JP2022073146A - 変異プロテアーゼ及びその利用 - Google Patents

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Abstract

【課題】グリシン－グリシン結合分解活性を有し、殺菌活性が向上したポリペプチド及びその利用法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列、又は、これと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、特定のアミノ酸残基の改変を含み、かつ、グリシン－グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチド。【選択図】なし

Description

本発明は、変異プロテアーゼ及びその利用に関する。
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は、ヒト及び動物の病原菌の中でも最も重要なものの１つであり、皮膚・眼の感染症、食中毒、肺炎、髄膜炎、心内膜炎、骨髄炎といった広範な疾患の原因となる。また、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をはじめとする薬剤耐性菌の出現やその院内感染が深刻な課題となっている。そのため、黄色ブドウ球菌を溶菌により殺菌できる酵素は、臨床的、獣医学的、食品工学的な応用が期待されている（非特許文献１）。
最も広く産業利用されている溶菌酵素はリゾチームである。しかしながら、リゾチームは比較的広範な細菌の細胞壁分解活性を有するものの、黄色ブドウ球菌はその細胞壁構造に起因してリゾチームに耐性であることが知られている（非特許文献２）。
一方、プロテアーゼのＭ２３ファミリーは、ＭＥＲＯＰＳデータベースにおいて、ペプチド配列中のグリシン－グリシン結合を分解できるプロテアーゼとして定義されるプロテアーゼファミリーであり、エラスチンやバクテリア細胞壁のプロテオグリカンの分解活性を有し、溶菌酵素としても知られている。中でも、Ｍ２３Ａサブファミリーに属するβ－リティックメタロプロテアーゼ（beta-lytic metallopeptidase；ＢＬＰ）は、黄色ブドウ球菌や枯草菌等のグラム陽性細菌に対して強い溶菌活性を有していることが報告されている（非特許文献３及び４）。
Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼに関しては、プロタンパク質から成熟型タンパク質へのプロセシングが障壁となり、異種発現が困難であったが、最近、Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼ遺伝子をバチルス属菌宿主に導入し、培養することで、成熟型タンパク質を培養物中から効率よく生産可能であることが見出された（特許文献１）。しかしながら、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼへの変異導入による機能改良はこれまでに報告されていない。
国際公開第２０１９／１４２７７３号
Szweda, Piotr et al. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(5): 1157-1174 Bera, Agnieszka et al. Journal of Bacteriology, 2007, 189(1): 280-283 Li, Shaoliang et al, The Journal of Biochemistry, 1998, 124(2): 332-339 Ahmed, Kashfia et al. Journal of Bioscience and Bioengineeing, 2003, 95(1): 27-34
本発明は、グリシン－グリシン結合分解活性を有し、殺菌活性が向上したポリペプチド及びその利用法を提供することに関する。
本発明者らは、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼに属し、グリシン－グリシン結合分解活性を有するＢＬＰのアミノ酸配列上の特定のアミノ酸残基を改変することによって該ＢＬＰの殺菌活性が向上することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下に係るものである。
１）配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、下記：
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；並びに
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置、１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含み、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチド。
２）１）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
３）２）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
４）３）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換体。
５）１）のポリペプチドを有効成分とする抗菌剤。
６）１）のポリペプチドを用いる抗菌方法。
本発明のグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドは、優れた殺菌活性を有する。斯かるポリペプチドは、抗菌剤の有効成分として使用することができる。
ＢＬＰ変異体の黄色ブドウ球菌殺菌活性。 ＢＬＰ変異体の黄色ブドウ球菌殺菌活性。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本明細書において、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼとは、ＭＥＲＯＰＳデータベースの分類法（Rawlings, Neil D., et al. "MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors." Nucleic acids research 42.D1 (2013): D503-D509）に従って分類した際に、Ｍ２３ファミリーに属するメタロプロテアーゼのサブファミリーである、Ｍ２３Ａサブファミリーに分類されるプロテアーゼをいう。
本明細書において、「β－リティックメタロプロテアーゼ（beta-lytic metallopeptidase；ＢＬＰ）」とは、β－リティックプロテアーゼとも呼ばれる酵素であり、Ｍ２３Ａサブファミリーに属するプロテアーゼの１種をいう。ＢＬＰは、ペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有する。グリシン－グリシン結合の分解活性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、該活性は、グリシン－グリシン結合を含む適当な基質（例えばオリゴグリシンペプチドや、後記実施例に記載のＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ基質）の酵素的分解による生成物の量を測定することによって決定することができる。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性をいう。
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、１～４０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個を意味し得る。また本明細書において、別途定義されない限り、ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、１～１２０個、好ましくは１～９０個、より好ましくは１～６０個、さらに好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～９個を意味し得る。本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の同一性又は類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の同一性又は類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
本明細書において、アミノ酸の位置及び変異体の記載は、公認されているＩＵＰＡＣの１文字のアミノ酸略記により、以下のように表記され得る。
所定位置のアミノ酸は、［アミノ酸、位置］で表記される。例えば位置１１６のグルタミンは、「Ｑ１１６」と示される。
アミノ酸の「置換」に関しては、［元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸］で表記される。例えば位置１１６のグルタミンのヒスチジンへの置換は、「Ｑ１１６Ｈ」と示される。
アミノ酸の「欠失」に関しては、［元のアミノ酸、位置、Δ］で表記される。例えば、位置１７９でのアスパラギンの欠失は「Ｎ１７９Δ」と示される。
複数の改変を含む変異体は、加算記号（「＋」）によって表記される。例えば、「Ｑ１１６Ｈ＋Ｎ１７９Δ」は、それぞれ、位置１１６のグルタミンのヒスチジンへの置換と位置１７９でのアスパラギンの欠失を表す。
本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
本明細書において、所与の変異ポリペプチドの「親」ポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該変異ポリペプチドとなるポリペプチドをいう。言い換えると、「親」ポリペプチドとは、変異ポリペプチドに当該変異が加えられる前のポリペプチドである。同様に、変異ポリヌクレオチドの「親」ポリヌクレオチドとは、そのヌクレオチドに所定の変異がなされることにより、当該変異ポリヌクレオチドとなるポリヌクレオチドをいう。言い換えると、「親」ポリヌクレオチドとは、変異ポリヌクレオチドに当該変異が加えられる前のポリヌクレオチドである。
＜グリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチド＞
本発明のグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチド（「本発明のポリペプチド」と称す）は、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、下記：
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；並びに
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置、１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含むポリペプチドである。
斯かるポリペプチドは、基準となる親ポリペプチド、すなわち配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、上記の所定位置のアミノ酸残基が改変され、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有する変異ポリペプチドである。斯かる所定位置のアミノ酸残基の改変は、殺菌活性を向上するための改変であり、したがって、当該ポリペプチドは、親ポリペプチドと比して向上した殺菌活性を有する。
本発明のポリペプチドにおいて、アミノ酸残基の改変部位（変異位置）は、下記：
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、及び１７４位又はこれに相当する位置；並びに
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置、１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置、
からなる群より選択されるいずれかの位置である。
ここで、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＭＥＲＯＰＳデータベースにおいてＭＥＲＯＰＳ ＩＤ：Ｍ２３．００１として登録されているアクロモバクター・リティカス（Achromobacter lyticus）由来のＢＬＰである。本発明のポリペプチドにおける変異位置は、当該アミノ酸配列のアミノ酸番号に基づいて番号付けされる。
「親ポリペプチド」とは、本発明のポリペプチドをもたらすために改変が行われる基準ポリペプチドを意味する。親は、天然（野生型）ポリペプチド又はその変異体であり得る。
親ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸配列からなるＢＬＰ、及び配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号２のアミノ酸配列と８５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９２％以上の同一性、さらに好ましくは９４％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９６％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、さらに好ましくは９９％以上の同一性、さらに好ましくは９９．５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドの別の例としては、配列番号２のアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、グリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドのさらなる例としては、リゾバクター・グモサス（Lysobacter gummosus）由来のＢＬＰホモログ（ＷＰ＿０５７９４１６９０．１）、リゾバクター・アンティビオティカス（Lysobacter antibioticus）由来のＢＬＰホモログ（ＷＰ＿０５７９７０４３０．１）等が挙げられる。
好ましくは、該親ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置にＧｌｎを有するか、配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置にＴｙｒを有するか、配列番号２のアミノ酸配列の１７２位又はこれに相当する位置にＴｙｒを有するか、配列番号２のアミノ酸配列の１７３位又はこれに相当する位置にＴｙｒを有するか、配列番号２のアミノ酸配列の１７４位又はこれに相当する位置にＶａｌを有するか、配列番号２のアミノ酸配列の１７８位又はこれに相当する位置にＰｒｏを有するか、又は配列番号２のアミノ酸配列の１７９位又はこれに相当する位置にＡｓｎを有する。より好ましくは、該親ＢＬＰは、配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置、１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれらに相当する位置に、それぞれＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、及びＡｓｎを有する。
本発明のポリペプチドは、該親ポリペプチドのアミノ酸配列において、上記所定位置のアミノ酸残基を改変することによって製造することができる。上記所定位置で行われるアミノ酸残基の改変は、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失が挙げられる。ここで、「置換」はある位置にあるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し、「欠失」はある位置にあるアミノ酸の除去を意味し、「挿入」はある位置にあるアミノ酸に隣接して、直接連続するようアミノ酸を付加することを意味する。
なお、本発明のポリペプチドは、殺菌活性向上の点から、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドであるのが好ましい。また、ポリペプチドは、上記ポリペプチドとしての性質を保持する限り、任意の数の保存的アミノ酸置換を含み得る。
本発明において、配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、Ｈｉｓ又はＡｓｎへの置換が好ましく；１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、Ｓｅｒへの置換が好ましく；１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、Ｔｒｐへの置換が好ましく；１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、Ｐｈｅへの置換が好ましく；１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、Ｔｈｒへの置換が好ましく；１７８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、Ｈｉｓへの置換が好ましく；１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変としては、該アミノ酸残基の欠失が好ましい。
したがって、好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、下記：
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換；
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＡｓｎへの置換；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、１７８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換；並びに
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、１７８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含み、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチドである。
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置にＨｉｓを有し、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置にＡｓｎを有し、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置にＳｅｒを有し、１７２位又はこれに相当する位置にＴｒｐを有し、１７３位又はこれに相当する位置にＰｈｅを有し、１７４位又はこれに相当する位置にＴｈｒを有し、１７８位又はこれに相当する位置にＨｉｓを有し、かつ１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置にＳｅｒを有し、１７２位又はこれに相当する位置にＴｒｐを有し、１７３位又はこれに相当する位置にＰｈｅを有し、かつ１７４位又はこれに相当する位置にＴｈｒを有し、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する。
別の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置にＨｉｓを有し、１７０位又はこれに相当する位置にＳｅｒを有し、１７２位又はこれに相当する位置にＴｒｐを有し、１７３位又はこれに相当する位置にＰｈｅを有し、１７４位又はこれに相当する位置にＴｈｒを有し、１７８位又はこれに相当する位置にＨｉｓを有し、かつ１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する。
＜本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド＞
本発明のポリペプチドは、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して、親ポリペプチドに対して上述した改変を行うことで製造することができる。例えば、親ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド内の改変対象のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドを、改変後のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドに変異させ、更にその変異遺伝子からポリペプチドを発現させることにより、製造することができる。
本発明において、親ポリペプチドのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したＢＬＰ又はＢＬＰホモログを産生する微生物から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。配列番号２のアミノ酸配列からなるＢＬＰをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列を配列番号１に示した。配列番号１のヌクレオチド配列中、５９５～１１３４位のヌクレオチド配列が配列番号２のアミノ酸配列からなるＢＬＰをコードするヌクレオチド配列である。
変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。
ＢＬＰは、最初にプロタンパク質として発現し、自己プロセシングによりプロ領域が切断されて成熟型タンパク質に変換される。プロ領域とは、プロタンパク質上で該プロ領域の下流に位置する成熟型タンパク質領域の立体構造の形成に寄与する領域をいう。よって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの別の例としては、上記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流にＢＬＰのプロ領域として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが連結されたポリヌクレオチドが挙げられる。該ＢＬＰのプロ領域として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１の７３～５９４位のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の７３～５９４位のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有しかつＢＬＰのプロ領域として機能するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の７３～５９４位のヌクレオチド配列に対して１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加されかつＢＬＰのプロ領域として機能するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド等が挙げられる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのさらなる例としては、上記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流にＢＬＰの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが連結されたポリヌクレオチドが挙げられる。該ＢＬＰの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１の１～５９４位のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の１～５９４位のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有しかつＢＬＰの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の１～５９４位のヌクレオチド配列に対して１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加されかつＢＬＰの分泌シグナル及びプロ領域として機能するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド等が挙げられる。
＜ベクター又はＤＮＡ断片＞
得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターは、該遺伝子を安定に保持でき、宿主微生物内で複製維持が可能であり、かつ本発明のポリペプチドを安定に発現させることができるベクターである。斯かるベクターとしては、例えばｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。このうち、ベクターとしては、本発明のポリペプチドの製造効率の観点から、バチルス属細菌の形質転換に利用可能なベクターが好ましい。
上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。
上記プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Bacillus sp.KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列等が挙げられる。
あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
上記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。
＜形質転換体＞
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換体を得ることができる。
宿主微生物としては、特に制限されないが、Bacillus属（例えば枯草菌）等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌、Streptomyces属、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌などが挙げられる。好ましい宿主は、該宿主に導入する本発明のポリペプチドの親ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする親遺伝子の由来菌と同種もしくは同属の微生物、大腸菌、またはバチルス属細菌であり、より好ましくはバチルス属細菌である。さらに、導入する本発明のポリペプチド以外のプロテアーゼの生産が少ないバチルス属細菌が好ましい。好ましくは、枯草菌のａｐｒＸ、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選ばれる１以上の遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌株が挙げられる。
宿主へのベクターの導入の方法としては、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
あるいは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。
斯くして得られた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明のポリペプチドが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
あるいは、本発明のポリペプチドは、無細胞翻訳系を使用して本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明のポリペプチドは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で本発明のポリペプチドをコードする遺伝子と分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたタンパク質は細胞外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。
＜抗菌剤＞
前述の如く、ＢＬＰは、グラム陽性細菌に対する溶菌活性を有することが知られている（非特許文献３及び４）。また、後記実施例に示すとおり、本発明のポリペプチドは、親ポリペプチドと比して向上した溶菌による殺菌活性を有する。したがって、本発明のポリペプチドは、抗菌用酵素として有用であり、抗菌剤となり得る。また、抗菌剤を製造するために使用することができる。すなわち、本発明のポリペプチドは、抗菌のために使用することができる。
本発明において、「抗菌」とは、微生物を死滅させる「溶菌」、「殺菌」、「滅菌」、微生物の発生、発育、増殖を抑える「静菌」、「制菌」のいずれの概念をも含む語である。抗菌剤としては、好適には殺菌剤が挙げられる。
抗菌活性又は殺菌活性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、目的の酵素を含む試験液に試験菌を添加して所定時間処理した後、試験液を段階希釈して適当な固形培地にて培養し、生じたコロニー数を測定して生菌数を算出することによって評価できる。
上記「使用」の対象としては、ヒト、非ヒト動物、それらに由来する検体、物品等が挙げられる。ヒト又は非ヒト動物に対する使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。また、上記物品としては、例えば、日用品、医療用品、家電・電化製品、建具（ドア、戸、ドアノブ等）、住宅設備（浴室、キッチン、洗面所、トイレ等）等が挙げられる。
本発明の抗菌剤が抗菌活性を示す細菌としては、グラム陽性細菌が好ましい。グラム陽性細菌としては、特に限定されず、例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）等のブドウ球菌；肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、緑色レンサ球菌（Streptococcus viridans）、Ａ群β溶血性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、Ｂ群β溶血性レンサ球菌（Streptococcus agalactiae）等のレンサ球菌；フェカーリス菌（Enterococcus faecalis）等のエンテロコッカス属細菌；炭疽菌（Bacillus anthracis）等のバチルス属細菌；破傷風菌（Clostridium tetani）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）等のクロストリジウム属細菌；ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）等のコリネバクテリウム属細菌；リステリア菌（Listeria monocytogenes）等のリステリア属細菌等が挙げられる。このうち、ブドウ球菌がより好ましく、黄色ブドウ球菌がさらに好ましい。
本発明の抗菌剤は、本発明のポリペプチド単体であってもよく、また、これを含有する酵素組成物であってもよい。
該酵素組成物における本発明のポリペプチドの含有量は、抗菌活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、組成物全質量に対して、好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．０００２質量％以上、更に好ましくは０．０００５質量％以上、更に好ましくは０．００１質量％以上、更に好ましくは０．００５質量％以上、更に好ましくは０．０１質量％以上であり、そして好ましくは１０質量％以下、より好ましくは１質量％以下、更に好ましくは０．５質量％以下である。また、０．００００１～１０質量％とするのが好ましく、０．０００２～１質量％とするのがより好ましく、０．０００５～０．５質量％とするのが更に好ましく、０．００１～０．５質量％とするのが更に好ましく、０．００５～０．５質量％とするのが更に好ましく、０．０１～０．５質量％とするのが更に好ましい。
本発明の抗菌剤は、抗菌に有効な医薬品、医薬部外品、化粧料、日用品、試薬等として、又は医薬品、医薬部外品、化粧料、日用品、試薬、食品等の様々な製品に抗菌性を付与するための素材として使用することができる。なかでも、本発明の抗菌剤は、医薬品、医薬部外品若しくは化粧料として、又は医薬品、医薬部外品若しくは化粧料に配合する素材として用いることが好ましく、このような医薬品、医薬部外品又は化粧料として適したものとする観点からは、外用剤とすることがより好ましい。
本発明の抗菌剤は、液状、半固体状、固体状の他、シート等の基材に含浸させた態様としてもよいが、本発明の抗菌剤が外用剤の場合、その具体的な形態としては、軟膏剤、クリーム剤、乳液剤、ゲル剤、外用液剤、ローション剤、スプレー剤、外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤、貼付剤、テープ剤、パップ剤、外用固形剤、外用散剤、リニメント剤等が挙げられる。また、本発明の抗菌剤は、洗顔料、化粧水、ローション、乳液、クリーム、ミスト、スプレー、フェイスマスク、ボディソープ、シャンプー、ヘアトニック、洗浄料、入浴剤、石鹸、歯磨剤、洗口剤、ウェットティッシュ、洗顔シート、ボディシート等の形態とすることもできる。
斯かる製剤は、それぞれ一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール類、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、保湿剤、ｐＨ調整剤、色素、香料等とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、斯かる製剤には、必要に応じて、本発明のポリペプチド以外の抗菌剤、植物抽出物、抗炎症剤、清涼剤等を、本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
本発明の抗菌剤は、対象と接触させることにより、該対象上の細菌を死滅させる又は細菌の発生、発育、増殖を抑えることができる。抗菌剤と対象との接触の態様としては、特に限定されないが、例えば、該対象の表面に該抗菌剤を添加、塗布又は噴霧すること、該抗菌剤中に該対象を浸漬すること、該抗菌剤を用いて該対象を洗浄すること、等が挙げられる。対象の例としては、細菌が存在している、細菌が存在している可能性がある、細菌が付着する可能性がある等、抗菌を必要とする上述したヒト、非ヒト動物、それらに由来する検体、物品等が挙げられる。
別の一態様において、本発明は、グリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドの抗菌活性向上方法を提供する。当該方法は、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、下記：
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；並びに
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置、１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を行うことを含む。当該方法における改変の詳細は、上述した本発明のポリペプチドにおける改変と同様である。
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の態様を開示する。
＜１＞配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、下記：
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；並びに
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置、１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を含み、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチド。
＜２＞前記改変が下記：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換；
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＡｓｎへの置換；
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、１７８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失；
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換；並びに
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、１７８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変である、＜１＞記載のポリペプチド。
＜３＞ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置にＨｉｓを有し、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する、＜１＞又は＜２＞記載のポリペプチド。
＜４＞ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置にＡｓｎを有し、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する、＜１＞又は＜２＞記載のポリペプチド。
＜５＞ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置にＳｅｒを有し、１７２位又はこれに相当する位置にＴｒｐを有し、１７３位又はこれに相当する位置にＰｈｅを有し、１７４位又はこれに相当する位置にＴｈｒを有し、１７８位又はこれに相当する位置にＨｉｓを有し、かつ１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する、＜１＞又は＜２＞記載のポリペプチド。
＜６＞ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置にＳｅｒを有し、１７２位又はこれに相当する位置にＴｒｐを有し、１７３位又はこれに相当する位置にＰｈｅを有し、かつ１７４位又はこれに相当する位置にＴｈｒを有し、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する、＜１＞又は＜２＞記載のポリペプチド。
＜７＞ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置にＨｉｓを有し、１７０位又はこれに相当する位置にＳｅｒを有し、１７２位又はこれに相当する位置にＴｒｐを有し、１７３位又はこれに相当する位置にＰｈｅを有し、１７４位又はこれに相当する位置にＴｈｒを有し、１７８位又はこれに相当する位置にＨｉｓを有し、かつ１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失し、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する、＜１＞又は＜２＞記載のポリペプチド。
＜８＞前記配列同一性が９０％以上である、＜１＞～＜７＞のいずれかに記載のポリペプチド。
＜９＞親ポリペプチドと比較して抗菌活性が向上している、＜１＞～＜８＞のいずれかに記載のポリペプチド。
＜１０＞前記抗菌活性がグラム陽性細菌に対する抗菌活性である、＜９＞記載のポリペプチド。
＜１１＞前記抗菌活性がブドウ球菌に対する抗菌活性である、＜９＞又は＜１０＞記載のポリペプチド。
＜１２＞前記抗菌活性が黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性である、＜９＞～＜１１＞のいずれかに記載のポリペプチド。
＜１３＞配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、下記：
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；並びに
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置、１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を行うことを含む、グリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドの製造方法。
＜１４＞前記改変が下記：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換；
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＡｓｎへの置換；
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、１７８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失；
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換；並びに
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、１７８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変である、＜１３＞記載の方法。
＜１５＞＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜１６＞＜１５＞記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜１７＞＜１６＞記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換体。
＜１８＞微生物である、＜１７＞記載の形質転換体。
＜１９＞バチルス属細菌である、＜１７＞又は＜１８＞記載の形質転換体。
＜２０＞＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分とする抗菌剤。
＜２１＞グラム陽性細菌に対する抗菌剤である、＜２０＞記載の抗菌剤。
＜２２＞ブドウ球菌に対する抗菌剤である、＜２０＞又は＜２１＞記載の抗菌剤。
＜２３＞黄色ブドウ球菌に対する抗菌剤である、＜２０＞～＜２２＞のいずれかに記載の抗菌剤。
＜２４＞殺菌剤である、＜２０＞～＜２３＞のいずれかに記載の抗菌剤。
＜２５＞外用剤である、＜２０＞～＜２４＞のいずれかに記載の抗菌剤。
＜２６＞抗菌剤の製造のための、＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
＜２７＞抗菌に用いるための、＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載のポリペプチド。
＜２８＞＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載のポリペプチドを用いる抗菌方法。
＜２９＞抗菌のための、＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
＜３０＞抗菌方法であって、それを必要とする対象と＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載のポリペプチドとを接触させることを含む、方法。
＜３１＞抗菌方法であって、それを必要とする対象と＜２０＞～＜２５＞のいずれかに記載の抗菌剤とを接触させることを含む、方法。
＜３２＞配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、下記：
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；並びに
配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置、１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
からなる群より選択されるいずれかの改変を行うことを含む、グリシン－グリシン活性を有するポリペプチドの抗菌活性向上方法。
＜３３＞前記改変が下記：
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換；
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＡｓｎへの置換；
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、１７８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失；
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換；並びに
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、１７８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
からなる群より選択されるいずれかの改変である、＜３２＞記載の方法。
実施例１ ＢＬＰ変異体の調製
（１）ＢＬＰ変異体発現プラスミドの構築
５’末端にリバースプライマーとの相補配列を１５塩基有し変異配列を含むフォワードプライマー、及び変異配列の直前の塩基を５’末端とするリバースプライマーを変異導入用プライマー対として用いた。国際公開第２０１９／１４２７７３号の実施例１に記載のプラスミドｐＨＹ－ＢＬＰ２を鋳型として、変異導入用プライマー対を使用してＰＣＲを行った。複数断片を連結する場合、それぞれのＰＣＲ産物を用いてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。ＰＣＲ産物又はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を枯草菌にプロトプラスト法により形質転換して目的のＢＬＰ変異体発現プラスミドを保持する形質転換体を取得した。
（２）酵素生産培養
終濃度１５ｐｐｍとなるようにテトラサイクリンを添加したＬＢ培地１ｍＬに（１）で得た形質転換体コロニーを植菌した後、３０℃、１５０ｓｐｍで一晩培養した。翌日、培養液４００μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、２１μＭ ＺｎＳＯ４、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）５ｍＬに植菌し、３０℃、１５０ｓｐｍで２日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収した。
（３）酵素活性の測定
基質として、蛍光基Ｎｍａと消光基Ｌｙｓ（Ｄｐｎ）の間がペンタグリシンであるＦＲＥＴ基質［以下ＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ］（ピーエイチジャパンにて受注生産）を用いた。ここでＮｍａとは２－（Ｎ－メチルアミノ）ベンゾイル（Ｎｍａ）を指す。またＬｙｓ（Ｄｐｎ）とは２，４－ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）をリシン（Ｌｙｓ）の側鎖に有するものを指す。９６穴の黒色プレ－トに酵素溶液（適宣希釈）を２μＬ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を２００μＬ添加し、さらにＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ溶液（１ｍＭ ＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を１０μＬ添加して反応液を調製した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ）を用いて温度３０℃、励起波長３４０ｎｍ、測定波長４４０ｎｍにて反応液の蛍光強度を経時で測定した。同じ反応条件で、酵素溶液の代わりに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧの代わりにＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ１及びＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ２（ペプチド研究所）の等モル溶液を用いた反応液の蛍光強度を測定し、検量線を作成した。１ユニット（Ｕ）の活性は、１μｍｏｌ ＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ１及び１μｍｏｌ ＦＲＥＴＳ－２５－ＳＴＤ２を含む溶液の蛍光強度をＸとしたとき、Ｘ／ｍｉｎの蛍光強度の変化を示すのに必要な酵素量とした。酵素溶液のＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性（Ｕ／ｍＬ）を求めた。
（４）培養上清からの酵素精製
（２）で得た培養上清からＢＬＰ及びその変異体をそれぞれ精製した。培養上清をアミコンウルトラ 分画分子量１０Ｋ（メルクミリポア）を用いて１０ｍＭ クエン酸－Ｎａ ｐＨ６でバッファー交換した。バッファー交換後の液から、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １０Ｓ（ＧＥヘルスケア）を用いて酵素を精製した。まず該バッファー交換で得られた液をＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｇｉｇａｃａｐ ＣＭ－６５０Ｍカラム（東ソー）に通し、次いで溶出バッファー（１０ｍＭ クエン酸－Ｎａ ｐＨ６、２００ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して吸着成分を溶出させた。溶出分画のうち（３）の活性測定方法によってＦＲＥＴ－ＧＧＧＧＧ分解活性が認められた分画液を回収した。回収した分画液をアミコンウルトラ 分画分子量１０Ｋを用いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液でバッファー交換し、ＢＬＰ及びその変異体を含む各酵素溶液を得た。
（５）酵素溶液の濃度測定
酵素溶液の濃度測定にはＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いた。タンパク質量算出のための標準液にはＢＳＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＷＡＫＯ）を用いた。
実施例２ 黄色ブドウ球菌殺菌試験
試験菌としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ６５３８を用いた。ＳＣＤ液体培地はＳＣＤ培地「ダイゴ」，一般細菌検査用（富士フイルム和光純薬）を、ＳＣＤ寒天培地はＳＣＤ寒天培地「ダイゴ」，一般細菌検査用（富士フイルム和光純薬）を、ＬＰ希釈液はＬＰ希釈液「ダイゴ」（富士フイルム和光純薬）を、バッファーとしては２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いた。終濃度０．５ｐｐｍの各酵素を含むバッファーを試験液として用いた。ＳＣＤ液体培地中で３７℃、一晩振盪培養した試験菌を回収してバッファーで洗浄・再懸濁し、１０８－９ＣＦＵ／ｍＬに調製した。各試験液５００μＬに対して菌液を５μＬ添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。試験液をＬＰ希釈液で段階希釈し、１００μＬずつＳＣＤ寒天培地に塗布した。３７℃、２４時間インキュベートした後、コロニーを数えることで試験液１ｍＬ中に含まれる生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を算出した。
野生型ＢＬＰに対して、変異体Ｑ１１６Ｈ、Ｑ１１６Ｎ、Ｙ１７０Ｓ＋Ｙ１７２Ｗ＋Ｙ１７３Ｆ＋Ｖ１７４Ｔ＋Ｐ１７８Ｈ＋Ｎ１７９Δ、及びＹ１７０Ｓ＋Ｙ１７２Ｗ＋Ｙ１７３Ｆ＋Ｖ１７４Ｔでは黄色ブドウ球菌殺菌活性が向上していた（図１）。また、Ｑ１１６ＨとＹ１７０Ｓ＋Ｙ１７２Ｗ＋Ｙ１７３Ｆ＋Ｖ１７４Ｔ＋Ｐ１７８Ｈ＋Ｎ１７９Δの変異を組み合わせることで黄色ブドウ球菌殺菌活性はさらに向上した（図２）。

Claims (8)

  1. 配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、下記：
    配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
    配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；
    配列番号２のアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変；並びに
    配列番号２のアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置、１７０位又はこれに相当する位置、１７２位又はこれに相当する位置、１７３位又はこれに相当する位置、１７４位又はこれに相当する位置、１７８位又はこれに相当する位置、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の改変、
    からなる群より選択されるいずれかの改変を含み、かつグリシン－グリシン結合分解活性を有する、ポリペプチド。
  2. 前記改変が下記：
    配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換；
    配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＡｓｎへの置換；
    配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、１７８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失；
    配列番号２で示されるアミノ酸配列の１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、及び１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換；並びに
    配列番号２で示されるアミノ酸配列の１１６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、１７０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＳｅｒへの置換、１７２位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｒｐへの置換、１７３位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＰｈｅへの置換、１７４位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＴｈｒへの置換、１７８位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基のＨｉｓへの置換、及び１７９位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基の欠失、
    からなる群より選択されるいずれかの改変である、請求項１記載のポリペプチド。
  3. 請求項１又は２記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  4. 請求項３記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
  5. 微生物である、請求項４記載の形質転換体。
  6. 請求項１又は２記載のポリペプチドを有効成分とする抗菌剤。
  7. グラム陽性細菌に対する抗菌剤である、請求項６記載の抗菌剤。
  8. 請求項１又は２記載のポリペプチドを用いる抗菌方法。
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