CN115125271A - 一种适用于多位点新型冠状病毒核酸检测的假病毒阳性标准品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于多位点新型冠状病毒核酸检测的假病毒阳性标准品。所述阳性标准品以慢病毒为载体，所述慢病毒载体上覆盖有用于新型冠状病毒SARS‑CoV‑2核酸检测的靶标基因，所述靶标基因为ORF1ab基因、N基因、E基因和S基因。本发明提供的所述阳性标准品具有新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的特异性核酸序列，具有很好的稳定性和重复性，以该阳性标准品绘制的RT‑PCR标准曲线具有良好的扩增效率和线性关系，通过实时荧光定量PCR方法可以对新冠核酸检测样本中的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2载量进行绝对值定量，保证新冠核酸检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种适用于多位点新型 冠状病毒核酸检测的假病毒阳性标准品。
背景技术
新型冠状病毒即SARS-CoV-2，能引起严重急性呼吸感染，其早 期症状同普通病毒感冒类似，随着病情发展，病人会出现呼吸困难、 胸闷、甚至呼吸窘迫症状，通过医学影像学检查可见肺部有多发磨玻 璃影，严重者可出现肺实变。
SARS-CoV-2作为一种新型冠状病毒，是一类具有囊膜、基因组 为线性单股正链的RNA病毒，该病毒采集自不同地区患者的病毒样 本相关序列也已发布至国家生物信息中心的2019新型冠状病毒信息 库(https://bigd.big.ac.cn/ncov)。
NCBI收录序列为NC_045512.2，全长29903bp。将序列与SARS 比对，发现有88％的相似性。因此，针对新型冠状病毒SARS-CoV-2 的核酸诊断开发尤为重要，为了满足临床诊断的需要，截止目前，国 家已经紧急批准了数十款核酸检测试剂盒上市，用于临床诊断，这些 试剂盒大部分都是采用RT-PCR的方法，上市后的临床检测结果反馈 显示，多数试剂盒产品存在较高比例的假阴性问题。试剂盒的检测限 问题，是造成假阴性的最大根源，因此针对诊断产品的检测限，需要 认真做每款试剂盒的性能评价。以往针对检测限的性能评价，一般是 选择体外合成的RNA或者临床阳性病毒来作为标准品，用于性能评 价。但是两者都具有很明显的确定，首先体外合成的RNA，一般是 很纯，单一，不涉及提取，不符合临床病毒的微环境，因此必然造成 检测灵敏度被高估，这也是存在高概率假阴性的主要原因；再次临床 阳性病毒，即使是灭活的病毒，也是存在很大的生物安全隐患，因此 要求实验室级别为P3-P4，大部分开发诊断试剂盒单位都不满足该要 求，另外临床阳性病毒也是来源很有限，不能被稳定供应，反复用于 试剂盒的性能评价。
因此，有病毒的完整包膜结构，有新型冠状病毒SARS-CoV-2对 应的核酸序列，非常适合用于核酸诊断新型冠状病毒SARS-CoV-2。
现有技术中CN202010172424.1专利文献涉及一种用于核酸诊断 新型冠状病毒2019-nCoV的假病毒标准品及其应用，其假病毒标准 品包裹的基因包括新型冠状病毒SARS-CoV-2基因RdRp、Gene E和 Gene N中的一种或多种，其质粒是将合成后基因插入PCBLVX-PURO载体中构建而成。现有技术中CN202010579907.3专 利文献涉及一种病毒形式的新型冠状病毒核酸标准物质及其制备方 法，其假病毒标准品包裹的基因包括新型冠状病毒SARS-CoV-2靶标 基因ORF1ab、N基因和E基因，其质粒是将合成后基因插入慢病毒 质粒pLenti-puro载体而成。
上述现有技术中的两种技术方案的新型冠状病毒标准品均覆盖了 新型冠状病毒SARS-CoV-2靶标基因ORF1ab、N基因和E基因，但 是对于近期在英国出现的病毒变异株的S蛋白基因变异并未涉及；所 以有必要针对新增加的新型冠状病毒SARS-CoV-2靶标基因S基因也 设计进入阳性标准品中，保证目前主流新冠核酸检测结果及新型变异 株检测结果的准确性。另外，目前市面上的新型冠状病毒标准品产品 还很少，竞争性产品不多，造成产品价格较高，不利于试剂盒生产厂 家将更具性价比的标准品添加到试剂盒中，从而不利于新冠核酸检测 结果准确性的保证。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供的技术方 案可实现较低生产成本的基础上大量提供稳定性高、特异性好、可重 复性好的新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性标准品，并且该标准品不仅 覆盖了SARS-CoV-2主流靶标基因ORF1ab、N基因和E基因，还覆 盖了英国变异病毒株的S蛋白基因。
本发明提供一种适用于多位点新型冠状病毒核酸检测的假病毒 阳性标准品，所述阳性标准品以慢病毒为载体，所述慢病毒载体上覆 盖有用于新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测的靶标基因，所述靶标 基因为ORF1ab基因、N基因、E基因和S基因。
优选地，所述慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro载 体，通过全基因组合成的方法，将新型冠状病毒的ORF1ab基因、N 基因、E基因和S基因片段合成到该载体上。
优选地，其制备过程包括：靶标基因合成、合成后的靶标基因分 别载入慢病毒载体、及假病毒包装等步骤。
优选地，所述靶标基因合成的方法为：针对新型冠状病毒 SARS-CoV-2基因组中开放读码框ORF1ab、核壳蛋白N基因、包膜 蛋白E基因、刺突糖蛋白S基因序列进行修改，使其在5'端和3'端 包含随机的终止密码子；其中，ORF1ab基因覆盖检测区全长，并以 打散为多段首尾叠加衔接的目的片段的形式分别进行合成。
优选地，所述合成后的靶标基因分别载入慢病毒载体的方法为： 将靶标基因分别反向克隆到慢病毒载体 pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro中的Puromycin抗性基因上游的多克隆位点，同时替换慢病毒质粒载体上的CMV启动子。
优选地，所述假病毒包装的方法为：使用脂质体2000将慢病毒 载体转染HEK293T细胞，将pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro-GP1 -10慢病毒颗粒在培养皿中和表达病毒结构蛋白的辅助质粒混合 pVSVG蛋白及psPAX2蛋白，室温孵育后转染OptiMEM培养基中的HEK293T细胞，实现靶标基因片段的转录、病毒外壳蛋白的表达和 病毒组装，组装好的病毒分泌胞外。
相较于现有技术，本发明提供的用于新型冠状病毒核酸检测的阳 性标准品具有以下有益效果：
一、本发明构建的新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性标准品能够较 低成本的基础上大量生产，具有稳定性高、特异性好、可重复性好的 优点，并且该标准品不仅覆盖了SARS-CoV-2主流靶标基因ORF1ab、 N基因和E基因，还覆盖了英国变异病毒株的S蛋白基因。
二、新型冠状病毒SARS-CoV-2病毒阳性标准品制备的难点还在 于ORF1ab基因覆盖检测区有两万多个碱基，现有技术解决方案只选 取其中的少数几处热点片段，且不同的技术平台可能需要配对互补的 区域存在不同，存在标准品无法检测出非覆盖片段的变异、和满足不 同技术平台技术要求的问题，；如果全序列直接选取，则存在假病毒 具有致病性的风险。
本发明创造地将ORF1ab基因全序列打散为10段首位叠加衔接 的目的片段，巧妙地实现了假病毒对SARS-CoV-2病毒全长检测区模 拟序列的覆盖，完美的模拟出了接近真实病毒的核酸序列及完整包膜 结构，且无致病性，并满足生物安全级别。
三、实验数据表明，RT-PCR标准曲线具有较高的扩增效率和良 好的线性关系，以及熔解曲线分析提示，该标准品具有较好的 SARS-CoV-2病毒特异性；该标准品具有较大的检测范围，每个稀释 梯度PCR可检测到50个拷贝的重组质粒，具有较高的灵敏度；独立 实验的变异系数提示质粒标准品具有较高的稳定性和重复性。另外， 实验证明，以本发明构建的pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro质粒为 标准品建立的实时荧光定量PCR方法可以对新冠核酸检测样本中的 新型冠状病毒SARS-CoV-2载量进行绝对值定量，能够动态连续反映 样本中病毒拷贝数量，保证新冠核酸检测结果的准确性。
四、本发明构建的新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性标准品，必将 符合国内外巨大的市场需求，比现有技术中的标准品更具优势，且生 产成本更低，并可有效地评估临床核酸诊断试剂盒的性能，指导临床 核酸检测的结果。
附图说明
图1为本发明构建的新型冠状病毒重组质粒pCDH-CMV-MCS- EF1-GFP+Puro载体图谱。
图2为本发明的新型冠状病毒基因组中开放读码框ORF1ab基因 全序列打散为10段首位叠加衔接的目的片段的示意图。
图3为本发明构建的新型冠状病毒阳性标准品的Sanger测序验 证图谱。
图4为本发明构建的新型冠状病毒阳性标准品的慢病毒包装验 证图。
图5经10-3～10-10梯度稀释后进行荧光定量PCR扩增建立的标 准曲线。
图6为按照标准曲线测定的荧光定量PCR不同循环数扩增曲线。
图7为不同引物浓度的扩增产物熔解曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合 附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所 描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1、用于新型冠状病毒核酸检测的阳性标准品的制备方法 及假病毒包装等步骤
一、新型冠状病毒靶标基因合成及慢病毒载体构建
新型冠状病毒SARS-CoV-2核苷酸序列来自NCBI GenBank登录 号NC_045512.2。针对新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组中开放读码 框ORF1ab基因、核壳蛋白N基因、包膜蛋白E基因、刺突糖蛋白S 基因序列(本案中所涉及SARS-CoV-2序列信息请参见国家生物信息 中心网站网址：https://bigd.big.ac.cn/ncov/；其中新型冠状病毒英国变 异VUI- 202012/01序列信息请参见国家生物信息中心网站网址中的 https://bigd.big.ac.cn/ncov/variation/annotation/variant/23063。)进行修 改，使其在5'端和3'端包含随机的终止密码子；其中，ORF1ab基因 覆盖检测区全长，并以打散为多段首尾叠加衔接的目的片段的形式分 别进行合成。采用GenBuilderTM高效无缝克隆试剂盒，将靶标基因分 别反向克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro(结构图 参见图1，该慢病毒载体的详细信息请参考网站网址： http://www.addgene.org/vector-database/2082/)中的Puromycin抗性基因上游的多克隆位点，同时替换慢病毒质粒载体上的CMV启动子。 本案中ORF1ab基因覆盖检测区全长，并以打散为10段首尾叠加衔 接的目的片段的形式分别进行合成(参见图2)，具体如下：
选择载体：pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro(CD513B-1)
GP1：266-2473；
GP2：2324-4602；
GP3：4453-6731；
GP4：6582-8860；
GP5：8711-10989；
GP6：10840-13118；
GP7：12969-15247；
GP8：15098-17376；
GP9：17227-19505；
GP10：19356-21555。
每个质粒的最终序列通过Sanger测序确认载入基因序列的正确 性。将上述慢病毒质粒分别转化大肠杆菌，在LB培养基37℃、14～ 16小时过夜培养，用碱性裂解提取法分离质粒，经离子交换柱层析、 TE洗脱、质粒纯化后回收慢病毒质粒并去除内毒素。对回收的质粒 进行内毒素检测，小于5EU/mg后即可作为转染级别质粒进入下步使 用。
二、新型冠状病毒/假病毒的包装
使用脂质体2000将慢病毒载体转染HEK293T细胞，将 pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro-GP1-10慢病毒颗粒在培养皿中和 表达病毒结构蛋白的辅助质粒混合pVSVG蛋白及psPAX2蛋白，室 温孵育后转染OptiMEM培养基中的HEK293T细胞，实现靶标基因 片段的转录、病毒外壳蛋白的表达和病毒组装，组装好的病毒分泌胞 外。使用MycoAlertTMPLUS支原体检测试剂盒检测定支原体，阴性 即为合格。
具体为：HEK293T细胞到6孔板，密度大约40％后，进行转染， 转染前1h，移除培养基，换入新鲜预热的OptiMEM培养基。使用脂 质体2000进行转染，具体方法参照脂质体2000说明书。1ug pCDH- CMV-MCS-EF1-GFP+Puro-GP1-10质粒，分别与0.5ug pVSVG，和 1.5ugpsPAX2质粒。转染后6h，更换普通培养基培养。转染后60h， 收集培养基，3000rpm 4℃离心10min，移除细胞碎片。上清使用 0.45um滤器过滤，24,000rmp，4℃离心2h，使用普通培养基重悬并 分装冻存于-80℃。参见图4，显示HEK293T细胞包装慢病毒时，GFP 绿色荧光(图4中右侧)显示转染成功率，证明本发明的技术方案可 以成功构建出载体包装慢病毒。
实施例2、用于新型冠状病毒核酸检测的阳性标准品的性能评价
1)根据中国CDC推荐的针对新型冠状病毒SARS-CoV-2靶标 ORF1ab基因和N基因引物、探针序列信息；
根据国家生物信息中心https://bigd.big.ac.cn/ncov/，以及新冠病 毒英国变异VUI-202012/01序列https://bigd.big.ac.cn/ncov/variation/ annotation/variant/23063，靶标E基因和S基因序列信息；
进行新型冠状病毒SARS-CoV-2引物及探针合成，具体如下：
ORF1ab-F：5’-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3’；
ORF1ab-R：5’-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3’；
ORF1ab-P：5’-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-3’；
N-F：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’；
N-R：5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’；
N-P：5’-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-3’。
E-F：5’-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’；
E-R：5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’；
E-P：5’-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3’。
S-F：5’-TTGTGCCCTTTTGGTGAAGT-3’；
S-R：5’-TAGGACAGAATAATCAGCAACACA-3’；
S-P：5’-CCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTG-3’。
2)使用试剂盒提取假病毒中的RNA，在bio-rad QX200上开展 拷贝数定量，其中配置PCR反应液及设置PCR反应体系等步骤均遵 从本领域现有技术中的相关规定。
3)检测结果表明，本发明所构建的模拟SARS-CoV-2的病毒核 酸、包膜结构，利用CDC和现有技术设计的引物、探针的检测体系， 对假病毒的靶标基因拷贝数开展绝对定量，均能检测出符合标准拷贝 数的目的基因片段ORF1ab基因、N基因、E基因和S基因(参见图3)。
另外参见图5-7，其中图5为本发明构建的新型冠状病毒重组质 粒经10-3～10-10梯度稀释后进行荧光定量PCR扩增建立的标准曲 线；图6为按照标准曲线测定的荧光定量PCR不同循环数的扩增曲 线；图7为不同引物浓度的扩增产物熔解曲线。
上述实验数据表明，RT-PCR标准曲线具有较高的扩增效率和良 好的线性关系，以及熔解曲线分析提示，该标准品具有较好的 SARS-CoV-2病毒特异性；该标准品具有较大的检测范围，每个稀释 梯度PCR可检测到50个拷贝的重组质粒，具有较高的灵敏度；独立 实验的变异系数提示质粒标准品具有较高的稳定性和重复性。另外， 实验证明，以本发明构建的pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro质粒为 标准品建立的实时荧光定量PCR方法可以对新冠核酸检测样本中的 新型冠状病毒SARS-CoV-2载量进行绝对值定量，能够动态连续反映 样本中病毒拷贝数量，保证新冠核酸检测结果的准确性。
4)最后，为了评价该适用于多位点新型冠状病毒核酸检测的假 病毒阳性标准品的临床性能，我们还在广东地区19家实验室展开了 临床室间质评(省级医院包括中山大学附属第一医院、中山大学附属 第三医院、广东省第二中医院黄埔医院、广东省中医院大学城、广东 省第二人民医院；市级医院包括广州市第八人民医院、佛山市第一人 民医院、佛山市第二人民医院、佛山市第四人民医院、广州红十字会 医院、广州市胸科医院、佛山市中医院；区县级医院包括广州中医药 大学顺德医院、顺德区妇幼保健院、广东省人民医院南海医院、南方 医科大学南海医院、南方医科大学顺德医院、顺德区疾控中心、佛山 市南海区黄岐医院)，如下表所示。
新型冠状病毒阳性标准品室间质评多中心结果反馈表
结果分析显示，该阳性标准品在19家实验室均能成功被扩增， 不同实验室覆盖的核酸检测产品有迈克生物、上海之江、达安基因、 达安基因(快速试剂)、武汉明德生物科技有限公司、上海伯杰、圣 湘生物其中产品试剂盒，说明该试剂具有良好的检测线，能满足不同 厂家的不同位点检测要求；其中相同试剂盒的室间质评反馈的结果相 近，说明该产品性能稳定，具有临床应用的价值。
综上所述，本发明构建的新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性标准品 能够较低成本的基础上大量生产，具有稳定性高、特异性好、可重复 性好的优点，并且该标准品不仅覆盖了SARS-CoV-2主流靶标基因 ORF1ab、N基因和E基因，还覆盖了英国变异病毒株的S蛋白基因。
此外，SARS-CoV-2病毒阳性标准品制备的难点还在于ORF1ab 基因覆盖检测区有两万多个碱基，现有技术解决方案只选取其中的少 数几处热点片段，且不同的技术平台可能需要配对互补的区域存在不 同，存在标准品无法检测出非覆盖片段的变异、和满足不同技术平台 技术要求的问题，；如果全序列直接选取，则存在假病毒具有致病性 的风险。
本发明创造地将ORF1ab基因全序列打散为10段首位叠加衔接 的目的片段，巧妙地实现了假病毒对SARS-CoV-2病毒全长检测区模 拟序列的覆盖，完美的模拟出了接近真实病毒的核酸序列及完整包膜 结构，且无致病性，并满足生物安全级别。
另外，本发明构建的新型冠状病毒SARS-CoV-2阳性标准品，必 将符合国内外巨大的市场需求，比现有技术中的标准品更具优势，且 生产成本更低，并可有效地评估临床核酸诊断试剂盒的性能，指导临 床核酸检测的结果。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范 围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接 运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围 内。
Claims (6)
1.一种适用于多位点新型冠状病毒核酸检测的假病毒阳性标准品，其特征在于，所述阳性标准品以慢病毒为载体，所述慢病毒载体上覆盖有用于新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测的靶标基因，所述靶标基因为ORF1ab基因、N基因、E基因和S基因。
2.根据权利要求1所述的阳性标准品，其特征在于，所述慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro载体，通过全基因组合成的方法，将新型冠状病毒的ORF1ab基因、N基因、E基因和S基因片段分别合成到该载体上。
3.根据权利要求2所述的阳性标准品，其特征在于，其制备过程包括：靶标基因合成、合成后的靶标基因分别载入慢病毒载体、及假病毒包装等步骤。
4.根据权利要求3所述的阳性标准品，其特征在于，所述靶标基因合成的方法为：针对新型冠状病毒SARS-CoV-2基因组中开放读码框ORF1ab基因、核壳蛋白N基因、包膜蛋白E基因、刺突糖蛋白S基因序列进行修改，使其在5'端和3'端包含随机的终止密码子；其中，ORF1ab基因覆盖检测区全长，并以打散为多段首尾叠加衔接的目的片段的形式分别进行合成。
5.根据权利要求4所述的阳性标准品，其特征在于，所述合成后的靶标基因分别载入慢病毒载体的方法为：将靶标基因分别反向克隆到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro中的Puromycin抗性基因上游的多克隆位点，同时替换慢病毒质粒载体上的CMV启动子。
6.根据权利要求5所述的阳性标准品，其特征在于，所述假病毒包装的方法为：使用脂质体2000将慢病毒载体转染HEK293T细胞，将pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro-GP1-10慢病毒颗粒在培养皿中和表达病毒结构蛋白的辅助质粒混合pVSVG蛋白及psPAX2蛋白，室温孵育后转染OptiMEM培养基中的HEK293T细胞，实现靶标基因片段的转录、病毒外壳蛋白的表达和病毒组装，组装好的病毒分泌胞外。
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