CN103614333A - 一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，是将微载体处理后，以胰蛋白酶将微载体和细胞进行消化，再将细胞逐步进行扩大培养。本发明的有益效果为：本发明提供的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，其采用反应器和国产的胶原微载体扩大培养细胞的工艺，培养规模从方瓶→（0.25-2L悬浮培养瓶）→（5-7.5L反应器）→（50-120L反应器）→250L反应器→线性放大,从根本上解决了微载体培养细胞规模线性放大的技术工艺，该工艺操作简单，将对现有疫苗工艺进行技术升级的同时，降低了疫苗的生产成本，提高产品产量和质量，在实际生产中具有应用前景。

Description

一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法。

背景技术

目前，我国大多数疫苗仍采用传统的转瓶贴壁培养细胞的工艺生产，如兽用的猪繁殖与呼吸综合征疫苗（蓝耳病疫苗）、猪圆环病毒疫苗、猪细小病毒疫疫苗、猪瘟病毒疫苗和羊痘疫苗等，人用的有乙脑疫苗、甲肝疫苗和水痘疫苗等。传统工艺生产的疫苗存在批间差大、批量小，建设厂方面积大，生产过程人力物力投入大，总体来说生产成本高、产品质量不稳定。近几年有些品种的疫苗采用了反应器培养的工艺，如猪瘟疫苗采用了反应器纸片载体培养细胞的工艺，狂犬病疫苗采用了反应器微载体培养工艺，但最大的培养体积只有35L。这些工艺由于解决不了细胞线扩大培养工艺难题而使规模不能线性放大，并且这些工艺中所用的培养载体（如纸片载体和微载体）都是进口的，生产成本高。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种操作简单，成本低廉的用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，包括以下步骤：

1）微载体处理：

将微载体以含有吐温-80的纯化水浸泡，再以PBS平衡盐溶液清洗后，转入至反应器或悬浮培养瓶中，高压灭菌，冷却静置，以含新生小牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含新生小牛血清的细胞培养液备用；

2）胰蛋白酶消化微载体和细胞：

    消化1g长满细胞的胶原微载体用质量百分比浓度为0.25%的胰蛋白酶25-50ml的比例使用胰蛋白酶；

3）细胞扩大培养：

    从方瓶→0.25-2L悬浮培养瓶→5-7.5L反应器→50-120L反应器→250L反应器→线性放大。

进一步的，上述的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，所述步骤1）中的微载体处理，是按照以下步骤进行的：

a）所述胶原微载体为GF-240型微载体，将GF-240型微载体用含体积百分含量为万分之一的吐温-80的纯化水浸泡3-12h，期间搅拌一次使之充分浸泡，纯化水的用量为每1g微载体浸泡需20-100ml含吐温的纯化水；

b）将步骤a）处理的微载体弃纯化水，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS平衡盐溶液洗2次，每次清洗1g微载体需要20-100mlPBS平衡盐溶液，所述PBS平衡盐溶液的pH值为7.2±0.1, 渗透压在290-320mmol/kg之间；

c）将步骤b）处理的微载体弃PBS平衡盐沉溶液，用PBS平衡盐溶液制成2-20g/L的浓度后转移到反应器或悬浮培养瓶中，连同反应器或悬浮培养瓶以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却或向其中通空气加速冷却至室温后静置30min以上，所述PBS平衡盐溶液的pH值为7.2±0.1, 渗透压在290-320mmol/kg之间；

d）将步骤c）处理的微载体弃PBS平衡盐溶液，用含体积百分含量10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液洗1遍后再加相同体积的含体积百分含量2%-10%的新生小牛血清NBCS的细胞培养液备用；洗1g微载体需要20-50ml含体积百分含量10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液。

所述的细胞培养液是指将市售的MEM、DMEM和DMEM/F12等成品干粉培养基，按说明书配成液体，使用时加入相应比例的NBCS后用于培养动物细胞。

进一步的，上述的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，所述细胞扩大培养的过程包括以下步骤：

A）细胞复苏与扩增培养：按常规方法复苏细胞，在含体积百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液培养至单层，按常规方法用质量百分比浓度为0.25%-1%胰蛋白酶消化传代细胞至总量达下述B）所需的量；

B）悬浮细胞瓶微载体培养细胞：将上述步骤A）的细胞按常规方法消化，按每个载体上10-50个细胞的比例接种到微载体添加量为2-20g/L的悬浮培养瓶中培养，加含体积百分含量8-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至终培养体积的40-100%, 培养温度为37±1℃，培养前3-12h采用间歇搅拌的方式，其后采用20-50rpm固定转速搅拌，培养12h后加含体积百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至终培养体积100%，从培养时起每隔12-24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量8%-10%NBCS的DMEM培养液，以保证反应器中培养液的葡萄糖含量≥1g/L（因DMEM培养液中的葡萄糖含量为4.5g/L，细胞生长需要消耗培养液中的葡萄糖，取出部分已培养了细胞的培养液，换加没有培养细胞的新鲜培养液可提高培养液中的葡萄糖），至80%以上的微载体上细胞长成致密单层；所述间歇搅拌是搅拌3-5min,停止20-60min,再搅拌3-5min的反复搅停过程，其中搅拌转速为20-50rpm；

C）悬浮细胞瓶微载体扩大培养细胞：将上述步骤B）的细胞，以步骤1）中步骤b）的方法以25-38℃预热的PBS平衡盐溶液洗两次，按每克载体用10-50ml质量百分比浓度为0.25%-1%胰蛋白酶酶解消化至胶原载体全部消失和细胞完全分散的状态，加入新生小牛血清NBCS中和1-3min，用备好的原微载体2-8倍的量的微载体进行再培养，培养方法按上述步骤B）进行，至80%以上的微载体上细胞长成致密单层；其中，中和胰蛋白酶用新生小牛血清NBCS的量是以酶解消化用胰蛋白酶按质量百分比浓度0.25%计算的量的40%-60%；

D）5-7.5L反应器扩大培养细胞：将上述步骤C）处理得到的细胞悬液，同备好的原微载体2-6倍的量的微载体接种5-7.5L反应器中培养，加含体积百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至终培养体积的40-60%，反应器的参数设置为：温度37℃、pH7.1-7.3、溶氧20-80%，转速20-100rpm（转速以微载体能完全搅成悬浮状的最低转速为最好），培养前3-12h采用间歇搅拌的方式，其后采用20-100rpm固定转速搅拌，培养12h后加含体积百分含量8-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至培养终体积的100%，从培养时起每隔12-24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的DMEM培养液，以保证反应器中细胞液的葡萄糖含量≥1g/L，至80%以上的微载体上细胞长成致密单层为止；

E）50L及以上反应器扩大培养细胞：用上述步骤D）培养得到的细胞，将5-7.5L反应器的细胞按步骤D）逐级扩大培养至50-120L反应器→250 L反应器→线性放大。

本发明的有益效果为：本发明提供的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，其采用反应器和国产的胶原微载体扩大培养细胞的工艺，培养规模从方瓶→（0.25-2L悬浮培养瓶）→（5-7.5L反应器）→（50-120L反应器）→250L反应器→线性放大,从根本上解决了微载体培养细胞规模线性放大的技术工艺，该工艺操作简单，将对现有疫苗工艺进行技术升级的同时，降低了疫苗的生产成本，提高产品产量和质量，在实际生产中具有应用前景。

具体实施方式

实施例1：

1、材料：

1）细胞株，Marc-145细胞，从CCTCC引进；

2）DMEM培养液，Invitrigen Corporation，货号：02-5062EJ，按说明书配制；

3）胰蛋白酶，Invitrigen Corporation，货号：27250，使用时按常规方法配成质量百分比浓度为0.25%；

4）GF-240，兰州百灵，批号：20121218，每克含3.1×10⁶个载体；

5）新生牛血清（NBCS），兰州民海，批号：20120716；

2、仪器设备：

1）培养箱，Thermo Fisher Scientific Corporation，3111；

2）相差倒置显微镜，OLYMPUS， CKX41；

3）反应器

（1）New Brunswick，Celligen 310，培养罐总体积7.5L, 终有效培养体积5L；

（2）江苏绿扬，YB-50QXF，培养罐总体积75L, 终有效培养体积50L；

（3）江苏绿扬，YB-200QXF，培养罐总体积250L, 终有效培养体积200L；

4）悬浮培养瓶，兰州百灵，终有效培养体积1L。

5）磁力搅拌器，TECHEN，MSC-104S。

3、其它：

凯氏细胞培养方瓶：T-75、T-150。

4、方法：

1）各培养阶段按有效培养体积计算所加的微载体的量如下：

（1）1L悬浮细胞瓶，6g，

（2）7.5L反应器，9g，

（3）75L反应器，3.6g，

（4）250L反应器，4g。

2）微载体处理：

（1）按上述步骤4第1）条所示的微载体量，在每个培养阶段的接种细胞前48h完成微载体的浸泡、PBS清洗、灭菌及培养液清洗过程。

（2）浸泡：称取所需量的GF-240型微载体，含体积百分含量万分之一吐温-80的纯化水浸泡5h，期间搅拌一次使之充分浸泡，1g微载体浸泡用30ml含吐温-80的纯化水。

（3）清洗：将步骤（2）处理的微载体弃纯化水，用pH值为7.21、渗透压为295mmol/kg且无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS平衡盐溶液洗2次，每次清洗1g微载体需要30mlPBS平衡盐溶液。

（4）灭菌：将步骤（3）处理的微载体弃PBS平衡盐沉溶液，用PBS平衡盐溶液制成2-20g/L的浓度后转移到反应器（或悬浮培养瓶），以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却至温室后静置1h。

（5）培养液清洗：将步骤（4）处理的微载体弃PBS平衡盐溶液，用含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液洗1遍后再加相同体积的含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液备用。洗1g微载体用30ml含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液。

3）细胞复苏与扩增培养：按常规方法复苏细胞至T-75的方瓶中，在含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液培养至单层，按常规方法用质量百分比浓度为0.25%胰蛋白酶消化消化传代培养，培养扩大方式为1个T-75→1个T-150→4个T-150→16个T-150→48个T-150，消化1个T-75和T-150的细胞各需胰蛋白酶液5ml和10ml，消化作用时间3-5min。

4）1L悬浮细胞瓶微载体培养细胞：将上述步骤3）获得的细胞按常规方法消化，按每个载体上28个细胞的比例接种到微载体加量为6g/L的1L悬浮培养瓶中培养，加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至500ml, 培养温度为37℃，培养前6h采用间歇搅拌的方式，其后采用30rpm固定转速搅拌。培养12h后加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至1L，从培养时起每24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液，使反应器中培养细胞的培养液中葡萄糖含量保持在1g/L以上,至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层。所述间歇搅拌是搅拌3min,停止30min,再搅拌3min的反复搅停过程，其中搅拌转速为30rpm。

5）1L悬浮细胞瓶微载体扩大培养细胞：将上述步骤4）的细胞，用37℃预热的PBS液洗两次，每次用200ml的PBS液，用180ml质量百分比浓度为0.25%胰蛋白酶酶解消化至胶原载体全部消失和细胞完全分散的状态，加入90ml的NBCS中和3min后加入18g已处理备用的载体，平均分到三个1L悬浮细胞瓶中进行培养，每瓶加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至500ml继续培养至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层, 培养方法同步骤4）。

6）7.5L反应器扩大培养细胞：将上述步骤5）所获的细胞，弃上清后将微载体和细胞收集到一个1L悬浮细胞瓶中，用37℃预热的PBS液洗两次，每次用500ml的PBS液，用500ml质量百分比浓度为0.25%胰蛋白酶酶解消化至胶原载体全部消失和细胞完全分散的状态，加入250ml的NBCS中和3min后移到已处理备好50g微载体的7.5L反应器，加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至2.5L继续培养。反应器的参数设置为：温度37℃、pH7.2、溶氧60%，培养前3h采用间歇搅拌的方式，其后采用30rpm固定转速搅拌。培养12h后加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至5L。从培养时起每24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液，以保证反应器中细胞液的葡萄糖含量≥1g/L，至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层。所述间歇搅拌是搅拌3min,停止30min,再搅拌3min的反复搅停过程，其中搅拌转速为30rpm。

7）75L反应器扩大培养细胞：将上述步骤6）所获的细胞，按步骤5）所述的方法和程序扩大培养至备好200g微载体的75L反应器继续培养细胞至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层。其中，清洗过程每次用PBS液2L，消化细胞用酶液1.5L,中和用NBCS750ml，前12小时采用间歇搅拌的方式。反应器的参数设置为：温度37℃、pH7.2、溶氧60%，培养前3h采用间歇搅拌的方式，其后采用60rpm固定转速搅拌。培养前12h内用23L含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液培养，培养12h后加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至50L。所述间歇搅拌是搅拌3min,停止30min,再搅拌3min的反复搅停过程，其中搅拌转速为60rpm。

8）250L反应器扩大培养细胞：将上述步骤7）所获的细胞，按步骤7）所述的方法和程序扩大培养至备好1000g微载体的250L反应器继续培养细胞至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层。其中，清洗过程每次用PBS液10L，消化细胞用酶液5L,中和用NBCS2.5L。培养前12h内用120L含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液培养，培养培养12h后加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至200L。反应器的参数设置和培养过程同步骤7）。

表1为Marc-145细胞放大培养各阶段的细胞密度。

表1：

。

其中，A是3个悬浮培养瓶细胞密度的平均值,B是按终培养体积计算的细胞密度。

实施例2：

1、材料：

1）细胞株，MDCK细胞，从ATCC引进；

2）DMEM培养液，Invitrigen Corporation，货号：02-5062EJ，按说明书配制；

3）胰蛋白酶，Invitrigen Corporation，货号：27250，使用时按常规方法配成质量百分比浓度为0.5%；

4）GF-240，兰州百灵，批号：20121218，每克含3.1×10⁶个载体；

5）新生牛血清（NBCS），兰州民海，批号：20120716；

2、仪器设备：

1）培养箱，Thermo Fisher Scientific Corporation，3111；

2）相差倒置显微镜，OLYMPUS， CKX41；

3） 反应器

（1）New Brunswick，Celligen 310，培养罐总体积5L，终有效培养体积3.5L；

（3）江苏绿扬，YB-50QXF，培养罐总体积75L, 终有效培养体积50L；

（4）江苏绿扬，YB-200QXF，培养罐总体积250L, 终有效培养体积200L；

4）悬浮培养瓶，兰州百灵，终有效培养体积1L。

5）磁力搅拌器，TECHEN，MSC-104S。

3、其它：

凯氏细胞培养方瓶：T-75、T-150。

4、方法：

1）各培养阶段按有效培养体积计算所加的微载体的量如下：

（1）1L悬浮细胞瓶，3g和5g,

（2）7.5L反应器，8g；

（3）75L反应器，4g；

（4）250L反应器，4g。

2）微载体处理：

（1）按上述步骤4第1）条所示的微载体量，在每个培养阶段的接种细胞前48h完成微载体的浸泡、PBS清洗、灭菌及培养液清洗过程。

（2）浸泡：称取所需量的GF-240型微载体，含体积百分含量万分之一吐温-80的纯化水浸泡5h，期间搅拌一次使之充分浸泡，1g微载体浸泡用30ml含吐温-80的纯化水。

（3）清洗：将步骤（2）处理的微载体弃纯化水，用pH值为7.23、渗透压为289mmol/kg且无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS平衡盐溶液洗2次，每次清洗1g微载体需要30mlPBS平衡盐溶液。

（4）灭菌：将步骤（3）处理的微载体弃PBS平衡盐沉溶液，用PBS平衡盐溶液制成2-20g/L的浓度后转移到反应器（或悬浮培养瓶），以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却至温室后静置1h。

（5）培养液清洗：将步骤（4）处理的微载体弃PBS平衡盐溶液，用含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液洗1遍后再加相同体积的含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液备用。洗1g微载体用30ml含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液。

3）细胞复苏与扩增培养：按常规方法复苏细胞至T-75的方瓶中，在含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液培养至单层，按常规方法用质量百分比浓度为0.5%胰蛋白酶消化消化传代培养，培养扩大方式为1个T-75→1个T-150→3个T-150→9个T-150，消化1个T-75和T-150的细胞各需胰蛋白酶液5ml和10ml，消化作用时间3-5min。

4）1L悬浮细胞瓶微载体培养细胞：将上述步骤3）获得的细胞按常规方法消化，按每个载体上29个细胞的比例接种到微载体加量为3g/L的1L悬浮培养瓶中培养，加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至500ml, 培养温度为37℃，培养前6h采用间歇搅拌的方式，其后采用35rpm固定转速搅拌。培养12h后加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至1L，从培养时起每24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液，使反应器中培养细胞的培养液中葡萄糖含量保持在1g/L以上,至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层。所述间歇搅拌是搅拌3min,停止30min,再搅拌3min的反复搅停过程，其中搅拌转速为35rpm。

5）1L悬浮细胞瓶微载体扩大培养细胞：将上述步骤4）的细胞，用37℃预热的PBS液洗两次，每次用150ml的PBS液，用50ml质量百分比浓度为0.5%胰蛋白酶酶解消化至胶原载体全部消失和细胞完全分散的状态，加入50ml的NBCS中和3min后加入10g已处理备用的载体进行培养，平均分到2个1L悬浮细胞瓶中，每瓶加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至500ml继续培养至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层, 培养方法同步骤4）。

6）7.5L反应器扩大培养细胞：将上述步骤5）所获的细胞，弃上清后将微载体和细胞收集到一个1L悬浮细胞瓶中，用37℃预热的PBS液洗两次，每次用500ml的PBS液，用150ml质量百分比浓度为0.5%胰蛋白酶酶解消化至胶原载体全部消失和细胞完全分散的状态，加入150ml的NBCS中和3min后移到已处理备好40g微载体的7.5L反应器，加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至2.5L继续培养。反应器的参数设置为：温度37℃、pH7.25、溶氧50%，培养前3h采用间歇搅拌的方式，其后采用40rpm固定转速搅拌。培养12h后加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至5L。从培养时起每24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量10%NBCS的DMEM培养液，以保证反应器中细胞液的葡萄糖含量≥1g/L，至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层。所述间歇搅拌是搅拌3min,停止27min,再搅拌3min的反复搅停过程，其中搅拌转速为40rpm。

7）75L反应器扩大培养细胞：将上述步骤6）所获的细胞，按步骤5）所述的方法和程序扩大培养至备好200g微载体的75L反应器继续培养细胞至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层。其中，清洗过程每次用PBS液2L，消化细胞用酶液600ml,中和用NBCS600ml，前12小时采用间歇搅拌的方式。反应器的参数设置为：温度37℃、pH7.25、溶氧50%，培养前3h采用间歇搅拌的方式，其后采用70rpm固定转速搅拌。培养前12h内用30L含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液培养，培养12h后加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至50L。所述间歇搅拌是搅拌3min,停止30min,再搅拌3min的反复搅停过程，其中搅拌转速为70rpm。

8）250L反应器扩大培养细胞：将上述步骤7）所获的细胞，按步骤7）所述的方法和程序扩大培养至备好800g微载体的250L反应器继续培养细胞至到80%以上的微载体上细胞长成致密单层。其中，清洗过程每次用PBS液10L，消化细胞用酶液3L,中和用NBCS3L。培养前12h内用100L含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液培养，培养12h后加含体积百分含量10%NBCS的细胞培养液至200L。反应器的参数设置和培养过程同步骤7）。

表2为MDCK细胞放大培养各阶段的细胞密度。

表2：

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其中，A是2个悬浮培养瓶细胞密度的平均值,B是按终培养体积计算的细胞密度。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）微载体处理：

将微载体以含有吐温-80的纯化水浸泡，再以PBS平衡盐溶液清洗后，转入至反应器或悬浮培养瓶中，高压灭菌，冷却静置，以含新生小牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含新生小牛血清的细胞培养液备用；

2）胰蛋白酶消化微载体和细胞：

消化1g长满细胞的胶原微载体用质量百分比浓度为0.25%的胰蛋白酶25-50ml的比例使用胰蛋白酶；

3）细胞扩大培养：

    从方瓶→0.25-2L悬浮培养瓶→5-7.5L反应器→50-120L反应器→250L反应器→线性放大。

2.根据权利要求1所述的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，其特征在于，所述步骤1）中的微载体处理，是按照以下步骤进行的：

a）所述胶原微载体为GF-240型微载体，将GF-240型微载体用含体积百分含量为万分之一的吐温-80的纯化水浸泡3-12h，期间搅拌一次使之充分浸泡，纯化水的用量为每1g微载体浸泡需20-100ml含吐温的纯化水；

b）将步骤a）处理的微载体弃纯化水，用PBS平衡盐溶液洗2次，每次清洗1g微载体需要20-100mlPBS平衡盐溶液，所述PBS平衡盐溶液的pH值为7.2±0.1, 渗透压在290-320mmol/kg之间；

c）将步骤b）处理的微载体弃PBS平衡盐沉溶液，用PBS平衡盐溶液制成2-20g/L的浓度后转移到反应器或悬浮培养瓶中，连同反应器或悬浮培养瓶以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却或向其中通空气加速冷却至室温后静置30min以上，所述PBS平衡盐溶液的pH值为7.2±0.1, 渗透压在290-320mmol/kg之间；

d）将步骤c）处理的微载体弃PBS平衡盐溶液，用含体积百分含量10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液洗1遍后再加相同体积的含体积百分含量2%-10%的新生小牛血清NBCS的细胞培养液备用；洗1g微载体需要20-50ml含体积百分含量10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液。

3.根据权利要求2所述的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，其特征在于，所述细胞扩大培养的过程包括以下步骤：

A）细胞复苏与扩增培养：按常规方法复苏细胞，在含体积百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液培养至单层，按常规方法用质量百分比浓度为0.25%-1%胰蛋白酶消化传代细胞至总量达下述B）所需的量；

B）悬浮细胞瓶微载体培养细胞：将上述步骤A）的细胞按常规方法消化，按每个载体上10-50个细胞的比例接种到微载体添加量为2-20g/L的悬浮培养瓶中培养，加含体积百分含量8-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至终培养体积的40-100%, 培养温度为37±1℃，培养前3-12h采用间歇搅拌的方式，其后采用20-50rpm固定转速搅拌，培养12h后加含体积百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至终培养体积100%，从培养时起每隔12-24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量8%-10%NBCS的DMEM培养液，以保证反应器中培养液的葡萄糖含量≥1g/L，至80%以上的微载体上细胞长成致密单层；所述间歇搅拌是搅拌3-5min,停止20-60min,再搅拌3-5min的反复搅停过程，其中搅拌转速为20-50rpm；

C）悬浮细胞瓶微载体扩大培养细胞：将上述步骤B）的细胞，以步骤1）中步骤b）的方法以25-38℃预热的PBS平衡盐溶液洗两次，按每克载体用10-50ml质量百分比浓度为0.25%-1%胰蛋白酶酶解消化至胶原载体全部消失和细胞完全分散的状态，加入新生小牛血清NBCS中和1-3min，用备好的原微载体2-8倍的量的微载体进行再培养，培养方法按上述步骤B）进行，至80%以上的微载体上细胞长成致密单层；其中，中和胰蛋白酶用新生小牛血清NBCS的量是以酶解消化用胰蛋白酶按质量百分比浓度0.25%计算的量的40%-60%；

D）5-7.5L反应器扩大培养细胞：将上述步骤C）处理得到的细胞悬液，同备好的原微载体2-6倍的量的微载体接种5-7.5L反应器中培养，加含体积百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至终培养体积的40-60%，反应器的参数设置为：温度37℃、pH7.1-7.3、溶氧20-80%，转速20-100rpm，培养前3-12h采用间歇搅拌的方式，其后采用20-100rpm固定转速搅拌，培养12h后加含体积百分含量8-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至培养终体积的100%，从培养时起每隔12-24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的DMEM培养液，以保证反应器中细胞液的葡萄糖含量≥1g/L，至80%以上的微载体上细胞长成致密单层为止；

E）50L及以上反应器扩大培养细胞：用上述步骤D）培养得到的细胞，将5-7.5L反应器的细胞按步骤D）逐级扩大培养至50-120L反应器→250 L反应器→线性放大。