CN111471710B - 一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒反向遗传系统的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于水生动物病毒基因工程技术领域，具体涉及一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒（red‑spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV）反向遗传系统的方法。本发明以CMV为启动子构建含RGNNV基因组的真核表达质粒，采用高转染效率的人胚肾293T细胞和对RGNNV高效复制的条纹月鳢细胞（striped snakehead cell,SSN‑1）组合的方法来拯救RGNNV，克服了鱼类细胞转染效率低的问题。

Description

一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒反向遗传系统的方法
技术领域
本发明属于水生动物病毒基因工程技术领域，具体涉及到一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒反向遗传系统的方法。
背景技术
鱼类神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)是野田病毒(Nodaviridae)家族的一员。其感染导致的疾病称为病毒性神经坏死症(viral nervous necrosis,VNN)或者病毒性脑病和视网膜病(viral encephalopathy and retinopathy,VER)。现在已在120多种不同的养殖和野生鱼类中被报道，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。2001年，林蠡等在中国广东省大亚湾自然发病的赤点石斑鱼鱼苗中分离出病毒，为赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)。RGNNV为正链RNA病毒，病毒基因组包含两节段RNA(RNA1和RNA2)。RNA1编码病毒RNA聚合酶，RNA2编码病毒的唯一结构蛋白—衣壳蛋白。目前RGNNV的致病机制不完全清楚，因此，揭示RGNNV的致病机制及研制有效疫苗迫在眉睫。
反向遗传系统已经广泛应用于病毒学研究的各个领域，是研究病毒致病机制及研制疫苗的重要技术手段。在弹状病毒中，最先建立反向遗传系统的是狂犬病毒(1994年)。随后，水泡性口炎病毒、传染性造血器官坏死病病毒、病毒性出血性败血症病毒、乌鳢水泡病毒都建立了反向遗传系统。弹状病毒的反向遗传系统最开始是采用T7聚合酶启动子，因而细胞中需要通过感染痘苗病毒来提供T7聚合酶或者建立稳定表达T7聚合酶的细胞系；后来，逐渐采用CMV启动子。CMV启动子依靠RNA聚合酶II驱动，很多动物细胞内都含有RNA聚合酶II。因此，不需要像T7聚合酶启动子那样额外表达T7聚合酶，使得病毒拯救更便捷。2001年日本学者Naoki采用T7聚合酶启动子成功建立了RGNNV的反向遗传操作系统，但是目前还没有采用CMV启动子建立RGNNV反向遗传操作系统的报道。此外，鱼类病毒的反向遗传系统在使用细胞系方面，一般采用对病毒高效增殖的鱼类细胞进行质粒转染。然而，很多鱼类细胞因为转染效率很低，成为病毒拯救过程中的限制因素。因此，我们以CMV启动子构建含RGNNV基因组的真核表达质粒，采用人293T细胞(利用其转染效率高的特点)和条纹月鳢细胞SSN-1(利用其对RGNNV高效复制的特点)组合的方法来拯救病毒RGNNV，成功拯救出RGNNV。本发明的创新之处：以CMV启动子构建含RGNNV基因组的真核表达质粒，利用人293T细胞-鱼SSN-1细胞组合的方法进行RGNNV拯救，克服了鱼类细胞转染效率低的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)反向遗传系统的方法，以CMV启动子构建含RGNNV基因组的真核表达质粒，采用人293T细胞和条纹月鳢细胞SSN-1组合的方法来拯救病毒RGNNV。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV反向遗传系统的方法，包括以下步骤：
1)提取RGNNV的RNA并反转录成cDNA，PCR扩增RGNNV基因组，连接到含CMV启动子的质粒载体，载体上含有锤头状核酶HamRz和丁型肝炎核酶HdvRz序列；
2)将构建的含RGNNV基因组的真核表达质粒共转染293T细胞，拯救RGNNV；
3)收集转染后的293T细胞，冻融后离心取上清，转接条纹月鳢细胞SSN-1，拯救的RGNNV在SSN-1细胞中大量增殖。
优选地，上述的含CMV启动子的质粒载体是pcDNA-Ham-BamHI-Hdv，该质粒载体是通过将HamRz-BamHI-HdvRz片段连接到质粒载体pcDNA3.1(+)得到。
在本发明的一个具体实施例中，采用下述方法构建含RGNNV基因组的真核表达质粒：
a)将合成的HamRz-BamHI-HdvRz的片段(两端带有HindIII和XbaI酶切位点)通过HindIII和XbaI双酶切后连接到载体pcDNA3.1(+)，得到pcDNA-Ham-BamHI-Hdv；
b)将RGNNV感染SSN-1细胞的样品提取总RNA并反转录为cDNA；以RNA1-FW(SEQ IDNO.1)和RNA1-BW(SEQ ID NO.2)作为引物扩增RNA1基因，以RNA2-FW(SEQ ID NO.3)和RNA2-BW(SEQ ID NO.4)作为引物扩增RNA2基因，将扩增的基因回收；将载体pcDNA-Ham-BamHI-Hdv用BamHI酶切线性化并回收，将RNA1和RNA2两个基因通过同源重组的方法分别连接到质粒载体pcDNA-Ham-BamHI-Hdv，得到的质粒命名为pcDNA-RNA1和pcDNA-RNA2。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明采用CMV启动子的质粒，可以直接依靠细胞内的RNA聚合酶II驱动，比起采用T7聚合酶启动子的质粒，不需要表达T7聚合酶的细胞系，使病毒拯救更加便捷。
2.该病毒拯救技术克服了鱼类细胞因为转染效率很低而拯救困难的问题。我们首次将人293T细胞-鱼SSN-1细胞组合的方法进行鱼类神经坏死病毒的拯救，最终成功拯救出病毒。该发明为其他鱼类神经坏死病毒拯救提供了技术指导。
附图说明
图1：比较RGNNV在SSN-1细胞和GF-1细胞的复制效果。
图2：用于构建RGNNV基因组质粒的pcDNA3.1(+)的图谱。
图3：构建RGNNV基因组质粒的模型图。
图4：比较SSN-1和293T细胞转染效率，A为SSN-1细胞，B为293T细胞。
图5：RGNNV拯救过程的模型图及其拯救结果。
具体实施方式
实验材料说明：
赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)分离自赤点石斑鱼，由华中农业大学水产学院病毒学实验室保存，条纹月鳢细胞(SSN-1)、石斑鱼鳍条细胞(GF-1)、293T细胞由华中农业大学水产学院病毒学实验室保存，申请人保证自申请日起向公众发放该生物材料用以实验验证；pcDNA3.1(+)、pEGFP-N1质粒均可通过商业途径购买获得。
实施例1比较RGNNV在SSN-1细胞和GF-1细胞的复制效果
将RGNNV感染GF-1、SSN-1细胞，同时设置不感染RGNNV的对照组(Mock)，在感染后72小时，观察细胞病变情况并拍照。弃掉培养液，用预冷的PBS洗2次，再加入适量预冷的PBS孵育细胞2-3min，用移液枪轻轻将细胞从培养板中吹下，收集到1.5ml离心管中。4℃，3,000g离心10min。倒掉上清，用40-100μl的预冷PBS重悬细胞沉淀，加入相应体积的5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水煮10min。
夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板，按照说明书配置分离胶，将制好的分离胶约5ml迅速灌入两玻璃板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需的空间，在分离胶上加入一层异丙醇，置室温约1h后，清除覆盖层液体，用去离子水洗凝胶顶部数次，用滤纸吸净残留液体。再灌入5％的浓缩胶，立即插入梳子，置于室温聚合30min左右，待胶全部聚合后移出梳子，用水洗去加样槽中残留的液体，固定于垂直电泳装置中。向电泳装置中加入适量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，每孔加入10μl样品。接通电源，电压调到80V，待溴酚蓝指示剂跑到分离胶中，将电压调成120V，待溴酚蓝指示剂跑到分离胶底部时结束电泳。
当SDS-PAGE电泳结束后，取出电泳后的凝胶，用转膜仪转印装置将蛋白条带电转印到NC膜上，以9V恒压电转印30min。具体步骤如下:将凝胶多余部分切掉，转移到转膜缓冲液中浸泡10min，剪与胶大小相同的NC膜，以及2份6层滤纸，并放在转膜缓冲液中浸泡10min。按照滤纸、NC膜、凝胶、滤纸的顺序铺到转膜仪器中，每铺一层都要赶去气泡。电转印结束后打开转膜仪观察，确定条带都转到了NC膜上。
配制5％的脱脂奶粉，将膜平铺在封闭液中，蛋白面向下，置摇床上封闭2h。把膜从封闭液中夹出剪去边缘，用TBST溶液洗3次，每次15min，倒掉冲洗液。将膜平铺入一抗(RGNNV的衣壳蛋白Capsid抗体或内参β-actin抗体)溶液中，蛋白面朝下，置摇床上封闭2h。用1×TBST洗3次，每次15min，倒掉冲洗液。加入荧光二抗溶液，摇床上孵育1h。盒子外面需要用锡箔纸包裹。加入1×TBST洗3次，每次15min，然后用双色激光成像仪扫成像。结果表明RGNNV感染SSN-1细胞引起的细胞病变比感染GF-1细胞更明显。且RGNNV在SSN-1细胞比GF-1细胞复制更好(图1)。
实施例2 RGNNV基因组质粒的构建
将合成的HamRz-BamHI-HdvRz的片段(两端带有HindIII和XbaI酶切位点)通过HindIII和XbaI(购自宝生物工程(大连)有限公司)酶切，同时对pcDNA3.1(+)质粒(图2)通过HindIII和XbaI酶切，将酶切的片段和pcDNA3.1(+)质粒回收，用T4 DNA ligase(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接，连接体系如下：
Figure BDA0002431880980000051
16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养12-16小时，挑菌进行菌液PCR鉴定，阳性克隆送测序(武汉擎科生物技术有限公司)，得到的重组质粒命名为pcDNA-Ham-BamHI-Hdv。
表1引物序列
Figure BDA0002431880980000052
将RGNNV感染SSN-1细胞，感染后24小时，弃掉培养液，加入1ml Trizol试剂，室温作用10min，加入200μl的氯仿，涡旋混匀，室温静止5min，12,000g 4℃离心15min，吸取上清至新的RNase-free离心管，加入与上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min，12,000g 4℃离心10min，弃上清，加1ml75％乙醇，颠倒混匀，12,000g 4℃离心5min，弃上清保留沉淀，干燥2-5min，将管壁的液体吸掉，最后将RNA沉淀溶于20μl RNase-free的H2O。得到的RNA立即进行反转录，根据诺唯赞的反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，方法如下：
第一步：
Figure BDA0002431880980000053
用移液器轻轻吹打混匀，42℃，2min
第二步：
5×HiSctipt Select qRTSuperMixⅡ 4μl；
用移液器轻轻吹打混匀，50℃15min；
85℃2min。
得到的cDNA进行PCR扩增，首先根据RGNNV的基因组序列(参照GenBank登录号为AY369136.1)设计RNA1、RNA2的引物RNA1-FW、RNA1-BW、RNA2-FW和RNA2-BW(如表1所示)。以RNA1-FW和RNA1-BW作为引物扩增RNA1基因，以RNA2-FW和RNA2-BW作为引物扩增RNA2基因。在PCR反应管中加入反转录产物2μl，Primer star mix 25μl，上下游引物各1μl，最后用ddH2O将终体积调至50μl，混匀后于PCR仪上进行扩增。PCR扩增程序为：变性98℃10s，退火55℃5s，延伸72℃30s/kb，运行30个循环。
将载体pcDNA-Ham-BamHI-Hdv用BamHI酶切线性化并回收，将扩增得到的RNA1和RNA2两个基因用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(北京全式金生物技术有限公司)连接到载体pcDNA-Ham-BamHI-Hdv，50℃15min，转化DH5α感受态细菌，37℃培养12-16小时，挑菌进行菌液PCR鉴定，阳性克隆送测序(武汉擎科生物技术有限公司)，得到的质粒命名为pcDNA-RNA1和pcDNA-RNA2(图3)。
实施例3SSN-1细胞与293T细胞转染效率比较
于转染前24小时准备好转染用的SSN-1细胞和293T细胞。将绿色荧光质粒PEGFP-N1 4μg稀释至400μl无血清OPTI-MEM培养基中，加入12μl转染试剂TransIntroTM ELTransfection Reagent(北京全式金生物技术有限公司)，轻轻吹吸10余次，充分混匀，室温结合30min。将6孔培养板中已培养约18-24h，80％-90％丰度、分布均匀、生长状况好的SSN-1细胞或293T细胞，用无血清、无抗生素的OPTI-MEM洗2次，每种细胞加入质粒和转染试剂的混合物200μl，再补加800μl OPTI-MEM覆盖于细胞上。SSN-1细胞在25℃培养箱中，293T细胞在37℃，5％CO2培养箱中。吸附6-8小时，换入2ml含10％血清的MEM(SSN-1细胞)或DMEM(293T细胞)培养基。24h后观察绿色荧光数量，结果发现，293T细胞的绿色荧光数量(图4B)明显多于SSN-1细胞(图4A)，说明293T细胞具有更高的转染效率。
实施例4 RGNNV基因组质粒共转染293T细胞
按照OMEGA公司的Endo-free Plasmid Mini Kit的步骤提取RGNNV基因组质粒，具体步骤如下：(1)将含有质粒(pCDNA-RNA1、pCDNA-RNA2)的大肠杆菌接种于含有氨苄抗性的10-20ml LB培养基中，37℃摇床培养12-16h；(2)将菌液于室温下12,000g离心2min以沉淀菌种；(3)弃去培养基，往沉淀中加入500μl Solution Ⅰ/RNaseA重悬菌液；(4)将细菌悬液转移到2ml的微量离心管中，加500μl的Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10次，直至其变为澄清的液体，室温静置2min；(5)往重悬混和液中加入250μl预冷的buffer N3，直至形成白色絮狀沉淀；(6)12,000g 4℃，离心10min，将上清转移至1.5ml的离心管中，加入0.1倍体积的ETR solution，颠倒7-10次混匀，冰上孵育10min，期间需要数次颠倒混匀，使其澄清；(7)将上述液体于42℃下孵育5min，裂解液又将再次出现浑浊；(8)室温下，12,000g离心3min，ETR溶液将在EP管底部形成蓝色分层；(9)将上清液移至另一新的2ml离心管中，加入1/2倍体积室温的无水乙醇，轻轻颠倒试管6-7次，室温放置1-2min；(10)转移700μl的混合液完全流过柱子，10,000g离心1min，室温弃废液，将剩余的液体全部流过柱子；(11)加500μl HBCbuffer,10,000g离心1min，弃掉废液；(12)加700μl Wash solution buffer,10,000g离心1min，弃掉废液，重复洗一次；(13)弃废液，12,000g离心3min，弃去余液，将柱子放到新的1.5ml的离心管中，加80-100μl去内毒素的EB洗脱柱子，室温孵育2min，12,000g离心1min，测定浓度，保存。
于转染前24小时准备好转染用的293T细胞。将质粒pCDNA-RNA1和pCDNA-RNA2各1μg稀释至200μl无血清OPTI-MEM培养基中，将6μl转染试剂TransIntroTM EL TransfectionReagent(北京全式金生物技术有限公司)加至质粒中，轻轻吹吸10余次，充分混匀，室温结合30min。同时设对照(只转染质粒pCDNA-RNA1或pCDNA-RNA2)。将6孔培养板中已培养约18-24h,80％-90％丰度、分布均匀、生长状况好的293T细胞，用无血清、无抗生素的OPTI-MEM洗2次，加入质粒和转染试剂的混合物，再补加800μl OPTI-MEM覆盖于细胞上，在37℃，5％CO2培养箱中吸附6-8小时，换入2ml含10％血清的DMEM培养基。转染后每天观察并记录病变情况，在转染后的第3天，发现实验组和对照组细胞正常，没有明显病变。
实施例5拯救的RGNNV在SSN-1细胞上增殖
收集实施例4中的293T细胞，反复冻融三次，10,000g 4℃离心10min。将上清转接到SSN-1细胞中，孵育2小时后，换成含5％FBS的L-15培养基，观察并记录细胞的病变情况(图5A)。在转接后的72小时，实验组和对照组没有明显病变(图5B)。对收取细胞样品进行western blot检测病毒Capsid蛋白和内参β-actin。步骤如下：
首先弃掉培养基，用预冷的PBS洗2次细胞，再加入适量预冷的PBS孵育细胞2-3min，用移液枪轻轻将细胞从培养板中吹下，收集到1.5ml离心管中。3,000rpm/min 4℃离心10min。倒掉上清，用40-100μl的预冷的PBS重悬细胞沉淀，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水煮12min，-20℃保存。
夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板，根据目的蛋白的大小配制12％的分离胶，将制好的分离胶约5ml迅速灌入两玻璃板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需的空间，在分离胶上加入一层异丙醇，置室温聚合30min左右。分离胶聚合后，弃掉覆盖层液体，用去离子水洗凝胶顶部数次，用滤纸洗净残留液体。再灌入5％的浓缩胶，立即插入梳子，置于室温聚合30min左右，待胶全部聚合后移出梳子，用水洗去加样槽中残留的液体，用针头拨掉加样槽的胶将齿弄直，固定于垂直电泳装置中。
向电泳装置中加入适量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，取处理好的样品上样，每孔加入10μl的样品。接通电源，电压调到80V，待溴酚蓝指示剂跑到分离胶中，将电压调成120V，待溴酚蓝指示剂跑到分离胶底部时，结束电泳。
当SDS-PAGE电泳结束后，取SDS-PAGE电泳后的凝胶，不经染色，直接用转膜仪转印装置将蛋白条带电转印到NC膜上，以9V恒压电转印30min。操作步骤如下：戴上手套，将凝胶多余部分切掉，转移到转膜缓冲液中浸泡10min，同时根据胶的大小，剪大小相同的NC膜，同时剪2份6层滤纸，滤纸和膜同样在转膜缓冲液中浸泡10min。按照滤纸、NC膜、凝胶、滤纸的顺序铺到转膜仪器中，每铺一层都要赶赶气泡。结束后打开转膜仪观察，确定条带都转到了NC膜上。
配制封闭液5％的脱脂奶粉，将膜用镊子夹出平铺在封闭液中，蛋白面向下，置摇床上封闭1小时。把膜从封闭液中夹出剪去边缘，用TBST溶液洗3次，每次10min，倒掉冲洗液。将膜平铺入一抗(RGNNV病毒Capsid蛋白的抗体由本实验制备并保存，β-actin抗体购买自ABclonal公司)溶液中，蛋白面朝下，放在4℃的冰箱中，孵育过夜。倒掉一抗，用1×TBST洗3次，每次10min，倒掉冲洗液。二抗是FITC标记荧光二抗(购自ABclonal公司)，加入的时候需要避光。加入二抗溶液，摇床上孵育1小时。盒子外面需要用锡箔纸包裹，避光。加入1×TBST洗3次，每次10min，然后用双色激光成像仪扫描成像。
结果表明：实验组能检测到病毒Capsid蛋白，而对照组检测不到(图5B)，表明成功拯救出RGNNV。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒反向遗传系统的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaaaggaat tcctatagtc gtaacatcac cttcttgctc tg 42
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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Claims (4)

1.一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV反向遗传系统的方法，其特征在于，以CMV为启动子构建含RGNNV基因组的真核表达质粒，采用人胚肾293T细胞-条纹月鳢细胞SSN-1组合的方式拯救RGNNV，包括以下步骤：
1）提取RGNNV的RNA并反转录成cDNA，PCR扩增RGNNV基因组的RNA1和RNA2基因，将RNA1和RNA2基因分别连接到质粒载体的锤头状核酶HamRz序列和丁型肝炎核酶HdvRz序列之间，所述的质粒载体含CMV启动子 ；
2）将构建的含RGNNV基因组的真核表达质粒共转染293T细胞，拯救RGNNV；
3）收集转染后的293T细胞，冻融后离心取上清，转接条纹月鳢细胞SSN-1，拯救的RGNNV在SSN-1细胞中大量增殖。
2.根据权利要求1所述的构建赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV反向遗传系统的方法，其特征在于，所述的含CMV启动子的质粒载体是pcDNA-Ham-BamHI-Hdv，该质粒载体是通过将HamRz-BamHI-HdvRz片段连接到质粒载体pcDNA3.1(+)得到。
3.根据权利要求2所述的构建赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV反向遗传系统的方法，其特征在于，采用下述方法构建含RGNNV基因组的真核表达质粒：将RGNNV感染SSN-1细胞的样品提取总RNA并反转录为cDNA，分别扩增RNA1基因和RNA2基因，回收扩增基因；将载体pcDNA-Ham-BamHI-Hdv用BamHI酶切线性化并回收，将RNA1和RNA2两个基因通过同源重组的方法分别连接到质粒载体pcDNA-Ham-BamHI-Hdv，得到的质粒命名为pcDNA-RNA1和pcDNA-RNA2。
4.根据权利要求3所述的构建RGNNV反向遗传系统的方法，其特征在于，RNA1基因的扩增引物如SEQ ID NO.1和2所示，RNA2基因的扩增引物如SEQ ID NO.3和4所示。
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