CN101250226A - 抗猪蓝耳病免疫球蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗猪蓝耳病免疫球蛋白的制备方法，步骤如下：(1)用组织培养的灭活猪蓝耳病病毒与弗氏完全佐剂以1∶1的比例混合后作为免疫原免疫牛、驴，每头受体动物首次颈部多点肌肉注射30－50头份的猪蓝耳疫苗；(2)免疫后10－15天，进行加强免疫；猪蓝耳病疫苗为100－200头份；(3)采用自然加压凝血法分离免疫球蛋白，用硫酸铵沉淀杂蛋白，胃蛋白酶剪切Fc段，保留抗体F(ab)2段，再用硫酸铵沉淀Fc蛋白，除去Fc蛋白，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置2天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，杀灭其它不同动物易感病毒；(4)血液中加入抗生素，放置5－10小时，分离血清，用辛酸法和硫酸铵法分离提取免疫球蛋白；(5)过滤除菌，无菌分装。本发明制备简单，应用简便。

Description

抗猪蓝耳病免疫球蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及一种抗猪蓝耳病免疫球蛋白的制备方法。

背景技术

目前，猪病毒性疾病仍是当前严重制约养猪业健康发展的主要传染病。全国每年均有上亿头猪在不同季节发生病毒性传染病。猪一旦感染发病，则有起病急，临床症状严重，极易传播扩散，以及病死率和死亡率均较高的特点，对养殖业危害极大。

据有关权威机构对全国121个猪场以PCR检测蓝耳病抗原结果看，检出阳性场91个，阳性率为75.2％，证实猪群被蓝耳病病毒感染比较普遍，且非常严重。该病毒有两个血清型：美洲型和欧洲型。但从当前蓝耳病发病特点来看，发病已由过去母猪繁殖障碍为主转为以保育猪的呼吸道病综合征为主。在临床上见有初产母猪常发生流产、早产及产死胎等；经产母猪常出现滞后产、不发情或屡配不孕，而流产与死胎的大为减少，亚临床感染增多；断奶后的仔猪发病率上升，病情严重，死亡率增高。临床上常见蓝耳病与圆环病毒II型、或与猪蓝耳病毒或与伪狂犬病毒混合感染，同时继发多种细菌感染，如肺炎支原体、放线杆菌、链球菌及巴氏杆菌等。使病情复杂化，出现发热、腹式呼吸、腹泻、后躯麻痹、共济失调、眼睑水肿、皮下水肿、消瘦等症状，造成死亡率增高。

病猪可用黄芪多糖注射液等治疗。同时肌注青霉素与链霉素，以防治细菌继发感染。但治疗效果很不理想由于该病毒基因组的变异性很强，疫苗免疫效果不够理想。猪蓝耳病至今尚无有效的治疗药物和治疗方法。近年来曾经有人进行过用中草药制剂预防和治疗猪病毒性疾病的试验，但治愈率较低。抗生素及磺胺类药物基本无效。目前，猪蓝耳病血清是治疗猪病毒性疾病的有效药物。猪蓝耳病免疫球蛋白是治疗猪蓝耳的特异性生物制品，是一种被动免疫制剂，同时还有鉴别诊断和紧急预防接种等作用，具有较高的推广应用价值。89103922.8提供了一种生产治疗猪瘟血清的简单制取方法。本制品与抗菌素配合使用，主要用于治疗猪蓝耳病。200610131631.2提供一种抗猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒三联高免免疫球蛋白的制备方法，该产品主要针对母猪繁殖障碍病毒性疾病。200610131632.7提供一种抗猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒二联高免免疫球蛋白。主要是针对猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒。目前，有关用猪蓝耳病血清和免疫球蛋白的制备方法还未见报道。

因此，提供一种抗猪蓝耳病免疫球蛋白的制备方法，有效预防和治疗猪蓝耳病，是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术中的不足之处，提供一种制备简单、效果显著的抗猪蓝耳病免疫球蛋白的制备方法。

为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下：

一种抗猪蓝耳病免疫球蛋白的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：

(1)用组织培养的灭活猪蓝耳病病毒与弗氏完全佐剂以1∶1的比例混合后作为免疫原免疫牛、驴等动物，每头受体动物首次颈部多点肌肉注射30-50头份的猪蓝耳疫苗，进行基础免疫；

(2)基础免疫后10-15天，进行加强免疫；猪蓝耳病疫苗为100-200头份；

(3)强化免疫后，猪蓝耳抗体效价达到高峰值时准备屠宰采血；采用自然加压凝血法分离免疫球蛋白，用硫酸铵沉淀杂蛋白，胃蛋白酶剪切Fc段，保留抗体F(ab)2段，再用硫酸铵沉淀Fc蛋白，除去Fc蛋白，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置1-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，杀灭其它不同动物易感病毒；

(4)血液中加入100-300单位/ml青霉素和100-300微克/ml链霉素等抗生素，自然凝固、放置5-10小时，分离血清，用辛酸法和硫酸铵法分离提取免疫球蛋白；

(5)过滤除菌，无菌分装，冰箱内保存。

本发明动物是经过严格检疫的牛、驴等作为免疫动物。

本发明的有益效果是：免疫原用取猪蓝耳病毒细胞培养物经浓缩后加完全弗氏完全佐剂制备而成，然后免疫动物。通过免疫牛、驴，防止了同种动物之间某些其它病毒性传染病的人为传染。安全性好，效价高；通过免疫球蛋白提取免疫球蛋白，呈无色透明液体，既可以冰冻保存(-20℃以上)，也可以冷藏保存(+4℃～+12℃)储运方便。本发明制备的猪免疫球蛋白防治猪蓝耳病，每日注射1次，一个疗程1-3次，病重用量略加。临床试用表明，患蓝耳病猪经猪蓝耳病免疫球蛋白治疗后的痊愈率高达81.5％以上。制成的猪蓝耳病免疫球蛋白，注入动物机体后，具有疗效好、安全可靠、无毒副作用和成本低等优点。

具体实施方式

以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：

实施例1

一种抗猪蓝耳病免疫球蛋白的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：

(1)基础免疫，选健康的动物，如牛数头，每头受体动物首次颈部多点肌肉注射30-50头份的猪蓝耳疫苗，进行猪蓝耳病毒疫苗的基础免疫。猪蓝耳疫苗采取肌肉注射法、皮内、皮下多点注射、后海穴注射等多种免疫途径。用组织培养的灭活猪蓝耳病病毒与弗氏完全佐剂以1∶1的比例混合后作为免疫原免疫牛、驴，每头受体动物首次颈部多点肌肉注射30-50头份的猪蓝耳疫苗，进行基础免疫。

(2)基础免疫后8-12天，进行加强免疫；猪蓝耳病疫苗为100-200头份，肌肉或皮下注射。

(3)强化免疫后，猪蓝耳抗体效价达到高峰值时准备屠宰采血；即待血清中猪蓝耳抗体效价达到高峰值时准备屠宰采血，首先要常规保定，待宰猪颈部局部剪毛、冲洗、消毒，然后切开皮肤与脂肪，分离组织充分暴露颈静脉，切断颈静脉，用胶管导流或沿盆壁顺流接血。放血前一天晚上停食，可饮水；采用自然加压凝血法分离免疫球蛋白，用硫酸铵沉淀杂蛋白，胃蛋白酶剪切Fc段，保留抗体F(ab)2段，再用硫酸铵沉淀Fc蛋白，除去Fc蛋白，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置2天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，杀灭其它不同动物易感病毒。

(4)血液中加入100-300单位/ml青霉素和100-300微克/ml链霉素等抗生素，自然凝固、放置5-10小时，分离血清，用辛酸法和硫酸铵法分离提取免疫球蛋白。

(5)过滤除菌，无菌分装，冰箱内保存。

实施例2

一种抗猪蓝耳病免疫球蛋白的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：

(1)制备免疫血浆：用组织培养灭活病毒免疫动物，经过基础免疫、超免疫后，采血，分离血浆。

(2)精制提纯：将制得的免疫血浆按3倍稀释后经胃酶消化、加温变性、超滤等常规制备工艺，浓缩至蛋白含量为3-15％，效价含量为3000-8000单位/ml。加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置2天，灭活病毒，再加NaOH调至pH7.0，杀灭其它不同动物易感病毒。

(3)分包装：本发明可有液体及冻干两种类型，规格为治疗用400IU/瓶和预防用80IU/瓶；冻干制品分装后应立即在-320℃以下进行冷冻；干燥时间可根据水含量来决定；干燥完毕后进行真空封口。

应用实例：

天津某猪场累计购入仔猪324头，购入后结果相继发病，死亡92头，经临床症状和实验室诊断诊断为猪蓝耳病。对剩下的232余头猪进行了猪蓝耳病免疫球蛋白治疗。按每千克体重1毫升的剂量确定用量，选择肌肉丰满的部位进行多点肌肉注射，严重者间隔2日可再次注射猪蓝耳病免疫球蛋白。同时要饮用白糖水、维生素或葡萄糖水溶液，辅助给予青菜、水果等含维生素丰富的食物，结果康复189头，痊愈率为81.5％。

总之，猪蓝耳病免疫球蛋白制备包括有猪蓝耳病疫苗、猪免疫球蛋白、免疫佐剂等，经基础免疫→加强免疫→屠宰采集血液→用辛酸法和硫酸铵法→收获免疫球蛋白→分装→成品包装工序制成。用于防治猪蓝耳病等疾病。用法与用量：小猪3000单位/头/天、成年猪5000单位/头/天。每日注射1次，间隔2天后再次注射，一个疗程1-3次，病重者用量略加。临床试用表明，猪蓝耳病免疫球蛋白治疗猪蓝耳病治愈率在80％以上。

上述参照实施例对该抗猪蓝耳病免疫球蛋白的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1、一种抗猪蓝耳病免疫球蛋白的制备方法，其特征在于具体实施步骤如下：

(1)用组织培养的灭活猪蓝耳病病毒与弗氏完全佐剂以1∶1的比例混合后作为免疫原免疫牛、驴，每头受体动物首次颈部多点肌肉注射30-50头份的猪蓝耳疫苗，进行基础免疫；

(2)在基础免疫后10-15天进行加强免疫；猪蓝耳病疫苗为100-200头份；

(3)强化免疫后，猪蓝耳抗体效价达到高峰值时准备屠宰采血；采用自然加压凝血法分离免疫球蛋白，用硫酸铵沉淀杂蛋白，胃蛋白酶剪切Fc段，保留抗体F(ab)2段，再用硫酸铵沉淀Fc蛋白，除去Fc蛋白，加入盐酸调至pH2.0，4.0℃，放置1-4天，灭活病毒，再加NaOH调至pH 7.0，杀灭其它不同动物易感病毒；

(4)血液中加入100-300单位/ml青霉素和100-300微克/ml链霉素等抗生素，自然凝固、放置5-10小时，分离血清，用辛酸法和硫酸铵法分离提取免疫球蛋白；

(5)过滤除菌，无菌分装，冰箱内保存。