JP4425515B2 - プロテアーゼ、これに対する遺伝子およびその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、プロテアーゼに関し、さらに詳細には、アラニコラ プロテオリチクス(Aranicola proteolyticus)から由来したプロテアーゼ、前記酵素をコードする遺伝子、前記遺伝子を含む遺伝子発現システム、前記プロテアーゼの精製方法、および前記プロテアーゼの産業的な応用における用途に関する。
(発明の背景)
プロテアーゼはタンパク質またはペプチドにおけるペプチド結合の加水分解に触媒作用をする酵素であって、全ての生命体に存在し多様な生理学的な役割を果たしている。微生物のプロテアーゼの大部分は細胞外に分泌され、炭素源または窒素源によって活性が抑制されるか、活性化される。また、各種微生物プロテアーゼの大部分は、動物または植物に対する病原性微生物にその起源をおいているか、病原性を有している。
【0001】
微生物由来プロテアーゼは温度、至適pH、活性部位の残基などの特性によって多様に区分され、これにより産業的用途も異なるが、例えば、温度に基づいて耐熱性、中温性、高温性に分類され、至適pHに基づいて酸性、弱酸性、中性、または塩基性に分類され、活性部位の残基に基づいてセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼまたはメタロプロテアーゼ(metalloprotease)に分類される。
【0002】
プロテアーゼは活性部位に存在するCa2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+のような金属陽イオンによって酵素活性が調節されるが、ほとんどのプロテアーゼはZn2+を含むタンパク質であって、酵素活性のためにZn2+を必要とする。プロテアーゼの代表的な例には、蚕(Bombyx mori)の腸から分離されたセラチアマルセセンス(Serratia marcescens; ATCC 21074)から産生されるセラペプターゼ(serrapeptase)が挙げられ、該酵素はフィブリン分解能および炎症性ペプチド(inflammatory peptide)であるブラジキニン(bradykinin)、ヒスタミンに対する加水分解能を持っているため消炎剤として使用されることができる。これ以外に、今までクローニングされ特性が知られたバクテリア由来のプロテアーゼには、ビブリオプロテオリチクス(Vibrio proteolyticus;David,V.A.,A.H.Deutch,A.Sloma,D.Pawlyk,A.ally,andD.R.Durham.Gene.112:107−112.1992参照)、エルウィニアクリザンセミB374 prtA(Erwinia chysanthemi B374 prtA;Ghigo,J.M.,andC.Wandersman.Mol.Gene.Genet.236:135−144.1992参照)、シュードモナスアエルギノサLasB(Psudomonas aeruginosa LasB;Doung,F.,A.Lazdunsk,B.Cami,andMurgier.Gene. 121:47−54.1992参照)、セラチアマルセセンスPrtSM(Serratia marcescens PrtSM;Braunagel,S.C.,andM.J.Benedik.Mol.Gen.Genet.222:446−451 1990参照)、バシラスチューリンジエンシス(Bacillus thuringiensis;Lovgren,A.,M.Zhang,A.Engstrom,G.Dalhammar,andR.Landen.Mol.Microbiol.4:2137−3146.1990参照)などから由来したものがある。
(発明の要約)
従来、本発明者らは、韓国産女郎蜘蛛(Nephilia clavata)の腸からタンパク質分解能力のある新規微生物を単離するに成功し、これをアラニコラ プロテオリチクスHY−3(Aranicola proteolyticus HY−3)と命名した(KCTC寄託番号: 0268BP)。つまり、本発明者らは、韓国産女郎蜘蛛(Nephilia clavata)の腸からタンパク質分解酵素生成能があるアラニコラ プロテオリチクス(Aranicola proteolyticus)の菌株を単離および同定し(大韓民国特許公告第10−220091,1999.6.18)、20℃ないし40℃の温度、pH範囲6ないし10で安定であり、51.5kDaの見かけ分子量をもつプロテアーゼを精製することに成功した。しかし、前記公報は形態学的および分類学的観点から前記微生物の同定および特性化に焦点をおいたものであった。本発明者らは、当該微生物およびプロテアーゼに対して研究を重ねた結果、該タンパク質はメタロプロテアーゼ阻害剤によって阻害され、低温および広いpH範囲にかけて、または高い塩濃度下でタンパク質分解効能が著しく増加し、これが遺伝的に修飾された発現系の使用または特定微生物に好適な精製工程によって効率的に得られることを見出した。本発明者らは、また前記プロテアーゼが、例えば消化器の疾患、消化器手術後の消化異常または非正常的疾患を改善するための消化酵素剤、血栓に直接作用してフィブリンを溶解させる血栓溶解剤、および生体内防禦システムとして作用して炎症性物質または壊死組織を除去する消炎酵素、若しくは手術後のまたは外傷後の浮腫を軽減させるための消炎剤として使用され得る薬剤組成物だけでなく、洗剤、化粧品、皮革加工剤、学術研究用化学剤、食品の可溶化または軟化材、肉質改質剤、飼料または食品添加剤、油脂分離剤などの多様な産業的応用範囲を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0003】
従って、本発明の目的は、配列番号2に記載の配列を含むプロテアーゼをコードする新規遺伝子および前記プロテアーゼまたはその機能性等価物を産生し得る突然変異体または変異体を提供することにある。
【0004】
本発明の他の目的は、前記遺伝子;前記プロテアーゼ又はその機能性等価物をコードする遺伝子の突然変異体または変異体;構成プロモーターまたは誘導プロモーター;選択マーカーとして、URA3(オロチジン−5´−リン酸塩 デカルボキシラーゼ)のような栄養欠乏遺伝子またはAp(アンピシリン)耐性遺伝子のような抗生剤耐性遺伝子;及び転写終結因子(ターミネータ)を含む新規発現システム;並びに前記発現システムを有する微生物を提供することにある。
【0005】
本発明のさらに他の目的は、前述の特性を有し、配列番号1のアミノ酸配列を含むプロテアーゼを提供することにある。
【0006】
本発明のさらに他の目的は、
a. アラニコラ プロテオリチクス(Aranicola proteolytocus)を培養培地中で培養する工程;
b. 前記培養培地を濾過して上澄み液を得る工程;および
c. 上澄み液中に含まれたプロテアーゼを樹脂を用いて精製する工程を含む、前記プロテアーゼを精製する方法を提供することにある。
【0007】
本発明のさらに他の目的は、前記プロテアーゼおよびこれに対する遺伝子の産業的な応用、例えば、洗剤、化粧品、皮革加工剤、学術研究用化学剤、食品の可溶化または軟化材、肉質改質剤、飼料または食品添加剤、油脂分離剤などの用途を提供することにある。
【0008】
また、本発明は、有効成分として前記プロテアーゼ、その酵素変異体または突然変異酵素および製薬学上許さされる担体を含む薬剤組成物であって、消化器の疾患、消化異常または消化器手術後の非正常的な疾患を改善するための消化酵素剤;血栓に直接作用してフィブリンを溶解させる血栓溶解剤;及び炎症性物質または壊死組織を除去する消炎酵素で、生体内防禦システムとして、若しくは手術または外傷後の浮腫を軽減させるための消炎剤として作用する消炎酵素;として使用され得る薬剤組成物を提供する。
【0009】
本発明の追加的な目的および利点は後述する明細書の記載から明白になる。
(発明の好適態様)
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【0010】
本発明の一様態において、配列番号2に記載された配列を含むプロテアーゼをコーディングする新規遺伝子と前記プロテアーゼおよび当該プロテアーゼの機能性等価物を産生し得るその突然変異体(mutant)または変異体(variant)を提供する。
【0011】
本発明の遺伝子は添付された配列表の配列番号2のヌクレオチド配列を有し、大きさは2.48kbである。前記遺伝子には1,461個の塩基対からなるORF(開いた読み枠)が存在し、上流に16個の塩基対を介在して−35region(TGTGCA)及び−10region(TATAAT)の特異的塩基配列が存在し、開始コドンの前にリボソーム結合部位として知られたシャイン−ダルガルノ(Shine−Dalgarno;SD)塩基配列が存在する。停止コドンとしてTAAが使用され、下流に転写終結部位と考えられる回文(palindromic)塩基配列が存在する。この遺伝子はアラニコラ プロテオリチクスHY−3から単離される。このアラニコラ プロテオリチクス(Aranicola proteolyticus)HY−3は、1996年8月1日に本願出願人(コレア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー)によってKCTC(Korean Collection for Type Cultures)に受託番号KCTC 0268BPで寄託された。
【0012】
本発明において、「その突然変異体(mutant)または変異体(variant)」という用語は、一つまたは二つ以上の塩基が突然変異、例えば置換、欠失、付加、挿入などによって変化させられたが、なおも前記プロテアーゼまたはその機能性等価物を産生し得る突然変異遺伝子を意味する。従って、当業者であれば前記突然変異体または変異体が本発明の範囲に含まれることが容易に理解できる。一般に、本発明のプロテアーゼおよび遺伝子の場合、約80%以上の相同性をもつ突然変異体または変異体、好ましくは90%以上の相同性をもつ突然変異体または変異体が本発明の範疇に含まれる。
【0013】
本発明の他の様態において、前記プロテアーゼをコードする遺伝子;前記プロテアーゼまたはその機能性等価物を産生し得るその突然変異体または変異体;構成プロモーターまたは誘導プロモーター;選択マーカーとしてURA3(オロチジン−5´−リン酸塩デカルボキシラーゼ)のような栄養欠乏遺伝子またはAp(アンピシリン)耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝子;及び転写終結因子(terminator)を含む新規発現ベクター、並びにこの発現ベクターで形質転換された微生物を提供する。
【0014】
前記プロテアーゼをコーディングする遺伝子を含むベクター系およびその形質転換体は当業者に知られている従来の組換えDNA−技術に基づいて製造され得る。例えば、前記プロテアーゼをコードする配列を含むDNA断片をアラニコラ プロテオリチクスのような野生型菌株から単離し、このDNA断片を好適な発現シグナルとともに適当な調節要素内にクローニングしたのち、得られた媒体(vehicle)を自律的に複製するプラスミド内に又はバクテリアの染色体内に導入させる。
【0015】
このような通常の組換え方法を構成する一連の工程は本質的に当業界で知られており、例えば、文献[マニアチス(Maniatis)らのMolecular Cloning:A Laboratory Manual 8.11−8.13(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]に教示された工程等を採用することにより容易に目的を達成することができる。
【0016】
本発明はさらに他の様態において前述のような特性を有し、配列番号1のアミノ酸配列を含むプロテアーゼおよびその酵素変異体または突然変異酵素を提供する。
【0017】
本明細書で使用された「酵素変異体または突然変異酵素」という用語は、一つまたは複数のアミノ酸が母遺伝子(parental gene)またはその誘導体のDNAヌクレオチド配列の変更によって修飾または変更された、前記プロテアーゼと機能的に同一の酵素を意味する。本発明による好ましいプロテアーゼはアラニコラ プロテオリチクス、例えば、アラニコラ プロテオリチクスHY3−1から誘導し得るが、機能的に同等なプロテアーゼは母遺伝子が誘導された生物体とは本質的に同一でないベクター系および好適な宿主微生物を用いた変異体または突然変異体の形態から得られる。
【0018】
本発明者らは、アラニコラ プロテオリチクスから産生されたプロテアーゼを単離および精製し、その酵素学的特性を調査し、これに対する遺伝子をクローニングし、アミノ酸配列を分析した。その結果、配列番号1に記載されたプロテアーゼのアミノ酸配列はセラチアマルセセンスSM6から誘導されたプロテアーゼのアミノ酸配列と92.6%の類似性を示し、且つ、大部分のメタロプロテアーゼに存在するZn2+結合部位と酵素活性部位のアミノ酸配列がよく保存されていることが見出された。このプロテアーゼの相対活性は、これを同一濃度のメタロプロテアーゼ阻害剤、例えば、EDTAとフェナントロリン(phenanthroline)の存在下で低下した(図1参照)。かかる観察は、本発明のプロテアーゼが活性のためにはZn2+を必要とする亜鉛結合性メタロプロテアーゼ(zinc−binding metalloprotease)であることを裏付けている。なお、このメタロプロテアーゼは、4℃から80℃の範囲内の異なる温度で測定した相対活性の結果によれば、37℃で最大の活性を示し、20℃〜40℃で75%以上の相対的な活性を示した(図2参照)。相異なるpHで基質、アゾカゼインに対して測定した相対活性はpH8.0で最大の活性を表し、pH7.0〜pH9.5で最大活性の80%以上の相対的な活性を表した(図3参照)。該プロテアーゼをSDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル)電気泳動を行った結果、該プロテアーゼのバンドは約51.5kDaの見かけ分子量を有することが分かった。
【0019】
従って、本発明のプロテアーゼは、見かけ分子量が51.5kDaであり、至適活性温度は20℃ないし37℃(pH7.6で)の範囲であり、至適pHは7.0ないし9.5(37℃で)の範囲であり、高塩濃度下で高い活性を保有し、EDTAとフェナントロリン(phenanthroline)などのメタロプロテアーゼによって阻害される特徴を有する。
【0020】
本発明は、さらに他の様態において、
a.アラニコラ プロテオリチクスを培養培地で培養する工程;
b.前記培養培地を濾過して上澄み液を得る工程;および
c.上澄み液内に含まれた前記プロテアーゼを樹脂を用いて精製する工程;を含むプロテアーゼを精製する方法を提供する。
【0021】
本発明の好ましい一実施形態において、本発明のプロテアーゼは炭素源、窒素源および無機塩類を含む適当な栄養培地でアラニコラ プロテオリチクスを培養した後、プロテアーゼを回収することによって産生するか、または例えば、通常の組換えDNA技術を用いて産生することができる。
【0022】
アラニコラ プロテオリチクスHY−3は好気性グラム陰性細菌であり、運動性を有しており、直径が0.5ないし0.8mmの球状であり、その成長反応はカタラーゼ存在下では陽性であり、オキシダーゼ存在下では陰性である。
【0023】
この微生物は他の必須栄養素とともに同化可能な炭素源及び窒素源を含む栄養培地で培養され得るが、培養培地は通常の方法から製造され得る。醗酵ブロスで生成された細胞外プロテアーゼは当業界に知られた通常の方法によって回収および精製することができる。
【0024】
本発明のプロテアーゼを単離するためには、まず、アラニコラ プロテオリチクスを前述の如く培養する。菌体(bacterial pellet)と上澄み液とを分離した後、上澄み液を濃縮する。前記濃縮液を樹脂を用いて精製する。好ましい実施形態においては、この濃縮液は、DEAE−セルロースを用いたイオン交換樹脂(ion exchange resin)とトリス−塩酸緩衝液で前処理したセファデックスG−75を利用したゲル濾過交換樹脂により精製される。最後に、精製したプロテアーゼに保存剤を任意に添加することができる。
【0025】
本発明の他の実施形態において、前記プロテアーゼは、例えば前記プロテアーゼをコードする配列を含有したDNA断片をアラニコラ プロテオリチクスなどの野生型菌株から単離し、これを好適な発現シグナルとともに好適な調節要素内にクローニングした後、得られた媒体(vehicle)を自律的に複製するプラスミド内又はバクテリアの染色体内に導入するというような通常の組換えDNA技術によって産生することができる。次いで、前記バクテリアをプロテアーゼの発現に最適化された培地で培養し、プロテアーゼを前記方法によって培地から回収することによって産生され得る。好ましい宿主有機体はこれに限定されるのではなく、例えばE.coilまたはBacillus属,Aspergillus属,Streptomyces属,またはSaccharomyces属が挙げられる。
【0026】
本発明はさらに他の様態において、例えば消化器の疾患、消化異常、消化器手術後の非正常的な疾患を改善するための消化酵素剤、血栓に直接作用してフィブリンを溶解させる血栓溶解剤、および生体内防禦システムとして作用して炎症性物質または壊死組織を除去する消炎酵素、若しくは手術後または外傷後の浮腫を軽減させるための消炎剤として使用される得る薬剤組成物だけでなく、洗剤、化粧品、皮革加工剤、学術研究用化学剤、食品の可溶化または軟化材、肉質改質剤、飼料または食品添加剤、油脂分離剤などの前記プロテアーゼの応用用途を提供する。
【0027】
本発明によるプロテアーゼのタンパク質加水分解性質は洗剤産業に利用され得る。このプロテアーゼ利用の好ましい実施形態において、本発明は、本発明によるプロテアーゼ、その他の酵素成分および添加剤を含む洗剤組成物を提供する。
【0028】
当業界に知られた酵素成分等はこれらに限定されず、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび/またはこれらの混合物からなる群から選択された一つ以上の酵素を含む。
【0029】
本発明の洗剤組成は一つ以上の界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は陰イオン性、非イオン性、陽イオン性、双性(amphoteric)または両性イオン形態(zwitterionic type)、またはこれらの混合物であってもよい。陰イオン性界面活性剤の代表的な例には、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩(LAS)、アルキル硫酸塩(AS)、αオレフィンスルホン酸塩(AOS)、アルコールエトキシ硫酸塩(AES)および天然脂肪酸のアルカリ金属塩が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、アルキルポリエチレングリコールエーテル、ノニルフェニルポリエチレングリコールエーテル、スクロースとグルコースの脂肪酸エステル、およびポリエトキシル化アルキルグルコシドのエステルが挙げられる。
【0030】
また、本発明の洗剤組成物はビルダー、漂白剤、漂白活性剤(bleach activator)、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、染み−再沈着防止剤(soil−redeposition agent)、香水、酵素および漂白剤の安定化剤、剤型補助剤、蛍光増白剤、発泡ブースタ、キレート化剤、充填剤、織物柔軟剤などのような当業界で公知の他の洗剤成分をさらに含むことができる。
【0031】
本発明の洗剤組成物は粉末、液状などの任意の便利な形態に剤型化されることができる。
【0032】
本発明のプロテアーゼは、公知の洗剤プロテアーゼを含む別の添加剤を添加することによって、または他の洗剤酵素を含有する複合添加剤を添加することによって洗剤組成物中に含まれ得る。
【0033】
本発明の添加剤は粉末顆粒、液体、スラリー等に剤型化することができる。好ましい洗剤添加剤の剤型は非撒布性顆粒、液体、特に安定化した液体、スラリーまたは保護された酵素である。非撒布性顆粒は、例えば英国特許公報第1,362,365号、または米国特許第4,106,991号によって製造してもよく、当業界で公知の方法によって任意にコーティングしてもよい。洗剤用酵素は顆粒化の前または後に混合し得る。液体酵素製剤は、例えばプロピレングリコールなどのポリオール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸などを確立された方法に従って添加することにより安定化され得る。その他の酵素安定化剤は当業界でよく知られている。保護された酵素は欧州特許公報第238,216号に記載された方法に従って製造することができる。有用な一実施形態において本発明のプロテアーゼは、例えば欧州特許公報第342,177号、第368,575号、第378,261号および第378,262号による洗剤剤型に組み入れてもよい。
【0034】
本発明のさらに他の好ましい実施形態において、本発明は、有効成分として本発明のプロテアーゼ、その酵素変異体または突然変異酵素および薬学上許される担体を含む薬剤組成物を提供する。
【0035】
本発明の薬剤組成物は、消化器の疾患、消化異常、消化器手術後の異常疾患を改善するための消化酵素剤、血栓に直接作用してフィブリンを溶解させる血栓溶解剤、および外来の毒性物質が侵入すると、生体内防禦システムとして作用して炎症性物質または壊死組織を除去する消炎酵素、若しくは手術後または外傷後の浮腫を軽減させるための消炎剤として使用することができ、当業者は前述のような疾病、状態および異常に悩んでいるものと推定される個人等を標準診断技術を用いて容易に把握することができる。
【0036】
本発明による薬剤組成物は本発明のプロテアーゼと混合された薬学上許される担体を含む。薬学的剤型は周知であり、前記プロテアーゼを含む薬剤組成物は当業者によって容易に剤型化し得る。プロテアーゼの投与モードは該プロテアーゼが伝達される生体部位を決定することができる。非経口投与の場合、例えば静脈内、皮下、筋肉内などに投与することができ、静脈内投与が好ましい経路である。これらは他の溶質、例えば十分量の塩、グルコースまたはデキストロースを含んだ溶液を等張溶液とするように滅菌水溶液の形態で使用することが最もよい。経口投与モードにおいて、本発明のプロテアーゼは錠剤、カプセル剤、口内錠(lozenges)、トローチ剤、粉剤、シラップ剤、エリクシル剤、水溶液および懸濁液などの形態で使用され得る。澱粉などの種々の崩解剤、および潤滑剤を使用してもよい。カプセル型の経口投与のために有用な希釈剤はラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコール類である。水性懸濁液が経口用に要求される場合、特定甘味剤および/または香味剤を添加してもよい。その他の好適な製薬学的担体は当該分野で標準参考文献であるRemington’s Pharmaceutical Sciences,A.Osolに記載されており、これは本明細書で参考として引用される。
【0037】
有効成分、プロテアーゼの濃度は約10μg〜100mg/体重kg/日である。しかし、当業者は特定試薬の薬物動力学的特性とその投与モードおよび経路、受容者の年齢、健康、体重、症状の性質および程度、同時治療の種類、治療の頻度および目的とする効果などの公知の要因によって投与量が変化することは理解し得るだろう。Gennaro,Alfonso,ed.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition,1990,Mack Publishing Co.,Easton Pa参照。
【0038】
本発明は、さらに他の好ましい実施形態において本発明のプロテアーゼおよび/または酸性緩衝液、酸性プロテアーゼまたは無機酸と、化粧品として許される担体、ビヒクルまたは賦形剤を同時に含む化粧品組成物を提供する。
【0039】
酸性緩衝液の化粧品として許される担体、ビヒクルまたは賦形剤成分は製薬学的剤型に使用されるローション、チンキ剤、クリーム、エマルジョン、ゲル、軟膏、水、水作用性クリーム、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、セルロース、親水性アクリル系重合体、皮膚軟化薬、皮膚湿潤化成分、酵素安定化剤、グリセロール、界面活性剤、保存剤、親水性濃化剤およびこれらの混合物からなる群から選択される。酸性プロテアーゼは真菌性プロテアーゼ、細菌性プロテアーゼまたは哺乳類プロテアーゼまたはこれらの混合物からなる群から選択されるか、またはペプシン、カテプシン、人間尿酸プロテアーゼ、リゾプスペプシン(rhizopuspepsine)、ペニシロペプシン、エンドチアペプシン(endothiapepsine)またはこれらの混合物からなる群から選択される。無機酸の代表的な例はリン酸、ピロリン酸、三リン酸、ポリリン酸、重硫酸ナトリウム、重硫酸カリウムまたはこれらの混合物からなる群から選択される。
【0040】
また、本発明のプロテアーゼはさらに他の好ましい実施形態において皮革製品の加工剤として使用することができる。従って、本発明によって無水有機溶液を使用する皮革工業用として特に好適な液体酵素製剤または組成物を提供することが可能である。
【0041】
プロテアーゼの使用は皮革製造工程の大部分を占めており、以下に、皮革加工産業に関する本発明のプロテアーゼの用途を、さらに詳細に説明する。
【0042】
皮革製品の製造のために、原材料は浸漬工程(soaking process)、石灰工程(liming porcess)、脱灰工程(deliming process)、戻し工程(bating process)、酸洗い工程(pickling process)、なめし工程(tanning process)、染色工程(dyeing process)、乾燥工程(drying process)および仕上げ工程(finishing process)を経る。これらの工程のうちプロテアーゼは、脱灰工程および戻し工程で使用される。脱灰工程および戻し工程では、皮革のコラーゲンタンパク質を破壊させないように調節した状態で中和処理した後、酸処理する工程を含んでいる。換言すると、脱毛処理された裸皮を、脱灰および戻し工程を経ずに酸洗い工程やなめし工程に直接進行すると、皮革を構成する各種タンパク質の致命的な損傷または変性を招く恐れがある。
【0043】
脱灰工程では製革において不要である皮革成分をプロテアーゼ分解によって除去し、戻し工程では、脱灰工程だけでは皮革の繊維組織を弛緩させるのが不十分であるため、酵素処理によって皮革に柔軟性と伸長力を付与する。プロテアーゼの作用が最も重要であると考えられるのは、この戻し工程である。
【0044】
プロテアーゼは、石灰酸洗い工程を通して部分的な加水分解を受けた後にもまだ裸皮中に残存する表皮細胞、毛根、汗腺(glandulae)、カルシウム石鹸、乳化脂肪等を消化および溶出させ、脱毛処理された裸皮の表面を清浄にし、滑らかにする。また、余計な各種タンパク質を消化して溶出させ、エラスチン繊維やレチクリン繊維にある程度作用してその物理化学的性質を変化させる。
【0045】
プロテアーゼの学術研究用途は特定目的によって各種実施形態を考慮することができる。例えば、DNA単離および精製工程において余計なタンパク質を除去するのに用いることができる。また、アミノ酸配列化などのタンパク質化学を伴う研究に使用されることもできる。
【0046】
【実施例】
以下、本発明を下記の実施例に基づいてさらに詳細に説明するものの、本発明はこれらの実施例に制限されるのではない。
【0047】
実施例1:プロテアーゼの産生
本発明のプロテアーゼを精製するために、アラニコラ プロテオリチクスHY−3を培養培地(バクトトリプトン0.5%、酵母抽出物0.5%、塩化ナトリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、塩化カルシウム0.02%、塩化マグネシウム0.02%)で22℃に18時間培養した。2μmメンブレンフィルターを用いて培養液から上澄み液を分離した後、これを10kDaのメンブレンフィルターを用いて濃縮した。本発明のプロテアーゼは基本的に陰イオンタンパク質の特性を有しているので、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.6)で前処理したDEAE−セルロースを利用したイオン交換樹脂、続いて20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.6)に前処理したセファデックスG−75を利用したゲル濾過交換樹脂を用いてプロテアーゼを精製した。次いで、このようにして精製された酵素液を10%SDS−PAGEで分析してバンドパターンを同定した。その結果、本発明のプロテアーゼは約51.5kDaの見かけ分子量を有する単量体であることが分かった。
【0048】
実施例2:本発明のプロテアーゼおよびその遺伝子の配列決定
実施例1で得られたプロテアーゼの部分的なアミノ酸配列をアミノ酸配列分析機(Precise Protein Sequencing System,Applied Biosystems)を用いて分析した。このようにして得られたアミノ酸配列の配列番号3(Ala Glu Gln Gln Gln Gln Ala)と配列番号4(Ile Gly His Ala Leu Gly)で表される配列を基づいて、配列番号5(順方向 プライマー、gcggaacagc agcagcaggc)および配列番号6(逆方向プライマー、gcccaacgca tggccaat)をデザインした。合成プライマーを使用して、鋳型としてアラニコラ プロテオリチクスHY−3から精製されたゲノミックDNA(genomic DNA)の存在下でPCRを行った。その結果、2.48kbのDNA断片が得られ、PCR生成物の配列を決定した。この決定された配列を基にして、配列番号7(ataatggccg ggacgatcct ggctgtagtt ac)、配列番号8(cttacgcctt cctgccgaac accatttatc ag)で表されるPCRプライマーをデザインした。合成されたプライマーを使用して鋳型としてアラニコラ プロテオリチクスHY−3から精製されたgenomic DNAの存在下で逆PCR(reverse PCR)を行った。
【0049】
本発明の遺伝子は、添付された配列表の配列番号2に表したヌクレオチド配列を有し、そのサイズは2.48kbであった。前記遺伝子には1,461個の塩基対からなるORF(開いた読み枠)を有しており、上流に16個の塩基対を介在して−35region(TGTGCA)と−10region(TATAAT)の塩基配列が存在し、開始コドンの前にリボソーム結合部位として知られているシャイン−ダルガルノ(SD)塩基配列が存在する。停止コドンとしてはTAAが用いられており、下流に転写終結部位と予想される回文塩基配列が存在することが確認された。
【0050】
配列番号1で表された前記プロテアーゼのアミノ酸配列はセラチアマルセセンス(Serratia marcescens)SM6由来のプロテアーゼのアミノ酸配列と92.6%の類似性を表した。また、大部分のメタロプロテアーゼに存在するZn2+結合部位と酵素活性部位のアミノ酸配列はよく保存されていることがわかった。
【0051】
実施例3:新規なプロテアーゼの酵素学的特性に対する試験
(1)プロテアーゼに対するプロテアーゼ阻害剤の効果
プロテアーゼの酵素活性はブラウンおよびシュミッツの方法(Braun,V.&Schmitz,G.,Arch.Microbiol.124,55−61,1980)によって測定した。アゾカゼイン(azocasein)0.24gを50mMリン酸塩緩衝溶液(pH7.5)10mlに溶かして基質溶液を調製し、基質溶液300μlと細胞培養液100μlを混合して37℃で30分間反応させた。この反応液に10%三塩化酢酸(trichloride acetate)300μlを添加し常温で1時間インキュベートした。前記反応用液を7,000rpmに遠心分離した後、ペレットと上澄み液を分離した。上澄み液300μlに10%水酸化ナトリウム30μlを添加し、420nmで吸光度を測定した。酵素の力価は吸光度値が1.0倍増加するとき1単位(unit)と定義した。
【0052】
前記プロテアーゼに対するプロテアーゼ阻害剤の効果を調べるために、酵素液を、後述する各々の阻害剤1mMを添加して37℃で5分間インキュベーションして相対的な酵素活性を測定した。試験された阻害剤は、アミノペプチダーゼ阻害剤であるアントパイン(antopain)、メタロエンドペプチダーゼ(metalloendopeptidase)の阻害剤であるホスホラミドン(phosphoramidon)、アスパルテートプロテアーゼ(aspartate protease)阻害剤であるペプスタチン(pepstatin)、トリプシン阻害剤であるアンチパイン二塩化水素(antipain dihydrochloride)、システイン阻害剤であるE−64(L−trans−exoxysuccinyl leucylleucylamido(4−fuanidino)butane)、キモトリプシン阻害剤であるキモスタチン(chymostatin)、セリンプロテアーゼ阻害剤であるロイペプチン、ペファブロックSC (pefabloc SC)、アプロチニン(aprotinin)、PMSF、メタロプロテアーゼの阻害剤であるEDTAおよびフェナントロリンを含む。その結果、EDTAは約30%まで酵素活性を阻害し、フェナントロリンは約70%まで酵素活性を阻害した(図1参照)。
【0053】
(2)塩のプロテアーゼに対する効果
プロテアーゼの活性に対する塩の効果を調べるために、0〜1700mMまでの範囲で種々の濃度の塩化ナトリウム溶液の存在下で酵素液を37℃で4時間前処理をした後、相対的な酵素活性を測定した。相対活性は実施例3(1)に記載された方法によって測定した。比較のために、セラチアマルセセンスSM6由来のプロテアーゼを対照群として使用した。結果を表1に示す。
【0054】
【表1】
【0055】
表1において、本発明のプロテアーゼの相対活性は塩濃度に比例して約1.3ないし2.0倍増加した。
【0056】
(3)プロテアーゼの活性および安定性に対する熱の効果
本発明のプロテアーゼの活性および安定性に対する熱の効果を調べるために、相対酵素活性を4℃〜80℃の温度範囲で測定した。活性の測定は実施例3(1)に記載された方法によって施した。その結果を表2に示す。
【0057】
【表2】
【0058】
表2において、最大活性は約37℃で表れたけれども、プロテアーゼの最大活性の約半分が4〜15℃の低温でも保持された(図2参照)。さらに、アウレニウスの活性化エネルギーを温度に対してプロットしたときの傾きを示す「Ea値」(アゾカゼインの加水分解)は4℃ないし37℃の範囲の温度で2,432Kcal/moleであった。これらの結果から前記酵素が低温で強い活性を有することが分かる。
【0059】
(4)プロテアーゼの活性および安定性に対するpHの効果
本発明のプロテアーゼのpH−依存性を調べるために、本発明者らは、相異なる pHで各種基質溶液を調製した。各基質溶液は夫々クエン酸−リン酸塩緩衝液(pH3.0〜7.0)、リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0〜9.0)、トリス−HCl緩衝液(pH7.0〜10.0)、グリシン−苛性ソーダ緩衝液(pH9.0〜12.0)に溶かした。相対的なプロテアーゼ活性は、酵素を前記各基質溶液と37℃で30分間反応させた後測定した。相対的プロテアーゼ活性は、実施例3(1)に記載された方法によって測定した。結果を表3に示す。
【0060】
【表3】
【0061】
表3において、最大活性はpH8.0で得られた。pH7.0〜9.5では最大活性の80%以上、pH5.0〜12.0では最大活性の70%以上の相対活性を示すことが確認された(図3参照)。
【0062】
(5)プロテアーゼの種々の基質に対する活性
前記酵素の各種基質に対する分解能を調べるために、アルブミン、カゼイン、コラーゲン、エラスチン、及びヘモグロビンを基質として使用して、酵素反応を行わせた。アルブミンを24時間反応させた後の分解能を100とした場合、2時間程度反応をさせた場合に、ヘモグロビン以外の全ての基質が20〜30の分解能を示した。24時間後、ヘモグロビンを含む全ての基質で45以上の相対的な活性を示した。このような結果は本発明のプロテアーゼが種々の基質に対して広いスペクトルを示し、このことは本発明の酵素の産業的利用可能性を意味する。
【0063】
実施例4:薬剤の調製
剤型の形態(錠剤)
プロテアーゼ 50mg
ラクトース 80mg
でんぷん 17mg
ステアリン酸マグネシウム 3mg
結晶性セルロース 10mg
本実施例は、上記の組成例を有する錠剤の有効成分として本発明のプロテアーゼを使用した例を表している。前記錠剤は通常の方法によって製造した。前記錠剤の好ましい形態は、通常の腸溶性被覆(例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート)、糖コーティングまたはフィルムコーティングである。
【0064】
実施例5:プロテアーゼの皮革産業への応用
適当な寸法に裁断した原料皮革20gおよび蒸留水14mlを50mL試験管中で混合した。次いで、ここに皮革重量を基準として0.5%重亜硫酸ナトリウム、0.5%硫酸アンモニウムを添加して26℃で15分間インキュベートした。次いで再び0.2%の洗剤、0.5%の脱灰剤を添加した後、各々30分および1時間反応させ、皮革から溶出されたタンパク質量を測定した。プロテアーゼ0.5%存在下、30分および60分後にそれぞれ1054mg/mL、1062mg/mLタンパク質が溶出した。プロテアーゼの不在下、30分および60分後にそれぞれ304.5mg/mL、329.5mg/mLのタンパク質が溶出した。このような結果は前記プロテアーゼの皮革加工産業における利用可能性を意味する。
【0065】
【発明の効果】
本発明のプロテアーゼは高い塩濃度下、広範囲のpHで、安定な酵素活性を有する。従って、これは、例えば医薬組成物だけでなく洗剤、化粧品、皮革加工剤、学術研究用化学剤、食品の可溶化または軟化材、肉質改質剤、飼料または食品添加剤、油脂分離剤などの多様な産業的応用範囲を有する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 各種阻害剤によるアラニコラ プロテオリチクスから誘導したプロテアーゼの阻害効果を表すグラフである。ここで、プロテアーゼは基質としてアゾカゼインを使用して実施例1に記載された方法によって製造される。
【図2】 アラニコラ プロテオリチクスから産生されたプロテアーゼの熱に対する安定性を表すグラフである。ここで、プロテアーゼは基質としてアゾカゼインを使用して実施例1に記載された方法によって製造される。
【図3】 異なるpHによるプロテアーゼの活性および安定性を表すグラフである。ここで、プロテアーゼは基質としてアゾカゼインを使用して実施例1に記載された方法によって製造される。
【図4】 本発明のプロテアーゼをコードするDNA配列およびこのタンパク質の対応アミノ酸配列を表す図である。
Claims (22)
- 配列番号1に記載されたアミノ酸配列を含むプロテアーゼ。
- 受託番号KCTC 0268BPで寄託されたアラニコラ プロテオリチクス(Aranicola proteolyticus)HY−3から単離されたことを特徴とする請求項1に記載のプロテアーゼ。
- 活性部位に金属性陽イオン結合部位を有するメタロプロテアーゼ(metalloprotease)であることを特徴とする請求項1又は2に記載のプロテアーゼ。
- 20℃ないし40℃の温度およびpH6ないし10で最適の活性を示すことを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載のプロテアーゼ。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載のプロテアーゼをコードする遺伝子。
- 配列番号2に記載された塩基配列を含むことを特徴とする請求項5に記載の遺伝子。
- 請求項5又は6に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
- 請求項7に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換させて製造された形質転換宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、受託番号KCTC 0268BPで寄託されたアラニコラ プロテオリチクス(Aranicola proteolyticus)HY−3であることを特徴とする請求項8に記載の形質転換宿主細胞。
- 下記工程を含む請求項1ないし4のいずれか1項に記載のプロテアーゼを精製する方法:
a)受託番号KCTC 0268BPで寄託されたアラニコラ プロテオリチクス(Aranicola proteolyticus)HY−3を培養培地中で培養する工程;
b)前記培養培地を濾過して上澄み液を得る工程;および
c)前記上澄み液からプロテアーゼを樹脂を用いて精製する工程。 - 前記樹脂がイオン交換樹脂および/またはゲル濾過交換樹脂であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- イオン交換樹脂はトリス−塩酸緩衝液で前処理したDEAE−セルロース(DEAE−cellulose)であることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- ゲル濾過交換樹脂はトリス−塩酸緩衝液で前処理したセファデックスG−75であることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載のプロテアーゼを含む洗剤組成物。
- さらにアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび/またはこれらの混合物よりなる群から選択される一つ以上の酵素を含むことを特徴とする請求項14に記載の洗剤組成物。
- 非撒布性顆粒、液体、特に安定化した液体、スラリーまたは保護された酵素の形態であることを特徴とする請求項14又は15に記載の洗剤組成物。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載のプロテアーゼおよび化粧品として許容される担体、ビヒクルまたは賦形剤を含む化粧品組成物。
- さらにアミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび/またはこれらの混合物よりなる群から選択される一つ以上の酵素を含むことを特徴とする請求項17に記載の化粧品組成物。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載のプロテアーゼを含む皮革加工剤。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載のプロテアーゼを含む食品添加剤。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載のプロテアーゼを含む飼料添加剤。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載のプロテアーゼを含む油脂分離剤。
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