TW480284B - Mutant prenly diphosphate synthase - Google Patents

Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 480284 Λ7 ____Β7 五、發明説明（1 ) 發明之背景 1 .發明的範圍 本發明是有關於合成直鏈異戊烯二磷酸酯之新穎突變 型酶或其基因等，該異戊烯二磷酸酯是對生物體具重要性 之多種化合物的先驅物*該化合物例如類固醇、泛醌、多 萜類、類胡蘿蔔素、異戊烯化蛋白質、動物荷爾蒙、植物 荷爾蒙等。 2 ·相關技藝 說到在身體中具重要功能的物質，許多的物質是以異 戊二烯（2 —甲基一 1，3 —丁二烯）做爲構成元件來進 行生物合成的。這些化合物被稱爲類異戊二烯、類萜或萜 、並依照碳原子數而被分類爲半萜（C5)、單萜（ C10)、倍半萜（C15) 、雙萜（C20)、雙倍半 萜（C25)、三萜（C30)、四萜（C4 0)及其類 似物。確實的合成是以甲羥戊酸路徑起始，經此而合成甲 羥戊酸一 5 —二磷酸酯，接著有異戊烯二磷酸酯（ I P P )的合成，此即是一種活性異戊二烯單位。 此被提出做爲一種假設先驅物之異戊烯單位的本體被 發現爲I P P，所以稱之爲活性異戊烯單位。二甲丙烯基 二磷酸酯（DMAP P)是一種I P P異構物，其被用來 做爲異戊烯腺嘌呤反應中的一種基質，熟知該物係做爲一 種細胞動素與一種植物荷爾蒙，亦被熟知其與I P P進行 縮合反應以合成直鏈狀活性類異戊二烯如犍牛兒基二磷酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一~ ~ 4 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫^-頁)

IX 480284 A7 __________B7__ 五、發明説明（2 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 醋（G P )、尼基二碟酸醋（neryl diphosphate)、法 11 尼基二磷酸酯（FPP)、德牛兒犍牛兒基二磷酸酯（ GGpp)、犍牛兒法呢基二磷酸酯（GFPP)、六異 戊烯二磷酸酯（He xPP)、七異戊烯二磷酸酯（ HePPP)及其類似物。 有Z型與E型縮合反應。GPP即是E型縮合產物， 胃/S基二磷酸酯爲Z型縮合產物。雖然所有的E型被視爲 於FPP與GGPP中之活性型式，Z型縮合反應發現於 天然橡膠、多萜醇、細菌萜醇（十一萜醇）及植物中會導 致不同的聚萜醇的合成。咸信這些聚萜醇是利用焦磷酸和 /或分子內之碳主鏈的磷酸酯鍵能量、進行縮合反應以產 生焦磷酸和/或磷酸做爲反應的副產物。 好浐部中央桴準而只工消費合作拉印繁 藉由G —蛋白質*其在細胞中訊息傳導機制中是重要 的，以F P P或GGP P充當反應的基質將引起異戊烯化 蛋白質（從FPP或GGPP) ; archaea之細胞膜脂質 (從GGPP):鯊烯（從FPP) —類固醇之一種先驅 物；及八氫蕃茄紅素（從GGPP) —類胡蘿荀素之一種 先驅物的合成。從分別具六與七個異戊二烯單位之 H e X P P與H e p P P至具有十個異戊二烯單位的異戊 烯二磷酸酯皆可充當合成泛醌以及參與電子傳遞系統之甲 基棻醌類（維生素K2)的先驅物。 此外，經由這些活性型式類異戊二烯的生物合成，下 列維持生命所必需的植物類化合物已被合成。剛剛提及一 些，有細胞動素之植物荷爾蒙及使用半萜類做爲其合，成先 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐)~ 480284 Λ7 ___________B? 五、發明説明（3 ) 驅物之異戊烯修飾腺苷轉移核糖核酸（tRNA)，單萜 锯牛兒醇及其做爲玫瑰油香料主要成份之橙花醇異構體， 以及一種樟腦樹萃取物做爲殺蟲劑之樟腦•倍半萜類包含 昆蟲的青春激素•雙萜類包含一種植物荷爾蒙赤徽素、昆 蟲的蹤跡信息素，以及做爲視覺色素先驅物功能之視黃醇 與視黃醛、親鹵素性archaea之紫色膜蛋白的結合成份， 以及維生素A。 再者，利用一種三萜類的鯊烯，已合成各種不同的類 固醇化合物，包含例如動物之性荷爾蒙，維生素D，昆蟲 之一種交配荷爾蒙的銳皮激素，一種植物荷爾蒙 brass i no 1 i de，以及漿膜之組成份。做爲有機物及維生素 A之各種色素之先驅物的四萜類之種種類胡蘿蔔素亦是源 出於活性類異戊二烯的重要化合物•如hlorophyl 1，脫鎂 葉綠素、生育酚（維生素E )、及葉綠醌（維生素K 1 ) 等化合物亦是源出於四萜類· 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫七頁) 連續地縮合I PP與丙烯基質DMAPP、GPP、 FPP、GGPP、GFPP及其類似物之活性類異戊二 烯合成酶被稱爲異戊烯二磷酸酯合成酶，根據主要反應產 物之最大鏈長度，其亦被命名如法呢基二磷酸酯合成酶（ FPP合成酶）、锯牛兒牴牛兒基二磷酸酯合成酶（ G G P P合成酶），及其類似物。有報告提出關於如法呢 基二磷酸酯合成酶、锯牛兒樾牛兒基二磷酸酯合成酶、六 異戊烯二磷酸酯合成酶、七異戊烯二磷酸酯合成酶、八異 戊烯二磷酸酯合成酶、九異戊烯二磷酸酯合成酶（茄尼基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 480284 A7 _ _B7 五、發明説明（4 ) 二磷酸酯合成酶）、十一異戊烯二磷酸酯合成酶、及得自 細菌、archaea、徽菌、植物及動物類似物之酵素的純化 、活性測定、基因選殖及其核苷酸定序。 這些構成許多種不同之化合物之合成基礎的活性異戊 二烯合成酶在工業上及生命科學的領域上是重要的，由於 它們不穩定的特性與低特異活性•在工業應用上引起些微 的注意。然而，因得自嗜熱菌與archaea之F P P合成酶 及G G P P合成酶的基因分離〔A· Chenand D· Poulter (1993) J· Biol· Chem· 268: 11002-11007, Τ· Koyama et al· (1993) J. Biochem. 113:355-363, S· -i, Ohnuma et al. (1994) J. Biol. Chem. 269： 14792-1 4797〕，它們做爲酵素的效益已增加。 好浐部中央*?:率而於工消费合作4i印繁 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 合成具2 0至2 5個碳原子之異戊烯二磷酸酯的酵素 是同質二聚體並且如曾經公開於許多報告中所載，其相當 易於在活體外進行反應。然而，咸信此種合成具有上述極 佳長度鏈長之異戊烯二磷酸酯的酵素是異質二聚體，或需 要如脂質等額外的因子•所以，爲了實現其在工業上的應 用，必須尋找最適宜的條件以允許兩種次單位或額外因子 的再組合，這是一項困難的任務。 因此，冀求一種技術藉由人爲改變得自嗜熱生物穩定 且具髙度特異活性之同質二聚體型式之異戊烯二磷酸酯合 成酶的胺基酸序列，來製造能夠合成具較長鏈長之異戊烯 二磷酸酯的同質二聚體型式熱穩定性異戊烯二磷酸酯合成 酶β · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐） 480284 Λ7 B? 五、發明説明（5 ) 關於此種得自嗜熱生物之異戊烯二磷酸酯合成酶，目 前有衍自 Bac i 1 1 us stearothermoohi lus之經改變 F P P 合成酶及衍自 Sulfolobus ac i doca 1 dar i us 之 G G P P 合 成酶的範例。筛選 Bacillus stearothermonhi lus 之 F P P合成酶的突變型酵素及其基因，是藉由衍自 Er w i n i a uredovora之c r t B (八氫蕃苑紅素合成酶之 基因）與crt I (八氫蕃茄紅素去飽和酶，順式：反式 異構酶之基因）同時存在所產生之蕃茄紅素在該生物造成 的顔色變化*而突變型steirothermophi lus之F P P 合成酶的基因是選自大腸桿菌e ac i doca 1 dar i us之 G G P P合成酶與其突變體及其基因是根據 Saccharom vces cer ev i ceae 之 H e x P P 合成酶缺損性的 芽生酵母菌的甘油代謝活性之增補活性予以篩選。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) JL. uredovora之Cr tB與Cr t I基因同時存在的 方法無法用於篩選較突變型酵素之G G P P還長的反應產 物，並且利用H e X P P合成酶缺損之芽生酵母菌的互補 活性的篩選方法亦無法用於偵測較H e X P P還長之反應 產物的特異性•這些遺傳篩選方法可以選殖具有G G P P ，GFPP、與HexPP合成活性之突變型異戊烯二磷 酸酯合成酶的基因*但是在延長反應產物鏈長的目的下， 無法有系統地調控異戊烯二烯磷酸酯合成酶之反應物的鏈 長度。達成此目的之規則亦不被知曉· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8 - 480284 A7 B7 五、發明説明（6 ) 發明之摘要 本發明之目的是藉由改變異戊烯二磷酸酯酵素之胺基 酸殘基，來建立可系統性的調控反應產物鏈長度的規則。 一種新的酵素其可更穩定或具髙度特異活性而更適於工業 上的應用，將使其可能藉由基於上述改變胺基酸殘基的規 則而即刻獲得可合成較長鏈長之異戊烯二磷酸酯的突變型 酵素或及其基因·

由突變型t acidocaldarius之G G P P合成酶基因 的核苷酸序列資訊，可知根據異戊烯二磷酸酯合成酶之胺 基酸序列的分析所推測之兩個天門冬胺酸富藏區•位於胺 基末端天門冬胺酸富藏保存序列I (DDXX (XX) D )之上游第五位置的胺基酸殘基涉及控制反應產物之鏈長 〇 好浐部中央樣孪而只工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 因此，本發明提供一種突變型異戊烯二磷酸酯合成酶 ，其中位在原始異戊烯二磷酸酯合成酶保存區之第二區的 天門冬胺酸富藏區DDXX (XX) D (在括弧內的每個 X可能不存在）N —端，且由N —端方向自D算起第五位 置的胺基酸殘基已被其它胺基酸所取代· 本發明亦提供該酵素編碼之DNA或RNA· 本發明進一步地提供一個含有該DNA之重組載體* 一種特異的表現載體❶ 本發明更進一步地提供經由上述載體轉形之宿主。 此外本發明亦提供一種用以生產具2 0個碳原子或更 多之異戊烯二磷酸酯的方法，其特徵在於上述酵素是_與選 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X297公釐） 480284 Λ7 B*? 五、發明説明（7 ) 自包含異戊烯二磷酸酯、二甲丙烯基二磷酸酯、德牛兒基 二磷酸酯、法呢基二磷酸酯及犍牛兒搌牛兒基二磷酸酯的 基質接觸。 本發明另提供一種用以生產如申請專利範圍第1至第 4項中任一項之酵素的方法，該方法包含培養上述之宿主 ，之後並回收培養中的表現產物。 圖式簡要說明 第1圖顯示所獲得之19個突變型BstFPSs ( B. stearothermophi lus F P P 合成酶）與一個野生型 B s t FPS (樣本命名爲Y)之酵素活性的圖表·、引 子DMAPP#指示DMAPP被用來做爲丙烯基基質。 、引子GPP'指示GPP被用來做爲丙烯基基質，而、 引子F P P"指示F P P被用來做爲丙烯基基質·在命名 A至W的樣本中，於8 1位置導入取代作用後之胺基酸名 稱以單字母密碼來表示· 第2圖顯示當DMAP P被用來做爲丙烯基基質時， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫4頁) 突變型B s t FPS s反應之脫磷酸化產物的TLC發展 狀態的照片。Y 8 1 A至Y8 1 Y表示胺基酸取代式突變 〇 第3圖顯示當GPP被用來做爲丙烯基基質時，突變 型B s t F P S s反應之脫磷酸化產物的TL C發展狀態 的照片。Y 8 1 A至Y8 1 Y表示胺基酸取代型突變❶ 第4圓顯示當F P P被用來做爲丙烯基基質時，袭變 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X：297公楚） -10 - 480284 A7 B7 五、發明説明（8 ) 型B s t F P S s反應之脫磷酸化產物的TL C發展狀態 的照片· Y8 1 A至Y8 1 Y表示胺基酸取代型突變❶ 第5圓是顯示當DMA P P被用來做爲丙烯基基質時 ，酵素活性與胺基酸側鏈分子量之間相關性的圖。 第6圓是顯示當G P P被用來做爲丙烯基基質時，酵 素活性與胺基酸側鏈分子量之間相關性的圖· 第7圖是顯示當F P P被用來做爲丙烯基基質時，酵 素活性與胺基酸側鏈分子量之間相關性的圖· 第8圓是顯示當DMAP P被用來做爲丙烯基基質時 ，反應產物之平均鏈長度與胺基酸側鏈分子量之間相關性 的圖。 第9圖是顯示與G P P被用來做爲丙烯基基質時*反 應產物之平均鏈長度與胺基酸側鏈分子量之間相關性的圓 〇 第1 0圖是顯示當F P P被用來做爲丙烯基基質時， 反應產物之平均鏈長度與胺基酸側鏈分子量之間相關性的 圖。 經浐部中央榀率而β工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第11圖是顯示不同的異戊烯二磷酸酯合成酶之第一 區至第七區及天門冬胺酸富藏區的圖，並且胺基酸（加星 號）位於N —端方向自其末端算起第五位置•在此圖中* 該序列表示法呢基二磷酸酯合成酶的胺基酸序列*1是得 自 Bacillus stearothermophi lus * 2 是得自 Escherichia co 1 i , 3 是得自 Saccharomvces cer ev i ceae，4 是得自 老鼠，5是得自於人類。 . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -11 - 480284 A7 _____B7____ 五、發明説明（9 ) 詳細說明 曾經被提出在異戊烯二磷酸酯合成酶（在一個異質二 聚體案例中的一個次單位）的胺基酸序列中有七個保存區 (A, Chem et al., Protine Science Vol. 3, pp. 600-607, 1 994 )。其亦被熟知在五個保存區中，第二區包含 一個天門冬胺酸富藏區之保存區域〔DDXX (XX) D 〕（括弧內的兩個X可能不存在）·雖然在第四區中亦有 天門冬胺酸富藏區*該用於指定本發明胺基酸序列之修飾 區域的天門冬胺酸富藏區是位於第二區，相對於表現在第 四區之天門冬胺酸富藏區二*該區被稱爲天胺冬胺酸富藏 區~* ° 經浐部中央榀卒而只工消費合作扣印繁 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 至於具有如上陳述之天門冬胺酸富藏區的異戊烯二磷 酸酯合成酶，那兒可能有提及法呢基二磷酸酯合成酶，犍 牛兒德牛兒基二磷酸酯合成酶、六異戊烯二磷酸酯合成酶 、七異戊烯二磷酸酯合成酶、八異戊烯二磷酸酯合成酶、 九異戊烯二磷酸酯合成酶、十一異戊烯二磷酸酯合成酶， 及其類似物。較特殊的範例包括Bacillus stearothermophi lus之法呢基二碟酸酯合成酶* Escherichia co 1 i之法呢基二碟酸酯合成酶，

Sacchar om vces cer ev i ceae之法呢基二碟酸酯合成酶，老 鼠之法呢基二磷酸酯合成酶，人類之法呢基二磷酸酯合成 酶，Naeur ospor a cr assa之德牛兒德牛兒基二碟酸醋合成 酶，Sacchar om vces cereviceae之六異戊嫌二憐酸酯合成 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 12 - 480284 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 B7 _五、發明説明（1{)) 酶，及其類似物。 經由這些之中的一些範例，法呢基二磷酸酯合成酶之 胺基酸序列第一區至第七區以及位於第二區中之天門冬胺 酸富藏區一（在方格中）示於第1 1圖中。 本發明可應用於具有這些天門冬胺酸富藏區一的異戊 烯二磷酸酯合成酶。 根據本發明中，位於該天門冬胺酸富藏區一 DDXX (XX) D (括弧中的兩個X可能不表現）之胺 基酸序列由N—端方向自N-端之胺基酸D算起第五位置 的胺基酸殘基可被其它的胺基酸來取代·該胺基酸於第 1 1圓中以加上一個星號來指明•該取代後的胺基酸可能 是不同於原始胺基酸之自然存在的胺基酸。例如一個如此 的實施例中，提供一種酵素，其具有在SEQ ID No :1之8 1位置爲酪胺酸被一個自然存在的胺基酸所取代 的胺基酸序列。 本發明中多種突變型異戊烯二磷酸酯合成酶可合成較 原本的異戊烯二磷酸酯合成酶所合成還要長鏈的異戊烯二 磷酸酯。例如，一些法呢基二磷酸酯合成酶可合成具1 5 個碳原子的法呢基二磷酸酯，當改變成另一種突變型酵素 ，其可合成具3 0個碳原子的六異戊烯二磷酸酯。 一個酵素即使當其原始的胺基酸序列經由增加，刪除 ，與/或一個或一些胺基酸的取代而被改變，其仍可能保 留其原始的酵素活性是被熟知的。因此，本發明除了具有 位於SEQ ID No:1前方胺基酸序列之胜肽外， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (讀先閱讀背面之注意事項再填寫‘頁) -13 - 480284 A7 __；_____B1__ 五、發明説明（n) 更企圖包含那些含有經由一個或多個如髙達5或1 〇個胺 基酸之取代，刪除，與/或加入而改變胺基酸序列，並能 執行其原始功能的酵素· 本發明亦提供含有上述不同突變型酵素之密碼的基因 ’包含這些基因的載體，特殊的表現載體，以及轉殖該載 體的宿主。本發明的基因（DNA)能夠輕易地獲得，例 如，利用特異位置的遺傳突變法或其它傳統的方法，例如 P C R等方法，藉此將突變導入於如前文所述 SEQ ID No :1之含原本胺基酸序列密碼的 D N A中❶ 此外，一旦適合之酵素的胺基酸序列已被確定，其核 苷酸序列亦可被確定，DNA亦可以依照傳統之DNA合 成方法來進行化學合成。 本發明進一步提供一個含有如上述之D N A的表現載 體，轉殖該表現載體的宿主，以及本發明中利用這些宿主 來製造該酵素或胜肽的方法。 經浐部中央*?.率而於工消費合作4i印繁 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表現載體包含一個複製起點*表現調節序列等•但其 可能與宿主細胞相異。至於宿主，提供原核細胞例如細菌 如大腸桿菌，Bac i 1 1 u s屬如Bacillus subtilis ,以及真 核細胞例如徽菌如酵母菌，例如SaccharomvcesS如 Saccharomvces cerev i ceae，P i ch i a _屬如 P i c h i a pas tor i s ,絲狀徽菌例如 Asper g i 1 1 us 屬如 Asper g i LI us orvzae _與Aspergillus n i ger，動物細胞例如S的培養細 胞，高等動物如CHO細胞及其類似的培養細胞。此.外’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) " -14 - 480284 Λ7 _ B7 五、發明説明（12 ) 植物可能被用來做爲宿主。 如實施例中所顯示，依據本發明培養經由本發明之 D NA轉殖之宿主的過程中，長鏈的異戊烯二磷酸酯如 GGPP，GFPP，HexPP及其類似物可累積於培 養基中，其可被回收以產生其各別的二磷酸酯。再者，根 據本發明，長鏈的異戊烯二磷酸酯亦可藉由本發明所產生 之突變型異戊烯二磷酸酯合成酶，與如法呢基二磷酸酯之 異戊烯二磷酸酯基質及丙烯基基質接觸來產生· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫‘頁) 當以大腸桿菌做爲宿主時，其被熟知該宿主在自 DNA轉錄成mRNA以及自mRNA轉譯成蛋白質時期 具有基因調節功能。那些被熟知做爲調節mRNA合成之 起動子序列，除了自然存在的序列（例如1 ac，t rp ，bla ，lpp，PL，PR，ter ，T3，T7，等 等）之外，它們的突變型（例如1 a cUV5)中自然存 在之起動子的序列被人工融合，其並可利用於本發明中· 咸知核糖體結合位的序列（GAGG及其類似序列） 與起始密碼ATG之間的距離對於調節自mRNA合成蛋 白質之能力的序列而言是重要的•其亦被熟知一個終結子 (例如購自Pharmacia含rrnPTl T2商業上可利用 之載體）引導轉錄於3 > —端終結的完成，其可藉一個重 組體來影響蛋白質合成的效益。 至於可用於本發明中製備重組載體的載體，可提供多 種載體，並依據所欲使用的目的而衍生得來•例如那兒可 能敘述得自pMB 1具有一個複製子之pBR3 2 2.， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " -15 - 480284 A7 B? ________ 五、發明説明（13 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) PBR327，pKK223 - 3，pKK233- 3 , pT r c 9 9及其類似物；被改變以提昇複製體數目之 pUC18，pUC19，pUC118，pUC119 ，pTV118N，pTV119N， pBluescript ，pHSG298， pHSG 3 9 6及其類似物；或得P 1 5A具有一個複製 子之PACYC177，PACYC184及其類似物； 以及另外衍自pSClOl、ColEl，R1，F因子 及其類似物之質體。此外*也可利用較易於純化之融合蛋 白質表現載體例如PGEX — 2Τ，pGEX — 3Χ， pMa 1 — c 2。本發明中用來做爲起始物之基因的一個 範例被陳述於日本專利申請案No·6—315572· 另外 > 除了質體之外*病毒載體如λ —噬菌體或 Μ 1 3噬菌體、或轉因子可用於將基因引入。關於基因引 入大腸桿菌以外的微生物中，藉由PHY300PLK ( Takara Shuzo)將基因引入於Bac i 11 us屬之生物中是被熟 知的。這些載體被陳述於分子選殖學（J. Sambrook, E.F .Fritsch, and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press)與選殖載體（Ρ·Η· Pouwels, Β·Ε· Enger, Valk, and W.J· Brammar, Elsevier)，以及許 多製造廠商的目錄中。 P T r c 9 9除了一個可選擇性的抗安比西林基因標 記之外，由於其具有一個啓動子，調節基因如P t r c與 iacQ ，AGGA序列做爲核糖體結合位， · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16 - 480284 A7 ______B7 __ 五、發明説明（14) r r nP TiTz做爲終結子，以及F P P合成酶之基因表 現的調節功能，其尤其是令人滿意的· 含有異戊烯二磷酸酯合成酶密碼之D N A片段的結合 ，以及需要將具有該酵素基因之表現調節功能的DNA片 段結合於這些載體中，可藉由利用一個適當的限制酵素與 連結酶的熟知的方法來實行•如此構築之特殊質體範例包 括如PTV118N—Bst FPS❶ 當微生物藉由如此重組載體用來進行基因的融合，大 腸桿菌及Bacillus屬的微生物可被使用。這種轉殖亦可利 用敘述於分子選殖（J. Sambrook, E.F. Fritsch, and Τ· Man i at i s, Cold Spring Harbor Laboratry Press) 以及D N A選殖第一至三冊（D.M. Clover ed., IRL PRESS)中之氯化鈣法及胚細胞法來實行。 經浐部中央榀率Λβ工消費合作社印fi (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了產生本發明中之突變型酵素，如上述轉殖之宿主 被培養，之後該培養物依序進行包括鹽析，以一種有機溶 劑來沈澱，凝膠層析法，親和性層析法，拒水性交互作用 層析法，離子交換層析法及其類似的任何方法來回收並純 化該酵素· 本發明亦提供一種利用本發明之酵素用來產生異戊烯 二磷酸酯的方法。依照這種方法*本發明中之酵素被反應 於培養基中，尤其是一種液體培養基，之後如所述該異戊 烯二磷酸酯自反應培養基中被回收。至於該酵素，不僅是 一種純化酵素，且在不同時期之半純化的粗製酵素，或是 微生物之培養生物團的混合物均可被利用。那些可選擇性 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -17 - 480284 好浐部中央榀窣而只π消費合作相印聚 A7 B7 五、發明説明（15) 地利用從該酵素、粗製酵素或含該酵素之產物依傳統方法 製備之固定酵素。 至於基質，可利用異戊烯二磷酸酯以及具有5至2 0 個碳原子，較佳是少於所陳述異戊烯二磷酸酯之碳原子數 之5個碳原子的異戊烯二磷酸酯•至於反應培養基，可使 用水或液體緩衝溶液，例如三羥甲基胺基甲烷緩衝液或磷 酸緩衝液及其類似物。 藉由獲自本發明之異戊烯二磷酸酯合成酶反應產物之 鏈長度調節系統的使用，具較長鏈長之異戊烯二磷酸酯如 今僅可能以異質二聚體型式之酵素來合成，而利用可易於 處理之同質二聚體型式之突變型異戊烯二磷酸酯合成酶， 此長鏈之異戊烯二磷酸酯可被合成。此外，藉由位於含有 利用上述系統之異質二聚體型異戊烯二磷酸酯合成酶之天 門冬胺酸富藏區的相對應次單位之天門冬胺酸富藏區一的 上游五個胺基酸之胺基酸殘基的改變，預期可合成具有更 長長鏈之異戊烯二磷酸酯的突變型酵素的發明。 在本發明之申請專利範圍及詳細說明中，胺基酸殘基 藉由單字母密碼或三字母密碼來表示： A ; A 1 a ;丙胺酸 C ; C y s ;胱胺酸 D;Asp;天門冬胺酸 E ; G 1 y ;麩胺酸 F ; Phe ;苯丙胺酸 G ; G 1 y ;甘胺酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ， 一 18 - (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線表 %〇284

五、發明説明（16) Η » H i s ;組織胺 酸 I 9 I 1 e ;異白胺 酸 Κ > L y s ;離胺酸 L L e u ;白胺酸 Μ » M e t ;甲硫胺 酸 Ν 9 A s n :天門冬醯胺 Ρ 9 P r 1 ;脯胺酸 Q t G 1 n ;麩胺醯 胺 R 9 A r S ;精胺酸 S t S e r ;絲胺酸 T 9 T h r ;蘇胺酸 V t V a 1 ;纈胺酸 w » T r P ;色胺酸 Y 9 T y r ;酪胺酸 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 輕免部中央杜準而只X消費合作私印褽 胺基酸殘基的取代作用以，取代前的胺基酸殘基# ’ "胺基酸殘基的編號#及％取代後的胺基酸殘基#的順序 來表示。例如，在突變發生之8 1位置的酪胺酸殘基被甲 硫胺酸殘基取代》則以Y8 1M來表示。 實施例 本發明現在以明確之實施例作爲參考資料來說明*但 它們必須不可以任何方式來解釋而局限本發明。 實施例1 :含有F Ρ Ρ合成酯基因之質體的構築 得自 Bacillus stearothermophi lus 之 F Ρ Ρ 合成酶 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21 ΟΧ297公釐） -19 - 480284 A7 B7 五、發明説明（17) (誚先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (以下以B s t FP S表示）的基因在Takara Shuzo公司 生產之商業上可利用的質體載體p TV 1 1 8 N的 Nc ο I — H i ndm切位下進行無性繁殖繼代·該質體 DNA被命名爲pTVl 18N — Bs tFPS ·此得自 大腸桿菌JM109之Bs tFPS基因是可獲得，其於 1 9 9 1年9月2 6日由日本Ibalaki之工業科學與技術 學機構，國家生物科學與人類技術學學會完成國際寄存， 寄存編號爲FERM BP — 3581 ·而Bs tFPS 基因之完整的核苷酸序列也已公開於日本專利申請案 3(1991)-253788, T. Koyama et al., (1993) J. Biochem. 113:355-36 3或於遺傳訊息資料庫例如基因庫登 記目錄編號D1 329 3之下。由於Bacillus stearothermophi lus亦可由不同的微生物寄存機構例如 ATCC等獲得，B s t FPS區的基因DNA可藉由傳 統基因選殖的方法來獲得。 實施例2 :用以引入突變之寡核替酸的合成 爲了導入F P P合成酶基因之突變，如下之寡核苷酸 被命名並合成：

引子D N A ( Y 8 1 X ) • 5 "G A T C C A T A C G N N N T c T T T G A T T C A T G A T G A T T T G 3 〆 (s E Q ID No 2 ) 引子D N A ( Y 8 1 N ) 5 "G A T C C A T A C G A A c T c T T T G A T T C A 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） -20 - 480284 A7 B7 妗浐部中央ir率而只工消赍合作拉印繁 五、 發明説明（ 18 ) 1 | T G A τ G A T T T G 3 〆 ( S E Q ID N o · 1 I 3 ) 1 1 1 引子D N A ( Y 8 1 I ) ： 5 〆 G A T C C A /—V 1 I 讀 1 I T A C G A T T T c T T T G A T T C A 先 閱 1 1 讀 1 T G A Τ G A T T T G 3 ( S E Q ID N o · 背 δ 1 I 之 1 4 ) 注 意 1 | 事 1 引子D N A ( Y 8 1 M ) : 5 G A T C C A 項 1 填 T A C G A T G T c T T T G A T T C A % 本 頁 -· T G A Τ G A T T T G 3 〆 ( S E Q ID N 0 · >—^ 1 5 ) 1 1 引子D N A ( Y 8 1 F ) ·· 5 〆 G A T C C A 1 | T A C G T T C T c T T T G A T T C A 訂 I T G A Τ G A T T T G 3 ( S E Q ID N 0 ： 1 1 I 6 ) 1 1 I 引子D N A ( Y 8 1 P ) 5 〆 G A T C C A 1 1 T A C G C C G T c T T T G A T T C A I T G A Τ G A T 丁 T G 3 〆 ( S E Q I D 1 N 0 : 1 | 7 ) 1 I 引子D N A ( Y 8 1 V ) ： 5 〆 G A T C c A Γ I T A C G G T G T c T T T G A T T c A 1 1 T G A Τ G A T T T G 3 〆 ( S E Q I D N 0 ·· 1 1 8 ) 1 1 它們被設計嶄新地引入限制酵素B s P HI ( 1 1 5 〆 T C A T G A 3 〆 ) 的裂解位置 9 並於編碼 - 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -21 - 480284 A7 B7 五、發明説明（19) B s t FPS 8 1位置之胺基酵殘基之密碼的上導入突 變。而由於密碼的簡併性，B s pH I裂解位置的引入並 不會改變編碼於B s t F P S基因的胺基酸序列。由於突 變的引入取代B s t F P S基因8 1位置的胺基酸殘基同 時地產生一個新的B s ρ Η I裂解位置，習慣藉由 B s ρ Η I消化後以瓊脂凝膠電泳來偵測突變取代的質體 〇 這些引子DNA於如下顯示的反應培養基中在3 7 °C 進行3 0分鐘之磷酸化作用，接著於7 0°C進行1 0分鐘 的變性作用： 1 0 pmol/，l引子DNA 2 β 1 0倍活化作用緩衝液 1 β 1 0 m Μ 腺嘌呤核苷三磷酸 1 β 水 5 β T 4聚核苷酸激酶 1 β 經浐部中央榀卑而只工消費合作社印^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其中1 0倍活化作用緩衝液是1 〇 〇 〇mM之氯化三 羥甲基胺基甲烷（PH8.0) ，l〇〇mM氯化鎂，及 70mM之二硫蘇糖醇。 實施例3 :對應於B s t FPS某丙ft 1位置之胺基 酸殘基密碼導入取代式突戀 利用構築於實施例2中之每一個引子DNA，依照 Kunkel方法可將取代突變引入於製備於實施例1中之質體 。Takara Shuzo出產之商業上可利用之Mutan-K套組慣用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 22 - 480284 經浐部中央梂卒而只工消於合作妇印^ A7 B7 五、發明説明（20) 於實行Kunkel方法•該實驗流程描述於該套組使用說明。 該質體的取代突變並不需要進行丨11111^1法。例如’相同的

結 果 可 藉 由 聚合酶鏈 鎖反應 ( P C R ) 之 方 法 的使 用來 獲 得 〇 Mu tan- K套組中使用大腸桿菌c J 2 3 6做爲宿主細 胞 f 單 股 D N A可被獲得 9 其 中 於質體 Ρ Τ V 11 8 Ν 一 B S t F Ρ S中之胸腺嘧 啶 鹽 基 被去氧 尿 嘧 啶 鹽基 所取 代 該 因 此 獲得之單 股D N A 於 反應 中 被 用 來 做爲 模版 1 反 應 中 用 以 合成互補 股之 引 子 D N A 於 6 5 °c 中被 如下 之 反 nrte 應 溶 液 處 理1 5分 鐘之 後 t 令 其靜 止 於 3 7 〇C經 15 分 鐘 以 進 行 接 合： 單 股 D N A 0 • 6 P ΙΪ1 0 1 接合 緩 衝溶液 1 β 1 引 子 D N A溶液 (實 施 例 2 ) 1 β 1 加 水 至 最終體積 爲1 0 β 1 其 中 接合緩衝溶液是 2 0 0 m Μ 氯化 三 羥 甲 基 胺基 甲烷 ( P Η 8 • 0 )· 1 0 0 m Μ 氯 化 鎂， 5 0 0 m Μ氯 化鈉 及 1 0 m Μ 二 硫蘇糖醇 〇 此 外 1 2 5 β H 的延 伸 緩衝溶液 » 6 0 單 位的 大腸 桿 菌 D N A 連 結酶，與 1單 位 的 Τ 4 D Ν A 聚 合酶 被加 入 t 於 2 5 °C 進行2小 時以 合成 互 補股 0 該 延伸緩衝溶液 是 5 0 m Μ 氯 化三羥甲 基胺 基 甲 焼 (P Η 8 • 0 )， 6 0 mM醋酸氨，5mM氯化鎂，5mM二硫蘇糖醇，lmM (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 480284 A7 ____.____B7___ 五、發明説明（21 ) 菸鹸醯胺腺嘌呤雙核苷酸，〇 · 5mM四種去氧核苷三磷 酸混合物。 在反應結束後，的〇 · 2M乙二胺四乙酸（ ΡΗ8 · 0)被加入其中並於6 5°C處理5分鐘以終結反 應β 實施例4 :具有引入對應於B s t __F_ __P S基因8 1 位置之脓基酸殘基密碼之取代突變的重組體的構築 依據實施例3，該配製之DNA溶液藉由氯化鈣法被 轉殖於大腸桿菌D Η 5 2。另一種選擇方法例如電穿孔可 給予相同的結果· 該藉由氯化鈣法所獲得之轉殖體被塗覆於含有轉殖體 可選擇性標記之安比西林明膠盤上，並隔夜培養於3 7 °C 〇 好浐部中央榀枣而Μ工消资合作妇印家 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ，在如上述所獲得的轉殖體中，那些在B s t F P S編 區有B s pH I裂解位的取代突變之pTVl 1 8N — B s t FPS質體可被選出。相對應於選擇性取„代突變之 pTVl 18N_Bs tFPS 8 1位置之胺基酸殘基 密碼的鄰近核苷酸序列可藉由雙去氧法而被確定。結果， 獲得該含有如下1 9個取代突變之B s t F P S基因的 pTV118N — BstFPS: 本紙張尺度適用中國國家楳準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -24 ~ 480284 A7 B7 五、發明説明（22 ) 対沪部中央*?.卑而只工消费合作ii印繁

突變 Y 8 1 A 密碼 G C T Y 8 1 C T G C Y 8 1 D G A C Y 8 1 E G A A Y 8 1 F T T C Y 8 1 G G G T Y 8 1 Η C A C Y 8 1 I A T T Y 8 1 K A A G Y 8 1 L C T C Y 8 1 Μ A T G Y 8 1 Ν A A C Y 8 1 Ρ C C G Y 8 1 Q C A A Y 8 1 R A G G Y 8 1 S T C G Y 8 1 Τ A C A Y 8 1 V G T G Y 8 1 W T G G Y 8 1 Υ (野生型） T A C 實施例5 ：奕戀型B s t FPS之活伸的検測 從包含1 9個獲自實施例4之突變型B s t FPS基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） J---5--------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 480284 A7 B7 五、發明説明（23) 因與1個野生型B s t F P S基因之2 0個轉殖體製備之 粗製酵素溶液如下。 隔夜培養於2倍L B培養基中之轉殖體被離心以採集 細胞，之後該細胞被懸浮於使細胞均質化之緩衝液中（ 50mM氯化三羥甲基胺基甲烷（pH8·0) ，1〇 mM貝他一巯基乙醇，ImM乙二胺四乙酸）·藉由超音 波進行均質化之後*於4 °C每分鐘10 〇 〇 〇轉之轉速下 離心1 0分鐘。該懸浮物在5 5 °C下處理3 0分鐘，以將 得自大腸桿菌之異戊烯二磷酸酯合成酶的活性去活化。在 相同的條件下進行進一步的離心，所獲得的懸浮物被使用 做爲粗製酵素萃取液，於如下反應溶液中進行5 5 °C， 1 5分鐘的反應： 〔1 一 “(：〕-ΙΡΡ(1 Ci/mol) 2 5 nmol - 丙烯基基質（DMAPP或GPP或FPP) 2 5 nmol 氯化三羥甲基胺基甲烷（pH8 · 5) 5 .0 m Μ 好浐部中央榀卑而只工消費合作妇卬^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 氯化鎂 5 m Μ 氯化銨 5 0 m Μ

貝他一疏基乙醇 50mM 酵素溶液 5 0 μ g 加水達到1 m $ 在反應結束之後，加入3mi的丁醇以萃取進入丁醇 層的反應產物。lmj^之所獲得的丁醇層被加於3111艾之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 480284 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（24 ) 液體閃爍液藉由閃爍計數器來測量其放射性β該結果顯示 於第1圖中，Y8 1 P突變型B s t FP S表現出極低的 酵素活性，其可推論是由於此唯一的脯胺酸胺基殘基是得 自亞胺基酸，並因此其無法形成阿爾法螺旋或貝他摺板結 構型式，因此明顯的改變該酵素本身基本的髙度結構· 藉由加熱並同時灌入氮氣*將該溶劑自丁醇層之殘餘 物中蒸發，該層得以濃縮至0 · 5mJ。該濃縮物被加入 2mj?的乙醇與1111$的馬鈴薯酸磷酸酶溶液（2mg/ m文馬鈴薯酸磷酸酶，〇 · 5M醋酸鈉（pH4 · 7)以 在3 7°C下進行去磷酸化反應。接著去磷酸化反應產物以 3 m艾之正戊烷進行萃取•此藉由灌入氮氣而蒸發該溶劑 來進行濃縮，之後並藉由TLC(逆相TLC板： L K C 1 8 ( Whatman )，展開溶劑：丙酮/水=9 / 1 )來進行分析。該展開之去磷酸反應產物藉由Bio Image Analyzer BAS2000 ( Fuji Photo Film)來分析以確定放 射性的位置與相關性•當所有反應產物之總量比例是相同 的，該放射性比例變爲FPP:GGPP:GFPP: HexPP = 2 : 3 : 4 : 5❶當DMAPP被用來做爲 丙烯基基質時，該結果顯示於第2圖，而當GP P被用來 做爲丙烯基基質時，顯示於第3圖，以及當F P P被用來 做爲丙烯基基質時則*顯示於第4圖· 實施例6 ：取代突變之胺基酸殘基與反應牵物銶县麽 之關係 -I--- I--- 丨---I.--，丁 _ _____mi (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ；297公釐） 480284 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 - B?五、發明説明（25 ) 第1圖與第4圖顯示當反應以F P P做爲丙烯基基質 來進行反應時，大部分的突變型B s t FPS s將I PP 轉化成具有較G G P P還長之鏈長的異戊烯二磷酸酯。同 時，該取代突變體其胺基酸側鏈是如甘胺酸、丙胺酸及絲 胺酸的小分子*則具有髙度的活性*然而取代突變體中， 胺基酸側鏈爲大的野生型分子如酪胺酸與色胺酸時，則顯 示較低的活性•因此*該酵素活性對關於8 1位置胺基酸 殘基側鏈的分子量作圖（第5圖，第6圖及第7圖）。然 而，該失去酵素功能之Y 8 1 P取代突變酵素被排除。 結果，明白的顯示當側鏈分子量小時則活性趨向增加 (第7圓）。這種趨勢即使當變數與側鏈分子量不同時亦 可被觀察到，這表示胺基酸殘基的尺寸可被利用，例如可 接近之表面區*亦即胺基酸殘基及其類似物之曝露表面區 的變數〔C· Chothia ( 1 976 ) J· Mol. Biol· 195: 1-14, B. Lee and F.M. Richads (1971) J. Mol. Biol. 55： 379-400, S. Miller et al. (1987) J. Mol. Biol. 196： 641) 至今已有極少數的報告指出，在研究F P P合成酶催 化作用之機制中，藉由導入特異位置突變，但不篩選例如 隨機突變率，可改變反應產物的鏈長度。藉由本發明中單 一特定位置突變的引入使得如此反應產物鏈長度的動力學 得以控制，這完全是令人意想不到的· 從第5圖及第6圖中可見當D MAP P與G P P被用 來做爲丙烯基基質時，在取代突變胺基酸殘基的分子量與 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -28 - 480284 Λ7 B? 五、發明説明（26 ) 酵素活性之間沒有任何明顯的相關性。咸信此係因爲當 F P P被用來做爲丙烯基基質時*該野生型酵素之反應特 異性直接反應出該酵素活性。野生型酵素天生擁有利用 DMAP P與GP P做爲丙烯基基質之特異性，因此單獨 藉由酵素活性之變數的趨勢分析是困難重重的· 因此，該反應產物之鏈長度的期望值，亦即平均鏈長 度藉由如下的公式來獲得： (反應產物之鏈長度的期望值）= (FPP的比例）X 1 5 + (GGPP 的比例）X20 + (GFPP 的比例） X25 + (HexPP 的比例）X30 反應產物鏈長度之所獲得的期望值而對81位置胺基 酸側鏈的分子量作圖。然而*該失去酵素功能之Y 8 1 P 取代突變酵素被除外·從這些圖中發現即使當丙烯基基質 爲DMA P P或GP P時，當8 1位置胺基酸殘基側鏈分 子量變得較小時，反應產物鏈長度的期望值則變得較髙。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 當利用在8 1位置胺基酸的其他特性* 一個類似圖形 分析也可完成，例如以Hopp & Woods Scale做爲厭水性的 變數〔J · E · C ο 1 i g a n e t a 1 · ( 1 9 9 5 ) C u r r e n t P r 〇 t 〇 c ο 1 s in Protein Science, Johen Wiley & Sons, Inc·〕當 F P P被用來做爲丙烯基基質時》沒有任何規律的趨向性 可觀察到關於反應產物鏈長度之期望值以及酵素活性·再 者，即使當輕易採用如阿爾法螺旋結構〔J.E. Col igan et a 1 . ( 1 995 ) Current Protocols in Protein Science ,Johen Wiley & Sons, Inc·〕或貝他摺板結構〔J.E· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210^< 297公釐)~ ' 一 480284 Λ 7 • Β， 五、發明説明（27 )

Coligan et a 1 . ( 1 9 9 5 ) Current Protocols in Protein

Science, Johen Wiley & Sons, Inc·〕變數，當 F P P 被用來做爲丙烯基基質時，並未發現關於反應產物鏈長度 之期望值或酵素活性之明顯相關性。藉由本發明首度瞭解 *決定反應產物鏈長度之可信賴的因子是位於天門冬胺酸 富藏區一（DDXX (XX) D)上游5個胺基酸殘基之 胺基酸殘基側鏈的尺寸大小。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 480284 Λ7 B1 -· _ - -- —— —--- — —— - - ---------------------------- 五、發明説明（28 ) 序列表 S E Q ID Ν Ο ·· 1 序列長度：8 9 4 序列型式：核苷酸 股鏈：雙股 局部解剖學：線性 分子型式··染色體DNA 來源 生物·· Bacillus stearothermophilus 序列： GTG GCG CAG CTT TCA GTT GAA CAG TTT CTC AAC GAG CAA AAA CAG GCG A8

Met Ala Gin Leu Ser Val Glu Gin Phe Leu Asn Glu Gin Lys Gin Ala 5 10 15 GTG GAA ACA GCG CTC TCC CGT TAT ATA GAG CGC TTA GAA GGG CCG GCG 96 ·· · _ i *

Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr lie Glu Arg Leu Glu Gly Pro Ala · 20 25 30 AAG CTG AAA AAG GCG ATG GCG TAC TCA TTG GAG GCC GGC GGC .AAA CGA 1“

Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Led Glu Ala Gly Gly Lys Arg 35 40 A5 ATC CGT CCG TTG CTG CTT CTG TCC ACC GTT CGG GCG CTC GGC AAA GAC 192 lie Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala Leu Gly Lys Asp 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 50 55 60 CCG GCG GTC GGA TTG CCC GTC GCC TGC GCG ATT GAA ATG ATC CAT ACG 240

Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala lie Glu Met lie His Thr 65 70 75 80 TAC TCT TTG ATC CAT GAT GAT TTG CCG AGC ATG GAC AAC GAT GAT TTG 288

Tyr Ser Leu lie His Asp Asp Leu Pro Ser Met Asp Asn Asp Asp *Leu 85 90 95 CGG CGC GGC AAG CCG ACG AAC CAT AAA GTG TTC GGC GAG GCG ATG GCC 336

Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Phe Gly Glu Ala Met Ala 100 105 110 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） Λ7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 . B7 五、發明説明（29 ) ATC TTG GCG GGG GAC GGG TTG TTG ACG TAC GCG TTT CAA TTG ATC ACC 38A lie Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu Thr Tyr Ala Phe Gin Leu lie Thr 115 120 125 GAA ATC GAC GAT GAG CGC ATC CCT CCT. TCC GTC CGG CTT CGG CTC ATC 432 Glu lie Asp Asp Glu Arg lie Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu lie 130 135 140 GAA CGG CTG GCG AAA GCG GCC GGT CCG GAA GGG ATG GTC GCC GGT CAG 480 Glu Arg Leu Ala Lys Ala Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gin 145 150 155 160 GCA GCC GAT ATG GAA GGA GAG GGG AAA ACG CTG ACG CTT TCG GAG CTC 528 Ala Ala Asp Met Glu Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu 165 170 175 GAA TAC ATT CAT CGG CAT AAA ACC GGG AAA ATG CTG CAA TAC AGC GTG 576 Glu Tyr lie His Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gin Tyr Ser Val 180 185 190 CAC GCC GGC GCC TTG ATC GGC GGC GCT GAT GCC CGG CAA ACG CGG GAG 624 His Ala Gly Ala Leu lie Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gin Thr Arg Glu 195 200 205 CTT GAC GAA TTC GCC GCC CAT CTA GGC * CTT GCC TTT CAA ATT CGC GAT 672 Leu Asp Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gin lie Arg Asp 210 215 220 GAT ATT CTC GAT ATT GAA GGG GCA GAA GAA AAA ATC GGC AAG CCG GTC 720 Asp lie Leu Asp lie Glu Gly Ala Glu Glu Lys lie Gly Lys Pro Val 225 230 235 2A0 GGC AGC GAC CAA AGC AAC AAC AAA GCG ACG TAT CCA GCG TTG CTG TCG 768 Gly Ser Asp Gin Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Ser 245 250 255 CTT GCC GGC GCG AAG GAA AAG TTG GCG TTC CAT ATC GAG GCG GCG CAG 816 Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His He Glu Ala Ala Gin 260 265 270 CGC CAT TTA CGG AAC GCC GAC GTT GAC GGC GCC GCG CTC GCC TAT% ATT 86A Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu Ala Tyr lie 275 280 285 TGC GAA CTG GTC GCC GCC CGC GAC CAT TAA 89A Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His **★ 290 295 (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

• fIT 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )A4規格（210X297公釐） 480284 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 Λ7 • B? 五、發明説明（30 ) S E Q ID Ν Ο ： 2 序列長度：3 4 序列型式：核苷酸 股鏈：單股 局部解剖學：線性 分子型式：合成D N A 序列 GATCCATACG NNNTCTTTGA TTCATGATGA TTTG 34 S E Q ID N 0 ·· 3 序列長度：3 4 序列型式：核苷酸 股鏈：單股 局部解剖學：線性 分子型式：合成DNA 序列 GATCCATACG AACTCTTTGA TTCATGATGA TTTG 34 S E Q ID N 0 ： 4 序列長度：3 4 序列型式：核苷酸 股鏈：單股 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） * '~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

480284 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 __-__Β7 五、發明説明（31 ) 局部解剖學：線性 分子型式：合成DNA 序列 GATCCATACG ATTTCTTTGA TTCATGATGA TTTG 34S E Q ID N 0 ： 5 序列長度：3 4 序列型式：核苷酸 股鏈：單股 局部解剖學：線性 分子型式：合成DNA 序列 .GATCCATACG ATGTCTTTGA TTCATGATGA TTTG 34S E Q ID N 0 ： 6 序列長度：3 4 序列型式：核苷酸 股鏈：單股 局部解剖學：線性 分子型式：合成DNA 序列 GATCCATACG TTCTCTTTGA TTCATGATGA TTTG 34 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） 480284 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 Λ7 - B? 五、發明説明（32 ) S E Q ID Ν Ο ： 7 序列長度：3 4 序列型式1核苷酸 股鏈：單股 局部解剖學：線性 分子型式：合成DNA 序列 GATCCATACG CCGTCTTTGA TTCATGATGA TTTG 34 S E Q ID N 0 ： 8 序列長度：3 4 序列型‘式：核苷酸 -股鏈：單股 局部解剖學：線性 分子型式：合成DNA — 序列 GATCCATACG GTGTCTTTGA TTCATGATGA TTTG 34 1«-----I I I---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 一 35 -

Claims (1)

1. 480284 A8 B8 C8 D8 公告不 六、申請專利範圍 附件1 — 1 :第86109466號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 ^ ： -‘一- ' I年月3修正I 民國90年5月修正 丨9(1 ^ 1(:丨禎充ΐ 、一•一丨…—:— ^ j 1 · 一種突變型異戊烯二磷酸酯合成酶’其中位在原 始酶，異戊烯二磷酸酯合成酶，保存區中第二區之天門冬 胺酸富藏區DDXX (XX) D (括弧中兩個Χ可能不表 現）Ν —端且由Ν —端方向，自D算起第五位置的胺基酸殘 基被其他胺基酸取代，該其他胺基酸係選自丙胺酸、胱胺 酸、天門冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組織胺酸 、異白胺酸、離胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、天門冬醯胺、 脯胺酸、麩胺醯胺、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、 及色胺酸，其中該原始酶（異戊烯二磷酸酯合成酶）具有 SEQ ID No :1所示之胺基酸序列： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·裝 冉填寫女 '—訂----- % 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 480284 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 S E Q ID Ν ο : 1 GTG GCG CAG CTT TCA GTT GAA CAG TTT CTC AAC GAG CM AAA CAG GCC A8 Met Ala Gin Leu .Ser Val Glu Gin Phe Leu Asn Glu Gin Lys Gin Ala 5 10 . 15 GTG GAA ACA GCG CTC TCC CGT TAT ATA GAG CGC ΤΤΛ GAA GGG CCG GCG 96 Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr He Glu Arg Leu Glu Gly Pro Ala . • 20 25 30 MG CTG AAA AAG GCG ATG GCG TAC TCA TTG GAG GCC GGC GGC AAA CGA 1AA Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Gly Lys Arg 35 AO A5 ATC CGT CCG TTG CTG CTT CTG.TCC ACC GTT CGG GCG CTC GGC AAA GAC 192 lie Arg Fro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala Leu Gly Lys Asp 50 55 60 CCG GCG GTC GGA TTG CCC GTC GCC TGC GCG ATT GAA ATG ATC CAT ACG 2A0 Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala lie Glu Met lie His Thr 65 70 -75 80 TAC TCT TTG ATC CAT GAT GAT TTG CCG AGC ATG GAC AAC GAT GAT TTG 288 9C Ser Leu lie His Asp Asp Leu Pro Ser Met Asp Asn Asp Asp Leu 85 90 95 ' CGG CCC GGC AAG CCG ACG AAC CAT AAA GTG TTC GGC GAG GCG ATG. GCC 336^ Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Phe Gly Glu Ala Met. Ala ' 100 105 110 ATC TTG GCG GGG GAC GGG TTG TTG ACG TAC GCG TTT CAA TTG ATC ACC 38A lie Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu The Tyr Ala Phe Gin Leu lie Thr 115 120 125 (請先閱讀背面之注意事項 裝--- 寫本頁) 訂， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 2 480284 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 GAA ATC GAC GAT GAG CGC ATC CCT CCT. TCC GTC CGG CTT CGG CTC ATC A32 Glu lie Asp Asp Glu Arg lie Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Lea lie 130 135 1^*0 GAA CGG CTG GCG ΑΛΛ GCG GCC GGT CCG GAA GGG ATG GTC GCC GGT CAG A80 Glu Arg Leu Ala Lys Ala Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gla 1^5 150 155 , 160 GCA GCC GAT ATG GAA GGA GAG GGG AAA ACG CTG ACG CTT TCG GAG CTC 528 Ala Ala Asp.Met Glu Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu ! 165 170 175 GAA TAC ATT CAT CGG CAT AAA ACC GGG AAA ATG CTG CAA TAC ACC GTG 576 Glu Tyr lie His Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gin Tyr Ser Val 180 · 185 190 CAC GCC GGC GCC .TTG ATC GGC GGC GCT GAT GCC CGG CAA ACG CGG GAG 62A His Ala Gly Ala Leu lie Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gin Thr Arg Glu 195 200 205 _ ·« / ·· * CTT GAC GAA TTC GCC GCC·CAT CTA GGC*CTT GCC TTT CAA ATT CGC GAT 672 Leu Asp Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gin lie Arg Asp 210 215 220 GAT ATT CTC GAT ATT GAA GGG GCA GAA GAA AAA ATC GGC AAG CCG GTC 7 20 Asp lie Leu Asp lie Glu Gly Ala Glu Glu Lys lie Gly Lys Pro Val 225 230 . 235 2^0 GGC AGC GAC CAA AGC AAC AAC AAA GCG ACG TAT CCA GCG TTG CTG TCG 768 | * Gly Ser Asp Gin Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Ser 245 250 255 CTT GCC GGC GCG AAG GAA AAG TTG GCG TTC CAT ATC GAG GCG GCG CAG 816 Lea Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His lie Glu Ala Ala Gin 260 265 270 GGC CAT TTA CGG AAC GCC GAC GTT GAC GGC GCC GCG CTC GCC TAT ATT 86A Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu Ala Tyr lie 275 280 285 TGC GAA CTG GTC GCC GCC CGC GAC CAT TAA 894 ! Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His ★★★ 290 295 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） _____________---- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) il: 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3 480284 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 2 .如申請專利範圍第1項之酶，其中該異戊烯二磷 酸酯合成酶是法呢基二磷酸酯合成酶、_牛兒樾牛兒基二 磷酸酯合成酶、六異戊烯二磷酸酯合成酶、七異戊烯二隣 酸酯合成酶、八異戊烯二磷酸酯合成酶、九異戊烯二磷酸 酯合成酶、或十一異戊烯二磷酸酯合成酶。 3 .如申請專利範圍第1或第2項之酶，其中該異戊 烯二磷酸酯合成酶是一種熱穩定酶。 4 .如申請專利範圍第1項之酶，其中該異戊烯二磷 酸酯合成酶是法呢基二磷酸合成酸，且在具有 SEQ ID No : 1胺基酸序列之法呢基二磷酸酯合 成酶8 1位置的酪胺酸被該其他胺基酸取代。 5 · —種DNA，其編碼如申請專利範圍第1至4項 中任一項之酶，其中該原始酶具有 S E Q ID N 〇 : 1列示之胺基酸序列。 6 · —種RNA，其係由如申請專利範圍第5項之 D N A轉錄。 7 . —種生產具2 0至3 0個碳原子之異戊烯二磷酸 酯的方法’其特徵爲，令申請專利範圍第1至4項中任一 項之酶與受質接觸反應，該受質係選自異戊烯二磷酸酯、 二甲丙烯基二磷酸酯、法呢基二磷酸酯與_牛兒樾牛兒基 二磷酸酯。/ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ί· ^ -----*丨丨.訂·--— — — — — — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -4 -