmad等(生物化学杂志270，8976(1995))、Neish等(实验医学杂志176，1583(1992))、Jademarco等(生物化学杂志267，16323(1992))和Cybulsky等(PNAS US88，7859(1991))描述了VCAM-1启动子序列。

-合成的激活物序列

作为天然的内皮特异性启动子的一种替换，也可以利用合成的激活物序列，这种序列包含在内皮细胞中是优先或选择性活性的转录因子之寡聚结合位点。这种转录因子的例子是转录因子GTTA-2，其在内皮细胞um-基因中的结合位点是5-TTATCT-3′(Lee等，生物化学杂志266，16188(1991)；Dorfmann等，生物化学杂志267，1279(1992)和Wilson等，分子细胞生物学10，4854(1990))。

1.1.b)在激活的内皮细胞附近之细胞中激活的启动子或者激活物序列

的选择

当内皮细胞进行增殖时，通过打开紧密接头，相邻的细胞变得能够使来源于血液的大分子进入。这种功能和结构相互作用的结果是，和激活的内皮细胞邻近之细胞成为本发明意义之内的靶细胞。

-VEGF

VEGF基因的基因调节序列是

·VEGF基因的启动子序列(5′侧翼区)(Michenko等，细胞分子生物学研究40，35(1994)；Tischer等，生物化学杂志266，11947(1991))或者

·VEGF基因的增强子序列(3′侧翼区)(Michenko等，细胞分子生物学研究40，35(1994))或者

·C-Src基因

(Mukhopadhyay等，自然375，577(1995)；Bonham等，癌基因8，1973(1993)；Parker等，分子细胞生物学5，831(1985)，Anderson等，分子细胞生物学5，112(1985))或者

·V-Src基因

(Mukhodpadhyay等，自然375，577(1995)；Anderson等，分子细胞生物学5，112(1985)；Gibbs等，病毒学杂志53，19(1985))

-类固醇激素受体和他们的启动子组件(Truss和Beato，内分泌学研究14，459(1993))，特别是

·小鼠乳房肿瘤病毒启动子

Chalepakis等(细胞53，371(1988))及Truss和Beato(内分泌学研究14，459(1993))描述了MMTV长末端重复区的启动子区之cDNA序列。

 1.2.抗肿瘤(或者抗炎症)物质的结构基因

1.2.a)增殖抑制剂

在本发明中，抗肿瘤或者抗炎症物质应理解为抑制内皮细胞增殖之蛋白质的DNA序列。这种DNA序列的例子是以下蛋白质的DNA序列：

-成视网膜细胞瘤蛋白质(pRb/p110)或者其类似物p107和120

-p53蛋白质

-p21(WAF-1)蛋白质

-p16蛋白质

-其它CdK抑制蛋白

-GADD45蛋白质

-bak蛋白质。

为了阻止这些细胞周期抑制剂在胞内迅速失活，优选使用在表达蛋白质的失活位点显示出突变，因而这些蛋白质的功能没有受到破坏的那些基因。

成视网膜细胞瘤蛋白质(pRb)和相关的p107和p130蛋白质通过磷酸化灭活。优选使用发生点突变的pRb/p110、p107或者p130 cDNA序列，这样编码蛋白质的磷酸化位点由不能磷酸化的氨基酸替代。

1.2.b)凝结诱导因子和血管形成抑制剂

抗肿瘤或者抗炎症物质也将理解为诱导凝结和/或者抑制血管形成之蛋白质的DNA序列。这些蛋白质的例子是：

-组织因子(TF)和其凝结活性片段

(Morrissey等，细胞50，129(1987)；Scarpati等，生物化学26，5234(1987)；Spicer等，PNAS US 84，5148(1987)；Rehemtulla等，Thromb.Heamost.65，521(1991))

-血纤维蛋白溶酶原激活抑制剂-1(PAI-1)

-PAI-2

-PAI-3

Angiostatin和类似的抗血管生成肽(O′Reilly等，自然医学2，689(1996)；Folkman等，新英格兰医学杂志26，1757(1995))

-干扰素

·IFNα

·IFNβ

·IFNγ

-Thrombospondin

-TNFα

-血小板因子4

-IL-2

-TIMP-1

-TIMP-2

-TIMP-3

-白血病抑制因子(LIF)

1.2.c)细胞抑制和细胞毒素蛋白质

然而，抗肿瘤或者抗炎症物质也应理解为对肿瘤细胞直接或者间接显示出细胞抑制作用的蛋白质之DNA序列。具体地说，所述蛋白质包括：

-抗体或抗体切割产物

-穿孔素

-粒酶

-IL-2

-IL-4

-IL-12

-干扰素，例如

·IFNα

·IFNβ

·IFNγ

-TNF

·TNFa

·TNFB

-制瘤素M

-神经磷脂酶

(Jarvis等PNAS-美国91，73(1994))

-瓜蟾抗菌肽和瓜蟾抗菌肽衍生物

(Cruciani等，PNAS 88，3792(1991)；Jacob等，Ciba Found.Symp.186，197(1994)；Peck-Miller等，癌化学疗法药理学32，109(1993))

1.2.d)感染诱导物

抗肿瘤物质也应理解为这样一种蛋白质的DNA序列，这种蛋白质除了其抗肿瘤作用外，也能刺激感染，进而有助于肿瘤细胞的消除。这些蛋白质特定的例子是：

-RANTES(MCP-2)

-单核细胞趋化性和激活因子(MCAF)

-IL-8

-巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1α和-β)

-嗜中性白细胞活化因子-2(NAP-2)

-IL-3

-IL-4

-IL-5

-人类白血病抑制因子(LIF)

-IL-7

-IL-11

-IL-13

-GM-CSF

-G-CSF

-M-CSF

-眼镜蛇毒因子(CVF)或它的部分序列，其功能相当于人类补体因子C3b，即其能够和补体因子B结合，在用因子D切割之后，形成C3转化酶。Frikinger等(美国科学院学报91，12775(1994))公开了CVF的DNA序列和其部分序列。

-人类补体因子C3和它的部分序列C3b。De Bruijn等(美国科学院学报82，708(1985))公开了C3的DNA序列及其部分序列。

-和CVF功能及结构类似的人类补体因子C3的切割产物。OKeefc等(生物化学杂志263，12690(1988))描述了这种特性的切割产物。

-激活补体或者触发炎症的细菌蛋白质，如Salminella typhimurium膜孔蛋白(Galdiero等，感染和免疫性46，55(1994))、金黄色酿脓葡萄球菌丛生因子(Espersen ACTA Path.Microb.Et Imm.Scandin.Sect C93，59(1985))、modulins，特别是那些革兰氏阴性细菌(Henderson等，炎症研究44，187(1995))、军团菌属的主要外部膜蛋白(Bellinger-Kawahara等，实验医学杂志172，1201(1990))、或者嗜血菌属的流感B型(BHetherington等，感染和免疫60，852(1992))、或者来源于克雷伯氏菌属(Alberti等，感染和免疫61，852(1992))、或者来源于链球菌属G族的M分子(Campo等，传染病杂志171，601(1995))。

融合蛋白的DNA序列，一方面其在所列出的细胞因子或生长因子和细胞膜上的受体配位体(例如，内皮细胞或肿瘤细胞特异性的抗体，或者人类免疫球蛋白的Fc部分)之间形成，另一方面，其可作为本发明的活性物质。已经描述了例如在EPA 0464 633 A1中具有这种性质的DNA序列。

1.2.e)用以激活细胞抑制剂前体的酶

然而，抗肿瘤或者抗炎症物质也应理解为一种酶的DNA序列，这种酶能够把抗肿瘤活性化合物的前体转化成为抗肿瘤活性化合物。

Deonarain等(英国癌症杂志70，786(1994))、Mullen(药物治疗63，199(1994))和Harris等(基因治疗1，170(1994))已经描述了具有这种特性的酶(其切割非活性前体物质(前药物(prodrugs)，进而形成在每种情况下相关的活性细胞抑制剂(药物)、前体药物和药物)。

例如，下列酶之一的DNA序列可被使用：

-单纯疱疹病毒胸苷激酶

(Garapin等，PNAS US 76，3755(1979)；Vile等，癌研究，53，3860(1993)；Wagner等，PNAS US 78，1441(1981)；Moelten等，癌研究46，5276(1986)；国家癌症协会杂志82，297(1990))

-水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶

(Huber等，PNAS US 88，8039(1991)，Snoeck，完美抗菌剂杂志(Int.J.Antimicrob.)4，211(1994))

-细菌硝酸还原酶

(Michael等，FEMS微生物学通讯125，195(1994)；Bryant等，生物化学杂志266，4126(1991)；Watanabe等，核酸研究。18，1059(1990))

-细菌β-葡萄糖醛酸酶

(Jefferson等，PNAS US 83，8447(1986))

-Secale cereale的植物β-葡萄糖醛酸酶

(Schulz等，植物化学26，933(1987))

-人类β-葡萄糖醛酸酶

(Bosslet等，英国癌症杂志65，234(1992)；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))

·例如，人类羧肽酶(CB)，

·肥大细胞CB-A

(Reynolds等，临床研究杂志89，273(1992))

·胰CB-B

(Yamamoto等，生物化学杂志267，2575(1992)；Catasus等，生物化学杂志270，6651(1995))

·细菌羧肽酶

(Hamilton等，细菌学杂志174，1626(1992)；Osterman等，蛋白质化学杂志11，561(1992))

-细菌β-内酰胺酶

(Rodrigues等，癌研究55，63(1995)；Hussain等，细菌学杂志164，223(1985)；Coque等，EMBO J.12，631(1993))

-细菌胞嘧啶脱氨酶

(Mullen等，PNAS US 89，33(1992)；Austin等，分子药理学43，380(1993)；Danielson等，分子微生物学6，1335(1992))

-人类过氧化氢酶或者过氧物酶

(Ezurum等，核酸研究21，1607(1993))

-磷酸酶，特别是

·人类碱性磷酸酶

(Gum等，癌研究50，1085(1990))

·人类酸性前列腺磷酸酶

(Sharieff等，美国人类基因杂志49，412(1991)；Song等，基因129，291(1993)；Tailor等，核酸研究18，4928(1990))

·5型酸性磷酸酶

(基因130，201(1993))

-氧化酶，特别是

·人类赖氨酰氧化酶

(Kimi等，生物化学杂志270，7176(1995))

·人类酸性D-氨基氧化酶

(Fukui等，生物化学杂志267，18631(1992))

-过氧化物酶，特别是

·人类谷胱甘肽过氧化物酶

(Chada等，基因组学6，268(1990)；Ishida等，核酸研究15，10051(1987))

·人类嗜酸性细胞过氧化物酶

(Ten等，实验医学杂志169，1757(1989)；Sahamaki等，生物化学杂志264，16828(1989))

·人类甲状腺过氧化物酶

(Kimura，PNAS US 84，5555(1987))。

-半乳糖苷酶

为了有利于所列出酶的分泌，在每种情况下都包含在DNA序列中的同源信号序列可以由促进胞外分泌的异源信号序列代替。

这样，β-葡萄糖醛酸酶的信号序列(DNA位点≤27-93；Oshima等，PNAS84，685(1987))可以由，例如，免疫球蛋白的信号序列(DNA位点≤63-≥107；Riechmann等，自然332，323(1988))或者由CEA的信号序列(DNA位点≤33-≥134；Schrewe等，分子细胞生物学10，2738(1990)，Berling等，癌研究50，6534(1990))或者由人类呼吸合胞体病毒糖蛋白的信号序列(氨基酸的cDNA≤38-≥50或48-65；Lichtenstein等，普通病毒学杂志77，109(1996))替代。

此外，优选的是选择这些酶的基因，作为点突变的结果，这些酶只很少地储存在溶酶体中，并以增加的程度分泌。已经描述了这种性质的点突变，例如，β-葡萄糖醛酸酶的(Shiplex等，生物化学杂志268，12193(1993))。

另外(或者此外)，可以将跨膜域的序列导入到信号序列中，目的是将酶锚定在酶形成细胞的细胞膜上。

这样，可以将人类巨噬细胞菌落激活因子的跨膜序列(DNA位点≤1485-≥1554；Cosman等，Behring.Inst.Mitt.83，15(1988))、或者人类呼吸合胞体病毒(RSV)糖蛋白G的信号及跨膜域之DNA序列(氨基酸1-63或者它们的部分序列，氨基酸38-63；  Vijaya等，分子细胞生物学8，1709(1988)；Lichtenstein等，普通病毒学杂志77，109(1996))、或者流感病毒神经氨酸酶之信号及跨膜域的DNA序列(氨基酸7-35或者其部分序列(氨基酸7-27)；Brown等，病毒学杂志62，3824(1988))插入到启动子DNA序列和酶(例如D-葡萄糖醛酸酶)的DNA序列之间。

为了扩大翻译，可以将核苷酸序列GCCACC或者GCCGCC插入到信号及跨膜序列启动子的3′末端，并恰好在起始信号(ATG)的5′末端之前(Kozak，细胞生物学杂志108，299(1989))。

然而，为了将酶锚定在酶形成细胞的细胞膜上，也可以插入糖磷化物锚的核苷酸序列。

将糖磷化物锚的核苷酸序列插入到该酶核苷酸序列的3′末端；这种插入可以是除信号序列之外的插入。

已经描述了糖磷化物锚，例如，CEA(DNA位点≤893-≥1079；Berling等，癌研究50，6534(1990))、N-CAM(Cunningham等，科学236，799(1987))和其它跨膜蛋白(如Thy-1)(Clissold，生物化学杂志281，129(1992))或者CD16(Selvaray等，自然333，565(1988))。

Ferguson等(生物化学年度综述57，285(1988))已经出版了锚定糖磷化物膜蛋白的综述。

按照本发明，另一个细胞膜锚定酶的选择是利用配位体-酶融合蛋白的DNA序列。这种融合蛋白的配位体的特异性直接针对存在于增殖的内皮细胞或者肿瘤细胞之细胞膜上的膜结构。

和增殖的内皮细胞表面结合的配位体包括，例如，直接针对于内皮细胞膜结构的抗体和抗体片段，这一点已经描述过，例如，Burrows等(药物治疗64，155(1994))、Hughes等(癌研究49，6214(1989))和Maruyama等(PNAS US 87，5744(1990))。特别是，它们包括VEGF受体的抗体。

优选的是利用人源化形式的鼠单克隆抗体。以Winter等(自然349，293(1991))和Hoogenbooms等(V.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993))描述的方法实现人源化。按照本领域的方法制备抗体片段，例如，以Winter等(自然349，293(1991))、Hoogenbooms  等(V.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993))、Girol.Mol.Immunol.28，1379(1991)或者Huston等(国际免疫学综述10，195(1993))描述的方法制备。

并且，配位体包括所有和内皮细胞的膜结构或者膜受体结合的活性化合物。这些活性化合物包括，例如，含有末端甘露糖的物质、还有IL-1或生长因子或它们的片段、或部分序列(它们都和内皮细胞表达的受体(如PDGF，bFGF，VEGF，TGGO(Pusztain等，病理学杂志169，191(1993)))结合)、或者细胞分裂素和细胞分裂素的衍生物或类似物。它们还包括和激活的和/或增殖的内皮细胞结合的附着分子。已经描述了具有这种特性的附着分子，例如，Slex、LFA-1、MAC-1、LeCAM-1、CLA-4或者玻连蛋白和其衍生物或类似物(Augustin-Voss等的综述，细胞生物学杂志119，483(1992)；Pauli等，癌转移综述9，175(1990)；Honn等，癌转移综述11，353(1992)；Varner等，细胞附着和共有3，367(1995))。)

然而，配位体也包括抗体或者他们的片段，这些物质直接针对于肿瘤细胞膜上的肿瘤特异性或肿瘤结合性抗原。

Sedlacek等(辅助肿瘤学(Contrin.Oncol.)32(1988)和辅助肿瘤学43(1992))给出了具有这种性质的抗原和相关抗体。已经描述了抗体-酶融合蛋白，例如，Bosslet等，英国癌研究65，234(1992)。为了有利于所引用的配位体/酶融合蛋白质的分泌，在每种情况下都包含在酶DNA序列中的同源信号序列(如已经描述过的)可以由促进胞外分泌的异源信号序列代替。

1.3.几种抗肿瘤或者抗炎症物质的组合

本发明也涉及包含几种相同的抗肿瘤或抗炎症物质(A，A)或者不同的抗肿瘤物质(A，B)之组合的核酸构建体。为了表达这两种DNA序列，优选将内部核糖体进入位点(IRES)的cDNA作为调节组件插入其中。(参见图7)。

例如，Mountford和Smith(TIG 11，179(1995))、Kaufman等(核酸研究19，4485(1991))、Morgan等(核酸20，1293(1992))、Dirks等(基因128，247(1993))、Pelletier和Sonenberg(自然334，320(1988))和Sugitomo等(生物技术12，694(1994))已经描述了具有这种特性的IRES。

这样，脊髓灰质炎病毒IRES序列的cDNA(位点≤5′UTR的140-≥630；Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988))可以用于和抗炎物质A的DNA(3′末端)和抗炎物质B的DNA(5′末端)连接。

取决于组合，具有这种特性的活性化合物在本发明的范围内具有加和(A+A，A+B)或协同效应。

2.消除血液细胞缺失形成的活性化合物

2.1.选择造血细胞的启动子或者激活物序列

在本发明中，基因调节序列，或者在造血细胞中编码特别强烈或选择表达之蛋白质的基因元件，最好用作由启动子或增强子组成的启动子或者激活物序列。基因调节序列包括细胞因子或者其受体基因的启动子序列，这种基因调节序列在未成熟造血细胞中的表达发生在随后的细胞因子之前，需要这种细胞因子作为活性物质是所需的，并对造血细胞发挥作用。对未成熟的造血细胞发挥作用的这种特性之细胞因子的例子是：

-干细胞因子

-IL-1

-IL-3

-IL-6

-GM-CSF

2.2.造血细胞活性物质结构基因的选择

在本发明中，活性物质应理解为这样一种DNA序列，其表达的蛋白质引起血液细胞的增殖和/或分化。

3.治疗自身免疫疾病、变应性变态反应和炎症以及预防器官排斥的活性化合物

3.1.特别的用于自身免疫疾病之启动子或者激活物序列的选择

在免疫反应期间，在巨噬细胞和/或者淋巴细胞中形成增加的蛋白质的基因调节序列将用作包含启动子或者增强子的启动子或者激活物序列。具有这种特性的蛋白质的例子是：

-IL-1

-IL-1β

-IL-1受体

-IL-2

-IL-2受体

-IL-3

-IL-3受体

-IFNγ

-IL-4

-IL-4受体

-IL-5

-IL-6

-LIF

-IL-7

-IL-10

-IL-11

-IL-12

-IL-13

-GM-CSF

-GM-CSF受体

-整联蛋白β-2蛋白质

3.2.特别的用于自身免疫疾病之活性化合物的基因选择

在本发明中，活性物质是编码抗体、抗体片段，细胞因子、趋化因子、生长因子或者其一种抑制剂、血浆蛋白质、核酶(催化这些DNA序列之一的转录产物或者催化编码细胞周期控制蛋白质之基因的转录产物)的DNA序列或者是抗体或酶的DNA序列。活性物质的选择取决于所治疗的基本疾病和所选择的启动子序列。

4.治疗风湿性关节炎的活性化合物

4.1.风湿性关节炎激活物序列之启动子的选择

在本发明中，由启动子或者增强子或者基因调节序列组成的激活物序列应理解为，优选的是和与转录因子(转录因子在滑液细胞和炎症性细胞中形成或具有活性)相互作用的那些基因联合。在本发明中，优选的启动子序列包括编码(特别是在滑液细胞和炎症性细胞中)所表达的蛋白质之基因的基因调节序列或元件。

4.2.风湿性关节炎之活性物质结构基因的选择

在本发明中，活性物质应理解为这样一种DNA序列，其表达的蛋白质直接或间接抑制关节炎症，例如，和/或促进关节胞外基质(软骨、结缔组织)的重建。

5.针对感染物的活性化合物的制备

可以通过两种根本不同的形式制备活性化合物：

-用于治疗病毒感染和寄生物侵入，或者

-用于预防病毒、细菌或寄生虫引起的传染病

为了预防传染病，利用了疫苗。然而，通过常规的方法制备有效疫苗的可能性受到限制(Brown，Tnt.J.Technol.Assessm.10，161(1994))；Ellis，实验医学生物学进展327，263(1992)；Arnon等，FASEB J.6，3265(1992))。

因此，发展了DNA疫苗技术。然而，这些DNA疫苗引起有关功效程度、安全性和副作用的问题(Fynan等，国际免疫药物学杂志17，79(1995)；Donnelly等，免疫学2，20(1994))。

在本发明中，用于预防传染病的活性化合物，由于它们的细胞特异性和受细胞周期调节，因此以高度的安全性引人注目。

5.1.启动子或者激活物序列的选择

5.1.a)用于传染病的治疗

选择细胞基因(特别是其活性通过细菌或者寄生物感染而变化的那些基因)的启动子序列作为激活物序列，或者选择来源于这些病毒的启动子序列，这些病毒转化它们感染的细胞并刺激这些细胞增殖。

这些病毒的例子是HBV、HCV、HSV、HPV、HIV、EBV和HTLV。

5.2.活性物质结构基因的选择

5.2.a)用于治疗传染病

显示出细胞抑制、细胞毒性、抗细菌或者抗病毒作用之蛋白质的DNA选为活性物质。上文已经阐述了细胞毒素和细胞抑制蛋白质的例子。抗体或抗体片段可以作为抗细菌或抗病毒之蛋白质的例子提到。当选择酶时，随后必须施用抗病毒的细胞毒素和抗寄生虫物质的前体(此前体可以由酶切割)。

并且，在本发明中，用于抗病毒蛋白质的活性物质是细胞因子和生长因子，这两种物质具有抗病毒活性。例如，它们包括下列活性物质的DNA序列：

-IFNα

-IFNβ

-IFNγ

-TNFβ

-TNFα

-IL-1

-TGFβ

然而，在所列出的细胞因子、生长因子或受体的胞外部分之间形成的融合蛋白之DNA序列，以及配位体，都可以用作本发明的活性物质；例如，EPA 0464 633 A1中已经描述了含有人类免疫球蛋白Fc部分的融合蛋白。

消化细胞周期控制蛋白质之基因的mRNA或者病毒的mRNA之核酶的基因，也可以作为活性物质。例如，Christoffersen等(医用化学杂志38，2033(1995))已经综述了催化HIV的核酶。

并且，在本发明中的化学物质是具有特异性的抗体的DNA序列，这种特异性能灭活相关的病毒、或其含有V_H-和V_L-片段、或者通过接头连接在一起的V_H和V_L片段，例如，这些片段按照Marasco等描述的方法制备(美国科学院学报90，7889(1993))。具有这种特异性抗病毒特性之抗体的例子在5.2.b)部分给出。

5.2.b)用于预防传染病

待选择的活性物质是对感染物特异性的抗体或抗体片段的DNA，或者是通过感染物形成的且通过触发或免疫反应(即由于抗体结合和/或由于细胞毒素T淋巴细胞)导致该感染物的中和和/或破坏之蛋白质的DNA。所说的具有这种特性的中和抗原已作为疫苗抗原(参见Ellis的实验医学生物学进展327，263(1992))。编码中和抗原之DNA序列的例子可从下列出版物中找到：

-流感A病毒抗原

(Ulmer等，科学259，1745(1993)；Robinson等，疫苗11，957(1993)；Fynan等，国际免疫药学杂志17，79(1995))

-HIV抗原

(Wang等，PNAS US 90，4156(1993))

-狂犬病病毒抗原

(Donnelly等，免疫学2/1，20(1994))

-HSV(单纯疱疹病毒)抗原

(Fleckenstein等，自然274，57(1978))

-RSV(呼吸合胞体病毒)抗原

(Du等，生物技术12，813(1994)；Hall，科学265，1393(1993))

-副流感病毒抗原

(Du等，生物技术12，813(1994))

-轮状病毒属抗原

(Albert等，临床微生物学杂志25，183(1987)；Anderson等，传染病杂志153，823(1986)；Battaglia等，传染病杂志155，140(1987)；Chanock等，传染病杂志148，49(1983)；Dyall-Smith等，病毒学杂志38，1099(1981)；Glass等，科学265，1389(1994))

-VZV(水痘-带状疱疹病毒)抗原

(Straus等，内科医学年鉴109，438(1988)；Gershon，儿科传染病2，171(1991)；Kinchington等，病毒学杂志64，4540(1990))

-CMV(细胞肥大病毒)抗原

(Plotkin，科学265，1383(1994))

-麻疹病毒抗原

(Katz和Kellin，科学265，1391(1994))

-HPV(人类乳头状瘤病毒)抗原

(Tindl和Frazer，当今微生物免疫学主题186，217(1994))

-HBV(肝炎B病毒)抗原

(Valenzuela等，自然280，815(1979)；Heerman等，病毒学杂志52，396(1984))

-HCV(肝炎C病毒)抗原

(Cerny等，当今微生物免疫学主题189，169(1994)；Esteban等，肝疾病进展10，253(1992)；Jung等，欧洲临床研究杂志24，641(1994种))

-HDV(肝炎D病毒)抗原

(Iwarson，Scand.J.Infect.24，129(1992)；Consolo等，肾瘤(Nephron)61，251(1992))

-HEV(肝炎E病毒)抗原

(Iwarson，Scand.J.Infect.24，129(1992)；Consolo等，肾瘤(Nephron)61，251(1992))

-HAV(肝炎病毒)抗原

(d′Hondt，疫苗10，48(1992)；Andre，传染病杂志171，33(1995)；Lemon等，疫苗10，40(1992)；Melnick等，疫苗10，24(1992)；Flehmig，Baillieres临床胃肠病学4，707(1990))

-霍乱弧菌抗原

(Levine和Kaper，疫苗11，207(1993))

-布氏疏螺旋体抗原

(Schaible等，免疫学通讯36，219(1993)；Wallich等，实验医学17，669(1993))

-幽门螺杆菌抗原

(Crabtree等，Lancet 338，332(1991)；Blascr，传染病杂志161，626(1990)；Cover和Blaser，生物化学杂志267，10570(1993)；Cover等，传染免疫学58，603(1990)；Dunn等，生物化学杂志265，9464(1990)；Dunn等，传染免疫学60，1946(1992)；Lagc等，比利时胃肠病学学报56(增刊)，61(1993)；Mobley等，Scand.J.Gastroint 26(增刊.187)，39(1991)

-疟疾抗原

(Nussenzweig和Long，科学265，1381(1994)；Maurice，科学267，320(1995)；Enders等，疫苗10，920(1992)；Knapp等，传染病免疫学60，2397(1992))

然而，在本发明中，具有这种特性的活性物质也包括抗独特型抗体或者其抗原结合片段，它的抗原结合结构(即互补决定区)构成了感染物中和抗原的蛋白质结构或者碳水化合物结构的拷贝。

具体地说，具有这种特性的抗独特型抗体在细菌感染物存在的情况下，能够代替碳水化合物抗原。

Hawkins等(免疫疗法杂志14，273(1993))和Westerink和Apicella(免疫病理学Springer讨论会。15，227(1993))已经综述了抗独特型抗体和它们的切割产物。

5.3用于治疗和预防传染病之相同或不同活性物质的组合

本发明还涉及包含相同活性物质(A，A)或不同活性物质(A，B)之DNA序列组合的活性物质。为了表达两种序列，优选内核糖体进入位点的cDNA作为调节元件插入。

例如，Montford和Smith(TIG11，179(1995))、Kaufman等(核酸研究19，4485(1991))、Morgan等(核酸研究20，1293(1992))、Cirk等(基因128，247(199 3))、Pelletier和Sonenberg(自然334，320(1988))和Sugitomo等(生物技术12，694(1994))已经描述了具有这种特性的IRES。

这样，脊髓灰质炎病毒IRES序列的cDNA(位点≤5′UTR的140-≥630；Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988))可以用于连接病毒物质A的DNA(3′末端)和病毒物质B的DNA(5′末端)(参见图8)。

依据组合，在本发明的范围内的具有这种特性的活性化合物，具有加和(A+A，A+B1)或协同效应。

这样，对于例如治疗病毒疾病，两种相同或两种不同的抗活性物质可以彼此组合。

这样，在预防传染病的过程中，编码一种感染物之不同抗原或不同感染物之不同抗原的几种活性物质可以彼此组合。并且，编码感染物抗原的活性物质可以和编码细胞因子或者细胞因子受体之活性物质组合。

同时，这样形成(即在注射活性化合物之后形成的)的细胞因子或者细胞因子受体作为感染物受体可以影响正在进行的免疫反应的特性和强度。

5.2.d)已经描述了扩增体液免疫反应之细胞因子和细胞因子受体的DNA序列，5.2.a)和5.2.c)描述了扩增细胞免疫反应的序列。

下列是整体上扩增免疫反应之细胞因子的DNA序列的例子：

-I1-1α

(Fenton，国际免疫药学杂志14，401(1992)；Furntani等，核酸研究14，3167(1986)；Lafage等，血液73，104(1989)；Aarch等，自然315，641(1985))

-I1-1β

(Bensi等，基因52，9(1987)；Auron等，PNAS 81，7907(1984)；Clark等，核酸研究14，7897(1986))

-I1-2

(Fletscher等，淋巴循环研究6，45(1987)；Matsui等，淋巴因子12，1(1985)；Tanaguchi等，自然302，305(1983))

-GM-CSF

(Gough等，自然309，763(1979)；Nicola等，生物化学杂志254，5290(1979)；Wong等，科学228，810(1985))

6.治疗肿瘤的活性化合物

6.1.肿瘤细胞启动子或激活物序列的选择

和在肿瘤细胞中形成或激活的转录因子相互作用的基因调节序列被称为启动子或激活物序列。

新核酸构建体能够达到的肿瘤是优选的。例如，这些肿瘤是白血病细胞(除在不同类型固体肿瘤邻区中的增殖的内皮细胞外)(静脉施用核酸构建体之后)、卵巢癌和胰癌(例如在腹膜内注射核酸构建体之后)、肺癌(例如在支气管内施用构建体)。

在本发明中，优选的启动子或者激活物序列包括编码特别是在白血病细胞、癌细胞或者肉瘤细胞中形成的蛋白质之基因的基因调节序列或元件。这样，N-CAM蛋白质的启动子在小细胞支气管癌的情况下优选使用；而肝炎生长因子受体或L-网质的启动子在卵巢癌的情况下优选使用；L-网质或多形上皮粘蛋白(PEM)之启动子在胰癌的情况下优选使用；前列腺特异性抗原(PSA)的启动子在前列腺肿瘤的情况下优选使用。

6.2.肿瘤细胞活性物质之结构基因的选择

在本发明中，活性物质被理解为这样一种DNA序列，其表达的蛋白质抑制细胞(特别是白血病细胞)的增殖。例如，这些细胞周期抑制剂包括如已经描述过的抑制性细胞抑制和细胞毒素蛋白质的DNA序列、抗体或抗体切割产物的DNA序列、酶的DNA序列。

并且，细胞周期抑制剂应理解为表达对肿瘤细胞或者白血病细胞直接或间接显示出细胞抑制或者细胞毒素效应之蛋白质的DNA序列。

细胞周期抑制剂也应理解为一种核酶的DNA序列，这种核酶催化细胞周期控制蛋白之基因的mRNA。肿瘤细胞的活性物质也应理解为一种DNA序列，这种DNA序列表达的蛋白质或肽组成了触发免疫反应的肿瘤抗原。

7.抑制与血管闭塞相关的平滑肌细胞增殖之活性化合物

7.1.平滑肌细胞启动子或者激活物序列的选择

在本发明中将使用的由启动子或者增强子组成的启动子或者激活物序列优选的是编码特别在平滑肌细胞中形成的蛋白质之基因的基因调节序列或元件。

7.2.平滑肌细胞活性物质结构基因的选择

在本发明中，活性物质应理解为这样一种DNA序列，其表达的蛋白质抑制平滑肌细胞的增殖。这些增殖抑制剂包括1.2.a)和1.2.c)已经提及的蛋白质。

然而，活性物质也应理解为把细胞抑制剂的非活性前体转化为细胞抑制剂酶的DNA序列(参见1.2.f)

8.对凝结有作用的活性化合物

8.1.对凝结有作用的启动子或者激活物序列的选择

在本发明中，使用的启动子或者激活物序列优选的是编码可以在平滑肌细胞、激活的内皮细胞、激活的巨噬细胞或者激活的淋巴细胞中检测到的蛋白质的基因的基因调节序列或元件。

8.1.a)平滑肌细胞

已经给出了平滑肌细胞中基因启动子序列的例子。

8.1.b)激活的内皮细胞

具体地说，Burrows等(药物治疗64，155(1994))已经描述了在激活的内皮细胞中形成的蛋白质的例子。具体地说，这些蛋白质的例子是在内皮细胞中表现出增加的程度的蛋白质(例如，上文已经描述的那些蛋白质和它们基因的启动子序列)。

8.1.c)激活的巨噬细胞和/或者激活的淋巴细胞

在本发明中，激活物序列也应理解为在免疫应答期间在巨噬细胞和/或者淋巴细胞中形成增加的程度的蛋白质的基因的启动子序列。这种特性的蛋白质已经描述过。

8.2.对凝结有作用之活性物质的结构基因的选择

本发明中所使用的活性物质是编码直接或间接抑制血小板聚合或者血液凝固因子或者刺激纤维蛋白溶解之蛋白质的DNA序列。

具有这种特性的活性物质定义为凝结抑制剂。血纤蛋白溶酶或者血纤蛋白溶酶原激活物(PAs)(如组织PA(tPA)或者类尿激酶PA(uPA)、或者蛋白C、抗凝血酶III、C-1S抑制剂、α1-抗胰蛋白酶、组织因子途径抑制剂(TFPI)或者水蛭素)都可以用作凝结抑制剂。

然而，编码促进血液凝结之蛋白质的DNA序列也作为本发明的活性物质。具有这种特性的蛋白质的例子是血浆蛋白质(如FVIII或者FIX或者组织因子)。

9.防止CNS破坏的活性化合物

9.1.由防止CNS破坏之活性化合物的启动子或者增强子形成的启动子或者激活物序列

9.1.a)在内皮细胞中激活的启动子或者激活物序列

具体地说，这些序列包括内皮细胞特异性蛋白质基因的启动子序列。

9.1.b)在神经胶质细胞中激活的启动子或者激活物序列

优选的激活物序列也应理解为和神经胶质细胞中以特殊的程度形成或具有活性的转录因子相互作用的核苷酸序列(启动子序列或者增强子序列)。

9.2神经特异性因子结构基因的选择

在本发明中，神经特异性因子应理解为编码神经生长因子的DNA序列。

利用下列实施例帮助更详细地解释本发明，而不是把本发明限制在这些实施例中。实施例1制备杂交启动子

新杂交启动子由下列不同的核苷酸序列组成，这些序列在下游方向上相继排列。元件I

-VEGF受体I基因启动子

(核苷酸-1195至100；Morishita等，生物化学杂志270，27948(1995)。TATA盒(核苷酸TATAAA在位点-31至-26)突变成TGTAAA)

-序列GCCACC

(Kodak，细胞生物学杂志108，229(1989))

-免疫球蛋白信号肽的cDNA

(核苷酸序列63至107；Riechmann等，自然332，323(1988))

-β-葡萄糖醛酸酶的cDNA

(核苷酸序列93至1982；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))元件II

-cdc25C基因的启动子(核苷酸-487至+121，优选的核苷酸是-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子细胞生物学。14，999(1994)，特别是核苷酸-290至+121)

-TATA盒结合蛋白质的基因

(核苷酸序列+1至+1001，此序列在下列位点发生突变：核苷酸862(T替换A)889和890(AC替换GT)及895(G替换C)(Strubin和Struhl，细胞68，721(1992)；Heard等，EMBO J.12，3519(1993))

元件I和元件II的核苷酸序列如附图9的方案所示连接。

把以这种方式制备的核苷酸构建体克隆到pUC18/19或Bluescript衍生的质粒载体中，然后将这种载体直接或以胶态分散体系统用于体内给药。

此构建体的单个组件通过合适的限制位点连接，在PCR扩增期间在不同组件的终点引入这些限制位点。利用对这些限制位点特异性的，并且技术人员熟悉的酶及DNA连接酶进行连接。

将在培养物中一直保留的人类脐带内皮细胞和成纤维细胞(Wi-38)用所描述的质粒之一，利用技术人员熟知的方法转染(Lucibello等，EMBOJ.14，132(1995))，利用4-methylumbelliferyl-β-葡糖苷酸作为底物检测内皮细胞产生的β-葡萄糖醛酸酶的数量。

为了检测细胞周期特异性，通过除去甲硫氨酸48小时，使内皮细胞G0/G1同步化(Nettelbeck等，有关制备的出版物)。用Hoechst 33258染色之后，在荧光激活细胞分选仪中测定细胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))。

得到了下列结果：

和未转染的成纤维细胞相比，在转染的成纤维细胞中没有检测到β-葡萄糖醛酸酶的增加。

转染的内皮细胞较未转染的内皮细胞实质上表达了更多的β-葡萄糖醛酸酶。

增殖的内皮细胞(DNA＞2S；S＝单染色体组)较G0/G1同步化的内皮细胞(DNA＝2S)实质上分泌更多的β-葡萄糖醛酸酶。

已经描述的多启动子引起β-葡萄糖醛酸酶结构基因的细胞特异性、细胞周期依赖性表达。实施例2

和核保留信号(NRS)及核输出因子(NEF)组合的杂交启动子的制备。

新杂交启动子由下列不同的核苷酸序列组成，这些核苷酸序列在下游的方向上相继排列：元件III

-VEGF受体I基因的启动子

(核苷酸-1195至100；Morishita等，生物化学杂志270，27948(1995)。TATA盒(核苷酸TATAAA在位点-31至-26)突变成TGTAAA)

-序列GCCACC

(Kodak，细胞生物学杂志108，229(1989))

-免疫球蛋白信号肽的cDNA

(核苷酸序列63至107；Riechmann等，自然332，323(1988))

-β-葡萄糖醛酸酶的cDNA

(核苷酸序列93至1982；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))

-作为核保留信号(NRS)的HIV-1病毒RER之cDNA

(核苷酸序列7357至7602；Ratner等，自然313，277(1985)；Malim等，自然338，254(1989))。元件IIa

-cdc25C基因的启动子

(核苷酸-290至+121；Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)；Zwicker等，核酸研究23，3822(1995))

-包含共突变的TATA盒结合蛋白的基因(核苷酸序列1至1001，此序列在下列位点发生突变：核苷酸862(T替换A)889和890(AC替换GT)及895(G替换C)(Strubin和Struhl，细胞68，721(1992)；Heard等，EMBO J.12，3519(1993))元件IV

-von Willebrand因子(vWF)基因的启动子

(核苷酸-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子细胞生物学14，999(1994))

-作为核输出因子(NEF)的HIV-1病毒REV的cDNA

氨基酸序列1-117；Ratner等，自然313，277(1985)。

元件II、III和IV的核苷酸序列如附图10的方案所示连接。

把以这种方式制备的核苷酸构建体克隆到pUC 18/19或Bluescript衍生的质粒载体中，然后将这种载体直接或以胶态分散体系统用于体内给药。

此构建体的单个组件通过合适的限制位点连接，在PCR扩增期间在不同组件的终点引入这些限制位点。利用对这些限制位点特异性的，并且技术人员熟悉的酶及DNA连接酶完成连接。

将在培养物中一直保留的人类脐带内皮细胞和成纤维细胞(Wi-38)用所描述的质粒，利用技术人员熟知的方法转染(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))，利用4-methylumbellifcryl-β-葡糖苷酸作为底物检测内皮细胞产生的β-葡萄糖醛酸酶的数量。

为了检测细胞周期特异性，通过除去甲硫氨酸48小时，使内皮细胞G0/G1同步化(Nettelbeck等，有关制备的出版物)。用Hoechst 33258染色之后，在荧光激活细胞分选仪中测定细胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))。

得到了下列结果：

和未转染的成纤维细胞相比，在转染的成纤维细胞中没有检测到β-葡萄糖醛酸酶增加的可能性。

转染的内皮细胞较未转染的内皮细胞实质上表达了更多的β-葡萄糖醛酸酶。

增殖的内皮细胞(DNA＞2S)较G0/G1同步化的内皮细胞(DNA＝2S)实质上分泌更多的β-葡萄糖醛酸酶。

已经描述的多启动子引起β-葡萄糖醛酸酶结构基因的细胞特异性、细胞周期依赖性表达。实施例3

和激活物响应启动子单位组合的杂交启动子的制备。

新激活物响应启动子单位由下列不同的核苷酸序列组成，这些核苷酸序列在下游的方向上相继排列：元件V激活物亚单位

-cdc25C基因的启动子

(核苷酸-290至+121；Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)；Zwicker等，核酸酸研究23，3822(1995))

-Ga14蛋白质DNA结合域的cDNA

(氨基酸1至147；Chasman和Kornberg，分子细胞生物学10，2916(1990))

-Ga180的cDNA

(氨基酸1至435；Leuther等，科学256，1333(1992))激活物亚单位B

-VEGF受体I基因启动子

(核苷酸-1195至+100；Morishita等，生物化学杂志270，27948(1995)；在核苷酸-31至-26发生TGTAAA突变)

-Ga14的Ga180结合域的cDNA

(氨基酸851至881；Leuther等，科学256，1333(1992))

-SV40的核定位信号(NLS)

(SV40大T；氨基酸126至132：PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))

-HSV-1VP16的酸反式激活域(TAD)

(406至488氨基酸；Triezenberg等，基因发展2，718(1988)；Triezenberg，基因发展的现代观点5，190(1995))激活物响应启动子

具有和SV40基础启动子(核苷酸48至5191；Toozeb编辑，DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约；冷泉港实验室)偶联之核苷酸序列5-CGGACAACTGTTGAC CG-3′(SEQ ID NO：2，Chasman和Kornberg，分子细胞生物学)的Ga14结合序列。

激活物响应启动子单位核苷酸序列的排列顺序如图11的方案所示。

描述的激活物序列功能如下：

-cdc25C启动子以细胞周期特异性方式调节Ga14结合蛋白和Ga180的组合cDNA的转录。

-VEGF受体I启动子限制Ga14的Ga180结合域、SV40 NSL和内皮细胞TPA之偶联的cDNA的转录。然而，这种激活作用由突变抑制。

-激活物亚单位A和B的表达产物通过Ga14的Ga180结合域和Ga180结合二聚化。

图2通过图解的方式表示了二聚化。

二聚化的蛋白质是Ga14结合域/SV40启动子的激活物响应启动子DNA序列的嵌合转录因子。

按照本发明图13的方案，所述启动子在其3′末端和序列GCCACC连接(Kocak，细胞生物学杂志108，229(1989))，后者和免疫球蛋白信号肽的cDNA连接(核苷酸序列63至107；Riechmann等，自然332，323(1989))。之后是β-葡萄糖醛酸酶的cDNA(核苷酸序列93至1982；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))。

接下来，此单位在其3′末端和元件VI连接，然而，这种元件IV也可以加入到核苷酸构建体的5′末端。元件VI

元件VI包括：

-von Willebrand因子基因的启动子

(核苷酸-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子细胞生物学14，999(1994))

-TATA盒结合蛋白基因

(核苷酸序列1至1001，此序列在下列位点发生突变：核苷酸862(T替换A)889和890(AC替换GT)及895(G替换C)。

TATA盒结合蛋白的共突变消除了VEGF受体启动子激活(激活物亚单位B)的抑制作用。

把以这种方式制备的核苷酸构建体克隆到pUC 18/19或Bluescript衍生的质粒载体中，然后将这种载体直接或以胶态分散体系统用于体内给药。

此构建体的单个组件通过合适的限制位点连接，在PCR扩增期间在不同组件的终点引入这些限制位点。利用对这些限制位点特异性的，并且技术人员熟悉的酶及DNA连接酶完成连接。

将在培养物中一直保留的人类脐带内皮细胞和成纤维细胞(Wi-38)用所描述的质粒，利用技术人员熟知的方法转染(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))，利用4-methylumbelliferyl-β-葡糖苷酸作为底物检测内皮细胞产生的β-葡萄糖醛酸酶的数量。

为了检测细胞周期特异性，通过除去甲硫氨酸48小时，使内皮细胞G0/G1同步化(Nettelbeck等，有关制备的出版物)。用Hoechst 33258染色之后，在荧光激活细胞分选仪中测定细胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))。

得到了下列结果：

和未转染的成纤维细胞相比，在转染的成纤维细胞中没有检测到β-葡萄糖醛酸酶增加的可能性。

转染的内皮细胞较未转染的内皮细胞实质上表达了更多的β-葡萄糖醛酸酶。

增殖的内皮细胞(DNA＞2S)较G0/G1同步化的内皮细胞(DNA＝2S)实质上分泌更多的3-葡萄糖醛酸酶。

已经描述的多启动子引起β-葡萄糖醛酸酶结构基因的细胞特异性、细胞周期依赖性表达。

如实施例I-III描述的按照本发明的活性化合物，在局部给药(例如在肿瘤位点)、或者在颅内或蛛网膜下给药、或者全身(优选的是静脉或动脉)给药后，作为激活物响应启动子亚单位的细胞周期特异性或者内皮细胞特异性的结果，具有确保主要(如果不是唯一的)增殖分泌β-葡萄糖醛酸酶的内皮细胞的作用。此β-葡萄糖醛酸酶切割强耐受阿霉素-β-葡萄糖醛酸化物(Jacquesy等，EPO 0 511 917 A1)，现在这种物质被注射到具有细胞抑制作用的阿霉素中。阿霉素抑制内皮细胞增殖，并且对内皮细胞和邻近的肿瘤细胞具有细胞抑制作用。这导致肿瘤细胞的生长受到抑制。

    序列表(1)一般信息(i)申请人：

(A)姓名：Hoechst Aktiengesellschaft

(B)街道：-

(C)城市：Franlfurt

(D)州：-

(E)国家：德国

(F)邮政编码(ZIP)：65926

(G)电话：069-305-3005

(H)传真：069-35-7175

(I)电报：-(ii)发明名称：用于基因治疗的含杂交启动子的核酸构建体(iii)序列数：2(iv)计算机可读形式：

(A)介质类型：Floppy软盘

(B)计算机IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn #1.0，#1.25版本(EPO)(2)SEQ ID NO：1信息：(i)序列特征：

(A)长度：7个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(ix)特性：

(A)名称/关键词：肽

(B)位点：1..7  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1Pro Lys Lys Lys Arg LysVal1               5(2)SEQ ID NO：2信息：(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特性：

(A)名称/关键词：外显子

(B)位点：1..17(xi)序列描述：SEQ ID NO：2

CGGACAACTG TTGACCG

                17

Claims (36)

1.一种用于在宿主细胞中调节转基因表达的核酸构建体，这种核酸构建体包含：

至少一种含有第一突变的核酸序列，这种突变抑制所说的转基因正常表达，和

至少一种含有第二种突变的核酸序列，这种突变消除由第一突变产生的抑制作用。

2.权利要求1的用于在宿主细胞中调节转基因表达的核酸构建体，其中：

(i)当所说的含有所说的第一突变的核酸序列是包含抑制所说的转基因的转录和/或翻译，或者抑制药理活性化合物的功能的突变的转基因(b)时，所说的核酸构建体还包含第一启动子或增强子序列(a)，此序列定位在所说转基因5′末端的上游，或者

(i′)当所说的含有所说的第一突变的核酸序列是包含抑制第一启动子的功能的突变的启动子或增强子序列(a′)时，所说的核酸构建体还包含编码药理活性化合物的转基因(b′)。

3.按照权利要求1或2的用于在宿主细胞中调节转基因表达的核酸构建体，这种核酸构建体在5′至3′末端方向的阅读框架中包含下列组件：

(i)激活所说的转基因转录的第一启动子或增强子序列(a)，或包含抑制第一启动子功能的突变的第一启动子或增强子序列(a)；

(ii)编码药理活性化合物的转基因(b′)或者包含一种突变的转基因(b)，这种突变抑制所说的转基因的转录和/或翻译，或者抑制由所说的转基因编码的药理活性化合物的功能；

(iii)第二启动子或增强子序列(c)，这种序列激活组件(d)的基础转录或包含抑制第二启动子功能的突变；和

(iv)编码消除启动子(a)和(c)至少之一或转基因(b)中突变之tRNA或调节蛋白的基因。

4.权利要求3的核酸构建体，其中所说的启动子(a)和(c)是非特异性的、细胞特异性或病毒特异性的，并且其中启动子(a)和(c)可以被包括下列几种激活机制在内的至少一种机制激活：非特异性地、病毒特异性地、代谢性地、由四环素、由氧不足、细胞特异性地和细胞周期特异性地。

5.如权利要求1-4之任一所要求的核酸构建体，其中所说的转基因(b)包含核保留信号(NRS)，这种核保留信号在其5′末端直接或间接和转基因的3′末端连接，并且，其中所说的NRS的转录产物提供结合核输出因子(NEF)的结构。

6.权利要求5的核酸构建体，这种核酸构建体还包含下列组件：

(v)激活NEF基础转录的第三启动子或增强子序列(i)；和

(vi)编码和NRS转录产物结合进而介导转基因转录产物从细胞核向细胞质转运的NEF(k)的核酸序列。

7.权利要求3或4的核酸构建体，其中所说的启动子或增强子序列(a)和(c)是相同的。

8.如权利要求3-7之任一所要求的核酸构建体，其中启动子或增强子序列(a)和(c)至少之一是含有启动子组件CDE-CHR或E2FBS-CHR的嵌合启动子，其中所说的启动子组件对下游基因的表达起作用，并且和邻区、上游、激活物序列相互作用。

9.如权利要求1-8之任一所要求的核酸构建体，其中所说的下游基因的表达是受细胞周期特异性抑制的。

10.权利要求6的核酸构建体，其中启动子或增强子序列(a)、(c)和(i)至少之一是包含下列组件的激活物响应启动子单位：

(vii)至少一种启动子或增强子序列(e)，这种启动子或增强子序列由包括下列几种激活方法在内的至少一种方法激活：非特异性地、病毒特异性地、代谢性地、由四环素、细胞特异性地和细胞周期特异性地；

(viii)至少一种位于启动子或增强子序列(e)下游的激活物亚单位(f)，并且其中所说的激活物亚单位的基础转录由启动子或增强子序列(e)激活；和

(ix)一种激活物响应启动子(g)，这种启动子由该激活物亚单位(f)或几种相同亚单位(f)或不同激活物亚单位(f′)的表达产物激活。

11.权利要求10的核酸构建体，其中启动子或增强子序列(a)、(c)或(i)和激活物响应启动子(g)至少之一是嵌合启动子，并且激活物亚单位(f)是编码至少一种激活嵌合启动子的转录因子之基因。

12.权利要求10或11的核酸构建体，其中所说的激活物响应启动子(g)是和SV40启动子结合的单体或多体LexA操纵基因，并且由两种激活物亚单位(f)和(f′)激活；其中

激活物亚单位(f)包含编码LexA DNA结合蛋白的cDNA，其3′末端和编码Ga180蛋白之cDNA的5′末端连接；和

激活物亚单位(f′)在5′至3′末端的阅读框架上包含编码Ga14蛋白的Ga180结合域的cDNA、编码SV40大T抗原的cDNA和编码HSV-1 VP16反式激活域的cDNA。

13.权利要求12的核酸构建体，其中所说的编码LexA DNA结合蛋白的cDNA编码LexA DNA结合蛋白的1-81或1-202位氨基酸；编码Ga180蛋白的cDNA编码Ga180蛋白的1-435氨基酸；编码Ga14蛋白之Ga180结合域的cDNA编码Ga14蛋白的851-881位氨基酸；编码SV40大T抗原的cDNA编码SV40大T抗原的126-132位氨基酸；编码反式激活域的cDNA编码HSV-1VP16的406-488位氨基酸。

14.权利要求12或13的核酸构建体，其中所说的LexA操纵基因的单体或多体由Ga14结合域的单体或多体替代；并且编码LexA DNA结合蛋白的cDNA由编码Ga14蛋白的DNA结合域的cDNA替代。

15.权利要求10-13之任一所要求的核酸构建体，其中所说的激活物响应启动子(g)是编码Ga14结合蛋白之结合序列的单体或多体；激活物亚单位(f)包含来源于SV40大T抗原的核定位信号(NLS)和来源于HSV-1 VP16的酸反式激活域(TAD)；或者激活物亚单位(f′)含有来源于SV40大T的核定位信号(NLS)、编码Ga14蛋白质DNA结合域的cDNA和编码p56 Ick蛋白质CD4结合序列的cDNA。

16.权利要求15的核酸构建体，其中NLS编码SEQ ID NO.：1，TAD编码HSV-1 VP16的406-488位氨基酸，Ga14蛋白质DNA结合域的cDNA编码Ga14蛋白质的1-147位氨基酸，CD4结合序列的cDNA编码p56 Ick蛋白质的1-71位氨基酸。

17.权利要求6的核酸构建体，其中所说的编码NRS的核酸序列选自由来源于HIV-1或HIV-2的Rev响应元件(RRE)、不同于HIV-1和HIV-2的反转录病毒之RRE相等保留信号及HBV的RRE相等保留信号组成的组。

18.权利要求6的核酸构建体，其中所说的NEF(k)选自由反转录病毒的rev基因、编码hnRNP-A1蛋白质的基因或编码转录因子TFIII-A的基因组成的组。

19.权利要求6核酸构建体，其中所说的反转录病毒选自由HIV-1、HIV-2、Visna-maedi病毒、羊关节炎脑炎病毒、马传染性盆血病毒和猫免疫缺陷病毒和HTLV组成的组。

20.权利要求10的核酸构建体，其中启动子(a)、(c)、(g)和(i)至少之一的至少一种TATA序列是突变的；并且组件(d)是编码TATA结合蛋白质(TBP)的基因，这种基因是突变的且和突变的TATA盒结合，使得能够转录。

21.权利要求20的核酸构建体，其中所说的TATA盒突变成TGTAAA，编码TBP的基因在N862突变成T，在N889突变成A，在N890突变成C，在N895突变成G。

22.权利要求2-21之任一所要求的包含杂交启动子的核酸构建体，所说的杂交启动子在5′至3′末端方向的阅读框架中包含下列元件：元件I，其包含：

-VIGF受体I基因的启动子

包含核苷酸-1195至+100，其中所说的TATAA的TATA盒在-31至-26位上的核苷酸突变成TGTAAA；

-序列GCCACC

-编码免疫球蛋白信号肽之cDNA的63至107位核苷酸序列；和

-编码β-葡糖醛酸酶之cDNA的93-1982位的核苷酸序列；和元件II，其包含：

cdc25C基因启动子的-487至+121位核苷酸；

TATA盒结合蛋白质的+1至+1001位核苷酸序列，这种核苷酸序列在下列位点上发生突变：核苷酸862(T替代A)、889和890(AC替代GT)和895(G替代C〕。

23.如权利要求2至21之任一所要求的核酸构建体，其包含在5′至3′方向的阅读框架中含有下列元件的杂交启动子：元件III

-包含核苷酸-1195至100的VIGF受体I基因之启动子，并且其中所说的TATAAA的TATA盒之核苷酸在-31至-26位上突变成TGTAAA；

-序列GCCACC

-编码免疫球蛋白信号肽之cDNA的63至107位核苷酸序列；和

-编码β-葡糖醛酸酶之cDNA的93-1982位核苷酸序列；和

-编码作为核保留信号(NRS)的HIV-1病毒RER之cDNA的7357至7602位核苷酸序列；和元件IIa

-cdc25C基因启动子的-290至+121位核苷酸；

-TATA盒结合蛋白质的+1至+1001位核苷酸序列，这种核苷酸序列在下列位点上发生突变：核苷酸862(T替代A)、889和890(AC替代GT)和895(G替代C〕。元件IV

-von Willebrand因子(vWF)基因启动子的-487至+247位核苷酸；和

-编码作为核输出因子(NEF)的1-117位氨基酸序列的HIV-1病毒REV之cDNA。

24.如权利要求2至21之任一所要求的核酸构建体，其包含杂交启动子和激活物响应启动子单位(包含在5′至3′末端方向阅读框架中)的这种核酸构建体包含下列元件：元件V，其包含：

1)激活物亚单位A，其包含：

-cdc25C基因启动子的-290至+121位核苷酸；

-Ga14蛋白质1-147位氨基酸的DNA结合域之cDNA；和

-编码Ga1801-435位氨基酸的cDNA；

2)激活物亚单位B，其包含：

-VIGF受体I基因的启动子，

其包含-1195至+100位核苷酸，并且在其-31至-26核苷酸位上是TGTAAA；

-Ga14 851-881位氨基酸的Ga180结合域的cDNA；

-编码SEQ ID NO.：1的核定位信号(NLS)；和

-编码HSV-1 VP16 406-488位氨基酸的酸反式激活域；和

3)激活物响应启动子，其包含：

-具有SEQ ID NO.：2核苷酸序列的Ga14之结合序列，这种结合序列可操作地和SV40基础启动子的48-5191位核苷酸连接；

-序列GCCACC；

-编码免疫球蛋白信号肽之cDNA的63至107位核苷酸序列；和

-β-葡糖醛酸酶之cDNA的93-1982位核苷酸序列；和元件VI包含

von Willebrand因子(vWF)基因启动子的-487至+247位核苷酸；和

TATA盒结合蛋白质的+1至+1001位核苷酸序列，这种核苷酸序列在下列位点上发生突变：核苷酸862(T替代A)，889和890(AC替代GT)和895(G替代C〕。

25.权利要求20的核酸构建体，其中包括转基因(b)、核输出因子(k)、TBP(d)和激活物响应启动子(g)的结合蛋白(f)和/或(f′)在内的组件中至少之一的至少一种基因发生突变，结果使表达的蛋白质没有功能，并且其中所说的组件d)是具有反密码子的tRNA的基因，这种反密码子和该突变互补或者携带给出正确的氨基酸以消除所说的组件中的突变的末端基团。

26.权利要求25的核酸构建体，其中至少一种下列密码子UAU，UUF，UAC，CAG，AAA，AAG或UGG突变成UAG，UAA，UAG，UGA或UGG，并且抑制基因tRNA(组件d))是sup F(su+3)；sup C(su+4)；sup D(su+1)；supE(su+2)；sup G(su+5)或sup U(su+7)基因。

27.权利要求1的核酸构建体，其中所说的核酸是DNA。

28.权利要求27的核酸构建体，其中所说的核酸构建体是载体，如质粒载体或病毒载体。

29.如权利要求1-28之任一所要求的核酸构建体，其中所说的转基因是编码药理活性化合物的结构基因，这些药理活性化合物选自由下列物质组成的组：细胞因子；干扰素；生长因子；抗体；来源于细胞因子或生长因子受体的抗体片段；具有抗增殖、apoptotic、细胞抑制或溶细胞作用的蛋白质；血管生成抑制剂和/或血栓形成诱导蛋白；凝结抑制剂；具有纤维蛋白溶解作用的蛋白质；血浆蛋白；补体激活蛋白(如眼镜蛇毒因子)；人类C3b；修饰的C3b；细菌蛋白；病毒外被蛋白；细菌抗原和寄生虫抗原；肿瘤抗原；对血液循环具有作用的蛋白质；肽激素；酶；由配位体和活性化合物组成的融合蛋白；反义RNA和核酶。

30.如权利要求1-29之任一所要求的核酸构建体，其中所说的转基因是编码酶和/或编码配位体/酶融合蛋白的结构基因，所述酶切割药物前体形成药物。

31.权利要求30的核酸构建体，其中所说的配位体和增殖的内皮细胞结合，并且选自由下列物质组成的组：抗体和它们的片段；含有末端甘露糖的蛋白质；细胞因子；生长因子和附着分子。

32.权利要求29的核酸构建体，其中所说的细胞因子是IL-1或TNF；生长因子是PDGF、G-FGF、VEGF或TGFβ；附着因子是SLex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1或VLA-1。

33.一种分离的细胞，这种细胞含有如权利要求1-32之任一所要求的核酸构建体。

34.权利要求33的分离细胞，其中所说的细胞是巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞和肿瘤细胞。

35.一种通过制备含有细胞增殖抑制量核酸构建体的药物抑制细胞增殖的方法，这种药物用于治疗患有下列疾病的患者：和过量细胞增殖有关的疾病、肿瘤、心血管疾病、自身免疫疾病、变应性变态反应、炎症、器官排斥、关节炎、传染病或神经元疾病。

36.一种药物组合物，其含有在药学上可接受的载体中的细胞增殖抑制量的如权利要求1-32之任一所要求的核酸构建体。

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