CN101250227A - 抗猪瘟免疫球蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗猪瘟免疫球蛋白的制备方法，步骤如下：(1)用组织培养的灭活猪瘟病毒与弗氏完全佐剂以1∶1的比例混合后作为免疫原免疫牛，每头受体动物首次颈部多点肌肉注射40－60天头份的猪瘟疫苗；(2)免疫后10－15天，进行加强免疫；猪瘟疫苗为150－250天头份；(3)采用自然加压凝血法分离免疫球蛋白，用硫酸铵沉淀杂蛋白，胃蛋白酶剪切Fc段，保留抗体F(ab)2段，再用硫酸铵沉淀Fc蛋白，除去Fc蛋白，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置2天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，杀灭其它不同动物易感病毒；(4)血液中加入抗生素，放置5－10小时，分离血清，用辛酸法和硫酸铵法分离提取免疫球蛋白；(5)过滤除菌，无菌分装。本发明制备简单，应用简便。

Description

抗猪瘟免疫球蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及一种抗猪瘟免疫球蛋白的制备方法。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的一种高度接触性传染病，流行广泛，发病率及死亡率甚高，危害极大，对养猪业造成严重的经济损失。

随着养猪业的发展，集约化程度越来越高，规模越来越大；并随着不断从国外大量引进种猪和国内生猪的交易流通日益加大等等因素，给猪瘟的防治带来了不少困难。虽然普遍注射了猪瘟兔化弱毒疫苗，但各地猪瘟仍时有发生，而且多表现为非典型、慢性及隐性状态，并普遍出现猪瘟的持续性感染。持续性感染的根源在于带毒母猪——“带毒母猪综合征”。这也是连年注射猪瘟疫苗，连年还会发生猪瘟的主要原因。

母猪带毒现象在我国是相当普遍的，造成的后果及经济损失也是相当严重的。特别是那些设备陈旧、圈舍拥挤、经营年限又长，加上管理较差的猪场，母猪带毒比例较高，造成的损失较大。即使是一些新建的全新猪场，设备先进、各方面条件都不错；但由于急于求成，从不同地方大量引进未经检验合格的种猪，结果猪瘟随种猪携带而来，从第一胎起，猪瘟在本场便连绵不断。带毒母猪通过垂直传播和水平传播，造成猪瘟的持续感染，如不加以有效控制则将愈演愈烈，将造成巨大的损失。

由于猪瘟是一种病毒病，至今尚无有效的治疗药物和治疗方法。近年来曾经有人进行过用中草药制剂预防和治疗猪瘟的试验，但均未取得成功。抗生素及磺胺类药物基本无效。目前，唯一有效的治疗制剂是猪瘟高免血清。病猪可用黄芪多糖注射液等治疗。同时肌注青霉素与链霉素，以防治细菌继发感染。但治疗效果很不理想。由于该病毒基因组的变异性很强，疫苗免疫效果不够理想。猪瘟至今尚无有效的治疗药物和治疗方法。近年来曾经有人进行过用中草药制剂预防和治疗猪病毒性疾病的试验，但治愈率较低。目前，猪瘟血清是治疗猪病毒性疾病的有效药物。猪瘟免疫球蛋白是治疗猪瘟的特异性生物制品，是一种被动免疫制剂，同时还有鉴别诊断和紧急预防接种等作用，具有较高的推广应用价值。猪瘟的免疫接种，包括被动免疫和主动免疫。被动免疫应用免疫血清，主动免疫则有高免疫血清——血毒同时接种法、灭活结晶紫疫苗和弱毒活疫苗。许多大型猪场利用淘汰的老母猪制成高免血清，自制猪瘟血清治疗效果良好。高免血清和血毒同时注射法可以产生强化持久的保护力，但因使用猪瘟病毒免疫猪制备的高免血清，应用强毒血毒，有造成散毒的危险，推广应用受到很大限制。

89103922.8提供了一种病毒疫苗免疫猪生产猪瘟血清的简单制取方法。本制品与抗菌素配合使用，主要用于治疗猪瘟，其治愈率97.7％。200610131631.2提供一种病毒疫苗免疫马、驴、骡等制备抗猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒三联高免免疫球蛋白的制备方法，该产品主要针对母猪繁殖障碍病毒性疾病。使用猪瘟病毒免疫猪制备的高免血清，应用强毒血毒，有造成散毒的危险，推广应用受到很大限制。马、驴、骡在许多地区饲养数量有限，而牛在全国的饲养量很大，利用病毒疫苗免疫牛制备猪瘟血清具有原料来源广泛、效价高等优点。

目前，有关病毒疫苗免疫牛制备猪瘟血清和免疫球蛋白的制备方法还未见报道。

因此，提供一种抗猪瘟免疫球蛋白的制备方法，有效预防和治疗猪瘟，是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术中的不足之处，提供一种制备简单、效果显著的抗猪瘟免疫球蛋白的制备方法。

为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下：

一种抗猪瘟免疫球蛋白的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：

(1)用组织培养的灭活猪瘟病毒与弗氏完全佐剂以1∶1的比例混合后作为免疫原免疫牛等动物，每头受体动物首次颈部多点肌肉注射40-60天头份的猪瘟疫苗，进行基础免疫；

(2)基础免疫后7-10天，进行加强免疫；猪瘟疫苗为150-250天头份；

(3)强化免疫后，猪瘟抗体效价达到高峰值时准备屠宰采血；采用自然加压凝血法分离免疫球蛋白，用硫酸铵沉淀杂蛋白，胃蛋白酶剪切Fc段，保留抗体F(ab)2段，再用硫酸铵沉淀Fc蛋白，除去Fc蛋白，不同pH作用，杀灭其它不同动物易感病毒；

(4)血液中加入100-300单位/ml青霉素和100-300微克/ml链霉素等抗生素，自然凝固、放置5-10小时，分离血清，用辛酸法和硫酸铵法分离提取免疫球蛋白；

(5)过滤除菌，无菌分装，冰箱内保存。

本发明动物是经过严格检疫的牛等作为免疫动物。

本发明的有益效果是：免疫原用取猪瘟毒细胞培养物经浓缩后加完全弗氏完全佐剂制备而成，然后免疫动物。通过免疫牛，防止了同种动物之间某些其它病毒性传染病的人为传染。安全性好，效价高；通过免疫球蛋白提取免疫球蛋白，呈无色透明液体，既可以冰冻保存(-20℃以上)，也可以冷藏保存(+4℃～+12℃)储运方便。本发明制备的猪免疫球蛋白防治猪瘟，每日注射1次，一个疗程1-3次，病重用量略加。临床试用表明，患瘟病猪经猪瘟免疫球蛋白治疗后的痊愈率高达81.5％以上。制成的猪瘟免疫球蛋白，注入动物机体后，具有疗效好、安全可靠、无毒副作用和成本低等优点。

具体实施方式

以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：

实施例1

一种抗猪瘟免疫球蛋白的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：

(1)基础免疫，选健康的动物，如牛数头，每头受体动物首次颈部多点肌肉注射40-60天头份的猪瘟疫苗，进行猪瘟毒疫苗的基础免疫。猪瘟疫苗采取肌肉注射法、皮内、皮下多点注射、后海穴注射等多种免疫途径。用组织培养的灭活猪瘟病毒与弗氏完全佐剂以1∶1的比例混合后作为免疫原免疫牛，每头受体动物首次颈部多点肌肉注射40-60天头份的猪瘟疫苗，进行基础免疫。

(2)基础免疫后10-15天，进行加强免疫；猪瘟疫苗为150-250天头份，肌肉或皮下注射。

(3)强化免疫后，猪瘟抗体效价达到高峰值时准备屠宰采血；即待血清中猪瘟抗体效价达到高峰值时准备屠宰采血，首先要常规保定，待宰猪颈部局部剪毛、冲洗、消毒，然后切开皮肤与脂肪，分离组织充分暴露颈静脉，切断颈静脉，用胶管导流或沿盆壁顺流接血。放血前一天晚上停食，可饮水；采用自然加压凝血法分离免疫球蛋白，用硫酸铵沉淀杂蛋白，胃蛋白酶剪切Fc段，保留抗体F(ab)2段，再用硫酸铵沉淀Fc蛋白，除去Fc蛋白，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置2天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，杀灭其它不同动物易感病毒。

(4)血液中加入100-300单位/ml青霉素和100-300微克/ml链霉素等抗生素，自然凝固、放置5-10小时，分离血清，用辛酸法和硫酸铵法分离提取免疫球蛋白。

(5)过滤除菌，无菌分装，冰箱内保存。

实施例2

一种抗猪瘟免疫球蛋白的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：

(1)制备免疫血浆：用组织培养灭活病毒免疫动物，经过基础免疫、超免疫后，采血，分离血浆。

(2)精制提纯：将制得的免疫血浆按3倍稀释后经胃酶消化、加温变性、超滤等常规制备工艺，浓缩至蛋白含量为3-15％，效价含量为3000-8000单位/ml。加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置2天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，杀灭其它不同动物易感病毒。

(3)分包装：本发明可有液体及冻干两种类型，规格为治疗用400IU/瓶和预防用80IU/瓶。冻干制品分装后应立即在-320℃以下进行冷冻。干燥时间可根据水含量来决定。干燥完毕后进行真空封口。

应用实例：

天津某猪场累计购入仔猪512头，购入后结果相继发病，死亡102头，经临床症状和实验室诊断诊断为猪瘟。对剩下的410余头猪进行了猪瘟免疫球蛋白治疗。按每千克体重1毫升的剂量确定用量，选择肌肉丰满的部位进行多点肌肉注射，严重者间隔2日可再次注射猪瘟免疫球蛋白。同时要饮用白糖水、维生素或葡萄糖水溶液，辅助喂食青菜、水果等含维生素丰富的食物，结果康复354头，痊愈率为86.3％。

总之，猪瘟免疫球蛋白制备包括有猪瘟疫苗免疫牛、猪免疫球蛋白、免疫佐剂等，经基础免疫→加强免疫→屠宰采集血液→用辛酸法和硫酸铵法→收获免疫球蛋白→分装→成品包装工序制成。用于防治猪瘟等疾病。用法与用量：小猪3000单位/头/天、成年猪5000单位/头/天。每日注射1次，间隔2天后再次注射，一个疗程1-3次，病重者用量略加。临床试用表明，猪瘟免疫球蛋白治疗猪瘟治愈率在80％以上。

上述参照实施例对该抗猪瘟免疫球蛋白的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1、一种抗猪瘟免疫球蛋白的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：

(1)用组织培养的灭活猪瘟病毒与弗氏完全佐剂以1∶1的比例混合后作为免疫原免疫牛，每头受体动物首次颈部多点肌肉注射40-60天头份的猪瘟疫苗，进行基础免疫；

(2)在基础免疫后7-10天进行加强免疫；猪瘟疫苗为150-250天头份；

(3)强化免疫后，猪瘟抗体效价达到高峰值时准备屠宰采血；采用自然加压凝血法分离免疫球蛋白，用硫酸铵沉淀杂蛋白，胃蛋白酶剪切Fc段，保留抗体F(ab)2段，再用硫酸铵沉淀Fc蛋白，除去Fc蛋白，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置2天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，杀灭其它不同动物易感病毒；

(4)血液中加入100-300单位/ml青霉素和100-300微克/ml链霉素等抗生素，自然凝固、放置5-10小时，分离血清，用辛酸法和硫酸铵法分离提取免疫球蛋白；

(5)过滤除菌，无菌分装，冰箱内保存。