BRPI0715619A2 - variantes de pululanase com produtividade aumentada - Google Patents

Abstract

VARIANTES DE PULULANASE COM PRODUTIVIDADE AUMENTADA. A presente invenção refere-se a novas variantes de pululanase de peptídeo enzimática, a sequências de gene que codificam os referidos novos peptídeos, a vetores de expressão compreendendo aquelas sequências de gene, bem como a organismos que expressam as novas variantes de pululanase. As novas variantes de pululanase da presente invenção foram produzidas empiricamente pelo uso de procedimentos de otimização de códon, mutilação de moléculas do "tipo selvagem", e através da substituição de resíduos de aminoácido selecionados. Além disso, a presente invenção se refere ao uso desses novos peptídeos de pululanase em indústrias têxteis, de fermentação, de alimento, e outras.

Description

Relatorio Descritivo da Patente de Invengao para "VARIANTES DE PULULANASE COM PRODUTIVIDADE AUMENTADA".

Referenda cruzada a pedidos relacionados

Este pedido reivindica prioridade aos pedidos provisorios dos Estados Unidos US 60/903.247, depositado em 23 de fevereiro de 2007, e US 60/839.735, depositado em 23 de agosto de 2006, cada um do qual sen- do aqui incorporado por referencia em sua totalidade. Campo da Invencao

A presente invengao refere-se a novas variantes da pululanase de peptideo enzimatica, as sequencias de gene que codificam referidos no- vos peptideos, a veto res de expressao compreendendo aquelas sequencias de gene, bem como a organismos que expressam as novas variantes de pululanase. Alem disso, a invengao se refere ao uso destes novos peptideos de pululanase em indijstrias texteis, de fermentagao, de alimento, e outras. Antecedentes da Invencao

As pullulanases sao enzimas encontradas iiteis em numerosas aplicag5es industrials, especialmente nas indijstrias de alimento e de bebida. As pullulanases sao enzimas de desramificagao de amido, e sao efetivas na desramificagao de hidrolizatos de amido (uteis em pasta de condicionamen- to), na desramificagao de dextrans β-limite (iiteis na preparagao de cervejas e ales), e na produgao de xaropes de agiicar de milho, batata, trigo, mandio- ca, e arroz, por exemplo. As pullulanases sao enzimas classificadas em EC 3.2.1.41, e tais enzimas sao caracterizadas por sua capacidade de hidrolisar as Iigag5es a-1,6-gIicosidicas em, por exemplo, amilopectin e pullulan. As pullulanases sao ο produto de bacteria, especialmente do

genero Bacillus. A produgao de pullulanases para uso industrial nao e sem problemas. As pullulanases sao rapidamente degradadas por varias protea- ses tambem produzidas pela bacteria, produzindo, desse modo, a recupera- gao de grandes quantidades de pululanase ineficiente e custosa. Varias pes- soas no campo tem metodos delineados para aumentar a produgao pela Ii- mitagao da degradagao de pululanase na cultura. Por exemplo, mostra-se anteriormente que e retirada dos genes AprL e Mpr (que expressam proteases) de uma cepa de produgao de pululanase foi necessaria para a expressao economica de pululanase ativa. Ainda1 ο tempo de fermentagao e Iimitado a 51-60 horas para Iimitar degradagao proteolitica e perda de atividade do ρ rod uto de pululanase. Svendsen designou variantes de pululanase que alte- ram a conformagao tridimensional da enzima para aumentar a estabilidade termica, ou mudar como a enzima degrada seu substrato (vide, Patentes dos Estados Unidos 6.350.599 e 6.838.257, bem como Pedido dos Estados Uni- dos ns 2004/0082028).

Mais recentemente, mostra-se que a regulagao de degradagao de pululanase foi determinada com ο seguinte resultado: entre 30 e 50 horas um pingamento parcial da molecula de pululanase de comprimento total nas moleculas truncadas que carecem de aminoacidos 98 e 102 N-terminais, respectivamente, foi observado. O pingamento ocorreu N-terminalmente de res id uos de acido glutamico E99 e E103, respectivamente, e pode ser visua- Iizado por HPLC. Surpreendentemente, as moleculas de pululanase trunca- das 1-98 e 1-102 retem atividade de pululanase, e ainda mais surpreenden- temente, foi demonstrado que sua atividade e mais alta do que da pululana- se de comprimento total. Apos 51 horas, degradagao adicional de pululanase resultou na queda de atividade que eventualmente aboliu toda atividade. Ainda, existe capacidade para ο aperfeigoamento no desenho de

peptideos de pululanase e nas sequencias de nucleotideo que codificam as mesmas. Portanto, ο que e necessario sao compostos e metodos para a produgao mais eficiente de pululanase por, por exemplo, Iimitagao de degra- dagao proteolitica, aumentando-se as titulagoes de fermentagao, ou aumen- tando-se a atividade de pululanase. Sumario da Invencao

A presente invengao refere-se a novas e nao-obvias formas de pululanase, uma enzima de peptideo. As pullulanases da presente invengao compreendem novas modificagdes que resultam em desempenho superior com relagao a produgao de titulagdes, e/ou suportando degradagao (por e- xemplo, degradagao enzimatica por proteinases) e/ou sao mais ativas na

quebra de materials de substrato alvos do que os peptideos originais ("tipo selvagem"). Neste particular, a presente invengao se refere as pullulanases de peptideo SEQ ID NO: 2’ SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6’ conforme mos- trado nas figuras 7(b), 8(b) e 9(b), respectivamente. A presente invengao tambem se refere as sequencias de nucleotideo que codificam sequencias de aminoacido SEQ ID NOS: 2, 4 e 6. As respectivas sequencias de nucleo- tideo sao tambem mostradas nas figuras 7(a), 8(a) e 9(a) como SEQ ID NOS: 1，3 e 5, respectivamente. Conforme e bem conhecido na tecnica, ο codigo genetico e redundante com codons de nucleotideo mijltiplos que co- dificam ο mesmo aminoacido. Desse modo, a presente invengao adiciorial- mente se refere a quaisquer sequencias de nucleotideo alternadas que codl· ficam os peptideos de SEQ ID NOS: 2, 4 e 6. Um versado na tecnica e ca- paz de determinar as sequencias de nucleotideo que codificam as sequen- cias de peptideo da presente invengao baseado nos ensinamentos do reIato- rio descritivo e conhecimento da tecnica.

A presente invengao tambem se refere a construtos de expres- sao que codificam os peptideos da presente invengao. A presente invengao nao e Iimitada a qualquer construto de expressao considerando-se que ela e capaz da expressao dos peptideos da presente invengao. Neste particular, exemplos nao-limitativos de construtos de expressao adequadas sao mos- trados esquematicamente na parte (a) das figuras 4-6.

Conforme explanado em maiores detalhes na Descrigao Deta- Ihada e seg5es de Exemplos deste relatorio descritivo, a sequencia que codi- fica ο peptideo de pululanase original (de Bacillus deramificans) foi modifica- da por tecnicas de otimizagao de codon para produzir uma sequencia de nucleotideo otimizada por codon [SEQ ID N0:1], que codifica uma duplicata da sequencia de aminoacido de pululanase tipo seIvagem (isto e, original) [SEQ ID NO:2]. A sequencia de nucleotideo que codifica sequencia de ami- noacido [SEQ ID N0:2] foi clonada em duas orientag5es no local Xhol do vetor de integragao B. Iicheniformis plCatH criando versdes Ori 1 (plCatH- PUL-Oril) e Ori2 (plCatH-PUL-0ri2) da construto de expressao.

Em outra concretizagao, a sequencia que codifica ο peptideo de pululanase original foi modificada para produzir um peptide。de pululanase da qual os 104 aminoacidos N-terminais foram retirados. A sequencia de nucleotideo que codifica esta nova pululanase foi tambem, em uma concreti- za?§o, otimizada por codon [SEQ ID NO:3], O peptide。express。por esta construto，PULm 104, e dado em SEQ ID N〇:4 (Vide, figura 8(b)). A sequen- cia de nucleotideo que codifica [SEQ ID NO:4] foi clonada em duas orienta- ?0es no local Xhol do vetor de integragao B. Iicheniformis plCatH criando versSes Oril (plCatH-PULm104-Oril) e Ori2 (PICatH-PUL-Ori2) da construto de expressao.

Em outra concretizagao, a sequencia que codifica ο peptideo de pululanase original foi alterada para substituir os residuos de aminoacido nas posi?5es 99 e 103 de acido glutamico (E) em glutamina (Q) para produzir ο PePtideo resultante mais resistente para degradagao proteolitica nestas po- si?5es. A sequencia de nucleotideo que codifica esta nova pululanase foi tambem, em uma concretizagao, otimizada por codon [SEQ ID NO:3], O pep- tideo expresso por esta sequencia de acido nucleico, PUL_E99Q—E103Q e dado em SEQ ID NO:6. A sequencia de nucleotideo que codifica [SEQ ID NO:6] foi clonada em duas orientagoes no local Xhol do vetor de integragao B. Iicheniformis plCatH criando vers5es Ori 1 (plCatH-PUL_E99Q_E103Q- Oril) e Ori2 (pICat-PUL—E99QJE103Q-〇ri2) da construto de expressao.

A presente invengao tambem se refere a transfecgao da constru- to de expressao da presente invenpao em organismos hospedeiros adequa- dos. A presente invengao nao e Iimitada a qualquer organismo hospedeiro particular. O organismo hospedeiro pode ser, por exemplo, um micro- organismo, uma celula eucariotica ou cultura de tecido, uma celula de planta, ou uma cultura de tecido, ou uma celula de fungo, ou cultura de tecido. Em uma concretizagao preferida, ο organismo hospedeiro em um micro- organismo. Organismos hospedeiros preferidos incluem, mas nao estao Iimi- tados a, Bacillus sp. (esp., Bacillus subtilis, B. Iicheniformis e B. deramifici- cans), Escherichia coli, Trichoderma reesei, Saccharomyces cerevisiae ou Aspergillus niger. Em uma concretizagao mais preferida, ο organismo hos- pedeiro e B. Iicheniformis. A presente invengao se refere ao isolamento e purificagao dos peptideos da presente invengao a partir do meio no qual os organismos hos- pedeiros da presente invengao sao cultivados. Em particular, a presente in- vengao nao e Iimitada a qualquer tecnica particular de isolamento e purifica- gao considerando-se que ela resulta em uma pureza minima de 10%. Em uma concretizagao mais preferida, a pureza minima do peptideo isolado e purificado e 25%, em uma ainda concretizagao mais preferida, a pureza mi- nima do peptideo isolado e purificado e 50%. Em uma concretizagao ainda mais preferida, a pureza minima do peptideo isolado e purificado e 75%. Em uma concretizagao mais preferida, a pureza minima do peptideo isolado e purificado da presente invengao e 90%. A pureza minima pode ser medida pela percentagem de peso seco total, ou outros meios adequados conheci- dos na tecnica.

A presente invengao nao e Iimitada a qualquer meio de purifica- gao particular do isolamento ou purificagao dos peptideos da presente in- vengao. Qualquer meio de purificagao de peptideo conhecido na tecnica e adequado. Exemplos nao-limitativos de qualquer meio de purificagao ade- quado incluem cromatografia de afinidade, precipitagao, cromatografia de exclusao de tamanho, cromatografia de camada delgada, eletroforese, filtra- gao de tamanho, etc.

Um versado na tecnica reconhecera que um fragmento biologi- camente ativo das pullulanases da presente invengao pode ser usado em vez da sequencia de comprimento total ou equivalente no contexto da pre- sente invengao. Um "fragmento biologicamente ativo" e pretendido para en- volver qualquer analogo, mimetico, mutilagao, retirada e/ou substituigao das sequencias da presente invengao. Peptidomimeticos das pullulanases e do- minios ativos das pullulanases da presente invengao podem ser designados computacionalmente usando-se dados estruturais, conforme e conhecido na tecnica. Adicionalmente1 em uma concretizagao da presente invengao, e contemplado que analogos e mutagoes das sequencias de nucleotideo das pullulanases da presente invengao podem ser gerados por evolugao molecu-

lar direta. As tecnicas de evolugao de molecula direta sao conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N0 5.605.793 para Stemmmer et al, ou Patente dos Estados Unidos Ne 6.537.776 para Short1 que são aqui incorporadas por referência). As proteínas geradas por evolu- ção molecular direta terão menor, igual ou maior capacidade de funcionar, conforme comparada aos peptídeos da presente invenção.

Em outra concretização da presente invenção, os peptídeos da presente invenção são usados como proteínas de fusão com, por exemplo, outros domínios de peptídeo estruturais ou funcionais. Tal domínio pode, por exemplo, conferir outras capacidades enzimáticas à proteína de fusão, ou ligar o peptídeo a uma superfície.

Os peptídeos da invenção também incluem aqueles que ocorrem como um resultado da existência de genes múltiplos, eventos de transcrição alternativos, eventos de união de RNA alternativos, e eventos translacionais e pós-translacionais alternativos. O polipeptídeo pode ser expresso em sis- temas, por exemplo, células cultivadas, que resultam em substancialmente as mesmas modificações pós-translacionais presentes quando pululanase expressa é expressa em uma célula nativa, ou em sistemas que resultam nas omissões de modificações pós-translacionais presentes quando expres- sas em uma célula nativa. Também incluída na invenção é um composição que incluí um

ou mais polipeptídeos de pululanase (ou um ácido nucléico que codifica), e um ou mais componentes adicionais, por exemplo, um transportador, diluen- te ou solvente. O componente adicional pode ser um que torna a composi- ção útil para uso farmacêutico in vitro, in vivo, ou veterinário. Em outro aspecto, a invenção proporciona um ácido nucléico

substancialmente puro tendo ou compreendendo uma seqüência de nucleo- tídeo que codifica um polipeptídeo, a seqüência de aminoácido da qual in- clui, ou é, a seqüência de um peptídeo de pululanase da presente invenção.

Em concretizações preferidas, o ácido nucléico de pululanase objeto incluirá uma seqüência regulatória transcricional, por exemplo, pelo menos um de um promotor transcricional, ou seqüência intensificadora transcricional, operavelmente ligada a seqüência de gene de pululanase, por exemplo, para tornar a seqüência de gene de pululanase adequada para uso como um vetor de expressão.

Em ainda uma outra concretização preferida, o ácido nucléico que codifica um peptídeo de pululanase da invenção hibridiza sob condições estringentes a uma sonda de ácido nucléico correspondente a pelo menos 12 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NOS: 1, 3 ou 5, mais preferivelmente a pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NOS: 1, 3 ou 5.

Outra concretização preferida da presente invenção proporciona aplicações de pululanase aqui descrita em uma variedade de ajustes indus- triais. Por exemplo, a presente invenção se refere ao uso das novas varian- tes de pululanase da invenção na produção de produtos alimentícios (inclu- indo, mas não limitados a, várias massas e xaropes), bebidas (incluindo, mas não limitadas a, várias bebidas fermentadas tais como cervejas e ales), bioetanol e numerosos outros produtos conhecidos àqueles versados na técnica.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra uma representação esquemática do processo de pululanase atual e as variantes de pululanase designadas neste projeto.

A figura 2 mostra a arquitetura molecular das construtos presen- tes nas cepas de expressão de pululanase produzidas na presente invenção, em comparação a construto de expressão de pululanase na cepa BMP139.

A figura 3 mostra uma representação esquemática do vetor pl- CatH. O vetor pICatH contém uma origem sensível de temperatura de repli- cação (ori pE194, para replicação em Bacillus), ori pBR322 (para amplifica- ção em E. coli), um gene de resistência à neomicin para seleção, e o gene de resistência de cloranfenicol B. Iicheniformis (cat) com repetições para se- leção, integração cromossomal, e amplificação de cassete.

A figura 4 mostra uma representação esquemática da construto pICatH-PUL Oril.

A figura 5 mostra uma representação esquemática da construto

pICatH-PULml 040ri1.

A figura 6 mostra uma representação esquemática da construto plCatH-PUL_E99Q_E103Q Ori.

As figuras 7A-B mostra (a) a seqüência de ácido nucléico [SEQ ID NO:1] e (b) a seqüência de aminoácido [SEQ ID NO:2] de pululanase "ti- po selvagem" optimizada de códon (PUL).

As figuras 8A-B mostra (a) a seqüência de ácido nucléico [SEQ

ID NO:3] e (b) a seqüência de aminoácido [SEQ ID NO:4] de pululanase PULmI 04.

As figuras 9A-B mostra (a) a seqüência de ácido nucléico [SEQ ID NO:5] e (b) a seqüência de aminoácido [SEQ ID NO:6] de PUL_E99Q- E103Q pululanase. Seção de Definição

Deve ser notado que, conforme usado neste relatório descritivo e reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referentes plurais, a menos que o conteúdo indique claramente de outro mo- do. Desse modo, por exemplo, referência a uma composição contendo "um composto" inclui uma mistura de dois ou mais compostos. Deve ser também notado que o termo "ou" é geralmente empregado em seu sentido incluindo "e/ou", a menos que o conteúdo indique claramente de outro modo.

O termo "pullulunase" se refere a um tipo específico de glucana- se, uma endoenzima amilolítica que degrada pullulante. Ela é produzida co- mo, por exemplo, uma lipoproteína ancorada na superfície da célula, extra- celular, por bactéria Gram-negativa do gênero Klebsiella. Bactéria Gram- positiva, contudo, produz pululanase como proteínas secretadas. As pullula- nases tipo I atacam especificamente ligações a-1,6, enquanto pullulanases tipo Il são capazes de hidrolisar ligações a-1,4. Ela é também produzida por algumas outras bactérias ou archeae. A pululanase é usada como um deter- gente em biotecnologia. A pululanase (EC 3.2.1.41) é também conhecida como pullulan-6-glucanohidrolase (enzima de desramificação). A pullulan está relacionada como uma cadeia de unidades de maltotriose ligadas por ligações a-1,6-glucosídicas. A pullulunase clivará hidroliticamente pullulan (α-glucan polissacarídeos).

Q termo "otimização de códon" se refere a técnicas para aumen- tar níveis de expressão por substituição de códons de nucleotídeo em uma seqüência de codificação com códons que codificam o mesmo aminoácido, ou mais eficientemente processados pelo organismo hospedeiro. A prefe- rência de códon entre espécies diferentes pode ser dramaticamente diferen- te. Para aumentar o nível de expressão de uma proteína estranha em um sistema de expressão particular (bactérias, fungos, levedura, inseto, planta ou células mamíferas), é muito importante ajustar a freqüência de códon da proteína estranha para equiparar aquela do sistema de expressão otimizado. Um exemplo clássico é GFP (proteína fluorescente verde) que foi otimizada para alcançar alto nível de expressão em células de mamífero. Desse modo, otimização de códon pode ser usada para expressar as proteínas da presen- te invenção em uma ampla variedade de organismos hospedeiros onde tais seqüências não podem ser expressas eficientemente sob qualquer condição.

O termo "vetor de expressão", conforme aqui usado, se refere a uma molécula de DNA recombinante contendo uma seqüência de codifica- ção desejada e seqüência de ácido nucléico apropriada necessária para a expressão das seqüências de codificação operavelmente ligadas em um or- ganismo hospedeiro particular. As seqüências de ácido nucléico necessárias para expressão em procariotes inclui um promotor, opcionalmente uma se- quência operadora, um local de ligação de ribossomo, e, possivelmente, ou- tras seqüências.

Um "promotor heterólogo", conforme aqui usado, é um promotor que não está naturalmente associado com um gene ou um ácido nucléico purificado. O termo "promotor", "elemento promotor", ou "seqüência promo- tora", conforme aqui usados, se referem a uma seqüência de DNA que quando ligada a uma seqüência de nucleotídeo de interesse é capaz de con- trolar a transcrição da seqüência de nucleotídeo de interesse em mRNA. Um promotor está tipicamente, embora não necessariamente, localizado 5' (isto é, à montante) de uma seqüência de nucleotídeo de interesse cuja transcri- ção em mRNA ela controla, e proporciona um local para ligação específica por RNA polimerase e outros fatores de transcrição para iniciação de trans- crição. O termo "tipo específico de célula" ou "organismo hospedeiro específico", ou termos equivalentes, conforme aplicados a um elemento re- gulatório, se refere a um elemento regulatório que é capaz de direcionar ex- pressão seletiva de uma seqüência de nucleotídeo de interesse em um tipo específico de célula ou organismo na ausência relativa de expressão da mesma seqüência de nucleotídeo de interesse em um tipo diferente de célu- la ou organismo dentro do mesmo tecido. O termo "tipo específico de célula" ou "organismo hospedeiro específico", quando aplicado a um elemento regu- latório também significa um elemento regulatório capaz de promover expres- são seletiva de uma seqüência de nucleotídeo de interesse em uma região dentro de um tecido ou organismo simples, respectivamente.

Um "isolado", "preparação purificada" ou uma "preparação subs- tancialmente pura" de um polipeptídeo, conforme aqui usado, significa que foi identificado e separado de pelo menos um contaminante com o qual é ordinariamente associado em seu estado natural, ou quando obtido de sua fonte atual. O pelo menos um outro contaminante pode ser, por exemplo, outras proteínas, lipídeos, e ácidos nucléicos com o qual ele naturalmente ocorre. Preferivelmente, o polipeptídeo é também separado da substância, por exemplo, anticorpos ou matriz de gel, por exemplo, poliacrilamida, que são usados para purificá-lo. Preferivelmente, o polipeptídeo constitui pelo menos 10, 20, 50, 70, 80 ou 95% de peso seco da preparação purificada. Preferivelmente, a preparação contém: polipeptídeo suficiente para permitir sequenciamento de proteína; pelo menos 1, 10 ou 100 mg do polipeptídeo; pelo menos 1, 10 ou 100 mg do polipeptídeo.

Uma "preparação purificada de células", conforme aqui usado, se refere a, no caso de células de planta ou de animal, uma preparação in vitro de células e não uma planta ou animal intacto total. No caso de células cultivadas ou células microbiais, ela consiste de uma preparação de pelo menos 10% e, mais preferivelmente, 50% das células objetos.

Um "ácido nucléico substancialmente puro", por exemplo, um DNA substancialmente puro, é um ácido nucléico que é um ou ambos de: não imediatamente contíguo com ou uma ou ambas das seqüências, por exemplo, seqüências de codificação, com a qual é imediatamente contígua (isto é, um na extremidade 5' e um na extremidade 3') no genoma que ocor- re naturalmente do qual o ácido nucléico é derivado; ou que é substancial- mente livre de uma seqüência de ácido nucléico com a qual ele ocorre no organismo do qual o ácido nucléico é derivado. O termo inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, por exemplo, em um plasmídeo de replicação autônoma ou vírus, ou no DNA genômico de uma procariote ou eucariote, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ou um fragmento de DNA genômico produzido por PCR ou tratamento de endonuclease de restrição), independente de outra se- qüência de DNA. Adicionalmente, o termo "isolado" quando usado em rela- ção a um ácido nucléico, conforme em "uma seqüência de ácido nucléico isolada" se refere a uma seqüência de ácido nucléico que é identificada e separada de pelo menos um ácido nucléico contaminante com o qual ele é ordinariamente associado em seu estado atual, ou quando obtido de sua fonte atual. Ácido nucléico isolado é o ácido nucléico presente em uma for- ma ou assentamento que é diferente daquela na qual ela é encontrada na natureza. Em contraste, ácidos nucléicos não-isolados são ácidos nucléicos tais como DNA e RNA que são encontrados no estado que eles existem na natureza. Por exemplo, uma dada seqüência de DNA (por exemplo, gene) é encontrada no cromossomo de célula hospedeira em proximidade aos genes vizinhos. Seqüências de RNA, tal como uma seqüência de mRNA específica que codifica uma proteína específica, são encontradas na célula como uma mistura com numerosos outros mRNAs que codificam uma multiplicidade de proteínas. Contudo, uma seqüência de ácido nucléico isolado compreenden- do, por exemplo, SEQ ID NO:1 inclui, por meio de exemplo, tais seqüências de ácido nucléico em células que contêm ordinariamente SEQ ID NO:1 onde a seqüência de ácido nucléico está em uma localização cromossomal ou extracromossomal diferente daquela de células naturais, ou é, de outro mo- do, flanqueada por uma seqüência de ácido nucléico diferente daquela en- contrada na natureza. A seqüência de ácido nucléico isolada pode estar pre- sente na forma de trançado simples ou trançado duplo. Quando uma se- quência de ácido nucléico isolada é para ser utilizada para expressar uma proteína, a seqüência de ácido nucléico conterá (em um mínimo) pelo menos uma porção do sentido ou de trançado de codificação (isto é, a seqüência de ácido nucléico pode ser de trançado simples). Alternativamente, ela pode conter ambos os trançados de sentido e de antissentido (isto é, a seqüência de ácido nucléico pode ser de trançado duplo).

"Homóloga", conforme aqui usado, se refere à similaridade de seqüência entre duas moléculas de polipeptídeo, ou entre duas moléculas de ácido nucléico. Quando uma posição em ambas das duas seqüências comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade de monômero de aminoácido, por exemplo, se uma posição em cada uma de duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então as moléculas são homólogas naquela posição. A percentagem de homologia entre duas seqüências é uma função do número de posições de equiparação ou homóloga compartilhas pelas duas seqüências divididas pelo número de posições comparadas χ 100. Por exemplo, se 6 de 10 das posições em duas seqüências são equiparadas ou homólogas, então as duas seqüências são 60% homólogas. Por meio de exemplo, as seqüências de DNA ATTGCC e TATGGC compartilham 50% de homologia. Geralmente, uma comparação é feita quando duas seqüências estão alinhadas para dar homologia máxima.

Os termos "peptídeo(s)", "proteína(s)" e "polipeptídeo(s)" são usados permutavelmente aqui.

O termo "protease" significa uma proteína ou domínio de poli- peptídeo derivado de um micro-organismo, por exemplo, um fungo, bactéria, ou de uma planta ou animal, e que tem a capacidade de catalisar clivagem de ligações de peptídeo em uma ou mais de várias posições de um suporte de proteína.

Preferivelmente, proteínas de pululanase, de acordo com a pre- sente invenção, são isoladas ou purificadas. Por purificação ou isolamento é significativo que a proteína de pululanase é alterada de seu estado natural em virtude da separação da pululanase de alguns ou todos dos constituintes que ocorrem naturalmente com o qual ela está associada na natureza. Tal isolamento ou purificação pode ser acompanhado por técnicas de separação conhecidas na técnica, tais como, cromatografia de troca de íon, cromato- grafia de afinidade, separação hidrofóbica, diálise, tratamento de protease, precipitação de sulfato de amônia, ou outra precipitação de sal de proteína, centrifugação, cromatografia de exclusão de tamanho, filtração, microfiltra- ção, eletroforese de gel ou separação em um gradiente para remover células totais, fragmentos de célula, impurezas, proteínas estranhas, ou enzimas indesejáveis na composição final. É adicionalmente possível adicionar então constituintes a composição contendo pululanase que proporciona benefícios adicionais, por exemplo, agentes de ativação, agentes anti-inibição, íons de- sejáveis, compostos para controlar pH ou outras enzimas. Preferivelmente, as proteínas de pululanase, de acordo com a presente invenção, são produ- zidas por métodos recombinantes.

Conforme aqui usado, "micro-organismo" se refere a uma bacté- ria, um fungo, um vírus, um protozoário e outros micróbios ou organismos microscópicos. Na presente invenção, micro-organismos são usados como organismos hospedeiros para a expressão de peptídeos exógenos.

Conforme aqui usado, "derivado", "variante" ou "peptídeo, poli- peptídeo ou proteína modificada" significa uma proteína que é derivada de uma proteína precursora (por exemplo, a proteína nativa) pela adição de um ou mais aminoácidos para qualquer ou ambas das extremidades terminais C e N, substituição de um ou mais aminoácidos em um ou um número de lo- cais diferentes na seqüência de aminoácido, retirada de um ou mais amino- ácidos em qualquer ou ambas as extremidades da proteína ou em um ou mais locais da seqüência de aminoácido, ou inserção de um ou mais amino- ácidos em um ou mais locais na seqüência de aminoácido. A preparação de um derivado de pululanase é preferivelmente efetuada pela modificação de uma seqüência de DNA que codifica a proteína nativa, transformação daque- la seqüência de DNA em um hospedeiro adequado, e expressão da seqüên- cia de DNA modificada para formar a pululanase derivada. Os "derivados" da invenção incluem peptídeos incluindo seqüências de aminoácido alteradas em comparação com a seqüência de aminoácido precursora (por exemplo, pululanase tipo selvagem ou em estado nativo), no qual os peptídeos retêm uma natureza característica de pululanase da pululanase precursora, mas tem propriedades alteradas em algum aspecto específico. Por exemplo, um derivado de pululanase pode ter um pH ótimo aumentado, resistência au- mentada a degradação enzimática ou outra degradação, eficiência enzimáti- ca, temperatura aumentada, ou estabilidade oxidativa, mas retém sua ativi- dade de modificação enzimática característica. Similarmente, derivados de acordo com a presente invenção incluem uma proteína, ou outro substrato, domínio de ligação, que foi adicionado ou modificado para alterar sua capa- cidade de ligação de substrato. É contemplado que os derivados de acordo com a presente invenção são derivados de um fragmento de DNA que codi- fica um derivado de pululanase no qual a atividade funcional do derivado de pululanase expresso é retida. Os derivados incluem adicionalmente modifi- cação química que mudam as características da pululanase.

Ordinariamente, um derivado de pululanase terá pelo menos 50%, 70% ou 85% de identidade de seqüências de aminoácido, preferivel- mente pelo menos 85% de identidade de seqüências de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos 90% de identidade de seqüências de aminoáci- do, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüências de aminoácido, e, ainda mais preferivelmente, 98% de identida- de de seqüências de aminoácido. Preferivelmente, quaisquer substituições de aminoácido são "substituições de aminoácido conservativas" usando-se L-aminoácidos, no qual um aminoácido é substituído por outro aminoácido similar biologicamente ativo. Substituições de aminoácido conservativas são aquelas que preservam a carga geral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, e/ou massa estérica do aminoácido sendo substituída. Exemplos de substituintes conservativos são aqueles entre os seguintes grupos: Gly/Ala, Val/lle/Leu, Lys/Arg, Asn/Gln, Glu/Asp, Ser/Cys/Thr, e Phe/Trp/Tyr. Um derivado pode, por exemplo, diferir por menos que 1 a 10 resíduos de aminoácido, tais co- mo 6-10, menos que 5, menos do que 4, 3, 2 ou ainda 1 resíduo de aminoá- cido. A Tabela 1 aqui ilustra substituições de aminoácido exemplares que são reconhecidas na técnica. 15

30

Conforme aqui usado, uma "seqüência nativa" de pululanase ou

uma seqüência "tipo selvagem" de pululanase inclui um polipeptídeo tendo a

mesma seqüência de aminoácido como um derivado de pululanase a partir

da cepa original de natureza, ou a mesma seqüência de aminoácido como a

pululanase da qual a pululanase modificada ou derivada foi produzida, por

exemplo, a pululanase expressa pela cepa original B. deramificans

(BMP139) da presente invenção. Tal pululanase de seqüência nativa pode

ser isolada da natureza, ou pode ser produzida por meios recombinantes ou

sintéticos. O termo pululanase "tipo selvagem" ou de "seqüência nativa", em

uma concretização, se refere ao peptídeo de pululanase do qual as variantes

da presente invenção foram derivadas, e é encontrado na figura 7b como SEQ ID NO:2.

Conforme aqui usado, "percentagem (%) de identidade de se- qüência" com relação ao aminoácido ou seqüências de nucleotídeos aqui identificada é definida como a percentagem de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em uma seqüência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em uma seqüência de pululanase, após ali- nhamento das seqüências e introdução de folgas, se necessário, para alcan- çar a identidade de seqüência de percentagem máxima, e não consideran- do-se quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de seqüência. Métodos para realizar alinhamento de seqüência e determinar identidade de seqüência são conhecidos aos versados na técnica, podendo ser realizados sem experimento indevido, e cálculos de identificar valores podem ser obtidos com limitação. Vide, por exemplo, Ausubel, et al„ eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publi- shing and Wiley-lnterscience, New York); e o programa ALIGN (Dayhoff (1978) em Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl. 3 (National Bi- omedical Research Foundation, Washington, D.C.). Um número de algorit- mos é disponível para alinhamento de seqüências e determinação de identi- dade de seqüência e incluem, por exemplo, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needlemann et al (1970) J. Mol. Biol. 48:443; o algoritmo de homologia local de Smith, et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; a pesquisa

20

25 para método de similaridade de Pearson et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444; o algoritmo de Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997); e algoritmos BLASTP, BLASTIN e BLASTX (vide, Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). Programas computadorizados usando es- tes algoritmos são também disponíveis, e incluem, mas não estão limitados a: software ALIGN ou Megalign (DNASTAR), ou WU-BLAST-2 (Altschul, et al., Math. Enzym., 266:460-480 (1986)); ou GAP, BESTFIT, BLAST (Altschul, et al), supra, FASTA, e TFASTA, disponíveis no pacote Genetics Computing Group (GCG), Versão 8, Madison, Wis., USA; e CLUSTAL no programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, Calif. Aqueles versados na téc- nica podem determinar parâmetros apropriados para medição do alinhamen- to, incluindo algoritmos necessários para alcançar alinhamento máximo so- bre o comprimento das seqüências sendo comparadas. Preferivelmente, a identidade de seqüência é determinada usando-se os parâmetros de falta determinados pelo programa. Especificamente, a identidade de seqüência pode ser determinada pelo algoritmo de pesquisa de homologia de Smith- Waterman (Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997)), conforme implementado no programa MSPRCH (Oxford Molecular) usando-se a pesquisa de folga não- parente com os seguintes parâmetros de pesquisa: penalidade de abertura de folga de 12, penalidade de extensão de folga de 1. Preferivelmente, com- parações de aminoácido emparelhados podem ser efetuadas usando-se o programa GAP do pacote de sofware de análise de seqüência de GCG de Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wis., empregando a matriz de substituição de blosum62 aminoácido, com um peso de folga de 12 e um peso de comprimento de 2. Com relação ao alinhamento ótimo de duas se- qüências de aminoácido, o segmento contíguo da seqüências de aminoácido variante pode ter resíduos de aminoácido adicionais ou resíduos de aminoá- cido retirados com relação a seqüências de aminoácido de referência. O segmento contíguo usado para comparação à seqüências de aminoácido de referência incluirá pelo menos 20 resíduos de aminoácido contíguos, e pode ser 30, 40, 50 ou mais resíduos de aminoácido. As correções para identida- de de seqüência aumentada associada com inclusão de folgas na sequên- cias de aminoácido de derivado podem ser produzidas por designação de penalidades de folga.

Conforme aqui usado, "construto de expressão" (ou "vetor de expressão") significa um construto de DNA incluindo uma seqüência de DNA que é operavelmente ligada a uma seqüência de controle adequada capaz de afetar a expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais seqüên- cias de controle podem incluir um promotor para afetar transcrição, uma se- qüência operadora ótima para controlar transcrição, uma seqüência que co- difica locais de ligação de ribossomo adequados no mRNA, e seqüências que controlam a terminação de transcrição e translação. A presente inven- ção não é limitada ao uso de qualquer construto de expressão particular. Tipos de células diferentes são preferivelmente usados com vetores de ex- pressão diferentes. Por exemplo, um promotor preferido para vetores usados em Bacillus subtilis é o promotor AprE1 um promotor preferido para vetores usados em Bacillus deramificans é o promotor AmyL; um promotor preferido usado em E. coli é o promotor Lac, um promotor preferido usado em Sac- charomyces cerevisiae é PGK1, um promotor preferido usado em Aspergillus niger é glaA, e um promotor preferido para Trichoderma reesei é cbhl. O ve- tor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago, ou simplesmente um in- serto genômico potencial.

Uma vez transformada (ou transfectada) em um hospedeiro a- dequado, a construto de expressão pode replicar e funcionar independente- mente do genoma hospedeiro, ou pode, sob condições adequadas, integrar- se no próprio genoma. No presente relatório descritivo, os termos "plasmí- deo", "vetor" e "construto (ões) de expressão" são, as vezes, usados permu- tavelmente. Contudo, a invenção é pretendida para incluir outras formas de vetores de expressão que servem funções equivalentes, e que são, ou tor- nam-se, conhecidos na técnica. Desse modo, uma ampla variedade de com- binações de hospedeiro/vetor de expressão pode ser empregada na expres- são de seqüências de DNA desta invenção. Vetores de expressão úteis para a presente invenção não citados em outra parte neste relatório descritivo, por exemplo, podem consistir em segmentos de seqüências cromossomais, não-cromossomais e de DNA sintético, tais como vários derivados conheci- dos de SV40 e plasmídeos bacteriais conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli incluindo col E1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC 19 e seus derivados, plasmídeos de faixa de hospedeiro mais ampla, por exemplo, RP4, DNAs de fago, por exemplo, os numerosos derivados de fago λ, por exemplo, NM989, outros fagos de DNA, por exemplo, M13 e fagos de DNA de trançado sim- ples filamentoso, plasmídeos de levedura, tais como o plasmídeo 2v, ou de- rivado do mesmo, vetores úteis em células eucarióticas, tais como vetores úteis em células de animal e vetores derivados de combinações de plasmí- deos, e DNAs de fago, tais como plasmídeos que foram modificados para empregar DNA de fago ou outras seqüências de controle de expressão.

Técnicas de expressão usando os vetores de expressão da pre- sente invenção são conhecidas na técnica, e são descritas geralmente em, por exemplo, Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION, Cold Spring Harbor Press (1989). Freqüen- temente, tais vetores de expressão, incluindo seqüências de DNA da inven- ção, são transformados em um hospedeiro unicelular por inserção direta no genoma de uma espécie particular através de um evento de integração (vi- de, por exemplo, Bennet & Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego, pp. 70-76 (1991), e artigos citados no mesmo descrevendo inserção genômica alvo em hospedeiros de fungo).

Os termos "operavelmente ligado", "em combinação operável", e "em ordem operável", conforme aqui usados, se referem a ligação de se- qüências de ácido nucléico tal que elas realizam sua função pretendida. Por exemplo, ligação operável de uma seqüência promotora a uma seqüência de nucleotídeo de interesse se refere a ligação da seqüência promotora e da seqüência de nucleotídeo de interesse em uma maneira tal que a seqüência promotora é capaz de direcionar a transcrição da seqüência de nucleotídeo de interesse e/ou a síntese de um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeo de interesse. Similarmente, operavelmente ligando uma seqüên- cia de ácido nucléico tendo atividade regulatória relacionada a idade a uma seqüência promotora e a uma seqüência de nucleotídeo de interesse signifi- ca ligação da seqüência de nucleotídeo tendo atividade regulatória relacio- nada a idade, a seqüência promotora e a seqüência de nucleotídeo de inte- resse em uma maneira tal que a seqüência de nucleotídeo tendo atividade regulatória relacionada a idade é capaz de alterar sobre um período de tem- po suficiente o nível de transcrição no mRNA da seqüência de nucleotídeo de interesse e/ou a síntese de um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeo de interesse.

Conforme aqui usado, "organismo hospedeiro", "cepa hospedei- ra", ou "célula hospedeira" significa um hospedeiro para um vetor de expres- são incluindo DNA de acordo com a presente invenção. Células hospedeiras úteis na presente invenção são geralmente hospedeiros procarióticos ou eu- carióticos, incluindo qualquer micro-organismo transformável em que ex- pressão pode ser efetuada. No contexto da presente invenção, por exemplo cepas de hospedeiro podem ser Bacillus subtilis, Bacillus deramificans (ou outro Bacillus sp.), Escherichia coli, Trichoderma reeesei, Saccharomyces cerevisiae ou Aspergillus niger. As células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com vetores construídos usando-se técnicas de DNA re- combinante. Tais células hospedeiras transformadas podem ser capaz de ambos replicar vetores que codificam pululanase e seus derivados ou varian- tes (mutantes), ou expressar o produto de peptídeo desejado, ou ambos.

O termo "cultura" ou "condição(ões) de cultura" quando usado no contexto de crescimento de uma população de organismos hospedeiros, se refere a um vaso de cultura, meio de cultura e condições de cultura que são adequados para o crescimento do organismo hospedeiro e, no caso de or- ganismos hospedeiros, transfectados com as seqüências de nucleotídeo da presente invenção e suas variantes, para a produção de pululanase da pre- sente invenção. A presente invenção não é limitada a qualquer cultura parti- cular ou condição de cultura considerando-se que a desistência é satisfeita.

Conforme aqui usado, "funcionalmente fixado" ou "operavelmen- te ligado" significa que uma região regulatória, tal como um promotor, termi- nador, sinal de secreção ou região intensificadora, é fixada a, ou ligada a um gene estrutural, e controla a expressão daquele gene. Conforme aqui usado, uma substância (por exemplo, um poli- peptídeo ou proteína derivada de" um micro-organismo significa que a subs- tância é nativa ao micro-organismo.

"Trichoderma" ou "Trichoderma sp" se refere a quaisquer cepas de fungo que foram anteriormente classificadas como Trichoderma, ou que são atualmente classificadas como Trichoderma. Preferivelmente as espé- cies são Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride. Na presente invenção, Trichoderma sp. May pode ser usada como um organismo hospedeiro na presente invenção.

Conforme aqui descrito, um aspecto da invenção caracteriza um ácido nucléico "substancialmente puro" (ou recombinante) que inclui uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de pululanase e/ou equivalentes de tais ácidos nucléicos. O termo ácido nucléico, conforme aqui usado, pode incluir fragmentos e equivalentes. O termo "equivalente" se re- fere a seqüências de nucleotídeo que codificam funcionalmente polipeptí- deos equivalentes, ou proteínas funcionalmente equivalentes. Seqüências de nucleotídeo equivalentes incluirão seqüências que diferem por uma ou mais substituições, adições ou retiradas de nucleotídeo, tais como variantes alélicas, e incluem seqüências que diferem da seqüência de nucleotídeo de pululanase mostrada em SEQ ID NO:1, devido a degeneração do código genético.

A prática da presente invenção empregará, a menos que de ou- tro modo indicado, técnicas convencionais de biologia de célula, cultura de célula, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombi- nante, e imunologia, que estão dentro da técnica do assunto. Tais técnicas são descritas na literatura. Todas as publicações, patentes e pedidos de pa- tente citados aqui são, desse modo, incorporados por referência em sua to- talidade para todas as propostas. Vide, por exemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2- edição, ed. por Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I e Il (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., Patente dos Estados Unidos Ns 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986);B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); o triatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H.Miller e Μ. P. Carlos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155 (Wu, et al., eds). Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer e Wal- ker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Im- munology, Volumes I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds., 1986); Manipula- ting the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986). Também, métodos relacionados a informação de pre- paração, expressão, isolamento e uso de proteases podem ser obtidos pela revisão da Patente dos Estados Unidos Ns 6.768.001, que é aqui incorpora- da em sua totalidade por referência.

Outras características e vantagens da invenção tornar-se-ão a- parentes a partir da seguinte descrição detalhada, e das reivindicações. Descrição Detalhada

A invenção será agora descrita em detalhe por meio de referên- cia somente usando-se as seguintes definições e exemplos. Todas as paten- tes e publicações, incluindo todas as seqüências descritas dentro de tais patentes e publicações referidas aqui são expressamente incorporadas por referência.

A menos que de outro modo definido aqui, todos os termos téc- nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comu- mente compreendido por um versado na técnica ao qual esta invenção per- tence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECU- LAR BIOLOGY, 2D ED, John Wiley and Sons, New York (1994), e Hale & Marhan, THE HARPER COLLINGS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporciona um versado na técnica com um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta invenção. Embora quaisquer mé- todos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos. Faixas numéricas são inclusive dos números que definem a faixa. A menos que de outro modo indicado, ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5' a 3'; seqüências de ami- noácido são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino para carbóxi, respectivamente. Os praticantes são particularmente dirigidos para Sambrook et al, 1989, e Ausubel FM et al, 1993, para definições e termos da técnica. É para ser compreendido que esta invenção não é limitada a meto- dologia, protocolos e reagentes particulares descritos, visto que estes podem variar.

Faixas numéricas são inclusive dos números que definem a faixa.

A menos que de outro modo indicado, ácidos nucléicos são es- critos da esquerda para a direita na orientação 5' a 3'; seqüências de amino- ácido são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino para carbóxi, respectivamente.

Os títulos aqui providos não são limitações dos vários aspectos ou concretizações da invenção que podem ser tidos por referência ao relató- rio descritivo como um todo. Consequentemente, os termos definidos ime- diatamente abaixo são totalmente definidos por referência ao relatório des- critivo como um todo. Biologia Molecular

Em uma concretização esta invenção proporciona a expressão de genes heterólogos sob controle do promotor amyL. Portanto, esta inven- ção ocorre em técnicas de rotina no campo de genéticas recombinantes. Textos básicos que descrevem os métodos gerais de uso nesta invenção incluem Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ã edi- ção, 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Ausubel, et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)).

Genes heterólogos compreendendo as seqüências promotoras de gene de celulase de fungos filamentosos são tipicamente clonados em vetores intermediários antes da transformação em células de Trichoderma reesei para replicação e/ou expressão. Estes vetores intermediários são tipi- camente vetores procarióticos, por exemplo, plasmídeos, ou vetores de trá- fego.

Para obter expressão de alto nível de um gene clonado, o gene heterólogo é preferivelmente posicionado sobre a mesma distância a partir do promotor como no gene de celulase que ocorre naturalmente. Conforme é conhecido na técnica, contudo, alguma variação nesta distância pode ser acomodada sem perda de função promotora.

Aqueles versados na técnica estão cientes que um promotor na- tural pode ser modificado por reposição, substituição, adição ou eliminação de um ou mais nucleotídeos sem mudança de sua função. A prática desta invenção envolve, e não é restrita a tais alterações no promotor.

O vetor de expressão/construto contém tipicamente uma unida- de de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adicionais requeridos para a expressão da seqüência heteróloga. Um casse- te de expressão típico desse modo contém um promotor operavelmente li- gado a seqüência de ácido nucléico heteróloga e sinais requeridos para poli- aldenilação eficiente do transcrito, locais de ligação de ribossomo, e termi- nação de translação. Elementos adicionais do cassete podem incluir intensi- ficadores e, se DNA genômico é usado como o gene estrutural, íntrons com doador de união funcional e locais aceitantes.

A prática da invenção não está restrita pela escolha de promotor na construto genética. Contudo, promotores exemplares são os promotores de Trichoderma reesei cbhl, cbh2, eg1, eg2, eg3, eg5, xln1 e xln2.

Em adição a uma seqüência promotora, o cassete de expressão deve conter uma região de terminação de transcrição a jusante do gene es- trutural para proporcionar terminação eficiente. A região de terminação pode ser obtida a partir do mesmo gene como a seqüência promotora, ou pode ser obtida de genes diferentes.

Embora qualquer terminador de fungo seja similarmente para ser funcional na presente invenção, terminadores preferidos incluem: o termina- dor de gene de Aspergillus nidulans trpC (Yelton, M. et al. (1984) PNAS USA 81: 1470-1474, Mullaney, E.J. et al (1985) MGG 199-37-45), os genes As- pergillus awamori ou Aspergillus niger glucoamilase (Nenberg, J. H. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 4:2306, Boel, E. et al (1984) EMBO J. 3:1581-1585) e o gene Mucor miehei carboxil protease (EPO Publicação Ns O 215 594).

O vetor de expressão particular usado para transportar a infor- mação genética na célula não é particularmente crítico. Qualquer dos veto- res convencionais para expressão em células eucarióticas ou procarióticas pode ser usado. Vetores de expressão bacterial padrão incluem bacteriófa- gos λ e M13, bem como plasmídeos, tais como plasmídeos baseados em pBR322, pSKF, pET23D, e sistemas de expressão de fusão, tais como MBP, GST e LacZ. Etiquetas de epítope podem também serem adicionadas às proteínas recombinantes para proporcionar métodos convenientes de isola- mento, por exemplo, c-myc.

Os elementos que são tipicamente incluídos nos vetores de ex- pressão também incluem um replicon, um gene que codifica resistência à antibiótico para permitir seleção de bactéria que abriga plasmídeos recombi- nantes, e locais de restrição únicos em regiões não-essenciais do plasmídeo para permitir inserção de seqüências heterólogas. O gene de resistência à antibiótico particular escolhido não é crítico, qualquer dos muitos de gene de resistência conhecido na técnica são adequados. As seqüências procarióti- cas são preferivelmente escolhidas tal que elas não interferem com a repli- cação ou integração do DNA em Trichoderma reesei.

Os métodos de transformação da presente invenção podem re- sultar na integração estável de toda ou parte do vetor de transformação no genoma do fungo filamentoso. Contudo, a transformação resultante na ma- nutenção de um vetor de transformação extracromossomal de autorreplica- ção é também contemplada.

Muitos métodos de transfecção padrão podem ser usados para produzir linhas de célula de Trichoderma reesei que expressam grandes quantidades da proteína heteróloga. Alguns dos métodos para a introdução de construtos de DNA em cepas de produção de celulase de Trichoderma incluem Lorito, Hayes, DiPietro and Harman, 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu and Herrera-Estrella, 1990, Curr. Genet. 17-169-174; Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen and Knowles, 1987, Gene 6: 155-164, para Aspergillus, Yelton, Hamer and Timberlake1 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1470-1474, para Fusarium Bajar, Podila and Kolottukudy, 1991, Proc. Natl. Sei. USA 88: 8202-8212, para Streptomyces Hopwood et al, 1985, The John Innes Foundation, Norwieh, UK, e para Baeillus Brigidi, De- Rossi1 Bertarini, Rieeardi and Matteuzzi, 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138).

Contudo, qualquer dos procedimentos bem conhecidos para in- trodução de seqüências de nucleotídeo estranhas em células hospedeiras pode ser usado. Estes incluem o uso de transfecção de fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, biolísticos, lipossomas, micro- injeção, vetores de plasma, vetores virais, e qualquer dos outros métodos conhecidos para introdução de DNA genômico clonado, cDNA, DNA sintéti- co, ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (vide, por exemplo, Sambrook et al, supra). Também de uso é o método de transfec- ção mediado por Agrobacterium descrito na Patente dos Estados Unidos Ns 6.255.115. É somente necessário que o procedimento de projeto genético particular usado seja capaz de introduzir com sucesso pelo menos um gene na célula hospedeira capaz de expressar o gene heterólogo. A invenção também refere-se a uma pululanase produzida hete-

rologamente por um micro-organismo. Exemplos de bactérias adequadas são bactérias gram-positivas, tais como Bacillus subtilis, Bacillus Iichenifor- mes, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothemophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circu- lans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, ou Strep- tomyces Iividans ou Streptomyces murinus, ou bactérias gram-negativas, tal como E. coli. A transformação da bactéria pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplasto, ou pelo uso de células competentes em uma maneira conhecida por si. Geralmente, a presente invenção inclui um método para produ-

ção de pululanase por expressão do DNA incorporado em um sistema de expressão que foi transformado em uma célula hospedeira. Uma ampla vari- edade de combinações de hospedeiro/vetor de expressão pode ser empre- gada na expressão de seqüência de DNA desta invenção. Muitos vetores de expressão eucarióticos e procarióticos são comercialmente disponíveis. A seleção de vetores de expressão apropriados está dentro do conhecimento daqueles versados na técnica. O vetor pode ser um plasmídeo, uma partícu- la de fago, ou simplesmente um inserto genômico potencial. Uma vez trans- formado em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar e funcionar in- dependentemente do genoma de hospedeiro, ou pode, em alguns exemplos, se integrar no próprio genoma. No presente relatório descritivo, o plasmídeo e vetor são, às vezes, usados permutavelmente como o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor no presente. Contudo, a invenção é pre- tendida para incluir tais outras formas de vetores de expressão que servem para funções equivalentes e que são, ou tornam-se, conhecidos na técnica. Vetores de expressão úteis, por exemplo, segmentos de seqüências de DNA cromossomal, não-cromossomal e sintético, tais como os vários plasmídeos e fagos conhecidos úteis para esta proposta. Em adição, qualquer de uma ampla variedade de seqüências de controle de expressão são geralmente usadas nestes vetores.

Células hospedeiras úteis na presente invenção são geralmente hospedeiros procarióticos ou eucarióticos, incluindo qualquer micro- organismo transformável em que a expressão de pululanase de acordo com a presente invenção pode ser alcançada. Células hospedeiras são transfor- madas ou transfectadas com vetores construídos usando-se técnicas de DNA recombinantes. Tais células hospedeiras transformadas são capazes de, ou replicarem vetores que codificam a pululanase e suas variantes (mu- tantes), ou expressão da pululanase desejada. Estes hospedeiros podem incluir hospedeiros eucarióticos e procarióticos bem conhecidos, tais como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, vários fungos, leve- dura e células de animal. Preferivelmente, o hospedeiro expressa a pulula- nase da presente invenção extracelularmente para facilitar purificação e pro- cessamento a jusante.

Em algumas concretizações, a célula hospedeira é um membro do gênero Bacillus, enquanto, em algumas concretizações, a cepa Bacillus de interesse em uma cepa de Bacillus industrial. Exemplos de cepas de Ba- cillus industrial incluem, mas não estão limitados a, B. licheniformis, B. subti- lis, B. lentus, B. amyloliquefaciens. Em concretizações adicionais, a cepa de hospedeiro de Bacillus é selecionada a partir do grupo consistindo em B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. coagulans, B. cirulans, B. pumilus, B. thuringiensis, B. clausii, B. megaterium, bem como outros organismos dentro do gênero Bacillus, conforme discutido acima. Em algumas concretizações, B. subtilis é usado. Em outras concretizações, B. licheniformis é usado. A Patente dos Estados Unidos N2 5.264.366 e 4.760.025 (RE34.606) e US2002/0182734 (Publicação Internacional N2 WO 02/14490) descreve várias cepas de hospedeiro de Bacillus que encontram uso na presente invenção, embora outras cepas adequadas sejam contem- pladas para uso na presente invenção. Preferível mente, uma cepa de Bacil- Ius negativa de protease (genes retirados, por exemplo, Aapr ou Anpr entre outros) é usada.

Vários métodos são conhecidos para a transformação de espé- cie de Bacillus. De fato, métodos para alterar o cromossomo de Bacillus en- volvendo construtos de plasmídeo e transformação do plasmídeo em E. coli são bem-conhecidos. Em muitos métodos, os plasmídeo são subseqüente- mente isolados de E. coli e transformados em Bacillus. Contudo, ele não é essencial usar tais micro-organismos de intervenção, tal como E. coli em algumas concretizações, a construto de DNA é diretamente transformada em um hospedeiro de Bacillus competente via protoplastos ou transformação de célula competente. A expressão e purificação da pululanase mutante da in- venção pode ser efetuada através de meios reconhecidos na técnica para efetuar tais processos.

Após o vetor de expressão ser introduzido nas células, as célu- las transfectadas são cultivadas sob condições que favorecem expressão de genes sob controle de seqüências promotoras de gene de protease. Gran- des bateladas de células transformadas podem ser cultivadas conforme des- crito nos exemplos, infra. Finalmente, o produto é recuperado a partir da cul- tura usando-se técnicas padrão.

Desse modo, a invenção aqui proporciona a expressão e secre- ção aumentada de polipeptídeos desejados cuja expressão está sob controle de seqüências promotoras de gene, incluindo genes de amilase que ocorrem naturalmente, seqüências de DNA de fusão, e várias construtos homólogas. A invenção também proporciona processos para expressão e secreção de altos níveis de tais polipeptídeos desejados. Expressão de Proteína

As proteínas da presente invenção são produzidas pelo cultivo de células transformadas com um vetor de expressão contendo genes cuja expressão está sobcontrole de seqüências promotoras de gene de amilase. A presente invenção é particularmente útil para aumentar a produção intra- celular e/ou extracelular de proteínas. A proteína pode ser homóloga ou he- teróloga. As proteínas que podem ser produzidas pela presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, hormônios, enzimas, fatores de cresci- mento, citoquinas, anticorpos, e similares.

Enzimas incluem, mas não estão limitadas à, hidrolases, tais como protease, esterase, libase, oxidase fenólica, permease, amilase, pulu- lanase, celulase, isomerase de glicose, Iacase e isomerase de dissulfeto da proteína.

Condições apropriadas para expressão de referidos genes com- preendem provisão à cultura de uma composição de alimentação de indu- ção, vide, por exemplo, US-2002-0121446. Condições opcionais para a pro- dução das proteínas variarão com a escolha da célula hospedeira, e com a escolha da proteína a ser expressa. Tais condições serão facilmente deter- minadas por um versado na técnica através de experimentação de rotina, ou otimização.

A proteína de interesse, por exemplo, uma pululanase conforme aqui descrito, é tipicamente purificada ou isolada após expressão. A proteína de interesse pode ser isolada ou purificada em uma variedade de modos conhecidos àquele versado na técnica, dependendo de quais outros compo- nentes estão presentes na amostra. Métodos de purificação padrão incluem técnicas eletroforéticas, moleculares, imunológicas e cromatográficas, inclu- indo cromatografia de troca de íon, hidrofóbica, de afinidade, e de HPLC de fase reversa. Por exemplo, a proteína de interesse pode ser purificada usan- do-se uma antiproteína padrão de coluna de anticorpo de interesse. Técni- cas de ultrafiltração e diafiltração, em conjunto com concentração de proteí- na, são também úteis. Para guia geral nas técnicas de purificação adequa- das, vide Scopes, Protein Purification (1982). O grau de purificação necessá- rio variará dependendo do uso da proteína de interesse. Em alguns exem- plos, nenhuma purificação será necessária. Análogos das Pullulanases da Presente Invenção

Os análogos podem diferir da pululanase de origem "tipo selva- gem", ou de uma pululanase que ocorre naturalmente em seqüências de aminoácido, ou em modos que não envolvem seqüência, ou ambos. Modifi- cações de não-sequência incluem derivação química in vivo ou in vitro de pululanase. Modificações de não-sequência incluem mudanças na acetila- ção, metilação, fosforilação, carboxilação, ou glicosilação.

Análogos preferidos incluem pululanase (ou fragmentos biologi- camente ativos das mesmas) cujas seqüências diferem da seqüência "tipo selvagem", ou a partir da seqüência natural por uma ou mais substituições de aminoácido conservativas, ou por uma ou mais substituições, retiradas ou inserções de aminoácido conservativas que não abolem a atividade biológica da pululanase. Substituições tipicamente conservativas incluem a substitui- ção de um aminoácido por outro com características similares, por exemplo, substituições dentro dos seguintes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina, ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glu- tamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina.

Substituições conservativas podem ser produzidas, por exemplo, de acordo com a tabela abaixo que descreve um agrupamento de diagrama de Venn geralmente aceito de aminoácidos. Tabela 1

Conjunto Subconjunto Hidrofóbico FW YHKMIL VAGC Aromático FWYH Alifático I LV Polar WYHKREDCSTNQ Carregado HKRED Positivamente carregado HKR Negativamente carregado E D Pequeno VCAGSPTND Muito pequeno AGS

Outras substituições conservativas podem ser tomadas a partir

da tabela abaixo. Tabela 2

SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDO CONSERVATIVAS

Para Aminoácido Código Substituir com qualquer de Alanina A D-Ala1 Gly1 beta-Ala, L-Cys1 D-Cys Arginina R D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, lie, D-Met, D-lle, Orn, D-Orn Asparagina N D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln Ácido Aspártico D D-Asp1 D-Asn, Asn, Glu, D-Glu1 Gln, D-Gln Ciste ína C D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr Glutamina Q D-Gln1 Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp Ácido Glutâmico E D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln Glicina G Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, b-Ala Acp Isoleucina I D-lle, Vai, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met Leucina L D-Leu, Vai, D-Val, lie, D-lle, Met, D-Met Lisina K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, lie, D-lle, Orn, D-Orn Metionina M D-Met, S-Me-Cys, lie, D-lle, Leu, D-Leu, Vai, D-Val Fenilalanina F D-Phe, Tyr, D-Tyr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans-3,4, ou 5-fenilprolina, cis-3,4, ou 5-fenilprolina Prolina P D-Prol, ácido L-l-tioazolidina-4-carboxílico, ácido D-ou L-1-oxazolidina-4-carboxílico | Tabela 2 -continuação-

Para Aminoácido Código Substituir com qualquer de Serina S D-Ser, Thr, D-Thr, alIo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys Treonina T D-Thr, Ser, D-Ser, alIo-Thr, MetjD-Met, Met(O), D-Met(O), Vai, D-Val Tirosina Y D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa1His, D-His Valina V D-Val, Leu, D-Leu, lie, D-IIe1Met1 D-Met

Outros análogos dentro da invenção são aqueles com modifica-

ções que aumentam a estabilidade do peptídeo; tais análogos podem conter, por exemplo, uma ou mais ligações de não-peptídeo (que substituem as Ii- gações de peptídeo) na seqüência de peptídeo. Também incluídos estão: análogos que incluem resíduos outros do que L-aminoácidos que ocorrem naturalmente, por exemplo, D-aminoácidos ou aminoácidos que ocorrem naturalmente, ou sintéticos, por exemplo, análogos de α ou β aminoácidos, e análogos cíclicos. Outras Concretizações

Incluídos na invenção estão: variações alélicas; mutantes natu- rais; mutantes induzidos; proteínas codificadas por DNA que hibridizam sob altas ou baixas condições de estringência para uma ácido nucléico que codi- fica um polipeptídeo de SEQ ID N0:1 (para definições de alta e baixa estrin- gência vide Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989, 6.3.1-6.3.6, desse modo incorporado por referência); e polipeptí- deos especificamente ligados por antissoro a pululanase, especialmente por antisoro para um local ativo ou domínio de ligação de pululanase.

Os ácidos nucléicos e polipeptídeos da invenção incluem aque- Ies que diferem das seqüências aqui descritas em virtude de erros de se- quenciamento nas seqüências descritas.

A invenção também inclui fragmentos, preferivelmente fragmen- tos biologicamente ativos, ou análogos de pululanase. Um fragmento biolo- gicamente ativo ou análogo é um tendo atividade in vivo ou in vitro que é característico da pululanase mostrada em SEQ ID NOS: 2, 4 e 6, ou de ou- tras pullulanases que ocorrem naturalmente, por exemplo, uma ou mais das atividades biológicas aqui descritas. Especialmente preferidos são fragmen- tos que existem in vivo, por exemplo, fragmentos que ocorrem de processa- mento pós-transcricional, ou que ocorrem de translação de RNA's alternati- vãmente unidos. Os fragmentos incluem aqueles expressos em células nati- vas ou endógenas, por exemplo, como um resultado de processamento pós- translacional, por exemplo, como o resultado da remoção de uma seqüência de sinal amino-terminal, bem como aquela produzida em sistemas de ex- pressão, por exemplo, em células CHO. Fragmentos particularmente preferi- dos são fragmentos, por exemplo, fragmentos ativos, que são gerados por clivagem proteolítica ou eventos de união alternativos. Devido a peptídeos tal como pululanase freqüentemente exibirem uma faixa de propriedades fisiológicas, e devido a tais propriedades poderem ser atribuíveis a porções diferentes da molécula, um fragmento de pululanase útil ou análogo de pulu- Ianase é um que exibe uma atividade biológica em qualquer ensaio biológico para atividade de pululanase. Mais preferivelmente o fragmento ou análogo possui 10%, 40%, 60%, 70%, 80%, ou pelo menos 90% da atividade de pu- lulanase (SEQ ID NOS: 2, 4, E 6), em qualquer ensaio de pululanase in vivo ou in vitro. Um método de produção de tais análogos de pululanase inclui a síntese de análogos de pululanase via evolução molecular direta, conforme discutido infra.

Fragmentos de pululanase podem ser gerados por métodos co- nhecidos àqueles versados na técnica. A capacidade de um fragmento can- didato exibir uma atividade biológica de pululanase pode ser avaliada por métodos conhecidos àqueles versados na técnica conforme aqui descrito. Também incluem resíduos contendo peptídeos de pululanase que não são requeridos para atividade biológica do peptídeo, ou que resultam de união de mRNA alternativa ou eventos de processamento de proteína alternativos.

De modo a obter um peptídeo de pululanase, DNA de codifica- ção de pululanase pode ser introduzido em um vetor de expressão, o vetor introduzido em uma célula adequada para expressão da proteína desejada, e o peptídeo recuperado e purificado, por métodos da técnica anterior. Anti- corpos para os peptídeos e proteínas podem ser produzidos por imunização de um animal, por exemplo, um coelho ou camundongo, e recuperação de anticorpos de anti-pululanase por métodos da técnica anterior. Aplicação Industrial da Invenção A presente invenção tem muitas aplicações práticas na indústria;

conforme é contemplado aqui, esta descrição é pretendida para ser exem- plar, e não inclusiva.

Em várias concretizações, a presente invenção contempla uso na produção de etanol, cozedura, produção de suco de fruta, preparação de bebida fermentada, destilação, produção de vinho, couro, óleos e gorduras, papel e polpa, e a produção de alimento.

Em outras concretizações, a presente invenção contempla uso como o componente "biológico" ativo de detergentes e produtos de limpeza. Aqui, proteases, amilases e lípases são usadas para quebrar proteína, ami- do e manchas de gordura. Concretizações da invenção incluem teste da compatibilidade de enzimas com ingredientes detergentes por se efetuar estudos de estabilidade e testá-los em uma variedade de formulações.

Em outra concretização, a presente invenção contempla uso na indústria têxtil, principalmente no acabamento de tecidos e artigos de vestuá- rio. Aplicações maiores incluem: Classificação de tamanho, remoção de ta- manho (isto é, remoção de elementos rijos de fibra), de fios em tecido após tecedura. Processo de biopolimento para reduzir tendência de empilhamen- to, e dar aos tecidos uma aparência mais lisa e mais brilhante. Processo de Biolapidação, onde uma pequena dose de enzima pode substituir pedras- pomes tradicionais usadas em lavagem por pedra de tecido forte de algodão para alcançar aparência de desgaste.

Em ainda outra concretização, a presente invenção contempla uso enzimáticos para a liquefação e sacarificação de amido em glicose e isomerização em frutose. A presente invenção pode ser usada para conver- ter grandes volumes de milho e outros grãos em adoçantes, similares a xa- rope de milho de frutose e xarope de maltose. Exemplos

Na descrição experimental que se segue, as seguintes abrevia- ções se aplicam: eq (equivalentes); M (Molar); μΜ (micromolar); N (normal); mol (mois); mmol (milimols); μιτιοΙ (micromols); nmol (nanomols); g (gramas);

mg (miligramas); kg (kilogramas); pg (microgramas); L (litros); ml (mililitros); μΙ (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); μιη (micrômetros); nm (nanômetros); 0C (grau Centígrado); h (horas); min (minutos); seg (segun- dos); mseg (milissegundos); TLC (cromatografia de camada delgada); nt (nucleotídeos); Q (glutamina); E (ácido glutâmico); CAP (cloroanfenicol). A presente invenção é descrita em detalhes adicionais nos e-

xemplo seguintes que não são, de qualquer modo, pretendidos para limitar o escopo da invenção conforme reivindicada. As figuras em anexo são signifi- cativas para serem consideradas como partes integrais do relatório descriti- vo e descrição da invenção. Todas as referências aqui citadas são incorpo- radas especificamente por referência a tudo que é descrito na mesma. Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não limitar a invenção reivindicada. Exemplo 1

Delineacão de variantes de pululanase As seguintes variantes de pululanase foram designadas (vide

figura 1).

"PUL" Esta é a pululanase de B. deramificans "tipo selvagem", idêntica a molécula expressa por BMP139. O gene foi codificado por códon, é acionado pelo promotor amyL (LAT), e tem uma seqüência de sinal de am- yL. As diferenças entre esta construto e a construto presente em BMP139 são conforme segue (vide, figura 2). Primeiro, a nova construto tem uma re- gião de codificação otimizada por códon, conforme comparada a seqüência de codificação nativa em BMP139. Segundo, a nova construto tem uma re- gião promotora de amyL mais curta de 100 nts, versus aproximadamente 800 nts em BMP139. Terceiro, a nova construto tem o terminador amyL, en- quanto BMP139 tem o terminador de pululanase B. deramificans. Ambas a nova e a antiga construto têm a seqüência de sinal de amyL, e expressam moléculas de pululanase idênticas. Enquanto a molécula expressa por esta nova construto é idêntica ao produto atual, ela pode ser um benefício com relação as titulações de produção como um resultado da otimização de có- don.

"PULm104" Esta é a pululanase de B. deramificans da qual os

aminoácidos N-terminal 104 foram retirados. A construto envolve o promotor amyL, seqüência de sinal de amyL, região de codificação de pululanase oti- mizada por códon carecendo da seqüência que codifica os aminoácido N- terminal 104 da pululanase matura, e o terminador amyL. A pululanase trun- cada PULmI04 se assemelha às moléculas de PULm98 e PULmI02 produ- zidas após pinçamento da pululanase de comprimento total N-terminalmente em E99 e E103. A pululanase foi retirada até aminoácido 104 de modo a obter uma seqüência de consenso alvo de peptidase de sinal ideal entre a seqüência de sinal de amyL e a seqüência de pululanase: ASA-A. A análise racional atrás desta variante de pululanase truncada segue observações surpreendentes prévias na qual uma atividade específica mais alta foi vista para as variantes de pululanase pinçadas comparadas à molécula de com- primento total.

"PUL_E99Q_E103Q" Esta é a pululanase de B. deramificans em que os motivos alvos de protease em E99 e E103 foram modificados em Q99 e Q103, com o objetivo de produzir a molécula de pululanase resistente a pinçamento em E99 e E103. Além disso, no caso de degradação pós- 51 horas de pululanase seria dependente do pinçamento inicial em E99 e E103, esta modificação seria esperada para impedir a degradação e queda de ati- vidade após 51 horas. Exemplo 2

Construto e transformação de plasmídeo

Duas construtos de pululanase otimizadas por códon foram sin- tetizadas, uma codificando a proteína de pululanase "tipo selvagem", a outra codificando a variante E99Q_E103Q.

Ambas envolvendo 57 nucleotídeos de promotor amyL (anteri- ormente demonstrado para mostrar clonagem em E. coli; esticamentos de promotor mais longos são letais), a seqüência de sinal de amyL, a seqüência (variante) de pululanase otimizada por códon, e o terminador de amyL. Estas construtos serviram como gabarito para construto de PCR das três constru- tos de pululanase descritas acima: "PUL" Os seguintes prímeres foram usados para amplificar a

construto de pululanase "tipo selvagem" a partir da pululanase "tipo selva- gem" sintética (local Xhol em negrito): Plat5-Xhol_FW:

Cccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaatggtacttgttaaaaattcggaatatttatac aatacatatgtttacattgaaagggg [SEQ ID NO: 7],

TIat-XhoLRV: tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc [SEQ ID NO: 8]

"PULm104" O cassete de expressão para a pululanase truncada foi gerado por PCR de fusão. Os seguintes dois fragmentos foram amplifica- dos a partir da construto de pululanase "tipo selvagem", e subsequentemen- te fundidos:

um fragmento cobrindo o promotor amyL e seqüência de sinal de

amyL.

Um fragmento cobrindo a seqüência de codificação de pululana- se truncada e o terminador de amyL. Ad A)

Os seguintes iniciadores foram usados para amplificação do promotor amyL e seqüência de sinal: Plat5-Xhol_FW: [SEQ ID NO: 7] (vide acima). ssLAT-PULm104_RV: gcgttgctgactgccggtttagcagctgctgaagctgcagaatgaggcagc [SEQ ID NO: 9] (ini- ciador de fusão; seqüência de pululanase reversa começando no códon 105 em negrito).

Ad B)

Os seguintes prímeres foram usados para amplificação da se- quência de codificação de pululanase e o terminador de amyL: ssLAT-PULm 104_FW: gcgtcctcattctgcagcttcagcagctgctaaaccggcagtcagcaacgc [SEQ ID NO: 10] (iniciador de fusão; seqüência de pululanase começando no códon 105 em negrito).

TIat-XhoLRV: [SEQ ID NO: 8] (vide acima).

Os prímeres de fusão cada um envolve dois esticamentos de seqüência que são 312 nts afastadas na seqüência de gabarito (represen- tando os aminoácidos N-terminais 104). Os dois fragmentos de PCR descri- tos sob A) e B) foram fundidos em uma reação de PCR usando prímeres Plat5-Xhol_FW e Tlat-Xhol_RV.

"PUL_E99Q_E103Q" A construto da variante de pululanase E99Q_E103Q foi idêntica àquela da construto de pululanase "tipo selvagem" (vide 1 acima), com a construto sintética de E99Q_E103Q como gabarito.

Os fragmentos gerados foram clonados em duas orientações no local Xhol do vetor de integração de B. Iicheniformis pICatH (figura 3). Isto resultou em duas construtos, pICatH-PUL-Ori (figura 4), plCatH-PUL-Ori2, plCatH-PULm104-Ori (figura 5), plCatH-PULm104-Ori2, plCatH-PUL_E99Q_ E1030-0ri (figura 6), e plCatH-PUL_E99Q_E103Q-Ori2.

Os construtos Oril e Ori2 têm orientações opostas do gene de pululanase relativas ao gene de resistência a cloroanfenicol (CatH). As figu- ras 4(a), 5(a) e 6(a) mostram mapas de plasmídeo das três construtos de Ori 1.

Todos os seis construtos foram transformados em B. subtilis, e classificados para halo formação em sobreposições AZCL-puIlulan (Me- gazyme) (0,1% de NaAc a 100 mM pH 5,1% ágar). Transformantes de plCa- tH-PULm104 produzem halos maiores do que transformantes de qualquer pululanase de comprimento total. As construtos eram seqüências verificadas e transformados em cepas de hospedeiro de B. Iicheniformis BML612 e B- ML780 usando-se transformação de protoplasto. Exemplo 3

Integração no genoma de B. Iicheniformis Após transformação, os transformantes foram selecionados em

placas de regeneração mínimas contendo 5 pg/ml de cloroanfenicol e 10 pg/ml de neomicina. Os transformantes foram colocados em réplica para duas placas Heart-lnfusão-ágar (conhecidas daqueles versados na técnica) contendo os mesmos antibióticos, um dos quais sendo sobrepostos com AZCL-puIlulan para selecionar transformantes positivos de pululanase. Aná- logos a situação no B. subtilis, os transformantes de PULmI 04 mostraram os halos maiores. Os plasmídeos foram integrados no local CatH no cromos- somo de B. licheniformis. Desse modo, o seguinte conjunto de integrantes, conforme mostrado na Tabela 2, foi comprado adicionalmente para exci- são/amplificação.

Tabela 2

BML612 PULOriI BML612 PUL Ori2 BML612 PULmI04 Ori 1 BML612 PULmI 04 Ori2 BML612 PUL_E99Q_E103Q Oril BML612 PUL_E99Q_E103Q Ori2 BML780 PULOriI BML780 PUL Ori2 BML780 PULmI04 Oril BML780 PULm 104 Ori2 BML780 PUL_E99Q_E103Q Oril BML780 PUL_E99Q_E103Q Ori2

Excisão de plasmídeo e amplificação de cassete foi realizada

conforme se segue. Cepas sem DNA estranho ("cepas isentas") foram obti- das através de excisão de seqüências de vetor ('loop-outs'), deixando so- mente o catH - cassete de expressão de pululanase integrado no cromos- somo. O cassete de expressão foi então amplificado por sujeição das cepas a um aumento escalonado em concentração de cloroanfenicol (5, 25, 50, 75 pg/ml). A produção de pululanase foi monitorada por sobreposição de placas de réplica com AZCL-puIlulan após cada etapa de amplificação. De cada cepa, quatro níveis de amplificação foram obtidos: CAP5, CAP25, CAP50 e CAP75. Exemplo 4

Avaliação de cepas de pululanase B. Iicheniformis

Cepas foram escolhidas em duplicata em todos os níveis de am- plificação em uma placa Heart Infusão-ágar contendo 5 pg/ml de cloroanfe- nicol, e crescidas durante toda a noite a 37°C. A cepa de produção de pulu- lanase BMP139 foi incluída como marca de referência. A atividade de pulu- lanase foi visualizada pela sobreposição da placa com AZCL-puIlulan ágar. A sobreposição foi incubada 8 horas a 37°C, seguido por 16 horas de incuba- ção à temperatura ambiente. O resultado é resumido na Tabela 3 abaixo. TABELA 3

Cepa CAP5 CAP25 CAP50 CAP75 BML612 PULOriI + + + ++ BML612 PUL Ori2 + + + ++ BML612 PULmI04 Oril + ++ ++ +++ BML612 PULmI 04 Ori2 + + +++ +++ BML612 PUL_E99Q_E103Q Oril + + ++ ++ BML612 PUL_E99Q_E103Q Ori2 + + ++ ++ BML780 PUL OriM + + + ++ BML780 PUL Oril2 + + ++ ++ BML780 PULmI04 OriM ++ ++ +++ +++++ BML780 PULmI04 Oril2 ++ ++ +++ +++++ BML780 PUL_E99Q_E103Q OriH ++ ++ ++ ++ BML780 PUL_E99Q_E103Q Oril2 + ++ ++ +++ BMP 139 +

Legenda:

+ = diâmetro de halo 7-9 mm ++ = diâmetro de halo 10-12 mm +++ = diâmetro de halo 13-15 mm ++++ = diâmetro de halo 16-18 mm +++++ = diâmetro de halo 19-21 mm A partir da avaliação, é claro que a amplificação resulta no au- mento nas titulações e/ou desempenho. Conclusões mais específicas:

As cepas PUL truncadas N-terminalmente (PULm104) têm um benefício de desempenho muito pronunciado sobre as cepas de pululanase de comprimento total. Cepas de BML780 PULm 104 CAP75 produzem halos com superfície 2,5 vezes aumentada (acima de 1,5 vez o diâmetro aumenta- do) sobre aquelas da cepa BMP 139 e as cepas BML780 PUL CAP75. Isto sugere que a molécula mais curta seja produzida em titulações mais altas, ou sua atividade é aumentada comparada às moléculas de pululanase de comprimento total.

A variante PUL_E99Q_E103Q pode ter um leve benefício sobre a PUL 'tipo selvagem'. Os halos produzidos por cepas de B- ML780PUL_E99Q_E103Q são um tanto maiores do que aqueles de cepas de BML780 PUL.

A cepa de produção de BMP139 parece ser igual em desempe-

nho às cepas PUL "tipo selvagem" amplificadas CAP75. Desse modo, base- ado na avaliação de placa, otimização de códon não resulta no desempenho aumentado.

As cepas de BML780 têm geralmente melhor desempenho do que as cepas BML612. Esta observação está em linha com dados anteriores na degradação de pululanase no antecedente de BML612. O fato que as cepas de pululanase de BML612 construídas aqui ainda mostram justifica- ção de AZCL razoável, sugere que nas placas, a pululanase é relativamente estável mesmo no antecedente de BML612. Nenhuma diferença de desempenho clara é observada entre as

cepas de pululanase OriH e Oril2.

Todas as publicações e patentes mencionadas no relatório des- critivo acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações dos métodos descritos e sistemas da invenção serão aparentes àquele versado na técnica, sem fugir do escopo e espírito da invenção. Em- bora a invenção tenha sido descrita em conjunto com concretizações prefe- ridas específicas, deve ser compreendido que a invenção conforme reivindi- cada não deve ser indevidamente limitada a tais concretizações específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para efetuar a invenção que são óbvios àqueles versados na técnica são pretendidas para estarem dentro do escopo das reivindicações que se seguem.

Claims (20)

1. Composição compreendendo uma molécula de peptídeo iso- lada tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácido selecionada de um grupo consistindo em SEQ ID NOS: 2,4 e 6, na qual a referida molécula de polipeptídeo isolada tem atividade de pulu- lanase.

2. Composição compreendendo uma molécula de ácido nucléico isolada de uma seqüência de nucleotídeo selecionada de um grupo consis- tindo em SEQ ID NOS: 1, 3 e 5, na qual a referida seqüência de nucleotídeo codifica uma pululanase.

3. Composição compreendendo um DNA isolado que codifica uma proteína tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NOS: 2, 4 ou 6.

4. Composição compreendendo um construto de expressão con- sistindo em um DNA isolado consistindo em uma seqüência de nucleotídeo selecionada de um grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1, 3 e 5.

5. Construto de expressão, como definido na reivindicação 4, operavelmente ligado às seqüências de controle reconhecidas por uma célu- la hospedeira transformada como referido construto de expressão.

6. Construto de expressão, de acordo com a reivindicação 5, no qual o referido construto de expressão é transfectado em um organismo hospedeiro.

7. Organismo hospedeiro, como definido na reivindicação 6, no qual o referido organismo hospedeiro é selecionado de um grupo consistindo em fungos, bactérias e células eucarióticas.

8. Organismo hospedeiro, de acordo com a reivindicação 7, no qual o referido organismo hospedeiro é selecionado de um grupo consistindo em Bacillus sp., Bacillus subtilis, Escherichia coli, Trichoderma reesei, Sac- charomyces cerevisiae, Aspergillus niger e B. licheniformis.

9. Composição compreendendo um construto de expressão que codifica uma pululanase, o referido construto de expressão compreendendo uma seqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, 3 e 5.

10. Composição compreendendo um construto de expressão que codifica um peptídeo selecionado de um grupo consistindo em SEQ ID NOS: 2, 4 e 6.

11. Método para produção de uma pululanase, compreendendo: a. provisão de: i) um construto de expressão em uma condição operável compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma pululanase, a referida seqüência de nucleotídeo selecionada a partir de um grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1, 3 e 5; ii) um organismo hospedeiro, e; iii) um meio de cultura; b. transfecção do referido construto de expressão no referido organismo hospedeiro para criar um organismo hospedeiro transfectado; c. cultura do referido organismo hospedeiro transfectado no refe- rido meio de cultura por um espaço de tempo e sob condições suficientes para a produção de pululanase.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, no qual a referida pululanase é isolada de referido meio de cultura.

13. Organismo hospedeiro, como definido naql reivindicação 11, no qual referido organismo hospedeiro é selecionado de um grupo consistin- do em fungos, bactérias e células eucarióticas.

14. Organismo hospedeiro, de acordo com a reivindicação 13, no qual o referido organismo hospedeiro é selecionado de um grupo consis- tindo em Bacillus sp„ Bacillus subtilis, Escherichia coli, Trichoderma reesei, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger e B. licheniformis.

15. Método para produção de uma pululanase, compreendendo: a. provisão de: i) um organismo hospedeiro transfectado com um construto de expressão; o referido construto de expressão se codificando em condição operável uma seqüência de nucleotídeo que codifica um peptídeo selecionado de um grupo consistindo em SEQ ID NOS: 2, 4 e 6, e ii) um meio de cultura; b· cultura do referido organismo hospedeiro transfectado no refe- rido meio de cultura por um espaço de tempo e sob condições suficientes para a produção de pululanase.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, no qual a referida pululanase é isolada do referido meio de cultura.

17. Organismo hospedeiro, de acordo com a reivindicação 15, no qual o referido organismo hospedeiro é selecionado de um grupo consis- tindo em fungos, bactérias e células eucarióticas.

18. Organismo hospedeiro, de acordo com a reivindicação 17, no qual o referido organismo hospedeiro é selecionado de um grupo consis- tindo em Bacillus sp., Bacillus subtilis, Escherichia coli, Trichoderma reesei, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger e B. licheniformis.

19. Seqüência de nucleotídeo que codifica uma pululanase, na qual a referida seqüência é derivada de qualquer de SEQ ID NOS: 1, 3 e 5 por evolução molecular direcionada.

20. Composição compreendendo uma ou mais cepas de B. li- cheniformis conforme dadas na Tabela 3.