CN109872774A - 一种基于yess分析原核生物中蛋白相互作用的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种基于酵母内质网滞留信号筛选系统‑‑Yeast Endoplasmic reticulum Sequestration System(YESS)分析原核生物中蛋白相互作用的方法，基于pESD‑PPI质粒构建带有gfp和mCherry荧光基因的能进行Golden gate组装的表达质粒pESD‑PPI‑GFP‑mCherry；从UniProt数据库上运动发酵单胞菌中已有的数据中选择5对相互作用的蛋白对和未被报道有相互作用的蛋白对分别作为研究运动发酵单胞菌中蛋白相互作用的正对照和负对照；并对分析结果进行量化。本发明提供的用于原核生物蛋白相互作用的方法，可以达到对运动发酵单胞菌中蛋白相互作用进行高通量、定量研究。本方法具有简单、易于操作、高效、灵敏等诸多优点。

Description

一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

研究蛋白-蛋白相互作用在诸多生物学领域中有着极其重要的意义，对于解析细胞胞内的多种代谢过程，调控网络以及能量转化的分子机理至关重要。

目前，验证蛋白-蛋白相互作用的方法主要包括几种经典的实验技术：酵母双杂交技术，大肠杆菌杂交技术，pull-down技术等等。酵母双杂交技术的特点在于灵敏、高效、高通量自动化。但在实际应用过程中存在诸多缺点，例如假阴性和假阳性太高；转化效率低；两蛋白在不同的载体上，其表达量受载体复制数的影响；同时由于反应发生在细胞核内，所以也并非适用于所有的蛋白质。pull-down技术需要纯化蛋白，不能坚持瞬时的蛋白相互作用并且具有假阳性。大肠杆菌杂交技术的宿主是原核生物，会造成很多假阳性和假阴性，并且该技术未实现高通量。

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有的普遍技术中，由于技术问题或者物种同源性问题导致的假阳性和假阴性太高。

现有的技术无法将原核生物中蛋白相互作用的关系强度进行量化。

现有的技术，能进行高通量的方法中，不适用于所有类型的蛋白。例如酵母双杂交技术反应发生在细胞核内，所以也并非适用于所有的蛋白质；或者不能检测瞬时的蛋白相互作用网络，例如pull-down，Co-IP，TAP。

解决上述技术问题的意义：

该方法可以解决上述问题，提供一种低假阳性和假阴性、高蛋白覆盖率、高通量、能检测瞬时相互作用的蛋白并能定量蛋白相互作用强弱的研究方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法。

本发明是这样实现的，一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法包括：

基于pESD-PPI质粒构建带有GFP和mCherry荧光基因的能进行Golden gate组装表达质粒pESD-PPI-GFP-mCherry；

从数据库UniProt上分别选择5对运动发酵单胞菌中相互作用的蛋白对和未被报道有相互作用的蛋白对分别作为分析运动发酵单胞菌中蛋白相互作用的正对照和负对照；

对分析结果进行量化，量化的公式：单荧光比例/(单荧光比例+双荧光比例)*100％。

进一步，表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry构建方法包括：

1)以F-1和R-1为引物，mCherry基因为模板扩增片段1；

2)以片段1为模板，F-2和R-2为引物扩增片段2；

3)以片段2为模板，F-3和R-2为引物扩增片段3；

4)以pESD-PPI为模板，F-4和R-3为引物扩增片段4；

5)以片段3和片段4为模板，F-3和R-3为引物扩增片段5；

6)用NdeI和SalI酶切载体pESD-PPI，获得酶切载体1；

7)利用Gibson装配试剂盒组装片段5和酶切载体1，转化大肠杆菌感受态，获得含mC herry的表达载体pESD-PPI-mCherry；

8)以pEZ15a-lacUV5-GFP为模板，F-5和R-4为引物扩增片段6；

9)以片段6为模板，F-5和R-5为引物扩增片段7；

10)以pESD-PPI为模板，F-6和R-6为引物扩增片段8；

11)以片段8和片段7为模板，F-6和R-5为引物扩增片段9；

12)用PstI和BamHI酶切载体pESD-PPI-mCherry，获得酶切载体2；

13)利用Gibson装配试剂盒组装片段9和酶切载体2，转化大肠杆菌感受态，获得含GFP和mCherry的表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry。表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry序列SEQ ID NO：5：CGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACTGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAGAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTTCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGaTCaCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGCAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCCGACAGGTTATCAGCAACAACACAGTCATATCCATTCTCAATTAGCTCTACCACAGTGTGTGAACCAATGTATCCAGCACCACCTGTAACCAAAACAATTTTAGAAGTACTTTCACTTTGTAACTGAGCTGTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATTCTTACTTTTTTTTTGGATGGACGCAAAGAAGTTTAATAATCATATTACATGGCATTACCACCATATACATATCCATATCTAATCTTACTTATATGTTGTGGAAATGTAAAGAGCCCCATTATCTTAGCCTAAAAAAACCTTCTCTTTGGAACTTTCAGTAATACGCTTAACTGCTCATTGCTATATTGAAGTACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTTCACCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCGAATTCCCTACTTCATACATTTTCAATTAAGATGCAGTTACTTCGCTGTTTTTCAATATTTTCTGTTATTGCTTCAGTTTTAGCAAGCTTGTTTAAGGGGCCGCGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCATTTGTTTCGCCGCAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTCTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGCGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTGAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTCATGAATTGATAATAGCTCGAGATCTGATAACAACAGTGTAGATGTAACAAAATCGACTTTGTTCCCACTGTACTTTTAGCTCGTACAAAATACAATATACTTTTCATTTCTCCGTAAACAACATGTTTTCCCATGTAATATCCTTTTCTATTTTTCGTTCCGTTACCAACTTTACACATACTTTATATAGCTATTCACTTCTATACACTAAAAAACTAAGACAATTTTAATTTTGCTGCCTGCCATATTTCAATTTGTTATAAATTCCTATAATTTATCCTATTAGTAGCTAAAAAAAGATGAATGTGAATCGAATCCTAAGAGAATTGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCCTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCtCCaGCTTCTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTCTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGGATCAAGATTGTACGTAAGGTGACAAGCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATCTGGCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGATGCTGTCTATTAAATGCTTCCTATATTATATATATAGTAATGTCGTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGGGGCCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGAATTGGAGCGACCTCATGCTATACCTGAGAAAGCAACCTGACCTACAGGAAAGAGTTACTCAAGAATAAGAATTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTCACTTTAAAATTTGTATACACTTATTTTTTTTATAACTTATTTAATAATAAAAATCATAAATCATAAGAAATTCGCTTATTTAGAAGTGTCAACAACGTATCTACCAACGATTTGACCCTTTTCCATCTTTTCGTAAATTTCTGGCAAGGTAGACAAGCCGACAACCTTGATTGGAGACTTGACCAAACCTCTGGCGAAGAATTGttaattaaGTCAAGTTTGGAAGTTGGTTGTCACAAGACATATGCGCTCTTCCCTTTGTGGCTCTCTAAATTTCAGCTTTTGAGGAAATGGTGGGAAATCCTTAGGCATGCGAATAATTATCATGTCCCTCTCATCAATGAGGTGTTGTTGCAAAGTCGTGGTGTTCTTGACCTTGAATACACCATGTAGTGATTGGACCAACAGTGTTCCATTATTGCGGCGAAACAAATGCTTGTTTGTAATGATGAAGGGACCAAATCCAATACCATACAACGATGTTGTGTGCCCATCAGATTCATTCGTCAAATGACAAATGGTGCTCGATATCGGGTTGTAATCACGCGGCCCCTTAAACAAGCTTTCTCCGCTGCCGTTGCTCGCGCCCGGGTTGCTCGGGCTCGCGCTGCTGGTATCTTTCGCCAGGCTGCTGCTCGCGGTGGTGCAGCTTTCATCCTGCGGGCCCAGGCTCGGCGGGGTGCGGCCGCGCGCaGAGACCataaaacgaaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttgatgcctggagatccttactcgagtttggatccttacttgtacagctcgtccatgccgagagtgatcccggcggcggtcacgaactccagcaggaccatgtgatcgcgcttctcgttggggtctttgctcagcacggactgggtgctcaggtagtggttgtcgggcagcagcacggggccgtcgccgatgggggtgttctgctggtagtggtcggcgagctgcacgctgccgtcctccacgttgtggcggatcttgaagttggccttgatgccgttcttctgcttgtcggcggtgatatagacgttgtggctgttgaagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtaggtgccgtcgtccttgaagctgatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcagatgaacttcagggtcagcttgccgttggtggcatcgccctcgccctcgccgcgcacgctgaacttgtggccgtttacgtcgccgtccagctcgaccaggatgggcaccaccccggtgaacagctcctcgcccttgctcaccatatgtatatctccttcttaaaagatcttttgaattctgaaattgttatccgctcacaattccacacattatacgagccggaagcataaagtgtaaaGGTCTCgTGCTAAAACTGAAGCAATAACAGAAAATATTGAAAAACAGCGAAGTAACTGCATTGCAGACTAGTGCGGCCGCcctttagtgagggttgaattttcaaaaattcttactttttttttggatggacgcaaagaagtttAATAATCATATTACATGGCATTACCACCATATACATATCCATATACATATCCATATCTAATCTTACTTATATGTTGTGGAAATGTAAAGAGCCCCATTATCTTAGCCTAAAAAAACCTTCTCTTTGGAACTTTCAGTAATACGCTTAACTGCTCATTGCTATATTGAAGTACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTCACCGGTCGCGTTCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACACATCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagtatcaacaaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaccccgtaatacgactcactatagggcccgggcgATGCAACTTTTGAGATGCTTCAGTATTTTCAGCGTCATCGCCAGTGTGCTGGCCAGAGACCttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagcATGGTTAGCAAAGGTGAAGAAGATAACATGGCCATCATCAAGGAATTTATGCGCTTCAAGGTTCATATGGAAGGTAGCGTCAATGGCCATGAATTTGAAATCGAAGGCGAAGGTGAAGGCCGTCCGTATGAAGGCACCCAGACCGCCAAATTGAAAGTTACCAAAGGCGGTCCGTTGCCGTTTGCTTGGGATATCTTGAGCCCGCAATTCATGTATGGTAGCAAAGCCTATGTCAAACATCCGGCTGATATTCCGGATTATTTGAAATTGAGCTTTCCGGAAGGCTTCAAATGGGAACGCGTTATGAATTTCGAAGATGGCGGTGTTGTCACCGTCACCCAGGATAGCAGCTTGCAAGATGGTGAATTTATCTATAAGGTTAAATTGCGTGGCACCAATTTCCCGAGCGATGGCCCGGTCATGCAGAAGAAAACCATGGGCTGGGAAGCCAGCAGCGAACGCATGTATCCGGAAGATGGTGCTTTGAAAGGCGAAATCAAGCAGCGTTTGAAATTGAAGGATGGCGGTCATTATGATGCCGAAGTTAAGACCACCTATAAGGCTAAAAAACCGGTTCAATTGCCGGGTGCCTATAACGTCAACATCAAATTGGATATCACCAGCCATAACGAAGATTATACCATTGTCGAACAGTATGAACGCGCTGAAGGCCGTCATAGCACCGGCGGTATGGATGAATTGTATAAATAAtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttataGGTCTCACGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCGCCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGCGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTGAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTCATGAATGAACTGGTGTATAGCCAGGGCTCATGATGTAGatccgctctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaagatccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc。

进一步，表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry构建方法进一步包括：

1)构建蛋白的表达载体：

与NH2-TEVF融合表达蛋白的基因引物：

F：agcgtgGGTCTCaGCGC+基因上游引物；

R：GTGCTGGGTCTCcAGCA+基因下游引物；

与COOH-TEVF融合表达蛋白的基因引物：

F：agcgtgGGTCTCAGGCC+基因上游引物；

R：GTGCTGGGTCTCTGCCGCC+基因下游引物；

扩增基因片段，并纯化；

Golden gate组装载体和片段。体系：0.05mol基因片段,20ng pESD-PPI-GFP-mCherry，1μL T4ligase buffer(Thermo)，0.2μL T4ligase(Thermo)，0.3μL BsaI(NEB)，0.1μL BSA(Takara)；反应程序：37℃，3h；

转化大肠杆菌感受态；

挑取不发荧光的单菌落做菌体PCR，测序；

2)转化酵母EBY-100：

酵母划线活化；

挑取单菌落到1mL YPD培养基中过夜，30℃，220rpm；

第二天早上测量OD_600nm,加入适量YPD，将OD_600nm调到0.1；

30℃220rpm培养4-5h后，OD_600nm＝0.4-0.6；

6,000rpm离心2min，弃上清；

1mL无菌水洗一次，6,000rpm离心2min，1mL 0.1M LiAc/TE洗一次，6,000rpm离心2min；

100μL 0.1M LiAc重悬，20μL菌液+2μL质粒；

62.4μL 50％PEG3350；

8.23μL 1M LiAc；

9.58μL DMSO；

6μL 50mg/mL ssDNA；

30℃培养箱 30min-1h；

42℃水浴锅 15min；

用200μL-1mL 5mmol/L CaCl₂洗一次，6,000rpm离心2min；

101μL 5mmol/L CaCl₂重悬，涂SD-UT平板；

3)酵母表面展示：

挑取单菌落至800μL SD-UT培养基中培养过夜；

转移合适的菌液于800μL SD-DT培养基中，使起始OD_600nm＝0.8；

取10⁶个细胞，用Buffer B洗一次，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清；

用150μL Buffer B洗一次，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清；

每个样品中加20μL Buffer B+0.15uL抗体，避光于4℃避光放置15min；

转到室温30min，避光；

取出样品，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清，用150uL的Buffer B洗一遍；

加入150μL Buffer C(1*PBS)重悬细胞，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清；

加300μL Buffer C重悬细胞，转移到2mL EP管中，流式细胞仪进行结果展示。

本发明的另一目的在于提供一种实施所述的基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法的Y2H的自动化平台。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明提供的用于原核生物蛋白相互作用的方法，可以达到对运动发酵单胞菌中蛋白相互作用进行低假阳性和假阴性、高蛋白覆盖率、高通量、能检测瞬时相互作用的蛋白并能定量蛋白相互作用强弱的研究。本方法具有简单、易于操作、高效、灵敏等诸多优点。

本发明以酵母为模式菌株，利用酵母内质网滞留信号筛选系统--YeastEndoplasmic reticulum Sequestration System(YESS)研究原核生物Zymomonas mobilis中蛋白相互作用，并结合了一种Golden gate的组装技术以及基于流式细胞术分选的筛选系统用于高通量和定量研究原核生物中蛋白相互作用的强度。该方法对比经典研究原核生物蛋白相互作用(Y2H)的方法的特点：

附图说明

图1是本发明实施例提供的pESD-PPI-GFP-mCherry的质粒图谱和pESD-PPI-GFP-mCherry双向启动子两端基因片段示意图。

图中：A：pESD-PPI-GFP-mCherry的质粒图谱；B：pESD-PPI-GFP-mCherry双向启动子两端基因片段示意图。

图2是本发明实施例提供的pEZ15a-lacUV5-GFP的质粒图谱。

图3是本发明实施例提供的UniProt数据库中被报道的5对相互作用的蛋白对(N-Prs a nd C-Pth,N-Prs and C-PyrE,N-Prs and C-ZMO1200,N-Prs and C-ZMO1686,N-HisG and C-ZMO1686)以及未被报道的5对蛋白对(N-HisG and C-PyrE,N-HisG and C-ZMO1200,N-PurF and C-ZMO1686,N-PurF and C-ZMO1200,N-PurF and C-PyrE)。

图4是本发明实施例提供的YESS体系验证5对正对照和5对负对照图。

图5是本发明实施例提供的UniProt数据库中与Hfq有关系的10对蛋白图。

图6是本发明实施例提供的YESS体系验证UniProt数据库中10对蛋白与Hfq的相互作用图。

图7是本发明实施例提供的对该体系的结果进行量化图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有酵母双杂交技术中，在实际应用过程中假阴性和假阳性太高；转化效率低；两蛋白在不同的载体上，其表达量受载体复制数的影响；同时由于反应发生在细胞核内，所以也并非适用于所有的蛋白质。

pull-down技术需要纯化蛋白，不能坚持瞬时的蛋白相互作用并且具有假阳性。

大肠杆菌杂交技术的宿主是原核生物，会造成很多假阳性和假阴性，并且该技术未实现高通量。

为解决上述问题，下面结合具体方案对本发明作详细描述。

本发明实施例提供的基于YESS(Yeast Endoplasmic reticulum SequestrationSystem)分析原核生物中蛋白相互作用的方法包括：

(1)首先基于pESD-PPI质粒构建带有GFP和mCherry荧光基因的能进行Goldengate组装表达质粒pESD-PPI-GFP-mCherry(图1A和图1B)。

1)以F-1和R-1为引物，mCherry基因为模板扩增片段1。

2)以片段1为模板，F-2和R-2为引物扩增片段2。

3)以片段2为模板，F-3和R-2为引物扩增片段3。

4)以pESD-PPI为模板，F-4和R-3为引物扩增片段4。

5)以片段3和片段4为模板，F-3和R-3为引物扩增片段5。

6)用NdeI和SalI酶切载体pESD-PPI，获得酶切载体1。

7)利用Gibson装配试剂盒组装片段5和酶切载体1，转化大肠杆菌感受态，获得含mC herry的表达载体pESD-PPI-mCherry。

表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry序列SEQ ID NO：5：CGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACTGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAGAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTTCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGaTCaCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGCAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCCGACAGGTTATCAGCAACAACACAGTCATATCCATTCTCAATTAGCTCTACCACAGTGTGTGAACCAATGTATCCAGCACCACCTGTAACCAAAACAATTTTAGAAGTACTTTCACTTTGTAACTGAGCTGTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATTCTTACTTTTTTTTTGGATGGACGCAAAGAAGTTTAATAATCATATTACATGGCATTACCACCATATACATATCCATATCTAATCTTACTTATATGTTGTGGAAATGTAAAGAGCCCCATTATCTTAGCCTAAAAAAACCTTCTCTTTGGAACTTTCAGTAATACGCTTAACTGCTCATTGCTATATTGAAGTACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTTCACCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCGAATTCCCTACTTCATACATTTTCAATTAAGATGCAGTTACTTCGCTGTTTTTCAATATTTTCTGTTATTGCTTCAGTTTTAGCAAGCTTGTTTAAGGGGCCGCGTGATTACAACCCGATATCGAGCACCATTTGTCATTTGACGAATGAATCTGATGGGCACACAACATCGTTGTATGGTATTGGATTTGGTCCCTTCATCATTACAAACAAGCATTTGTTTCGCCGCAATAATGGAACACTGTTGGTCCAATCACTACATGGTGTATTCAAGGTCAAGAACACCACGACTTTGCAACAACACCTCATTGATGGGAGGGACATGATAATTATTCGCATGCCTAAGGATTTCCCACCATTTCCTCAAAAGCTGAAATTTAGAGAGCCACAAAGGGAAGAGCGCATATGTCTTGTGACAACCAACTTCCAAACTAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCACCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGCGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTGAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTCATGAATTGATAATAGCTCGAGATCTGATAACAACAGTGTAGATGTAACAAAATCGACTTTGTTCCCACTGTACTTTTAGCTCGTACAAAATACAATATACTTTTCATTTCTCCGTAAACAACATGTTTTCCCATGTAATATCCTTTTCTATTTTTCGTTCCGTTACCAACTTTACACATACTTTATATAGCTATTCACTTCTATACACTAAAAAACTAAGACAATTTTAATTTTGCTGCCTGCCATATTTCAATTTGTTATAAATTCCTATAATTTATCCTATTAGTAGCTAAAAAAAGATGAATGTGAATCGAATCCTAAGAGAATTGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCCTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCtCCaGCTTCTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTCTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGGATCAAGATTGTACGTAAGGTGACAAGCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATCTGGCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGATGCTGTCTATTAAATGCTTCCTATATTATATATATAGTAATGTCGTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGGGGCCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGAATTGGAGCGACCTCATGCTATACCTGAGAAAGCAACCTGACCTACAGGAAAGAGTTACTCAAGAATAAGAATTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTCACTTTAAAATTTGTATACACTTATTTTTTTTATAACTTATTTAATAATAAAAATCATAAATCATAAGAAATTCGCTTATTTAGAAGTGTCAACAACGTATCTACCAACGATTTGACCCTTTTCCATCTTTTCGTAAATTTCTGGCAAGGTAGACAAGCCGACAACCTTGATTGGAGACTTGACCAAACCTCTGGCGAAGAATTGttaattaaGTCAAGTTTGGAAGTTGGTTGTCACAAGACATATGCGCTCTTCCCTTTGTGGCTCTCTAAATTTCAGCTTTTGAGGAAATGGTGGGAAATCCTTAGGCATGCGAATAATTATCATGTCCCTCTCATCAATGAGGTGTTGTTGCAAAGTCGTGGTGTTCTTGACCTTGAATACACCATGTAGTGATTGGACCAACAGTGTTCCATTATTGCGGCGAAACAAATGCTTGTTTGTAATGATGAAGGGACCAAATCCAATACCATACAACGATGTTGTGTGCCCATCAGATTCATTCGTCAAATGACAAATGGTGCTCGATATCGGGTTGTAATCACGCGGCCCCTTAAACAAGCTTTCTCCGCTGCCGTTGCTCGCGCCCGGGTTGCTCGGGCTCGCGCTGCTGGTATCTTTCGCCAGGCTGCTGCTCGCGGTGGTGCAGCTTTCATCCTGCGGGCCCAGGCTCGGCGGGGTGCGGCCGCGCGCaGAGACCataaaacgaaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttgatgcctggagatccttactcgagtttggatccttacttgtacagctcgtccatgccgagagtgatcccggcggcggtcacgaactccagcaggaccatgtgatcgcgcttctcgttggggtctttgctcagcacggactgggtgctcaggtagtggttgtcgggcagcagcacggggccgtcgccgatgggggtgttctgctggtagtggtcggcgagctgcacgctgccgtcctccacgttgtggcggatcttgaagttggccttgatgccgttcttctgcttgtcggcggtgatatagacgttgtggctgttgaagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtaggtgccgtcgtccttgaagctgatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcagatgaacttcagggtcagcttgccgttggtggcatcgccctcgccctcgccgcgcacgctgaacttgtggccgtttacgtcgccgtccagctcgaccaggatgggcaccaccccggtgaacagctcctcgcccttgctcaccatatgtatatctccttcttaaaagatcttttgaattctgaaattgttatccgctcacaattccacacattatacgagccggaagcataaagtgtaaaGGTCTCgTGCTAAAACTGAAGCAATAACAGAAAATATTGAAAAACAGCGAAGTAACTGCATTGCAGACTAGTGCGGCCGCcctttagtgagggttgaattttcaaaaattcttactttttttttggatggacgcaaagaagtttAATAATCATATTACATGGCATTACCACCATATACATATCCATATACATATCCATATCTAATCTTACTTATATGTTGTGGAAATGTAAAGAGCCCCATTATCTTAGCCTAAAAAAACCTTCTCTTTGGAACTTTCAGTAATACGCTTAACTGCTCATTGCTATATTGAAGTACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTCACCGGTCGCGTTCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACACATCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagtatcaacaaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaccccgtaatacgactcactatagggcccgggcgATGCAACTTTTGAGATGCTTCAGTATTTTCAGCGTCATCGCCAGTGTGCTGGCCAGAGACCttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagcATGGTTAGCAAAGGTGAAGAAGATAACATGGCCATCATCAAGGAATTTATGCGCTTCAAGGTTCATATGGAAGGTAGCGTCAATGGCCATGAATTTGAAATCGAAGGCGAAGGTGAAGGCCGTCCGTATGAAGGCACCCAGACCGCCAAATTGAAAGTTACCAAAGGCGGTCCGTTGCCGTTTGCTTGGGATATCTTGAGCCCGCAATTCATGTATGGTAGCAAAGCCTATGTCAAACATCCGGCTGATATTCCGGATTATTTGAAATTGAGCTTTCCGGAAGGCTTCAAATGGGAACGCGTTATGAATTTCGAAGATGGCGGTGTTGTCACCGTCACCCAGGATAGCAGCTTGCAAGATGGTGAATTTATCTATAAGGTTAAATTGCGTGGCACCAATTTCCCGAGCGATGGCCCGGTCATGCAGAAGAAAACCATGGGCTGGGAAGCCAGCAGCGAACGCATGTATCCGGAAGATGGTGCTTTGAAAGGCGAAATCAAGCAGCGTTTGAAATTGAAGGATGGCGGTCATTATGATGCCGAAGTTAAGACCACCTATAAGGCTAAAAAACCGGTTCAATTGCCGGGTGCCTATAACGTCAACATCAAATTGGATATCACCAGCCATAACGAAGATTATACCATTGTCGAACAGTATGAACGCGCTGAAGGCCGTCATAGCACCGGCGGTATGGATGAATTGTATAAATAAtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttataGGTCTCACGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAAGAGCATGTCTAGCATGGTGTCAGACACTAGTTGCACATTCCCTTCATCTGATGGCATATTCTGGAAGCATTGGATTCAAACCAAGGATGGGCAGTGTGGCAGTCCATTAGTATCAACTAGAGATGGGTTCATTGTTGGTATACACTCAGCATCGAATTTCGCCAACACAAACAATTATTTCACAAGCGTGCCGAAAAACTTCATGGAATTGTTGACAAATCAGGAGGCGCAGCAGTGGGTTAGTGGTTGGCGATTAAATGCTGACTCAGTATTGTGGGGGGGCCATAAAGTTTTCATGGTGAAACCTGAAGAGCCTTTTCAGCCAGTTAAGGAAGCGACTCAACTCATGAATGAACTGGTGTATAGCCAGGGCTCATGATGTAGatccgctctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaagatccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc。

8)以pEZ15a-lacUV5-GFP(图2，实验室已有)为模板，F-5和R-4为引物扩增片段6。

9)以片段6为模板，F-5和R-5为引物扩增片段7。

10)以pESD-PPI为模板，F-6和R-6为引物扩增片段8。

11)以片段8和片段7为模板，F-6和R-5为引物扩增片段9。

12)用PstI和BamHI酶切载体pESD-PPI-mCherry，获得酶切载体2。

13)利用Gibson装配试剂盒组装片段9和酶切载体2，转化大肠杆菌感受态，获得含GFP和mCherry的表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry。

(2)从数据库UniProt上分别选择5对运动发酵单胞菌中已知的相互作用的蛋白对和未被报道有相互作用的蛋白对分别作为该体系研究运动发酵单胞菌中蛋白相互作用的正对照和负对照(图3)。

(3)实验结果(图4)表明：被证实有相互作用的5对蛋白对都有相互作用，可能没有相互作用的蛋白对中PurF与PyrE有微弱的相互作用，其他负对照蛋白对没有相互作用，初步认定该体系可以用于研究原核生物中蛋白相互作用的研究。

(4)用该体系验证数据库UniProt中与Hfq有关联的10个蛋白(图5)。结果表明被验证有相互作用的蛋白对被该体系YESS验证仍有相互作用，没有被报道有相互作用的蛋白对也被验证有不同程度的相互作用(图6)。

(5)对该体系的结果进行量化，量化的公式(图7)：

单荧光比例/(单荧光比例+双荧光比例)*100％。

在本发明实施例中，F-1～F-6和R-1～R-6引物序列如下表。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

本发明实施例提供的基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法包括：

(1)构建蛋白的表达载体：

1)设计蛋白基因的引物

与NH2-TEVF融合表达蛋白的基因引物：

F：agcgtgGGTCTCaGCGC+基因上游引物SEQ ID NO：1。

R：GTGCTGGGTCTCcAGCA+基因下游引物SEQ ID NO：2。

与COOH-TEVF融合表达蛋白的基因引物：

F：agcgtgGGTCTCAGGCC+基因上游引物SEQ ID NO：3。

R：GTGCTGGGTCTCTGCCGCC-基因下游引物SEQ ID NO：4。

2)扩增基因片段，并纯化。

3)Golden gate组装载体和片段。体系：0.05mol基因片段(两个基因或者两个基因库),20ng pESD-PPI-GFP-mCherry，1μL T4ligase buffer(Thermo)，0.2μL T4ligase(Thermo)，0.3μL BsaI(NEB)，0.1μL BSA(takara)。反应程序：37℃，3h。

4)转化大肠杆菌感受态。

5)挑取不发荧光的单菌落做菌体PCR，已经测序。

(2)转化酵母EBY-100包括：

1)酵母划线活化。

2)挑取单菌落到1mL YPD(20g/L Glucose，10g/L Yeast extract，20g/LPeptone)培养基中过夜(30℃，220rpm)。

3)第二天早上测量OD_600nm,加入适量YPD，将OD_600nm调到0.1。

4)30℃220rpm培养4-5h后，OD_600nm＝0.4-0.6(每个样需要的菌液量1mL-5mL)。

5)6000rpm离心2min，弃上清。

6)1mL无菌水洗一次，6,000rpm离心2min，1mL 0.1M LiAc/TE洗一次，6,000rpm离心2min。

7)100μL 0.1M LiAc重悬，20μL菌液+2μL质粒。

8)30℃培养箱30min-1h。

9)42℃水浴锅15min。

10)用适量(200μL-1mL)5mmol/L CaCl2洗一次，6,000rpm离心2min。

11)100μL 5mmol/L CaCl2重悬，涂SD-UT(20g/L Galactose，6.7g/L YeastNitrogen Base W/O Amino Acid，10g/L Casamino acids，1.5％Agar)平板。

(3)酵母表面展示包括：

1)挑取单菌落至800μL SD-UT培养基中培养过夜。

2)转移合适的菌液于800μL SD-DT(2％Glucose；0.67％Yeast Nitrogen Base W/O Amino acids；1％Casamino acids)培养基中，使起始OD_600nm＝0.8。

3)取10⁶个细胞(10⁶＝10⁷*OD_600nm*V_体积)，用Buffer B(0.5％BSA+1*PBS：137mmol/LNaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄)洗一次，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清。

4)用150μL Buffer B洗一次，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清。

5)每个样品中加20μL Buffer B+0.15uL抗体(HA和Flag的荧光抗体)(棕色瓶子里的荧光抗体取10uL到pcr管里即可，注意用锡箔纸包着避光)，避光于4℃避光放置15min。

6)转到室温30min，避光。

7)取出样品，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清，用150uL的Buffer B洗一遍。

8)加入150μL Buffer C(1*PBS)重悬细胞，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清。

9)加300μL Buffer C重悬细胞。

转移到2mL EP管中，流式细胞仪进行结果展示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcgtgggtc tcagcgc 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgctgggtc tccagca 17

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcgtgggtc tcaggcc 17

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgctgggtc tctgccgcc 19

<210> 5

<211> 10701

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 60

taataatggt ttcttaggac ggatcgcttg cctgtaactt acacgcgcct cgtatctttt 120

aatgatggaa taatttggga atttactctg tgtttattta tttttatgtt ttgtatttgg 180

attttagaaa gtaaataaag aaggtagaag agttactgaa tgaagaaaaa aaaataaaca 240

aaggtttaaa aaatttcaca aaaagcgtac tttacatata tatttattag acagaaagca 300

gattaaatag atatacattc gattaacgat aagtaaaatg taaaatcaca ggattttcgt 360

gtgtggtctt ctacacagac aagatgaaac aattcggcat taatacctga gagcaggaag 420

agcaagataa aaggtagtat ttgttggcga tccccctaga gtcttttaca tcttcggaaa 480

acaaaaacta ttttttcttt aatttctttt tttactttct atttttaatt tatatattta 540

tattaaaaaa tttaaattat aattattttt atagcacgtg atgaaaagga cccaggtggc 600

acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 660

atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 720

agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 780

cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 840

gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 900

cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 960

tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 1020

ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 1080

ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 1140

atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt tttcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 1200

cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 1260

atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 1320

gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 1380

cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtgga 1440

tcacgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 1500

tacacgacgg gcagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 1560

gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 1620

gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 1680

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 1740

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 1800

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 1860

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 1920

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 1980

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 2040

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 2100

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagcattg agaaagcgcc 2160

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 2220

gagcgcacga gggagcttcc aggggggaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 2280

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcc gagcctatgg 2340

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 2400

atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 2460

gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 2520

gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc 2580

tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt 2640

tacctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcc tatgttgtgt 2700

ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag 2760

ctcggaatta accctcacta aagggaacaa aagctgggta cccgacaggt tatcagcaac 2820

aacacagtca tatccattct caattagctc taccacagtg tgtgaaccaa tgtatccagc 2880

accacctgta accaaaacaa ttttagaagt actttcactt tgtaactgag ctgtcattta 2940

tattgaattt tcaaaaattc ttactttttt tttggatgga cgcaaagaag tttaataatc 3000

atattacatg gcattaccac catatacata tccatatcta atcttactta tatgttgtgg 3060

aaatgtaaag agccccatta tcttagccta aaaaaacctt ctctttggaa ctttcagtaa 3120

tacgcttaac tgctcattgc tatattgaag tacggattag aagccgccga gcgggtgaca 3180

gccctccgaa ggaagactct cctccgtgcg tcctcgtctt caccggtcgc gttcctgaaa 3240

cgcagatgtg cctcgcgccg cactgctccg aacaataaag attctacaat actagctttt 3300

atggttatga agaggaaaaa ttggcagtaa cctggcccca caaaccttca aatgaacgaa 3360

tcaaattaac aaccatagga tgataatgcg attagttttt tagccttatt tctggggtaa 3420

ttaatcagcg aagcgatgat ttttgatcta ttaacagata tataaatgca aaaactgcat 3480

aaccacttta actaatactt tcaacatttt cggtttgtat tacttcttat tcaaatgtaa 3540

taaaagtatc aacaaaaaat tgttaatata cctctatact ttaacgtcaa ggagaaaaaa 3600

ccccggatcg aattccctac ttcatacatt ttcaattaag atgcagttac ttcgctgttt 3660

ttcaatattt tctgttattg cttcagtttt agcaagcttg tttaaggggc cgcgtgatta 3720

caacccgata tcgagcacca tttgtcattt gacgaatgaa tctgatgggc acacaacatc 3780

gttgtatggt attggatttg gtcccttcat cattacaaac aagcatttgt ttcgccgcaa 3840

taatggaaca ctgttggtcc aatcactaca tggtgtattc aaggtcaaga acaccacgac 3900

tttgcaacaa cacctcattg atgggaggga catgataatt attcgcatgc ctaaggattt 3960

cccaccattt cctcaaaagc tgaaatttag agagccacaa agggaagagc gcatatgtct 4020

tgtgacaacc aacttccaaa ctaagagcat gtctagcatg gtgtcagaca ctagttgcac 4080

attcccttca tctgatggca tattctggaa gcattggatt caaaccaagg atgggcagtg 4140

tggcagtcca ttagtatcaa ctagagatgg gttcattgtt ggtatacact cagcatcgaa 4200

tttcaccaac acaaacaatt atttcacaag cgtgccgaaa aacttcatgg aattgttgac 4260

aaatcaggag gcgcagcagt gggttagtgg ttggcgatta aatgctgact cagtattgtg 4320

ggggggccat aaagttttca tggtgaaacc tgaagagcct tttcagccag ttaaggaagc 4380

gactcaactc atgaattgat aatagctcga gatctgataa caacagtgta gatgtaacaa 4440

aatcgacttt gttcccactg tacttttagc tcgtacaaaa tacaatatac ttttcatttc 4500

tccgtaaaca acatgttttc ccatgtaata tccttttcta tttttcgttc cgttaccaac 4560

tttacacata ctttatatag ctattcactt ctatacacta aaaaactaag acaattttaa 4620

ttttgctgcc tgccatattt caatttgtta taaattccta taatttatcc tattagtagc 4680

taaaaaaaga tgaatgtgaa tcgaatccta agagaattga gctccaattc gccctatagt 4740

gagtcgtatt acaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc 4800

gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccccttcg ccagctggcg taatagcgaa 4860

gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcgac 4920

gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct 4980

acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg 5040

ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt 5100

gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca 5160

tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga 5220

ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa 5280

gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac 5340

gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc 5400

atctgtgcgg tatttcacac cgcaggcaag tgcacaaaca atacttaaat aaatactact 5460

cagtaataac ctatttctta gcatttttga cgaaatttgc tattttgtta gagtctttta 5520

caccatttgt ctccacacct ccgcttacat caacaccaat aacgccattt aatctaagcg 5580

catcaccaac attttctggc gtcagtccac cagctaacat aaaatgtaag ctttcggggc 5640

tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg agttccaatc caaaagttca cctgtccctc 5700

cagcttctga atcaaacaag ggaataaacg aatgaggttt ctgtgaagct gcactgagta 5760

gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc ttttaataac tggcaaaccg aggaactctt 5820

ggtattcttg ccacgactca tctccatgca gttggacgat atcaatgccg taatcattga 5880

ccagagccaa aacatcctcc ttaggttgat tacgaaacac gccaaccaag tatttcggag 5940

tgcctgaact atttttatat gcttttacaa gacttgaaat tttccttgca ataaccgggt 6000

caattgttct ctttctattg ggcacacata taatacccag caagtcagca tcggaatcta 6060

gagcacattc tgcggcctct gtgctctgca agccgcaaac tttcaccaat ggaccagaac 6120

tacctgtgaa attaataaca gacatactcc aagctgcctt tgtgtgctta atcacgtata 6180

ctcacgtgct caatagtcac caatgccctc cctcttggcc ctctcctttt cttttttcga 6240

ccgaattaat tcttaatcgg caaaaaaaga aaagctccgg atcaagattg tacgtaaggt 6300

gacaagctat ttttcaataa agaatatctt ccactactgc catctggcgt cataactgca 6360

aagtacacat atattacgat gctgtctatt aaatgcttcc tatattatat atatagtaat 6420

gtcgtttatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc 6480

gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg ggggccatcc 6540

gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca 6600

tcacccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt 6660

acgccagctg aattggagcg acctcatgct atacctgaga aagcaacctg acctacagga 6720

aagagttact caagaataag aattttcgtt ttaaaaccta agagtcactt taaaatttgt 6780

atacacttat tttttttata acttatttaa taataaaaat cataaatcat aagaaattcg 6840

cttatttaga agtgtcaaca acgtatctac caacgatttg acccttttcc atcttttcgt 6900

aaatttctgg caaggtagac aagccgacaa ccttgattgg agacttgacc aaacctctgg 6960

cgaagaattg ttaattaagt caagtttgga agttggttgt cacaagacat atgcgctctt 7020

ccctttgtgg ctctctaaat ttcagctttt gaggaaatgg tgggaaatcc ttaggcatgc 7080

gaataattat catgtccctc tcatcaatga ggtgttgttg caaagtcgtg gtgttcttga 7140

ccttgaatac accatgtagt gattggacca acagtgttcc attattgcgg cgaaacaaat 7200

gcttgtttgt aatgatgaag ggaccaaatc caataccata caacgatgtt gtgtgcccat 7260

cagattcatt cgtcaaatga caaatggtgc tcgatatcgg gttgtaatca cgcggcccct 7320

taaacaagct ttctccgctg ccgttgctcg cgcccgggtt gctcgggctc gcgctgctgg 7380

tatctttcgc caggctgctg ctcgcggtgg tgcagctttc atcctgcggg cccaggctcg 7440

gcggggtgcg gccgcgcgca gagaccataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct 7500

ttcgttttat ttgatgcctg gagatcctta ctcgagtttg gatccttact tgtacagctc 7560

gtccatgccg agagtgatcc cggcggcggt cacgaactcc agcaggacca tgtgatcgcg 7620

cttctcgttg gggtctttgc tcagcacgga ctgggtgctc aggtagtggt tgtcgggcag 7680

cagcacgggg ccgtcgccga tgggggtgtt ctgctggtag tggtcggcga gctgcacgct 7740

gccgtcctcc acgttgtggc ggatcttgaa gttggccttg atgccgttct tctgcttgtc 7800

ggcggtgata tagacgttgt ggctgttgaa gttgtactcc agcttgtgcc ccaggatgtt 7860

gccgtcctcc ttgaagtcga tgcccttcag ctcgatgcgg ttcaccaggg tgtcgccctc 7920

gaacttcacc tcggcgcggg tcttgtaggt gccgtcgtcc ttgaagctga tggtgcgctc 7980

ctggacgtag ccttcgggca tggcggactt gaagaagtcg tgctgcttca tgtggtcggg 8040

gtagcggctg aagcactgca cgccgtaggt cagggtggtc acgagggtgg gccagggcac 8100

gggcagcttg ccggtggtgc agatgaactt cagggtcagc ttgccgttgg tggcatcgcc 8160

ctcgccctcg ccgcgcacgc tgaacttgtg gccgtttacg tcgccgtcca gctcgaccag 8220

gatgggcacc accccggtga acagctcctc gcccttgctc accatatgta tatctccttc 8280

ttaaaagatc ttttgaattc tgaaattgtt atccgctcac aattccacac attatacgag 8340

ccggaagcat aaagtgtaaa ggtctcgtgc taaaactgaa gcaataacag aaaatattga 8400

aaaacagcga agtaactgca ttgcagacta gtgcggccgc cctttagtga gggttgaatt 8460

ttcaaaaatt cttacttttt ttttggatgg acgcaaagaa gtttaataat catattacat 8520

ggcattacca ccatatacat atccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 8580

tggaaatgta aagagcccca ttatcttagc ctaaaaaaac cttctctttg gaactttcag 8640

taatacgctt aactgctcat tgctatattg aagtacggat tagaagccgc cgagcgggtg 8700

acagccctcc gaaggaagac tctcctccgt gcgtcctcgt ctcaccggtc gcgttctgaa 8760

acgcagatgt gcctcgcgcc gcactgctcc gaacaataaa gattctacaa tactagcttt 8820

tatggttatg aagaggaaaa attggcagta acctggcccc acacatcttc aaatgaacga 8880

atcaaattaa caaccatagg atgataatgc gattagtttt ttagccttat ttctggggta 8940

attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgc aaaaactgca 9000

taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcggtttgta ttacttctta ttcaaatgta 9060

ataaaagtat caacaaaaaa attgttaata tacctctata ctttaacgtc aaggagaaaa 9120

accccgtaat acgactcact atagggcccg ggcgatgcaa cttttgagat gcttcagtat 9180

tttcagcgtc atcgccagtg tgctggccag agaccttgac ggctagctca gtcctaggta 9240

cagtgctagc atggttagca aaggtgaaga agataacatg gccatcatca aggaatttat 9300

gcgcttcaag gttcatatgg aaggtagcgt caatggccat gaatttgaaa tcgaaggcga 9360

aggtgaaggc cgtccgtatg aaggcaccca gaccgccaaa ttgaaagtta ccaaaggcgg 9420

tccgttgccg tttgcttggg atatcttgag cccgcaattc atgtatggta gcaaagccta 9480

tgtcaaacat ccggctgata ttccggatta tttgaaattg agctttccgg aaggcttcaa 9540

atgggaacgc gttatgaatt tcgaagatgg cggtgttgtc accgtcaccc aggatagcag 9600

cttgcaagat ggtgaattta tctataaggt taaattgcgt ggcaccaatt tcccgagcga 9660

tggcccggtc atgcagaaga aaaccatggg ctgggaagcc agcagcgaac gcatgtatcc 9720

ggaagatggt gctttgaaag gcgaaatcaa gcagcgtttg aaattgaagg atggcggtca 9780

ttatgatgcc gaagttaaga ccacctataa ggctaaaaaa ccggttcaat tgccgggtgc 9840

ctataacgtc aacatcaaat tggatatcac cagccataac gaagattata ccattgtcga 9900

acagtatgaa cgcgctgaag gccgtcatag caccggcggt atggatgaat tgtataaata 9960

atcacactgg ctcaccttcg ggtgggcctt tctgcgttta taggtctcac ggcggcggca 10020

gcggcggcgg cggcagcaag agcatgtcta gcatggtgtc agacactagt tgcacattcc 10080

cttcatctga tggcatattc tggaagcatt ggattcaaac caaggatggg cagtgtggca 10140

gtccattagt atcaactaga gatgggttca ttgttggtat acactcagca tcgaatttcg 10200

ccaacacaaa caattatttc acaagcgtgc cgaaaaactt catggaattg ttgacaaatc 10260

aggaggcgca gcagtgggtt agtggttggc gattaaatgc tgactcagta ttgtgggggg 10320

gccataaagt tttcatggtg aaacctgaag agccttttca gccagttaag gaagcgactc 10380

aactcatgaa tgaactggtg tatagccagg gctcatgatg tagatccgct ctctaaccga 10440

aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta tagttatgtt 10500

agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca gacgcgtgta 10560

cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaagatcca 10620

gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 10680

cgcttcctcg ctcactgact c 10701

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaccttgacg gctagctcag tcctaggtac agtgctagca tggttagcaa aggtgaag 58

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccacccgaag gtgagccagt gtgattattt atacaattca tccataccgc 50

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttcagtatt ttcagcgtca tcgccagtgt gctggccaga gaccttgacg gctagctc 58

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgccgccgc cgtgagacct ataaacgcag aaaggcccac ccgaaggtga g 51

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctatagggcc cgggcgatgc aacttttgag atgcttcagt attttcag 48

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttagagagcg gatctacatc atgagccctg gctatac 37

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attttctgtt attgcttcag ttttagcacg agacctttac actttatgct tccggc 56

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcggccgcgc gcagagacca taaaacgaaa ggccc 35

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccgcactagt ctgcaatgca gttacttcgc tgtttttcaa tattttctgt tattgcttc 59

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggcgaagaa ttgttaatta agtcaagttt ggaagttggt tgtc 44

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tggtctctgc gcgcggccgc accccg 26

Claims (4)

1.一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法，其特征在于，所述基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法包括：

基于pESD-PPI质粒构建带有gfp和mCherry荧光基因的能进行Golden gat e组装表达质粒pESD-PPI-GFP-mCherry；

从数据库UniProt上分别选择5对运动发酵单胞菌中相互作用的蛋白对和未被报道有相互作用的蛋白对分别作为分析运动发酵单胞菌中蛋白相互作用的正对照和负对照；

对分析结果进行量化，量化的公式：单荧光比例/(单荧光比例+双荧光比例)*100％。

2.如权利要求1所述的基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法，其特征在于，表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry构建方法包括：

1)以F-1和R-1为引物，mCherry基因为模板扩增片段1；

2)以片段1为模板，F-2和R-2为引物扩增片段2；

3)以片段2为模板，F-3和R-2为引物扩增片段3；

4)以pESD-PPI为模板，F-4和R-3为引物扩增片段4；

5)以片段3和片段4为模板，F-3和R-3为引物扩增片段5；

6)用NdeI和SalI酶切载体pESD-PPI，获得酶切载体1；

7)利用Gibson装配试剂盒组装片段5和酶切载体1，转化大肠杆菌感受态，获得含mCherry的表达载体pESD-PPI-mCherry；

8)以pEZ15a-lacUV5-GFP为模板，F-5和R-4为引物扩增片段6；

9)以片段6为模板，F-5和R-5为引物扩增片段7；

10)以pESD-PPI为模板，F-6和R-6为引物扩增片段8；

11)以片段8和片段7为模板，F-6和R-5为引物扩增片段9；

12)用PstI和BamHI酶切载体pESD-PPI-mCherry，获得酶切载体2；

13)利用Gibson装配试剂盒组装片段9和酶切载体2，转化大肠杆菌感受态，获得含GFP和mCherry的表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry SEQ ID NO：5。

3.如权利要求2所述的基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法，其特征在于，表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry构建方法进一步包括：

1)构建蛋白的表达载体：

与NH2-TEVF融合表达蛋白的基因引物：

F：agcgtgGGTCTCaGCGC+基因上游引物；

R：GTGCTGGGTCTCcAGCA+基因下游引物；

与COOH-TEVF融合表达蛋白的基因引物：

F：agcgtgGGTCTCAGGCC+基因上游引物；

R：GTGCTGGGTCTCTGCCGCC+基因下游引物；

扩增基因片段，并纯化；

Golden gate组装载体和片段。体系：0.05mol基因片段,20ng pESD-PPI-GFP-mCherry，1μL T4 ligase buffer(Thermo)，0.2μL T4 ligase(Thermo)，0.3μL BsaI(NEB)，0.1μLBSA(Takara)；反应程序：37℃，3h；

转化大肠杆菌感受态；

挑取不发荧光的单菌落做菌体PCR，测序；

2)转化酵母EBY-100：

酵母划线活化；

挑取单菌落到1mL YPD培养基中过夜，30℃，220rpm；

第二天早上测量OD_600nm,加入适量YPD，将OD_600nm调到0.1；

30℃220rpm培养4-5h后，OD_600nm＝0.4-0.6；

6000rpm离心2min，弃上清；

1mL无菌水洗一次，6,000rpm离心2min，1mL 0.1M LiAc/TE洗一次，6,000rpm离心2min；

100μL 0.1M LiAc重悬，20μL菌液+2μL质粒；

62.4μL 50％PEG3350；

8.23μL 1M LiAc；

9.58μL DMSO；

5μL 50mg/mL ssDNA；

30℃培养箱30min-1h；

42℃水浴锅15min；

用200μL-1mL 5mmol/L CaCl₂洗一次，6,000rpm离心2min；

100μL 5mmol/L CaCl₂重悬，涂SD-UT平板；

3)酵母表面展示：

挑取单菌落至800μL SD-UT培养基中培养过夜；

转移合适的菌液于800μL SD-DT培养基中，使起始OD_600nm＝0.8；

取10⁶个细胞，用Buffer B洗一次，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清；

用150μL Buffer B洗一次，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清；

每个样品中加20μL Buffer B+0.15uL抗体，避光于4℃避光放置15min；

转到室温30min，避光；

取出样品，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清，用150uL的Buffer B洗一遍；

加入150μL Buffer C(1*PBS)重悬细胞，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清；

加300μL Buffer C重悬细胞，转移到2mL EP管中，流式细胞仪进行结果展示。

4.一种实施权利要求1所述的基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法的Y2H的自动化平台。