CN117813317A - 改良的芽孢杆菌生产宿主 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于提高生物化合物生产的芽孢杆菌宿主细胞。具体来说，本发明涉及一种具有遗传修饰的芽孢杆菌宿主，所述遗传修饰导致生物膜组分的产量减少和磷酸化DegU的水平增加。所述芽孢杆菌宿主包含至少一个用于产生化合物的基因表达盒，其具有与启动子可操作地连接的编码至少一种感兴趣的多肽的多核苷酸。本发明还涉及一种基于培养本发明的细菌宿主细胞来增加至少一种感兴趣的多肽产量的方法。

Description

改良的芽孢杆菌生产宿主

技术领域

本发明涉及一种用于提高生物化合物产量的芽孢杆菌(Bacillus)宿主细胞。具体来说，本发明涉及一种具有遗传修饰的芽孢杆菌宿主，所述遗传修饰导致生物膜组分的产量减少和磷酸化DegU的水平增加。所述芽孢杆菌宿主包含用于产生化合物的至少一个基因表达盒，其具有与启动子可操作地连接的编码至少一种感兴趣的多肽的多核苷酸。本发明还涉及一种基于培养本发明的细菌宿主细胞来增加至少一种感兴趣的多肽产量的方法。

背景技术

芽孢杆菌属的微生物被广泛用作工业劳动力，用于生产有价值的化合物，如化学品、聚合物和蛋白，特别是蛋白，如洗涤和/或清洁活性酶或者用于饲料和食品应用的酶。这些有用物质的生物技术生产是通过这样的芽孢杆菌的发酵和随后的产物纯化来进行的。芽孢杆菌能够将大量蛋白分泌至发酵液中。与细胞内生产相比，这允许简单的产品纯化过程，并且解释了芽孢杆菌在工业应用中的成功。

芽孢杆菌属的革兰氏阳性微生物已进化出细胞分化、适应和存活机制，以应对不断变化的环境条件，如高温、干旱、水分过剩、营养限制。芽孢杆菌细胞的时空不同分化提供了一种生存策略，单个细胞执行不同的功能，如能力发育和群集运动、生物膜形成、胞外降解酶的产生以及合成抗生素和芽孢。这些分化过程通过复杂的细胞间信号传导网络进行调节，并通过细胞内信号转导级联进行整合，最终导致分化的基因表达。

在不同的细胞调节子系统中，DegS-DegU双组分系统控制枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和相关芽孢杆菌的各种细胞过程。事实上，反应调节子DegU及其同源的传感器激酶DegS控制着100多个基因的表达(U.,Homuth,G.；2002；Molecular Geneticsand Genomics,268(4),455-467)。因此，DegU的磷酸化状态以及细胞内磷酸化DegU(DegU-P)的总体水平决定了差异基因表达(Verhamme,/>T.；Nicola R.；2007；In:Molecularmicrobiology 65(2),S.554–568)。遗传能力的发展需要未磷酸化的DegU，这是由degSU操纵子从位于操纵子上游的启动子的基础表达提供的。低水平的DegU-P激活运动所需基因的表达，而中等水平的DegU-P诱导生物膜形成，DegU-P控制bslA、yvcA和合成多聚γ-谷氨酸的pga操纵子的表达。最后，高水平的DegU-P导致胞外酶产生增强，同时抑制低水平DegU-P激活的细胞过程，包括生物膜形成(Msadek T,Dedonder R；1990；JBacteriol 172(2):824–834；Verhamme,/>T.；Nicola R.；2007；In:Molecular microbiology 65(2),S.554–568)。通过紧接degU基因上游的启动子激活DegU-P正反馈环来实现胞外酶产生所需的DegU-P水平。

除DegS外，DegU的磷酸化状态还受DegQ、DegR、RapG和PhrG的影响。DegQ和DegR分别通过增强DegS激酶活性和稳定DegU-P来促进高水平的DegU-P(Amory,A.,Kunst,F.,Aubert,E.,Klier,A.,&Rapoport,G；(1987)；Journal of bacteriology,169(1),324-333.；Mukai,K.；Tanaka,T.；1992；Journal of bacteriology 174(24),S.7954–7962。

相反，反应调节子天冬氨酸磷酸酶RapG通过与DegU-P的DNA结合结构域相互作用来控制DegU-P活性，从而阻止DegU-P与其靶启动子结合，而PhrG与RapG的结合则抵消了这种相互作用(Ogura,M.,Shimane,K.,Asai,K.,Ogasawara,N.,&Tanaka,T.；2003；In:Molecular microbiology,49(6),1685-1697.)。

导致遗传能力降低和胞外酶分泌增强的几个突变被定位到编码DegS/DegU系统组分的基因上。这些所谓的“hy”(超)突变包括但不限于degU32(DegU-H12L)、degU31(DegU-V131L)、degS100(DegS V236M)、degS200(DegS-G218E)、degS-S76D(DegS-S76D)和degQ36等位基因(Amory,A.,Kunst,F.,Aubert,E.,Klier,A.,&Rapoport,G；(1987)；Journal ofbacteriology,169(1),324-333.；Msadek T,Dedonder R；1990；J Bacteriol172(2):824–834)。degU32等位基因编码更稳定的DegU-P变体，导致更高水平的DegU-P，从而增强胞外酶表达(Msadek T,Dedonder R；1990；J Bacteriol 172(2):824–834)。类似地，由于DegS(hy)蛋白的磷酸酶活性降低，degS200等位基因导致更高的DegU-P水平(Tanaka T,Kawata M,Mukai K；1991；J Bacteriol.173(17):5507–5515.)。与导致各自蛋白内氨基酸变化的degU32和degS200不同，在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中描述的突变degQ36编码degQ36启动子-10框内的C->T突变，代表未驯化的芽孢杆菌菌株(US5264350)中实际的野生型degQ等位基因。由于驯化，特别是筛选高可转化性(遗传能力)，degQ表达减少的菌株进化，导致转化效率提高但胞外酶产量降低。因此，degQ36代表在驯化菌株中发现的degQ等位基因的反向突变(McLoon,Anna L；Losick,Richard；2011；Journal of bacteriology 193(8),S.2027–2034。

此外，已经在枯草芽孢杆菌中描述了degQ基因的过量表达以增强细胞外酶的产量(US5017477,US5264350)。

芽孢杆菌生物膜的特征在于形成基质胞外多糖(多聚N-乙酰葡糖胺)和淀粉样蛋白TasA。由yuaB基因编码的BslA蛋白(也称作疏水蛋白)构成防水表面层，覆盖含有生物膜的菌落并促进复杂的菌落形态。

芽孢杆菌中的生物膜形成需要表达用于TasA蛋白生产和加工的操纵子tapA-sipW-tasA以及表达用于Eps(胞外多糖)合成和加工的epsA-O操纵子(Branda,Steven S.；Kolter,Roberto；2006；Molecular microbiology 59(4),S.1229–1238。tapA-sipW-tasA和epsA-O的表达受到复杂的调控，包括受到全局调节子SinR、转录阻遏物AbrB、抗阻遏蛋白SinI和SlrA以及调节子SlrR(原Slr)的控制(Kobayashi,Kazuo,2008；Molecularmicrobiology 69(6),S.1399–1410)。

全局调节子SinR作为负调节子抑制两种生物膜操纵子的表达。调节子SinI和SlrA通过与SinR结合并形成无活性的SinI/SinR和SlrA/SinR异源复合物来控制SinR阻遏。但是，SinI和SlrA在拮抗SinR中的作用以及功能重叠的程度还知之甚少(Kobayashi,Kazuo；2008；Molecular microbiology 69(6),S.1399–1410)。SlrR作为两种生物膜操纵子的转录激活物，并且slrR表达受SinR的负调控。AbrB负调控tapA-sipW-tasA操纵子的转录。abrB和sinR的表达受磷酸化Spo0A主调节子丰度的控制。编码BslA蛋白的yuaB基因的表达受磷酸化转录激活物DegU的调控。

只有有限数量的研究在芽孢杆菌菌株优化的背景下分析了生物膜形成，以增加化合物的产量。显示slrR的失活导致枯草芽孢杆菌中蛋白酶生产率的增加(WO2003083125)，然而epsA-O操纵子的失活(yveF-yveK；WO2003083125)在相同的培养条件下没有导致蛋白酶生产率的增加。与此相反，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)菌株2709中epsAO操纵子的缺失导致蛋白酶活性增加1.2倍，其中aprE蛋白酶基因在启动子PaprE的控制下(Zhou,C.,Li,D.；Microb Cell Fact19,45(2020)。与epsA-O操纵子缺失时增强的蛋白酶表达相反，位于epsA-O操纵子内的epsE基因的过量表达导致PaprE的活性更高(Cairns,Lynne S.；Stanley-Wall,Nicola R.；2013；Molecular microbiology 90(1),S.6–21)。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中tasA基因的失活减少表膜形成中的生物膜形成，但对淀粉酶或果聚糖蔗糖酶(SacB)生产率没有积极影响(Feng,Jun；Gao,Weixia；2015；Scientific reports 5,S.13814)。另一项研究表明，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中epsA-O操纵子的失活导致转化效率增加(WO 14/205096)。

更有趣的是，尽管TasA和Eps是芽孢杆菌生物膜基质的主要组分，但是tapA-sipW-tasA和epsA-O的转录并不受DegU-P的直接控制。相反，高水平的DegUP通过调节疏水外壳蛋白BslA，脂蛋白YvcA和参与多聚γ-谷氨酸(pga)产生的基因，即ywsC(pgsB)、ywtA(pgsC)、ywtB(pgsA)、ywtC(pgsE)的转录来促进生物膜形成(Stanley and Lazazzera；2005；Molecular microbiology 57(4),S.1143–1158；Verhamme,T.；Nicola R.；2007；In:Molecular microbiology 65(2),S.554–568))。相反，高水平的DegU-P抑制tapA-sipW-tasA和epsA-O操纵子的表达(Marlow,Victoria L.；Stanley-Wall,Nicola R.；2014；Journal of bacteriology 196(1),S.16–27)。

因此，生物膜形成的作用以及DegS-DegU双组分调节系统对化合物生产的影响仍然难以捉摸。为了通过重组生产宿主高水平生产化合物，需要具有降低的分化潜能并优化用于重组生产的遗传修饰的芽孢杆菌细胞。

现在仍然需要宿主细胞允许增强的感兴趣的多肽的生产，优选具有增加的纯度。

发明内容

在本发明的研究中发现，具有i)导致生物膜组分如胞外聚合物质(EPS)和/或TasA的产生减少的遗传修饰以及ii)导致磷酸化DegU的水平增加的遗传修饰的芽孢杆菌宿主细胞允许在所述宿主细胞中有效产生至少一种感兴趣的多肽，例如胞外酶。

因此，本发明涉及一种修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其包含

i)与对照细胞相比，减少胞外聚合物质(EPS)的量的遗传修饰和/或减少生物膜胞外基质组分TasA的量的遗传修饰，以及

ii)与对照细胞相比，增加磷酸化的DegU的量的遗传修饰。

在一实施方案中，减少胞外聚合物质(EPS)的量的遗传修饰是减少epsA-O操纵子表达的遗传修饰。

在一实施方案中，减少生物膜胞外基质组分TasA的量的遗传修饰是减少tapA-sipW-tasA操纵子表达的遗传修饰。

在一优选实施方案中，减少胞外聚合物质(EPS)的量的遗传修饰和/或减少生物膜胞外基质组分TasA的量的遗传修饰选自

a)使tapA-sipW-tasA操纵子失活的遗传修饰，

b)使epsA-O操纵子失活的遗传修饰，

c)使激活物基因remA失活的遗传修饰，

d)使激活物基因remB失活的遗传修饰，以及

e)使slrA基因失活的遗传修饰。

在一优选实施方案中，使tapA-sipW-tasA操纵子失活的遗传修饰是tapA-sipW-tasA操纵子或其一部分的缺失。

在一优选实施方案中，使epsA-O操纵子失活的遗传修饰是epsA-O操纵子或其一部分的缺失。

在一优选实施方案中，使激活物基因remA失活的遗传修饰是remA基因的缺失或错义突变，优选错义突变。

在一优选实施方案中，使激活物基因remB失活的遗传修饰是remB基因的缺失或错义突变，优选错义突变。

在另一优选实施方案中，使激活物基因remA和remB失活，优选通过remA和/或remB基因的错义突变，优选导致相应蛋白中的一个或多个非保守氨基酸取代。

在一优选实施方案中，使slrA基因失活的遗传修饰是所述基因或其一部分的缺失。

在本发明的修饰的宿主细胞的优选实施方案中，增加磷酸化的DegU的量的遗传修饰是选自以下的遗传修饰

u1)导致选自degU、degS、degQ和degR的至少一种基因表达增加的遗传修饰，

u2)导致rapG基因表达减少或phrG基因表达增加的遗传修饰，

u3)稳定DegU磷酸化状态的遗传修饰，如degU32突变，

u4)增加DegS蛋白自磷酸化活性的遗传修饰，如DegS-S76D突变，和/或

u5)降低DegS蛋白磷酸酶活性的遗传修饰，如degS200突变。

在本发明的修饰的宿主细胞的优选实施方案中，增加磷酸化的DegU的量的遗传修饰是degU32突变。因此，宿主细胞包含所述突变。优选地，degU32基因在degU基因的天然启动子的控制下表达。或者或额外地，degQ基因可以过量表达，例如通过引入和表达degQ的额外的拷贝。

在本发明的修饰的宿主细胞的优选实施方案中，增加磷酸化的DegU的量的遗传修饰是导致degQ表达增加的突变，如在宿主细胞中引入和表达degQ基因的额外的拷贝。

在本发明的修饰的宿主细胞的优选实施方案中，所述宿主细胞属于物种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、解淀粉芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、地衣芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌(Bacillusparalicheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))、漠海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、球芽孢杆菌(Bacillus globigii)或枯草芽孢杆菌。例如，所述宿主细胞属于短小芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。

在本发明的修饰的宿主细胞的优选实施方案中，所述宿主细胞包含感兴趣的多肽的表达盒。优选地，所述感兴趣的多肽是酶，如胞外酶(即，由细胞分泌到发酵液中的酶)。优选地，所述酶是异源酶。例如，所述酶选自淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、葡糖淀粉酶、核酸酶、半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶和纤维素酶。

本发明进一步涉及一种生产感兴趣的多肽的方法，包括

a)提供本发明的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，

b)在允许表达感兴趣的多肽的条件下培养宿主细胞，以及

c)任选地，从培养基分离感兴趣的多肽。

在本发明的方法的一实施方案中，步骤b)中的培养以补料分批培养进行。

附图说明

图1：DegSU双组分系统。芽孢杆菌中DegS-DegU双组分调节系统的模型。根据其磷酸化程度，DegU-P促进运动、生物膜形成和胞外酶产生，同时抑制由低水平DegU-P控制的表型。未磷酸化的DegU是发展遗传能力所需要的。DegU-P水平的增加由包括“P”的灰色圆圈的大小表示。DegU的磷酸化由传感器激酶DegS进行。此外，DegU的磷酸化状态还受DegQ、DegR、RapG和PhrG的影响。DegQ和DegR分别通过增强DegS激酶活性和稳定DegU-P来促进高水平的DegU-P。相反，反应调节子天冬氨酸磷酸酶RapG通过与DegU-P的DNA结合结构域相互作用来控制DegU-P活性，从而阻止degU-P与其靶启动子结合，而PhrG与RapG的结合则抵消了这种相互作用。

图2：来自所示芽孢杆菌的degQ基因5’区内启动子序列的比对。示出相对于翻译起始密码子的核苷酸位置-61至-119。序列编号相对于枯草芽孢杆菌的启动子序列。示出核心启动子区的-35框和-10框。在-10框内示出驯化的枯草芽孢杆菌菌株168的C到T转变。

图3：不同地衣芽孢杆菌菌株的蛋白酶生产率。

将地衣芽孢杆菌菌株M409设置为100％(灰/黑格子设计)，在补料分批培养的72h时间点，针对所示地衣芽孢杆菌菌株绘制相对蛋白酶活性百分比。与地衣芽孢杆菌M409相比，阴性对照菌株地衣芽孢杆菌菌株M309缺少整合到pga基因座中的蛋白酶BLAP表达盒。示出携带野生型degU(灰色)或degU32等位基因(深灰色)的地衣芽孢杆菌突变体的蛋白酶活性。引入两个菌株背景中的任何一个的突变在相应菌株编号旁边标注为“关键突变”。

图4：不同地衣芽孢杆菌菌株的蛋白酶生产率。

将地衣芽孢杆菌菌株PC36设置为100％(灰色设计)，在补料分批培养的72h时间点，针对所示地衣芽孢杆菌菌株绘制相对蛋白酶活性百分比。携带degQ基因的额外的拷贝的地衣芽孢杆菌突变体的蛋白酶活性，该基因在整合到cat基因座中的强组成型启动子的控制下(灰色/白色设计)。额外引入菌株背景中的突变在相应菌株编号旁边标注为“关键突变”。

图5：模拟补料分批培养72h后，来自地衣芽孢杆菌菌株的上清液的SDS-PAGE。

1-3＝对照菌株；4＝ForD缺失菌株；5-7＝DegQ过量表达菌株；

DegQ的过量表达导致ForD从胞外蛋白质组中丢失；

M＝Precision Plus Protein Standard，具有指示大小(kDa)的所选条带；实心箭头突出了ForD蛋白条带。

图6：模拟补料分批培养72h后，来自地衣芽孢杆菌蛋白酶表达菌株的上清液的SDS-PAGE。

1-3＝对照菌株；4＝ForD缺失菌株；5-7＝DegQ过量表达菌株；DegQ的过量表达导致ForD从胞外蛋白质组中丢失；M＝Precision Plus Protein Standard，具有指示大小(kDa)的所选条带；实心箭头突出了ForD蛋白条带；空心箭头表示异源蛋白酶。

表A包含可以按照本发明进行修饰的基因的概述。该表包含关于基因功能/活性的信息。进一步包括枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌基因的序列，以及由所述基因编码的多肽。

发明详述

应当理解，如在说明书和权利要求书中所用，“一个(a)”或“一个(an)”可以表示一个或多个，这取决于其使用的上下文。因此，例如，提到“一个细胞”可以表示可以使用至少一个细胞。

此外，应当理解，如本文所用的术语“至少一个”表示可以按照本发明使用该术语后面提到的一个或多个项目。例如，如果该术语表示应当使用至少一种进料溶液，这可以理解为一种进料溶液或一种以上的进料溶液，即两种、三种、四种、五种或任何其他数量的进料溶液。根据该术语所指的项目，技术人员理解该术语可能指的上限(如果有的话)。

如本文所用的术语“约”表示对于所述术语之后列举的任何数字，存在区间精度，在该区间内可以实现技术效果。因此，如本文提到的约优选是指精确数值或所述精确数值±20％左右的范围，优选±15％，更优选±10％，甚至更优选±5％。

如本文所用的术语“包含”不应当理解为限制意义。该术语表示可能存在比实际提到的项目更多的项目，例如，如果它是指包含某些步骤的方法，则不应当排除其他步骤的存在。然而，术语“包含”还涵盖仅存在所提到的项目的实施方案，即它在“由…组成”的意义上具有限制性含义。

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用，是指任何长度的聚合无支化形式的核苷酸，通常是脱氧核糖核苷酸。术语“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指任何长度的聚合形式的氨基酸，通过肽键连接在一起。

术语“编码(coding for)”和“编码(encoding)”在本文中可互换使用。通常，这些术语是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的特性，用作合成其他大分子的模板，如确定的氨基酸序列。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该基因编码蛋白。

术语“失活”基因优选表示与对照细胞中的表达相比，基因的表达降低。优选地，与对照细胞中的相应表达相比，本发明的细菌宿主细胞中基因的表达降低至少40％，如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。更优选地，所述表达降低至少95％。更优选地，其降低100％，即完全消除。

本文提到的基因失活可以通过任何被认为合适的方法来实现。在一实施方案中，通过突变，即通过突变基因，使基因失活。优选地，所述突变是缺失，缺失所述基因。

如本文所用，基因的“缺失”是指整个编码序列的缺失、部分编码序列的缺失或包括侧翼区在内的编码序列的缺失。最终结果是缺失的基因实际上是无功能的。简单地说，“缺失”定义为核苷酸或氨基酸序列的变化，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基分别被去除(即，不存在)。因此，缺失菌株比各自的野生型生物体具有更少的核苷酸或氨基酸。

在芽孢杆菌中产生染色体基因缺失、取代、突变的方法在本领域中是已知的。WO03083125和Kostner等人(Kostner D,Ehrenreich A.Microbiology(Reading).2017Nov；163(11))给出了通过同源重组使基因失活的实例，或者通过如WO2020206202和WO2020206197所述的CRISPR/Cas技术。

此外，可以通过基因沉默使基因失活。基因沉默可以通过引入所述细菌宿主细胞反义表达构建体来实现，所述构建体导致与基因mRNA互补的反义RNA，从而抑制所述基因的表达。或者，可以通过CRISPR-抑制机制阻断转录起始或转录延伸来抑制所述基因的表达。

引入宿主细胞的一些遗传修饰会导致基因表达增加，如degU、degS、degQ和/或degR。增加基因或基因产物表达的方法在本领域中已有很好的记录，包括例如由适当启动子驱动的过量表达。在一些实施方案中，通过将基因引入宿主细胞并表达(在合适的启动子控制下)来实现增加的表达。例如，通过将degQ基因引入宿主细胞并表达所述degQ基因来实现degQ的表达增加。因此，引入degQ的额外的拷贝。

此外，可以通过在基因的适当位置(通常在上游)引入作为启动子的分离核酸来实现核酸的表达增加，从而上调核酸编码基因的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代在体内改变内源启动子，或者可以将分离的启动子以适当的方向和与核酸编码序列的距离引入宿主细胞，以增加基因的表达。

宿主细胞

根据本发明的术语“宿主细胞”是指细菌细胞。在一优选实施方案中，所述宿主细胞属于芽孢杆菌属。例如，所述宿主细胞可以是短小芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲醇芽孢杆菌、球芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌宿主细胞。

在一优选实施方案中，所述宿主细胞是地衣芽孢杆菌宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是地衣芽孢杆菌菌株ATCC14580的宿主细胞(与DSM13相同，参见Veith et al."Thecomplete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13,an organism withgreat industrial potential."J.Mol.Microbiol.Biotechnol.(2004)7:204-211)。

在另一优选实施方案中，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是枯草芽孢杆菌菌株NCIB 3610的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞优选不是degQ表达水平降低的枯草芽孢杆菌宿主细胞，其中枯草芽孢杆菌宿主细胞在相对于deqQ基因的翻译起始密码子的-85位处不包含突变T到C，如枯草芽孢杆菌168中。优选地，所述枯草芽孢杆菌宿主细胞不是枯草芽孢杆菌168。

在另一优选实施方案中，所述宿主细胞是贝莱斯芽孢杆菌宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是贝莱斯芽孢杆菌菌株FZB42的宿主细胞。

在另一优选实施方案中，所述宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是解淀粉芽孢杆菌菌株XH7的宿主细胞。

在另一优选实施方案中，所述宿主细胞是短小芽孢杆菌宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是短小芽孢杆菌菌株DSM27的宿主细胞。

在另一优选实施方案中，所述宿主细胞是迟缓芽孢杆菌宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是迟缓芽孢杆菌菌株DSM9的宿主细胞。

在另一优选实施方案中，所述宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是嗜碱芽孢杆菌菌株ATCC27647的宿主细胞。

在另一优选实施方案中，所述宿主细胞是甲醇芽孢杆菌宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是甲醇芽孢杆菌菌株PB1(DSM16454)或甲醇芽孢杆菌菌株MGA3(ATCC53907)的宿主细胞。

本发明的芽孢杆菌宿主细胞应当是修饰的宿主细胞。具体地，所述宿主应当包含

i)至少一种(即一种或多于一种)导致生物膜组分的产生减少(与对照细胞相比)的遗传修饰，以及

ii)至少一种(即一种或多于一种)导致磷酸化的DegU的水平增加(与对照细胞相比)的遗传修饰。

术语“增加”和“增强”在本文中可互换使用，在应用的意义上应指增加，优选至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。

术语“减少”和“降低”在本文中可互换使用，在应用的意义上应指降低，优选至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，基因产物的水平或其活性降低100％。因此，活性被完全消除。

优选地，增加或减少是相对于对照细胞。如本文提到的“对照细胞”是不携带相应修饰的同一物种的对照细胞，优选其与宿主细胞的不同之处仅在于不携带相应修饰。因此，对照细胞是未修饰的细胞，如野生型细胞，即未修饰的野生型细胞，优选地衣芽孢杆菌细胞，其不携带相应修饰。优选地，对照细胞是地衣芽孢杆菌细胞，其与宿主细胞的不同之处仅在于不携带相应修饰。

Formosin D(ForD,SEQ ID NO:215)是一种细菌素，由地衣芽孢杆菌产生，但不由枯草芽孢杆菌产生。在本发明的研究中已经表明，DegQ的过量表达导致ForD从胞外蛋白质组中丢失。因此，DegQ在地衣芽孢杆菌中的过量表达也会允许获得高纯度的感兴趣的多肽。由于DegQ过量表达导致磷酸化DegU水平升高，导致磷酸化DegU水平升高的其他遗传修饰也可能导致更高的纯度。

因此，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌，优选包含减少的Formosin D(ForD，细菌素)编码基因表达，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。优选地，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞不包含内源forD基因的修饰，即，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞仍然包含未修饰的内源forD基因。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的Formosin D蛋白编码基因表达，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，其中Formosin D蛋白由与SEQ ID NO:214具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性的序列编码。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的Formosin D蛋白编码基因表达，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，其中Formosin D蛋白与SEQ ID NO:215具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的Formosin D蛋白编码基因表达，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，其中Formosin D蛋白与SEQ ID NO:215具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性。

因此，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌产生纯度更高的感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。因此，优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌包含纯度更高的感兴趣的化合物，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌产生感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽，且Formosin D(ForD)的量减少，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞产生感兴趣的化合物，优选感兴趣的多肽，且Formosin D(ForD)蛋白的量减少，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，其中Formosin D蛋白与SEQ ID NO:215具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性。

优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌包含增加的感兴趣的化合物产量，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。优选地，本文所述的修饰的地衣芽孢杆菌包含增加的感兴趣的化合物纯度，优选Formosin D的量减少，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比，并且包含增加的感兴趣的化合物产量，优选与不包含本文所述修饰的地衣芽孢杆菌对照细胞相比。

导致磷酸化的DegU的水平升高的遗传修饰

宿主细胞应当包含至少一个(即一个或多个)遗传修饰，其导致磷酸化的DegU的水平升高。“磷酸化的DegU”在本文中也称作DegU-P。

优选地，增加磷酸化的DegU的量的遗传修饰是选自以下的遗传修饰

u1)导致选自degU、degS、degQ和degR的至少一种基因表达增加的遗传修饰，

u2)导致rapG基因表达减少或phrG基因表达增加的遗传修饰，

u3)稳定DegU磷酸化状态的遗传修饰，如degU32突变，

u4)增加DegS蛋白自磷酸化活性的遗传修饰，如DegS-S76D突变，和/或

u5)降低DegS蛋白磷酸酶活性的遗传修饰，如degS200突变。

转录调节蛋白DegU是双组分调节系统DegS/DegU的成员，其在过渡生长阶段发挥重要作用。DegU蛋白在本领域是众所周知的。优选地，DegU蛋白是芽孢杆菌DegU-蛋白。

在一实施方案中，DegU蛋白来自地衣芽孢杆菌(或其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:173所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:169所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:173至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

在一实施方案中，DegU蛋白来自枯草芽孢杆菌(或其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:163所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:159所示序列的多核苷酸编码)。术语“变体”在本文其他地方有定义。通常，变体包含与SEQ ID NO:163至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

优选地，DegU蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:173所示的序列或其变体。

如本文所用的术语“磷酸化的DegU”优选是指在对应于SEQ ID NO:163的56位或SEQ ID NO:173的56位的位置磷酸化的DegU蛋白。

可以优选通过DegS/DegU双组分调节系统中的突变来增加DegU-P的量。

在一实施方案中，可以通过遗传修饰来增加DegU-P的量，所述遗传修饰导致degU(或其变体)、degS(或其变体)、degQ(或其变体)或degR(或其变体)的表达增加。术语“DegU”已在上文中定义。

DegS是信号转导组氨酸-蛋白激酶/磷酸酶。该激酶在过渡生长阶段发挥重要作用，并且参与控制不同细胞功能的表达。该蛋白既是一种蛋白激酶，发生自磷酸化，又将磷酸转移至DegU。

在一实施方案中，DegS蛋白来自地衣芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:172所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:168所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:172至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

在一实施方案中，DegS蛋白来自枯草芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:162所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:158所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:162至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

优选地，DegS蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:172所示的序列或其变体。

DegQ是一种降解酶调节蛋白，其刺激磷酸-DegS向DegU的磷酸转移。

在一实施方案中，DegQ蛋白来自地衣芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:170所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:166所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:170至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

在一实施方案中，DegQ蛋白来自枯草芽孢杆菌(或其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:160所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:156所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:160至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

优选地，DegQ蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:170所示的序列或其变体。

DegR是稳定DegU磷酸化形式的调节蛋白。通常，这种稳定有助于磷酸化的DegU的水平升高，并且导致胞外酶如碱性蛋白酶和中性蛋白酶的产量增加。

在一实施方案中，DegR蛋白来自地衣芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:171所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:167所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:171至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

在一实施方案中，DegR蛋白来自枯草芽孢杆菌(或其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:161所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:157所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:161至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

优选地，DegR蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:171所示的序列或其变体。

在另一实施方案中，通过稳定DegU磷酸化状态的遗传修饰如degU32突变增加DegU-P的量。degU32突变，也称作DegU H12L过度磷酸化突变体，在本领域是众所周知的。该突变体包含H12L取代，即12位的氨基酸组氨酸被亮氨酸取代。degU32突变在本文中也称作“DegU H12L突变”。可以通过使用如实施例部分所述的CRISPR-Cas9技术引入该突变。

在一实施方案中，degU32突变多肽包含如SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列，或是其变体。语“变体”在本文其他地方有定义。通常，变体包含与SEQ ID NO:165至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。应当理解所述变体包含H12L取代。

在另一实施方案中，degU32突变多肽包含如SEQ ID NO:175所示的氨基酸序列，或是其变体。通常，变体包含与SEQ ID NO:175至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。应当理解所述变体包含H12L取代。

优选地，degU32突变多肽包含如SEQ ID NO:175所示的氨基酸序列，或是其变体。

优选地，degU32突变多肽在修饰的宿主细胞中表达。这可以通过在宿主细胞中引入和表达编码degU32突变多肽(或其变体)来实现。优选地，将多核苷酸与合适的启动子可操作地连接。术语“启动子”在本文其他地方有定义。还优选地，将degU32突变引入染色体degU基因，使得degU32基因在天然degS/degU操纵子及其转录和翻译调节中表达。这可以例如通过使用CRISPR-Cas9技术来实现。

如上所示，增加磷酸化DegU的量的突变也可以是导致rapG表达减少或phrG表达增加的突变。

在一实施方案中，RapG蛋白来自地衣芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:153所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:130所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:153至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

在一实施方案中，RapG蛋白来自枯草芽孢杆菌(或其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:107所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:84所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:107至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

优选地，RapG蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:153所示的序列或其变体。

在一实施方案中，PhrG肽来自地衣芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:152所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:129所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:152至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

在一实施方案中，PhrG肽来自枯草芽孢杆菌(或是其变体)。所述蛋白具有如SEQID NO:106所示的序列(并且由包含如SEQ ID NO:83所示序列的多核苷酸编码)。通常，变体包含与SEQ ID NO:106至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

优选地，PhrG蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:152所示的序列或其变体。

如上所示，增加磷酸化DegU的量的突变也可以是增加DegS蛋白自磷酸化活性的遗传修饰，如DegS-X76D，优选DegS-S76D突变。

DegS-X76D突变体包含X76D取代，即根据SEQ ID NO:172的编号在76位取代为天冬氨酸，优选根据SEQ ID NO:172的编号在DegS蛋白的76位氨基酸处用天冬氨酸取代第76位的氨基酸丝氨酸。在一实施方案中，DegS-X76D突变多肽包含如SEQ ID NO:164或174所示的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:174，或是其变体。通常，变体包含与SEQ ID NO:164或174，优选SEQ ID NO:174至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。应当理解所述变体包含X76D取代，优选S76D取代。优选地，突变多肽在修饰的宿主细胞中表达。这可以通过在宿主细胞中引入和表达编码突变多肽(或其变体)来实现。优选地，将多核苷酸与合适的启动子可操作地连接。

如上所示，增加磷酸化的DegU的量的突变也可以是减少DegS蛋白磷酸酶活性的遗传修饰，如degS200突变。DegS已在上文中定义。

degS200突变，也称作DegS-X218E突变体，包含X218E，优选G218E取代，即根据SEQID NO:172的编号在218位取代为谷氨酸，优选根据SEQ ID NO:172的编号在DegS蛋白的218位用谷氨酸取代氨基酸甘氨酸。在一实施方案中，DegS-G218E突变多肽包含如SEQ ID NO:185或186所示的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:186，或是其变体。通常，变体包含与SEQ IDNO:185或186，优选SEQ ID NO:186至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。应当理解所述变体包含X218E取代，优选G218E取代。在本发明的范围内应当理解，氨基酸交换X218D，优选G218D，会导致相同的效果。优选地，突变多肽在修饰的宿主细胞中表达。这可以通过在宿主细胞中引入和表达编码突变多肽(或其变体)来实现。优选地，将多核苷酸与合适的启动子可操作地连接。

在一实施方案中，宿主细胞包含两个增加磷酸化的DegU的量的遗传修饰。例如，宿主细胞包含导致degQ表达增加的遗传修饰和degU32突变。

导致胞外聚合物质(EPS)和/或TasA水平降低的遗传修饰

与对照细胞相比，如本文所示的宿主细胞应当包含减少胞外聚合物质(EPS)的量的突变和/或减少生物膜胞外基质组分TasA的量的突变。

细菌胞外聚合物质(EPS)是为了应对自然环境中遇到的生理胁迫而释放的分子。胞外聚合物质是胞外基质的结构组分，生物膜形成过程中细胞被嵌入其中。

TasA多肽是生物膜基质的主要组分。它形成淀粉样纤维。

在一实施方案中，TasA多肽是枯草芽孢杆菌TasA多肽(或其变体)。

在一实施方案中，TasA多肽是地衣芽孢杆菌TasA多肽(或其变体)。地衣芽孢杆菌TasA多肽包含如SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列。它由包含如SEQ ID NO:128所示的核酸序列的多核苷酸编码。通常，变体包含与SEQ ID NO:151至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

枯草芽孢杆菌TasA多肽包含如SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列。它由包含如SEQID NO:82所示的核酸序列的多核苷酸编码。通常，变体包含与SEQ ID NO:105至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

优选地，TasA蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:151所示的序列或其变体。

优选地，减少生物膜胞外基质组分TasA的量的突变是导致tapA-sipW-tasA操纵子表达减少的突变。所述表达减少可以通过使tapA-sipW-tasA操纵子或其一部分失活来实现。例如，可以使tapA-sipW-tasA操纵子或其一部分缺失。操纵子的一部分可以是tasA基因、sipW基因或tapA基因。上述基因/多肽的核酸序列以及氨基酸序列如表A所示(对于地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)。

优选地，减少胞外聚合物质(EPS)的量的突变是导致epsA-O操纵子表达减少的突变。epsA-O操纵子包含以下基因：epsA、epsB、epsC、epsD、epsE、epsF、epsG、epsH、epsI、epsJ、epsK、epsL、epsM、epsN和epsO。上述基因/多肽的核酸序列以及氨基酸序列如表A所示(对于地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)。优选地，使epsA-O操纵子失活的突变是epsA-O操纵子或其一部分的缺失。在一些实施方案中，选自epsA、epsB、epsC、epsD、epsE、epsF、epsG、epsH、epsI、epsJ、epsK、epsL、epsM、epsN和epsO的至少一个基因缺失。优选地，选自epsA、epsB、epsC、epsD、epsE、epsF、epsG、epsH、epsI、epsJ、epsK、epsL、epsM、epsN和epsO的至少一个基因缺失。更优选地，选自epsD、epsE、epsK、epsM和epsN的至少一个基因缺失。更优选地，至少epsE基因缺失。

更优选地，上述基因中的至少6个基因，即选自epsA、epsB、epsC、epsD、epsE、epsF、epsG、epsH、epsI、epsJ、epsK、epsL、epsM、epsN和epsO的至少6个基因缺失(优选地，所述至少6个基因中的至少一个是epsE基因)。

在一些实施方案中，整个epsA-O操纵子缺失。

或者或额外地，导致胞外聚合物质(EPS)和/或TasA水平降低的遗传修饰可以是使基因remA失活的突变。因此，设想使所述基因失活。在不受理论束缚的情况下，发明人认为，芽孢杆菌宿主细胞中RemA蛋白功能的降低导致由芽孢杆菌宿主细胞产生的感兴趣的化合物产量增加。因此，优选地，宿主包含改变的RemA蛋白，优选其中RemA蛋白的改变会导致RemA介导的转录激活的丧失。优选地，RemA蛋白的改变会导致RemA蛋白的DNA结合亲和力降低。例如，可以使所述基因或其一部分缺失，以便使蛋白失活。上述基因/多肽的核酸序列以及氨基酸序列如表A所示，对于地衣芽孢杆菌(氨基酸序列SEQ ID NO:154)和枯草芽孢杆菌(氨基酸序列SEQ ID NO:108)。

或者或额外地，导致胞外聚合物质(EPS)和/或TasA水平降低的遗传修饰可以是使基因remB失活的突变。因此，设想使所述基因失活。例如，可以使所述基因或其一部分缺失。上述基因/多肽的核酸序列以及氨基酸序列如表A所示(对于地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)。

在一实施方案中，RemA多肽是地衣芽孢杆菌RemA多肽(或其变体)。

地衣芽孢杆菌RemA多肽包含如SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列。它由包含如SEQID NO:131所示的核酸序列的多核苷酸编码。通常，变体包含与SEQ ID NO:154至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

枯草芽孢杆菌RemA多肽包含如SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列。它由包含如SEQID NO:85所示的核酸序列的多核苷酸编码。通常，变体包含与SEQ ID NO:108至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

优选地，RemA蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:154所示的序列或其变体。

在一实施方案中，RemB多肽是地衣芽孢杆菌RemB多肽(或其变体)。地衣芽孢杆菌RemB多肽包含如SEQ ID NO:207所示的氨基酸序列。它由包含如SEQ ID NO:206所示的核酸序列的多核苷酸编码。通常，变体包含与SEQ ID NO:207至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

枯草芽孢杆菌RemB多肽包含如SEQ ID NO:205所示的氨基酸序列。它由包含如SEQID NO:204所示的核酸序列的多核苷酸编码。通常，变体包含与SEQ ID NO:205至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同的氨基酸序列。

优选地，RemB蛋白来自地衣芽孢杆菌，优选具有如SEQ ID NO:207所示的序列或其变体。

在一实施方案中，RemA蛋白的改变是由编码RemA蛋白的基因中的一个或多个点突变引起的。优选地，编码RemA蛋白的基因中的一个或多个点突变选自错义突变、无义突变和移码突变。优选地，编码RemA蛋白的基因中的一个或多个点突变是一个或多个错义突变。优选地，remA基因中的一个或多个点突变导致芽孢杆菌宿主细胞中RemA蛋白的失活。

优选地，编码RemA蛋白的基因中的一个或多个错义点突变位于编码RemA蛋白中保守氨基酸的位置。蛋白中的保守氨基酸位置也可以描述为IC值等于或大于2.0的位置。如本文所用的IC(信息量)值是计算值R_Sequence(l)，如Schneider,T.D.；Stephens,R.M.Sequence Logos:ANew Way to Display Consensus Sequences.Nucleic AcidsRes.1990,18(20),6097–6100所述，使用氨基酸序列的20种状态。优选地，编码RemA蛋白的基因中的一个或多个错义点突变位于编码SEQ ID NO:154的保守氨基酸的位置，IC值等于或大于2.0，优选等于或大于2.5，更优选等于或大于3.0，或者甚至更优选等于或大于3.2，最优选等于或大于3.5。优选地，编码RemA蛋白的基因中的一个或多个错义点突变位于编码SEQ ID NO:154的保守氨基酸位置的位置，IC值等于或大于3.2，最优选等于或大于3.5。

优选地，编码RemA蛋白的基因中的一个或多个点突变导致RemA蛋白中的非保守氨基酸取代(如本文定义，参见，例如，表10)。因此，优选改变的RemA蛋白包含一个或多个非保守氨基酸交换。优选改变的RemA蛋白包含一个或多个非保守氨基酸交换，其导致芽孢杆菌细胞中RemA蛋白的功能降低。优选改变的RemA蛋白包含一个或多个非保守氨基酸交换，其导致芽孢杆菌细胞中RemA蛋白的失活。优选地，编码RemA蛋白的基因中的一个或多个点突变导致SEQ ID NO:154的保守氨基酸位置上的非保守氨基酸取代，优选失活取代，IC值等于或大于2.0，优选等于或大于2.5，更优选等于或大于3.0，或者甚至更优选等于或大于3.2，最优选等于或大于3.5。优选地，编码RemA蛋白的基因中的一个或多个错义点突变位于编码SEQ ID NO:154的保守氨基酸位置的位置，IC值等于或大于3.2，最优选地等于或大于3.5。优选地，编码RemA蛋白的基因中的一个或多个点突变导致SEQ ID NO:154的保守氨基酸位置上的非保守氨基酸取代，优选如表10所示，优选失活取代，IC值等于或大于3.0，或者甚至更优选等于或大于3.2，最优选等于或大于3.5。

优选地，编码RemA蛋白的基因中的一个或多个点突变导致对应于SEQ ID NO:154的氨基酸位置5-77的一个或多个氨基酸位置上的非保守氨基酸取代，优选失活取代，优选在对应于选自SEQ ID NO:154的I8、G9、F10、G11、N12、R18、S27、P29、K31、R32、D45、T47、G49、R50、T52、D59、L65、S66、T72和R76的氨基酸位置的一个或多个氨基酸位置，最优选在选自对应于SEQ ID NO:154的R18和P29的氨基酸位置的一个或多个氨基酸位置。优选改变的RemA蛋白包含SEQ ID NO:154的氨基酸位置R18和P29上的取代X18W和X29S中的至少一个。优选改变的RemA蛋白包含SEQ IDNO:154的氨基酸位置R18和P29上的取代X18W和X29S。

术语“对应于氨基酸位置的氨基酸位置”，后面是某些氨基酸位置，以SEQ ID NO:154的编号或残基和编号表示，应当表示在提到特定RemA蛋白中的某些氨基酸位置时，与SEQ ID NO:154进行序列比对，并且使用SEQ ID NO:154在某个氨基酸位置上的氨基酸编号作为参考(即，根据SEQ ID NO:154的编号)。

优选地，改变的RemA蛋白包含与SEQ ID NO:154或108具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同性的氨基酸序列。优选地，改变的RemA蛋白包含与SEQ ID NO:154或108，优选SEQ ID NO:154具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同性的氨基酸序列。

优选地，改变的RemA蛋白包含与SEQ ID NO:154或108，优选SEQ ID NO:154具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同性的氨基酸序列，以及一个或多个氨基酸取代，优选一个或多个非保守氨基酸取代，优选失活取代，在对应于SEQ ID NO:154的氨基酸位置5-77的一个或多个氨基酸位置，优选在对应于选自SEQ ID NO:154的I8、G9、F10、G11、N12、R18、S27、P29、K31、R32、D45、T47、G49、R50、T52、D59、L65、S66、T72和R76的氨基酸位置的一个或多个氨基酸位置，最优选在选自对应于SEQ ID NO:154的R18和P29的氨基酸位置的一个或多个，优选两个氨基酸位置。优选地，改变的RemA蛋白包含与SEQ ID NO:154具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同性的氨基酸序列以及一个或多个非保守氨基酸取代，优选失活取代，在对应于SEQ ID NO:154的氨基酸位置5-77的一个或多个氨基酸位置，优选在对应于选自SEQ ID NO:154的I8、G9、F10、G11、N12、R18、S27、P29、K31、R32、D45、T47、G49、R50、T52、D59、L65、S66、T72和R76的氨基酸位置的一个或多个氨基酸位置，最优选在选自对应于SEQ ID NO:154的R18和P29的氨基酸位置的一个或多个氨基酸位置。优选改变的RemA蛋白包含SEQ ID NO:154的氨基酸位置R18和P29上的取代X18W和X29S中的至少一个。优选改变的RemA蛋白包含SEQ ID NO:154的氨基酸位置R18和P29上的取代X18W和X29S。优选地，改变的RemA蛋白包含与SEQ ID NO:154具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但少于100％相同性的氨基酸序列，并且包含SEQ ID NO:154的氨基酸位置R18和P29上的取代R18W和P29S中的至少一个，优选两个。

或者地或额外地，导致胞外聚合物质(EPS)和/或TasA水平降低的遗传修饰可以是使slrA基因失活的突变。因此，设想使所述基因失活。例如，可以使所述基因或其一部分缺失。或者，使slrA基因失活的突变是slrA基因的错义突变。上述基因/多肽的核酸序列以及氨基酸序列如表A所示(对于地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：DegU H12L突变以及remA或remB，优选remA错义突变。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：DegU H12L突变和使slrA基因失活的突变(如slrA基因的缺失)。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：DegU H12L突变，和使epsA-O操纵子失活的突变(如epsA-O操纵子或其一部分的缺失)。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：DegU H12L突变，和使tapA-sipW-tasA操纵子失活的突变(如tapA-sipW-tasA操纵子或其一部分的缺失)。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：DegU H12L突变，使epsA-O操纵子失活的突变(如epsA-O操纵子或其一部分的缺失)和使tapA-sipW-tasA操纵子失活的突变(如tapA-sipW-tasA操纵子或其一部分的缺失)。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：DegU H12L突变，导致degQ表达增加的突变(如引入和表达degQ基因的额外的拷贝)和使epsA-O操纵子失活突变的突变(如epsA-O操纵子或其一部分的缺失)。所述宿主细胞可以包含一种或多种进一步的修饰，如本文所述的使tapA-sipW-tasA操纵子失活的修饰、remA修饰、remB修饰和/或slrA修饰。优选地，所述宿主细胞可以包含一种或多种进一步的修饰，如本文所述的使tapA-sipW-tasA操纵子失活的修饰、remA修饰和/或slrA修饰。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：DegU H12L突变，和使tapA-sipW-tasA操纵子失活的突变(如tapA-sipW-tasA操纵子或其一部分的缺失)。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：DegU H12L突变，导致degQ表达增加的突变(如引入和表达degQ基因的额外的拷贝)和使tapA-sipW-tasA操纵子失活突变的突变(如tapA-sipW-tasA操纵子或其一部分的缺失)。所述宿主细胞可以包含一种或多种进一步的修饰，如本文所述的使tapA-sipW-tasA操纵子、epsA-O操纵子失活的修饰、remA修饰、remB修饰和/或slrA修饰。优选地，所述宿主细胞可以包含一种或多种进一步的修饰，如本文所述的使tapA-sipW-tasA操纵子、epsA-O操纵子失活的修饰、remA修饰和/或slrA修饰。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：导致degQ表达增加的突变(如引入和表达degQ基因的额外的拷贝)，以及remA或remB错义突变。优选地，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：导致degQ表达增加的突变(如引入和表达degQ基因的额外的拷贝)和remA错义突变。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：导致degQ表达增加的突变(如引入和表达degQ基因的额外的拷贝)，使epsA-O操纵子失活的突变(如epsA-O操纵子或其一部分的缺失)，使tapA-sipW-tasA操纵子失活的突变(如tapA-sipW-tasA操纵子或其一部分的缺失)。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：导致degQ表达增加的突变(如引入和表达degQ的额外的拷贝)和使epsA-O操纵子失活突变的突变(如epsA-O操纵子或其一部分的缺失)。

在一优选实施方案中，本发明的宿主细胞至少包含以下修饰：导致degQ表达增加的突变(如引入和表达degQ的额外的拷贝)和使tapA-sipW-tasA操纵子失活突变的突变(如tapA-sipW-tasA操纵子或其一部分的缺失)。

此外，宿主细胞可以包含编码感兴趣的多肽的多核苷酸(如本文其他地方更详细地描述)。

此外，设想如本文所示的修饰的宿主细胞不产生多聚γ-谷氨酸(pga)或产生减少量的pga。因此，使参与多聚γ-谷氨酸(pga)产生的至少一个基因失活(如缺失)。优选地，所述参与多聚γ-谷氨酸(pga)的至少一个基因是选自ywsC(pgsB)、ywtA(pgsC)、ywtB(pgsA)和ywtC(pgsE)的至少一个基因。优选地，所有上述基因，即ywsC(pgsB)、ywtA(pgsC)、ywtB(pgsA)和ywtC(pgsE)失活(如缺失)。

此外，设想修饰的宿主细胞不能产生芽孢。这可以通过使至少一个参与芽孢形成的基因失活(如缺失)来实现。参与芽孢形成的基因是本领域众所周知的(EP1391502)，包括但不限于sigE、sigF、spoIIGA、spoIIE、sigG、spoIVCB、yqfD。在一优选实施方案中，使sigF基因缺失。

感兴趣的多肽

本发明的宿主细胞应当进一步包含至少一种编码感兴趣的多肽的多核苷酸(与启动子可操作地连接)。

如本文所用的术语“感兴趣的多肽”是指打算在细菌宿主细胞中产生的任何蛋白、肽或其片段。因此，蛋白涵盖多肽、肽、其片段以及融合蛋白等。

优选地，感兴趣的多肽是酶，如胞外酶。胞外酶(细胞外酶)是由宿主细胞分泌的酶。

在一特别优选的实施方案中，所述酶被分类为氧化还原酶(EC 1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、异构酶(EC 5)或连接酶(EC 6)。在一优选实施方案中，感兴趣的蛋白是适合用于洗涤剂、饲料和食品应用的酶。

最优选地，所述酶是水解酶(EC 3)，优选糖苷酶(EC 3.2)或肽酶(EC 3.4)。特别优选的酶是选自淀粉酶(特别是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-β淀粉酶(EC 3.2.1.2)、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、内切-1,3-β-木聚糖酶木聚糖酶(EC 3.2.1.32)、内切-1,4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)、乳糖酶(EC 3.2.1.108)、半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23和EC 3.2.1.24)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.24和EC 3.2.1.25)、脂肪酶(EC 3.1.1.3)、植酸酶(EC 3.1.3.8)、核酸酶(EC3.1.11至EC 3.1.31)和蛋白酶(EC 3.4)的酶；特别是选自淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乳糖酶葡糖淀粉酶、核酸酶和纤维素酶的酶，优选淀粉酶、甘露聚糖酶、乳糖酶或蛋白酶，优选淀粉酶和蛋白酶。最优选的是丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)，优选枯草杆菌蛋白酶。

特别地，优选以下感兴趣的蛋白：

具有蛋白水解活性的酶称为“蛋白酶”或“肽酶”。蛋白酶是发挥“蛋白酶活性”或“蛋白水解活性”的活性蛋白。蛋白酶是EC 3.4类的成员。蛋白酶包括氨肽酶(EC 3.4.11)、二肽酶(EC 3.4.13)、二肽基-肽酶和三肽基-肽酶(EC 3.4.14)、肽基-二肽酶(EC 3.4.15)、丝氨酸型羧肽酶(EC 3.4.16)、金属羧肽酶(EC 3.4.17)、半胱氨酸型羧肽酶(EC 3.4.18)、ω肽酶(EC 3.4.19)、丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)、半胱氨酸内肽酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸内肽酶(EC 3.4.23)、金属-内肽酶(EC 3.4.24)、苏氨酸内肽酶(EC 3.4.25)、催化机制未知的内肽酶(EC 3.4.99)。可商购的蛋白酶包括但不限于Lavergy^TM Pro(BASF)；Duralase^TM、Durazym^TM、/>Ultra、/>Ultra、 Ultra、/> Ultra、/>和/>(Novozymes A/S)，以商品名Prime、Pura-fect/>PurafectPurafect/> 和/>(Dan-isco/DuPont)、Axapem^TM(Gist-Brocases N.V.)出售的那些蛋白酶，迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶和来自Kao的KAP(嗜碱芽孢杆菌蛋白酶)。至少一种蛋白酶可以选自丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶(EC 3.4.21)的特征在于在催化活性位点具有丝氨酸，其在催化反应期间与底物形成共价加合物。丝氨酸蛋白酶可以选自胰凝乳蛋白酶(例如，EC 3.4.21.1)、弹性蛋白酶(例如，EC 3.4.21.36)、弹性蛋白酶(例如，EC 3.4.21.37或EC 3.4.21.71)、颗粒酶(例如，EC 3.4.21.78或EC 3.4.21.79)、激肽释放酶(例如，EC 3.4.21.34、EC3.4.21.35、EC 3.4.21.118或EC 3.4.21.119)、纤溶酶(例如，EC 3.4.21.7)、胰蛋白酶(例如，EC 3.4.21.4)、凝血酶(例如，EC 3.4.21.5)和枯草杆菌蛋白酶(也称作枯草杆菌肽酶，例如，EC 3.4.21.62)，后者在下文中也称作“枯草杆菌蛋白酶”。优选地，所述蛋白酶是迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶(BLAP)的蛋白酶变体，优选包含取代R101E的BLAP(根据BPN的编号)。根据本发明的蛋白酶具有蛋白水解活性。确定蛋白水解活性的方法在文献中是众所周知的(参见例如Gupta et al.(2002),Appl.Microbiol.Bio-technol.60:381-395)。

在一实施方案中，编码至少一种感兴趣的多肽的多核苷酸与细菌宿主细胞异源。在整个说明书中使用的术语“异源”(或外源或外来或重组或非天然)多肽或蛋白在本文中定义为非宿主细胞天然的多肽或蛋白。类似地，术语“异源”(或外源或外来或重组或非天然)多核苷酸是指非宿主细胞天然的多核苷酸。

在一实施方案中，所述至少一种编码感兴趣的多肽的多核苷酸存在于质粒上。术语“质粒”是指染色体外的环状DNA，即在宿主细胞中自主复制的载体。因此，质粒被理解为染色体外载体。

在另一实施方案中，将所述至少一种编码感兴趣的多肽的多核苷酸稳定地整合到细菌染色体中。

启动子

所述至少一种编码感兴趣的多肽的多核苷酸应当与启动子可操作地连接。

如本文所用的术语“可操作地连接”是指启动子序列和编码感兴趣的多肽的多核苷酸之间的功能性连接，使得启动子序列能够启动编码感兴趣的多肽的多核苷酸(在本文中也称作感兴趣的基因)的转录。

“启动子”或“启动子序列”是位于基因上游的核苷酸序列，与基因位于同一条链上，使该基因能够转录。启动子之后是基因的转录起始位点。启动子被RNA聚合酶(连同任何所需的转录因子)识别，从而启动转录。启动子的功能片段或功能变体是可被RNA聚合酶识别并能够启动转录的核苷酸序列。

“活性启动子片段”、“活性启动子变体”、“功能性启动子片段”或“功能性启动子变体”描述了仍然具有启动子活性的启动子核苷酸序列的片段或变体。

启动子可以是“诱导物依赖性启动子”或“诱导物非依赖性启动子”，包含组成型启动子或受其他细胞调节因子控制的启动子。

本领域技术人员能够选择合适的启动子来表达第三丙氨酸消旋酶和感兴趣的多肽。例如，编码感兴趣的多肽的多核苷酸优选与“诱导物依赖性启动子”或“诱导物非依赖性启动子”可操作地连接。此外，编码第三丙氨酸消旋酶的多核苷酸优选与“诱导物非依赖性启动子”，如组成型启动子可操作地连接。

“诱导物依赖性启动子”在本文中理解为在发酵培养基中添加“诱导物分子”后，其活性增加，从而使启动子可操作地连接的基因能够转录的启动子。因此，对于诱导物依赖性启动子，诱导物分子的存在会通过信号转导触发与启动子可操作地连接的基因的表达增加。通过诱导物分子的存在激活之前的基因表达不需要不存在，而是也可以以低水平的基础基因表达存在，在添加诱导物分子后增加。“诱导物分子”是一种分子，其在发酵培养基中的存在能够通过增加与基因可操作地连接的诱导物依赖性启动子的活性来影响基因表达的增加。优选地，诱导物分子是碳水化合物或其类似物。在一实施方案中，诱导物分子是芽孢杆菌细胞的次级碳源。在碳水化合物混合物的存在下，细胞选择性地吸收为其提供最多能量和生长优势的碳源(主要碳源)。同时，它们抑制参与不太优选的碳源(次级碳源)的分解代谢和摄取的各种功能。通常，芽孢杆菌的主要碳源是葡萄糖，各种其他糖和糖衍生物被芽孢杆菌用作次级碳源。次级碳源包括例如甘露糖或乳糖，但不限于这些。

诱导物依赖性启动子的实例在下表中通过参考各自的操纵子给出：

与此相反，不依赖于诱导物分子存在的启动子(在本文中称作“诱导物非依赖性启动子”)的活性是组成型活性的，或者可以增加，无论添加至发酵培养基中的诱导物分子是否存在。

组成型启动子不依赖其他细胞调节因子，转录起始依赖于σ因子A(sigA)。sigA依赖性启动子包含σ因子A特异性识别位点‘-35’-区和‘-10’-区。

优选地，“诱导物非依赖性启动子”序列选自组成型启动子，其不限于启动子Pveg、PlepA、PserA、PymdA、Pfba及其具有不同基因表达强度的衍生物(Guiziou et al,(2016):Nucleic Acids Res.44(15),7495-7508)，编码芽孢杆菌aprE基因的枯草杆菌蛋白酶的aprE启动子，噬菌体SPO1启动子P4、P5、P15(WO15118126)，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的cryIIIA启动子(WO9425612)，来自解淀粉芽孢杆菌的amyQ启动子，来自地衣芽孢杆菌的amyL启动子和启动子变体(US5698415)及其组合，或者它们的活性片段或变体，优选aprE启动子序列。

在一优选实施方案中，与编码感兴趣的多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子是DegU调节的启动子。因此，所述启动子应当是由DegU激活的启动子。DegU调节的启动子的激活通过DegU与启动子的结合而发生(这导致与其可操作地连接的基因的表达增加)。启动子是否被DegU结合和上调(即增加)可以如Ogura等人(Ogura,M.,Shimane,K.,Asai,K.,Ogasawara,N.,&Tanaka,T.；2003；In:Molecular microbiology,49(6),1685-1697)所述进行评估。术语增加已在上文中定义。

芽孢杆菌的DegS-DegU双组分调节系统控制各种细胞分化过程，特别是在从指数生长期过渡到稳定生长期的过程中，高水平的DegU-P水平对100多个基因转录增强的影响已得到描述(U,Homuth G.,Mol Genet Genomics.2002Dec；268(4):455-67.)。包含转录因子结合位点如DegU-P、核心-启动子、5’-UTR和Shine Dalgarno序列的这些基因的5’基因调节区在本发明的范围内。

优选的基因调节区选自但不限于编码细胞外酶的基因如AprE、Bpr、SacB，或者合成多聚γ-谷氨酸的基因(ywsC(pgsB),ywtA(pgsC),ywtB(pgsA),ywtC(pgsE))。最优选地，基因调节区包含DegU-P结合位点。

来自枯草芽孢杆菌的bpr基因的启动子及其核心启动子区和DegU结合位点都得到了很好的描述。转录起始位点(TSS)在相对于bpr基因起始ATG的核苷酸nt-84处。核心启动子涵盖相对于TSS的核苷酸nt-1至nt-38，并且三个DegU结合位点位于nt-66至nt-154内。更优选地，功能性bpr启动子片段包含相对于TSS的核苷酸nt-1至nt-175(Tsukahara K,OguraM.FEMS Microbiol Lett.2008Mar；280(1):8-13)。

同样，已经描述了通过高水平的DegU-P对多聚γ谷氨酸的转录激活(Ohsawa T,Ogura M.Biosci Biotechnol Biochem.2009Sep；73(9):2096-102)，定义了DegU-P与相对于转录起始位点的核苷酸nt-24至nt-47结合的区域。

已经绘制了DegU-P与果聚糖蔗糖酶基因sacB的5’-调节区的结合位点，并且显示了与参考菌株相比，degU32(Hy)菌株背景对sacB启动子的刺激作用(Henner DJ,Hoch JA.,J Bacteriol.1988Jan；170(1):296-300；Shimotsu H,Henner DJ.,J Bacteriol.1986Oct；168(1))。

来自编码芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因的天然启动子，也称作aprE启动子，在本领域中得到了很好的描述。aprE基因由σ因子A(sigA)转录，其表达受到几种调节子的高度控制–DegU作为aprE表达的激活物，而AbrB,ScoC(hpr)和SinR是aprE表达的阻遏物(Ferrari,E J.A.Hoch.1988.；J Bacteriol 170:289-295；Henner,D.J.,J.A.Hoch.1988；J.Bacteriol.170:296-300；Park,S.S.,R.H.Doi.1989；J Bacteriol 171:2657-2665；Gaur,N.K.,I.Smith.1991；J Bacteriol 173:678-686；Kallio,P.T.,M.A.Strauch.1991；Journal of Biological Chemistry 266:13411-13417)。

包含σ因子A结合位点-35和-10的核心启动子区已被定位到相对于转录起始位点的nt-1-nt-45区域(Park,S.S.,R.H.Doi.1989；J Bacteriol 171:2657-2665)。

WO0151643描述了通过将野生型aprE启动子的-35位点由TACTAA突变为典型的TTGACA-35位点基序来增加表达(Helmann,J.D.1995；Nucleic Acids Res.23:2351-2360)。

转录起始位点(TSS)位于相对于aprE基因的起始GTG的nt-58处。5’UTR包含核糖体结合位点(Shine Dalgarno)和相对于起始GTG的nt-58–nt-33内的序列，形成mRNA5’端非常稳定的茎-环结构，负责长达25min的高mRNA转录本稳定性(Hambraeus,et al.,2000,Microbiology.146Pt 12:3051-3059；Hambraeus et al.,2002,Microbiology.148(Pt6):1795-1803)。

相对于转录起始位点的nt-141–nt–161区域已被证明以DegU(SacU)和DegQ(SacQ)依赖性方式负责完全诱导，而nt-200至nt-600的5’区域受ScoC(Hpr)的负调控(Henner,D.J.,J.A.Hoch.1988；J.Bacteriol.170:296-300)。对DegU-P结合序列的更深入分析显示，相对于TSS的nt-70至-nt-27之前的存在额外区域(Shimane K,Ogura M.；JBiochem.2004Sep；136(3):387-97)。

抑制过渡态调节子ArbB的结合位点已被定位至相对于转录起始位点的nt-58至+nt15(Strauch,M.A.,J.A.Hoch.1989；EMBO J 8:1615-1621)。

阻遏物SinR的结合位点已被定位至相对于转录起始位点的nt-233至nt-268(Gaur,N.K.,I.Smith.1991；J Bacteriol 173:678-686)。

Jacobs等人(Jacobs M,Flock JI.1985；Nucleic Acids Res 13:8913-8926；Jacobs,M.F.1995.Expression of the subtilisin Carlsberg-encoding gene inBacillus licheniformis and Bacillus subtilis.Gene 152:69-74)公开了地衣芽孢杆菌NCIB6816菌株的aprE(subC)基因及其5’区的序列(GenBank登录号X03341)。描述了枯草杆菌蛋白酶Carlsberg aprE(subC)基因表达的调节和涉及的DNA序列。转录起始位点(TSS)位于nt-73，因此5’UTR包含相对于起始ATG的nt-73至nt-1。核糖体结合位点(ShineDalgarno)位于位置nt-16至nt-9。σ因子A的识别序列-10-位点(TATAAT-box)高度保守，位于nt-84至nt-79，而位于-10位点上游17nt的-35位点(TACCAT)与芽孢杆菌中的标准σ因子A依赖性启动子相比保守性较低(Helmann et al.,1995,Nucleic Acids Res.23:2351-2360)。在调节子DegU(degU32H)或DegQ(degQ36H)升高的枯草芽孢杆菌菌株中，与启动子片段nt-225至nt-1(突变体769，如Jacobs et al.,1995所述)表达相比，包含nt-122至nt-1和nt-181至nt-1的5’端启动子截短(分别为突变体771和突变体770，如Jacobs et al.,1995所述)显示枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶表达活性降低了20-40倍。因此，调节子degU刺激枯草杆菌蛋白酶Carlsberg表达的结合位点位于包含nt-225至nt-182的区域内。

WO9102792公开了碱性蛋白酶基因启动子的功能，用于在地衣芽孢杆菌中大规模生产枯草杆菌蛋白酶Carlsberg型蛋白酶及其在发酵过程中的生产。

编码枯草杆菌蛋白酶的短小芽孢杆菌基因aprE1和aprE2的启动子已用于在短小芽孢杆菌中表达重组蛋白酶和淀粉酶(Küppers T,Wiechert W.Microb CellFact.2014Mar24；13(1):46.)。特别地，与PaprE1-IV启动子变体(相对于起始ATG的nt-357)相比，包含相对于起始ATG的核苷酸nt-382的PaprE1-III启动子变体表现出非常高的生产力。

“aprE启动子”、“aprE型启动子”或“aprE启动子序列”是位于aprE基因上游的核苷酸序列(或者其部分或变体)，即编码芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因，与aprE基因位于同一条链上，使得aprE基因能够转录。术语“转录起始位点”或“转录的起始位点”应当理解为在基因序列5’端的转录起始的位置。在原核生物中，称作+1的第一个核苷酸一般为腺苷(A)或鸟苷(G)核苷酸。在这种情况下，术语“位点”和“信号”在本文中可互换使用。

根据本发明，启动子优选包含degU结合基序。DegU是已知增加aprE型启动子表达的转录因子。因此，优选存在相应的转录因子结合位点。

任选地，启动子进一步包含选自ScoC(hpr)、SinR和AbrB的调节因子的另一个结合基序。这些调节因子主要是负调节子。然而，这类结合位点的存在优选在工业发酵过程中改善靶基因表达的正确时机。

进一步任选地，启动子包含5'UTR。这是-1启动子位置下游的转录但不翻译的区域。例如，这种非翻译区应当包含核糖体结合位点，以便在靶基因编码肽或多肽的情况下促进翻译。

在一特别优选的实施方案中，DegU调节启动子是aprE启动子。

“aprE启动子”或“aprE启动子序列”是位于aprE基因上游的核苷酸序列(或者其部分或变体)，即编码芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的基因，与aprE基因位于同一条链上，使得aprE基因能够转录。

在一优选实施方案中，aprE启动子包含如SEQ ID NO:187、188、189、190、191、192、193、194、202或203所示的序列，特别是SEQ ID NO:188、192或194。在本发明的研究中，具有如SEQ ID NO:188所示序列的启动子用于表达感兴趣的多核苷酸。

来自编码Carlsberg蛋白酶的基因的天然启动子，也称作aprE启动子，在本领域中得到了很好的描述。aprE基因由σ因子A(sigA)转录，其表达受到几种调节子的高度控制–DegU作为aprE表达的激活物，而AbrB、ScoC(hpr)和SinR是aprE表达的阻遏物。

WO9102792公开了碱性蛋白酶基因启动子的功能，用于在地衣芽孢杆菌中大规模生产枯草杆菌蛋白酶Carlsberg型蛋白酶。特别地，WO9102792描述了地衣芽孢杆菌编码枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白酶的aprE基因的5’区(图27)，其包含功能性aprE基因启动子和包含核糖体结合位点的5’UTR(Shine Dalgarno序列)。

术语“转录起始位点”或“转录的起始位点”应当理解为在基因序列5’端的转录起始的位置。在原核生物中，称作+1的第一个核苷酸一般为腺苷(A)或鸟苷(G)核苷酸。在这种情况下，术语“位点”和“信号”在本文中可互换使用。

术语“表达”或“基因表达”是指一个特定基因或多个特定基因或特定核酸构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别是指一个基因或多个基因或遗传构建体转录为结构RNA(例如，rRNA、tRNA)或mRNA，后者随后翻译或不翻译为蛋白。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。

进一步任选地，启动子包含5'UTR。这是-1启动子位置下游的转录但不翻译的区域。例如，这种非翻译区应当包含核糖体结合位点，以便在靶基因编码肽或多肽的情况下促进翻译。

关于5'UTR，本发明特别教导将本发明的启动子与包含一个或多个稳定元件的5'UTR组合。这样，可以加工由启动子区合成的mRNA以产生在转录本的5’端具有稳定序列的mRNA转录本。如Hue et al,1995,Journal of Bacteriology 177:3465-3471所述，优选在mRNA转录本5'端的这种稳定物序列增加它们的半衰期。合适的mRNA稳定元件如下所述

-WO08148575，优选WO08140615的SEQ ID NO.1至5，或这些序列中保持mRNA稳定功能的片段，以及

-WO08140615，优选苏云金芽孢杆菌CrylllA mRNA稳定序列或噬菌体SP82mRNA稳定序列，更优选根据WO08140615的SEQ ID NO.4或5的mRNA稳定序列，更优选根据WO08140615的SEQ ID NO.6的修饰的mRNA稳定序列，或者这些序列中保持mRNA稳定功能的片段。

优选的mRNA稳定元件选自aprE、grpE、cotG、SP82、RSBgsiB、CrylllA mRNA稳定元件，或根据这些序列中保持mRNA稳定功能的片段。优选的mRNA稳定元件是grpE mRNA稳定元件(对应于WO08148575的SEQ ID NO.2)。

5'UTR还优选包含位于启动子下游和核糖体结合位点(RBS)上游的修饰的rib前导序列。在本发明的背景下，rib前导序列在此定义为芽孢杆菌细胞(更优选枯草芽孢杆菌细胞)中核黄素生物合成基因(rib操纵子)上游的前导序列。在枯草芽孢杆菌中，包含参与核黄素生物合成的基因的rib操纵子包括ribG(ribD)、ribB(ribE)、ribA和ribH基因。枯草芽孢杆菌中来自rib启动子(Prib)的核黄素操纵子的转录由核糖开关控制，该核糖开关涉及一个近300个核苷酸的非翻译调节前导区(rib前导区)，位于操纵子ribG中第一个基因的转录起始和翻译起始密码子之间的rib操纵子的5'-区域。WO2015/1181296，特别是第23-25页中描述了合适的rib前导序列，其援引加入本文。

degQ基因可以在任何认为合适的启动子的控制下表达，如组成型启动子。在一实施方案中，启动子包含如SEQ ID NO:58所示的序列。或者，该基因在PaprE启动子(具有如SEQ ID 188所示的序列)Pveg启动子或PspoVG启动子的控制下表达。

根据本发明，细菌宿主细胞应当包含至少两个突变。所述突变应当改变(即增加或减少)基因产物如多肽或其变体的活性和/或量，如本文其他地方所述。

术语“变体”

亲本多肽的变体可以具有与相应亲本多肽的氨基酸序列至少n％相同的氨基酸序列，n是50和100之间的整数，优选与全长多肽序列相比50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。本文所述的与亲本酶相比时n％相同的变体酶具有酶促活性。

在一些实施方案中，亲本多肽的变体包含与亲本多肽的氨基酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但低于100％相同的氨基酸序列。

因此，变体可以通过它们与亲本多肽相比时的序列相同性来定义。序列相同性通过提供为“％序列相同性”或“％相同性”。为了确定两个氨基酸序列之间的百分比相同性，在第一步中在这两个序列之间产生成对序列比对，其中将两个序列在它们的整个长度上比对(即，成对全局比对)。用实现Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(1979)48,p.443-453)的程序生成比对，优选通过使用程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))，用程序默认参数(gapopen＝10.0，gapextend＝0.5和matrix＝EBLOSUM62)。用于本发明目的的优选比对是可以由其确定最高序列相同性的比对。

比对两个序列之后，在第二步中，应当从比对确定相同性值。因此，根据本发明，以下百分比相同性的计算适用：

％-相同性＝(相同残基/在其完整长度上显示本发明的相应序列的比对区域的长度)*100。因此，与根据这个实施方案的两个氨基酸序列的比较相关的序列相同性是通过将相同残基的数量除以比对区域的长度来计算的，所述比对区域在其完整长度上显示本发明的相应序列。将这个值乘以100以给出“％-相同性”。

对于计算两个DNA序列的百分比相同性，与计算两个氨基酸序列的百分比相同性相同，具有一些规范。对于编码蛋白的DNA序列，应当在编码区的整个长度上进行成对比对，从起始密码子到终止密码子，不包括内含子。对于非蛋白编码DNA序列，应当在本发明序列的整个长度上进行成对比对，因此将本发明的完整序列与另一序列或另一序列之外的区域进行比较。此外，实现Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(1979)48,p.443-453)的优选比对程序是“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))，用程序默认参数(gapopen＝10.0，gapextend＝0.5和matrix＝EDNAFULL)。

在一实施方案中，变体多肽包含1-30、1-20、1-10或1-5个氨基酸取代，优选地，这类取代与酶的功能结构域无关。

变体可以通过它们与亲本多肽相比时的序列相似性来定义。序列相似性通过提供为“％序列相似性”或“％-相似性”。为了计算序列相似性，在第一步中必须如上所述生成序列比对。在第二步中，必须计算百分比-相似性，而百分比序列相似性考虑到定义的氨基酸集合具有相似的特性，例如，它们的大小，它们的疏水性，它们的电荷或其他特征。在这里，一个氨基酸与相似氨基酸的交换被称作“保守突变”。包含保守突变的多肽变体似乎对蛋白折叠的影响最小，导致某些多肽，优选酶，在与亲本多肽的多肽特性相比时，其特性基本上保持不变。

对于根据本发明确定％-相似性，适用以下内容，这也符合BLOSUM62矩阵，该矩阵式数据库搜索和序列比对中最常用的氨基酸相似性矩阵之一。如果字母对的BLOSUM62取代矩阵的值为正，则氨基酸交换通常被定义为相似。表9示出了保守交换。

表9：

氨基酸A与氨基酸S相似

氨基酸D与氨基酸E；N相似

氨基酸E与氨基酸D；K；Q相似

氨基酸F与氨基酸W；Y相似

氨基酸H与氨基酸N；Y相似

氨基酸I与氨基酸L；M；V相似

氨基酸K与氨基酸E；Q；R相似

氨基酸L与氨基酸I；M；V相似

氨基酸M与氨基酸I；L；V相似

氨基酸N与氨基酸D；H；S相似

氨基酸Q与氨基酸E；K；R相似

氨基酸R与氨基酸K；Q相似

氨基酸S与氨基酸A；N；T相似

氨基酸T与氨基酸S相似

氨基酸V与氨基酸I；L；M相似

氨基酸W与氨基酸F；Y相似

氨基酸Y与氨基酸F；H；W相似。

保守氨基酸取代可能发生在功能蛋白如酶的多肽序列的全长序列上。在一实施方案中，这类突变与酶的功能结构域无关。在另一实施方案中，保守突变与酶的催化中心无关。

因此，根据本发明，以下百分比相似性的计算适用：

％-相似性＝[(相同残基+相似残基)/在其完整长度上显示本发明的相应序列的比对区域的长度]*100。因此，与两个氨基酸序列的比较相关的序列相似性是通过将相同残基的数量加上相似残基的数量除以比对区域的长度来计算的，所述比对区域在其完整长度上显示本发明的相应序列。将这个值乘以100以给出“％-相似性”。

特别地，包含保守突变的变体多肽，其与相应的亲本序列至少m％相似，m是50和100之间的整数，优选与全长多肽序列相比50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，预期具有基本上不变的多肽特性。在另一实施方案中，保守突变与酶的催化中心无关。在一实施方案中，变体多肽包含1-30、1-20、1-10或1-5个保守氨基酸取代，优选地，这类取代与酶的功能结构域无关。

同样，一个氨基酸与非相似氨基酸的交换被称作“非保守突变”。包含非保守突变的酶变体似乎对蛋白折叠有影响，导致某些酶特性与亲本酶的酶特性相比不同。因此，如果字母对的BLOSUM62取代矩阵的值为负，则氨基酸交换被定义为非保守的。表10示出了非保守交换。

表10：

氨基酸A与氨基酸D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、W、Y不相似

氨基酸C与氨基酸D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y不相似

氨基酸D与氨基酸A、C、F、G、H、I、K、L、M、P、R、T、V、W、Y不相似

氨基酸E与氨基酸A、C、F、G、I、L、M、P、T、V、W、Y不相似

氨基酸F与氨基酸A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、V不相似

氨基酸G与氨基酸C、D、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、R、T、V、W、Y不相似

氨基酸H与氨基酸A、C、D、F、G、I、K、L、M、P、S、T、V、W不相似

氨基酸I与氨基酸A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、W、Y不相似

氨基酸K与氨基酸A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、T、V、W、Y不相似

氨基酸L与氨基酸A、C、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、W、Y不相似

氨基酸M与氨基酸A、C、D、E、G、H、K、N、P、R、S、T、W、Y不相似

氨基酸N与氨基酸A、C、F、I、L、M、P、V、W、Y不相似

氨基酸P与氨基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、Y不相似

氨基酸Q与氨基酸A、C、F、G、I、L、P、T、V、W、Y不相似

氨基酸R与氨基酸A、C、D、F、G、I、L、M、P、S、T、V、W、Y不相似

氨基酸S与氨基酸C、F、H、I、L、M、P、R、V、W、Y不相似

氨基酸T与氨基酸C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、W、Y不相似

氨基酸V与氨基酸C、D、E、F、G、H、K、N、P、Q、R、S、W、Y不相似

氨基酸W与氨基酸A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V不相似

氨基酸Y与氨基酸A、C、D、E、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V不相似

亲本多肽的变体可以具有亲本多肽的活性或功能。下面的表A提供了关于可以根据本发明修饰的亲本多肽的活性/功能的信息。本文所述的与亲本酶相比具有m％-相似性的变体酶因此具有酶促活性。

产生感兴趣的多肽的方法

本发明进一步考虑使用本发明的修饰的芽孢杆菌宿主细胞产生感兴趣的多肽。为了产生感兴趣的多肽，修饰的芽孢杆菌宿主细胞应当包含至少一个编码感兴趣的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸与启动子可操作地连接。因此，宿主细胞应当包含至少一种感兴趣的多肽的表达盒。

因此，本发明涉及一种产生感兴趣的多肽的方法，包括

a)提供本发明的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其包含感兴趣的多肽的表达盒，

b)在允许表达感兴趣的多肽的条件下培养宿主细胞，以及

c)任选地，从培养基分离感兴趣的多肽。

上面给出的关于本发明修饰的宿主细胞的解释和定义比照适用于本发明的方法。

如本文所用的术语“培养”是指至少在预定时间内使培养物中包含的修饰的宿主细胞保持存活和/或增殖。该术语涵盖接种后生长开始时的指数细胞生长阶段以及稳定生长阶段。培养条件应当允许表达，即产生感兴趣的多肽。这类条件可以由技术人员选择，无需赘述。实施例1描述了培养修饰的宿主细胞的示例性条件。在本发明的方法的一实施方案中，步骤b)中的培养以补料分批培养进行。

如果应用本发明的方法，则允许增加至少一种感兴趣的多肽的表达，即产生。优选地，与未修饰的对照细胞中的表达相比，表达增加。在一优选实施方案中，与对照细胞中的表达相比，至少一种感兴趣的多肽的表达增加至少10％、20％或至少40％，如至少50％，或至少80％。例如，与对照细胞相比，至少一种感兴趣的多肽的表达可以增加20％-100％，如40％-60％。此外，设想表达增加至少100％、150％、200％、250％或300％，如200％-300％。通常，可以通过确定宿主细胞和/或培养基中多肽的量来测量表达。

如果修饰的宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞，与未修饰的对照细胞相比，有利地产生纯度增加的感兴趣的多肽(由于ForD的表达减少)。因此，如果应用本发明的方法，则允许提高感兴趣的化合物的纯度。优选地，与对照细胞产生的感兴趣的化合物的纯度相比，关于特定污染的纯度增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。

优选地，与未修饰的对照细胞相比，地衣芽孢杆菌宿主细胞包含减少的FormosinD表达，优选地，其中Formosin D优选包含与SEQ ID NO:215具有至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列。优选地，修饰的地衣芽孢杆菌宿主细胞不包含内源性forD基因的修饰。

实施例

材料和方法

以下实施例仅用于说明本发明。对本领域技术人员显而易见的许多可能的变化也落在本发明的范围内。

除非另有说明，以下实验是通过应用如遗传工程、分子生物学和通过微生物培养发酵生产化合物中使用的标准设备、方法、化学品和生物化学品进行的。还参见Sambrook等人(Sambrook,J.and Russell,D.W.Molecular cloning.Alaboratory manual,3^rd ed,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.2001)。

电转感受态地衣芽孢杆菌细胞和电穿孔

通过电穿孔将DNA转化到地衣芽孢杆菌(US5352604)中。电转感受态地衣芽孢杆菌细胞的制备和DNA的转化基本上如Brigidi等人(Brigidi,P.,Mateuzzi,D.(1991).Biotechnol.Techniques 5,5)所述进行，有以下修改：DNA转化后，将细胞在1ml LBSPG缓冲液中恢复并在37℃下温育60min(J.,1989,FEMS Microbio.Lett.,61:165-170)，然后在选择性LB-琼脂平板上铺板。/>

为了克服地衣芽孢杆菌菌株DSM641的地衣芽孢杆菌特异性限制性修饰系统，如下所述从Ec#098细胞分离质粒DNA。为了转移到地衣芽孢杆菌限制酶(restrictase)敲除菌株中，从大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)分离质粒DNA。

质粒分离

通过(Sambrook,J.and Russell,D.W.Molecular cloning.Alaboratory manual,3rd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.2001)中描述的标准分子生物学方法或碱性裂解方法(Birnboim,H.C.,Doly,J.(1979).Nucleic AcidsRes 7(6):1513-1523)从芽孢杆菌或大肠杆菌细胞分离质粒DNA。在细胞裂解之前，将芽孢杆菌细胞与在37℃下用10mg/ml溶菌酶处理30min的大肠杆菌进行比较。

质粒

质粒p689-T2A-lac

大肠杆菌质粒p689-T2A-lac包含lacZ-alpha基因，侧翼为BpiI限制性位点，再次5’侧翼为大肠杆菌rrnB基因的T1终止子且3’侧翼为T0λ终止子，订购为基因合成构建体(SEQ ID 027)。

pEC194RS-芽孢杆菌温度敏感缺失质粒

将质粒pE194用具有侧翼PvuII位点的寡核苷酸SEQ ID 009和SEQ ID 010进行PCR扩增，用限制性内切酶PvuII消化并与用限制性酶SmaI消化的载体pCE1连接。pCE1是pUC18衍生物，其中氨苄西林抗性基因内的BsaI位点已通过沉默突变去除。将连接混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化子涂布在含有100μg/ml氨苄西林的LB-琼脂平板上，在37℃下培养过夜。从单个克隆中分离质粒DNA，并通过限制性消化分析其正确性。将得到的质粒命名为pEC194S。

从质粒pBSd141R(登录号：KY995200)PCR扩增II型组装mRFP盒(Radeck,J.,Meyer,D.,Lautenschlager,N.,and Mascher,T.2017.Bacillus SEVAsiblings:AGolden Gate-based toolbox to create personalized integrative vectors for Bacillussubtilis.Sci.Rep.7:14134)，用寡核苷酸SEQ ID 011和SEQ ID NO:12，包含限制性位点BamHI的额外核苷酸。将PCR片段和pEC194S用限制性酶BamHI限制，然后连接并转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化子涂布在含有100μg/ml氨苄西林的LB-琼脂平板上，在37℃下培养过夜。从单个克隆中分离质粒DNA，并通过限制性消化分析其正确性。得到的质粒pEC194RS携带mRFP盒，其开放阅读框与红霉素抗性基因的阅读框相反。

pDel003–aprE基因缺失质粒

地衣芽孢杆菌aprE基因的基因缺失质粒是用质粒pEC194RS和基因合成构建体SEQID 021构建的，基因合成构建体SEQ ID 021包含aprE基因的基因组区域5’和3’，侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点。如(Radeck et al.,2017；Sci.Rep.7:14134)所述用限制性内切酶BsaI进行II型组装，随后将反应混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化子涂布在含有100μg/ml氨苄西林的LB-琼脂平板上，在37℃下培养过夜。从单个克隆中分离质粒DNA，并通过限制性消化分析其正确性。将得到的aprE缺失质粒命名为pDel003。

pDel005-sigF基因缺失质粒

如对pDel003所述构建地衣芽孢杆菌sigF基因(spoIIAC基因)的基因缺失质粒，但是使用基因合成构建体SEQ ID 024，其包含sigF基因的基因组区域5’和3’，侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点。将得到的sigF缺失质粒命名为pDel005。

pDel006–限制酶基因缺失质粒

地衣芽孢杆菌DSM641(SEQ ID 013)限制性修饰系统的限制酶基因(SEQ ID 014)的基因缺失质粒是用质粒pEC194RS和基因合成构建体SEQ ID 015构建的，基因合成构建体SEQ ID 015包含限制酶基因的基因组区域5’和3’，侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点。如上所述用限制性内切酶BsaI进行II型组装，随后将反应混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化子涂布在含有100μg/ml氨苄西林的LB-琼脂平板上，在37℃下培养过夜。从单个克隆中分离质粒DNA，并通过限制性消化分析其正确性。将得到的限制酶缺失质粒命名为pDel006。

pDel007–多聚γ-谷氨酸合成基因缺失质粒

如对pDel006所述构建用于缺失参与多聚γ-谷氨酸(pga)产生的基因的缺失质粒，即地衣芽孢杆菌的ywsC(pgsB)、ywtA(pgsC)、ywtB(pgsA)、ywtC(pgsE)，但是使用基因合成构建体SEQ ID 018，其包含ywsC(pgsB)、ywtA(pgsC)、ywtB(pgsA)、ywtC(pgsE)基因侧翼的基因组区域5’和3’，侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点。将得到的pga缺失质粒命名为pDel007。

pMA110-pga::BLAP整合质粒

通过两步克隆策略构建用于将BLAP基因表达盒整合到多聚γ-谷氨酸合成基因座中的pga::BLAP整合质粒。使用寡核苷酸Seq ID 028和Seq ID NO:029从pCB56C(US5352604)PCR扩增包含PaprE启动子的BLAP蛋白酶表达盒，并且在与限制性内切酶BpiI的II型组装反应中将其亚克隆到p689-T2A-lac中。对得到的质粒p689-BLAP进行序列验证。用质粒pEC194RS和p689-BLAP在与限制性内切酶BsaI的第二次II型组装反应中构建通过BLAP表达盒交换pga合成基因座的质粒，提供pga合成基因座的5’和3’同源区(Seq ID 001和Seq ID 02)作为基因合成构建体，侧翼是与pEC194RS和p689-BLAP相容的BsaI限制性位点，以允许定向克隆。将得到的序列验证的质粒命名为pMA110。

pInt010-CAT::Psy-degQ整合质粒

通过两步克隆策略构建用于将地衣芽孢杆菌degQ基因表达盒整合到氯霉素-乙酰转移酶(CAT)基因座中的CAT::Psy-degQ整合质粒。包含枯草芽孢杆菌Pveg启动子的合成启动子变体(称作Psy(SEQ ID 058))和地衣芽孢杆菌的degQ基因片段(SEQ ID 059)的degQ表达盒订购为具有侧翼BpiI限制性内切酶位点的基因合成片段，并且在与限制性内切酶BpiI的II型组装反应中亚克隆到p689-T2A-lac中。对得到的质粒p689-Psy-degQ进行序列验证。用质粒pEC194RS和p689-Psy-degQ在与限制性内切酶BsaI的第二次II型组装反应中构建通过degQ表达盒交换CAT基因座的质粒，提供CAT基因座的5’和3’同源区(Seq ID 041和SeqID 042)作为基因合成构建体，侧翼是与pEC194RS和p689-Psy-degQ相容的BsaI限制性位点，以允许定向克隆。将得到的序列验证的质粒命名为pInt010。

质粒pJOE8999.1：

Altenbuchner J.2016.通过CRISPR-Cas9系统编辑枯草芽孢杆菌基因组。ApplEnviron Microbiol 82:5421–5.

质粒pJOE-T2A

为了允许基于II型组装(T2A)的sgRNA和DSB修复的同源区域的一步克隆，对CRISPR/Cas9质粒pJOE8889.1进行如下修饰。对来自质粒pBSd141R(登录号：KY995200)(Radeck et al.,J 2017；Sci.Rep.7:14134)的II型组装mRFP盒进行修饰，以去除多个限制性位点和BpiI限制性位点，并且订购为具有侧翼SfiI限制性位点的基因合成片段(SEQ ID030)。将质粒命名为p#732。将质粒p#732和质粒pJOE8999.1用SfiI(New England Biolabs,NEB)消化，将p#732的mRFP盒连接到SfiI消化的pJOE8999.1中，然后转化到感受态大肠杆菌DH10B细胞中。在含有IPTG/X-Gal和卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂平板上筛选阳性克隆，获得紫色菌落(蓝白筛选和mRFP1表达)。将得到的序列验证的质粒命名为pJOE-T2A。

质粒pCC027-T2A CRISPR目标载体

质粒pCC027是质粒pJOE-T2A的衍生物，其中启动子PmanP被启动子片段(SEQ ID031)取代，该启动子片段在5’至3’方向上包含pMutin2的终止子区(登录号AF072806)，随后是通过Gibson组装方法(HiFi DNA组装克隆试剂盒，New England Biolabs)衍生自Guiziou等人(Guiziou,S.,V.Sauveplane,H.J.Chang,C.Clerte,N.Declerck,M.Jules,and J.Bonnet.2016.Apart toolbox to tune genetic expression inBacillus subtilis.Nucleic Acids Res.44:7495-7508)的Pveg启动子变体。

pDel004–amyB基因缺失质粒

如对pDel003所述构建地衣芽孢杆菌amyB基因的基因缺失质粒，但是使用基因合成构建体SEQ ID 217，其包含amyB基因的基因组区域5’和3’，侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点。将得到的amyB缺失质粒命名为pDel004。

pDel034-remA功能缺失质粒

为了使RemA失活，地衣芽孢杆菌的野生型等位基因在其天然基因座上被remA基因的突变拷贝交换，导致表达具有组合功能缺失突变R18W和P29S的RemA(Winkelman,J.TKearns,D.B.(2009):Journal of bacteriology 191(12),S.3981–3991)。将具有5’和3’侧翼区域的侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点的remAR18W,P29S基因订购为基因合成构建体SEQ ID 218。如对pDel003所述构建基因编辑质粒。将得到的remA编辑质粒命名为pDel034。

pDel023–formosin D缺失质粒

如对pDel003所述构建地衣芽孢杆菌formosin D基因(forD基因)的基因缺失质粒，但是使用基因构建体SEQ ID NO:216，其包含forD基因的基因组区域5’和3’，具有突变的RBS序列，侧翼是与pEC194RS相容的BsaI位点。将得到的forD缺失质粒命名为pDel023。

构建靶标特异性CRISPR/Cas9质粒的一般步骤

为了构建基于质粒pCC027的基于靶标特异性CRISPR/Cas9的基因缺失质粒，设计了20bp的间隔序列。通过两个互补寡核苷酸的退火组装间隔区，每个寡核苷酸携带4bp的延伸，适合克隆到质粒pCC0027的BsaI位点。通过包含靶基因5’和3’侧翼区域的两个PCR片段的SOE-PCR(通过重叠延伸PCR剪接)合成同源定向修复(HDR)区域。将BsaI限制性内切酶位点作为突出端引入5’区正向引物和3’区反向引物。在SOE-PCR之前对5’和3’片段进行柱纯化，以去除第一反应中使用的寡核苷酸。通过琼脂糖凝胶提取纯化融合的同源定向修复(HDR)模板。在一步II型组装反应中将寡核苷酸双链体和HDR模板克隆到pCC027质粒中。将II型组装反应混合物转化到大肠杆菌DH10B细胞(Life technologies)中。将转化子涂布在含有X-Gal、IPTG和卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂平板上，在37℃下培养过夜。从单个克隆中分离质粒DNA，通过限制性消化或PCR分析并验证序列。

寡核苷酸退火以形成寡核苷酸双链体

将寡核苷酸在水中的浓度调整为100μM。将5μl正向和5μl相应的反向寡核苷酸添加至90μl 30mM HEPES-缓冲液(pH 7.8)中。将反应混合物加热至95℃，持续5min，然后从95℃降低至4℃进行退火，以0.1℃/sec的速度降低温度(Cobb,R.E.,Wang,Y.,&Zhao,H.(2015).High-Efficiency Multiplex Genome Editing of Streptomyces Species Usingan Engineered CRISPR/Cas System.ACS Synthetic Biology,4(6),723–728)。

用于等位交换的pCC031–degU32(Hy)质粒

通过将野生型基因与degU32等位基因(也称作sacU32)交换来实现DegU H12L过度磷酸化突变体的构建(Kunst,F.；Pascal,M.；Lepesant-Kejzlarova,J.；Lepesant,J.A.；Billault,A.；Dedonder,R.(1974):Pleiotropic mutations affecting sporulationconditions and the syntheses of extracellular enzymes in Bacillus subtilis168.Biochemie 56(11-12),S.1481–1489)。如上所述进行引入DegU H12L突变的degU32基因组编辑构建体的构建，但是，引入DegU H12L突变的突变以及引入沉默点突变以去除PAM位点的degU32同源区订购为基因合成构建体(Geneart,Regensburg)，具有侧翼BsaI位点(SEQ ID 032)。设计sgRNA的degU基因的20bp靶序列，并且如上所述将得到的具有5’磷酸化的寡核苷酸SEQ ID 033和SEQ ID 034退火以形成寡核苷酸双链体。

pCC050-bslA基因缺失质粒

通过鉴定特征性N-末端序列和C-末端CxC基序来交叉检验bslA编码区(登录号AAU42812；基因座标签：地衣芽孢杆菌DSM13＝BLi03999)，以区分BslA蛋白与其旁系同源物YweA(Morris,R.J.；Schor,M.；Gillespie,R.M.C.；Ferreira,A.S.；Baldauf,L.；Earl,C.etal.(2017):Natural variations in the biofilm-associated protein BslAfrom thegenus Bacillus.Sci.Rep.7(1),S.6730)。为了构建bslA基因缺失载体，使用地衣芽孢杆菌gDNA作为模板，用寡核苷酸SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6扩增5’和3’同源侧翼区域，并如上所述通过SOE-PCR融合。通过寡核苷酸Seq ID 007和Seq ID 008的退火构建bslA特异性间隔序列。在一步II型组装反应中将寡核苷酸双链体和HDR模板克隆到pCC027中。将得到的质粒命名为pCC050。

pCC051-epsA-epsO基因缺失质粒

为了缺失epsABCDEFGHIJKLMNO操纵子(yveK–yvfF)，使用地衣芽孢杆菌gDNA作为模板，用寡核苷酸SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38扩增同源侧翼区域。通过SOE-PCR融合5’和3’片段，产生HDR模板。通过寡核苷酸SEQ ID NO:39和SEQID NO:40的退火构建间隔序列。在一步II型组装反应中将寡核苷酸双链体和HDR模板克隆到pJOE-T2A中。将得到的质粒命名为pCC051。

pCC052-slrA基因缺失质粒

为了缺失slrA基因(登录号AAU42855；基因座标签：地衣芽孢杆菌DSM13＝BLi04042，SEQ ID NO:152)，使用地衣芽孢杆菌gDNA作为模板，用寡核苷酸Seq ID 043和Seq ID 044和Seq ID 045和Seq ID 046扩增同源侧翼区域。通过SOE-PCR融合5’和3’片段，产生HDR模板。通过寡核苷酸Seq ID 037和Seq ID 048的退火构建slrA特异性间隔序列。在一步II型组装反应中将寡核苷酸双链体和HDR模板克隆到pJOE-T2A中。将得到的质粒命名为pCC052。

pCC053-tapA-sipW-tasA基因缺失质粒

为了缺失tapA-sipW-tasA操纵子，使用地衣芽孢杆菌的gDNA作为模板，用寡核苷酸Seq ID 049和Seq ID 050和Seq ID 051和Seq ID 052扩增同源侧翼区域。通过SOE-PCR融合5’和3’片段，产生HDR模板。通过寡核苷酸SEQ ID 053和Seq ID 054的退火构建tapA-sipW-tasA特异性间隔序列。在一步II型组装反应中将寡核苷酸双链体和HDR模板克隆到pJOE-T2A中。将得到的质粒命名为pCC053。

菌株

大肠杆菌菌株Ec#098

大肠杆菌菌株Ec#098是携带编码DNA-甲基转移酶的表达质粒pMDS003WO2019016051的大肠杆菌INV110菌株(Life technologies)。

地衣芽孢杆菌基因k.o.菌株的产生

为了在地衣芽孢杆菌菌株(US5352604)及其衍生物中进行基因缺失，将缺失质粒转化到根据Chung的方法制备的感受态大肠杆菌菌株Ec#098中(Chung,C.T.,Niemela,S.L.,and Miller,R.H.(1989).One-step preparation of competent Escherichiacoli:transformation and storage of bacterial cells in the same solution.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A86,2172-2175)，然后在含有100μg/ml氨苄西林和30μg/ml氯霉素的LB-琼脂平板上于37℃下进行选择。从单个克隆中分离质粒DNA，并用于随后转移到地衣芽孢杆菌菌株中。分离的质粒DNA分别携带地衣芽孢杆菌菌株(US5352604)的DNA甲基化模式，并且在转移至地衣芽孢杆菌中时免受降解。对于具有缺失的限制酶基因的地衣芽孢杆菌菌株中的基因缺失，在大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)内构建缺失质粒。

地衣芽孢杆菌P304：缺失的限制性内切酶

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌细胞，用1μg分离自大肠杆菌Ec#098的pDel006限制酶基因缺失质粒转化，然后在30℃下涂布于含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上。

如下所述进行基因缺失过程：

使携带质粒的地衣芽孢杆菌细胞在具有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上于45℃下生长，驱动缺失质粒通过Campbell重组整合到染色体中，pDel006的同源区之一与限制酶基因的序列5’或3’同源。挑取克隆，在没有选择压力的LB-培养基中于45℃下培养6小时，然后涂布在具有5μg/ml红霉素的LB-琼脂培养基上并在30℃下培养过夜。挑取单个克隆，用寡核苷酸SEQ ID 016和SEQ ID 017通过菌落-PCR分析筛选限制酶基因的成功基因组缺失。挑取推定的缺失阳性单个克隆，在不含抗生素的LB培养基中于45℃下连续两次过夜培养以固化质粒，并且涂布于LB-琼脂平板上在37℃下过夜培养。通过菌落PCR分析单克隆，确定限制酶基因的基因组缺失成功。分离出具有正确缺失的限制酶基因的单个红霉素敏感克隆，命名为地衣芽孢杆菌P304。

地衣芽孢杆菌P305：缺失的sigF基因

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌P304细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)的pDel005 sigF基因缺失质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。

如对限制酶基因所述进行基因缺失过程。

用寡核苷酸SEQ ID 025和SEQ ID 026通过PCR分析sigF基因的缺失。将得到的缺失sigF基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌P305，并且如所述(WO9703185)不再能够产生芽孢。

地衣芽孢杆菌P307：缺失的aprE基因

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌P305细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞的pDel003 aprE基因缺失质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。

如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失过程。用寡核苷酸SEQ ID 022和SEQ ID023通过PCR分析aprE基因的缺失。将得到的缺失aprE基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌P307。

地衣芽孢杆菌M309：缺失的多聚γ-谷氨酸合成基因

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌P307细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)的pDel007 pga基因缺失质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。

如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失过程。用寡核苷酸SEQ ID 019和SEQ ID020通过PCR分析pga基因的缺失。将得到的缺失pga合成基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌M309。

地衣芽孢杆菌M409：将BLAP蛋白酶表达盒整合到多聚γ谷氨酸合成(pga)基因座中

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌P307细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)的pMA110-pga::PaprE-BLAP基因缺失/整合质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。

如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失/整合过程。用寡核苷酸SEQ ID ID NO:19和SEQ ID NO:20通过PCR分析通过置换pga基因整合BLAP表达盒。将得到的具有整合BLAP表达盒基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌M409。

地衣芽孢杆菌PC30：缺失的tapA-sipW-tasA操纵子

如下进行tapA-sipW-tasA操纵子的缺失。如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌M409细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞的pCC053质粒转化，然后涂布在含有20μg/ml卡那霉素的LB-琼脂平板上并在37℃下培养过夜。

第二天对转化反应的克隆进行菌落PCR，以分析地衣芽孢杆菌tapA-sipW-tasA操纵子的成功缺失。将阳性克隆转移到不含抗生素的新鲜LB-琼脂平板上，然后在48℃下培养过夜用于质粒固化。再次通过PCR分析卡那霉素敏感克隆，并且对缺失的基因座进行序列验证。将得到的菌株命名为地衣芽孢杆菌PC30。

地衣芽孢杆菌PC31：缺失的epsA-0操纵子

如对地衣芽孢杆菌菌株PC30所述构建携带epsA-O操纵子缺失的地衣芽孢杆菌菌株PC31，但是使用质粒pCC051。

地衣芽孢杆菌PC40：缺失的epsA-0操纵子和缺失的tapA-sipW-tasA操纵子

如对地衣芽孢杆菌菌株PC31所述，使用质粒pCC051将epsA-O操纵子缺失引入携带tapA-sipW-tasA操纵子缺失的地衣芽孢杆菌菌株PC31中。

地衣芽孢杆菌PC54：缺失的bslA基因

如对地衣芽孢杆菌菌株PC30所述构建携带bslA(yuaB)缺失的地衣芽孢杆菌菌株PC54，但是使用质粒pCC050。

地衣芽孢杆菌PC32：缺失的slrA基因

如对地衣芽孢杆菌菌株PC30所述构建携带slrA缺失的地衣芽孢杆菌菌株PC32，但是使用质粒pCC052。

地衣芽孢杆菌PC36：degU H12L突变

如对地衣芽孢杆菌菌株PC30所述构建携带突变的degU32等位基因导致DegU H12L突变的地衣芽孢杆菌菌株PC36，但是使用质粒pCC031。

地衣芽孢杆菌PC38：缺失的epsA-O操纵子和degU H12L突变

如对地衣芽孢杆菌菌株PC36所述，使用质粒pCC031将degU32(DegU H12L)突变引入地衣芽孢杆菌菌株PC31(ΔepsA-O)中。

地衣芽孢杆菌PC39：缺失的tapA-sipW-tasA操纵子和degU H12L突变

如对地衣芽孢杆菌菌株PC36所述，使用质粒pCC031将degU32(DegU H12L)突变引入地衣芽孢杆菌菌株PC30(ΔtapA-sipW-tasA)中。

地衣芽孢杆菌PC41：缺失的epsA-O和tapA-sipW-tasA操纵子与degU H12L突变组合

如对地衣芽孢杆菌菌株PC36所述，使用质粒pCC031将degU32(DegU H12L)突变引入地衣芽孢杆菌菌株PC40(ΔepsA-O,ΔtapA-sipW-tasA)中。

地衣芽孢杆菌PC55：缺失的bslA和degU H12L突变

如对地衣芽孢杆菌菌株PC36所述，使用质粒pCC031将degU32(DegU H12L)突变引入地衣芽孢杆菌菌株PC54(ΔbslA)中。

地衣芽孢杆菌PC56：epsA-O、tapA-sipW-tasA、bslA的联合缺失和degU H12L突变的引入

如对地衣芽孢杆菌菌株PC54所述，使用质粒pCC0050和地衣芽孢杆菌PC41作为亲本菌株，构建携带epsA-O、tapA-sipW-tasA、bslA(yuaB)缺失和degU32(DegU H12L)等位基因的地衣芽孢杆菌菌株PC56。

地衣芽孢杆菌PC51：缺失的slrA和degU H12L突变

如对地衣芽孢杆菌菌株PC36所述，使用质粒pCC031将degU32(DegU H12L)突变引入地衣芽孢杆菌菌株PC32(ΔslrA)中。

地衣芽孢杆菌PC57：将degQ表达盒整合到CAT基因座中

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌PM409细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)的pInt010基因缺失/整合质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。

如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失/整合过程。通过PCR分析通过置换CAT-基因座整合degQ表达盒。将得到的具有整合degQ表达盒基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌PC57。

地衣芽孢杆菌PC58：将degQ表达盒整合到PC40菌株中

如对地衣芽孢杆菌PC57的构建所述在地衣芽孢杆菌PC40中进行质粒pInt010的基因缺失/整合过程。将得到的具有整合degQ表达盒基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌PC58。

aprE基因缺失菌株Bli#002

如上所述制备US5352604中所述的电转感受态的地衣芽孢杆菌细胞，用1μg分离自大肠杆菌Ec#098的pDel003 aprE基因缺失质粒转化，然后在30℃下涂布于含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上。

如下所述进行基因缺失过程：

使携带质粒的地衣芽孢杆菌细胞在具有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上于45℃下生长，迫使缺失质粒通过Campbell重组整合到染色体中，pDel003的同源区之一与aprE基因的序列5’或3’同源。挑取克隆，在没有选择压力的LB-培养基中于45℃下培养6小时，然后在30℃下涂布于具有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上。挑取单个克隆，通过菌落-PCR分析aprE基因的成功缺失。挑取推定的缺失阳性单个克隆，在不含抗生素的LB培养基中于45℃下连续两次过夜培养以固化质粒，并且涂布在LB-琼脂平板上于30℃下过夜培养。将单克隆再次在具有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上重新划线，并且通过菌落PCR分析aprE基因的成功缺失。分离出具有正确缺失的aprE基因的单个红霉素敏感克隆，命名为Bli#002。

amyB基因缺失菌株Bli#003

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌Bli#002细胞，用1μg分离自大肠杆菌Ec#098的pDel004 amyB基因缺失质粒转化，然后在30℃下涂布于含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上。

如对aprE基因所述进行基因缺失过程。

通过PCR分析amyB基因的缺失。将得到的具有缺失的aprE和缺失的amyB基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为Bli#003。

sigF基因缺失菌株Bli#004

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌Bli#003细胞，用1μg分离自大肠杆菌Ec#098的pDel005 sigF基因缺失质粒转化，然后在30℃下涂布于含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上。

如对aprE基因所述进行基因缺失过程。

通过PCR分析sigF基因的缺失。将得到的具有缺失的aprE、缺失的amyB基因和缺失的sigF基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为Bli#004。如所述(WO9703185)地衣芽孢杆菌菌株Bli#004不再能够产生芽孢。

多聚γ谷氨酸合成基因缺失菌株Bli#008

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌Bli#004细胞，用1μg分离自大肠杆菌Ec#098的pDel007 pga基因缺失质粒转化，然后在30℃下涂布于含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上。

如对aprE基因缺失所述进行基因缺失过程。

通过PCR分析pga基因的缺失。将得到的具有缺失的aprE、缺失的amyB基因、缺失的sigF基因和缺失的pga基因簇的地衣芽孢杆菌菌株命名为Bli#008。

remA R18W P29S菌株Bli#030

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌Bli#008细胞，用1μg分离自大肠杆菌Ec#098的pDel034 remA基因编辑质粒转化，然后在30℃下涂布于含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上。

如对aprE基因缺失所述进行基因缺失过程。

用ClaI限制性内切酶进行限制性酶切割后，用寡核苷酸通过PCR分析remA基因的基因编辑。将得到的具有缺失的aprE、缺失的amyB基因、缺失的sigF基因、缺失的pga基因簇和突变的remAR18W P19S的地衣芽孢杆菌菌株命名为Bli#030。

地衣芽孢杆菌P311：缺失的forD基因

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌M309细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞的pDel023 forD基因缺失质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。

如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失过程。用寡核苷酸通过PCR分析forD基因的缺失。将得到的具有缺失forD基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌P311。

地衣芽孢杆菌P312：将degQ表达盒整合到CAT基因座中

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌M309细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞(Life technologies)的pInt010基因缺失/整合质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。

如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失/整合过程。通过PCR分析通过置换CAT-基因座整合degQ表达盒。将得到的具有整合degQ表达盒基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌P312。

地衣芽孢杆菌P313：缺失的forD基因

如上所述制备电转感受态的地衣芽孢杆菌M409细胞，用1μg分离自大肠杆菌INV110细胞的pDel023 forD基因缺失质粒转化，然后涂布在含有5μg/ml红霉素的LB-琼脂平板上并在30℃下培养过夜。

如对限制酶基因缺失所述进行基因缺失过程。用寡核苷酸通过PCR分析forD基因的缺失。将得到的具有缺失forD基因的地衣芽孢杆菌菌株命名为地衣芽孢杆菌P313。

degQ启动子分析

驯化的枯草芽孢杆菌菌株168在degQ基因的启动子区内含有核苷酸交换，导致degQ表达水平较低，而degQ36Hy突变类似于对野生型启动子的反向突变(Stanley NR,Lazazzera BA.Mol Microbiol.2005；57(4):1143-1158)。因此，分析了来自不同驯化和未驯化的枯草芽孢杆菌菌株以及其他芽孢杆菌物种的degQ基因5’区内的启动子在保守启动子区内的核苷酸交换。

启动子区的获得和比对如下：从NCBI Genomes中手动收集来自各种芽孢杆菌菌株的全基因组组装体，其中仅考虑完整的基因组用于进一步分析。随时获得模式菌株和参考基因组。degQ基因主要通过基因组中注释的名称进行鉴定。对于两个菌株，即短小芽孢杆菌SH-B9和贝莱斯芽孢杆菌FZB42，使用地衣芽孢杆菌DSM13 DegQ蛋白作为查询(SEQ ID170)，将degQ基因鉴定为BLAST搜索结果的第一位(通过bitscore)。使用Geneious Prime2020.1.2进行BLAST搜索，用程序tblastn和以下参数：BLOSUM80矩阵，最大评估值0.1，缺口开放损失10，缺口延伸损失1，启用低复杂度过滤器，最多10次命中。为了启动子比对的目的，将启动子定义为degQ 5’末端上游的序列，从degQ基因链手动提取序列后延伸至上游注释基因的起始/末端。

用Geneious Prime 2020.1.2比对完整的启动子区，参数如下：

-aligner：ClustalO版本1.2.2

-细化迭代次数(--iter)：30

-使用全距离矩阵进行初始和迭代引导树计算(--full,--full-iter)

将最终比对截短为相对于翻译起始密码子的核苷酸-61至-119，以允许可读性，如图2所示。

表1总结了用于degQ启动子分析的信息。

表1

生物体	DegQ PRT[SEQ ID]	degQ-5’区[SEQ ID]
			枯草芽孢杆菌168	160	179
枯草芽孢杆菌菌株NCIB 3610	160	180
			地衣芽孢杆菌菌株ATCC 14580＝DSM 13	170	181
短小芽孢杆菌菌株SH-B9	176	182
			贝莱斯芽孢杆菌FZB42	177	183
解淀粉芽孢杆菌XH7	178	184

实施例1：

在基于微量滴定板的补料分批过程中培养具有导致生物膜组分产量减少和磷酸化DegU水平增加的遗传修饰(如表2所示)的地衣芽孢杆菌菌株(Habicher et al.,2019Biotechnol J.；15(2))。

表2–地衣芽孢杆菌突变菌株‘D’表示缺失；RE：限制性内切酶

地衣芽孢杆菌菌株名称	基因型
		DSM641(US5352604)	野生型
P304	DSM641 DRe
		P305	DSM641 DRe,DsigF
P307	DSM641 DRe,DsigF,DaprE
		M309	DSM641 DRe,DaprE,DsigF,Dpga
M409	DSM641 DRe,DaprE,DsigF,pga::BLAPR
		PC30	M409 DtapA-sipW-tasA
PC31	M409 DepsA-O
		PC40	M409 DepsA-O,DtapA-sipW-tasA
PC54	M409 DbslA
		PC32	M409 DslrA
PC36	M409 degU32(H12L)
		PC39	M409 DtapA-sipW-tasA,degU32
PC38	M409 DepsA-O,degU32
		PC41	M409 DepsA-O,DtapA-sipW-tasA,degU32
PC55	M409 DbslA,degU32
		PC56	M409 DepsA-O,DtapA-sipW-tasA,degU32,DbslA
PC51	M409 DslrA,degU32

所有培养均在直径为25mm的轨道摇床(Innova 42,New Brunswick Scientific,Eppendorf AG；Hamburg,Germany)中在30℃和400rpm下进行。将菌株在FlowerPlates(MTP-48-OFF,m2p-labs GmbH)中进行后续两次预培养，使其同步生长。第一次预培养在800μl TB培养基中进行，接种来自划线在LB琼脂平板上的菌株的新鲜单菌落。20h后，用8μl第一次预培养物接种含有800μl V3基本培养基的第二次预培养物(Meissner etal.,2015,Journalof industrial microbiology&biotechnology 42(9):1203–1215)并培养24h。使用48-孔圆形和深孔微量滴定板进行基于微量滴定板的补料分批主要培养，每个孔的底部都有含葡萄糖的聚合物(FeedPlate,货号:SMFP08004,Kuhner Shaker GmbH；Herzogenrath,Germany)。将70μl第二次预培养物用于接种700μl不含葡萄糖的V3基本培养基。将主要培养物温育72h。用无菌透气密封箔(AeraSeal薄膜，Sigma-Aldrich)覆盖预培养物以避免污染。将饲养板用无菌透气、减少蒸发的箔(F-GPR48-10,m2p-labs GmbH)密封，以减少蒸发和避免污染。

在发酵过程结束时，取出样品并通过光度法测定蛋白酶活性：通过使用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基酰苯胺(Suc-AAPF-pNA，短AAPF；参见例如DelMar et al.(1979),Analytical Biochem 99,316-320)作为底物来测定蛋白水解活性。通过在30℃，pH8.6TRIS缓冲液中进行蛋白水解切割，将pNA从底物分子上切割下来，导致释放黄色的游离pNA，通过在OD₄₀₅处测量进行定量。

地衣芽孢杆菌菌株M409的蛋白酶产量设定为100％，其他地衣芽孢杆菌菌株的蛋白酶产量相应地参考M409。在图3中，与地衣芽孢杆菌菌株M409和阴性对照菌株M309相比，绘制了补料分批培养的72h时间点突变地衣芽孢杆菌菌株的相对蛋白酶活性百分比。如前所述，eps(epsA-O,Strain PC31)的缺失提高蛋白酶表达。相反，tasA(tapA-sipW-tasA，菌株PC30)、bslA(菌株PC54)和slrA(菌株PC32)的单一失活以及eps和tasA(菌株PC40)的同时失活导致蛋白酶活性略微降低或相当野生型。如前所述，degU32等位交换degU导致蛋白酶表达增强1.25倍。在degU32菌株背景中tasA、eps和slrA的失活(菌株PC39、PC38、PC51)进一步提高蛋白酶表达，与亲本菌株M409相比提高1.5–1.6倍，与degU32单突变菌株PC36相比提高1.2–1.3倍。失活的bslA基因和degU32等位基因的组合(菌株PC55)并不提高蛋白酶表达，尽管在芽孢杆菌中生物膜组分bslA的转录由DegU-P直接激活。

实施例2：

如实施例1所述，在基于微量滴定板的补料分批过程中培养具有导致生物膜组分产量减少和磷酸化DegU水平增加的遗传修饰(如表3所示)的地衣芽孢杆菌菌株。

表3–地衣芽孢杆菌突变菌株‘D’表示缺失；RE：限制性内切酶

地衣芽孢杆菌菌株名称	基因型
		PC36	M409 degU32(H12L)
PC57	M409 CAT::Psy-DegQ
		PC58	M409 DepsA-O,DtapA-sipW-tasA,CAT::Psy-DegQ

在发酵过程结束时，取出样品并如实施例1所述通过光度法测定蛋白酶活性。

携带degU32(H12L)突变的地衣芽孢杆菌菌株PC36的蛋白酶产量设定为100％，其他地衣芽孢杆菌菌株的蛋白酶产量相应地参考PC36。在图4中，与地衣芽孢杆菌菌株PC36(degU32(H12L))相比，绘制了补料分批培养的72h时间点突变地衣芽孢杆菌菌株的相对蛋白酶活性百分比。在地衣芽孢杆菌M409中引入内源天然degQ基因旁边的强组成型启动子控制下的degQ基因的额外拷贝，得到地衣芽孢杆菌菌株PC57。与地衣芽孢杆菌菌株PC36(degU32(H12L))相比，地衣芽孢杆菌菌株PC57的蛋白酶产量甚至提高了40％。与实施例1中结合degU32突变与tasA和eps基因失活的菌株PC41类似，通过将强组成型启动子控制下的degQ基因的额外拷贝引入携带失活的tasA和eps操纵子和地衣芽孢杆菌菌株PC40，构建了地衣芽孢杆菌菌株PC58。与已经改进的地衣芽孢杆菌菌株PC57相比，得到的地衣芽孢杆菌菌株PC58显示蛋白酶表达进一步提高了1.15倍。

表生物膜

表A：枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的生物膜基因(PRT：蛋白)

/>

实施例3：RemA内保守氨基酸位置的鉴定

感兴趣的蛋白序列中氨基酸的保守位置可以如下确定：

在第一步中，用感兴趣的序列和来自数据库的序列创建多序列比对，优选使用作用于UniRef30数据库(优选版本2020_06)的程序HHblits(优选版本3.3.0)，使用默认参数。

HHblits是HH-套件(Steinegger M,Meier M,Mirdita M,H,Haunsberger S J,and/>J(2019)HH-suite3 for fast remote homology detectionand deep protein annotation,BMC Bioinformatics,473)的一部分，可以例如下载自https://github.com/soedinglab/hh-suite/。

数据库UniRef30(Mirdita M,von den Driesch L,Galiez C,Martin MJ,J,Steinegger M.Uniclust databases of clustered and deeply annotated proteinsequences and alignments.Nucleic Acids Res.2017Jan 4；45(D1):D170-D176.)可以例如下载自https://uniclust.mmseqs.com/。

为了便于对比对中的每个位置进行后续统计计算，还可以将得到的比对转化为FASTA格式。例如，可以用工具“reformat.pl”将A3M比对格式转化为FASTA格式，该工具也包括在HH-套件内，使用-r参数。

在第二步中，对于每个比对位置，信息含量(IC)值应当计算为值R_Sequence(l)，如Schneider,T.D.；Stephens,R.M.Sequence Logos:ANew Way to Display ConsensusSequences.Nucleic Acids Res.1990,18(20),6097–6100所述，使用氨基酸序列的20种状态。

保守位置被定义为具有2.0或更高的信息含量。

表4列出了参考RemA的查询序列(SEQ ID 154)在氨基酸位置的多序列比对(MAS)的IC值。

表4

/>

/>

Pos.＝位置

AA＝氨基酸

IC＝信息含量

C.＝IC>2.0的保守氨基酸；用*(星号)标记MAS.＝多序列比对

实施例4：地衣芽孢杆菌酶表达菌株的产生

如上所述将表5中所列的地衣芽孢杆菌菌株制备感受态。从枯草芽孢杆菌Bs#056菌株(WO2019016051)分离蛋白酶表达质粒pUK56(WO2019016051)，以携带地衣芽孢杆菌特异性DNA甲基化模式。在所示菌株中转化质粒，并涂布在具有20μg/μl卡那霉素的LB-琼脂平板上。通过限制性消化分析单个克隆的质粒DNA正确性，并且通过将单个克隆转移到具有1％脱脂奶的LB-平板上以清除蛋白酶生成菌株的区域形成来评估功能酶的表达。得到的地衣芽孢杆菌表达菌株列于表5中。

表5：地衣芽孢杆菌表达菌株概述

地衣芽孢杆菌表达菌株	表达质粒	地衣芽孢杆菌菌株
			BES#130	pUK56	Bli#008
BES#131	pUK56	Bli#030

实施例5：地衣芽孢杆菌蛋白酶表达菌株的培养

使用化学成分确定的发酵培养基在发酵过程中培养来自实施例4的地衣芽孢杆菌菌株。

在发酵过程中提供以下常量元素：

在发酵过程中提供以下微量元素：

用含有8g/l葡萄糖的培养基开始发酵。使用含有50％葡萄糖的溶液作为进料溶液。在发酵期间使用氨调整pH。在两个实验中，添加的化学成分确定的碳源总量保持在每升初始培养基200g以上。在有氧条件下进行发酵，持续时间超过70小时。

在发酵过程结束时，取出样品并通过光度法测定蛋白酶活性：通过使用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基酰苯胺(Suc-AAPF-pNA，短AAPF；参见例如DelMar et al.(1979),Analytical Biochem 99,316-320)作为底物来测定蛋白水解活性。通过在30℃，pH8.6TRIS缓冲液中进行蛋白水解切割，将pNA从底物分子上切割下来，导致释放黄色的游离pNA，通过在OD405处测量进行定量。

通过将产物滴度除以每最终反应器体积添加的葡萄糖量来计算蛋白酶产量。将菌株BES#130的蛋白酶产量设定为100％，菌株BFS#131的蛋白酶产量相应地参考BES#130(表6)。与地衣芽孢杆菌表达菌株BES#130相比，具有突变的remA基因(导致包含突变R18W和P29S的改变的RemA蛋白)的地衣芽孢杆菌表达菌株BES#131的蛋白酶产量提高了10％。

表6地衣芽孢杆菌表达菌株的蛋白酶产量

地衣芽孢杆菌表达菌株	蛋白酶产量[％]
		BES#130	100
BES#131	110

实施例6：

在基于微量滴定板的补料分批过程中培养具有遗传修饰(如表1所示)的地衣芽孢杆菌菌株(Habicher et al.,2019Biotechnol J.；15(2))。

表7–地衣芽孢杆菌突变菌株‘D’表示缺失；RE：限制性内切酶

地衣芽孢杆菌菌株名称	基因型
		DSM641(P300)	野生型
M309	P300 DRe,DaprE,DsigF,Dpga
		P311	M309 DforD
P312	M309 CAT::Psy-DegQ

所有培养均在直径为25mm的轨道摇床(Innova 42,New Brunswick Scientific,Eppendorf AG；Hamburg,Germany)中在30℃和400rpm下进行。将菌株在FlowerPlates(MTP-48-OFF,m2p-labs GmbH)中进行后续两次预培养，使其同步生长。第一次预培养在800μl TB培养基中进行，接种来自划线在LB琼脂平板上的菌株的新鲜单菌落。20h后，用8μl第一次预培养物接种含有800μl V3基本培养基的第二次预培养物(Meissner etal.,2015,Journalof industrial microbiology&biotechnology 42(9):1203–1215)并培养24h。使用48-孔圆形和深孔微量滴定板进行基于微量滴定板的补料分批主要培养，每个孔的底部都有含葡萄糖的聚合物(FeedPlate,货号:SMFP08004,Kuhner Shaker GmbH；Herzogenrath,Germany)。将70μl第二次预培养物用于接种700μl不含葡萄糖的V3基本培养基。将主要培养物温育72h。用无菌透气密封箔(AeraSeal薄膜，Sigma-Aldrich)覆盖预培养物以避免污染。将饲养板用无菌透气、减少蒸发的箔(F-GPR48-10,m2p-labs GmbH)密封，以减少蒸发和避免污染。

在培养过程结束时，通过离心和用0.2μm过滤器无菌过滤制备培养上清液。对于SDS-PAGE分析，将等量的上清液直接用2xSDS样品缓冲液重悬并在95℃下煮沸10min，然后上样于SDS-PAGE凝胶上。

对于SDS PAGE分析，将4-12％BIS-TRIS-Gel(NuPAGE)、10孔与MES运行缓冲液一起使用。使用溶于乙酸/乙醇的考马斯亮蓝G250进行染色，用乙酸/乙醇进行脱色。

图5显示地衣芽孢杆菌M309培养上清液的SDS PAGE，与具有缺失的forD基因的地衣芽孢杆菌P311菌株以及具有组成型启动子控制下的degQ基因额外拷贝的包含forD基因的地衣芽孢杆菌P312菌株相比，DegQ表达水平增加。令人惊讶的是，与对照菌株M309相比，在地衣芽孢杆菌P312菌株中，Formosin D的量大大减少。作为对照，具有缺失的forD基因的地衣芽孢杆菌P311菌株在SDS-PAGE上未显示Formosin D条带。图5：模拟补料分批培养72h后，来自地衣芽孢杆菌菌株的上清液的SDS-PAGE。1-3＝对照菌株；4＝ForD缺失菌株；5-7＝DegQ过量表达菌株；M＝Precision Plus Protein Standard，具有指示大小(kDa)的所选条带；实心箭头突出了ForD蛋白条带。

实施例7：

如实施例6所述在基于微量滴定板的补料分批过程中培养具有遗传修饰(如表8所示)的地衣芽孢杆菌菌株。

表8–地衣芽孢杆菌突变菌株‘D’表示缺失；RE：限制性内切酶

地衣芽孢杆菌菌株名称	基因型
		DSM641(P300)	野生型
M309	P300 DRe,DaprE,DsigF,Dpga
		M409	M309 pga::BLAP
P313	M409 DforD
		PC57	M409 CAT::Psy-DegQ

在培养过程结束时，通过离心和用0.2μm过滤器无菌过滤制备培养上清液。对于SDS-PAGE分析，将上清液TCA沉淀，然后进行SDS-PAGE，用考马斯蓝染色。对于TCA沉淀，将样品调整至13.3％TCA(w/w)，在冰上保持10min，然后使用台式离心机沉淀，用丙酮洗涤沉淀。然后使用1xSDS样品缓冲液重悬沉淀。在SDS-PAGE之前，将样品在95℃下煮沸10min。对于SDS-PAGE分析，将等量的上清液上样于SDS-PAGE凝胶上。对于SDS PAGE分析，将4-12％BIS-TRIS-Gel(NuPAGE)、10孔与MES运行缓冲液一起使用。使用溶于乙酸/乙醇的考马斯亮蓝G250进行染色，用乙酸/乙醇进行脱色。

图6显示地衣芽孢杆菌M409培养上清液的SDS PAGE，与具有缺失的forD基因的地衣芽孢杆菌P313菌株以及具有组成型启动子控制下的degQ基因额外拷贝的包含forD基因的地衣芽孢杆菌PC57菌株相比，DegQ表达水平增加。令人惊讶的是，与对照菌株M409相比，在地衣芽孢杆菌PC57菌株中，Formosin D的量大大减少。作为对照，具有缺失的forD基因的地衣芽孢杆菌P313菌株在SDS-PAGE上未显示Formosin D条带。图6：模拟补料分批培养72h后，来自地衣芽孢杆菌蛋白酶表达菌株的上清液的SDS-PAGE。1-3＝对照菌株；4＝ForD缺失菌株；5-7＝DegQ过量表达菌株；M＝Precision Plus Protein Standard，具有指示大小(kDa)的所选条带；实心箭头突出了ForD蛋白条带；空心箭头表示异源蛋白酶。

序列表

<110> 巴斯夫欧洲公司

<120> 改良的芽孢杆菌生产宿主

<130> 202298

<160> 218

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 507

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 5-prime region of pga genes with flanking BsaI sites

<400> 1

ggtctcagag aataattcct atcagatttt tgtcagcgtt ttaagtatgc gctttcaaaa 60

ttcgacatta tgatttttgt acttttctcc ctatttcaga tgaaaggttg aaggatggat 120

tcaggatctc ttttttcccc cggccgcaat cccctttaaa tgggctgtca gccgggatgt 180

ctcttttctt ttagtatttt cgctcttttc gaacaggtta aaaagtcacc aatgttccct 240

cttcaaaaca aatccgtcct atgacaatca gaccatctat caaaaaatga aaatctcttt 300

tagcataaag cgggattcat tgacaaatcc aaatattttg tgagtcgttc gatccacctt 360

atttcttcag attttaggtt aaaatcctag gatttaaaaa gccattaatt tttttcaatg 420

ataattcatc aaactttaac atttttaatt tttcttacta ttctcattgt tactgtattc 480

gccattaaac gcccctctca tgagacc 507

<210> 2

<211> 560

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 3-prime region of pga genes with flanking BsaI sites

<400> 2

ggtctcaacc cagttaaaaa taaagacatc caaagcaccg caattccaca aaacaaaacc 60

aactttttgt ttgccgcttt ttttatcaat tgatctgttc ctcctcttct ttcctctttc 120

atcgtcattc aactgggata tttaaaggac tttttttgca tgtacagcag cgtcatagcg 180

agaagaaacg ctcagcacag catgatcagc tttttcacct aagcgcggat taaaaagatg 240

aagggaaata ttctaaagag gtcatgaaca tgaggtgcgg ttcccatccc gaattggtaa 300

ggtgatgcat tttcaaattt tgcttcagtc gaaatttgtc agtttttatt cccttcaaaa 360

gaatacaata aacatgaacc ccaaaaccat gtatatatcc tcctgatttt ctataaaact 420

ttatacactg accggttaag aaaattgtcg tgtttccctt tcaaaccggc cgcttttcac 480

aggtctttta taaccgggat cagcacacaa aaaagagagc gccggcggca ctctcttttg 540

cactgttatg cgacgagacc 560

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomA bslA

<400> 3

ggtggtggtc tctacccggc caacgaggcc tcaatcataa actcggttcg tg 52

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomA bslA

<400> 4

ggagcttttt tgcctattta cacagcaatt cccccaagtc 40

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomB bslA

<400> 5

gacttggggg aattgctgtg taaataggca aaaaagctcc aaag 44

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomB bslA

<400> 6

ggtggtggtc tcttgagggc cttattggcc atgtctgctt ctatccgatg 50

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: Spacer bslA

<400> 7

tacgaactga atctgtctac cgcc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: Spacer bslA

<400> 8

aaacggcggt agacagattc agtt 24

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of pE194

<400> 9

tatatacagc tggattcaca aaaaataggc ac 32

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of pE194

<400> 10

tatatacagc tggattatgt cttttgcgca gtc 33

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of functional mRFP cassette

<400> 11

tatatggatc cgtaatcagg gtatcgaggc 30

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of functional mRFP cassette

<400> 12

tatatggatc cctcattagg cgggctacta a 31

<210> 13

<211> 2633

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> P300 DSM641 RMS region

<400> 13

tttttgccta cttatttatt tgttttcatt ttcaaattca tcataagaac ccatttcaca 60

aaaatcaatg gagtaatgtt gttcgctgtg tttataaaca attactgagt caatatttag 120

tctttccagc atttcatagg ttagaagttc tttttcctct aagttcataa cttgtcttag 180

tagccattct ccaagagcac tatttggatt agacataagt gctttactat tgtcttggca 240

taccttggct gataaaagcg atttgtctgg caagcgtaac tgaaaaggtt tatcacgagc 300

tgggaaaaat gttgggaata cattatgaat ccattttgga attggtatat aaatctcgtt 360

agggtttcgt ggtcgaccta aagcattcca ttggtttaga ccgctttttt ctggtacatg 420

acgctttgag ccacggtctg aaaagagtgg aagaataacg tgctcaaggt tttcaaaagg 480

attgacagtt ggtgctggaa tttttggaat ttcaaagcca aatagtttag ccaattcatg 540

ataaggattt tctaagattt caacattaat ttcttcaata ggtttatcag tgataaaacg 600

cttataaagg gtgctcttag tgacattaaa gctgtattcg tgtagaccgt cttcaaaggt 660

gattgtattt ctgttgttac ttactttcac atttgtaatt gaggagattt caaccaagtc 720

cattggctct tcaaaaataa gaattttccc tggctttctt gttacacagt ggtatatcat 780

tgaatcaata ccatatgttc ttttagtaaa ttcaattctc tcgttacgga gagaagcaac 840

cgtgtttatt agctcttttg gagatttccc acgatacaag tctgagtctt tattgaattc 900

agctactttt tgaagagtat gaccattacc atgaagaaaa gtcttaatac caattccgac 960

acgatttaat gaagcgtcag cagaacagtc tgacctcccc aagttttcag ctccaaatgc 1020

ttcacaaaaa gcattttcca cattccttga gaccaaataa ggcgagtcac tttcagagaa 1080

caaattggat agcgaaccag ttgagcggag catttgtttg tatgtagtgc agttgatggc 1140

tggttgatta gtatagaaca ttatttttcc tcctctttta tgcttgtcat ttcttctttc 1200

agacccaaaa ggtagtcagc tgatacgttc aatgtttcag ctattctttt gaaagtgtcc 1260

aatgatggag ttctattttc actttcatat agtgaccaag tgcttctagt gaccccgact 1320

ttttcagcga tttggctggg taataaccta cgagcttctc ttgcattttg aatacgattt 1380

ccaaggaaag gtatcatttt tgcacctcca agatttgttg ttttcagagt atcaccagaa 1440

cccccgaaaa tagtccaaag ttagctaaca gcaaacaaat aaaaataaat aagttgttta 1500

ctcttagcaa acttgttact aaaatttgat aaagttattc atttaatcca gctcttatgc 1560

taaaattgca ttagcggaca agcttaatgt ttgcaaggag gtataatttt gacttatcga 1620

gtaggtagta tgtttgctgg gataggtgga acttgtttag ggtttatcca agctggcgct 1680

aggattgtct gggcaaatga aatagacaaa aatgcttgta ttacttatag aaattatttt 1740

ggggatgctt acttacaaga gggtgacatt aacctaatag ataaaaactc catacctgaa 1800

ctggacattt tgattggagg ttttccttgc caagccttct ctatagctgg ctatcgtaaa 1860

gggtttgaag atgaaagggg aaacgtgttc tttcaaatat tagaggtatt ggaagcacaa 1920

agaaatgttt atggacactt accccaagca ataatgcttg agaatgtaaa gaacttattt 1980

acacatgata gaggtaatac gtacagagta ataaaagagg ctttggaagc ctttggttat 2040

accgtaaaag ctgaggttct taattcaatg gaatacggta acgtgccaca aaacagagag 2100

cggatttata ttgtaggttt tcaagatgag agccaagctg aaaggtttag ctttccagac 2160

ccaattcctt taacaaatca acttaatgat gtaattgacc gaactcggag agttgataaa 2220

agatattatt atgatgaaac ctctcaatat tatgatatgt tgcgagaagc catggacagt 2280

acagatacaa cttatcaaat aagacgtata tatgttcgag aaaatagaag caatgtttgt 2340

cctacactga cagcgaatat gggaactgga gggcataatg ttcctattgt attagacttt 2400

gaaaataata taagaaaact aacaccagaa gaatgcttac tattgcaagg tttcccagct 2460

gactatcatt ttccagaagg catggcaaac actcacaaat ataaacaagc tggtaactct 2520

gttacggtgc cagttataag aagaattgcc actaatatta ttagcgtatt gaacattgga 2580

atgaatataa atcaagaaca tgaatatgca atagctgaat aagaccaact aat 2633

<210> 14

<211> 1146

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding Restrictase P300 DSM641

<400> 14

atgttctata ctaatcaacc agccatcaac tgcactacat acaaacaaat gctccgctca 60

actggttcgc tatccaattt gttctctgaa agtgactcgc cttatttggt ctcaaggaat 120

gtggaaaatg ctttttgtga agcatttgga gctgaaaact tggggaggtc agactgttct 180

gctgacgctt cattaaatcg tgtcggaatt ggtattaaga cttttcttca tggtaatggt 240

catactcttc aaaaagtagc tgaattcaat aaagactcag acttgtatcg tgggaaatct 300

ccaaaagagc taataaacac ggttgcttct ctccgtaacg agagaattga atttactaaa 360

agaacatatg gtattgattc aatgatatac cactgtgtaa caagaaagcc agggaaaatt 420

cttatttttg aagagccaat ggacttggtt gaaatctcct caattacaaa tgtgaaagta 480

agtaacaaca gaaatacaat cacctttgaa gacggtctac acgaatacag ctttaatgtc 540

actaagagca ccctttataa gcgttttatc actgataaac ctattgaaga aattaatgtt 600

gaaatcttag aaaatcctta tcatgaattg gctaaactat ttggctttga aattccaaaa 660

attccagcac caactgtcaa tccttttgaa aaccttgagc acgttattct tccactcttt 720

tcagaccgtg gctcaaagcg tcatgtacca gaaaaaagcg gtctaaacca atggaatgct 780

ttaggtcgac cacgaaaccc taacgagatt tatataccaa ttccaaaatg gattcataat 840

gtattcccaa catttttccc agctcgtgat aaaccttttc agttacgctt gccagacaaa 900

tcgcttttat cagccaaggt atgccaagac aatagtaaag cacttatgtc taatccaaat 960

agtgctcttg gagaatggct actaagacaa gttatgaact tagaggaaaa agaacttcta 1020

acctatgaaa tgctggaaag actaaatatt gactcagtaa ttgtttataa acacagcgaa 1080

caacattact ccattgattt ttgtgaaatg ggttcttatg atgaatttga aaatgaaaac 1140

aaataa 1146

<210> 15

<211> 1022

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Fusion of 5-prime and 3-prime regions of restrictase gene with

flanking BsaI sites

<400> 15

ggtctcgacc caacttctat aaatgtaacg atacgattta ttgtttcatt aaagtcttcc 60

tttatttcat gttcccatat tcttttaatg ttccaatcct tttcctcgta atatttatta 120

acttccttat ctcttttttt atttctttcg agttttttct cccaatattc cgtattactt 180

tttggtatat tcccgtgttt ttcacacgca tgccagaaac aagaatcaat gaatatgact 240

attttatatt tctgtattac tatatctgga ctaccgtata atttcttaac attttttcgg 300

aatcttattc cacggtgcca tagttcttta gtaaccttat cttctaattt tgaacgagat 360

ttgattgcct gcatgttttt tcttctttgt tcttttgaaa ccgtgtcagt catagaagag 420

tcctccaaag ccacaataat tgtattctat aaacgaggaa gcaagccctc aagcttaccc 480

cctcttagtt ccttttttgc ctacttattt atatttttcc tcctctttta tgcttgtcat 540

ttcttctttc agacccaaaa ggtagtcagc tgatacgttc aatgtttcag ctattctttt 600

gaaagtgtcc aatgatggag ttctattttc actttcatat agtgaccaag tgcttctagt 660

gaccccgact ttttcagcga tttggctggg taataaccta cgagcttctc ttgcattttg 720

aatacgattt ccaaggaaag gtatcatttt tgcacctcca agatttgttg ttttcagagt 780

atcaccagaa cccccgaaaa tagtccaaag ttagctaaca gcaaacaaat aaaaataaat 840

aagttgttta ctcttagcaa acttgttact aaaatttgat aaagttattc atttaatcca 900

gctcttatgc taaaattgca ttagcggaca agcttaatgt ttgcaaggag gtataatttt 960

gacttatcga gtaggtagta tgtttgctgg gataggtgga acttgtttag gctcaggaga 1020

cc 1022

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of restrictase genomic region

<400> 16

gacaatcccc ttttactgac c 21

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of restrictase genomic region

<400> 17

ctatttcatt tgcccagaca atcc 24

<210> 18

<211> 1363

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Fusion of 5-prime and 3-prime regions of pga genes with flanking

BsaI sites

<400> 18

ggtctcgacc cgaacactga aattttagac cgggctggga tatcgagaca tatatagggg 60

cgtttaatgg cgaatacagt aacaatgaga atagtaagaa aaattaaaaa tgttaaagtt 120

tgatgaatta tcattgaaaa aaattaatgg ctttttaaat cctaggattt taacctaaaa 180

tctgaagaaa taaggtggat cgaacgactc acaaaatatt tggatttgtc aatgaatccc 240

gctttatgct aaaagagatt ttcatttttt gatagatggt ctgattgtca taggacggat 300

ttgttttgaa gagggaacat tggtgacttt ttaacctgtt cgaaaagagc gaaaatacta 360

aaagaaaaga gacatcccgg ctgacagccc atttaaaggg gattgcggcc gggggaaaaa 420

agagatcctg aatccatcct tcaacctttc atctgaaata gggagaaaag tacaaaaatc 480

ataatgtcga attttgaaag cgcatactta aaacgctgac aaaaatctga taggaattaa 540

gaactttcga tttccaaaaa tatcaataaa aagataggca ttaatgactc gggcgaggtg 600

atctttgtca cggaaaattt cgtcgtcttc tgttacataa tgccgattgt gatttcatag 660

tgaaccctga tcccggttat aaaagacctg tgaaaagcgg ccggtttgaa agggaaacac 720

gacaattttc ttaaccggtc agtgtataaa gttttataga aaatcaggag gatatataca 780

tggttttggg gttcatgttt attgtattct tttgaaggga ataaaaactg acaaatttcg 840

actgaagcaa aatttgaaaa tgcatcacct taccaattcg ggatgggaac cgcacctcat 900

gttcatgacc tctttagaat atttcccttc atctttttaa tccgcgctta ggtgaaaaag 960

ctgatcatgc tgtgctgagc gtttcttctc gctatgacgc tgctgtacat gcaaaaaaag 1020

tcctttaaat atcccagttg aatgacgatg aaagaggaaa gaagaggagg aacagatcaa 1080

ttgataaaaa aagcggcaaa caaaaagttg gttttgtttt gtggaattgc ggtgctttgg 1140

atgtctttat ttttaacgaa tcataatgat gtacgcgccg atacgatcgg cgagaaaata 1200

gcggaaactg ccagacagct tgagggtgcg aaatacagct acggcggaga gaagccgaaa 1260

acggggtttg actcgtcagg ctttgtgcaa tatgtgtttc aatcgctcga tattacgctt 1320

ccgagaacgg taaaggaaca atcgactctt ggctcaggag acc 1363

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of pga genomic region

<400> 19

aaagccttct cctctctatt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of pga genomic region

<400> 20

ttcttgaaaa agacaaggtc 20

<210> 21

<211> 1027

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Fusion of 5-prime and 3-prime regions of the aprE gene with

flanking BsaI sites

<400> 21

ggtctcgacc cgaagttctt ttttaacata taggtaaaac aatacgaaaa aaggcgccaa 60

gtattgaaga attgcagcag ccgcggcatt tcccttttcg attgaagcaa aaaacgtata 120

ttgaacagta agcattccaa aaatggaaaa tactaaaatc gaacaaatat ctgttttttt 180

cttccatatc tgacacacat gttgaaaacc gtttttcatt gaaacatata acaagagaat 240

gactcccgat gccagaagcc tgacagagac aagcgagccg gcttcaaccg ctcccctttc 300

aaatatgtac tgtgcagcgc ttcccgataa tccccacaat gaagcccctg caagcaccat 360

caatacgcct ttcacatgag ctgatttcat atctttcacc cgtttctgta tgcgatatat 420

tgcatatttt aatagatgat cgacaaggcc gcaacctcct tcggcaaaaa atgatctcat 480

aaaataaatg aatagtattt tcataaaatg agctcaataa catattctaa caaatagcat 540

atagaaaaag ctagtgtttt tagcactagc tttttcttca ttctgatgaa ggttgttcaa 600

tattttgaat ccgttccatg atcgtcggat ggccgtattt aaaaatcttg acgagaaacg 660

gcgggtttgc ctcgctcagc ccggcttttg agagctcttg aaacgtcgaa accgctgcat 720

cgctgttttg cgtcagttca atcgcatact ggtcagcagc tttttcctga tgcctcgaaa 780

ctgcgttcgt aaatggagac gacgcgaaag agatgacccc catcagcatc agaagaagcg 840

gaagtgcggc tagatcggat tttcctgcaa tatgaaggct tcttccatag cggccgatga 900

tccgcttgta cagcttgtcg atcacataaa agacagcaag ggataaaagc agatacccgc 960

caagtcctat gtaaacatgc ttcatcacat agtgccccat ttcgtgcgcc atgatgctca 1020

ggagacc 1027

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of aprE genomic region

<400> 22

ccggttgtca ttgatccttt a 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of aprE genomic region

<400> 23

atcctcctgc aaaaaccgta t 21

<210> 24

<211> 1022

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Fusion of 5-prime and 3-prime regions of sigF gene with flanking

BsaI sites

<400> 24

ggtctcgacc caaaatcatt cgccttgagc aatcagagca gcgtgcactt gaaacgttgg 60

gggtggcgtc atgaaaaatg aaatgaacat tcagtttaca gcgctcagcc aaaatgaatc 120

gtttgcacgg gtgacagtcg ctgcttttat cgctcagctt gacccgacga tggatgaact 180

gaccgaaatt aaaacggtcg tatccgaagc ggtcacaaac gcgatcattc acggttatga 240

aaactcaggg cagggaaacg tatatatttc cgtcactctc gaggaccata ttgtctattt 300

aacgatccgc gacgaaggag tcggcatccc tgatcttgaa gaagcgcgcc agcccctgtt 360

cacgacaaag cctgaactcg agcggtcggg aatgggcttt acgatcatgg aaaatttcat 420

ggatgatatt tcgatcgact cctcacctga gatgggaacc acaatacact taacaaagca 480

cttatcaaaa agcaaagcgc tttgcaatta atgaggctgc tcatgttgca ggcagcctcg 540

gatgtccgat gaaaaaccgg acgctcttgg gagcgttccg gttttttttg tgtggtaatt 600

tatggtcttt tgcgcctttc tgaatgataa atgggatgta cttcatacta caactataac 660

catcatatag gaagtgaccc agatggaacg tcaagttttt atcagactcc gccaccggct 720

tgaggcagat ccggatgaat tgattttgct cggccatatc gcacaggtag cgggtgaccg 780

cggatacaaa gaaaagcttg aacggctgcc tatttatcag gtcagcaaag cggatcaaag 840

catggtggtg ctggacgtga tgaaggtgat tgaagctgta cataaatcgt ttcctgacct 900

tgatgtccaa accgtcggcg gttctgaaac catcgtggag atccaatatc cgaaaagggg 960

tctgtcgccc gtgcttttca tcgccgtctg gctgctcttg ttcgtcggtg cctcaggaga 1020

cc 1022

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of sigF genomic region

<400> 25

agcagctcgg cggagaaat 19

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of sigF genomic region

<400> 26

accttgcccg tcaccatttc g 21

<210> 27

<211> 865

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Functional fragment: T2A lacZ cassette

<400> 27

gcgatgttaa ggaccgtctc atctcacctg caaggtctca tctcttttac tccatctgga 60

tttgttcaga acgctcggtt gccgccgggc gttttttatc taaaactagt gtcgagggtc 120

ttcggtaccg cgatttacat atgctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt 180

gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt 240

atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac 300

agctatgacc atgattacgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatccccg 360

ggtaccgagc tcgaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg 420

cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga 480

agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct 540

gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct 600

cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 660

tgccgcgttt ataatgaaga ccctagcagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa 720

gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 780

ccgccgccct agacagctgt cgctgagacg atcgctgaga cctcgcaagt tctcgccatc 840

gcaggtgaaa tctagatgta ttcgc 865

<210> 28

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of BLAP expression cassette

<400> 28

ggagaagacc ttcgacctcg ggacctcttt ccctc 35

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: PCR-amplification of BLAP expression cassette

<400> 29

tccgaagacc cgctattagc gtgttgccgc ttctgc 36

<210> 30

<211> 1345

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Functional fragment: T2A mRFP cassette

<400> 30

ggaatagatc tggccaacga ggcctcgagg atccgatatc atgcatggcg cgccaccctg 60

agacgaccct gatgcaggtg accctgagac cttcgcgccc agctgtctag ggcggcggat 120

ttgtcctact caggagagcg ttcaccgaca aacaacagat aaaacgaaag gcccagtctt 180

tcgactgagc ctttcgtttt atttgatgcc tttaattaag taccttgtcg gataaagctg 240

tgttatatta tgtcttggtg ttaaatacac acgcttaacg atttatgcag agggtgctgc 300

aggcggcagt tctgtacaaa aatgacctaa gcggaggaaa aaaaccatta tattaggagg 360

aaataacatg gcctcttcag aggatgttat taaagaattt atgcggttta aggtgaggat 420

ggaaggctcg gtgaacggac atgagttcga aattgaggga gaaggtgaag gccgccctta 480

tgaaggtact cagacagcga aattgaaagt cacgaaaggc ggaccgctgc cgtttgcttg 540

ggacattctc tcacctcaat ttcaatatgg ctcaaaagcc tacgtaaaac acccggctga 600

catccctgat tacttaaagc tatccttccc ggagggcttt aaatgggaac gagttatgaa 660

ttttgaggac ggcggcgtcg ttactgtcac acaggattct tcccttcagg atggcgaatt 720

tatttacaaa gtaaaacttc gtggaactaa cttcccaagt gatggtcccg tgatgcaaaa 780

aaaaacaatg ggatgggaag catctacgga acgtatgtat ccggaggatg gagccttaaa 840

gggtgaaatc aaaatgcgcc tgaaacttaa agatggcgga cactatgacg cggaagttaa 900

aacaacatat atggctaaaa aaccagtcca actgccggga gcatataaga cggatataaa 960

gttggacatt accagccata atgaagatta cacgattgtg gaacagtatg agagagcaga 1020

gggcagacat agcacaggcg cgtaagaatt aatgaaaaat aagcggcagc ctgcttttcc 1080

atgcgggctg ccgcttatcg ggttattgtc gtgactggga aaaccctggc gactagtctt 1140

ggactcctgt tgatagatcc agtaatgacc tcagaactcc atctggattt gttcagaacg 1200

ctcggttgcc gccgggcgtt ttttattggt gagaatccag gggtccccaa taattacgat 1260

ttggtctcac tcacacctgc tcgtctcact caatttaaat ggcggccgcg gatcctcgac 1320

gggccaataa ggccagatct ggatt 1345

<210> 31

<211> 645

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Artificial promoter

<400> 31

gagtcgcttt tgtaaatttg gaaagttaca cgttactaaa gggaatgtag ataaattatt 60

aggtatacta ctgacagctt ccaaggagct aaagaggtcc ctagactcta gacccgggga 120

tctctgcagt cgggaagatc tggtaatgac tctctagctt gaggcatcaa ataaaacgaa 180

aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc 240

tgagtaggac aaatccgccg ctctagctaa gcagaaggcc atcctgacgg atggcctttt 300

tgcgtttcta caaactcttg ttaactctag agctgcctgc cgcgtttcgg tgatgaagat 360

cttcccgatg attaattaat tcagaacgct cggttgccgc cgggcgtttt ttatgcagca 420

atggcaagaa cgttgctcta gagttaaggg attttggtca tggccattct tctgtacacc 480

aatgtcatga catttttatc tcatttggat tattaaaatt ttgtcaaaat aattttattg 540

acaacgtctt attaacgttg ataccggtta aattttattt gaacaaaaat gggctcgtgt 600

tggagaataa atgtggagaa agattaacta ataaggagga caaac 645

<210> 32

<211> 814

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Homology region of the mutated degU gene with flanking BsaI sites

<400> 32

ggtctcgacc cgatttggga ttgataccga cgctcagaaa atacttgaac acgatcgaag 60

attatcatgg aaaagcaaag attcatttcc aatgcatcgg agaatccgaa gaaagaagaa 120

tagcaccgcg gtttgaggtt gcactattcc ggcttgcaca ggaagcggtg acaaacgcct 180

taaaacactc cgaatcaact gaaattcatg ttaaagtaga agtgacaaaa gattttgtga 240

cgctgattat caaagacaat ggaaacggct ttgacttaaa agaagtaaaa ggcaagaaga 300

acaaatcttt cggtctgcta ggtatgaaag aaagagtcga tttgctcgaa ggctcaatga 360

caatcgattc gaaaataggt cttgggacat ttatattgat taaagttcca ctgtctttgt 420

aaagataatt gtaaaataga gacaaaagac atattgacca taaaagcggt gtgtttaaca 480

atgagaatgg ggaggcgtag cttgtgacta aagtaaatat tgtaattatt gacgatctgc 540

agttattccg tgaaggtgtc aaacggattt tggatttcga gcctaccttt gaagtagtgg 600

ccgaaggaga cgacggagat gaagcggctc gcattgtcga gcactaccat cctgatgttg 660

ttatcatgga tattaatatg ccgaatgtga acggagtaga agcgacaaaa caactggtcg 720

acttgtatcc ggaatcaaag gttattattt tatccatcca tgatgacgaa aactatgtta 780

cacatgcatt aaaaacagga gccctcagga gacc 814

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: Protospacer degU target gene

<400> 33

tacgggattt cgaacctacc tttg 24

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: Protospacer degU target gene

<400> 34

aaaccaaagg taggttcgaa atcc 24

<210> 35

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomA eps operon

<400> 35

gaggaggcag tcaagcatgt gacaggcggt ttttttgcta tgc 43

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomA eps operon

<400> 36

ggtggtctct accctgatcg gggaatatcg gagtc 35

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomB eps operon

<400> 37

ggtggtctct tgagcctgta caagatgggt tctcc 35

<210> 38

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomB eps operon

<400> 38

gcatagcaaa aaaaccgcct gtcacatgct tgactgcctc ctc 43

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: Spacer eps

<400> 39

tacggcattc ggacggtagc ccgt 24

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: Spacer eps

<400> 40

aaacacgggc taccgtccga atgc 24

<210> 41

<211> 524

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 5-prime region of the CAT gene with flanking BsaI sites

<400> 41

ggtctcagag aacctcatcc tgtattgtaa atgaattgta gcgcgtttcg gaggccgaag 60

caaccgatcc ctccttcttt gtattcttgc tgtgccgttc tccgtctctc acccccggct 120

gtcatttagg ttatactgac atatatcggg gtgaagatat gaacagcaaa tcacgattga 180

cgcctgaaat gtggcgggca attacggaaa acgattccgc ctatgacgga gttttttatt 240

acgcggtcaa aacgaccggc atattttgcc gcccatcctg caaatcgaga gttccgcaaa 300

tcgacaatgt gcagattttt ttcaatgcaa aagatgcttt atcagaaggg ttccgcccct 360

gcaaacgctg caatcccgcc ggagcgctgc tgccggatga agagctggca cagcgggtag 420

tgcaaatcat cgagaaatct tatcgcgata cgctgtctct gcaagctttg gctgacaggt 480

gccatatcag cccttttcac ctgcagcgga catctcatga gacc 524

<210> 42

<211> 424

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> 3-prime region of the CAT gene with flanking BsaI sites

<400> 42

ggtctcaacc caatcctatg tataccggct tttcactccg gcttccggca gggtaaataa 60

aaggattgga gtgatcaagc aatgccgcaa aacaataaca atcgatatga actctttttc 120

aaaaaaagat acaaagttct acatatatta aacgattttc tcatcggcct tttattcctt 180

gtcgggagct tctgcttttt ctccgaggaa ctgaagccgg cgggactatg gatgtttgtg 240

atcggcagct ttcagctgtt aatcaggccg acgatccgtt tggttcatga ttttcactac 300

agaaagtttg ttgagagccg gcgttccaaa tgccgggagt aaacacacca cagtaagacc 360

gctaagcagc gcatataaaa aaggccgaat catatcggcc tttcctctgt catgcgacga 420

gacc 424

<210> 43

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomA slrA

<400> 43

ggtggtctct acccttccac ttaatgctga tcgg 34

<210> 44

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomA slrA

<400> 44

acgcttagga tcccatagct tcctccaata tgataagac 39

<210> 45

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomB slrA

<400> 45

tcttatcata ttggaggaag ctatgggatc ctaagcgttt aaaagcatca gttatcc 57

<210> 46

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomB slrA

<400> 46

ggtggtctct tgagcagttt aagataacaa caaccatc 38

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: Spacer slrA

<400> 47

tacgagattg ggtgattttg atga 24

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: Spacer slrA

<400> 48

aaactcatca aaatcaccca atct 24

<210> 49

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomA tapA-sipW-tasA

<400> 49

ggtggtggtc tctacccgaa gtcattcaat aaatcctttc 40

<210> 50

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomA tapA-sipW-tasA

<400> 50

gctaggaggg tagtctctgt ggtgcaattt aaaaaacgg 39

<210> 51

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomB tapA-sipW-tasA

<400> 51

attgcaccac agagactacc ctcctagcga gtatg 35

<210> 52

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: HomB tapA-sipW-tasA

<400> 52

ggtggtggtc tcttgagctc aatgtgacat ggtattg 37

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: Spacer tasA

<400> 53

tacggctaaa gcaattgaag ccgc 24

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide: Spacer tasA

<400> 54

aaacgcggct tcaattgctt tagc 24

<210> 55

<211> 794

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Gene synthesis construct

<400> 55

ggtggtctct acccaagtcg cactgtttgc agaccgttcg gatatcacgg aagaagtgac 60

gaggctgaaa agccatttcc gccagttccg cgatatttgc aaagcgggag gagccgcggg 120

gagaaagctc gatttcctcg tccaggagct caaccgtgaa gcgaacacga tcggttcaaa 180

agcgaatgat caccagatca caaaacatgt ggtcgaaatg aaaagctcta ttgaaaaaat 240

aaaagaacaa gtgcaaaata tagaatagcg attgtgcgta ttgtttacgg atgttctctg 300

caggttaaac tagagacgtc caagtacagg gggaacgtat aggatgacga ttaaactgat 360

caatatcggc tttggaaata tcatatccgc gaattggctg atctcgattg tgagtcctga 420

gtccgcatcg attaagcgga tgatccagga tgcccgcgac agaggcatgc ttatagatgc 480

tacatatgga agaagaaccc gtgcggttgt cattatggac agtgaccata tcatcttatc 540

tgccgtccag cctgagacag tagcacaaag gctttccgtt aaagaagaaa ttatggatga 600

agggcaggga taagagcttt atgaaagaaa gaggtttgtt aatcgttctc tccggccctt 660

ccggcgtcgg aaaaggaaca gtcaggcagg cgctgtttgc tcaggaggac acaaaatttg 720

aatattcgat ttcggtgacg acaagaaaac cgcgtcaagg cgaaagagac ggcgtcgact 780

ctcaagagac cacc 794

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 56

tacgtcctgg atcatccgct taat 24

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Oligonucleotide

<400> 57

aaacattaag cggatgatcc agga 24

<210> 58

<211> 110

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthetic promoter Psy flanked by type-II restriction sites

<400> 58

atatatgaag actttcgaga gtaataagta tcttcatatc tattgacaac tgaagatata 60

ttctatataa tcgttctaga aaaggaggta gaatatttgt cttcatatat 110

<210> 59

<211> 218

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> Functional fragment: degQ gene with 3-prime region flanked by

type-II restriction sites

<400> 59

gaagacctat atggaaaagc aacaaattga agaattaaaa caactgcttt ggcggctaga 60

gaatgaaatc agagaaacaa aggactcctt gcgcaagatt aacaaaagca ttgatcaata 120

cgataagtac acatatctaa aaacctcgta aaaagacttg tttcagacaa gtcttttttt 180

tgtgtgcaaa cgaacccaaa aaaaggtagc aagtcttc 218

<210> 60

<211> 173

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> Native 5-prime region comprising P1 degSU promoter

<400> 60

attcgtacag tctttagaat ttttgtgcgt attttggtat cataaagagt agatagtata 60

taaaaatgtt tttttctaga atatacgcat tctttcatta taattcgaca taatttgcag 120

atcaattaca tttataataa aaatatatga caacgccgtg acggagggaa att 173

<210> 61

<211> 136

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> Native 5-prime region comprising P2 and P3 promoters of degU

<400> 61

tcgaaaatag gtcttgggac atttattatg attaaggttc cgttatctct ttgactatga 60

tttgtaaaat agagccaaaa ggcatattga ccgaatgcta gagtatatag aacaataata 120

caaggaggcg tggctt 136

<210> 62

<211> 172

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> Native 5-prime region comprising P1 degSU promoter

<400> 62

aatcgaacag acttagaatt ttggcgcgta ttttgttatg attaaataga aatggatcgg 60

taaccataaa aaaaccagaa tacgcattct ttcattataa ttcgacacga atttcagttc 120

aatgaaattt atgataaaac taaatgacaa tgctgttacg gagggaaaat gg 172

<210> 63

<211> 135

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> Native 5-prime region comprising P2 and P3 promoters of degU

<400> 63

tcgaaaatag gtcttgggac atttatattg attaaagttc cactgtcttt gtaaagataa 60

ttgtaaaata gagacaaaag acatattgac cataaaagcg gtgtgtttaa caatgagaat 120

ggggaggcgt agctt 135

<210> 64

<211> 546

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding bslA

<400> 64

atgaaacgca aattattatc ttctttggca attagtgcat taagtctcgg gttactcgtt 60

tctgcaccta cagcttcttt cgcggctgaa tctacatcaa ctaaagctca tactgaatcc 120

actatgagaa cacagtctac agcttcattg ttcgcaacaa tcactggcgc cagcaaaacg 180

gaatggtctt tctcagatat cgaattgact taccgtccaa acacgcttct cagccttggc 240

gttatggagt ttacattgcc aagcggattt actgcaaaca cgaaagacac attgaacgga 300

aatgccttgc gtacaacaca gatcctcaat aacgggaaaa cagtaagagt tcctttggca 360

cttgatttgt taggagctgg cgaattcaaa ttaaaactga ataacaaaac acttcctgcc 420

gctggtacat atactttccg tgcggagaat aaatcattaa gcatcggaaa taaattttac 480

gcagaagcca gcattgacgt ggctaagcgc agcactcctc cgactcagcc ttgcggttgc 540

aactaa 546

<210> 65

<211> 705

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsA

<400> 65

atgaatgaga atatgagttt caaagaatta tatgcgattg tcagacacag attcgtgctg 60

attctgctca tcacaatcgg cgtcaccctt attatgggtt ttgtgcaatt taaggtcatt 120

tcaccgacct accaggcgtc gacacaggtg ctggttcatg aatcagacgg tgaagaaaac 180

tcgaatctca gtgacatcca gcgaaatctt cagtatagca gcacgttcca atcgattatg 240

aaaagcactg ccttgatgga agaagttaag gcggaattgc acctatctga atcggcttcc 300

tcgctgaaag gaaaagtggt taccagcagt gaaaatgaat cagaaataat caacgttgcc 360

gttcaggatc acgatccggc gaaagcagct gagattgcga acacgttagt gaacaagttt 420

gaaaaagaag tagatgaaag aatgaatgta caaggcgtac atatattatc agaggcgaag 480

gcttcggaaa gcccgatgat caagccggcc aggctgcgaa atatggtcat ggcttttggc 540

gctgctgtca tgggcggcat tacactggca ttttttctgc attttctcga tgatacatgc 600

aaaagcgcac ggcagctcag cgagagaacc ggattgccat gcttaggctc cgttcctgat 660

gtccacaaag ggcggaatcg cgggataaaa catttcgggg agtga 705

<210> 66

<211> 684

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsB

<400> 66

gtgatcttta gaaaaaagaa agcaaggcga ggtttggctc aaatatctgt tttacacaat 60

aaatcagttg ttgcggaaca atatcgcacc attcggacaa acattgagtt ctcatctgtc 120

cagaccaact tgcgatctat cctcgtcacc tcctctgtgc ctggtgaagg taaatcgttc 180

agtgcagcga atcttgcggc tgtctttgcg cagcagcagg aaaagaaagt actgctggtg 240

gatgccgatt taagaaagcc gaccatcaat cagacgtttc aggttgataa tgtaaccggg 300

ctgacaaatg tgctggtcgg caatgcttca ctcagtgaga cggtgcaaaa gacgccgatc 360

gataacttat atgtactgac aagcgggccg accccgccaa acccggcaga actgttgtct 420

tcaaaagcaa tgggagattt aatatctgag atctatgaac aattcagcct cgtcatcttt 480

gattcccctc ctcttttggc tgttgcagat gctcagattc tagcaaatca gacagacggc 540

agcgtgctcg tcgttttaag cggaaaaaca aaaaccgata ccgttctgaa agcaaaagat 600

gcactggaac aatccaatgc gaagctgtta ggcgctcttt taaacaaaaa gaaaatgaaa 660

aaatcggaac actattccta ctag 684

<210> 67

<211> 1797

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsC

<400> 67

atgattattg cgctggatac ttacctcgtt ttaaattcag ttattgcagg atatcaattt 60

ttaaaagatt cctatcaatt ttatgactcc ggagcattac tgcttaccgc tgtcagcttg 120

ctcctcagct atcatgtgtg tgctttcctg ttcaatcagt ataaacaggt gtggacatac 180

accgggcttg gcgagctgat tgtcctgctt aagggcatta cgctttcagc cgctgtgacc 240

ggcgtcattc agtatgctgt gtatcacacg atgttcttcc gtctgttaac cgcgtgctgg 300

gtgcttcagc ttttgtctat tggagggacc cgtattttat ccagagtatt aaacgaaagc 360

atcaggaaaa aacgctgcgc ctcgtcccgc gcgctgatta tcggggcggg ctcaggtggg 420

actctgatgg tcaggcagct gctttcgaaa gatgaacctg atatcatacc tgtcgctttt 480

attgatgacg accaaacgaa gcataaatta gaaattatgg ggctgcccgt aatcggcgga 540

aaagaaagta tcatgcctgc ggtgcaaaag ctcaaaatta attatattat tattgccatt 600

ccttcactcc gcacccatga gcttcaggtg ttatataaag aatgtgtgcg aaccggagta 660

agcattaaaa ttatgcctca ttttgatgaa atgctgcttg gcacacgaac tgccggacaa 720

atcagagatg taaaagctga ggacttgctc ggcagaaagc cggtaaccct cgacactagc 780

gaaatttcga accgcatcaa aggaaaaaca gttctcgtca cgggagcggg cggatcaatc 840

ggctcggaaa tctgccgtca gatcagcgcg tttcagccta aggaaatcat tctgctcggc 900

catggggaaa acagcattca ttcgatttat acagagctga acggacgatt cggcaaacac 960

attgtgttcc atacggaaat cgctgatgtg caggaccgcg ataaaatgtt taccttgatg 1020

aaaaaatacg agccgcatgt tgtctatcat gcagctgccc ataagcatgt gcctttaatg 1080

gaacacaatc cagaagaggc ggtcaaaaac aatattatcg gaacaaaaaa tgtcgcggaa 1140

gcagccgata tgtcgggaac tgagacattc gtgctgattt catcggacaa agcggtgaac 1200

ccagccaacg taatgggggc gacaaaacga ttcgcagaga tgattattat gaatcttggg 1260

aaagtcagca gaaccaaatt tgttgctgtt cgcttcggca atgtactcgg gagccgcggc 1320

agcgtcattc caattttcaa aaaacagatt gaaaaaggcg gcccggtgac agtaacacat 1380

ccggcaatga cccgctattt catgacgatt cccgaggcat caaggcttgt gattcaggct 1440

ggggcactgg cgaaagggcg tcaaattttc gttctcgata tgggagagcc cgtaaagatt 1500

gtggatcttg ccaaaaacct cattcatttg tccggctaca cgactgagca ggttccaatc 1560

gaattcacag gcattcgtcc gggcgaaaaa atgtatgaag aattgctgaa caaaaatgaa 1620

gtccatgctg aacaaatctt tccaaaaatt cacatcggta aagcggtgga cggcgattgg 1680

ccggtgctga tgcgctttat cgaggatttt catgagctgc cggaagccga cctgagagcg 1740

aggctgtttg cggcaatcaa tacatcagaa gaaatgacgg ctgccagcgt tcattag 1797

<210> 68

<211> 1146

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsD

<400> 68

atgacgaaaa agatattgtt ttgcgcgact gttgattatc attttaaggc ctttcacctc 60

ccttatttta aatggttcaa gcaaatgggc tgggaggttc atgtcgccgc gaacggacaa 120

accaagctgc cgtatgtgga tgagaaattc tccatcccga ttcgcaggtc accttttgac 180

cctcagaacc tggccgttta taggcagctg aagaaagtga ttgacactta tgaatacgac 240

attgtccatt gccatacacc ggtcggcggc gttctcgcca gactggcggc gaggcaggca 300

cggcggcacg gaacaaaggt gctgtacaca gcgcacggat ttcacttctg caaaggggca 360

ccgatgaaaa attggcttct ttactatccg gttgagaaat ggctttcagc atatacagac 420

tgcctgatta cgattaatga agaggattac atacgggcga aaggacttca aaggccgggc 480

ggaaggacgc agaaaattca cggcattggc gtcaataccg agcgtttccg gcctgtcagt 540

ccgatagagc agcaaagact cagagaaaag cacgggttcc gtgaagatga ttttatattg 600

gtttatccgg ctgagctcaa tctgaacaaa aaccagaagc agttaattga agccgcagcc 660

ttgctaaaag aaaaaattcc ctcactccgc cttgtgtttg ccggggaagg ggcaatggaa 720

catacgtatc aaacgttagc tgaaaagctt ggtgcctccg cccatgtctg tttttacggc 780

ttttgcagcg acatacatga gttgattcag cttgcggatg tatctgtcgc atccagcatt 840

agagaaggcc tcggtatgaa tgtgcttgag ggaatggcgg cagaacaacc ggcgatcgcc 900

acagataatc gcgggcatcg ggaaatcatc cgcgacggag aaaacggttt tctgatcaaa 960

atcggtgaca gtgctgcttt tgcccgccgg attgaacagc tttaccataa gccggagctc 1020

tgccgaaagc tgggacagga aggccgaaaa acagccttgc gcttctcgga ggcgcgaacg 1080

gtggaagaaa tggcagatat ttattccgcg tacatggata tggatacaaa ggagaaaagc 1140

gtatga 1146

<210> 69

<211> 837

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsE

<400> 69

atgaactcag gaccgaaagt ttctgtcatt atgggcattt ataattgcga acgcactttg 60

gcagaaagca tagaatccat actcagccaa tcctataaaa attgggagct gattttgtgc 120

gatgatgcgt caacagacgg cacgctccgt atcgcgaagc agtatgccgc tcattacagc 180

gaccgcatca aactgattca aaacaaaaca aataagcggc ttgccgcatc attaaatcat 240

tgtctttcgc atgcgacagg cgattatatc gcacgtcagg acggagatga cctttcgttt 300

ccgcgccgtc tggaaaagca ggtcgcgttt ttagaaaagc accgacacta tcaggtggtt 360

ggcaccggca tgcttgtgtt tgatgaattt ggcgtaagag gcgcccgcat tctgccttct 420

gttccggagc cgggcatcat ggcaaaaggg actccatttt gccacggcac gattatgatg 480

agagcgagtg cctaccgcac gctgaaaggc taccggtcgg tgcggcggac gagacgaatg 540

gaagatattg atttgtggct tcgctttttt gaagagggct tcaggggcta taatcttcag 600

gaagccttgt ataaagtgag ggaagacagc gatgcattca aacggcggtc atttacgtat 660

tcaatcgaca atgccattct tgtctatcag gcgtgcagac gcttgaagct tcctttatct 720

gattacatat atatcgcaaa accgttaatt cgcgccttta tgcctgcagc tgtgatgaat 780

cgctaccata aaaaaagagt gatgaaccaa aaggaagggc ttgtcaagca tgaatag 837

<210> 70

<211> 1155

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsF

<400> 70

atgaatagca gccaaaagcg cgtgctccat gttctcagcg gcatgaacag gggcggcgcg 60

gaaaccatgg taatgaattt atatcggaag atggacaaaa gcaaagtgca atttgatttt 120

ttaacgtatc gaaatgatcc gtgcgcttat gatgaagaga ttttatcttt aggcgggcgg 180

cttttttatg tcccgagcat tgggcaaagc aatcccctta catttgtgag gaatgtgaga 240

aacgcgataa aagaaaatgg gccgttcagc gccgttcatg cgcacacgga tttccaaacg 300

ggttttatcg cccttgcggc aaggctcgcc ggagtgccgg tcagggtatg ccactcccac 360

aatacgtctt ggaagaccgg cttcaactgg aaggatcgat tgcagctgct cgtgttcagg 420

cggctcattt tggcaaatgc gacagcgctg tgtgcctgcg gagaggatgc gggcaggttt 480

ttatttggac agtccaatat ggagcgggag cgtgttcacc ttcttcctaa cgggattgac 540

cttgagttgt tcgccccaaa tgggcaggcg gctgatgaag aaaaagcagc acgcggcatt 600

gcagccgacc ggctcatcat tggccatgtg gcccggtttc atgaagtgaa aaaccacgcg 660

ttcctgttga agcttgccgc acatctcaag gaaagaggca ttcgctttca gctcgttctg 720

gcgggagacg ggccgttgtg cggggagata gaggaggagg cgcggcagca gaatttgcta 780

tcagacgtcc tctttttagg cacggaagaa cggatccatg aactgatgcg aacattcgat 840

gtatttgtca tgccgtctct gtacgaaggc ttgccggttg tgcttgtgga agcgcaggcg 900

tcggggcttc catgcatcat ttcagacagc attacagaaa aagtcgacgc cggtctcggg 960

cttgtcacaa gattaagtct ttctgagccg atcagcgtct gggctgaaac cattgcaagg 1020

gcggccgccg caggcaggcc gaagcgtgag ttcatcaaag aaacactcgc tcaacttggc 1080

tacgatgcac agcaaaatgt aggagcgctg ctgaatgtat acaacatcag cacggaaaag 1140

gaccataacc gatga 1155

<210> 71

<211> 1104

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsG

<400> 71

atgattgtat atgccgtcaa tatggggatt gtatttattt ggtcttggtt cgctaaaatg 60

tgcggcggcc gtgatgattc gcttgccacg gggtatcggc cgaataagct tttgatctgg 120

attccgctcg cttcacttgt gctcgtgtca ggtctccgct atcgagtcgg cacggatttt 180

cagacgtaca cgctgttgta cgaattggcg ggcgattatc aaaatgtgtg gcagatattc 240

ggtttcggca cagcgaaaac agcgacagat ccggggttta ccgcactcct ttggctgatg 300

aatttcatca cggaagatcc tcaaatcatg tattttacgg tggcggtcgt gacctacagc 360

tttattatga agacactcgc cgactatggc aggccgtttg agctgagtgt ctttttattt 420

ttgggaacct ttcattatta cgcatctttt aacggcatca ggcaatacat ggtggcagct 480

gttttgtttt gggcgatccg ttatatcatt agcgggaact ggaagcgata tttcctgatt 540

gtgctggtca gctcgctctt tcattcgtcg gcgctgatta tgattccagt gtactttatt 600

gtcagaagaa aagcctggtc accggcgata ttcggcctat ccgctttatt tctcggcatg 660

acatttttat atcaaaaatt tatttctgtg tttgtcgttg tacttgaaaa cagctcatac 720

agccattatg aaaaatggct catgacgaac acaaatggaa tgaatgtgat caaaatcgct 780

gttttggttc tgccgctgtt ccttgcattt tgctataaag aacgactgcg gagtctgtgg 840

ccgcaaattg atattgtcgt caatttgtgc ctgctaggtt ttttgttcgg ccttttggcc 900

acaaaggacg tgatttttgc cagattcaat atttatttcg gtctgtatca aatgatccta 960

gtcccttatt tcgtcaggat atttgatgaa aaatcgaacg ctcttatcta tatcgctatc 1020

gttgtttgtt attttcttta cagttatttg cttatgccgg tcgattcatc ggttctgcct 1080

tacagaacga ttttttcccg gtaa 1104

<210> 72

<211> 1035

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsH

<400> 72

atggaaacac ctgcggttag tctgttagtc gctgtttata acacagaaac atatatcaga 60

acgtgtctcg aatcactgcg gaaccagaca atggacaata ttgaaatcat cattgtcaat 120

gacggttcag ctgacgccag cccggatatc gcagaagaat acgccaaaat ggacaacagg 180

ttcaaggtga ttcatcagga aaaccaggga ctcggtgcgg ttcggaataa aggcattgaa 240

gctgcacgcg gcgaatttat cgcgtttatc gattcagacg attggattga gcctgattat 300

tgcgagcaga tgctccggac agcaggcgat gaaactgatc tggtcatttg caattacgcc 360

gcagagtttg aggacactgg caaaaccatg gactctgaca ttgcccaaac ctatcaggat 420

cagccgaagg agcactatat caaggcgtta ttcgaaggga aggtcagagg gttttcatgg 480

aacaaactgt acagaagaag catgattgaa gcccatcggc tgtcgtttcc gctccgaggc 540

gagctggagc atgtcgagga tcagtttttc agcttcaggg ctcatttttt cgcccgctca 600

gtatcctacg taaaaacgcc gctctatcat tatcgaattc acctttcctc cattgtgcag 660

cgctatcaga aaaaattgtt tgaatcagga cttgcgctgt atgagacgaa tgcggcgttt 720

ttacaggaga acaacaaact ggaggagtat cgcaaggagc ttgatacctt tatcgttctt 780

cacagcagca tctgtatgct gaatgaatgg aaaacgagcg gcagccgccg gctgtttgaa 840

aagcttagaa atgttggcgt gatatgcgcg gacccggtgt ttcaagaaag tctttcaaaa 900

acgggtactg ctccttttga cgcaaaacgg tcatgcctgc ttctgatggc gaaatacaga 960

atgattccgt tcgtcgctat ggcatcggct gtgtatcagc gggtgatcga gtacaaaatg 1020

agaaacagag ggtga 1035

<210> 73

<211> 1077

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsI

<400> 73

atgtcgttac aatcgttgaa aatcaatttt gcagaatggc tgctgctaaa ggtcaaatac 60

ccgtcccaat attggctggg agcggcagat caaccggtaa aggccgcagc acatcagaaa 120

aaaatcatac tgaccctgct gccgtcccat gacaatttgg gagatcacgc aattgcttat 180

gccagcaagg catttcttga gcaagaatac ccggactttg acatcgtcga ggtcgatatg 240

aaggacattt acaaatcagc aaaaagcctg atccgctcgc gccatccgga ggatatggtc 300

tttatcatcg gcggcggaaa catgggggat ttataccgtt atgaggagtg gacgcgccgc 360

ttcatcatta aaacattcca tgactatcgg gttgtccagc ttccggcaac ggctcatttt 420

tctgacacga aaaaagggcg caaagagctg aaacgggcac agaaaattta taatgcgcac 480

cccggcctat tgctgatggc gcgggatgaa acaacgtatc aatttatgaa acagcatttt 540

caagaaaaaa caattttgaa gcagccggac atggtgctgt atttagacag aagcaaggct 600

cccgcagaac gcgaaggggt ttatatgtgt ttgcgcgagg atcaggaaag cgtgcttcag 660

gaggagcaga ggaaccgggt caaggctgcg ctatgtgagg aattcggcga gatcaaatcc 720

tttacgacaa cgatcggccg ccgggtcagc cgcgatacac gcgaacatga acttgaagca 780

ctgtggtcta agctgcaaag cgcagaagcc gtcgtcactg acaggcttca tggcatgatt 840

ttttgcgcgc tgacaggaac gccgtgtgtt gtcattcgct cctttgacca taaggtgatg 900

gagggctatc aatggcttaa agacatcccg ttcatgaagc tgatagaaca tccggagcca 960

gagcgcgtaa cagccgcagt caatgagctt ttaacaaaag aaacatcccg tgcaggcttt 1020

ccgagagatg tgtattttaa aggtctgcgt gacaaaatca gcggtgaagc gcaatga 1077

<210> 74

<211> 1035

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsJ

<400> 74

atgatcccgc tcgtcagcat tattgtcccg atgtataatg ttgaaccatt tatagaagag 60

tgcattgatt ctttgcttcg tcaaacgctt tctgatattg aaatcatcct cgtgaatgac 120

ggaacaccgg atcgttcagg cgaaattgca gaggactatg caaaacggga tgcgagaatc 180

cgggtcattc atcaggcaaa cggcgggctt agttcagcgc gaaatacggg aataaaggcc 240

gcgcggggca cttacatcgg ctttgtagac ggagacgatt atgtatcatc cgccatgttc 300

cagaggctga ctgaagaagc ggagcaaaat cagcttgaca tcgtcggatg cggtttttac 360

aagcagtcat cggacaggcg gacatatgtg ccgccgcagc ttgaggcaaa ccgcgtgctg 420

acgaaaccag aaatgactga acagcttaaa catgctcacg aaacgagatt tatctggtat 480

gtatggcgtt atctttaccg tcgtgagctt tttgaaaggg cgaatctgct gtttgatgaa 540

gacatccgtt ttgctgaaga ctctcccttt aatttgtccg cttttcgcga agcggagcgg 600

gtgaaaatgc ttgatgaagg attgtacatt tatcgtgaaa acccgaacag cctgacagaa 660

atcccttata agccggcgat ggatgaacat cttcaaaaac aatatcaggc taaaatcgca 720

ttctacaatc actacggctt agcaggcgca tgtaaagaag atttgaatgt gtacatttgc 780

aggcaccagc ttccgatgct tttggcaaat gcctgtgctt ctccgaattc gccgaaagac 840

atcaaaaaga agatcagaca gattttatcc tatgacatgg tgcggcaggc tgtcagacat 900

acaccgtttc agcatgagaa attattaaga ggagagcgtt tggtattagc actgtgtaaa 960

tggcggctca cttttctcat caagctgttt ttcgagcagc gggggacaat gaaaggcagt 1020

gcgaagcagg catga 1035

<210> 75

<211> 1518

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsK

<400> 75

atgaaattca cgataaattt cagcgcgaat ctcacggctt ttctcttgtc tgttttccta 60

tcggtttgga tgacgccttt tattgtcaaa acgctcggtg tcgaagcgtt tggctttgtt 120

cacttgacac aaaatgtgat taattacttt tcggttatta ccgtggcgct cagctcggtt 180

gtcgttcggt tcttttctgt tgctgcccac aggggagagc gggagaaagc aaatgcgtat 240

atcagcaatt atttagccgc ctctgttttg atttccttgc tgctcttgct gccgcttgcg 300

ggttcggctt tttttattga ccgcgtcatg aatgtgccgc aagcgctttt ggcagatgtg 360

cgtttgtcga ttttaatcgg cagtgtgctg tttattttaa cgtttctgat ggcgggcttc 420

ggcgctgcac cattttatgc caaccgcctt tatatcacca gttccattca ggcggtgcaa 480

atgcttatac gggtgctgtc tgtgctgctc ctgtttgcat gctttgcgcc gaaaatctgg 540

cagatccagc ttgcagcttt agctggtgct gttattgcgt ctgtgctgtc tttctatttc 600

ttcaaaaagc tgattccgtg gttttcgttt cgtatgaagg atctttcatt ccgtacaagc 660

aaggagctgt ttcaagcggg cgcatggagc tccgtcaatc aaatcggcgt cctgcttttt 720

ttgcagattg atctgttaac cgccaatttg atgctggggg cgtctgcatc cgggaaatac 780

gcggcgatta tccagtttcc gctgcttttg cgcagcttgg ccggaacggt cgcatccctg 840

tttgcgccca tcatgacttc atattattca aaaggcgata tggaaggatt gatgaattac 900

gccaataagg cagtaaggct caatggtctt ttgcttgcac ttcctgctgc cttattgggc 960

ggattggcgg gaccttttct gacaatctgg ctcggaccgt ccttttcaac gatagcaccg 1020

cttttattta ttcatgccgg atacttggtt gtcagcctcg cctttatgcc gctgttttat 1080

atatggaccg cttttaatca acaaaaaaca ccggcgattg ttaccctgct gttaggtgcg 1140

gtgaatgtgg tgctggcggt cacgctgagc gggccggctc atctcggtct gtacggcata 1200

acattggcag gggccatttc tcttatttta aaaaatgcca tctttacgcc gctttacgta 1260

tcccgcatta caggctacaa aaagcacgtg ttccttaaag gcataatcgg gcctctttca 1320

gccgctgtat ttgcctggac ggtctgtaag gcaattcagt tcattgtgaa gattgacagc 1380

tggccgtcat tgatagcgac gggagtgaca gtcagctttt gctacgctgt tttcgctttt 1440

atgctcgttt gtacaaaaga ggaaagacag ctggtattaa aacggtttcg aaaaacgaaa 1500

ggagctgtga atctttga 1518

<210> 76

<211> 609

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsL

<400> 76

ttgatcctga aacgactttt tgatctgacg gccgccattt ttttgttgtg ctgtacaagt 60

gtgatcattc tgttcaccat cgccgttgtc aggctgaaaa taggatcacc tgtcttcttt 120

aagcaagtaa ggccgggcct gcacggcaaa ccgttcaccc tatataagtt ccggacaatg 180

acggatgaac gggacagtaa aggaaatctg ctgcctgatg aagtccggct gacgaaaacg 240

ggcaggctga tcagaaagct gagcattgat gagcttccgc agctcctgaa tgtcctgaag 300

ggcgatctga gccttgtcgg gccgcggccg cttttgatgg actatctgcc tctttataca 360

gaaaaacagg cacggcgcca tgaggtgaag ccgggtatca caggctgggc gcaaatcaat 420

ggcagaaacg cgatttcctg ggaaaagaaa tttgaattag atgtttggta cgttgacaac 480

tggtcatttt ttctcgattt gaaaatttta tgtttgacgg tgcgaaaggt ccttgtttca 540

gaagggattc agcaaaccaa tcatgtgacc gcggaacggt ttaccggaag cggagatgtg 600

tcctcatga 609

<210> 77

<211> 651

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsM

<400> 77

atgaaaaatg tggccattgt gggtgacggc ggtcacggaa aggtgatcag agagctgata 60

aacgcccgct cagatacgcg cttagccgcg gtgctggatg ataaattcaa aacgttcgaa 120

ggcggaaaag aatggtacac aggaccgccg aaagccgtta ctgaactgcg caggctcatt 180

cctgatgtgc tgtttctgat tgctgttggg aataacagtg tcagaaaaca gctggcggag 240

cgactgggac tggggaaaga tgattttatt acattgattc acccgtcagc catcgtcagc 300

aagtcggctg tcattgggga agggacagtg attatggcgg gcgcgatcat tcaggcggat 360

gcgcgcatcg gcgcccactg catcatcaat acgggtgcag tggcagagca cgacaatcaa 420

atcagcgatt acgttcatct gtccccgcgt gccacgctgt caggagcggt ttccgttcag 480

gaaggcgctc acgtcggaac cggtgcatcc gtcataccgc agatcataat cggggcttgg 540

agcattgtcg gagccggctc cgcggtgatc cgttccatac cggacagggt aacggcggcc 600

ggtgctccgg cacgcatcat ttcttccatt caaacatcaa acaaaggatg a 651

<210> 78

<211> 1167

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsN

<400> 78

atgcataaaa aaatctactt atctccccct catatgagcg gcagggagca gcactatatt 60

tcagaagcct ttcgctcaaa ctggattgcg ccgcttgggc cgctcgtgaa ttcatttgaa 120

gaacagctgg cagaacgagt cggtgtaaaa gcagcagctg cggtcggctc aggaacggcg 180

gcgattcatc tcgcgctgcg tttgcttgag gtaaaagaag gtgacagcgt gttttgccag 240

tccttcacat ttgtagcaac cgccaatccg attctatatg aaaaagcggt gcccgtcttt 300

attgattctg agcctgatac gtggaatatg tcgccgacag cccttgaaag agcattggag 360

gaagcgaaaa gaaacggaac actgccaaaa gcggtaattg ccgtcaatct atatgggcag 420

agcgcgaaaa tggatgaaat cgtaagcctg tgtgatgcat acggagttcc tgtcattgag 480

gacgcagccg aatctctcgg cacagtctat aaagggaagc aaagcggaac attcgggcgc 540

ttcggcattt tttcatttaa cgggaacaaa atcatcacca catcaggggg agggatgctc 600

gtttcaaatg atgaagccgc aattgaaaaa gcaagatttc tcgcttcgca ggcacgagag 660

ccggctgttc attatcagca cagtgaaatt ggacataatt acaggctgag caatatctta 720

gccggcgtcg gcattgccca gcttgaggtg ctggatgagc gagtggagaa aagaaggacc 780

attttcacga gatacaaaaa tgcgctcggt cacttagacg gcgtccgctt tatgccagag 840

tacgcagcag gcgtatccaa tcgctggctc accacgctca cacttgataa cgggctcagc 900

ccatatgaca tagttcaacg tcttgctgaa gaaaacattg aagcccgtcc gctgtggaag 960

ccgctccata cccagccgct gttcgatccg gctttatttt attctcatga agatacagga 1020

agcgtatgcg aagatttgtt caagcgagga atctgtctcc catcggggtc caatatgaca 1080

gaagatgagc aaggccgggt cattgaagtg ctactgcact tattccatac tgtcgaggtg 1140

aagaaatgga cagcaagcat tcgatga 1167

<210> 79

<211> 969

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding epsO

<400> 79

atggacagca agcattcgat gatcagcctg aaacagaaac tgtccgggct gctcgacgtc 60

attccgaaac aatcagagat tatatatgct gactatcctc tatatgggaa tgtaggggat 120

ttatttatta tgaaaggaac agaagccttc tttaaagaac acgggattcg ggtcagaaaa 180

cgctggaatc cagacaattt cccaatcggg cgaaagcttg atccgaatct catcatcgtc 240

tgccagggag gcggaaactt cggggatctg tatccgtatt atcaaggctt tagagagaaa 300

atcgtccaaa cctatccgaa ccacaaaatt gtgatcctgc cgcaatcgat ttattttcaa 360

aacaaagaca acctcaagcg gacggcagag atattttcta agcatgcgaa ccttcacatc 420

atgacaaggg aaaaagcctc ctatgctacg gcacaggcct attttacaac aaatcacatt 480

cagcttctgc ctgatatggc tcatcagctg tttcccgtca ttcccacgca gcagccgtcc 540

aatcaaaagc tgagatttat ccgaacagat catgaagcaa accaggcgct tcaggaacac 600

gcagaagcgg aaagctacga ctggcgcacg gtgctgtcag cttcagaccg ccggacgatt 660

gcttttctcc aaacgctgaa cgtcttgaat aaaaaagcag gcaacccttt gcccattgcg 720

tatatatggg aaaaatactc ggattatatc gtccaaaaag cgattcggtt tttcagccgt 780

tacgaatcgg tggaaacatc aaggctgcac ggccacatcc tgtcttctct tcttcaaaaa 840

gaaaacacgg tcattgataa ttcctacggg aaaaacgcca attactttca tacctggatg 900

gaaggcgtgc caagcacccg tctcatccag cacgcctcaa agaaggaaaa ccttcctgct 960

cacatgtga 969

<210> 80

<211> 762

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding tapA

<400> 80

atgtttcgat tgtttcacaa tcagcaaaag gcgaagacga aactgaaagt tctgcttatc 60

tttcagcttt cagtcatttt cagtctgact gccgcaatat gcttacaatt ttccgatgat 120

acaagcgctg cttttcatga tattgaaaca tttgatgtct cacttcaaac gtgtaaagac 180

tttcagcata cagataaaaa ctgccattat gataaacgct gggatcaaag tgatttgcac 240

atatcagatc aaacggatac gaaaggcact gtatgctcac ctttcgcctt atttgctgtg 300

ctcgaaaata caggtgagaa acttaagaaa tcaaagtgga agtgggagct tcataagctt 360

gaaaatgccc gcaaaccgtt aaaggatggg aacgtgatcg aaaaaggatt tgtctccaat 420

caaatcggcg attcacttta taaaattgag accaagaaaa aaatgaaacc cggcatttat 480

gcatttaaag tatataaacc ggcaggctac ccggcaaacg gcagtacatt tgagtggtcg 540

gagcctatga ggcttgcaaa atgcgatgaa aaaccgacag tccctaaaaa agaaacaaag 600

tcggacgtca aaaaggagaa tgaaacaaca caaaaagata taccggaaaa aacaatgaaa 660

gaagaaacat ctcaagaagc tgtaaccaaa gaaaaagaaa ctcaatcaga ccagaaggaa 720

agcggggaag aggatgaaaa aagcaatgaa gctgatcagt aa 762

<210> 81

<211> 573

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding sipW

<400> 81

atgaagctga tcagtaatat tttatacgtg atcatcttta ctcttattat tgtgctgaca 60

cttgtcgtga tttcaacacg ttcatccggg ggagagccgg cagtgtttgg gtatacgctg 120

aaatcagttc tgtcaggttc gatggagccg gagttcaata caggttcctt aatattggtc 180

aaagaaatca ctgatgtgaa agagctccaa aaaggtgacg ttattacatt tatgcaggat 240

gcaaatacgg cggtcaccca cagaattgtt gacataacaa agcaaggaga ccatttgtta 300

tttaaaacaa aaggtgataa taatgcagca gctgattcag cgcctgtatc ggacgaaaat 360

gttcgcgcgc aatacacagg ttttcagctt ccatatgccg gctatatgct tcattttgcc 420

agccagccga ttggaacggc tgtattattg attgttcccg gcgtgatgct gttagtttac 480

gcttttgtga cgatcagcag cgccattaga gaaattgaaa gaaagacaaa agccttggaa 540

acagatacaa aggacagcac catgtctact taa 573

<210> 82

<211> 786

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding tasA

<400> 82

atgggtatga aaaagaaatt gagtttagga gttgcttctg cagcactagg attagcttta 60

gttggaggag gaacatgggc agcatttaac gacattaaat caaaggatgc tacttttgca 120

tcaggtacgc ttgatttatc tgctaaagag aattcagcga gtgtgaactt atcaaatcta 180

aagccgggag ataagttgac aaaggatttc caatttgaaa ataacggatc acttgcgatc 240

aaagaagttc taatggcgct taattatgga gattttaaag caaacggcgg cagcaataca 300

tctccagaag atttcctcag ccagtttgaa gtgacattgt tgacagttgg aaaagagggc 360

ggcaatggct acccgaaaaa cattatttta gatgatgcga accttaaaga cttgtatttg 420

atgtctgcta aaaatgatgc agcggctgct gaaaaaatca aaaaacaaat tgaccctaaa 480

ttcttaaatg caagcggtaa agtcaatgta gcaacaattg atggtaaaac cgctcctgaa 540

tatgatggtg ttccaaaaac accaactgac ttcgatcagg ttcaaatgga aatccaattc 600

aaggatgata aaacaaaaga tgaaaaaggg cttatggttc aaaataaata tcaaggcaac 660

tccattaagc ttcaattctc attcgaagct acacagtgga acggcttgac aatcaaaaag 720

gaccatactg ataaagatgg ttacgtgaaa gaaaatgaaa aagcgcatag cgaggataaa 780

aattaa 786

<210> 83

<211> 117

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding phrG

<400> 83

atgaaaagat ttctgattgg cgcaggcgtc gcagcggtga ttttatcagg ttggtttatt 60

gcggaccatc aaacccactc acaggaaatg aaagtcgctg agaaaatgat tggataa 117

<210> 84

<211> 1098

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding rapG

<400> 84

atgaataaga tcgcacccgc agaaatcgct agcatgctca acgattggta ccttgccatc 60

aagaaacatg aagttgaaga atcctcccgt ttatttgaag aagtgaagcc tttattggat 120

gacatggaag aggatcagga ggtgcttgcc tacttctcct tattggaact gcgccacaag 180

gttttgcttc acgaggcgag aggacagggc tttcagcatg aggagccttc tcatatgaat 240

gctacgtctg acatgctgaa atattacttt tttctgtttg aaggcatgta tgaggcctat 300

aaaaataatt atgacattgc cattgggctg tataaagatg cagagcagta tctcgacaac 360

attcccgatc cgattgaaaa agccgaattt cacctgaagg tcggtaagct ctattataag 420

ctgggacaaa atattgtgtc cctcaatcat acacggcaag cagtcaaaac attcagagaa 480

gagacagatt ataaaaagaa gctggcttca gccctgatta ccatgtcagg caattttaca 540

gagatgagcc agtttgaaga agctgaggct tatttggacg aagcaattcg gatcacgagt 600

gaattagagg atcatttttt tgaagcccag cttttgcata acttcggcct tctacatgcg 660

caaagcggca aatcagaaga agcggtttcg aaattagagg aggctctaca gaacgatgag 720

tatgcccgct ccgcctatta ttatcattct gcctacttgc tgatacgaga gctgtttaag 780

atcaaaaaga aagaacaggc cttatcttat taccaagacg tgaaggaaaa attgactgct 840

gagccgaata gaatatgtga ggcaaaaata gacattttat atgccattta tgcagaaggg 900

ggtcatgcgg aaacgtttca cttatgcaaa caacatatgg atgacttgtt gtccgagaaa 960

gagtatgaca gtgtaagaga actttccatt ttggctggcg aacggtatag ggaacttgag 1020

ctttacaaag aagctgccca ctttttttat gaagcattac agattgaaga actgattaaa 1080

cgaacggagg ttatataa 1098

<210> 85

<211> 270

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding remA

<400> 85

atgacgatta aactgattaa tatcggattt ggcaatatca tctccgccaa tcggatgatt 60

tcgattgtca gcccggagtc tgcgccaatc aaacggatga ttcaggatgc aagagaccgc 120

ggaatgctaa ttgacgctac atacggacga agaacccgtg cagttgtcgt catggatagt 180

gatcacatta tcttatctgc cgtccagcct gagacagttg cacacagact ttctgttaaa 240

gaagaaatta tggatgaagg gcaggggtaa 270

<210> 86

<211> 159

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DNA encoding slrA

<400> 86

atgaaaactc atgttaaaaa agatttggac aaaggttggc atatgttaat tcaagaagct 60

agatccattg gattaggcat tcatgatgtg aggcagtttt tagaatctga gacagcatca 120

agaaagaaaa accacaaaaa aaccgtccgg caagactag 159

<210> 87

<211> 181

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> bslA

<400> 87

Met Lys Arg Lys Leu Leu Ser Ser Leu Ala Ile Ser Ala Leu Ser Leu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Val Ser Ala Pro Thr Ala Ser Phe Ala Ala Glu Ser Thr

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165 170 175

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180 185 190

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Glu Leu Phe Lys Ile Lys Lys Lys Glu Gln Ala Leu Ser Tyr Tyr Gln

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Asp Val Lys Glu Lys Leu Thr Ala Glu Pro Asn Arg Ile Cys Glu Ala

275 280 285

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<212> DNA

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tcggtccaag atgaaaatca gaaacgggcg gccgatatag cgaacacttt aactgcggtg 420

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tttgagaagc cgttcaagtc attgctcatt acatcgggcc tgccgggaga aggcaaatca 180

ttctcggctt caaacttggc gatcgtattt tcgcaacagg aaaaaaaggt ccttttgatc 240

gacgcagatt taagaaagcc gacgatccat aaaatttttg agctcgataa ccattcaggt 300

gtcacaaatg tattaatgaa aaaatcgacg ctggaaaatg tcgtccagca aagccaggcg 360

gaaaatctcc atgtgctgac aagcggtccg attcctccga atccgtccga gcttttgtcg 420

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<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

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ttgacatatc ggagaaggct ttccattatt accgcactcg attcgtactt ggttttgctg 60

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ctgctgatga cttcactgat actgcttggc gctcagcatt tattcgccca ttgcttccac 180

ctttataaaa aagtatggga gtatgcaagc atcggtgaat tgtatgtgct gcttaaatcg 240

attacattgt cccatcttgt gacggcggcc ctcgagctgt ttttctttca aaacgttccg 300

gttcgtcttt tatgtttaag ctggctgttc cagctcattt tgatcggcgg atcgcggatg 360

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cttggcagac atcctgtcgg ccagcttcgc gatgtcaaag cagaagattt gcttggaagg 780

gagcctgtcc agctcgatac gagcgaaatc tccaatacgg tcaaggaccg cgtcgtactt 840

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ccgaaatcga tcattttagt cgggcacgga gaaaacagca tccattcgat cctgcttgaa 960

ctgaaggaga aattcggaaa gcatgtcgcc tattatcccg aaatcgcgga catacaggac 1020

agagaaaaaa tgtttttgct gatggaacgc tacaaaccga atgtcattta tcatgcagct 1080

gcccacaagc atgtaccgct gatggaaaaa tgcccgaaag aagctgtcaa aaacaatatc 1140

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atatcgtcag acaaagcggt caaccctgcc aatatcatgg gggcaacgaa gcggttcgcg 1260

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tatacgacag aacagatcaa aatcgaattt acaggcatcc ggccgggaga aaaaatgtac 1620

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<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding epsD

<400> 114

atgacaagaa cggttttgtt ttgcgctact gtggattacc atttcaaggc cttccacctc 60

ccgtatttaa aatggtttaa agagcagggg tggaatgttc atatcgccgc aaaaggagat 120

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agaaaagagg ggacgaaagt gatctatacc gctcacggtt tccacttttg ccaaggtgct 360

cctttaaaaa attggctgct gtattatccg attgaaaaag ggctgtccgc tttgaccgat 420

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cgcacggaaa aaatccacgg gatcggcgtc gatacggagc ggtttcatcc tgtcagtgaa 540

acagagaaaa tgctgctcag gaaaacatac ggtttcaaag aagacgactt tatcctcata 600

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aaataccgaa atcacgctga acaaaaaggc gtttcttcgc tcgtcatgtt tgccggtttt 780

caaaaaaaca tccacgaatg gattcagctt gcagacgtgt ctgtcgcctc aagcatcagg 840

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aaaggatga 1149

<210> 115

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<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding epsE

<400> 115

atgatagggg gtcaaaagcc gaaagtttct gtcattatgg gagtctacaa ttgtgagaac 60

acgatcgcag agagcatcga gtcaatttta aatcaaacct ataaaaattg ggaactgatt 120

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atgaacagat atcataaaag aagattgatg aatgaaggcg gaggggtcgt aaaacatgaa 840

tga 843

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<211> 1161

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding epsF

<400> 116

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<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding epsG

<400> 117

atggctgtct acatgttgaa tatggggatt gttttcgtct ggtcatggtt tgcgaaaatg 60

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<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding epsH

<400> 118

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<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

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<223> DNA encoding epsI

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cgcttcatta tcaaaacatt caagcattat aaaatcgtcc agctcccggc aactgcgcac 420

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ttttgtgcga taacaggaac gccgtgcgtc gtgatccgct cttttgatca taaggtgctt 900

gaaggctttc gctggctgaa agacgttcct tcgatgaagc ttgtggaaaa tcccgatgcg 960

gcagaggttc tcggcgcaat cgaagagctg gtcaagaccg gtgactcgca tcgtgagacc 1020

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<211> 1020

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding epsJ

<400> 120

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<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

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<223> DNA encoding epsK

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aagtgcaaaa aactgcttca ggcgggagga tggagctccg tcagccaagt cggcatcctg 720

ctgtttctgc aaatcgattt aatggtggcg aatgtgatgc tgggggtttc cgaatccggc 780

atgtacgcgg cgatcattca gtttccgctg ttgttgcgga cgctttcggg aacgctagcg 840

gccgtatttt cacctacgat tacactctat tattcaaaag gcgacaaaga agggctcgtc 900

cgttatgcca atcaggccgt caggtttaac ggcatcctgc tcgctttgcc ggcggcgctt 960

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<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

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<223> DNA encoding epsL

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tga 603

<210> 123

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<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding epsM

<400> 123

atgcaaaacg tggtgatcat cggagccggc ggccatggga aagtcgttcg ggaacttgta 60

aaagagcggc cggatacgga gcttgccggt attcttgatg accggtatgc ggagcttcat 120

gttgagaacg gtctgtatcg agggccttca gctgccgcag aagaacttgc gcggcttcat 180

ccggacgcga agttcgtcct ggctgtcggc caaaacagca tcagacagca gctgtatgaa 240

cgcattggtc ttccgcttga ccggtatgcg gttttgattc atccctctgc tgttgtcagc 300

ggttcggccc ggattcaaaa cggcgccgtt gttatggcat cgagcgtcat ccaagcggat 360

gcagacgtcg gcatccacgc gattgtcaac acaggtgcga tcgtcgaaca cgacaatcgg 420

atcggcgatt acgttcatct ttcgcccgga acggtgttaa ccggcggcgt gacagttatg 480

gaaggcgctc atctcggcgc gggaacggcg gtcattcccg gaaagacagt cggacgctgg 540

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<210> 124

<211> 1146

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding epsN

<400> 124

atgagtcaga ataagcgaat ttatttatca ccgccgcaca tgagcggaga cgaggagcgc 60

tatgtagccg aagcgtttcg gacaaactgg atcgcgcccc tcggtcccct tgtcgacaca 120

tttgaagaaa agcttgccgc ctatgcgggg acgtccggag ccgcggcagt cagctcagga 180

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tgctcttctt ttacgtttgt agcgagcgcc aatccgatca tatatgagca ggctgaaccg 300

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cttgacgaag cggagcgggc caggaatctc ccgaaagccg tcatcgtcgt caacttgtac 420

ggccaaagcg cgaaaatgga cgagattatg gccatttgcg atcgatttgc cgtgcctgtc 480

attgaagatg cagccgaatc gctcggttct gtttataaag gcagaaaaag cgggaccttc 540

ggacgcttcg gcatttattc gttcaacggt aacaaaatca tcaccacatc gggcggagga 600

atgctggtca gcgatgatga agacgcgttg aagaaggcgc gctttttagc cactcaggcg 660

cgcgagccag ccattcatta tcagcacgaa aaagcgggct acaattaccg gatgagcaat 720

gttctggccg gaatcggcat cgcacagctc gccgttctgg atgaccgggt acatgccaga 780

cgggcggttt tcgagcgcta taaggaggcg ctttccggta tcgaaggtat agaattcatg 840

cctgaggccg gcatgtcaaa ccgctggctc acgacattaa cgttagacac agcaaagatt 900

caaacaacac cggcggacat catcgaacag ctcgcaaatg aaaacattga ggcccgcccg 960

ttatggaagc ctttgcacag acagcccctt tttaaaggcg cggcctttta tccgcacgat 1020

gaccagggct ctgtctgctg cgacttattt cagcgcgggc tctgcctgcc gtcaggatca 1080

agtatgacgc gaaaagagca ggaccgggta attcaaatcg ttgccgaccg gattaaatat 1140

aaatga 1146

<210> 125

<211> 978

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding epsO

<400> 125

atggcgatta catattccat ggacagctta aagcataagc tggcagaaat tttggatgtc 60

attccaaggc attcatcagt cgtttacttg gactacccgc tatacggaaa cgtcggggat 120

ctattgatca tgaaaggaac ggaagctttt tttgaagcat acggcatcaa ggtgcgcgaa 180

agatggaatg cggagaattt cattccgggc cgccgcattc caaaggacgc catcattgtt 240

tgtcaggggg gcggcaattt cggcgacttg taccctcact tccagcagtt cagagaacgg 300

gtggtcgaac attacccgga caaccggatc gtcattctgc cgcagtcgat ttattatgag 360

catgaagaaa atataataaa aacgcgcggc attttggcgg ctcacccgga tctgcactta 420

ttcacgcggg aaaaggcatc attcgatttt gccgtcaagc gtttcgaaga ggtgaaaaac 480

atcaaaatga tgcccgatat ggctcaccag ctctggccga tcgcggcacc tgccgaaaag 540

ccgtccgagt ccgttctgcg gttgatcagg accgacaaag aagccaacag cagcctgcag 600

aaagcagggg agccggacac gtacgattgg aacgtcatct tatcagaagg cgacaaacgc 660

ggaatcaaac gcctgcagac gatcaatgtc ctcaacaaaa aagcgggcaa tccgctgccg 720

atcgcttctt attggaaacg cttttcggac agcctcgtcg acaaatcaat ccgtttcttc 780

agccgctatg aatcagtcgt tacttcaagg ctgcacggcc acatcttatc gtgcctgctc 840

ggaaaagaaa acgtagtgat tgacaactcc tacggaaaaa acgcgaatta ctacaataca 900

tggatgaaag acatcccgaa tacgaaactg attcaaaacc atcagacaga agcagaaaaa 960

ccgcctgttc acgtatga 978

<210> 126

<211> 729

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding tapA

<400> 126

atgttccgat tatctcgaac taggagatgc cgaaaaagag ccggaaaaaa cattatcgtt 60

tttcaaacgc tgctgatcat atacctgtta attggattgg ggagtcagct gtcacagcat 120

acaaacgcat catttcatga tgtggaaaca tacagcatga caatgaaagc ggcctcaact 180

tttcctcaag atgagaagca gtgggacggg agcgatttga agcttcaaaa gcagacgaag 240

acgaaaggaa cggtctgtgc accgctgaca ttgtttgcag aatataaaaa ccgcggcagt 300

caaatcgccg actctgaatg gaagtgggag cttcataaac tcggtcattc caaaaagccg 360

ctagaggacg ggactgtgat cgataaaggc gtgttcaaaa aagaagccga aagcagcatc 420

taccggatag agtcaaagcg ggcagcaaaa ggagggctat acgcttttaa attgatcaga 480

cctgaaggcc atccagatgt taaaaagggc aaacctttca tttggtcaaa tgtaatggag 540

cttcaagact gcaatgaaga aacaccgaag cctcctaaaa aagcttcagc aaaaccaaag 600

caaactgaac agactcaaac aacgcaaaag tctgaacagg atatagagga aacaccaaag 660

gacagtgaat ccgtagataa agaaaataga aaagaagata attcattaga aagcggggaa 720

gcgtcatga 729

<210> 127

<211> 585

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding sipW

<400> 127

atgaaacatg tgatgaaatg gatcagcaat ttcttatatg tgattatttt cacaatcatc 60

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ggctatcaat tgaaaacggt tttatccgga tcgatggagc cggagtttaa aacaggttct 180

gtgattgccg ttcaaaaagt tgaaaatccc gggtctttga aaaagggaga tatcattaca 240

ttcatgcaag acgaaaacac catggttacc caccgaatta tcggtataac aaaaaataaa 300

tcaaatctca tgttcaagac aaagggtgac aataaccaaa accctgattc cgatccggta 360

ctggcggaaa atgttgtcgc taagtattcg ggcattacgg ttccgtatgc cgggtatttg 420

ctggactttg caagtaaacc gatcggcaca gccattttgc tgatcgtgcc gggactcttg 480

ttgattcttt atgcagtaat tactgtatcc gcggctttaa gagagattga ccaaaaagct 540

aaagcaattg aagccgctgg aaaagatcaa tcagtttcca tgtaa 585

<210> 128

<211> 795

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding tasA

<400> 128

atgggtacaa agaaaaaact aggattaggc gttgcgtctg ctgcgcttgg actggcatta 60

gtaggaggag gaacttgggc tgcgtttaac gacatcgaaa caactcaagc aacttatgca 120

gcaggtacgc ttgacttaaa tgcgaaagat acatctgcaa gagtgaactt gtccaactta 180

aaaccaggcg acaaattcac taaagatttc gagttcaaaa atgacggatc acttgcgatt 240

aaagaagtgc tgatgcaggt tggctacagc aatttcgttg acggaaacgc gaaaaacggc 300

ggaaaaagca cagcggaaga cttcctgaaa caatttaaag tcagcgttct gactgtcgga 360

gttgaaggcg gtaacggcta tcctaaaaac atcattttag atgaagccaa cctttatgat 420

ctgtacaata tgtccgcgaa aaaagataag aacgcatatg aaaaagtgaa gaaagccatt 480

gagccagagt tcctgcatga caatggcaaa atcaatgtag cgacaatcaa cggaaaaact 540

gcgcctgaat acgacggcat tccgaaagac ccatatgact ttgataaagt tcaattggtg 600

attgagtttg taaatgacaa aacaacagac gccagcggca gaatggtaca gaacaaatat 660

caaggtgatt ctgtacagct tgacttctca ttcgaagcta ctcaatggaa cggcttgaca 720

atcgacggca aaaaacatgc cgatgaaaaa ggttatgtga aagagaacga aagagcgcac 780

agtgaagata aataa 795

<210> 129

<211> 117

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding phrG

<400> 129

atgaaaaaac tgttcattgt tgctgcgatt gctgccgtcg tatgttcggg atggtttgcg 60

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<210> 130

<211> 1101

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding rapG

<400> 130

atgaacaaga tcgccgcgga agaagtcgcc aacatcctta atacatggta ccgcgccatc 60

agaagaaatg atgctgaaca gtcgatccga atatttgaag aagtcaaacc gatgctggca 120

gagatggagg aagaccaaga ggttttaatc tactattctc tgctggaact gcggcataaa 180

atcatgctgt atgatacgcg gggaaaaaag atagaacagc aagaggagtt aacgaacggc 240

ggcagtgctg catcacatat gacatcctat tactactacc tgttttcagg agcttatgaa 300

gtgtataaaa agaattatga gcaggcgatc agcttctata aaattgccga gaagaagctt 360

gctcatgtac atgatgaaat tgaggtggcg caatttcacg ataaagtcgg aaagctctac 420

tattacttgg gccagaatat cgtctcttta aaccataccc ggcaggcgat ggaaattttc 480

aaggggcatg gcgaccatga tatgaacctt gtttccactt atattacgat ggccggaaat 540

tatacagaga tggggaaata tacagaggcg gaagaatatt taacagaagc catccatacg 600

gtaagaaaag ccggcgactg ttttaaagaa atgcagctcc ttcataattt tgccttgctt 660

tatgcggcga tggacaattc ggaaaaaagc attcagtttt tagaaatcgt tttggatgat 720

caagcatatg ctgcatcaga ttattatttc aatgctgtgt ttttaatgat caaagagctg 780

tttaaagtcg gagaccataa acgcgctgca gccttttaca aagaagggaa ggaaaggtcg 840

aaatccgcgg cgaataaaat atttgacgcc aaaatcgata ttttatatgc ggcttatgca 900

ggagatggtg aacaggcggt taaagactgc aaagacaaca ttgaaatcct gtttcaaaca 960

aagcaatacg acagcgccag agaactttcg ctcttaacgg ccaatgttta cagatcaaag 1020

tcactttata aagaagccgc acatttcttt ttggaagcga ttaaagcgga agaaaaaatg 1080

aaaaaagtgg agggaatgtg a 1101

<210> 131

<211> 270

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding remA

<400> 131

atgacgatta aactgatcaa tatcggcttt ggaaatatca tatccgcgaa tcggctgatc 60

tcgattgtga gtcctgagtc cgcgcctatt aagcggatga tccaggatgc cagagaccgc 120

ggcatgctta tagatgctac atatggaaga agaacccgtg cggttgtcat tatggacagt 180

gaccatatca tcttatctgc cgtccagcct gagacagtag cacaaaggct ttccgttaaa 240

gaagaaatta tggatgaagg gcagggataa 270

<210> 132

<211> 150

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DNA encoding slrA

<400> 132

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agcgatgctg aaaaacagat aaagcaataa 150

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<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> bslA

<400> 133

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Tyr Ser Val Ile Thr Gly Ala Ser Lys Gln Glu Trp Ser Phe Ser Asp

50 55 60

Ile Glu Leu Thr Tyr Arg Pro Asn Ser Ile Leu Ala Leu Gly Thr Val

65 70 75 80

Glu Phe Thr Leu Pro Ser Gly Phe Ser Ala Thr Thr Lys Asp Thr Val

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Asn Gly Arg Ala Leu Thr Thr Gly Gln Ile Leu Asn Asn Gly Lys Thr

100 105 110

Val Arg Leu Pro Leu Thr Ile Asp Leu Leu Gly Ile Ala Glu Phe Lys

115 120 125

Leu Val Leu Ala Asn Lys Thr Leu Pro Ala Ala Gly Lys Tyr Thr Phe

130 135 140

Arg Ala Glu Asn Arg Val Leu Gly Leu Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Glu

145 150 155 160

Ser Ser Ile Glu Val Gln Lys Arg Ala Thr Pro Pro Thr Gln Pro Cys

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<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

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<223> epsA

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Met Lys Glu Asn Ile Asp Phe Arg Glu Leu Ile Ala Ile Leu Arg Lys

1 5 10 15

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Gly Ile Ile Gln Phe Tyr Val Leu Thr Pro Val Tyr Gln Ala Ser Thr

35 40 45

Gln Ile Leu Val His Gln Val Gly Glu Lys Lys Gly Ser Ala Thr Tyr

50 55 60

Ser Asp Ile Gln Ile Asn Leu Gln Tyr Thr Arg Thr Phe Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Lys Asn Pro Val Ile Leu Glu Gln Val Lys Arg Glu Leu Asp Leu

85 90 95

Pro Tyr Ser Ala Gly Arg Leu Gly Glu Lys Ile Ala Thr Ser Ser Glu

100 105 110

Ser Glu Ser Glu Ile Ile Asn Ile Ser Val Gln Asp Glu Asn Gln Lys

115 120 125

Arg Ala Ala Asp Ile Ala Asn Thr Leu Thr Ala Val Leu Lys Lys Glu

130 135 140

Ile Lys Gln Ile Met Asn Thr Asp Arg Val Thr Val Leu Ser Lys Ala

145 150 155 160

Glu Ile Val Asp Ser Pro Thr Pro Val Arg Pro Asn Tyr Lys Met Asn

165 170 175

Ile Leu Leu Ala Phe Gly Ala Ala Leu Met Thr Gly Ile Ala Leu Ala

180 185 190

Phe Phe Leu Asp Phe Ile Asp Asp Thr Val Ala Arg Pro Ser Gln Val

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210 215 220

His Lys Lys Ser Leu Phe Arg Gly Asp Pro Asp Met Asn Ile Arg Val

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Lys Ala Gly Arg Ser Glu Pro Leu Gly Tyr

245 250

<210> 135

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<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> epsB

<400> 135

Met Gly Ile Arg Lys Lys Arg Ser Arg Lys Tyr Gln Ser Ala Leu Val

1 5 10 15

Ala Leu His Gln Pro Asn Thr Pro Ile Val Glu Gln Tyr Arg Thr Ile

20 25 30

Arg Thr Asn Ile Glu Phe Ser Ser Phe Glu Lys Pro Phe Lys Ser Leu

35 40 45

Leu Ile Thr Ser Gly Leu Pro Gly Glu Gly Lys Ser Phe Ser Ala Ser

50 55 60

Asn Leu Ala Ile Val Phe Ser Gln Gln Glu Lys Lys Val Leu Leu Ile

65 70 75 80

Asp Ala Asp Leu Arg Lys Pro Thr Ile His Lys Ile Phe Glu Leu Asp

85 90 95

Asn His Ser Gly Val Thr Asn Val Leu Met Lys Lys Ser Thr Leu Glu

100 105 110

Asn Val Val Gln Gln Ser Gln Ala Glu Asn Leu His Val Leu Thr Ser

115 120 125

Gly Pro Ile Pro Pro Asn Pro Ser Glu Leu Leu Ser Ser Gln Ala Met

130 135 140

Glu Asp Leu Leu Ala Glu Ala Tyr Asp Gln Tyr Asp Leu Val Ile Leu

145 150 155 160

Asp Ser Pro Pro Leu Leu Pro Val Ala Asp Ala Gln Ile Leu Ala Asn

165 170 175

Gln Val Asp Gly Ser Ile Leu Val Ile Leu Ser Gly Lys Thr Lys Leu

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Asp Asn Ala Ile Lys Ser Arg Asp Ala Leu Asn Ser Ser Lys Ser Glu

195 200 205

Leu Leu Gly Ala Val Leu Asn Gly Arg Lys Val Lys Lys Ala Arg Gln

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<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> epsC

<400> 136

Met Thr Tyr Arg Arg Arg Leu Ser Ile Ile Thr Ala Leu Asp Ser Tyr

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Ser Ile Phe Ile Gly Tyr Gln Leu Ile Leu Pro Ser

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Tyr Asp Leu Tyr Pro Ser Glu Met Leu Leu Met Thr Ser Leu Ile Leu

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115 120 125

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130 135 140

Gly Ser Ala Gly Ser Leu Ile Ala Lys Gln Leu Val Gln Lys Pro Glu

145 150 155 160

Leu Asn Ile Lys Pro Val Ala Phe Ile Asp Asp Asp Lys Thr Lys Tyr

165 170 175

Arg Leu Glu Ile Met Gly Leu Pro Val Leu Gly Gly Lys Glu Gln Ile

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Leu Gly Arg His Pro Val Gly Gln Leu Arg Asp Val Lys Ala Glu Asp

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530 535 540

Asn Gln Asn Glu Val Leu Ala Glu Gln Val Phe Pro Lys Ile His Ile

545 550 555 560

Gly Lys Ala Val Asp Val Glu Trp Thr Val Leu Lys Ser Phe Met Asp

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<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> epsD

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Met Thr Arg Thr Val Leu Phe Cys Ala Thr Val Asp Tyr His Phe Lys

1 5 10 15

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Val His Ile Ala Ala Lys Gly Asp Met Thr Leu Pro Tyr Thr Asp Lys

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Lys Phe Asp Ile Asp Ile Arg Arg Ser Pro Leu Asn Ala Ser Asn Ile

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Ile Asn Glu Glu Asp Phe Val Leu Ala Lys Gly Leu Arg Lys Ala Leu

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Arg Thr Glu Lys Ile His Gly Ile Gly Val Asp Thr Glu Arg Phe His

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Lys Tyr Arg Asn His Ala Glu Gln Lys Gly Val Ser Ser Leu Val Met

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Phe Ala Gly Phe Gln Lys Asn Ile His Glu Trp Ile Gln Leu Ala Asp

260 265 270

Val Ser Val Ala Ser Ser Ile Arg Glu Gly Leu Gly Met Asn Leu Leu

275 280 285

Glu Gly Met Ala Ser Gly Lys Pro Ala Val Ala Ala Asp Asn Arg Gly

290 295 300

His Arg Glu Val Ile Gln Glu Gly Val Asn Gly Phe Leu Val Pro Gln

305 310 315 320

Gly Asp Ala Gly Thr Phe Ser Asp Arg Ile Leu Gln Leu Tyr Arg Leu

325 330 335

Pro Ser Leu Arg Lys Lys Met Gly Asp Ala Gly Arg Arg Thr Ala Ala

340 345 350

Ala Phe Ser Gln Gln Arg Thr Val Lys Glu Met Ala Gly Ile Tyr Ser

355 360 365

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<213> Bacillus licheniformis

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<223> epsE

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Asn Cys Glu Asn Thr Ile Ala Glu Ser Ile Glu Ser Ile Leu Asn Gln

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Arg Glu Asp Glu Ser Ala Phe Lys Arg Arg Lys Leu Ser Tyr Ser Ile

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Leu Ser Asp Tyr Ile Tyr Thr Met Lys Pro Ile Ile Arg Gly Leu Met

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<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> epsF

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85 90 95

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Gly Arg Phe Leu Phe Gly Ala Lys Lys Met Gly Glu Asn Ala Val His

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Leu Leu Gln Asn Gly Ile Glu Leu Asp Arg Phe Lys Glu Ala Asn Gly

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195 200 205

Leu Val Ile Gly His Val Gly Arg Phe Phe Glu Gln Lys Asn His Ala

210 215 220

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260 265 270

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275 280 285

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Leu Gly Leu Gly Leu Leu Gln Arg Leu Ser Leu Asn Ala Gly Phe Glu

325 330 335

Arg Trp Ala Glu Asp Ile Ser Arg Ala Ala Gln Pro Lys Lys Pro Ala

340 345 350

Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ser Leu Ala Glu Arg Gly Tyr Asp Ala Lys

355 360 365

Ala Asn Leu Ala Arg Leu Met Asp Ile Tyr Ser Ile Ser Ala Ala Glu

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<213> Bacillus licheniformis

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Arg Pro Asn Ala Ile Leu Thr Val Val Pro Leu Ala Ser Leu Ile Ile

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Val Ala Gly Leu Arg Tyr Lys Val Gly Thr Asp Tyr His Thr Tyr Met

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Leu Leu Tyr Glu Leu Ala Gly Lys Tyr Asn Ser Ile Trp Glu Ile Phe

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Gly Phe Gly Thr Gly Lys Ser Ser Thr Asp Pro Gly Phe Thr Ala Leu

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Leu Trp Ile Leu Asn Gln Ile Ser Ala Asp Pro Ala Leu Met Phe Ala

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Val Val Ala Ala Ile Thr Tyr Ile Tyr Ile Val Lys Thr Leu Tyr Val

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Tyr Gly Arg Pro Phe Glu Leu Ser Met Phe Leu Phe Ile Gly Met Phe

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His Tyr Tyr Ala Ser Phe Asn Gly Ile Arg Gln Tyr Met Ala Ala Ala

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Ile Leu Phe Trp Ala Val Arg Tyr Leu Ile Asp Gly Lys Leu Val Arg

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Tyr Met Ile Val Val Leu Ile Cys Ser Leu Phe His Ser Ser Ala Leu

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Ile Met Ile Pro Val Tyr Phe Ile Val Arg Arg Lys Ala Trp Ser Pro

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Ile Lys Ile Ile Val Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Ala Phe Cys Phe

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<223> epsH

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195 200 205

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275 280 285

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Ser Ala Phe Asp Ser Lys Lys Lys Leu Leu Leu Met Leu Ile Arg Leu

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<223> epsI

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<213> Bacillus licheniformis

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Pro Pro Val His Val

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<213> Bacillus licheniformis

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<223> rapG

<400> 153

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Lys Gly His Gly Asp His Asp Met Asn Leu Val Ser Thr Tyr Ile Thr

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210 215 220

Asp Asn Ser Glu Lys Ser Ile Gln Phe Leu Glu Ile Val Leu Asp Asp

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Gln Ala Tyr Ala Ala Ser Asp Tyr Tyr Phe Asn Ala Val Phe Leu Met

245 250 255

Ile Lys Glu Leu Phe Lys Val Gly Asp His Lys Arg Ala Ala Ala Phe

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Tyr Lys Glu Gly Lys Glu Arg Ser Lys Ser Ala Ala Asn Lys Ile Phe

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Asp Ala Lys Ile Asp Ile Leu Tyr Ala Ala Tyr Ala Gly Asp Gly Glu

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Tyr Arg Ser Lys Ser Leu Tyr Lys Glu Ala Ala His Phe Phe Leu Glu

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<213> Bacillus licheniformis

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<223> remA

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65 70 75 80

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85

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<213> Bacillus licheniformis

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<213> Bacillus subtilis

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tag 183

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<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

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Leu

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180 185 190

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<213> Bacillus licheniformis

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Glu Asp Ala Gln Ala Lys Gln Asp Phe Gly Leu Arg Ile Ile Glu Ala

165 170 175

Gln Glu Glu Glu Arg Lys Arg Val Ser Arg Glu Ile His Asp Gly Pro

180 185 190

Ala Gln Met Leu Ala Asn Val Met Met Arg Ser Glu Leu Ile Glu Arg

195 200 205

Ile Phe Arg Asp Lys Gly Thr Glu Glu Gly Phe Gln Glu Ile Lys Asn

210 215 220

Leu Arg Gln Asn Val Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Val Arg Arg Ile Ile

225 230 235 240

Tyr Asp Leu Arg Pro Met Ala Leu Asp Asp Leu Gly Leu Ile Pro Thr

245 250 255

Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Thr Ile Glu Asp Tyr His Gly Lys Ala Lys

260 265 270

Ile His Phe Gln Cys Ile Gly Glu Ser Glu Glu Arg Arg Ile Ala Pro

275 280 285

Arg Phe Glu Val Ala Leu Phe Arg Leu Ala Gln Glu Ala Val Thr Asn

290 295 300

Ala Leu Lys His Ser Glu Ser Thr Glu Ile His Val Lys Val Glu Val

305 310 315 320

Thr Lys Asp Phe Val Thr Leu Ile Ile Lys Asp Asn Gly Asn Gly Phe

325 330 335

Asp Leu Lys Glu Val Lys Gly Lys Lys Asn Lys Ser Phe Gly Leu Leu

340 345 350

Gly Met Lys Glu Arg Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Met Thr Ile Asp

355 360 365

Ser Lys Ile Gly Leu Gly Thr Phe Ile Leu Ile Lys Val Pro Leu Ser

370 375 380

Leu

385

<210> 173

<211> 229

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DegU

<400> 173

Met Thr Lys Val Asn Ile Val Ile Ile Asp Asp His Gln Leu Phe Arg

1 5 10 15

Glu Gly Val Lys Arg Ile Leu Asp Phe Glu Pro Thr Phe Glu Val Val

20 25 30

Ala Glu Gly Asp Asp Gly Asp Glu Ala Ala Arg Ile Val Glu His Tyr

35 40 45

His Pro Asp Val Val Ile Met Asp Ile Asn Met Pro Asn Val Asn Gly

50 55 60

Val Glu Ala Thr Lys Gln Leu Val Asp Leu Tyr Pro Glu Ser Lys Val

65 70 75 80

Ile Ile Leu Ser Ile His Asp Asp Glu Asn Tyr Val Thr His Ala Leu

85 90 95

Lys Thr Gly Ala Arg Gly Tyr Leu Leu Lys Glu Met Asp Ala Asp Thr

100 105 110

Leu Ile Glu Ala Val Lys Val Val Ala Glu Gly Gly Ser Tyr Leu His

115 120 125

Pro Lys Val Thr His Asn Leu Val Asn Glu Phe Arg Arg Leu Ala Thr

130 135 140

Ser Gly Val Ser Ser His Ala Gln His Glu Val Tyr Pro Glu Ile Arg

145 150 155 160

Arg Pro Leu His Ile Leu Thr Arg Arg Glu Cys Glu Val Leu Gln Met

165 170 175

Leu Ala Asp Gly Lys Ser Asn Arg Gly Ile Gly Glu Ser Leu Phe Ile

180 185 190

Ser Glu Lys Thr Val Lys Asn His Val Ser Asn Ile Leu Gln Lys Met

195 200 205

Asn Val Asn Asp Arg Thr Gln Ala Val Val Val Ala Ile Lys Asn Gly

210 215 220

Trp Val Glu Met Arg

225

<210> 174

<211> 385

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DegS_S76D

<400> 174

Met Ser Val Ser Lys Met Asp Ser Lys Val Leu Asp Ser Ile Ile Met

1 5 10 15

Lys Met Leu Lys Thr Val Asp Gly Ser Lys Asp Glu Val Phe Gln Ile

20 25 30

Gly Glu Gln Ser Arg Gln Gln Tyr Glu Gly Leu Val Glu Glu Leu Lys

35 40 45

Gln Ile Lys Gln Gln Val Asn Glu Val Ile Asp Leu Gly Asp Arg Leu

50 55 60

Glu Val His Ala Arg His Ala Arg Asn Arg Leu Asp Glu Val Ser Arg

65 70 75 80

Asn Phe His Lys Phe Ser Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Tyr Glu Lys

85 90 95

Ala His Lys Leu Gln Val Glu Leu Thr Met Ile Gln Gln Arg Glu Lys

100 105 110

Gln Leu Arg Glu Lys Arg Asp Asp Leu Glu Arg Arg Leu Leu Gly Leu

115 120 125

Gln Glu Ile Ile Glu Arg Ser Glu Gly Leu Val Ser Gln Ile Thr Val

130 135 140

Val Leu Asn Tyr Leu Asn Gln Asp Leu Arg Gln Val Gly Val Leu Leu

145 150 155 160

Glu Asp Ala Gln Ala Lys Gln Asp Phe Gly Leu Arg Ile Ile Glu Ala

165 170 175

Gln Glu Glu Glu Arg Lys Arg Val Ser Arg Glu Ile His Asp Gly Pro

180 185 190

Ala Gln Met Leu Ala Asn Val Met Met Arg Ser Glu Leu Ile Glu Arg

195 200 205

Ile Phe Arg Asp Lys Gly Thr Glu Glu Gly Phe Gln Glu Ile Lys Asn

210 215 220

Leu Arg Gln Asn Val Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Val Arg Arg Ile Ile

225 230 235 240

Tyr Asp Leu Arg Pro Met Ala Leu Asp Asp Leu Gly Leu Ile Pro Thr

245 250 255

Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Thr Ile Glu Asp Tyr His Gly Lys Ala Lys

260 265 270

Ile His Phe Gln Cys Ile Gly Glu Ser Glu Glu Arg Arg Ile Ala Pro

275 280 285

Arg Phe Glu Val Ala Leu Phe Arg Leu Ala Gln Glu Ala Val Thr Asn

290 295 300

Ala Leu Lys His Ser Glu Ser Thr Glu Ile His Val Lys Val Glu Val

305 310 315 320

Thr Lys Asp Phe Val Thr Leu Ile Ile Lys Asp Asn Gly Asn Gly Phe

325 330 335

Asp Leu Lys Glu Val Lys Gly Lys Lys Asn Lys Ser Phe Gly Leu Leu

340 345 350

Gly Met Lys Glu Arg Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Met Thr Ile Asp

355 360 365

Ser Lys Ile Gly Leu Gly Thr Phe Ile Leu Ile Lys Val Pro Leu Ser

370 375 380

Leu

385

<210> 175

<211> 229

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DegU_H12L

<400> 175

Met Thr Lys Val Asn Ile Val Ile Ile Asp Asp Leu Gln Leu Phe Arg

1 5 10 15

Glu Gly Val Lys Arg Ile Leu Asp Phe Glu Pro Thr Phe Glu Val Val

20 25 30

Ala Glu Gly Asp Asp Gly Asp Glu Ala Ala Arg Ile Val Glu His Tyr

35 40 45

His Pro Asp Val Val Ile Met Asp Ile Asn Met Pro Asn Val Asn Gly

50 55 60

Val Glu Ala Thr Lys Gln Leu Val Asp Leu Tyr Pro Glu Ser Lys Val

65 70 75 80

Ile Ile Leu Ser Ile His Asp Asp Glu Asn Tyr Val Thr His Ala Leu

85 90 95

Lys Thr Gly Ala Arg Gly Tyr Leu Leu Lys Glu Met Asp Ala Asp Thr

100 105 110

Leu Ile Glu Ala Val Lys Val Val Ala Glu Gly Gly Ser Tyr Leu His

115 120 125

Pro Lys Val Thr His Asn Leu Val Asn Glu Phe Arg Arg Leu Ala Thr

130 135 140

Ser Gly Val Ser Ser His Ala Gln His Glu Val Tyr Pro Glu Ile Arg

145 150 155 160

Arg Pro Leu His Ile Leu Thr Arg Arg Glu Cys Glu Val Leu Gln Met

165 170 175

Leu Ala Asp Gly Lys Ser Asn Arg Gly Ile Gly Glu Ser Leu Phe Ile

180 185 190

Ser Glu Lys Thr Val Lys Asn His Val Ser Asn Ile Leu Gln Lys Met

195 200 205

Asn Val Asn Asp Arg Thr Gln Ala Val Val Val Ala Ile Lys Asn Gly

210 215 220

Trp Val Glu Met Arg

225

<210> 176

<211> 46

<212> PRT

<213> Bacillus pumilus

<220>

<223> DegQ Bacillus pumilus strain SH-B9

<400> 176

Met Glu Lys Tyr Glu Ile Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu Trp Lys Leu

1 5 10 15

Glu Asn Glu Ile Arg Glu Thr Thr Ala Ser Leu His Asn Ile Asn Lys

20 25 30

Ser Ile Asp Gln Tyr Asp Lys Tyr Glu Tyr Val Lys Ile Ser

35 40 45

<210> 177

<211> 46

<212> PRT

<213> Bacillus velezensis

<220>

<223> DegQ Bacillus velezensis FZB42

<400> 177

Met Glu Asn Lys Leu Glu Glu Val Lys Gln Leu Leu Phe Arg Leu Glu

1 5 10 15

Asn Asp Ile Arg Glu Thr Thr Asp Ser Leu Arg Asn Ile Asn Lys Ser

20 25 30

Ile Asp Gln Leu Asp Lys Phe Ser Tyr Ala Met Lys Ile Ser

35 40 45

<210> 178

<211> 46

<212> PRT

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<220>

<223> DegQ Bacillus amyloliquefaciens XH7

<400> 178

Met Glu Lys Lys Leu Glu Glu Val Lys Gln Leu Leu Phe Arg Leu Glu

1 5 10 15

Asn Asp Ile Arg Glu Thr Thr Asp Ser Leu Arg Asn Ile Asn Lys Ser

20 25 30

Ile Asp Gln Leu Asp Lys Phe Ser Tyr Ala Met Lys Ile Ser

35 40 45

<210> 179

<211> 221

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> Promoter: 5-prime region to degQ gene of Bacillus subtilis 168

<400> 179

atataaacgc tctttcgcat agaaagatag tcccgttctt gttgtgattc ctttgagtat 60

aaggacctat tgagatttgc ggtgtcacgc aggacttttt tgcatacttt tcggtgaaaa 120

atgagccgaa agcagacaca ctattagtaa cagatcaaat acctaggact cgttcaccat 180

acacaattca ttgatctttc aaaaaaagga gtgtggaaac g 221

<210> 180

<211> 221

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> Promoter: 5-prime region to degQ gene of Bacillus subtilis strain

NCIB 3610

<400> 180

atataaacgc tctttcgcat agaaagatag tcccgttctt gttgtgattc ctttgagtat 60

aaggacctat tgagatttgc ggtgtcacgc aggacttttt tgcatacttt tcggtgaaaa 120

atgagccgaa agcagataca ctattagtaa cagatcaaat acctaggact cgttcaccat 180

acacaattca ttgatctttc aaaaaaagga gtgtggaaac g 221

<210> 181

<211> 277

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> Promoter: 5-prime region to degQ gene of Bacillus licheniformis

strain ATCC 14580 = DSM 13

<400> 181

acttgcgatg ataaaggggt ttatatgcga tctttatttg actccttgaa aaacaaacaa 60

aaattttatg tttcattagg atttgagaac taatcgcaag ttgtgtaaaa tgggtgttat 120

ggtctattta aagtttgcgg tgtaacgcat gaatttatat gcaacttttc ggtgaaaaag 180

aaaccaaatc cctttaaact tgtattaaca gatcaaatac ctatgactcg ttcactatac 240

acaaattgat tgatcttcca aaaggagtgt ggaaccg 277

<210> 182

<211> 505

<212> DNA

<213> Bacillus pumilus

<220>

<223> Promoter: 5-prime region to degQ gene of Bacillus pumilus strain

SH-B9

<400> 182

atggtcacct cttctctcat tgacgtgaaa ttggacggat atctgttcta aatgtatgta 60

gaaaatcaga ataaagaatc aaaatcatct ttctatcttt ataaatccaa cataaaaata 120

ggtacttttg cggtcaattt cggtgaatgt cgccaaaaaa ttgcggtgtc cacaaagggg 180

cctgtcgtct gacctataac acgcaaaacc gaggttacag gagggatcgt atgttccgtt 240

gtgagagaag tgtgacgaat gatgcctatt cttgtcgcaa aaatgacgga gttcctttga 300

aattaagata aaagtatgat ttgaaaagtc agaaaatgat gaaaaaagac ctattgaatt 360

ttgcggtatc acgcacacat tttgtgcata cttttcggtg aaaaaatact caattacatt 420

tacactgtta gtaacagatc aaatacttat gacccaatca ccatacacaa atacattgat 480

cttccaaaaa aggagagtgg aatcg 505

<210> 183

<211> 464

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<220>

<223> Promoter: 5-prime region to degQ gene of Bacillus velezensis

FZB42

<400> 183

acggcggcct ccttcctgag aaaacattcg ttatatatga gtataggcgg cgtgataacg 60

agttatgaca tgcaaaagac cacaatgcgg gggttgcggt cttttcggtg tttgtcggtg 120

gttatgcgac gctgttcgcc cattctgttt tgaaattgcg acggcaggga ctatagtccc 180

tgccggtttg tcggaaaacc gttaaaaaaa cagcagaacc gccagattgg tctgcttcat 240

cctaaacgtc tgcctttctg gtagttatat agtcctgttc gctaaatgct tcattcggga 300

ctatgggatt accccggttt gcggtgtcac gcagatactt ttacacatac ttttcggtga 360

aaaatcccgc aaaaacgttt acactattag taacagatca aatacctagg actcgttcac 420

catacacaat tcattgatct ttcaaaaaaa ggagtgtgga aacg 464

<210> 184

<211> 464

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<220>

<223> Promoter: 5-prime region to degQ gene of Bacillus

amyloliquefaciens XH7

<400> 184

gcggcggcct ccttctgaga taacattcgt tatacatgag tataggcggc gtgataacga 60

gttatgacat gcaaaaagac cacaatgcgg gtgttgcggt cttttcggtg tttgtcggtg 120

gttatgcgac gctgttcgcc cattctcttt tgaaattgcg acgtcaggga ctatagtcct 180

tagcggtttg tcggaaaacc gttaaaaaac cagcagaacc accagattga tctgcttcat 240

cccaaacgtc tgcctttatg gtagttatat agtcctgttc gccaaatgct ctgttcggga 300

ctatgggatt accgtggttt gcggtgtcac gcagatactt ttacacatac ttttcggtga 360

aaaatcccgc aaaaacgttt acactattag taacagatca aatacctagg actcgttcac 420

catacacaat tcattgatct ttcaaaaaaa ggagtgtgga aacg 464

<210> 185

<211> 385

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> DegS_S218E

<400> 185

Met Asn Lys Thr Lys Met Asp Ser Lys Val Leu Asp Ser Ile Leu Met

1 5 10 15

Lys Met Leu Lys Thr Val Asp Gly Ser Lys Asp Glu Val Phe Gln Ile

20 25 30

Gly Glu Gln Ser Arg Gln Gln Tyr Glu Gln Leu Val Glu Glu Leu Lys

35 40 45

Gln Ile Lys Gln Gln Val Tyr Glu Val Ile Glu Leu Gly Asp Lys Leu

50 55 60

Glu Val Gln Thr Arg His Ala Arg Asn Arg Leu Ser Glu Val Ser Arg

65 70 75 80

Asn Phe His Arg Phe Ser Glu Glu Glu Ile Arg Asn Ala Tyr Glu Lys

85 90 95

Ala His Lys Leu Gln Val Glu Leu Thr Met Ile Gln Gln Arg Glu Lys

100 105 110

Gln Leu Arg Glu Arg Arg Asp Asp Leu Glu Arg Arg Leu Leu Gly Leu

115 120 125

Gln Glu Ile Ile Glu Arg Ser Glu Ser Leu Val Ser Gln Ile Thr Val

130 135 140

Val Leu Asn Tyr Leu Asn Gln Asp Leu Arg Glu Val Gly Leu Leu Leu

145 150 155 160

Ala Asp Ala Gln Ala Lys Gln Asp Phe Gly Leu Arg Ile Ile Glu Ala

165 170 175

Gln Glu Glu Glu Arg Lys Arg Val Ser Arg Glu Ile His Asp Gly Pro

180 185 190

Ala Gln Met Leu Ala Asn Val Met Met Arg Ser Glu Leu Ile Glu Arg

195 200 205

Ile Phe Arg Asp Arg Gly Ala Glu Asp Glu Phe Gln Glu Ile Lys Asn

210 215 220

Leu Arg Gln Asn Val Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Val Arg Arg Ile Ile

225 230 235 240

Tyr Asp Leu Arg Pro Met Ala Leu Asp Asp Leu Gly Leu Ile Pro Thr

245 250 255

Leu Arg Lys Tyr Leu Tyr Thr Thr Glu Glu Tyr Asn Gly Lys Val Lys

260 265 270

Ile His Phe Gln Cys Ile Gly Glu Thr Glu Asp Gln Arg Leu Ala Pro

275 280 285

Gln Phe Glu Val Ala Leu Phe Arg Leu Ala Gln Glu Ala Val Ser Asn

290 295 300

Ala Leu Lys His Ser Glu Ser Glu Glu Ile Thr Val Lys Val Glu Ile

305 310 315 320

Thr Lys Asp Phe Val Ile Leu Met Ile Lys Asp Asn Gly Lys Gly Phe

325 330 335

Asp Leu Lys Glu Ala Lys Glu Lys Lys Asn Lys Ser Phe Gly Leu Leu

340 345 350

Gly Met Lys Glu Arg Val Asp Leu Leu Glu Gly Thr Met Thr Ile Asp

355 360 365

Ser Lys Ile Gly Leu Gly Thr Phe Ile Met Ile Lys Val Pro Leu Ser

370 375 380

Leu

385

<210> 186

<211> 385

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> DegS_S218E

<400> 186

Met Ser Val Ser Lys Met Asp Ser Lys Val Leu Asp Ser Ile Ile Met

1 5 10 15

Lys Met Leu Lys Thr Val Asp Gly Ser Lys Asp Glu Val Phe Gln Ile

20 25 30

Gly Glu Gln Ser Arg Gln Gln Tyr Glu Gly Leu Val Glu Glu Leu Lys

35 40 45

Gln Ile Lys Gln Gln Val Asn Glu Val Ile Asp Leu Gly Asp Arg Leu

50 55 60

Glu Val His Ala Arg His Ala Arg Asn Arg Leu Ser Glu Val Ser Arg

65 70 75 80

Asn Phe His Lys Phe Ser Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Tyr Glu Lys

85 90 95

Ala His Lys Leu Gln Val Glu Leu Thr Met Ile Gln Gln Arg Glu Lys

100 105 110

Gln Leu Arg Glu Lys Arg Asp Asp Leu Glu Arg Arg Leu Leu Gly Leu

115 120 125

Gln Glu Ile Ile Glu Arg Ser Glu Gly Leu Val Ser Gln Ile Thr Val

130 135 140

Val Leu Asn Tyr Leu Asn Gln Asp Leu Arg Gln Val Gly Val Leu Leu

145 150 155 160

Glu Asp Ala Gln Ala Lys Gln Asp Phe Gly Leu Arg Ile Ile Glu Ala

165 170 175

Gln Glu Glu Glu Arg Lys Arg Val Ser Arg Glu Ile His Asp Gly Pro

180 185 190

Ala Gln Met Leu Ala Asn Val Met Met Arg Ser Glu Leu Ile Glu Arg

195 200 205

Ile Phe Arg Asp Lys Gly Thr Glu Glu Glu Phe Gln Glu Ile Lys Asn

210 215 220

Leu Arg Gln Asn Val Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Val Arg Arg Ile Ile

225 230 235 240

Tyr Asp Leu Arg Pro Met Ala Leu Asp Asp Leu Gly Leu Ile Pro Thr

245 250 255

Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Thr Ile Glu Asp Tyr His Gly Lys Ala Lys

260 265 270

Ile His Phe Gln Cys Ile Gly Glu Ser Glu Glu Arg Arg Ile Ala Pro

275 280 285

Arg Phe Glu Val Ala Leu Phe Arg Leu Ala Gln Glu Ala Val Thr Asn

290 295 300

Ala Leu Lys His Ser Glu Ser Thr Glu Ile His Val Lys Val Glu Val

305 310 315 320

Thr Lys Asp Phe Val Thr Leu Ile Ile Lys Asp Asn Gly Asn Gly Phe

325 330 335

Asp Leu Lys Glu Val Lys Gly Lys Lys Asn Lys Ser Phe Gly Leu Leu

340 345 350

Gly Met Lys Glu Arg Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Met Thr Ile Asp

355 360 365

Ser Lys Ile Gly Leu Gly Thr Phe Ile Leu Ile Lys Val Pro Leu Ser

370 375 380

Leu

385

<210> 187

<211> 381

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> B. licheniformis DSM641; 5-prime region to aprE gene comprising

promoter aprE

<400> 187

atctttcacc cgtttctgta tgcgatatat tgcatatttt aatagatgat cgacaaggcc 60

gcaacctcct tcggcaaaaa atgatctcat aaaataaatg aatagtattt tcataaaatg 120

aatcagatgg agcaatctcc tgtcattcgc ggccctcggg acctctttcc ctgccaggct 180

gaagcggtct attcatactt tcgaactgaa catttttcta aaacagttat taataaccaa 240

aaaattttaa attggtcctc caaaaaaata ggcctaccat ataattcatt ttttttctat 300

aataaattaa cagaataatt ggaatagatt atattatcct tctatttaaa ttattctgaa 360

taaagaggag gagagtgagt a 381

<210> 188

<211> 227

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> B. licheniformis DSM641; Promoter aprE trunc. DSM641

<400> 188

ctcgggacct ctttccctgc caggctgaag cggtctattc atactttcga actgaacatt 60

tttctaaaac agttattaat aaccaaaaaa ttttaaattg gtcctccaaa aaaataggcc 120

taccatataa ttcatttttt ttctataata aattaacaga ataattggaa tagattatat 180

tatccttcta tttaaattat tctgaataaa gaggaggaga gtgagta 227

<210> 189

<211> 375

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> B. licheniformis DSM641; Promoter aprE fl- DSM641

<400> 189

cacccgtttc tgtatgcgat atattgcata ttttaataga tgatcgacaa ggccgcaacc 60

tccttcggca aaaaatgatc tcataaaata aatgaatagt attttcataa aatgaatcag 120

atggagcaat ctcctgtcat tcgcggccct cgggacctct ttccctgcca ggctgaagcg 180

gtctattcat actttcgaac tgaacatttt tctaaaacag ttattaataa ccaaaaaatt 240

ttaaattggt cctccaaaaa aataggccta ccatataatt catttttttt ctataataaa 300

ttaacagaat aattggaata gattatatta tccttctatt taaattattc tgaataaaga 360

ggaggagagt gagta 375

<210> 190

<211> 380

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> B. licheniformis ATCC14580; 5-prime region to aprE gene

comprising promoter aprE (database Acc. CP000002)

<400> 190

atcttacacc cgtttctgta tgcgatatat tgcatatttt aatagatgat cgactaggcc 60

gcaacctcct tcggcaaaaa atgatctcat aaaataaatg aatagtattt tcataaaatg 120

aatcagacga agcaatctcc tgtcattcac ggaccccggg acctctttcc ctgccaggtt 180

gaagcggtct attcatactt tcgaaccgaa tatttttcta aaacagttat taataaccaa 240

taaatttaaa ttggccgttc aaaaaaatgg gtctaccata taattcattt tttttctata 300

ataaattaac agaataatta gaatagagta tattattctt ctatttcaat tattctgaat 360

aaaacggagg agagtgagta 380

<210> 191

<211> 226

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> B. licheniformis ATCC14580; Promoter aprE trunc. DSM13 (database

Acc. CP000002)

<400> 191

cccgggacct ctttccctgc caggttgaag cggtctattc atactttcga accgaatatt 60

tttctaaaac agttattaat aaccaataaa tttaaattgg ccgttcaaaa aaatgggtct 120

accatataat tcattttttt tctataataa attaacagaa taattagaat agagtatatt 180

attcttctat ttcaattatt ctgaataaaa cggaggagag tgagta 226

<210> 192

<211> 374

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> B. licheniformis ATCC14580; Promoter aprE fl- DSM13 (database

Acc. CP000002)

<400> 192

cacccgtttc tgtatgcgat atattgcata ttttaataga tgatcgacta ggccgcaacc 60

tccttcggca aaaaatgatc tcataaaata aatgaatagt attttcataa aatgaatcag 120

acgaagcaat ctcctgtcat tcacggaccc cgggacctct ttccctgcca ggttgaagcg 180

gtctattcat actttcgaac cgaatatttt tctaaaacag ttattaataa ccaataaatt 240

taaattggcc gttcaaaaaa atgggtctac catataattc attttttttc tataataaat 300

taacagaata attagaatag agtatattat tcttctattt caattattct gaataaaacg 360

gaggagagtg agta 374

<210> 193

<211> 434

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> B. subtilis subsp. 168; 5-prime region to aprE gene comprising

promoter aprE (database Acc. AL009126)

<400> 193

cttatttctt cctccctctc aataattttt tcattctatc ccttttctgt aaagtttatt 60

tttcagaata cttttatcat catgctttga aaaaatatca cgataatatc cattgttctc 120

acggaagcac acgcaggtca tttgaacgaa ttttttcgac aggaatttgc cgggactcag 180

gagcatttaa cctaaaaaag catgacattt cagcataatg aacatttact catgtctatt 240

ttcgttcttt tctgtatgaa aatagttatt tcgagtctct acggaaatag cgagagatga 300

tatacctaaa tagagataaa atcatctcaa aaaaatgggt ctactaaaat attattccat 360

ctattacaat aaattcacag aatagtcttt taagtaagtc tactctgaat ttttttaaaa 420

ggagagggta aaga 434

<210> 194

<211> 222

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> B. subtilis subsp. 168; Promoter aprE -222 (database Acc.

AL009126)

<400> 194

gcataatgaa catttactca tgtctatttt cgttcttttc tgtatgaaaa tagttatttc 60

gagtctctac ggaaatagcg agagatgata tacctaaata gagataaaat catctcaaaa 120

aaatgggtct actaaaatat tattccatct attacaataa attcacagaa tagtctttta 180

agtaagtcta ctctgaattt ttttaaaagg agagggtaaa ga 222

<210> 195

<211> 175

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> B. subtilis subsp. 168; Promoter bpr -175 (database Acc.

AL009126)

<400> 195

tctcttcaca ctttccttct tataaagtct ttttccctat tgcttccttc gcttagtaac 60

aaaacagata attagaccca tttatttttg tgacattttt atcattttca tatatatgga 120

aattgaatga catgaaacga caatatctgt aattcagatt gtctacagtt aatat 175

<210> 196

<211> 259

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> B. subtilis subsp. 168; 5-prime region to bpr gene comprising

promoter bpr (database Acc. AL009126)

<400> 196

tctcttcaca ctttccttct tataaagtct ttttccctat tgcttccttc gcttagtaac 60

aaaacagata attagaccca tttatttttg tgacattttt atcattttca tatatatgga 120

aattgaatga catgaaacga caatatctgt aattcagatt gtctacagtt aatatacagc 180

gatgttctga caaaccattc attattaaaa ggagggacga cacttttttt aaaaagcatg 240

ttgaaaaagg gggatgaaa 259

<210> 197

<211> 191

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> B. licheniformisATCC14580; 5-prime region to bpr gene comprising

promoter bpr (database Acc. CP000002)

<400> 197

taaaaaagga caaaaccttt aagcggtttt gtcctttttt tatctaattt taaacaaggc 60

cttgacaaat accgacaaaa taattaacca gtttttacta tatttaagtt acatcaaagt 120

cagacaaggc gtccacaagg agggggggac aggaaaattc agctaatttc ataaaaaagg 180

gggatgttca t 191

<210> 198

<211> 344

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> B. subtilis subsp. 168; 5-prime region to sacB gene comprising

promoter sacB (database Acc. AL009126)

<400> 198

taaaaaatac agagaatgaa aagaaacaga tagatttttt agttctttag gcccgtagtc 60

tgcaaatcct tttatgattt tctatcaaac aaaagaggaa aatagaccag ttgcaatcca 120

aacgagagtc taatagaatg aggtcgaaaa gtaaatcgcg cgggtttgtt actgataaag 180

caggcaagac ctaaaatgtg taaagggcaa agtgtatact ttggcgtcac cccttacata 240

ttttaggtct ttttttattg tgcgtaacta acttgccatc ttcaaacagg agggctggaa 300

gaagcagacc gctaacacag tacataaaaa aggagacatg aacg 344

<210> 199

<211> 350

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> B. licheniformis ATCC14580; 5-prime region to sacB gene

comprising promoter sacB (database Acc. CP000002)

<400> 199

acgattcccg cttatacaga ctatagattc atataaaaaa ggtgtctttc cgcttaaaat 60

cggtgtcatt tgcataaaaa tgtataggaa aagaggaact tagaccagtt gagtcccaga 120

gatgagtata ttagaatgat ggtaattcaa tatcgtcggg attgttactg tctaagcagg 180

caagacctaa aatgtgtgaa gggcgaaatc tatcttttgc ctatatgaac ttgcacattt 240

taggtctttt ttctgttctt caggacaatg ccgcagttag gagggatgat tgggaacgtt 300

catgttgtca gaagcaatct attacatatt gaaaaaggga ggaaatattg 350

<210> 200

<211> 700

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> B. subtilis subsp. 168; 5-prime region to ywsC gene comprising

promoter ywsC (database Acc. AL009126)

<400> 200

aaatctaatt gtaaattgta tatataattg aaaaatttaa ggttttcact ctttttttga 60

caaagtcttc acaaatatgg atgaagattt cttgaacaaa tattaagttt tattaaaatt 120

gtttcaaagt catgcgttta gacctgtaaa tggggagaaa cagaaaagac tatcatccca 180

gaaaatgttt aattatgtta gagaattcgg actcgtatgt ttagcgtttt catctcgaac 240

ctccttagtc attttggaat gggcctcata ttgcttattc catgcagaaa ggatgacatt 300

atgaccttgt ccttaagaaa caggataaaa ttattttgtg ttcataagaa ccggaaacac 360

gcatgatagc aggaaatgct tgataacaaa ggctgaaaaa aagattgatt tgaaatgcat 420

attaaataca aacagcaggg tgtgactata cgtccagaag gatatcagga gaaaaatgaa 480

agcgcattct ctttgatttt tttaaaaagt gataaggtat aagtcctgct gttttccaaa 540

aatagaaaac agtttgtagg tataaaatct ctttcaaaag agaagtttgg cttagtcgat 600

tagggaagat tatgttacat aatgccgatt gagaattcat agtgattcta tatactgatg 660

aatgaattta caacaatata gaaggagatg tcgaaaagca 700

<210> 201

<211> 700

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> B. licheniformis ATCC14580; 5-prime region to ywsC gene

comprising promoter ywsC (database Acc. CP000002)

<400> 201

tttagaccgg gctgggatat cgagacatat ataggggcgt ttaatggcga atacagtaac 60

aatgagaata gtaagaaaaa ttaaaaatgt taaagtttga tgaattatca ttgaaaaaaa 120

ttaatggctt tttaaatcct aggattttaa cctaaaatct gaagaaataa ggtggatcga 180

acgactcaca aaatatttgg atttgtcaat gaatcccgct ttatgctaaa agagattttc 240

attttttgat agatggtctg attgtcatag gacggatttg ttttgaagag ggaacattgg 300

tgacttttta acctgttcga aaagagcgaa aatactaaaa gaaaagagag atcccggctg 360

acagcccatt taaaggggat tgcggacggg ggaaaaaaga gatcctgaat ccatccttca 420

acctttcatc tgaaataggg agaaaagtac aaaaatcata atgtcgaatt ttgaaagcgc 480

atacttaaaa cgctgacaaa aatctgatag gaattaagaa ctttcgattt ccaaaaatat 540

caataaaaag ataggcatta atgactcggg cgaggtgatc tttgtcacgg aaaatttcgt 600

cgtcttctgt tacataatgc cgattgtgat ttcatagtga acctatatac tgatgaatga 660

atttacatat cagattccaa gaaggagatg tagacaaaca 700

<210> 202

<211> 382

<212> DNA

<213> Bacillus pumilus

<220>

<223> 5-prime region to aprE1 gene comprising promoter aprE1

<400> 202

ctgttatata aacaggttct tttaaatgac aaaaacaatg ataaaataat atttttttat 60

atcgaaattc gaaatagctg ctagacgttt ctacctattt taaggctttt cgggtatcga 120

atatttctcc gataatggat cataagaaaa atagcatact tcctttttaa tagataatcg 180

ctgaaacagt agaataaaca tattttacca ctatttccaa gtgacttaat tccccaattt 240

tcgctaggac tttcacaaaa attcaggtct actcttattt gcctacttcc cttaaactga 300

atatacagaa taatcaaacg tctcattctt atagactacg gatgattatt ctgaaataag 360

aaaaaaggga tgtggattgt gc 382

<210> 203

<211> 303

<212> DNA

<213> Bacillus pumilus

<220>

<223> 5-prime region to aprE2 gene comprising promoter aprE2

<400> 203

cgagaacatc ttgaaaggca gcacagccga aacccggaat tgtcgagagc gaacatgccg 60

cactttagta cacatgaaag aaagacaaaa acaaaacaag aagccttgca gcacatgata 120

ggaaaacata aaagaaggaa tgcttatgat cactatcaag aggatcataa gcatttttat 180

tttgcttttt tgtgacaact agcttaaata aatggaaaaa tttaaaaaat aggacaaacg 240

atcgtttctt tttgtctaaa aatgtagtta aatgacaaaa agatgaaagg gagagtgggt 300

att 303

<210> 204

<211> 246

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> remB

<400> 204

ttgtatattc atttaggtga tgactttgtg gtttcaacac gagatattgt cggcattttt 60

gactttaaag ccaacatgtc gcctattgtt gaagaatttc tgaaaaaaca gaaacacaag 120

gtggtgcctt ccgtaaacgg cacgcccaaa tctatcgtag tcacggttca gaatatatat 180

tactctccct tatcttccag cacattaaaa aaacgtgcgc aatttatgtt tgaaatagat 240

tcttag 246

<210> 205

<211> 81

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<220>

<223> remB

<400> 205

Met Tyr Ile His Leu Gly Asp Asp Phe Val Val Ser Thr Arg Asp Ile

1 5 10 15

Val Gly Ile Phe Asp Phe Lys Ala Asn Met Ser Pro Ile Val Glu Glu

20 25 30

Phe Leu Lys Lys Gln Lys His Lys Val Val Pro Ser Val Asn Gly Thr

35 40 45

Pro Lys Ser Ile Val Val Thr Val Gln Asn Ile Tyr Tyr Ser Pro Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Thr Leu Lys Lys Arg Ala Gln Phe Met Phe Glu Ile Asp

65 70 75 80

Ser

<210> 206

<211> 243

<212> DNA

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> remB

<400> 206

ttgtatatcc acttaggtga cgattttgtc gtctcaacgc gtgaaattgt ggctattttt 60

gattacaagg caaagacatc gccgattgtt gaggagtttt taagcaagca aaaacagcgg 120

attgtctctt ctaacagcac gccgaagtca attgttgtca cattacaatc gatttatttt 180

tctcctttag cctcaggcac gttgaaaaaa cgggcgcaat ccaagccgga aatcgattca 240

taa 243

<210> 207

<211> 80

<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis

<220>

<223> remB

<400> 207

Met Tyr Ile His Leu Gly Asp Asp Phe Val Val Ser Thr Arg Glu Ile

1 5 10 15

Val Ala Ile Phe Asp Tyr Lys Ala Lys Thr Ser Pro Ile Val Glu Glu

20 25 30

Phe Leu Ser Lys Gln Lys Gln Arg Ile Val Ser Ser Asn Ser Thr Pro

35 40 45

Lys Ser Ile Val Val Thr Leu Gln Ser Ile Tyr Phe Ser Pro Leu Ala

50 55 60

Ser Gly Thr Leu Lys Lys Arg Ala Gln Ser Lys Pro Glu Ile Asp Ser

65 70 75 80

<210> 208

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequence in Figure 2

<400> 208

catacttttc ggtgaaaaat gagccgaaag cagacacact attagtaaca gatcaaata 59

<210> 209

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequence in Figure 2

<400> 209

catacttttc ggtgaaaaat gagccgaaag cagatacact attagtaaca gatcaaata 59

<210> 210

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequence in Figure 2

<400> 210

tcggtgaaaa agaaaccaaa tccctttaaa cttgtattaa cagatcaaat a 51

<210> 211

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequence in Figure 2

<400> 211

catacttttc ggtgaaaaaa tactcaatta catttacact gttagtaaca gatcaaata 59

<210> 212

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequence in Figure 2

<400> 212

catacttttc ggtgaaaaat cccgcaaaaa cgtttacact attagtaaca gatcaaata 59

<210> 213

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Sequence in Figure 2

<400> 213

catacttttc ggtgaaaaat cccgcaaaaa cgtttacact attagtaaca gatcaaata 59

<210> 214

<211> 381

<212> DNA

<213> Bacillus licheniforms

<220>

<223> CDS of forD

<400> 214

atgaaaaatc atttgtatga gaaaaaaaag aggaaacctt tgactcggac aattaaagcg 60

acgctcgccg tgttgacaat gtccatcgct ttggtgggag gcgctacggt gccttcattt 120

gcatgggtga atccgggtta tcactaccag tacccatcgg aaggtggtac atggaggtat 180

ggattcgtaa acgccgggct ccgttcagag tacaaccacc cgacaaaggt ccacggctcg 240

acagtgcaaa agctcatcga tggaaaagtg gataaaacga atagaagtat tgatacggct 300

gcgggccgct actctaatgc ctatgtcgga gccataaact cacctggtct taagggtcgt 360

tactactatc gcaccaacta a 381

<210> 215

<211> 126

<212> PRT

<213> Bacillus licheniforms

<220>

<223> Protein of ForD (Formosin)

<400> 215

Met Lys Asn His Leu Tyr Glu Lys Lys Lys Arg Lys Pro Leu Thr Arg

1 5 10 15

Thr Ile Lys Ala Thr Leu Ala Val Leu Thr Met Ser Ile Ala Leu Val

20 25 30

Gly Gly Ala Thr Val Pro Ser Phe Ala Trp Val Asn Pro Gly Tyr His

35 40 45

Tyr Gln Tyr Pro Ser Glu Gly Gly Thr Trp Arg Tyr Gly Phe Val Asn

50 55 60

Ala Gly Leu Arg Ser Glu Tyr Asn His Pro Thr Lys Val His Gly Ser

65 70 75 80

Thr Val Gln Lys Leu Ile Asp Gly Lys Val Asp Lys Thr Asn Arg Ser

85 90 95

Ile Asp Thr Ala Ala Gly Arg Tyr Ser Asn Ala Tyr Val Gly Ala Ile

100 105 110

Asn Ser Pro Gly Leu Lys Gly Arg Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asn

115 120 125

<210> 216

<211> 1055

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Homology regions of Fusion of 5-prime and 3-prime regions

of forD gene with flanking BsaI sites

<400> 216

ggtctcgacc cggatcccat tcggagtatt tctgaatgat agagccacac ggtccacgtt 60

ctcactggct aaccggatca aatgatcttc aggagtcagc ataatacatc cagttcaggt 120

agataagatt tgaatttggt gacttgcttt tgttcttctt ctttcatttt ctgactaatc 180

caaactggaa aaagcaggtc ttttaacaga ttaggaggtt tctgacatgc accattcggt 240

cactaaccga atgcagtaaa ggacactgtg gtgcttgcca gccattaggg tattgaggag 300

gtgatcaaaa tgctaggtga cagtatttcg tcgaagtgga caagtcgtga ccaaatgacc 360

tcggatcgag ggttggtcat ggaggaaaaa attgatgtct ggtgacaaag aggagtcatg 420

atcatggcac cgccaacgag ggaaaaaact cttcccgcat cgacacggta tgtgggcggt 480

gacaaactaa cttatagagt aaatttatta gtcgaatgaa agctcctcca tgaaatataa 540

tcaaagggaa aacggttgct gtcaacgggg ctagcatggc aagacccaga aaagttctgg 600

gagatcccgc tttgcataag cgtattatag tggatgacgc gggctttgtt gtttacactt 660

cttgcacctg ctgacggcaa tcatccctat ctatgaaatc gagatttcag caggccgtta 720

ttttcgagag agttaaatct atattcattg tttttatttt ggtaaggaca taccggattt 780

taggtttgga ttaccggtcg agttagcttg tcttttcgcc cactaccgtg tcgatgcggg 840

agcaatttac cagaagcact taccgattga tagtttttta ttccggtgat tgcaaagttt 900

cataaactct gagaattcaa taggggtaat accccgcttt gaggggcgcg gcattttatg 960

cgccccgagt atttattctt aaaattttta aattaatgta tctatataaa aaggagatgc 1020

tttcggtgta ctgccaaacc atggctcagg agacc 1055

<210> 217

<211> 1022

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Homology region of the fusion of 5-prime and 3-prime

regions of amyB gene with flanking BsaI sites

<400> 217

ggtctcgacc cacaaggctg tcaaacgaaa aagcgtatca ggagattaac gacacgcaag 60

aaatgatcga aaaaatcagc ggacacctgc ctgtacactt gcgtcctcca tacggcggga 120

tcaatgattc cgtccgctcg ctttccaatc tgaaggtttc attgtgggat gttgatccgg 180

aagattggaa gtacaaaaat aagcaaaaga ttgtcaatca tgtcatgagc catgcgggag 240

acggaaaaat cgtcttaatg cacgatattt atgcaacgtc cgcagatgct gctgaagaga 300

ttattaaaaa gctgaaagca aaaggctatc aattggtaac tgtatctcag cttgaagaag 360

tgaagaagca gagaggctat tgaataaatg agtagaaagc gccatatcgg cgcttttctt 420

ttggaagaaa atatagggaa aatggtattt gttaaaaatt cggaatattt atacaatatc 480

atatgtttca cattgaaagg ggaggagaat ctagaagagc agagaggacg gatttcctga 540

aggaaatccg tttttttatt ttgcccgtct tataaatttc tttgattaca ttttataatt 600

aattttaaca aagtgtcatc agccctcagg aaggacttgc tgacagtttg aatcgcatag 660

gtaaggcggg gatgaaatgg caacgttatc tgatgtagca aagaaagcaa atgtgtcgaa 720

aatgacggta tcgcgggtga tcaatcatcc tgagactgtg acggatgaat tgaaaaagct 780

tgttcattcc gcaatgaagg agctcaatta tataccgaac tatgcagcaa gagcgctcgt 840

tcaaaacaga acacaggtcg tcaagctgct catactggaa gaaatggata caacagaacc 900

ttattatatg aatctgttaa cgggaatcag ccgcgagctg gaccgtcatc attatgcttt 960

gcagcttgtc acaaggaaat ctctcaatat cggccagtgc gacggcatta tctcaggaga 1020

cc 1022

<210> 218

<211> 794

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Homology regions of gene synthesis HomA + HomB remA R18W,

P29S

<400> 218

ggtggtctct acccaagtcg cactgtttgc agaccgttcg gatatcacgg aagaagtgac 60

gaggctgaaa agccatttcc gccagttccg cgatatttgc aaagcgggag gagccgcggg 120

gagaaagctc gatttcctcg tccaggagct caaccgtgaa gcgaacacga tcggttcaaa 180

agcgaatgat caccagatca caaaacatgt ggtcgaaatg aaaagctcta ttgaaaaaat 240

aaaagaacaa gtgcaaaata tagaatagcg attgtgcgta ttgtttacgg atgttctctg 300

caggttaaac tagagacgtc caagtacagg gggaacgtat aggatgacga ttaaactgat 360

caatatcggc tttggaaata tcatatccgc gaattggctg atctcgattg tgagtcctga 420

gtccgcatcg attaagcgga tgatccagga tgcccgcgac agaggcatgc ttatagatgc 480

tacatatgga agaagaaccc gtgcggttgt cattatggac agtgaccata tcatcttatc 540

tgccgtccag cctgagacag tagcacaaag gctttccgtt aaagaagaaa ttatggatga 600

agggcaggga taagagcttt atgaaagaaa gaggtttgtt aatcgttctc tccggccctt 660

ccggcgtcgg aaaaggaaca gtcaggcagg cgctgtttgc tcaggaggac acaaaatttg 720

aatattcgat ttcggtgacg acaagaaaac cgcgtcaagg cgaaagagac ggcgtcgact 780

ctcaagagac cacc 794

Claims (15)

1.一种修饰的芽孢杆菌宿主细胞，包含

i)与对照细胞相比，减少胞外聚合物质(EPS)的量的突变和/或减少生物膜胞外基质组分TasA的量的突变，以及

ii)与对照细胞相比，增加磷酸化的DegU的量的突变。

2.权利要求1的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述减少胞外聚合物质(EPS)的量的突变是导致epsA-O操纵子表达减少的突变，并且其中所述减少生物膜胞外基质组分TasA的量的突变是导致tapA-sipW-tasA操纵子表达减少的突变。

3.权利要求2的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述突变选自

a)使tapA-sipW-tasA操纵子失活的突变，

b)使epsA-O操纵子失活的突变，

c)使基因remA失活的突变，

d)使基因remB失活的突变，以及

e)使slrA基因失活的突变。

4.权利要求3的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述使tapA-sipW-tasA操纵子失活的突变是tapA-sipW-tasA操纵子或其一部分的缺失。

5.权利要求3的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述使epsA-O操纵子失活的突变是epsA-O操纵子或其一部分的缺失。

6.权利要求3的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述使基因remA或remB失活的突变是所述基因的错义突变或者其全部或部分缺失。

7.权利要求3的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述使slrA基因失活的突变是slrA基因的缺失。

8.权利要求5的修饰的芽孢杆菌宿主，其中所述增加磷酸化DegU的量的突变选自

u1)导致选自degU、degS、degQ和degR的至少一种基因表达增加的突变，

u2)导致rapG基因表达减少或phrG基因表达增加的突变，

u3)稳定DegU磷酸化状态的突变，如degU32突变，

u4)增加DegS蛋白自磷酸化活性的突变，如DegS-S76D突变，以及

u5)降低DegS蛋白磷酸酶活性的突变，如degS200突变。

9.权利要求8的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述突变是degU32突变。

10.权利要求8的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述突变是导致degQ表达增加的突变，如在宿主细胞中引入和表达degQ基因的额外的拷贝。

11.权利要求1-10中任一项的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞属于物种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲醇芽孢杆菌(Bacillusmethanolicus)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))、漠海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、球芽孢杆菌(Bacillus globigii)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

12.权利要求1-11中任一项的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述宿主细胞包含感兴趣的多肽的表达盒。

13.权利要求12的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述感兴趣的多肽是酶，如选自淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、甘露聚糖酶、植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、葡糖淀粉酶、核酸酶、半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶和纤维素酶的酶。

14.一种生产感兴趣的多肽的方法，包括

a)提供权利要求12或13的修饰的芽孢杆菌宿主细胞，

b)在允许表达感兴趣的多肽的条件下培养宿主细胞，以及

c)任选地，从培养基分离感兴趣的多肽。

15.权利要求14的方法，其中步骤b)中的培养以补料分批培养进行。