JP2022073146A - 変異プロテアーゼ及びその利用 - Google Patents
変異プロテアーゼ及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022073146A JP2022073146A JP2020182945A JP2020182945A JP2022073146A JP 2022073146 A JP2022073146 A JP 2022073146A JP 2020182945 A JP2020182945 A JP 2020182945A JP 2020182945 A JP2020182945 A JP 2020182945A JP 2022073146 A JP2022073146 A JP 2022073146A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- equivalent
- acid sequence
- seq
- acid residue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title description 14
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title description 12
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 title description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 159
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 143
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 138
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 138
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 59
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 42
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 37
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 36
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 107
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 86
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 54
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 54
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 54
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N ctk5a5089 Chemical compound NCC(O)=O.NCC(O)=O GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 22
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 136
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 53
- 239000002773 nucleotide Chemical group 0.000 description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 34
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 9
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 9
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 5
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241000579835 Merops Species 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- -1 daily necessities Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 3
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 2
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 150000002309 glutamines Chemical group 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001917 2,4-dinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(=C1*)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 241000590035 Achromobacter lyticus Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 description 1
- 101100449690 Bacillus licheniformis (strain ATCC 14580 / DSM 13 / JCM 2505 / CCUG 7422 / NBRC 12200 / NCIMB 9375 / NCTC 10341 / NRRL NRS-1264 / Gibson 46) blaSE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 101100043755 Bacillus subtilis (strain 168) epr gene Proteins 0.000 description 1
- 101100238373 Bacillus subtilis (strain 168) mpr gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460774 Bacillus subtilis (strain 168) nprB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100049732 Bacillus subtilis (strain 168) wprA gene Proteins 0.000 description 1
- 101710205059 Beta-lytic metalloendopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 208000001860 Eye Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 241000863031 Lysobacter Species 0.000 description 1
- 241000053197 Lysobacter gummosus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710149136 Protein Vpr Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 241001312524 Streptococcus viridans Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 108700026828 bacteria AprX Proteins 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 208000011323 eye infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 1
- 229940040145 liniment Drugs 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SCVOEYLBXCPATR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 229940051866 mouthwash Drugs 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150112117 nprE gene Proteins 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N pentaglycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 229940034610 toothpaste Drugs 0.000 description 1
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006097 ultraviolet radiation absorber Substances 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24032—Beta-lytic metalloendopeptidase (3.4.24.32)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/025—Achromobacter
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
【課題】グリシン-グリシン結合分解活性を有し、殺菌活性が向上したポリペプチド及びその利用法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列、又は、これと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、特定のアミノ酸残基の改変を含み、かつ、グリシン-グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチド。【選択図】なし
Description
本発明は、変異プロテアーゼ及びその利用に関する。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)は、ヒト及び動物の病原菌の中でも最も重要なものの1つであり、皮膚・眼の感染症、食中毒、肺炎、髄膜炎、心内膜炎、骨髄炎といった広範な疾患の原因となる。また、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)をはじめとする薬剤耐性菌の出現やその院内感染が深刻な課題となっている。そのため、黄色ブドウ球菌を溶菌により殺菌できる酵素は、臨床的、獣医学的、食品工学的な応用が期待されている(非特許文献1)。
最も広く産業利用されている溶菌酵素はリゾチームである。しかしながら、リゾチームは比較的広範な細菌の細胞壁分解活性を有するものの、黄色ブドウ球菌はその細胞壁構造に起因してリゾチームに耐性であることが知られている(非特許文献2)。
一方、プロテアーゼのM23ファミリーは、MEROPSデータベースにおいて、ペプチド配列中のグリシン-グリシン結合を分解できるプロテアーゼとして定義されるプロテアーゼファミリーであり、エラスチンやバクテリア細胞壁のプロテオグリカンの分解活性を有し、溶菌酵素としても知られている。中でも、M23Aサブファミリーに属するβ-リティックメタロプロテアーゼ(beta-lytic metallopeptidase;BLP)は、黄色ブドウ球菌や枯草菌等のグラム陽性細菌に対して強い溶菌活性を有していることが報告されている(非特許文献3及び4)。
M23Aサブファミリープロテアーゼに関しては、プロタンパク質から成熟型タンパク質へのプロセシングが障壁となり、異種発現が困難であったが、最近、M23Aファミリープロテアーゼ遺伝子をバチルス属菌宿主に導入し、培養することで、成熟型タンパク質を培養物中から効率よく生産可能であることが見出された(特許文献1)。しかしながら、M23Aサブファミリープロテアーゼへの変異導入による機能改良はこれまでに報告されていない。
Szweda, Piotr et al. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(5): 1157-1174
Bera, Agnieszka et al. Journal of Bacteriology, 2007, 189(1): 280-283
Li, Shaoliang et al, The Journal of Biochemistry, 1998, 124(2): 332-339
Ahmed, Kashfia et al. Journal of Bioscience and Bioengineeing, 2003, 95(1): 27-34
本発明は、グリシン-グリシン結合分解活性を有し、殺菌活性が向上したポリペプチド及びその利用法を提供することに関する。
本発明者らは、M23Aサブファミリープロテアーゼに属し、グリシン-グリシン結合分解活性を有するBLPのアミノ酸配列上の特定のアミノ酸残基を改変することによって該BLPの殺菌活性が向上することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下に係るものである。
1)配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含み、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチド。
2)1)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
3)2)のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
4)3)のベクター又はDNA断片を含有する形質転換体。
5)1)のポリペプチドを有効成分とする抗菌剤。
6)1)のポリペプチドを用いる抗菌方法。
1)配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含み、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチド。
2)1)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
3)2)のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
4)3)のベクター又はDNA断片を含有する形質転換体。
5)1)のポリペプチドを有効成分とする抗菌剤。
6)1)のポリペプチドを用いる抗菌方法。
本発明のグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドは、優れた殺菌活性を有する。斯かるポリペプチドは、抗菌剤の有効成分として使用することができる。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本明細書において、M23Aサブファミリープロテアーゼとは、MEROPSデータベースの分類法(Rawlings, Neil D., et al. "MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors." Nucleic acids research 42.D1 (2013): D503-D509)に従って分類した際に、M23ファミリーに属するメタロプロテアーゼのサブファミリーである、M23Aサブファミリーに分類されるプロテアーゼをいう。
本明細書において、「β-リティックメタロプロテアーゼ(beta-lytic metallopeptidase;BLP)」とは、β-リティックプロテアーゼとも呼ばれる酵素であり、M23Aサブファミリーに属するプロテアーゼの1種をいう。BLPは、ペプチド配列中のグリシン-グリシン結合の分解活性を有する。グリシン-グリシン結合の分解活性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、該活性は、グリシン-グリシン結合を含む適当な基質(例えばオリゴグリシンペプチドや、後記実施例に記載のFRET-GGGGG基質)の酵素的分解による生成物の量を測定することによって決定することができる。
本明細書において、「β-リティックメタロプロテアーゼ(beta-lytic metallopeptidase;BLP)」とは、β-リティックプロテアーゼとも呼ばれる酵素であり、M23Aサブファミリーに属するプロテアーゼの1種をいう。BLPは、ペプチド配列中のグリシン-グリシン結合の分解活性を有する。グリシン-グリシン結合の分解活性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、該活性は、グリシン-グリシン結合を含む適当な基質(例えばオリゴグリシンペプチドや、後記実施例に記載のFRET-GGGGG基質)の酵素的分解による生成物の量を測定することによって決定することができる。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はLipman-Pearson法(Science,1985,227:1435-1441)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(Ver.5.1.1;ソフトウェア開発)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも80%の同一性」とは、80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは92%以上、さらに好ましくは94%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、さらに好ましくは99.5%以上の同一性をいう。
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「1又は数個」とは、1~40個、好ましくは1~30個、より好ましくは1~20個、さらに好ましくは1~10個、さらに好ましくは1~5個、さらに好ましくは1~3個を意味し得る。また本明細書において、別途定義されない限り、ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「1又は数個」とは、1~120個、好ましくは1~90個、より好ましくは1~60個、さらに好ましくは1~30個、さらに好ましくは1~15個、さらに好ましくは1~9個を意味し得る。本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への1又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列(例えば、配列番号2のアミノ酸配列)とを、最大の相同性を与えるように整列(アラインメント)させることにより決定することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Clustal Wマルチプルアラインメントプログラム(Thompson,J.D.et al,1994,Nucleic Acids Res.22:4673-4680)をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Clustal Wの改訂版であるClustal W2やClustal omegaを使用することもできる。Clustal W、Clustal W2及びClustal omegaは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所(European Bioinformatics Institute:EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])や、国立遺伝学研究所が運営する日本DNAデータバンク(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html])のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の同一性又は類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の同一性又は類似性とは、2つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合(%)をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する20種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン;グルタミン酸とアスパラギン酸;セリンとトレオニン;グルタミンとアスパラギン;ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する20種のアミノ酸残基、アラニン(Ala又はA)、アルギニン(Arg又はR)、アスパラギン(Asn又はN)、アスパラギン酸(Asp又はD)、システイン(Cys又はC)、グルタミン(Gln又はQ)、グルタミン酸(Glu又はE)、グリシン(Gly又はG)、ヒスチジン(His又はH)、イソロイシン(Ile又はI)、ロイシン(Leu又はL)、リシン(Lys又はK)、メチオニン(Met又はM)、フェニルアラニン(Phe又はF)、プロリン(Pro又はP)、セリン(Ser又はS)、スレオニン(Thr又はT)、トリプトファン(Trp又はW)、チロシン(Tyr又はY)及びバリン(Val又はV)を意味する。
本明細書において、アミノ酸の位置及び変異体の記載は、公認されているIUPACの1文字のアミノ酸略記により、以下のように表記され得る。
所定位置のアミノ酸は、[アミノ酸、位置]で表記される。例えば位置116のグルタミンは、「Q116」と示される。
アミノ酸の「置換」に関しては、[元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸]で表記される。例えば位置116のグルタミンのヒスチジンへの置換は、「Q116H」と示される。
アミノ酸の「欠失」に関しては、[元のアミノ酸、位置、Δ]で表記される。例えば、位置179でのアスパラギンの欠失は「N179Δ」と示される。
複数の改変を含む変異体は、加算記号(「+」)によって表記される。例えば、「Q116H+N179Δ」は、それぞれ、位置116のグルタミンのヒスチジンへの置換と位置179でのアスパラギンの欠失を表す。
所定位置のアミノ酸は、[アミノ酸、位置]で表記される。例えば位置116のグルタミンは、「Q116」と示される。
アミノ酸の「置換」に関しては、[元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸]で表記される。例えば位置116のグルタミンのヒスチジンへの置換は、「Q116H」と示される。
アミノ酸の「欠失」に関しては、[元のアミノ酸、位置、Δ]で表記される。例えば、位置179でのアスパラギンの欠失は「N179Δ」と示される。
複数の改変を含む変異体は、加算記号(「+」)によって表記される。例えば、「Q116H+N179Δ」は、それぞれ、位置116のグルタミンのヒスチジンへの置換と位置179でのアスパラギンの欠失を表す。
本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、DNAセンス鎖においてプロモーターの3’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、DNAセンス鎖における該遺伝子の5’側の領域を意味する。
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来(すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド)であってもよい。
本明細書において、所与の変異ポリペプチドの「親」ポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該変異ポリペプチドとなるポリペプチドをいう。言い換えると、「親」ポリペプチドとは、変異ポリペプチドに当該変異が加えられる前のポリペプチドである。同様に、変異ポリヌクレオチドの「親」ポリヌクレオチドとは、そのヌクレオチドに所定の変異がなされることにより、当該変異ポリヌクレオチドとなるポリヌクレオチドをいう。言い換えると、「親」ポリヌクレオチドとは、変異ポリヌクレオチドに当該変異が加えられる前のポリヌクレオチドである。
<グリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチド>
本発明のグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチド(「本発明のポリペプチド」と称す)は、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含むポリペプチドである。
斯かるポリペプチドは、基準となる親ポリペプチド、すなわち配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、上記の所定位置のアミノ酸残基が改変され、かつペプチド配列中のグリシン-グリシン結合の分解活性を有する変異ポリペプチドである。斯かる所定位置のアミノ酸残基の改変は、殺菌活性を向上するための改変であり、したがって、当該ポリペプチドは、親ポリペプチドと比して向上した殺菌活性を有する。
本発明のグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチド(「本発明のポリペプチド」と称す)は、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含むポリペプチドである。
斯かるポリペプチドは、基準となる親ポリペプチド、すなわち配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、上記の所定位置のアミノ酸残基が改変され、かつペプチド配列中のグリシン-グリシン結合の分解活性を有する変異ポリペプチドである。斯かる所定位置のアミノ酸残基の改変は、殺菌活性を向上するための改変であり、したがって、当該ポリペプチドは、親ポリペプチドと比して向上した殺菌活性を有する。
本発明のポリペプチドにおいて、アミノ酸残基の改変部位(変異位置)は、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置、
からなる群より選択されるいずれかの位置である。
ここで、配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、MEROPSデータベースにおいてMEROPS ID:M23.001として登録されているアクロモバクター・リティカス(Achromobacter lyticus)由来のBLPである。本発明のポリペプチドにおける変異位置は、当該アミノ酸配列のアミノ酸番号に基づいて番号付けされる。
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置、
からなる群より選択されるいずれかの位置である。
ここで、配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、MEROPSデータベースにおいてMEROPS ID:M23.001として登録されているアクロモバクター・リティカス(Achromobacter lyticus)由来のBLPである。本発明のポリペプチドにおける変異位置は、当該アミノ酸配列のアミノ酸番号に基づいて番号付けされる。
「親ポリペプチド」とは、本発明のポリペプチドをもたらすために改変が行われる基準ポリペプチドを意味する。親は、天然(野生型)ポリペプチド又はその変異体であり得る。
親ポリペプチドとしては、配列番号2のアミノ酸配列からなるBLP、及び配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。
親ポリペプチドとしては、配列番号2のアミノ酸配列からなるBLP、及び配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号2のアミノ酸配列と85%以上の同一性、より好ましくは90%以上の同一性、さらに好ましくは92%以上の同一性、さらに好ましくは94%以上の同一性、さらに好ましくは95%以上の同一性、さらに好ましくは96%以上の同一性、さらに好ましくは98%以上の同一性、さらに好ましくは99%以上の同一性、さらに好ましくは99.5%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドの別の例としては、配列番号2のアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドのさらなる例としては、リゾバクター・グモサス(Lysobacter gummosus)由来のBLPホモログ(WP_057941690.1)、リゾバクター・アンティビオティカス(Lysobacter antibioticus)由来のBLPホモログ(WP_057970430.1)等が挙げられる。
好ましくは、該親ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にGlnを有するか、配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置にTyrを有するか、配列番号2のアミノ酸配列の172位又はこれに相当する位置にTyrを有するか、配列番号2のアミノ酸配列の173位又はこれに相当する位置にTyrを有するか、配列番号2のアミノ酸配列の174位又はこれに相当する位置にValを有するか、配列番号2のアミノ酸配列の178位又はこれに相当する位置にProを有するか、又は配列番号2のアミノ酸配列の179位又はこれに相当する位置にAsnを有する。より好ましくは、該親BLPは、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれらに相当する位置に、それぞれGln、Tyr、Tyr、Tyr、Val、Pro、及びAsnを有する。
本発明のポリペプチドは、該親ポリペプチドのアミノ酸配列において、上記所定位置のアミノ酸残基を改変することによって製造することができる。上記所定位置で行われるアミノ酸残基の改変は、アミノ酸残基の置換、挿入及び/又は欠失が挙げられる。ここで、「置換」はある位置にあるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し、「欠失」はある位置にあるアミノ酸の除去を意味し、「挿入」はある位置にあるアミノ酸に隣接して、直接連続するようアミノ酸を付加することを意味する。
なお、本発明のポリペプチドは、殺菌活性向上の点から、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドであるのが好ましい。また、ポリペプチドは、上記ポリペプチドとしての性質を保持する限り、任意の数の保存的アミノ酸置換を含み得る。
本発明において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、His又はAsnへの置換が好ましく;170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、Serへの置換が好ましく;172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、Trpへの置換が好ましく;173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、Pheへの置換が好ましく;174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、Thrへの置換が好ましく;178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、Hisへの置換が好ましく;179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、該アミノ酸残基の欠失が好ましい。
したがって、好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換;
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のAsnへの置換;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含み、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチドである。
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換;
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のAsnへの置換;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含み、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチドである。
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にHisを有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にAsnを有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、174位又はこれに相当する位置にThrを有し、178位又はこれに相当する位置にHisを有し、かつ179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、かつ174位又はこれに相当する位置にThrを有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にHisを有し、170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、174位又はこれに相当する位置にThrを有し、178位又はこれに相当する位置にHisを有し、かつ179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にAsnを有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、174位又はこれに相当する位置にThrを有し、178位又はこれに相当する位置にHisを有し、かつ179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、かつ174位又はこれに相当する位置にThrを有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にHisを有し、170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、174位又はこれに相当する位置にThrを有し、178位又はこれに相当する位置にHisを有し、かつ179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する。
<本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド>
本発明のポリペプチドは、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して、親ポリペプチドに対して上述した改変を行うことで製造することができる。例えば、親ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド内の改変対象のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドを、改変後のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドに変異させ、更にその変異遺伝子からポリペプチドを発現させることにより、製造することができる。
本発明のポリペプチドは、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して、親ポリペプチドに対して上述した改変を行うことで製造することができる。例えば、親ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド内の改変対象のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドを、改変後のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドに変異させ、更にその変異遺伝子からポリペプチドを発現させることにより、製造することができる。
本発明において、親ポリペプチドのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド(以下、親遺伝子ともいう)において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースPCR法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット(例えば、Stratagene社のQuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kitや、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit等)を使用することもできる。
親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列(コドン)に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列(コドン)を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列(コドン)は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な2つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したDNA断片を、SOE(splicing by overlap extension)-PCR(Gene,1989,77(1):p61-68)により1つに連結する方法を用いることもできる。
親遺伝子を含む鋳型DNAは、上述したBLP又はBLPホモログを産生する微生物から、常法によりゲノムDNAを抽出するか、又はRNAを抽出し逆転写によりcDNAを合成することによって、調製することができる。あるいは、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型DNAとして用いてもよい。配列番号2のアミノ酸配列からなるBLPをコードするヌクレオチド配列を含むDNA配列を配列番号1に示した。配列番号1のヌクレオチド配列中、595~1134位のヌクレオチド配列が配列番号2のアミノ酸配列からなるBLPをコードするヌクレオチド配列である。
変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法(Nucleic Acids R4esearch,1989,17:7059-7071)等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置(ABI社製など)を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型DNAとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は2本鎖のDNA、cDNA、RNAもしくは他の人工核酸を含み得る。該DNA、cDNA及びRNAは、化学合成されていてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム(ORF)に加えて、非翻訳領域(UTR)のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database([www.kazusa.or.jp/codon/])から入手可能である。
BLPは、最初にプロタンパク質として発現し、自己プロセシングによりプロ領域が切断されて成熟型タンパク質に変換される。プロ領域とは、プロタンパク質上で該プロ領域の下流に位置する成熟型タンパク質領域の立体構造の形成に寄与する領域をいう。よって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの別の例としては、上記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流にBLPのプロ領域として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが連結されたポリヌクレオチドが挙げられる。該BLPのプロ領域として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号1の73~594位のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号1の73~594位のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有しかつBLPのプロ領域として機能するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号1の73~594位のヌクレオチド配列に対して1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加されかつBLPのプロ領域として機能するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド等が挙げられる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのさらなる例としては、上記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流にBLPの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが連結されたポリヌクレオチドが挙げられる。該BLPの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号1の1~594位のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号1の1~594位のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有しかつBLPの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号1の1~594位のヌクレオチド配列に対して1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加されかつBLPの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド等が挙げられる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのさらなる例としては、上記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流にBLPの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが連結されたポリヌクレオチドが挙げられる。該BLPの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号1の1~594位のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号1の1~594位のヌクレオチド配列と少なくとも80%の同一性を有しかつBLPの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号1の1~594位のヌクレオチド配列に対して1又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加されかつBLPの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド等が挙げられる。
<ベクター又はDNA断片>
得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターは、該遺伝子を安定に保持でき、宿主微生物内で複製維持が可能であり、かつ本発明のポリペプチドを安定に発現させることができるベクターである。斯かるベクターとしては、例えばpHA3040SP64、pHSP64R又はpASP64(特許第3492935号)、pHY300PLK(大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター;Jpn J Genet,1985,60:235-243)、pAC3(Nucleic Acids Res,1988,16:8732)等のシャトルベクター;pUB110(J Bacteriol,1978,134:318-329)、pTA10607(Plasmid,1987,18:8-15)等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のベクター(例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC57、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)を用いることもできる。このうち、ベクターとしては、本発明のポリペプチドの製造効率の観点から、バチルス属細菌の形質転換に利用可能なベクターが好ましい。
得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターは、該遺伝子を安定に保持でき、宿主微生物内で複製維持が可能であり、かつ本発明のポリペプチドを安定に発現させることができるベクターである。斯かるベクターとしては、例えばpHA3040SP64、pHSP64R又はpASP64(特許第3492935号)、pHY300PLK(大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター;Jpn J Genet,1985,60:235-243)、pAC3(Nucleic Acids Res,1988,16:8732)等のシャトルベクター;pUB110(J Bacteriol,1978,134:318-329)、pTA10607(Plasmid,1987,18:8-15)等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のベクター(例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC57、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)を用いることもできる。このうち、ベクターとしては、本発明のポリペプチドの製造効率の観点から、バチルス属細菌の形質転換に利用可能なベクターが好ましい。
上記ベクターは、DNAの複製開始領域又は複製起点を含むDNA領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。
上記プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Bacillus sp.KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列等が挙げられる。
あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子(例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子)がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、SOE(splicing by overlap extension)-PCR法(Gene,1989,77:61-68)などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。
<形質転換体>
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むDNA断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換体を得ることができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むDNA断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換体を得ることができる。
宿主微生物としては、特に制限されないが、Bacillus属(例えば枯草菌)等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌、Streptomyces属、Saccharomyces属(酵母)、Aspergillus属(カビ)等の真菌などが挙げられる。好ましい宿主は、該宿主に導入する本発明のポリペプチドの親ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする親遺伝子の由来菌と同種もしくは同属の微生物、大腸菌、またはバチルス属細菌であり、より好ましくはバチルス属細菌である。さらに、導入する本発明のポリペプチド以外のプロテアーゼの生産が少ないバチルス属細菌が好ましい。好ましくは、枯草菌のaprX、aprE、nprB、nprE、vpr、mpr、epr及びwprAから選ばれる1以上の遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株が挙げられる。
宿主へのベクターの導入の方法としては、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、パーティクルガン法、PEG法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
あるいは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、SOE-PCR法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したDNA断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該DNA断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。
斯くして得られた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明のポリペプチドが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
あるいは、本発明のポリペプチドは、無細胞翻訳系を使用して本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、in vitro転写翻訳系又はin vitro翻訳系を構成したものである。
上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明のポリペプチドは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で本発明のポリペプチドをコードする遺伝子と分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたタンパク質は細胞外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。
<抗菌剤>
前述の如く、BLPは、グラム陽性細菌に対する溶菌活性を有することが知られている(非特許文献3及び4)。また、後記実施例に示すとおり、本発明のポリペプチドは、親ポリペプチドと比して向上した溶菌による殺菌活性を有する。したがって、本発明のポリペプチドは、抗菌用酵素として有用であり、抗菌剤となり得る。また、抗菌剤を製造するために使用することができる。すなわち、本発明のポリペプチドは、抗菌のために使用することができる。
前述の如く、BLPは、グラム陽性細菌に対する溶菌活性を有することが知られている(非特許文献3及び4)。また、後記実施例に示すとおり、本発明のポリペプチドは、親ポリペプチドと比して向上した溶菌による殺菌活性を有する。したがって、本発明のポリペプチドは、抗菌用酵素として有用であり、抗菌剤となり得る。また、抗菌剤を製造するために使用することができる。すなわち、本発明のポリペプチドは、抗菌のために使用することができる。
本発明において、「抗菌」とは、微生物を死滅させる「溶菌」、「殺菌」、「滅菌」、微生物の発生、発育、増殖を抑える「静菌」、「制菌」のいずれの概念をも含む語である。抗菌剤としては、好適には殺菌剤が挙げられる。
抗菌活性又は殺菌活性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、目的の酵素を含む試験液に試験菌を添加して所定時間処理した後、試験液を段階希釈して適当な固形培地にて培養し、生じたコロニー数を測定して生菌数を算出することによって評価できる。
抗菌活性又は殺菌活性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、目的の酵素を含む試験液に試験菌を添加して所定時間処理した後、試験液を段階希釈して適当な固形培地にて培養し、生じたコロニー数を測定して生菌数を算出することによって評価できる。
上記「使用」の対象としては、ヒト、非ヒト動物、それらに由来する検体、物品等が挙げられる。ヒト又は非ヒト動物に対する使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。また、上記物品としては、例えば、日用品、医療用品、家電・電化製品、建具(ドア、戸、ドアノブ等)、住宅設備(浴室、キッチン、洗面所、トイレ等)等が挙げられる。
本発明の抗菌剤が抗菌活性を示す細菌としては、グラム陽性細菌が好ましい。グラム陽性細菌としては、特に限定されず、例えば、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)等のブドウ球菌;肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、緑色レンサ球菌(Streptococcus viridans)、A群β溶血性レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、B群β溶血性レンサ球菌(Streptococcus agalactiae)等のレンサ球菌;フェカーリス菌(Enterococcus faecalis)等のエンテロコッカス属細菌;炭疽菌(Bacillus anthracis)等のバチルス属細菌;破傷風菌(Clostridium tetani)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)等のクロストリジウム属細菌;ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)等のコリネバクテリウム属細菌;リステリア菌(Listeria monocytogenes)等のリステリア属細菌等が挙げられる。このうち、ブドウ球菌がより好ましく、黄色ブドウ球菌がさらに好ましい。
本発明の抗菌剤は、本発明のポリペプチド単体であってもよく、また、これを含有する酵素組成物であってもよい。
該酵素組成物における本発明のポリペプチドの含有量は、抗菌活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、組成物全質量に対して、好ましくは0.00001質量%以上、より好ましくは0.0002質量%以上、更に好ましくは0.0005質量%以上、更に好ましくは0.001質量%以上、更に好ましくは0.005質量%以上、更に好ましくは0.01質量%以上であり、そして好ましくは10質量%以下、より好ましくは1質量%以下、更に好ましくは0.5質量%以下である。また、0.00001~10質量%とするのが好ましく、0.0002~1質量%とするのがより好ましく、0.0005~0.5質量%とするのが更に好ましく、0.001~0.5質量%とするのが更に好ましく、0.005~0.5質量%とするのが更に好ましく、0.01~0.5質量%とするのが更に好ましい。
本発明の抗菌剤は、抗菌に有効な医薬品、医薬部外品、化粧料、日用品、試薬等として、又は医薬品、医薬部外品、化粧料、日用品、試薬、食品等の様々な製品に抗菌性を付与するための素材として使用することができる。なかでも、本発明の抗菌剤は、医薬品、医薬部外品若しくは化粧料として、又は医薬品、医薬部外品若しくは化粧料に配合する素材として用いることが好ましく、このような医薬品、医薬部外品又は化粧料として適したものとする観点からは、外用剤とすることがより好ましい。
本発明の抗菌剤は、液状、半固体状、固体状の他、シート等の基材に含浸させた態様としてもよいが、本発明の抗菌剤が外用剤の場合、その具体的な形態としては、軟膏剤、クリーム剤、乳液剤、ゲル剤、外用液剤、ローション剤、スプレー剤、外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤、貼付剤、テープ剤、パップ剤、外用固形剤、外用散剤、リニメント剤等が挙げられる。また、本発明の抗菌剤は、洗顔料、化粧水、ローション、乳液、クリーム、ミスト、スプレー、フェイスマスク、ボディソープ、シャンプー、ヘアトニック、洗浄料、入浴剤、石鹸、歯磨剤、洗口剤、ウェットティッシュ、洗顔シート、ボディシート等の形態とすることもできる。
斯かる製剤は、それぞれ一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール類、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、保湿剤、pH調整剤、色素、香料等とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、斯かる製剤には、必要に応じて、本発明のポリペプチド以外の抗菌剤、植物抽出物、抗炎症剤、清涼剤等を、本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
本発明の抗菌剤は、対象と接触させることにより、該対象上の細菌を死滅させる又は細菌の発生、発育、増殖を抑えることができる。抗菌剤と対象との接触の態様としては、特に限定されないが、例えば、該対象の表面に該抗菌剤を添加、塗布又は噴霧すること、該抗菌剤中に該対象を浸漬すること、該抗菌剤を用いて該対象を洗浄すること、等が挙げられる。対象の例としては、細菌が存在している、細菌が存在している可能性がある、細菌が付着する可能性がある等、抗菌を必要とする上述したヒト、非ヒト動物、それらに由来する検体、物品等が挙げられる。
別の一態様において、本発明は、グリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドの抗菌活性向上方法を提供する。当該方法は、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を行うことを含む。当該方法における改変の詳細は、上述した本発明のポリペプチドにおける改変と同様である。
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を行うことを含む。当該方法における改変の詳細は、上述した本発明のポリペプチドにおける改変と同様である。
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の態様を開示する。
<1>配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含み、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチド。
<2>前記改変が下記:
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のAsnへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換;並びに
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変である、<1>記載のポリペプチド。
<3>ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にHisを有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、<1>又は<2>記載のポリペプチド。
<4>ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にAsnを有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、<1>又は<2>記載のポリペプチド。
<5>ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、174位又はこれに相当する位置にThrを有し、178位又はこれに相当する位置にHisを有し、かつ179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、<1>又は<2>記載のポリペプチド。
<6>ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、かつ174位又はこれに相当する位置にThrを有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、<1>又は<2>記載のポリペプチド。
<7>ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にHisを有し、170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、174位又はこれに相当する位置にThrを有し、178位又はこれに相当する位置にHisを有し、かつ179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、<1>又は<2>記載のポリペプチド。
<8>前記配列同一性が90%以上である、<1>~<7>のいずれかに記載のポリペプチド。
<9>親ポリペプチドと比較して抗菌活性が向上している、<1>~<8>のいずれかに記載のポリペプチド。
<10>前記抗菌活性がグラム陽性細菌に対する抗菌活性である、<9>記載のポリペプチド。
<11>前記抗菌活性がブドウ球菌に対する抗菌活性である、<9>又は<10>記載のポリペプチド。
<12>前記抗菌活性が黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性である、<9>~<11>のいずれかに記載のポリペプチド。
<1>配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含み、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチド。
<2>前記改変が下記:
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のAsnへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換;並びに
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変である、<1>記載のポリペプチド。
<3>ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にHisを有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、<1>又は<2>記載のポリペプチド。
<4>ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にAsnを有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、<1>又は<2>記載のポリペプチド。
<5>ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、174位又はこれに相当する位置にThrを有し、178位又はこれに相当する位置にHisを有し、かつ179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、<1>又は<2>記載のポリペプチド。
<6>ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、かつ174位又はこれに相当する位置にThrを有し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、<1>又は<2>記載のポリペプチド。
<7>ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置にHisを有し、170位又はこれに相当する位置にSerを有し、172位又はこれに相当する位置にTrpを有し、173位又はこれに相当する位置にPheを有し、174位又はこれに相当する位置にThrを有し、178位又はこれに相当する位置にHisを有し、かつ179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、<1>又は<2>記載のポリペプチド。
<8>前記配列同一性が90%以上である、<1>~<7>のいずれかに記載のポリペプチド。
<9>親ポリペプチドと比較して抗菌活性が向上している、<1>~<8>のいずれかに記載のポリペプチド。
<10>前記抗菌活性がグラム陽性細菌に対する抗菌活性である、<9>記載のポリペプチド。
<11>前記抗菌活性がブドウ球菌に対する抗菌活性である、<9>又は<10>記載のポリペプチド。
<12>前記抗菌活性が黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性である、<9>~<11>のいずれかに記載のポリペプチド。
<13>配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を行うことを含む、グリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドの製造方法。
<14>前記改変が下記:
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のAsnへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換;並びに
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変である、<13>記載の方法。
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を行うことを含む、グリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドの製造方法。
<14>前記改変が下記:
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のAsnへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換;並びに
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変である、<13>記載の方法。
<15><1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
<16><15>記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
<17><16>記載のベクター又はDNA断片を含有する形質転換体。
<18>微生物である、<17>記載の形質転換体。
<19>バチルス属細菌である、<17>又は<18>記載の形質転換体。
<16><15>記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
<17><16>記載のベクター又はDNA断片を含有する形質転換体。
<18>微生物である、<17>記載の形質転換体。
<19>バチルス属細菌である、<17>又は<18>記載の形質転換体。
<20><1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分とする抗菌剤。
<21>グラム陽性細菌に対する抗菌剤である、<20>記載の抗菌剤。
<22>ブドウ球菌に対する抗菌剤である、<20>又は<21>記載の抗菌剤。
<23>黄色ブドウ球菌に対する抗菌剤である、<20>~<22>のいずれかに記載の抗菌剤。
<24>殺菌剤である、<20>~<23>のいずれかに記載の抗菌剤。
<25>外用剤である、<20>~<24>のいずれかに記載の抗菌剤。
<26>抗菌剤の製造のための、<1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
<27>抗菌に用いるための、<1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチド。
<28><1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチドを用いる抗菌方法。
<29>抗菌のための、<1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
<30>抗菌方法であって、それを必要とする対象と<1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチドとを接触させることを含む、方法。
<31>抗菌方法であって、それを必要とする対象と<20>~<25>のいずれかに記載の抗菌剤とを接触させることを含む、方法。
<21>グラム陽性細菌に対する抗菌剤である、<20>記載の抗菌剤。
<22>ブドウ球菌に対する抗菌剤である、<20>又は<21>記載の抗菌剤。
<23>黄色ブドウ球菌に対する抗菌剤である、<20>~<22>のいずれかに記載の抗菌剤。
<24>殺菌剤である、<20>~<23>のいずれかに記載の抗菌剤。
<25>外用剤である、<20>~<24>のいずれかに記載の抗菌剤。
<26>抗菌剤の製造のための、<1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
<27>抗菌に用いるための、<1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチド。
<28><1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチドを用いる抗菌方法。
<29>抗菌のための、<1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
<30>抗菌方法であって、それを必要とする対象と<1>~<12>のいずれかに記載のポリペプチドとを接触させることを含む、方法。
<31>抗菌方法であって、それを必要とする対象と<20>~<25>のいずれかに記載の抗菌剤とを接触させることを含む、方法。
<32>配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を行うことを含む、グリシン-グリシン活性を有するポリペプチドの抗菌活性向上方法。
<33>前記改変が下記:
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のAsnへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換;並びに
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変である、<32>記載の方法。
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を行うことを含む、グリシン-グリシン活性を有するポリペプチドの抗菌活性向上方法。
<33>前記改変が下記:
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のAsnへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換;並びに
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変である、<32>記載の方法。
実施例1 BLP変異体の調製
(1)BLP変異体発現プラスミドの構築
5’末端にリバースプライマーとの相補配列を15塩基有し変異配列を含むフォワードプライマー、及び変異配列の直前の塩基を5’末端とするリバースプライマーを変異導入用プライマー対として用いた。国際公開第2019/142773号の実施例1に記載のプラスミドpHY-BLP2を鋳型として、変異導入用プライマー対を使用してPCRを行った。複数断片を連結する場合、それぞれのPCR産物を用いてIn-Fusion,HD Cloning kit(Clontech)のプロトコルに従ってIn-Fusion反応を行った。PCR産物又はIn-Fusion反応液を枯草菌にプロトプラスト法により形質転換して目的のBLP変異体発現プラスミドを保持する形質転換体を取得した。
(1)BLP変異体発現プラスミドの構築
5’末端にリバースプライマーとの相補配列を15塩基有し変異配列を含むフォワードプライマー、及び変異配列の直前の塩基を5’末端とするリバースプライマーを変異導入用プライマー対として用いた。国際公開第2019/142773号の実施例1に記載のプラスミドpHY-BLP2を鋳型として、変異導入用プライマー対を使用してPCRを行った。複数断片を連結する場合、それぞれのPCR産物を用いてIn-Fusion,HD Cloning kit(Clontech)のプロトコルに従ってIn-Fusion反応を行った。PCR産物又はIn-Fusion反応液を枯草菌にプロトプラスト法により形質転換して目的のBLP変異体発現プラスミドを保持する形質転換体を取得した。
(2)酵素生産培養
終濃度15ppmとなるようにテトラサイクリンを添加したLB培地1mLに(1)で得た形質転換体コロニーを植菌した後、30℃、150spmで一晩培養した。翌日、培養液400μLを2×L-マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン五水和物、21μM ZnSO4、15ppmテトラサイクリン;%は(w/v)%)5mLに植菌し、30℃、150spmで2日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収した。
終濃度15ppmとなるようにテトラサイクリンを添加したLB培地1mLに(1)で得た形質転換体コロニーを植菌した後、30℃、150spmで一晩培養した。翌日、培養液400μLを2×L-マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン五水和物、21μM ZnSO4、15ppmテトラサイクリン;%は(w/v)%)5mLに植菌し、30℃、150spmで2日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収した。
(3)酵素活性の測定
基質として、蛍光基Nmaと消光基Lys(Dpn)の間がペンタグリシンであるFRET基質[以下FRET-GGGGG](ピーエイチジャパンにて受注生産)を用いた。ここでNmaとは2-(N-メチルアミノ)ベンゾイル(Nma)を指す。またLys(Dpn)とは2,4-ジニトロフェニル(Dnp)をリシン(Lys)の側鎖に有するものを指す。96穴の黒色プレ-トに酵素溶液(適宣希釈)を2μL、20mM Tris-HCl(pH7.5)を200μL添加し、さらにFRET-GGGGG溶液(1mM FRET-GGGGG、100mM Tris-HCl(pH7.5))を10μL添加して反応液を調製した。infinite M200(TECAN)を用いて温度30℃、励起波長340nm、測定波長440nmにて反応液の蛍光強度を経時で測定した。同じ反応条件で、酵素溶液の代わりに20mM Tris-HCl(pH7.5)、FRET-GGGGGの代わりにFRETS-25-STD1及びFRETS-25-STD2(ペプチド研究所)の等モル溶液を用いた反応液の蛍光強度を測定し、検量線を作成した。1ユニット(U)の活性は、1μmol FRETS-25-STD1及び1μmol FRETS-25-STD2を含む溶液の蛍光強度をXとしたとき、X/minの蛍光強度の変化を示すのに必要な酵素量とした。酵素溶液のFRET-GGGGG分解活性(U/mL)を求めた。
基質として、蛍光基Nmaと消光基Lys(Dpn)の間がペンタグリシンであるFRET基質[以下FRET-GGGGG](ピーエイチジャパンにて受注生産)を用いた。ここでNmaとは2-(N-メチルアミノ)ベンゾイル(Nma)を指す。またLys(Dpn)とは2,4-ジニトロフェニル(Dnp)をリシン(Lys)の側鎖に有するものを指す。96穴の黒色プレ-トに酵素溶液(適宣希釈)を2μL、20mM Tris-HCl(pH7.5)を200μL添加し、さらにFRET-GGGGG溶液(1mM FRET-GGGGG、100mM Tris-HCl(pH7.5))を10μL添加して反応液を調製した。infinite M200(TECAN)を用いて温度30℃、励起波長340nm、測定波長440nmにて反応液の蛍光強度を経時で測定した。同じ反応条件で、酵素溶液の代わりに20mM Tris-HCl(pH7.5)、FRET-GGGGGの代わりにFRETS-25-STD1及びFRETS-25-STD2(ペプチド研究所)の等モル溶液を用いた反応液の蛍光強度を測定し、検量線を作成した。1ユニット(U)の活性は、1μmol FRETS-25-STD1及び1μmol FRETS-25-STD2を含む溶液の蛍光強度をXとしたとき、X/minの蛍光強度の変化を示すのに必要な酵素量とした。酵素溶液のFRET-GGGGG分解活性(U/mL)を求めた。
(4)培養上清からの酵素精製
(2)で得た培養上清からBLP及びその変異体をそれぞれ精製した。培養上清をアミコンウルトラ 分画分子量10K(メルクミリポア)を用いて10mM クエン酸-Na pH6でバッファー交換した。バッファー交換後の液から、AKTA explorer 10S(GEヘルスケア)を用いて酵素を精製した。まず該バッファー交換で得られた液をTOYOPEARL Gigacap CM-650Mカラム(東ソー)に通し、次いで溶出バッファー(10mM クエン酸-Na pH6、200mM NaCl)を使用して吸着成分を溶出させた。溶出分画のうち(3)の活性測定方法によってFRET-GGGGG分解活性が認められた分画液を回収した。回収した分画液をアミコンウルトラ 分画分子量10Kを用いて20mM Tris-HCl(pH7.5)溶液でバッファー交換し、BLP及びその変異体を含む各酵素溶液を得た。
(2)で得た培養上清からBLP及びその変異体をそれぞれ精製した。培養上清をアミコンウルトラ 分画分子量10K(メルクミリポア)を用いて10mM クエン酸-Na pH6でバッファー交換した。バッファー交換後の液から、AKTA explorer 10S(GEヘルスケア)を用いて酵素を精製した。まず該バッファー交換で得られた液をTOYOPEARL Gigacap CM-650Mカラム(東ソー)に通し、次いで溶出バッファー(10mM クエン酸-Na pH6、200mM NaCl)を使用して吸着成分を溶出させた。溶出分画のうち(3)の活性測定方法によってFRET-GGGGG分解活性が認められた分画液を回収した。回収した分画液をアミコンウルトラ 分画分子量10Kを用いて20mM Tris-HCl(pH7.5)溶液でバッファー交換し、BLP及びその変異体を含む各酵素溶液を得た。
(5)酵素溶液の濃度測定
酵素溶液の濃度測定にはDCプロテインアッセイキット(Bio-Rad)を用いた。タンパク質量算出のための標準液にはBSA Standard Solution(WAKO)を用いた。
酵素溶液の濃度測定にはDCプロテインアッセイキット(Bio-Rad)を用いた。タンパク質量算出のための標準液にはBSA Standard Solution(WAKO)を用いた。
実施例2 黄色ブドウ球菌殺菌試験
試験菌としてStaphylococcus aureus ATCC6538を用いた。SCD液体培地はSCD培地「ダイゴ」,一般細菌検査用(富士フイルム和光純薬)を、SCD寒天培地はSCD寒天培地「ダイゴ」,一般細菌検査用(富士フイルム和光純薬)を、LP希釈液はLP希釈液「ダイゴ」(富士フイルム和光純薬)を、バッファーとしては20mM Tris-HCl(pH7.5)を用いた。終濃度0.5ppmの各酵素を含むバッファーを試験液として用いた。SCD液体培地中で37℃、一晩振盪培養した試験菌を回収してバッファーで洗浄・再懸濁し、108-9CFU/mLに調製した。各試験液500μLに対して菌液を5μL添加し、30℃で30分間インキュベートした。試験液をLP希釈液で段階希釈し、100μLずつSCD寒天培地に塗布した。37℃、24時間インキュベートした後、コロニーを数えることで試験液1mL中に含まれる生菌数(CFU/mL)を算出した。
野生型BLPに対して、変異体Q116H、Q116N、Y170S+Y172W+Y173F+V174T+P178H+N179Δ、及びY170S+Y172W+Y173F+V174Tでは黄色ブドウ球菌殺菌活性が向上していた(図1)。また、Q116HとY170S+Y172W+Y173F+V174T+P178H+N179Δの変異を組み合わせることで黄色ブドウ球菌殺菌活性はさらに向上した(図2)。
試験菌としてStaphylococcus aureus ATCC6538を用いた。SCD液体培地はSCD培地「ダイゴ」,一般細菌検査用(富士フイルム和光純薬)を、SCD寒天培地はSCD寒天培地「ダイゴ」,一般細菌検査用(富士フイルム和光純薬)を、LP希釈液はLP希釈液「ダイゴ」(富士フイルム和光純薬)を、バッファーとしては20mM Tris-HCl(pH7.5)を用いた。終濃度0.5ppmの各酵素を含むバッファーを試験液として用いた。SCD液体培地中で37℃、一晩振盪培養した試験菌を回収してバッファーで洗浄・再懸濁し、108-9CFU/mLに調製した。各試験液500μLに対して菌液を5μL添加し、30℃で30分間インキュベートした。試験液をLP希釈液で段階希釈し、100μLずつSCD寒天培地に塗布した。37℃、24時間インキュベートした後、コロニーを数えることで試験液1mL中に含まれる生菌数(CFU/mL)を算出した。
野生型BLPに対して、変異体Q116H、Q116N、Y170S+Y172W+Y173F+V174T+P178H+N179Δ、及びY170S+Y172W+Y173F+V174Tでは黄色ブドウ球菌殺菌活性が向上していた(図1)。また、Q116HとY170S+Y172W+Y173F+V174T+P178H+N179Δの変異を組み合わせることで黄色ブドウ球菌殺菌活性はさらに向上した(図2)。
Claims (8)
- 配列番号2のアミノ酸配列又はこれと少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列において、下記:
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;
配列番号2のアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変;並びに
配列番号2のアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置、170位又はこれに相当する位置、172位又はこれに相当する位置、173位又はこれに相当する位置、174位又はこれに相当する位置、178位又はこれに相当する位置、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含み、かつグリシン-グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチド。 - 前記改変が下記:
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のAsnへの置換;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失;
配列番号2で示されるアミノ酸配列の170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、及び174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換;並びに
配列番号2で示されるアミノ酸配列の116位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、170位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のSerへの置換、172位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のTrpへの置換、173位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のPheへの置換、174位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のThrへの置換、178位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のHisへの置換、及び179位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変である、請求項1記載のポリペプチド。 - 請求項1又は2記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項3記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
- 微生物である、請求項4記載の形質転換体。
- 請求項1又は2記載のポリペプチドを有効成分とする抗菌剤。
- グラム陽性細菌に対する抗菌剤である、請求項6記載の抗菌剤。
- 請求項1又は2記載のポリペプチドを用いる抗菌方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2020182945A JP2022073146A (ja) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 変異プロテアーゼ及びその利用 |
EP21885842.1A EP4239071A1 (en) | 2020-10-30 | 2021-10-06 | Mutated protease and use thereof |
PCT/JP2021/036956 WO2022091723A1 (ja) | 2020-10-30 | 2021-10-06 | 変異プロテアーゼ及びその利用 |
US18/033,837 US20240043822A1 (en) | 2020-10-30 | 2021-10-06 | Mutant protease and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2020182945A JP2022073146A (ja) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 変異プロテアーゼ及びその利用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022073146A true JP2022073146A (ja) | 2022-05-17 |
Family
ID=81382421
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020182945A Pending JP2022073146A (ja) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 変異プロテアーゼ及びその利用 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20240043822A1 (ja) |
EP (1) | EP4239071A1 (ja) |
JP (1) | JP2022073146A (ja) |
WO (1) | WO2022091723A1 (ja) |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS492935B1 (ja) | 1968-10-07 | 1974-01-23 | ||
JP3024989B2 (ja) * | 1990-08-29 | 2000-03-27 | 和光純薬工業株式会社 | β―リティック プロテアーゼ遺伝子及びその遺伝子産物の製造法 |
US11371034B2 (en) | 2018-01-16 | 2022-06-28 | Kao Corporation | Production method for protease of M23A subfamily |
-
2020
- 2020-10-30 JP JP2020182945A patent/JP2022073146A/ja active Pending
-
2021
- 2021-10-06 US US18/033,837 patent/US20240043822A1/en active Pending
- 2021-10-06 WO PCT/JP2021/036956 patent/WO2022091723A1/ja unknown
- 2021-10-06 EP EP21885842.1A patent/EP4239071A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP4239071A1 (en) | 2023-09-06 |
US20240043822A1 (en) | 2024-02-08 |
WO2022091723A1 (ja) | 2022-05-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1456366B1 (de) | Neue alkalische protease aus bacillus gibsonii (dsm 14393) und wasch- und reinigungsmittel enthaltend diese neue alkalische protease | |
ES2381539T3 (es) | Nueva proteasa alcalina de Bacillus SP.(DSM 14392) y detergentes o agentes limpiadores que contienen esta nueva proteasa alcalina | |
Wong et al. | Engineering and production of streptokinase in a Bacillus subtilis expression-secretion system | |
Jaouadi et al. | The overexpression of the SAPB of Bacillus pumilus CBS and mutated sapB-L31I/T33S/N99Y alkaline proteases in Bacillus subtilis DB430: new attractive properties for the mutant enzyme | |
Zhu et al. | The novel virulence-related gene stp of Streptococcus suis serotype 9 strain contributes to a significant reduction in mouse mortality | |
JP4425515B2 (ja) | プロテアーゼ、これに対する遺伝子およびその用途 | |
Liu et al. | Improvement of cold adaptation of Bacillus alcalophilus alkaline protease by directed evolution | |
CN111601894B (zh) | M23a家族蛋白酶的制造方法 | |
US20230114779A1 (en) | Methods for cell free protein expression of mature polypeptides derived from zymogens and proproteins | |
WO2015044206A1 (de) | Stabilisierte inhibitor-proteasevarianten | |
Conibear et al. | Characterization of protease IV expression in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates | |
EP4114931A1 (en) | Methods for cell free protein expression of mature polypeptides derived from zymogens and proproteins | |
WO2022091723A1 (ja) | 変異プロテアーゼ及びその利用 | |
JP7057140B2 (ja) | 角質汚れ洗浄剤 | |
HUT53154A (en) | Process for producing protease-defective gram-positive bacteria and utilizing them as host-organizmus for producing recombinant products | |
Choi et al. | A novel thermotolerant and acidotolerant peptide produced by a Bacillus strain newly isolated from a fermented food (kimchi) shows activity against multidrug-resistant bacteria | |
Kim et al. | Purification and properties of bacteriolytic enzymes from Bacillus licheniformis YS-1005 against Streptococcus mutans | |
JP4736085B2 (ja) | 宿主微生物 | |
Ramakrishnan et al. | Partial characterization and cloning of protease from Bacillus | |
WO2023027066A1 (ja) | 硬質表面処理剤 | |
JP2020080710A (ja) | M23aファミリープロテアーゼの製造方法 | |
JP7389640B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
WO2023080136A1 (ja) | 抗菌ペプチド | |
KR102114929B1 (ko) | 신규한 저온 활성 서브틸라아제 및 이의 용도 | |
KR20060087627A (ko) | 신규한 혈전용해 프로테아제 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211005 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230921 |