CN102858969A - 新颖的β-葡萄糖苷酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明揭示一种新颖的β-葡萄糖苷酶以及编码该β-葡萄糖苷酶的核酸。本发明亦揭示关于使用该β-葡萄糖苷酶以将木质纤维素物质转化成为可发酵糖的细胞、组合物及方法。

Description

新颖的β-葡萄糖苷酶及其用途

相关申请的交叉引用

本申请主张享有2010年1月28日递交的美国临时申请No.61/299,007的优先权。在此通过引用该申请的全部内容将其引入本文。

背景技术

替代性能源的发展（如，太阳能、生物燃料、水力、风力等），多年来一直受到大力提倡，以解决因大量消耗化石燃料而产生的日渐严重的能源问题。在诸多可能的能源中，植物生质是特别受到关注的，因其为可再生性。植物体含有高量的纤维素，其为制造生物燃料的一种起始材料。为了将纤维素转化为生物燃料，其首先需由微生物的纤维素水解系统降解为可发酵糖，诸如纤维二糖及葡萄糖。此种系统包括三种主要类型的水解酶，亦即，内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)及β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。尽管已由各种微生物中分离出诸多葡萄糖苷酶，其效能皆不令人满意。因此，仍需要具有高效能的葡萄糖苷酶。

发明内容

本发明涉及一种新颖的葡萄糖苷酶，BGL-Cr-D2，其分离自台湾原生种的真菌刺孢壳叶斑菌(Chaetomella raphigera)。图2所示为该成熟BGL-Cr-D2蛋白的序列(722个氨基酸残基/SEQ ID NO:1)、对应的bgl-Cr-D2cDNA(2166bps/SEQ ID NO:2)、其信号肽序列(SEQ ID NO:7)、对应的cDNA(SEQ ID NO:8)、BGL-Cr-D2蛋白与其信号肽(SEQ ID NO:4)、以及对应的cDNA(SEQ IDNO:5)。图1所示为刺孢壳叶斑菌中编码该BGL-Cr-D2酶的基因组DNA区域(2851bps,SEQ ID NO:3)，其含有12个内含子节段，而该基因组DNA区域对应SEQ ID NO:4(SEQ ID NO:6)。

因此，本发明的一个方面表征为一种分离的多肽，其含有与SEQ ID NO:1具有由BLAST算法所测定的至少70%(如，80%、90%、95%、或99%)氨基酸同一性的序列。在一实例中，该多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。

本发明亦涵括(i)一种分离的核酸，其包括编码上述多肽的核苷酸序列，以及(ii)一种宿主细胞，其含有该种分离的核酸。在一实例中，该核苷酸序列含有SEQ ID NO:2、3、5或6的序列。本发明的分离核酸可为表达载体，其中该核苷酸序列以可操作的方式连接适当的启动子序列（亦即，可在宿主细胞中起始转录的序列）。

术语「分离的多肽」或「分离的核酸」在本文中指一多肽或核酸，其实质上不含天然相关的分子，亦即，该些天然相关的分子构成含有该多肽或核酸的制备物的最多20%干重。纯度可以任何适当的方法测量，如，柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳及HPLC。

本发明的范围中也包括(A)一种组合物，其含有上述的多肽、外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、及β-葡萄糖苷酶，以及(B)一种由木质纤维素物质制备可发酵糖的方法。该方法包括(i)提供上述的组合物，以及(ii)使此组合物与木质纤维素物质接触以制备可发酵糖，如，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、或纤维二糖。该可发酵糖可通过微生物发酵或酶的处理而转化成为发酵产物，诸如醇。用于此方法中的木质纤维素物质的实例包括，但不限于，果园剪枝、树丛、工厂废材、城市废木料、城市废弃物、伐木废弃物、森林疏伐、短轮伐期木质作物、工业废弃物、小麦、麦杆、燕麦杆、稻草、大麦杆、裸麦杆、亚麻茎、黄豆壳、稻壳、燕麦壳、甘蔗、玉米、玉米穗轴、玉米杆、玉米麸饲料、玉米芯、玉米皮、玉米粒、取自核仁的纤维、草原的草、鸭茅状磨擦禾、狐尾草、甜菜渣、柑橘类水果渣、种壳、纤维素质动物粪便、草坪修剪物、棉花、海草、树木、灌木、草、甘蔗渣、谷物的湿或干磨的产物及副产物、城市固体废弃物、废纸、庭院废弃物、草本材料、农业废弃物、林业废弃物、城市固体废弃物、废纸、纸浆、造纸厂废材、枝条、灌木、甘蔗、玉米、玉米皮、能源作物、森林、水果、花、谷粒、草、草本作物、叶、树皮、针状叶、圆木材、根、树苗、灌木、柳枝稷、树木、蔬菜、果皮、藤蔓、甜菜渣、小麦粉头、燕麦壳、硬及软木、由农业流程产生的有机废弃物质、林业废木，或其组合。如该发酵产物是可燃性的，该方法进一步包含燃烧该可燃性发酵产物以产生能量的步骤。

本发明亦提供一种生物反应器，其含有木质纤维素物质以及一种组合物，该组合物含有上述的多肽、外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和/或β-葡萄糖苷酶。

本发明的一或多个具体实例的细节述于附图及下文的叙述。本发明的其它特征、目的及优点将可由该叙述及附图以及权利要求书明示。

附图说明

图1是示出刺孢壳叶斑菌(Chaetomella raphigera)中编码BGL-Cr-D2酶的基因组DNA区域（2851bps，SEQ ID NO:3）的图表，该区域含有12个内含子节段（在图中以「白色」节段指明，并在序列中以「小写/灰色/删除线」节段指明）。编码信号肽的区域在图中以「黑色」指明，并在序列中以「底线」指明。

图2是显示bgl-Cr-D2cDNA（2166bps/SEQ ID NO:2，排除以底线指明的信号序列/SEQ ID NO:8）以及其对于台湾原生种真菌刺孢壳叶斑菌的编码氨基酸序列（722a.a残基/SEQ ID NO:1，排除信号肽/SEQ ID NO:7）的图示。

图3是根据取自糖苷水解酶（GH）家族3的β-葡萄糖苷酶（BGL）的氨基酸序列的种系发生树的图表，其显示由重构的巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）（SMD1168菌株）所分泌的BGL-Cr-D2-Pp与柄篮状菌（T.stipitatua）、土曲霉（A.terreus）NIH2624及烟曲霉（A.fumigates）A1163的β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶具有相关性（亦即，AA序列具有64-65%相似性）。

图4是重构pGAPZαC载体图谱的图表，其显示bgl-Cr-D2基因经克隆以进一步转化至巴斯德毕赤酵母表达系统。（在该图谱下方显示的简化核苷酸序列中，该些缩减区域的长度，亦即，GAP启动子、α-因子信号序列及bgl-Cr-D2，并不符合图示的图谱中依尺度绘制的实际大小。）

图5A及5B是显示下列菌落相对于时间的生长及pNPG酶活性的图示：(A)巴斯德毕赤酵母SMD 1168菌株及(B)带有bgl-Cr-D2的巴斯德毕赤酵母SMD1168菌株；其显示类似的生长曲线，但仅有克隆bgl-Cr-D2的菌落具有显著的pNPG酶活性。

图6A-C是显示非变性PAGE（A）、MUG酶谱分析（B）及SDS PAGE（C）的酶大小及活性的照片。（Pp：巴斯德毕赤酵母；Cr-D2：刺孢壳叶斑菌真菌菌株D2；BGL：β-葡萄糖苷酶。）

图7是显示根据20小时的pH稳定性评估（在进行标准的pNPG酶活性测量（亦即，pH 5及55℃，10分钟）之前，将酶置于4℃、特定pH值下20小时），重组酶BGL-Cr-D2-Pp在广泛的pH范围下(4-9)皆为稳定的图表。BGL-Cr-D2-Pp的pNPG酶活性的最适pH值为约5（在各个特定pH值测量该酶的pNPG酶活性）。

图8是显示根据4小时的热稳定性评估（在进行标准的pNPG酶活性测量之前，将酶置于各特定温度下4小时），重组酶BGL-Cr-D2-Pp在4-55℃的温度下皆为稳定的图示。BGL-Cr-D2-Pp的pNPG酶活性的最适温度为约70℃（在各个特定温度测量该酶的pNPG酶活性）；但在此高温下，该酶在较长的放置时间后（如，≥2小时，图9）会失活。

图9是显示重组β-葡萄糖苷酶BGL-Cr-D2-Pp在4至75℃的温度下，于9天期间内的热稳定性的图示。在≤50℃的温度下，BGL-Cr-D2-Pp于9天内皆维持稳定（相对活性>80%）。

具体实施方式

本发明是（至少部分）根据一种新颖β-葡萄糖苷酶及其高酶活性或效能的非预期性发现。β-葡萄糖苷酶（或β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶，BGL）是用于进行木质纤维素糖化作用的一组关键酶。此种类型的酶可在内切葡聚糖酶(EG)（主要降解纤维素纤维的非结晶部分）及外切葡聚糖酶（或纤维二糖水解酶，CBH）（主要降解结晶纤维素）的作用后，由纤维素水解基质（诸如，纤维二糖、纤维素寡糖、及其它葡萄糖苷）中释放D-葡萄糖单元。就由木质纤维素的工业规模生物燃料生产而言，发现具有高活性及生产力的低成本纤维素酶（亦即，CBH、EG、及BGL）是极为重要的。

本发明揭示下列新颖发现：具β-葡萄糖苷酶活性的多肽、编码该多肽的多核苷酸以及自酵母菌表达的重组β-葡萄糖苷酶的β-葡萄糖苷酶特异性活性增进。明确言之，发现一种台湾原生种的真菌，亦即，刺孢壳叶斑菌D2菌种，可分泌活性β-1,4-葡萄糖苷酶(BGL-Cr-D2)。编码此酶的基因（bgl-Cr-D2，大小=2166bps）已由逆转录的cDNA中克隆出来，并已经使用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168菌株作为宿主而成功在酵母菌中表达。由毕赤酵母分泌的重组酶BGL-Cr-D2-Pp具有高于原酶（约3X）及基准Novozyme-188（约17X）的较高β-葡萄糖苷酶活性（根据pNPG酶活性测量）。本发明提供一种新颖的重组β-葡萄糖苷酶，其具有与其它纤维素酶共同利用以进行纤维素糖化作用的潜力。

1.来自木质纤维素的生物燃料

再生性能源的发展（如，太阳能、生物燃料、水力、风力等）多年来一直受到大力提倡，以解决因大量消耗化石燃料而产生的日渐严重的能源问题。在目前所开发的能量形式/来源中，生物燃料具有可一方面减少农业/都市/工业的有机废弃物，同时产生洁净与富含能量的燃料（如，甲醇、乙醇、丁醇、及氢）的独特优点。因此，其已被列为重要永续能源之一(Antoni et al.,2007,Appl Microbiol Biotechnol 77:23-35；及Rubin,2008,Natures 454:841-845)。不只在台湾，全世界都亟需由木质纤维素生产生物乙醇，因为每年地球上都要产生约5×10¹²吨富含纤维素的农业废弃物，而在诸多国家中，其皆已经或将会在汽油中添加乙醇。在进一步的发酵进行乙醇生产之前，需要各种不同的酶系统（如，木质酶、纤维素酶及半纤维素酶）以完全分解木质纤维素（含有约5-30%的木质素、约35-50%的纤维素及约20-35%的半纤维素）而释放可发酵的葡萄糖(Lynd et al.,2002,Microbiol Mol Biol Rev 66:506-577)。

2.纤维素酶

就由纤维素所进行的生物乙醇生产而言，纤维素酶的有效糖化作用（降解多聚性的纤维素纤维以释放较小的葡萄糖分子）是极为关键的。纤维素酶是一群负责进行复杂纤维素水解作用的酶。根据该些酶的结构及功能特征，多种的纤维素酶已被分类成为三组，亦即，(i)外切葡聚糖酶（包括1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，CBH，EC 3.2.1.91及1,4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.74），(ii)内切葡聚糖酶(EG)(EC 3.2.1.4)及(iii)β-葡萄糖苷酶（或β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶，BGL）(EC 3.2.1.21)(Coughlan et al.,1988,于Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation,pp.11-30；及Henrissat et al.,1989,Gene 81:83-95)。CBH主要是作用在位于纤维素纤维的还原或非还原端的结晶部分，而EG则随机攻击纤维素的非结晶部分。更特定言之，该些纤维素酶可切割纤维素中葡糖基间的β-1,4-葡聚糖或β-D-葡萄糖苷连接，以形成短链基质，其包括纤维二糖（亦即，双糖）、其它纤维糊精（亦即，纤维素寡糖)、及葡萄糖苷（如，醇苷、氰苷、或酚苷）。该些短链中间化合物可由BGL进一步水解为葡萄糖（亦即，单糖），该酶主要是催化氧亲核基间的糖基转移(Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22(4):375-407)。就纤维素糖化作用而言，不足的BGL活性不仅会造成葡萄糖的缺乏，亦会造成纤维二糖的累积，而纤维二糖是CBH及EG的纤维素水解作用的强抑制剂(Harris et al.,2007,US专利7,244,605B2)。因此，BGL在由纤维素达成高乙醇产率上扮演着重要角色(Lynd et al.,2002,Microbiol Mol Biol Rev 66:506-577；及Hong etal.,2007,Appl Microbiol Biotechnol 73:1331-1339)。

3.β-葡萄糖苷酶(BGLs)的来源

酶BGL是遍在性的，且已在所有生物界中获得发现，从微生物、昆虫、及植物，到高度演化的哺乳动物(Esen,1993,Biochemistry and MolecularBiology,American Chemical Society,1-14;Bhatia et al.,2002,Crit RevBiotechnol 22(4):375-407)。其中一种主要的BGL产源是来自于细菌，包括农杆菌属（Agrobacterium）、杆菌属（Bacillus）、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）、纤维弧菌属（Cellovibrio）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、伊文氏杆菌属（Erwinia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、炽热球菌属（Pyrococcus）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、链霉菌属（Streptomyces）、热袍菌属（Thermotoga）、嗜热放线菌属（Thermobifida）等中的某些菌株(Hashimoto et al.,1998,ArchBiochem Biophys 360:1-9；Srivastava et al.,1999,Biotechnol Lett 21:293-297；及Yun et al.,2001,Biosci Biotechnol Biochem 65(9):2028-2032)。具有BGL生产能力的真菌菌株（霉菌或酵母菌）包括取自曲菌属（Aspergillus）、念珠菌属（Candida）、腐殖菌属（Humicola）、青霉属（Penicillium）、毕赤酵母属（Pichia）、覆膜酵母属（Saccharomycopsis）、踝节菌属（Talaromyces）、木霉菌属（Trichoderma）等(Dan et al.,2000,J Biol Chem 275(7):4973-4980；及Dunn-Coleman et al.,2008,美国专利公开案2008/0095889A1)。在该些微生物中，真菌种黑曲菌（Aspergillus niger）、熏烟曲菌（Aspergillus fumigates）、及瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是最为熟之且有效的BGL生产者，因而使其成为世界上商用BGL的主要来源(Dan et al.,2000,J Biol Chem275(7):4973-4980；Harris et al.,2007,美国专利第7,244,605B2号；及Dunn-Coleman et al.,2008,美国专利公开案2008/0095889A1)。此外，已发现少数的植物亦含有BGL，如大麦、闭鞘姜及玉米。

除上述的天然来源之外，有些重组BGLs已在不同的宿主中表达（如，大肠杆菌（E.coli）、枯草杆菌（B.subtilis）、巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）、酿酒酵母（S.cerevisiae）、白曲霉菌（A.kawachii）及瑞氏木霉（T.reesei））(Pandey et al.,1995,J Ferment Bioeng 80(5):446-453；Murray et al.,2004,Protein Expres Purif 38:248-257；及Roy et al.,2005,Biochem Bioph Res Co336:299-308)。举例而言，取自杆菌种的bgl基因已被成功克隆并在大肠杆菌系统表达(Hashimoto et al.,1998,Arch Biochem Biophys 360:1-9；及Srivastavaet al.,1999,Biotechnol Lett 21:293-297)。此外，黑曲菌的BGL编码基因bgl1已在巴斯德毕赤酵母及酿酒酵母中表达(Dan et al.,2000,J Biol Chem275(7):4973-4980)。由各种不同的来源克隆BGL基因，接着再在不同的宿主中表达，此已为取得较高BGL生产力（过表达）和/或活性（较佳的翻译后修饰改良该些酶的动力特征）的实务方法。

4.BGLs的特性

到目前为止，BGLs的特性相当分歧。一般而言，取自不同目及界的BGLs，对于连接糖基的糖苷配基部分（芳基-、烷基-、或胺基-），似乎具有不同的特异性(Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22(4):375-407)。已发现其为胞内、胞外、连接细胞溶质、连接膜或位于细胞周质。其对于水解短链纤维二糖或寡糖的催化功能在纤维素微生物之间相当类似，但在不同的生物中则已发现部分其它不同的功能（如，在部分微生物中可合成不同分子间的糖基键，在昆虫及植物中可由氰苷前体化合物释出氰化物，以及在人体中可水解糖基神经酰胺以治疗高雪氏症(Gaucher’s disease)）(Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22(4):375-407)。就纤维素的水解作用而言，BGLs可以保留净异头构象的方式水解其底物，该作用推测是经由两步骤、双替代的机制进行，其涉及关键活性位点的两个羧酸残基(Davies et al.,1998,Comprehensive Biological Catalysis Vol.1,pp.119-208;and Withers,2001,Carbohyd Polym 44:325-337)。已经指出，BGLs具有不同的底物特异性，且可作用于广泛的底物（如，pNPG、纤维二糖、水杨素、MUG、熊果素、芳基-、烷基-及甲基-葡糖苷）。此外，大部分的BGLs具有在弱酸范围中的最适pH，并具有嗜中温范围的最适温度，但亦曾报告有部分的强酸和/或嗜热特性。取自不同生物来源的BGL单体具有极为广泛的分子大小范围（亦即，约13-137kDa）(Gabelsberger et al.,1993,Appl Microbiol Biotechnol 40:44-52；Iwashita et al.,1999,Appl Environ Microbiol 65:5546-5553；Srivastava et al.,1999,Biotechnol Lett 21:293-297；及Dan et al.,2000,J Biol Chem275(7):4973-4980)。不同生物种BGLs间的氨基酸序列相似性亦广泛各异(10s-90s%)。然而，已鉴定出天冬氨酸(Asp,D)及谷氨酸(Glu,E)为BGLs的催化性亲核基团及催化性质子供体。

5.BGLs的分类

根据其所催化的化学反应，根据IUBMB（国际生物化学暨分子生物学联合会(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)）所公布用于3,000种以上的酶的数字分类规则，所有BGLs已被指定为EC 3.2.1.21类别（亦即，3-水解酶、2-糖基酶、1-糖苷酶及21-葡萄糖苷酶）(Webb,1992,Enzyme nomenclature:recommendations of the Nomenclature Committee of theInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclatureand classification of enzymes[酶命名法：国际生物化学暨分子生物学联合会命名委员会对于酶命名及分类的建议]，ISBN 0-12-227164-5；以及ExPASy,2009,www.expasy.org/enzyme/)。另外，BGLs是多功能的水解酶，其已根据各种标准而进一步分类（如，底物特异性及序列同一性）。早先，BGLs被归类成为第I型及第II型(Beguin et al.,1990,Ann Rev Microbiol 44:219-248)或是亚型A及B(Rojas et al.,1995,Biochem Mol Biol Int 35:1223-1231)；但近来该些较早期的分类大部分已被根据氨基酸和/或核苷酸序列同一性的现今所接受的标准取代(Henrissat et al.,1996,Biochem J 316:695-696)。

根据氨基酸序列及折叠相似性，BGLs已被归至115种至今（2009年11月）所定义的GH（糖苷水解酶）家族中的家族1或3中，除外糖基神经酰胺酶（亦即，归于家族30的酸性β-葡萄糖苷酶）(Henrissat,1991,Biochem J280:309-316；Henrissat et al.,1993,Biochem J 293:781-788；Henrissat et al.,1996,Biochem J 316:695-696；Hong et al.,2007,Appl Microbiol Biotechnol73:1331-1339；及Cantarel et al.,2009,Nucleic Acids Res.37:D233-238)。家族1(GH1)含有取自部分古细菌、细菌、真菌、植物及哺乳动物的β-葡萄糖苷酶，而家族3(GH3)则包含部分细菌、真菌及植物来源的β-葡萄糖苷酶(Henrissatet al.,1996,Biochem J 316:695-696；及Cantarel et al.,2009,NucleicAcids Res.37:D233-238)。

6.应用

除了用于进行纤维素乙醇生产的纤维二糖/纤维糊精水解功能之外，BGLs亦可广泛用于医药、农业及食品业的领域中，其中需要诸多涉及糖苷键的切割或合成的反应。根据BGLs的水解活性的应用包括(1)除去柑橘类果汁的苦涩感，(2)制造低黏度结冷胶食品，(3)解毒木薯（热带地区第三到第四大的能量来源），(4)增强香气释放以帮助制酒流程，(5)做为饲料添加物以增进单胃动物的营养利用，(6)将染料木苷水解为染料木黄酮以作为抗癌剂，(7)由根皮苷产生黑色素以降低皮肤癌的风险并促进毛发深色，(8)由橄榄苦苷产生羟基酪醇以预防冠状动脉心脏病及癌症，(9)水解昆布多糖以生产酵母提取物并将海藻生质转化成为可发酵糖，(10)制造色素作为糕点糖果产品中的天然食物染剂等等(Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22(4):375-407)。

此外，合成性的BGLs活性已被广泛用于制造药物、精细化学品及食品成份（如由Bhatia et al.,2002,Crit Rev Biotechnol 22(4):375-407所摘述）。例如，合成性的芳族n-烷基葡萄糖苷酯可有效用于治疗发烧、风湿、头痛、及其它疾病(Otto et al.,1998,Biotechnol Lett 20:437-440)。亦已有其它BGLs应用的报告，诸如，组织浆菌症的血清诊断，或是肝缺血再灌流损伤及复原之后诊断。因此，由各异的来源制备高质量/大量的BGLs就该些多用途的应用而言一直都是基本任务。

本文所述是一种分离的多肽，其包括与BGL-Cr-D2(SEQ ID NO:1)或其具有至少20个（如，30、50、80、100、150、200、250、300及350个）毗连氨基酸的部分具有至少70%同一性的氨基酸序列。

两氨基酸序列的「同一性百分比」是使用Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法，如Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中所修饰者进行判定。此种算法已纳入Altschul,et al.J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST及XBLAST程序（2.0版）中。BLAST蛋白检索可以XBLAST程序、得分=50、字长=3进行，以取得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。在两序列间存在空位时，可如Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997所述使用GappedBLAST。在使用BLAST及Gapped BLAST程序时，可使用各程序的系统预设参数（如，XBLAST及NBLAST）。

该分离的多肽可由适当微生物（如，刺孢壳叶斑菌）纯化而制备。其亦可经由已知的重组技术制备。其中一种实例如下。自刺孢壳叶斑菌细胞以聚合酶连锁反应制备编码BGL-Cr-D2的DNA片段，再将其克隆至表达载体中。在插入时，该编码BGL-Cr-D2的片段是以可操作的方式与该表达载体中所含的适当启动子连接。接着将所得的DNA构建体引入适当的宿主细胞中（如，大肠杆菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞）以进行BGL-Cr-D2的表达，其再可以已知的方法由该些细胞中纯化。酵母菌细胞的实例之一为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），如，巴斯德毕赤酵母SMD1168菌株。

为制备BGL-Cr-D2的功能等效物，其亦包括在本发明的范围之中，可在不破坏其β-葡萄糖苷酶活性的情形下，将一或多个保守性的氨基酸取代引入SEQ ID NO:1中。「保守性的氨基酸取代」是其中氨基酸残基经具有类似侧链的氨基酸残基置换者。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中获得定义。该些家族包括具有碱性侧链的氨基酸（如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、具有酸性侧链者（如，天冬氨酸、谷氨酸）、具有不带电荷的极性侧链者（如，甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、丝氨酸、羟丁氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非极性侧链者（如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、具有支链性侧链者（如，羟丁氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）以及具有芳族侧链者（如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，较佳可以取自相同侧链家族的另一氨基酸残基取代SEQ ID NO:1中预期为非必需的氨基酸残基。或者，可在SEQ ID NO:1的全部或部分随机引入突变，诸如，通过饱和突变，再筛选所得突变体的β-葡萄糖苷酶活性，以鉴定保留该活性的突变体，如下文实例一节所述。

可应用融合蛋白技术以改良本发明多肽的表达效率并协助其纯化。为制备含有BGL-Cr-D2的融合蛋白，可使编码此种β-葡萄糖苷酶的DNA片段与编码融合配对物（如，谷胱甘肽-s-转移酶(GST)、6x-His抗原表位标记或M13基因3蛋白）的另一DNA片段连接。在适当的宿主细胞内，将所得的融合核酸表达为融合蛋白，其可再以本领域中已知的方法分离。该分离的融合蛋白可进一步由，如，酶切消化作用处理，以除去该融合配对物，并取得本发明的重组多肽。

本文还描述了一种分离的核酸，其编码本发明的多肽。核酸是指DNA分子（如，cDNA或基因组DNA）、RNA分子、或DNA/RNA类似物，其可由核苷酸类似物合成。在一实例中，本发明的核酸是一表达载体，其中编码该多肽的DNA片段以可操作的方式连接适当的启动子。

在本文中，术语「启动子」是指一种核苷酸序列，其含有可在想要的宿主微生物中起始与其以可操作方式连接的核酸序列转录的元件。最低限度，启动子含有RNA聚合酶结合位点。其可进一步含有一或多个增强子元件，其就定义而言可增强转录，或是一或多个调控元件，其可控制该启动子的开/关状态。当使用大肠杆菌作为宿主微生物时，代表性的大肠杆菌启动子包括，但不限于，β-内酰胺酶及乳糖启动子系统（参见Chang et al.,Nature275:615-624,1978），SP6、T3、T5、及T7RNA聚合酶启动子(Studier et al.,Meth.Enzymol.185:60-89,1990)，λ启动子(Elvin et al.,Gene 87:123-126,1990)，trp启动子(Nichols and Yanofsky,Meth.in Enzymology 101:155-164,1983)，以及Tac及Trc启动子(Russell et al.,Gene 20:231-243,1982)。在使用酵母菌作为宿主微生物时，例示性的酵母菌启动子包括3-磷酸甘油酸激酶启动子，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，半乳糖激酶(GAL1)启动子，半乳糖表异构酶启动子以及醇脱氢酶(ADH)启动子。适合用于在其它类型的细胞中驱动基因表达的启动子亦为本领域中所熟知。

载体是指一种核酸分子，其可载运其所连接的另一核酸。载体可独立复制或是纳入宿主DNA中。载体的实例包括质粒、黏接质粒（cosmid）或病毒载体。本发明的载体包括编码BGL-Cr-D2的核苷酸序列，其形式为适合在宿主细胞中表达该核酸者。较佳地，该载体包括一或多个调控序列，以可操作的方式连接该编码序列。「调控序列」包括启动子、增强子以及其它表达控制元件（如，聚腺苷酸化信号）。调控序列包括该些可指引核苷酸序列的组成型全身表达者，以及组织特异性的调控和/或可诱导序列。表达载体的设计可取决于诸等因子，如，欲转化宿主细胞的选择、所欲的蛋白表达量及其类似者。可将该表达载体引入宿主细胞以制备本发明的多肽。

本发明的范围亦包括一种宿主细胞，其含有上述核酸。实例包括大肠杆菌细胞、昆虫细胞（如，使用杆状病毒表达载体）、酵母菌细胞、植物细胞、或哺乳动物细胞。参见，如，Goeddel,(1990)Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185[基因表达技术：酶学方法185],Academic Press,San Diego,CA。为制备本发明的多肽，可在容许本发明核酸所编码的多肽表达的条件下，于培养基中培养宿主细胞，再由该经培养的细胞或该细胞的培养基中纯化该多肽。或者，可在试管中转录及翻译本发明的核酸，例如，使用T7启动子调控序列及T7聚合酶。

本文还描述一种方法，使用含有本文所述的β-葡萄糖苷酶及其它纤维素水解酶（诸如，外切葡聚糖酶及内切葡聚糖酶）的多酶组合物，将木质纤维素物质转化成为可发酵产物（如，可发酵糖）。参见，如，美国专利申请案第20070238155及20070250961号。术语「纤维素水解酶」是指可将纤维素（一种由葡萄糖单元构成的多糖）水解成为较小糖类单元的酶。参见Gilbert H J,Hazlewood G P，1993J Gen Microbiol 139:187-194；Olimiya K et al.1997Biotechnol Genet Eng Rev.14:365-414。亦参见美国专利申请案第2007016805号。此种多酶组合物可取自，微生物、植物或其组合，且其含有可降解木质纤维素物质的酶。除上述纤维素水解酶外，其可进一步包括纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶）、半纤维素酶（诸如，木聚糖酶，包括，内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、及β-木糖苷酶）、木质素酶、淀粉酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、阿拉伯糖酶、葡糖苷酸酶、蛋白酶、酯酶（包括阿魏酸酯酶及乙酰基木聚糖酯酶）、脂肪酶、葡甘聚糖酶或木葡聚糖酶。

在本文中，术语「木质纤维素物质」指含有纤维素和/或半纤维素的物质。一般而言，该些物质亦含有木聚糖、木质素、蛋白质及碳水化合物，诸如，淀粉及糖类。木质纤维素可见于，例如，植物的茎、叶、壳、皮及穗轴，或是树木的叶、枝及木材。将复杂碳水化合物（诸如，淀粉、纤维素或半纤维素）转化为可发酵糖的过程在本文中称为「糖化作用」。可发酵糖在本文中是指简单糖类，诸如，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或纤维二糖。木质纤维素材料可包括原始植物生质和/或非原始植物生质，诸如，农业生质、商业有机物、营造及拆除废弃物、城市固体废弃物、废纸、及庭院废弃物。木质纤维素物质的常见形式包括树木、灌木及草、小麦、麦杆、甘蔗渣、玉米、玉米皮、玉米粒（包括取自玉米粒的纤维）、谷物（诸如，玉米、稻米、小麦及大麦）碾磨的产品及副产品（包括湿磨及干磨）、以及城市固体废弃物、废纸、及庭院废弃物。木质纤维素物质亦可为，但不限于，草本材料、农业废弃物、林业废弃物、及造纸厂废材。「农业生质」包括枝条、灌木、甘蔗、玉米及玉米皮、能源作物、森林、水果、花、谷粒、草、草本作物、叶、树皮、针状叶、圆木材、根、树苗、短轮伐期木质作物、灌木、柳枝稷、树木、蔬菜、果皮、藤蔓、甜菜渣、小麦粉头、燕麦壳、硬及软木（不包括具有害物质的木材）、由农业流程产生的有机废弃物质（包括农耕及林业活动，特别包括林业废木），或其混合物。

在上述方法中所制备的可发酵糖可经由酶处理或化学反应而转化成为具附加价值的有用发酵产物。该发酵产物的实例包括，但不限于，氨基酸、维生素、药物、动物饲料添加剂、特殊化学品、化学原料、塑料、溶剂、燃料、或其它有机聚合物、乳酸、及乙醇，包括燃料乙醇。可由本发明方法制备的特定具附加价值的发酵产物包括，但不限于，生物燃料（包括乙醇及丁醇）；乳酸；塑料；特殊化学品；有机酸，包括柠檬酸、琥珀酸、及马来酸；溶剂；动物饲料添加物；药物；维生素；氨基酸，诸如，离氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、羟丁氨酸及天冬氨酸；化学原料。可发酵糖亦可用于培养微生物，其可产制发酵产物，如，工业用酶，诸如，蛋白酶、纤维酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳酸酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶及木聚糖酶。

本发明亦提供一种由木质纤维素物质产生能量的方法。本方法包括提供上述的多酶组合物；使该组合物与木质纤维素物质接触，以产生可发酵产物；发酵该可发酵产物，以产生可燃性发酵产物，再燃烧该可燃性发酵产物以产生能量。本方法可在生物反应器中进行，该生物反应器含有所有必需的组分，且较佳可受配置以进行微生物的厌氧生长。制造及使用生物反应器的方法为本领域中已知。参见，如美国专利申请案第20080131958号。

上述的多肽及组合物亦可用于纸业及木浆业。举例而言，该多肽，其具有β-葡萄糖苷酶活性，可用于回收纸的脱墨及精制。在此应用中，其使用可大量降低每吨纸所需用的酶量，并降低欲增加该纸亮度所需的与该酶接触的时间。在精制过程中降低酶浓度及与酶的接触时间可相应且如所欲般降低纤维素酶对于纤维本身的反应时间以及处理成本。

本发明的多肽具有其它工业应用。由于其具有高β-葡萄糖苷酶活性，此种多肽可以较低的量作用。该多肽，结合其它酶，可用于以较高产率而由水果提取果汁，或是由植物提取果汁或汤品的调味料。在结合蛋白酶的情形下，其可用于分解干燥的海草，其接着可以醇进行发酵而产生醋。该多肽，混合其它酶，亦可在烘焙业中作为面团调整剂。参见，如美国专利第6602700号。

同时，本发明的多肽亦可用于纺织业。其可借着除去会造成布料外观暗沉的表面微纤维而用于增亮及软化棉布。更特定言之，其可用于在制造具有「石洗」效果的牛仔裤时取代浮石。相较于长时间接触浮石，酶处理可对牛仔布料造成较少的损害。参见美国专利第5232851、5677151、6451063及7226773号。

在另一方面，本发明提供一种转基因植物，其基因组经由以可操作方式连接启动子序列的编码本发明多肽的重组多核苷酸增强。该多核苷酸经优化处理以在植物中表达，且该多肽是以大于5%总可溶性蛋白、大于10%总可溶性蛋白或大于20%总可溶性蛋白的量制备。该多肽可以组成型全身方式或组织特异的方式表达。举例而言，其可在选自由茎及叶所构成群的植物组织中表达。其亦可在靶向的亚细胞区室或胞器中表达，诸如，质外体、叶绿体、细胞壁或液泡。该植物可为单子叶植物或双子叶植物。在部分具体实例中，该植物是作物植物。该植物可选自由玉米、柳枝稷、高粱、芒草、甘蔗、白杨、松树、小麦、稻米、大豆、棉花、大麦、草坪草、烟草、竹、油菜、甜菜、向日葵、柳树及尤加利树所构成的群。制造转基因植物的方法为本领域中所熟知。

下述的特定实例仅被视为说明，且不以任何方式限制本揭示内容的其它部分。在不需进一步详尽阐述的情形下，相信根据本文的叙述，本领域技术人员可将本发明利用至其最完整的程度。所有本文所引述的刊物因此以其全文并入本文作为参考。同时，下文所提议的任何机制并不已任何方式限制所请发明的范围。

I.材料及方法

1.原生D2真菌菌株的培育

以MR(Mendels-Reese)培养基(pH 5.0)培养原生真菌菌株（亦即，刺孢壳叶斑菌D2），以收集真菌细胞进行DNA/RNA提取，并收集粗制酶以进行特性分析（如，氨基酸序列、纤维素活性及酶浓度）。每1升的MR培养基含有1g大豆蛋白胨、1.4g(NH₄)2SO₄、0.3g尿素、2.0g KH₂PO₄、0.34g CaCl₂、0.3g MgSO₄·7H₂O、5.0mg FeSO₄·7H₂O、1.6mg MnSO₄·7H₂O、1.4mgZnSO₄·7H₂O、2mg CoCl₂·6H₂O及0.72g纤维二糖。在30℃的温度以及125rpm的混合速率下，使真菌培养物生长4天，接着再收集真菌细胞及其粗制酶。

2.核酸提取及粗制酶的收集

使用基因组DNA纯化试剂盒(Promega,USA)提取C.raphigeraD2真菌的基因组DNA，并使用植物总RNA微量制备纯化试剂盒(GeneMark,Taiwan)提取真菌RNA。以分光光谱仪(NanoDrop ND-1000,Thermo Scientific,USA)测量所提取核酸的浓度。在进行进一步的处理前（如，PCR及RT PCR），将该些DNA及RNA提取物贮存在-20℃下。

使4天真菌培养物的上清液，过滤通过Whatman No.1滤纸(Whatman/GEHealthcare,USA)，接着再过滤通过0.45μm

膜盘状过滤器(PALL,USA)，再过滤通过30K NMWL(Nominal Molecular Weight Limit)

Ultra-15离心过滤器(Millipore,USA)，收集粗制酶。根据Bio-Rad蛋白分析，使用BSA（牛血清白蛋白）作为校正标准物(Bio-Rad,USA)，测定酶浓度。将过滤的酶贮存在4℃下，直到进行进一步的分析。

3.酶电泳及N-端测序

根据Hoefer’s Protein Electrophoresis Applications Guide[Hoefer蛋白电泳应用指南](Hoefer Scientific Instruments,1994)所建议的操作流程，进行包括非变性PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）及SDS（十二烷基硫酸钠）PAGE的酶电泳。在对非变性PAGE进行考马斯蓝染色前，将凝胶浸在0.5mM MUG（4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷）溶液中，并在50℃下共置15分钟，接着在UV灯下观察，以进行酶谱分析(Benoit et al.,1995,Curr Microbiol30:305-312)。此外，亦使用PlusOne银染试剂盒(GE Healthcare,USA)进行银染而非使用SDS-PAGE的考马斯蓝染色，以观察具有部分低浓度的酶。

就N-端序列分析而言，使目标酶（亦即，具有MUG活性的BGL）自SDS-PAGE凝胶转移至PVDF膜(iBlot Gel Transfer Stacks,Invitrogen,USA)，再根据Edman降解化学，以Applied Biosystems Procise蛋白测序仪494型(Applied Biosystems,USA)进行分析。使用所揭示N-端序列的一部分，PGDGDWA(SEQ ID NO:9)，设计简并引物D2-bgl-NT:CCN GGN GAY GGNGAY TGG GC(SEQ ID NO:10)，以由基因组DNA和/或逆转录的cDNA，进一步扩增目标bgl基因。

4.D2-bgl基因的克隆及测序

首先使用聚-T引物：GGT TCT TGC CAC AGT CAC GAC TTT TTT TTTTTT TTT TTT(SEQ ID NO:11)及III逆转录酶(Invitrogen,USA)，由RNA样本逆转录(RT)出bgl-Cr-D2cDNA；再接着使用D2-bgl-NT及聚-T锚引物：GGT TCT TGC CAC AGT CAC GAC(SEQ ID NO:12)的引物组以及DNA聚合酶(TaKaRa Ex Taq^TM,TaKaRa Bio Inc,Japan)进行扩增。PCR的热循环条件为94℃4分钟，接着为30循环的94℃1分钟、58℃30秒、及72℃3分钟，接着进行72℃5分钟的终延伸步骤。将RT-PCR产物（亦即，bgl-Cr-D2cDNA扩增物）克隆于

-T Easy Vector中(Promega,USA)，再转移进入大肠杆菌细胞（DH5α菌株），以进行保存及进一步的测序。除此之外，亦使用D2-bgl-f:CCT GGT GAT GGT GAT TGG GCA GC (SEQ ID NO:13)及D2-bgl-r:ATG TCC ACC TTT CCG AAT ACC TTG GC(SEQ ID NO:14)的引物组以及TaKaRa Ex Taq^TM，由基因组DNA样本扩增bgl-Cr-D2基因（含有内含子）。亦将该PCR产物克隆于

-T Easy Vector中进行测序。比较bgl-Cr-D2cDNA（无内含子）及bgl-Cr-D2基因组DNA（具内含子）的序列以判定内含子部分。

此外，亦以SacI限制酶(NEB,New England Biolabs Inc.,USA)对基因组DNA进行酶切消化，再以T4DNA接合酶进行自体连接，以揭露bgl-Cr-D2基因上游的信号序列；接着，再以D2-bgl233f：CGT TTC GTC CAA AAT GTAACA GCA T(SEQ ID NO:15)及D2-bgl232r:GAT GCT TTC ACC GTC AGTTCT GA(SEQ ID NO:16)的引物组进行反向PCR。该PCR的程序如下：95℃5分钟，接着为25循环的95℃1分钟、55℃1分钟、及72℃6分钟，接着进行72℃10分钟的终循环。将该反向PCR产物（应含有如下顺序的序列：D2-bgl233f+部分D2-bgl+SacI+部分D2基因组+D2-bgl的信号序列+部分D2-bgl+D2-bgl232r）克隆于

-T Easy Vector中以进行进一步的测序。

使用Clustal X软件(Thompson et al.,1997,Nucleic Acids Research 25(24):4876-4882)，使由所揭示的bgl-Cr-D2cDNA取得的BGL-Cr-D2推定氨基酸序列与其它GH3家族的BGLs进行比对，以分析种系发生关系。使用该比对结果建立种系发生树，以TreeView图示(Page,1996,Computer Applications inthe Biosciences 12:357-358)。

5.在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达

在pGAPZαC载体中进一步构建bgl-Cr-D2cDNA（克隆于

-TEasy Vector中），以在毕赤酵母中(Invitrogen,USA)进行重组BGL-Cr-D2-Pp的组成型表达。简言之，以D2-bgl-f-EcoRI：CGC TTG AAT TCG ATG CCTGGT GAT GGT GAT TGG(SEQ ID NO:17)及D2-bgl-r-NotI:TTC AAG CGG CCG CAT GTC CAC CTT TCC GAA TAC C (SEQ ID NO:18)的引物组，进行Easy vector中bgl-Cr-D2cDNA的PCR扩增。以EcoRI及NotI (NEB,USA)进行扩增子及载体的双重酶切消化，再以T4DNA接合酶进行连接，将此PCR产物连接至pGAPZαC载体中。将所构建的带有bgl-Cr-D2cDNA的pGAPZαC载体转化进入大肠杆菌（DH5α菌株）中保存。在后续转化进入毕赤酵母宿主之前，先以质粒微量制备纯化试剂盒(GeneMark,Taiwan)纯化具有D2-bglcDNA的pGAPZαC载体，并以BspHI(NEB,USA)线性化。根据毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen,USA)的操作流程，经由同源重组，将该线性质粒DNA转化进入巴斯德毕赤酵母（GS115及SMD1168菌株）中。在YPD_zeocin100培养基及Invitrogen操作流程中所建议的条件下，培养该重构的巴斯德毕赤酵母细胞。在不同时点（0-14天）收集毕赤酵母细胞及其酶，以评估其生长及酶的活性/量。

6.活性试验

使用不同的底物（对硝基苯基β-D-葡萄糖苷，pNPG；纤维二糖；羧甲基纤维素，CMC；木聚糖；微晶纤维素；及，滤纸），试验取自天然D2菌株的粗制酶及取自巴斯德毕赤酵母的重组酶的纤维素水解活性。根据由2mMpNPG在55℃、于5分钟内的pNP释出率，测量该些酶的pNPG酶活性。pNP浓度是根据OD₄₀₅的分光光度吸收值而校正。纤维二糖活性是由纤维二糖还原率和/或葡萄糖生产率而评估，其中纤维二糖及葡萄糖的浓度是由HPLC（高效液相层析）分析而测定。此外，亦根据DNS（二硝基水杨酸）法所检测的还原糖生产率，测量CMC酶（针对其内切葡聚糖酶活性）、木聚糖酶（针对其木糖水解活性）、微晶纤维素酶（针对其外切葡聚糖酶活性）及FP酶（代表总纤维素酶活性）。

II.结果

在本发明中，根据使用pNPG（对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷）及纤维二糖作为底物进行的评估，其首先发现台湾原生种真菌刺孢壳叶斑菌D2菌种可分泌具有显着β-葡萄糖苷酶活性的粗制酶。自基因组DNA及逆转录的cDNA中衍生编码该目标β-葡萄糖苷酶(BGL-Cr-D2)的基因(bgl-Cr-D2)。其显示，bgl-Cr-D2cDNA具有2166bps的大小（不包括信号序列及终止密码子），而bgl-Cr-D2基因组DNA则具有2851bps的大小（图1&2）。在比较bgl-Cr-D2基因组DNA及cDNA后，鉴定出12个内含子。该bgl-Cr-D2基因可编码722个氨基酸基础以形成BGL-Cr-D2（图2）。根据衍生自糖苷水解酶（GH）家族3的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列比较，该新发现的BGL-Cr-D2与柄篮状菌（Talaromyces stipitatua）（65%相似性）及土曲霉（Aspergillus terreus）（64%相似性）的β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶同源（图3）。根据种系发生分析，发现C.raphigena D2、柄篮状菌及柄篮状菌形成一亚群，其可与其它真菌及细菌组群（如，青霉属（Penicillium）、覆膜酵母属（Saccharomycopsis）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）及大肠杆菌（Escherichia coli））区分。

将该bgl-Cr-D2基因进一步克隆至pGAPZαC载体中（图4），并使用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168菌株作为宿主细胞转化至酵母菌表达系统。在比较带有bgl-Cr-D2的巴斯德毕赤酵母SMD1168菌株的生长及pNPG酶活性时，仅在克隆bgl-Cr-D2的菌落中观察到显著的pNPG酶活性，而两种菌落的生长曲线则为相似（图5）。在30℃下培养4-6天后，其生长及活性到达稳定量。同时，该重组β-葡萄糖苷酶(BGL-Cr-D2-Pp)具有约95kDa的分子量（图6C）（因翻译后糖基化作用而大于79kDa的理论大小）；且根据糖基化率（表1）及非变性PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）（图6A）/MUG（4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡糖苷）酶谱分析（图6B）的观察结果，其显示具有高特异活性。

在广泛的pH范围下（亦即，pH4-pH9）放置20小时后，重组BGL-Cr-D2-Pp仍具有活性（图7）。然而，此酶的pNPG酶活性在高于5.5的pH值下会显着降低。此外，BGL-Cr-D2-Pp在75℃的温度下具有最高的pNPG酶活性；但在此高温下，其活性在短期（亦即，2小时）的放置后会大量下降（图8&9）。因此，在pH 5及55℃的温度下，使重组BGL-Cr-D2-Pp进行10分钟的pNPG酶活性测量。

表1.由巴斯德毕赤酵母分泌的原酶BGL-Cr-D2、由巴斯德毕赤酵母分泌的重组酶BGL-Cr-D2-Pp及Novozyme-188对于不同底物的酶活性比较（所有反应皆在pH5及55℃下进行）。

*:对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷；

羧甲基纤维素；

滤纸；**:1U=每分钟1μmole的由pNPG产生的pNP，由纤维二糖产生的葡萄糖，或是由CMC、木聚糖、微晶纤维素或FP产生的还原糖；

除BGL外的总酶。

其它具体实例

所有揭示于此说明书中的特征可以任何方式组合。各个揭示于此说明书中的特征可以另一提供相同、相当或类似目的的替代手段取代。因此，除非另有明示，各例示的特征仅是一总括系列的相当或类似特征中的一例。

已叙述诸多本发明的具体实例。然而，应理解，可在不偏离本发明精神及范围的情形下进行各种不同的修饰。因此，其它具体实例亦涵括于权利要求的范围中。

Claims (24)

1.一种分离多肽，其包含与SEQ ID NO:1具有至少70%同一性的序列，其中该多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。

2.根据权利要求1的分离多肽，其中该序列与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性。

3.根据权利要求2的分离多肽，其中该序列与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性。

4.根据权利要求3的分离多肽，其中该序列与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性。

5.根据权利要求4的分离多肽，其中该序列与SEQ ID NO:1具有至少99%同一性。

6.根据权利要求5的分离多肽，其中该多肽包括SEQ ID NO:1的序列。

7.一种分离核酸，其编码根据权利要求1的多肽。

8.根据权利要求7的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:2、3、5或6的序列。

9.一种表达载体，其包含根据权利要求7的核酸。

10.一种宿主细胞，其包含根据权利要求7的核酸。

11.一种制备多肽的方法，包括：

在培养基中培养宿主细胞，该宿主细胞含有一核酸，编码根据权利要求1的多肽，其培养条件为容许该核酸所编码的多肽表达，以及

由该经培养的细胞或该细胞的培养基中纯化该多肽。

12.根据权利要求11的方法，其中该多肽具有与SEQ ID NO:1具90%同一性的序列。

13.根据权利要求11的方法，其中该多肽具有与SEQ ID NO:1具95%同一性的序列。

14.根据权利要求11的方法，其中该多肽具有SEQ ID NO:1的序列。

15.一种组合物，其包含根据权利要求1的多肽。

16.根据权利要求15的组合物，其中该组合物还包含外切葡聚糖酶及内切葡聚糖酶。

17.一种由木质纤维素物质制备可发酵糖的方法，包括：

提供根据权利要求15的组合物，以及

使该组合物与木质纤维素物质接触以制备可发酵糖。

18.根据权利要求17的方法，其中该可发酵糖选自由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖及纤维二糖所构成的群。

19.根据权利要求17的方法，其中该多肽具有SEQ ID NO:1的序列。

20.根据权利要求17的方法，其中该木质纤维素物质系选自由纤维素质动物粪便、城市固体废弃物、废纸、庭院废弃物、农业废弃物及林业废弃物所构成的群。

21.根据权利要求17的方法，其进一步包含将该可发酵糖转化成为发酵产物。

22.根据权利要求21的方法，其中该转化步骤是由微生物发酵或酶处理而进行。

23.一种由木质纤维素物质产生能量的方法，包括：

提供根据权利要求15的组合物；

使该组合物与木质纤维素物质接触以制备可发酵糖；

转化该可发酵糖以产生可燃性的发酵产物，及

燃烧该可燃性发酵产物以产生能量。

24.一种生物反应器，其含有木质纤维素物质以及根据权利要求15的组合物。

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