^
Pathogen resistente transgene Pflanze
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pathogenresistente Pflanze, insbesondere eine Pflanze mit einer neuartigen Resistenz basierend auf der Reaktion von mehreren Teilen eines Avirulenzproteins mit einem korrespondierenden Resistenzprotein in einer Zelle der Pflanze, eine Zusammensetzung von Nukleinsäuren, die nach Integration in das Genom einer Pflanze, in dieser die Pathogenresistenz vermittelt, ein Verfahren zur Herstellung einer pathogenresistenten Pflanze und Pflanzen zur Herstellung einer pathogenresistenten Pflanze.
Hintergrund der Erfindung
Durch Phytopathogene wie Pilze, Viren, Nematoden und Bakterien hervorgerufene
Pflanzenkrankheiten bewirken weltweit große Ernteverluste, beeinträchtigen in hohem Maße die Qualität der Ernteprodukte und machen einen aufwendigen Einsatz chemischer Pflanzenschutzmittel notwendig. Häufig reichen die natürlichen Maßnahmen des pflanzlichen Immunsystems, mit deren Hilfe die Mehrzahl potentieller Krankheitserreger abgewehrt oder deren Ausbreitung verzögert und einschränkt werden kann, nicht aus.
Das pflanzliche Immunsystem reagiert auf einen Pathogenbefall. In einer ersten Phase erkennen Transmembranrezeptoren (PRRs, pattern recognition receptors) molekulare Muster eines Pathogens (sog. MAMPs oder PAMPs, microbial- oder pathogen-associated molecular patterns) und vermitteln in der Pflanze die "PAMP-triggered immunity" (PTI), die eine weitere Ausbreitung des Pathogens unterbinden soll.
Pathogene haben jedoch Strategien entwickelt dieser ersten Abwehrreaktion zu bestehen. Pathogene nutzen unterschiedlichste Infektionswege: Während pathogene Bakterien beispielsweise über Stomata und Hydathoden oder als Folge einer Verwundung in die Pflanze gelangen können und sich dort im apoplasmatischen Raum vermehren, dringen Pilze direkt in epidermale Pflanzenzellen ein oder bilden Hyphen auf oder zwischen den epidermalen Zellen, mit denen sie auch in der Lage sind nach
Erreichen der Stomata über diese in das Pflanzengewebe einzuwachsen. Bei all den Unterschieden ist jedoch allen Pathogenklassen gemein, dass sie im Wege der Infektion Effektormoleküle
(Virulenzfaktoren) in die Pflanzenzellen abgeben, wo diese maßgeblich die Virulenz des Pathogens beeinflussen. So sind einige Effektoren in der Lage die PTI derart abzuschwächen, dass eine
|Bestätigungskopie|
erfolgreiche Kolonialisierung der Wirtspflanze ermöglicht wird (effector triggered susceptibility, ETS) (Jones & Dangl, 2006).
Gegen diese ETS richten sich weitere Phasen der pflanzlichen Immunabwehr. Einige in die pflanzliche Zelle geschleuste Effektormoleküle, die Avirulenzproteine, werden sehr spezifisch durch pflanzliche NBS-LRR-Resistenzproteine (R-Proteine) erkannt. Dabei reagieren die Avirulenzproteine entweder direkt oder indirekt entsprechend der Guard-Hypothese mit dem korrespondierenden R-Protein, woraufhin eine Aktivierung des R-Protein erfolgt (Dangl & Jones, 2001 ; Jones & Dangl, 2006). Das aktivierte R-Protein ist in der Lage eine Signalkaskade auszulösen, die eine beschleunigte und verstärkte PTI in der Pflanze bewirkt, die sog. effector triggered immunity, ETI (Jones & Dangl, 2006). Somit stellen Avirulenzproteine generell Induktoren einer pflanzlichen Pathogenabwehr- reaktion dar. Diese äußert sich in unterschiedlichen physiologischen Reaktionen der Pflanze, wie in einer hypersensitiven Reaktion (HR), einer weiteren Verstärkung der Zellwand durch Lignifizierung und Kallosenbildung, in der Synthese von Phytoalexinen, der Produktion von PR-(pathogenesis- related)-Proteinen und häufig auch in dem kontrollierten Zelltod des Wirtsgewebes an der
Infektionsstelle des Pathogens.
Trotz dieser Maßnahmen des pflanzlichen Immunsystems gelingt es dennoch manchen Pathogenen die ETI zu behindern und die Pflanze erfolgreich zu infizieren, indem sie beispielsweise die erkannten Effektoren diversifizieren oder zusätzliche ETI-hemmende Effektoren bereitstellen. Daher ist es schon lange ein Ziel der Züchtung und Forschung die Resistenz von Pflanzen, bevorzugt von Nutzpflanzen, gegenüber Pathogenen weiter zu steigern, womit insbesondere beabsichtigt wird, die Pflanzen derart zu verbessern, dass sie gegenüber einer Vielzahl von Pathogenen gleichzeitig resistent gemacht werden (breite Pathogenresistenz).
Mit diesem Ziel stellte auch de Wit bereits Anfang der 1990er Jahre in WO/1991/15585 (auch in de Wit, 1992) sein visionäres Konzept vor: Es basiert auf der Pathogen-induzierten Coexpression eines pflanzlichen Resistenzgens und des korrespondierenden Avirulenzgens aus dem Pathogen in einer Zelle einer Pflanze, wodurch nach Pathogenbefall begrenzt auf den Ort der Infektion eine
Abwehrreaktion der Pflanze durch Aktivierung des synthetisierten Resistenzproteins induziert werden soll, und zwar schneller und effektiver als dies durch die Maßnahmen des pflanzlichen Immunsystems natürlicherweise geschehen würde.
Lange galt dieses Konzept jedoch als nicht umsetzbar. So wird in WO/1995/31564 schon darauf verwiesen, dass aus WO/1991/15585 insbesondere nicht hervorgeht, welche Polynukleotidsequenzen als geeignete Promotoren für eine breite Pathogenresistenz einsetzbar sind. So heißt es außerdem, dass im Falle des vorgeschlagenen Tomaten-Resistenzgens Cf-9 in Kombination mit dem Avirulenzgen
Avr9 aus Cladosporium f lv m die induzierte Nekrose aufgrund der Spezifität der vorgeschlagenen Promotoren zu einer weiterführenden Induktion von Cf-9 und/oder Avr9 führen könnte, was eine unkontrollierte Nekrose als Folge der Hypersensitiven Reaktion zur Folge haben könnte.
Erst im Jahre 1999 berichten Joosten und de Wit, dass es gelungen sei, eine Cf-9-tragende
Tomatenpflanze mit einem Avr9-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle eines verkürzten prpl -1 (gstl ) Promotors (Martini et al., 1993) zu transformieren und auf diese Weise eine erhöhte
Pilzresistenz von Tomaten gegenüber mehreren Pilzen zu bewirken (Joosten & de Wit, 1999). Die beiden Autoren räumen jedoch auch ein, dass ein weiterer Optimierungsbedarf hinsichtlich der stringenten Regulation des Promotors und einer unerwünschten Induktion des gst/-Promotorfragments in nichtinfizierten Geweben besteht (Strittmatter et al., 1996).
WO/1999/43823 offenbart die Erzeugung transgener Maispflanzen, welche mit dem fungalen Avirulenzgen avrRxv unter der Kontrolle eines Pathogen-induzierbaren Promotors biolistisch transformiert wurden, während sie das korrespondierende Resistenzprotein bereits natürlicherweise enthielten. Die eingesetzten Pathogen-induzierbaren Promotoren sind jedoch aufgrund einer hohen Hintergrundsaktivität nicht spezifisch genug für einen Ansatz zur Erlangung einer breiten
Pathogenresistenz. Zudem können einige der vorgeschlagenen Promotoren unter Umständen eine systemische Antwort auf eine Pathogeninfektion auslösen, was zu einer unerwünschte Aktivierung dieser Promotoren auch in nichtinfizierten Zellen führen würde. Dass die technische Lehre aus WO/1999/43823 bestenfalls nur auf Avirulenzgene mit einer schwachen Pathogenabwehrinduktion anwendbar ist, zeigt sich auch in dem Vorschlag der Autoren alternativ zu den Pathogen-induzierbaren auch schwach-konstitutive Promotoren zur Expressionskontrolle des Aviruienzgens einzusetzen.
Auch wenn der Stand der Technik bereits Verfahren zur Herstellung von Pflanzen sowie erzeugte Pflanzen mit einer verbesserten Pathogenresistenz nach dem Konzept von de Wit bereithält, können diese technischen Lehren des vorstehenden Stands der Technik jedoch nicht ohne Weiteres auf die Integration jeglicher Avirulenzgene, insbesondere solcher, die für starke Induktoren einer
Zelltodauslösung kodieren, übertragen und angewendet werden. Der Grund hierfür liegt nicht unmittelbar in der unzureichend stringenten Regulation der transgenen Expression des Aviruienzgens, sondern vielmehr in der Schwierigkeit ein solches Avirulenzgen unter der Kontrolle eines Pathogen- induzierbaren Promotors stabil in das Genom einer Pflanze zu integrieren. Denn bereits während der Durchführung der gebräuchlichen Techniken der Pflanzentransformation, welche für die stabile genomische Integration eines Aviruienzgens auch aus vorstehendem Stand der Technik vorgeschlagen werden, werden die heute bekannten Pathogen-induzierbaren pflanzlichen Promotoren ungewollt induziert. Dies betrifft sowohl Agrobacterium
als auch biolistische
Transformationsverfahren. So sind beispielsweise Pflanzen, insbesondere solche, die weniger
empfänglich für Transformationsverfahren sind, in der Lage über AMP- bzw. PAMP-responsive Rezeptoren in der pflanzlichen Zellmembran auf die Anwesenheit von A. tumefaciens direkt oder indirekt mit der Aktivierung von Pathogen-induzierbaren Promotoren zu reagieren (Jones & Dangl, 2006; uta & Tripathi, 2005; WO/2007/068935). Ebenso werden zahlreiche Pathogen-induzierbare Promotoren auch durch Verwundung, wie sie zum Beispiel während der biolistischen Transformation auftreten, aktiviert (Stahl et al., 2006). Das Ergebnis ist in jedem Fall die unerwünschte Expression des eingebrachten Avirulenzgens. Das synthetisierte Avirulenzprotein reagiert mit dem bereits vorhandenen korrespondierenden Resistenzprotein und löst die pflanzliche Abwehrmaßnahmen (ETI) aus. Deshalb fuhrt dies in der Regel schon dazu, dass entweder die Vitalität dieser transformierten Zellen auch ohne "echte Pathogeninfektion" bereits stark eingeschränkt wird oder die transformierten Zellen sogar kontrolliert zum Absterben gebracht werden. Dieser Umstand hat vor Allem die
Transformation von Avirulenzgenen, die für Induktoren von zelltodauslösenden HR-Reaktionen in Gegenwart eines korrespondierenden Resistenzproteins kodieren, und die erfolgreiche Regeneration der transformierten Zellen zu vitalen Pflanzen bislang gänzlich verhindert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung wurde vor dem Hintergrund des vorstehend beschriebenen Stands der Technik gemacht, wobei es Aufgabe der vorliegenden Erfindung war, eine transgene pathogenresistente Pflanze bereitzustellen, in welcher mittels einer stabilen Integration eines pathogenen Induktors eine stringent regulierte Resistenzprotein-vermittelten pflanzliche Abwehrreaktion mit Zelltodauslösung infolge einer Pathogeninfektion stattfindet.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der gestellten Aufgabe durch eine pathogenresistente Pflanze, umfassend mindestens zwei stabil in das Genom integrierte Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäuren
(i) für unterschiedliche Teile eines Avirulenzproteins kodieren und
(ii) mit Promotoren operativ verknüpft sind,
und mindestens einer der Promotoren Pathogen-induzierbar ist, so dass in einer Zelle der Pflanze infolge einer Infektion der Pflanze durch den Pathogen die unterschiedlichen Teile des
Avirulenzproteins synthetisiert vorliegen und mit einem korrespondierenden Resistenzprotein direkt oder indirekt reagieren.
Einige der in dieser Anmeldung verwendeten Begriffe werden nachfolgend zunächst näher erläutert:
Ein "Avirulenzprotein" wird durch ein "Avirulenzgen" kodiert und stellt ein Effektormolekül eines Pathogens dar, welches bei der Pathogenerkennung durch die pflanzliche Immunabwehr eine
wesentliche Rolle spielt. Im Zusammenhang mit der pflanzlichen Pathogenabwehr zeichnet sich ein Avirulenzprotein funktionell dadurch aus, dass es in der Lage ist, direkt oder indirekt mit einem korrespondierenden Resistenzprotein, sofern dieses vorhanden ist, in einer pflanzlichen Zelle zu reagieren, was dann zur Auslösung einer pflanzlichen Pathogenabwehrreaktion führt. Somit erzielte physiologische Reaktionen der Pflanze sind beispielsweise eine Hypersensitiven Reaktion (HR), eine weitere Verstärkung der Zellwand durch Lignifizierung und Kallosenbildung, die Synthese von Phytoalexinen, die Produktion von PR-(pathogenesis-related)-Proteinen und bevorzugt auch der kontrollierten Zelltod des Wirtsgewebes insbesondere am Ort der Pathogeninfektion.
Avirulenzproteine können sich unterscheiden im Bezug auf den Grad ihrer Induktionsfähigkeit für eine zelltodauslösende HR-Reaktion in Gegenwart eines korrespondierenden Resistenzproteins. Ob ein Avirulenzprotein als starker oder schwacher Induktor in einer pflanzlichen Zelle fungiert, beruht im Wesentlichen auf der Wirksamkeit des korrespondierenden Resistenzproteins in der
Pflanzenspezies, in welche das AvirulenzgenAprotein eingebracht wird. Wurde das Resistenzgen, welches das Resistenzprotein kodiert, mittels gentechnologischer Verfahren in eine Pflanze eingebracht, welche dieses Resistenzgen natürlicherweise nicht enthält, können weitere Faktoren wie z.B. ein Positionseffekt eines bestimmten Integrationsorts oder die Induzierbarkeit des mit dem Resistenzgen-verknüpften Promotors ebenfalls Auswirkungen auf die Wirksamkeit eines
Resistenzprotein und damit auch auf die Induktionsleistung eines Avirulenzproteins in dieser Pflanze haben.
Der hier verwendete Begriff "hybridisieren" bedeutet hybridisieren unter üblichen Bedingungen, wie sie in Sambrook et al. (1989) beschrieben sind, bevorzugt unter stringenten Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 x SSC bei 65 °C und
anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 x SSC bei 65 °C für insgesamt etwa 1 Stunde. Der hier verwendete Begriff "stringente Hybridisierungsbedingungen" kann auch bedeuten: Hybridisieren bei 68 °C in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA und 1 % BSA für 16 Stunden und anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 x SSC und 0,1 % SDS bei 68 °C.
Unter "Infektion" ist der früheste Zeitpunkt zu verstehen, bei dem der Stoffwechsel eines Pathogens auf eine Penetration des Wirtsgewebes vorbereitet wird. Dazu gehören z.B. bei Pilzen das Auswachsen von Hyphen oder die Bildung von spezifischen Infektionsstrukturen wie Penetrationshyphen und Appressorien. Eine "echte Pathogeninfektion" umfasst jegliche Infektion einer Pflanze mit einem Pathogen bzw. jegliche Verwundung, infolgedessen eine Pathogeninfektion stattfindet kann.
Ausgeschlossen sind jedoch Pathogeninfektionen und Verwundungen von Pflanzen und pflanzlichen Zellen, welche beabsichtigt und gezielt im Zuge eines gentechnologischen Verfahrens, wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation oder biolistische
Transformation, auftreten.
"Komplementäre" Nukleotidsequenz bedeutet bezogen auf eine Nukleinsäure in Form einer doppelsträngigen DNA, dass der zum ersten DNA Strang komplementäre zweite DNA Strang entsprechend den Basenpaarungsregeln die Nukleotide aufweist, die zu den Basen des ersten Stranges korrespondieren.
Pflanzliche "Organe" meinen beispielsweise Blätter, Sprossachse, Stamm, Wurzeln, vegetative Knospen, Meristeme, Embryos, Antheren, Ovula oder Früchte. Pflanzliche "Teile" meinen einen Zusammenschluss mehrerer Organe, z.B. eine Blüte oder ein Samen, oder einen Teil eines Organs, z.B. eine Querschnitt durch den Spross. Pflanzliche "Gewebe" sind zum Beispiel Kallusgewebe, Speichergewebe, meristematische Gewebe, Blattgewebe, Sprossgewebe, Wurzelgewebe,
Pflanzentumorgewebe oder reproduktives Gewebe. Unter pflanzlichen "Zellen" sind beispielsweise isolierte Zellen mit einer Zellwand oder Aggregate davon oder Protoplasten zu verstehen.
Ein "Pathogen" im Zusammenhang mit der Erfindung meint Organismen, die in Interaktionen mit einer Pflanze zu Krankheitssymptomen an einem oder mehreren Organen bei der Pflanze führen. Zu diesen Pathogenen zählen tierische, pilzliche, bakterielle und virale Organismen. Tierische Pathogene umfassen insbesondere solche des Stamms der Fadenwürmer (Nematoda), wie zum Beispiel Spezies der Gattungen Ang ina, Ditylenchus, Globodera, Heterodera, Meloidogyne, Paratrichodorus, Pratylenchus und Trichodorus, und solche der Klasse der Insekten (Insecta), wie zum Beispiel Spezies der Gattungen Agriotes, Aphis, Atomaria, Autographa, Blithophaga, Cassida, Chaetocnema, Cleonus, Lixus, Lygus, Mamestra, Mycus, Onychiurus, Pemphigus, Philaenus, Scrobipalpa und Tipula. Die pilzlichen Pathogene sind beispielsweise ausgewählt aus den Abteilungen Plasmodiophoromycota, Oomycota, Ascomycota, Basidiomycota oder Deuteromycota, dazu gehören zum Beispiel Spezies der Gattungen Actinomycetes, Alternaria, Aphanomyces, Botrytis, Cercospora, Erysiphe, Fusarium, Helicobasidium, Peronospora, Phoma, Phytium, Phytophthora, Pleospora, Ramularia, Rhizoctonia, Typhula, Uromyces und Verticillium. Zu den bakteriellen Pathogenen gehören beispielsweise Spezies der Gattungen Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas, Streptomyces und Xanthomonas und zu den viralen Pathogenen beispielsweise Spezies der Gattungen Benyvirus, Closterovirus, Curtovirus, Luteovirus, Nucleorhabdovirus, Potyvirus und Tobravirus.
Ein "Promotor" ist ein nicht-translatierter DNA-Abschnitt, typischerweise stromaufwärts einer kodierenden Region, welche die Bindestelle für die RNA-Polymerase beinhaltet und die Transkription der DNA initiiert. Ein Promotor enthält zudem andere Elemente, die als Regulatoren der
Genexpression fungieren (z.B. c/s-regulatorische Elemente).
Ein "Kern- oder Minimalpromotor" ist ein Promotor, der zumindest die Grundelemente, welche für die Transkriptionsinitiation gebraucht werden, aufweist (z.B. TATA-Box und/oder Initiator).
Als "synthetischer Promotor" oder "chimärer Promotor" wird hierbei ein Promotor bezeichnet, der so in der Natur nicht vorkommt, aus mehreren Elementen zusammengesetzt ist und einen Kern- oder Minimalpromotor beinhaltet sowie stromaufwärts des Kern- oder Minimalpromotors mindestens ein c i-regulatorisches Element aufweist, welches als Bindungsstelle für spezielle trans- wirkende Faktoren (trans-actingfactors, z.B. Transkriptionsfaktoren) dient. Ein synthetischer oder chimärer Promotor wird den gewünschten Anforderungen nach konzipiert und durch unterschiedliche Faktoren induziert oder reprimiert. Die Wahl des c/'i-regulatorischen Elements oder einer Kombination von cis- regulatorischen Elementen ist entscheidend für die Spezifität und das Aktivitätslevel eines Promotors. In einem synthetischen oder chimären Promotor können ein Kern- oder Minimalpromotor mit einem oder mehreren cw-regulatorischen Elementen funktionell verbunden sein, wobei die Promoter/cis- Element(e)-Kombination(en) aus natürlichen Promotoren nicht bekannt sind oder gegenüber natürlichen Promotoren andersartig ausgestaltet sind. Beispiele sind aus dem Stand der Technik bekannt (WO/00/29592; WO/2007/147395))
Ein "Pathogen-induzierbarer Promotor" ist ein Promotor, der in der Lage ist, das Gen, das er reguliert, in Folge einer Pathogenerkennung und/oder einer Pathogeninfektion und/oder einer Verwundung, welche auch die Folge einer abiotischen Einwirkung sein kann, zu exprimieren.
"Transgene Pflanze" bezieht sich auf einen Pflanze, in dessen Genom mindestens eine heterologe Nukleinsäure (z.B. ein Avirulenzgen oder auch ein Fragment eines Avirulenzgens aus einem bakteriellen Pathogen) stabil integriert wurde, was bedeutet, dass die integrierte Nukleinsäure in der Pflanze stabil erhalten bleibt, exprimiert wird und auch stabil an die Nachkommen vererbt werden kann. Die stabile Integration einer Nukleinsäure in das Genom einer Pflanze schließt auch die Integration in das Genom einer Pflanze der vorhergehenden Parentalgeneration mit ein, wobei die integrierte Nukleinsäure stabil weitervererbt werden kann.
Eine erfindungsgemäße pathogenresistente Pflanze weist mindestens zwei stabil in das Genom integrierte Nukleinsäuren auf. Jede dieser Nukleinsäuren ist charakterisiert durch eine
Nukleotidsequenz, die für jeweils einen unterschiedlichen Teil eines Avirulenzproteins kodiert.
Demnach stellen die Nukleinsäuren unterschiedliche Fragmente von ein und demselben Avirulenzgen dar. Jede Nukleinsäure umfasst mindestens ein Fragment des Avirulenzgens.
Zwei oder mehr Nukleinsäuren können Nukleotidsequenzen aufweisen, die für zwei oder mehr unterschiedliche Teile des Avirulenzproteins mit abschnittsweise identischen oder ähnlichen
Aminosäuresequenzen kodieren. Abschnittsweise meint, dass keine Aminosäuresequenz in seiner gesamten Länge zu 100% identisch oder ähnlich in einer anderen Aminosäuresequenz vorhanden ist. Identische Aminosäuresequenzen sind solche, deren Aminosäureabfolgen einander entsprechen, ähnliche Aminosäuresequenzen zeigen eine oder mehrere konservative und/oder semi-konservative
Aminosäuresubstitutionen basierend auf ähnlichen physio-chemischen Eigenschaften der unterschiedlichen Aminosäuren. Abschnittsweise identische oder ähnliche Aminosäuresequenzen können auch endständig überlappend sein, so dass beispielsweise eine Sequenz am C-Terminus eine identische oder ähnliche Sequenz mit einer anderen Sequenz am N-Terminus aufweist. Bevorzugt überlappen solche Aminosäuresequenzen über eine Länge von mehr als 3 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, besonders bevorzugt über eine Länge von mindestens 1 1 aufeinanderfolgenden Aminosäuren. Ähnliche überlappende Aminosäuresequenzen weisen eine Ähnlichkeit von 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% in dem überlappenden Sequenzbereich auf, identische überlappende Aminosäuresequenzen stimmen in dem überlappenden Sequenzbereich überein. Die Übereinstimmung kann gemäß bekannter Verfahren, z.B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Altschul et al., 1990), bestimmt werden.
Eine Nukleinsäure kann auch durch Addition, Substitution oder Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden weiter modifiziert sein. Zum Beispiel kann eine Nukleinsäure mit einem Start-Codon ATG (Translationsstart) und/oder Stoppcodon versehen werden, um eine stabile Translation der Nukleinsäure in einer Pflanzenzelle zu gewährleisten, oder Intron-Sequenzen können deletiert werden. Derartige Modifikationen und deren Durchführung sind dem Fachmann bekannt. Modifizierte Nukleinsäuren, schließen auch solche Nukleinsäuren ein, die unter üblichen Bedingungen (Sambrook et al. 1989), bevorzugt unter stringenten Bedingungen mit der entsprechenden nicht-modifizierten Nukleinsäure hybridisieren oder auf DNA-Level eine Homologie von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%>, 96%, 97%, 98% oder 99% zu der nicht-modifizierten Nukleinsäure zeigen. Die von einer modifizierten Nukleinsäure kodierte Aminosäuresequenz eines Avirulenzproteinteils kann eine Identität von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder eine
Ähnlichkeit von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit der originären Aminosäuresequenz aufweisen.
Ein einzelnes Fragment des Avirulenzgens kodiert für einen nicht-funktionellen Teil des
Avirulenzproteins. Dies bedeutet, dass anders als das gesamte Avirulenzprotein, ein einzelner Teil des Avirulenzproteins für sich, wenn er in einer Zelle einer Pflanze synthetisiert vorliegt, dort in keinem Fall als Induktor einer pflanzlichen Resistenzprotein-vermittelten Pathogenabwehrreaktion funktioniert. Liegen jedoch sämtliche unterschiedlichen nicht-funktionellen Teile desselben
Avirulenzproteins, kodiert durch die stabil in das Genom integrierten Nukleinsäuren, gemeinsam in einer pflanzlichen Zelle synthetisiert vor, vermitteln alle synthetisierten Teilproteine gemeinsam die Wirkung des kompletten Avirulenzproteins (Komplementation der Avirulenzprotein-Wirkung), indem sie direkt oder indirekt mit dem korrespondierenden Resistenzprotein reagieren. Das Ausmaß der hierbei erreichten Zelltodauslösung ist jedoch nicht zwangsläufig vergleichbar mit demjenigen, welches durch die Reaktion des gesamten Avirulenzproteins mit dem korrespondierenden
Resistenzprotein bewirkt werden würde. So kann beispielsweise durch die Substitution einer einzelnen Aminosäure in einem Teilprotein bereits nach Komplementation der Grad der Zelltodauslösung gesteigert werden, umgekehrt kann beispielsweise eine vermehrte N-terminale Deletion von
Aminosäuren bei einem Teilprotein eine deutliche Abschwächung der Zelltodauslösung herbeiführen. Dies zeigt, dass mit Hilfe von Modifikationen der Aminosäurensequenz eines Teilproteins bereits das Ausmaß der durch die Komplementation induzierten Zelltodauslösung also die Wirksamkeit des Induktors kontrolliert werden kann. Somit ist die Intensität der durch den transgenen Induktor bewirkten Pathogenabwehrreaktion kontrollierbar und vorbestimmt.
Erfindungsgemäß einsetzbare Nukleinsäuren können aus einem solchen Avirulenzgen eines Pathogens entnommen werden, welches für ein Avirulenzprotein kodiert, das
a) in der zur genomischen Integration vorgesehenen Pflanze bzw. in mindestens einer Zelle dieser Pflanze ein korrespondierendes Resistenzprotein vorfindet, mit dem das Avirulenzprotein direkt oder indirekt reagieren kann und infolgedessen dann eine pflanzliche Pathogenabwehrreaktion induziert wird, und
b) in mindestens zwei unterschiedliche Proteinteile zerlegt werden kann, wobei die
unterschiedlichen Teile des Avirulenzproteins jeweils für sich genommen keine Induktoren einer pflanzlichen Pathogenabwehrreaktion darstellen, jedoch dann, wenn die unterschiedlichen Teile des Avirulenzproteins synthetisiert in einer Zelle der zur genomischen Integration vorgesehenen Pflanze gemeinsam vorliegen, mit dem anwesenden, korrespondierenden Resistenzprotein direkt oder indirekt reagieren und infolgedessen dann eine pflanzliche Pathogenabwehrreaktion induziert wird.
Beispielsweise erfüllt ein Avirulenzgen mit eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ IE) NO: 3 sowie Varianten davon die vorstehenden Erfordernisse. Solche Nukleotidsequenzen kodieren beipielsweise für Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4.
Bevorzugt werden Avirulenzgene eingesetzt, die für einen starken Induktor in einer pflanzlichen Zelle kodieren, und damit effizient einen HR-vermittelten Zelltod herbeiführen können.
Zudem kann ein geeignetes Avirulenzgens unter Beibehaltung der originären Aminosäuresequenz des Avirulenzproteins aus dem Pathogen entsprechend der Degeneration des genetischen Codes verändert sein. Darüber hinaus kann auch, bevor die erfindungsgemäß einsetzbaren Nukleinsäuren entnommen werden, die Nukleotidsequenz eines geeigneten Avirulenzgens modifiziert werden, um beispielsweise die Wirksamkeit, die Spezifität und/oder die Aktivität des Avirulenzproteins zu ändern, oder um beispielsweise ein vorhandenes Intron zu entfernen. Modifikationen können durch Addition,
Substitution oder Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden herbeigeführt werden. Die
Durchführung derartiger Modifikationen ist dem Fachmann durchaus bekannt. In jedem Fall sollte ein modifiziertes Avirulenzgen weiterhin ein solches Avirulenzprotein kodieren, das die vorstehenden Erfordernisse a) und b) erfüllt. Zudem hybridisiert die Nukleotidsequenz eines modifizierten
Avirulenzgens unter üblichen Bedingungen (Sambrook et al. 1989), bevorzugt unter stringenten Bedingungen mit der nicht-modifizierten Nukleotidsequenz oder zeigt auf DNA-Level eine
Homologie von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu der nicht- modifizierten Nukleotidsequenz. Die kodierte Aminosäuresequenz weist eine Identität von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder eine Ähnlichkeit von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit der nicht-modifizierten Aminosäuresequenz auf.
Genannte genetische Modifikationen können auch dafür verwendet werden, um ein nicht-geeignetes Avirulenzgen eines Pathogens in einer Weise abzuändern, so dass es dann die vorstehenden
Erfordernisse a) und b) erfüllt, um dann daraus erfindungsgemäß einsetzbare Nukleinsäuren zur Intergration in das Genom einer Pflanze und zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Pathogenresistenten Pflanze zu gewinnen.
Erfindungsgemäß einsetzbarer Nukleinsäuren aus einem geeigneten Avirulenzgen können mit einem Verfahren, das die nachfolgenden fünf Schritte umfasst, zuverlässig identifiziert werden.
(1 ) Erzeugung von unterschiedlichen Nukleinsäuren, die Fragmente des kodierenden Bereichs eines Avirulenzgens umfassen.
Dieser erste Verfahrensschritt kann mittels Standard DNA Klonierungstechniken durchgeführt werden (Sambrook et al. 1989). Beispielsweise kann durch Einführung von neuen Translationsstarts und/oder Stoppcodons vom 5'- und/oder 3'-Ende her eine Verkürzung des Avirulenzgens erreicht werden. Auf diesem Wege können dann mehrere N- und/oder C-terminal verkürzte Teile des Avirulenzproteins in den nächsten Verfahrensschritten (2) und (3) synthetisiert werden.
(2) Transiente Expression einzelner Nukleinsäuren aus Schritt (1 ) unter der Kontrolle eines
konstitutiven Promotors in pflanzlichen Zellen, die ein zu dem Avirulenzprotein
korrespondierendes Resistenzprotein bereitstellen.
Hierfür kann der Fachmann auf die üblichen und bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik zurückgreifen. Beispielsweise beschreibt Schmidt et al., 2004, ein transientes Expressionssystem in Zellen eines pflanzlichen Blattgewebes auf der Grundlage von biolistischen Transfertechniken. Die transiente Expression ist in Zellen einer solchen Pflanzenart durchzuführen, für welche eine
Pathogenresistenz etabliert werden soll. Dementsprechend ist auch der konstitutive Promotor in der Weise auszuwählen, dass er in einer Zelle dieser Pflanze funktionsfähig ist (z.B. doppelter 35S
^ ^
Promotor). Bevorzugt ist die transiente Expression auf Zellen solcher Organe, Gewebe oder
Pflanzenteile zu beschränken, die als Pathogen-typische Infektionsorte bekannt sind.
(3) Selektion einzelner Nukleinsäuren, deren Expression in Schritt (2) nicht zu einem HR- vermittelten Zelltod geführt hat.
Um die Zelltodauslösung in Schritt (3) zu detektieren und zu quantifizieren kann ein
Nachweisverfahren der Vitalität von pflanzlichen Zellen genutzt werden. Hierfür bietet sich beispielsweise an, die Expression der in Schritt ( 1 ) erzeugten Nukleinsäuren und/oder des kompletten Avirulenzgens als Referenz in Gegenwart von mindestens zwei Reportergenen, wie z.B. die
Luciferasereportergene aus Photinns pyralis und Renilla reniformis durchzuführen.
(4) Transiente Coexpression von mindestens zwei selektierten Nukleinsäuren aus (3) jeweils unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors in pflanzlichen Zellen, die ein zu dem
Avirulenzprotein korrespondierendes Resistenzprotein bereitstellen.
Ebenso wie in Schritt (2) kann der Fachmann auf die üblichen und bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik zurückgreifen. Die notwendigen Anforderungen an die Auswahl der
transformierten Zellen und der einsetzbaren konstitutiven Promotoren entsprechen denjenigen aus Schritt (2).
(5) Identifikation von mindestens zwei selektierten Nukleinsäuren, deren Co-Expression in Schritt (4) zu einem HR-vermittelten Zelltod geführt hat.
In einer bevorzugten Ausführung ist die Zelltodauslösung vergleichbar mit derjenigen, welche durch die Expression des vollständigen Avirulenzgens unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors bewirkt wird. Die Detektion und Quantifizierung kann auf in Schritt (3) beschriebenes
Nachweisverfahren zurückgegriffen werden.
Mit Hilfe des vorstehenden Verfahrens identifizierte Nukleinsäuren, isoliert aus einem Avirulenzgen, sind zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pathogenresistenten Pflanze geeignet, da die
Syntheseprodukte dieser Nukleinsäuren gemeinsam in einer Zelle der Pflanze als Induktor einer Pathogenabwehrreaktion dienen. Um sicherzustellen, dass diese Induktion beabsichtigt bzw.
gewünscht stattfindet, ist die Regulation und Kontrolle der Expression der eingesetzten Nukleinsäuren in der pathogenresistenten Pflanze in nachfolgender Weise auszugestalten.
Die stabil integrierten Nukleinsäuren einer erfindungsgemäßen pathogenresistenten Pflanze sind jeweils operativ verknüpft mit einem Promotor, welcher die Expression der entsprechenden
Nukleinsäure reguliert. Mindestens einer dieser Promotoren ist Pathogen-induzierbar, und zwar wird dieser Promotor aktiviert infolge einer Infektion der Pflanze durch denjenigen Pathogen bzw. durch
diejenigen Pathogene, gegenüber welchen bzw. welche eine Resistenz in der erfindungsgemäßen Pflanze letztendlich etabliert werden soll. Dies bedeutet, dass die Expression der mit dem Pathogen- induzierbaren Promotor operativ verknüpften Nukleinsäure erst infolge einer Infektion der Pflanze durch den Pathogen bzw. die Pathogene stattfindet und somit auch der kodierte Teil des
Avirulenzproteins erst im Anschluss in Zellen der Pflanze synthetisiert vorliegt. Die Promotoren, welche operativ mit den verbleibenden Nukleinsäuren verknüpft sind, sind dadurch charakterisiert, dass sie eine solche Spezifität aufweisen, die sicherstellt, dass zum Zeitpunkt, wenn der Teil des Avirulenzproteins unter der Kontrolle des genannten Pathogen-induzierbaren Promotors in einer infizierten Zelle der Pflanze synthetisiert vorliegt, auch die verbleibenden Teile des Avirulenzproteins in dieser Zelle synthetisiert vorliegen. Dies wird dadurch realisiert, dass die Promotoren, welche operativ mit den verbleibenden Nukleinsäuren verknüpft sind, eine solche Spezifität aufweisen, dass mit dem genannten Pathogen-induzierbaren Promotor eine räumlich, eine zeitlich und/oder eine andersartig überlappende Expressionsregulation der operativ verknüpften Nukleinsäuren sichergestellt wird. Beispielsweise können drei Promotoren eine überlappende Expressionsregulation aufweisen, von denen einer Fruchtgewebe-spezifisch, ein weiterer Fruchtreife-spezifisch und ein dritter
Pilzpathogen-spezifisch ist. Eine überlappende Expression der mit den drei Promotoren operativ verknüpften Nukleinsäuren findet dann nur nach Pilzbefall der Frucht und nur in der reifenden Frucht selbst statt. Als Promotoren zur Regulation der verbleibenden Nukleinsäuren können prinzipiell sämtliche bekannten Promotoren eingesetzt werden, dazu gehören beispielhaft konstitutive, gewebespezifische, organspezifische, lagerungsinduzierte, entwicklungsspezifische oder auch Pathogen-induzierbare Promotoren.
Zum Erreichen einer breiten Pathogenresistenz ist der genannte Pathogen-induzierbare Promotor so auszuwählen, dass er durch möglichst viele Pathogene bzw. Pathogenklassen wie Viren, Bakterien, Pilzen und/oder Tieren, induziert werden kann. Je spezifischer einer der verwendete Pathogen- induzierbare Promotoren für beispielsweise einen bestimmten Pathogen oder einen bestimmten Teil einer Pathogenklasse ist, desto stärker wird auch das Spektrum an Pathogenen, gegenüber welchen letztendlich in der erfindungsgemäßen Pflanze eine gesteigerte Resistenz erreicht wird, eingeschränkt. Vorzugsweise sind unterschiedliche Pathogen-induzierbare Promotoren einzusetzen, da dadurch die Spezifität gegenüber abiotischen Stimuli deutlich gesteigert werden kann.
Bevorzugt lässt der Pathogen-induzierbare Promotor zudem eine Expression der regulierten
Nukleinsäure lokal begrenzt auf den Ort einer Pathogeninfektion oder einer Verwundung zu
(Strittmatter et al., 1996; Rushton et al, 2002). Vorteilhaft wäre auch die Verwendung eines Pathogen- induzierbaren Promotors, der direkt oder indirekt durch ein pathogenes Effektormolekül, welches von zahlreichen Pathogenen bzw. Pathogenklassen abgegeben wird, aktiviert wird. Ein solches
Effektormoleküle ist beispielsweise das bekannte PEP25. Ebenso können insbesondere Pathogen-
induzierbare Promotoren, die infolge einer Verwundung entweder direkt oder indirekt induziert werden, vor allem zur Abwehr von in die Zelle/Pflanze penetrierenden Pathogenen eingesetzt werden. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von pathogen-induzierbaren Promotoren, deren Aktivierung direkt oder indirekt durch die pflanzliche PAMP-/MAMP-Erkennung vermittelt wird. So wird sobald der Pathogen durch einen Pathogen-responsiven Transmembran-Rezeptor erkannt wird, also noch bevor oder während der Pathogen in die Zelle/Pflanze eindringt, schon die unterschiedlichen Teile des Avirulenzproteins im Zellinneren gemeinsam bereitgestellt, woraufhin als Folge der Reaktion mit dem korrespondierenden Resistenzprotein eine ETI auslöst. Durch diesen "Kurzschluss" zwischen der PAMPTMAMP-Erkennung und der ETI ist die Reaktionszeit von Pathogenerkennung bis hin zur ETI deutlich verkürzt, und die Resistenzleistung deutlich gesteigert.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist mindestens ein Promotor zur Regulation der Expression der Nukleinsäuren ein synthetischer oder chimärer Promotor. In einer besonders bevorzugten
Ausgestaltung ist mindestens einer der Pathogen-induzierbaren Promotoren ein synthetischer oder chimärer Promotor. Der Grund hierfür liegt darin, dass bislang gewöhnlich die pflanzlichen Pathogen- induzierbaren Promotoren vor Allem von pathogenresponsiven Genen verwendet wurden, deren Spezifität teilweise durch eine Verkürzung noch verbessert werden konnte (Martini et al., 1993). Da diese pathogenresponsiven Gene (z.B. PR-Proteingene) aber nicht nur unter biotischem Stress, sondern auch in Reaktion auf abiotischen Stress, hormonelle Veränderungen und diverse
Entwicklungsreize, aktiviert werden, ist das Erlangen einer ausreichenden bzw. ausschließlichen Pathogenspezifität technisch schwierig zu realisieren (Stahl et al., 2006). Synthetische oder chimäre Promotoren dagegen enthalten lediglich die Sequenzmotive (z.B. c s-regulatorische Elemente) aus natürlichen, Pathogen-induzierbaren Promotoren, die für die Pathogeninduktion relevant sind.
Sequenzmotive für andere Stimuli wurden dagegen entfernt. Die c s-regulatorischen Elemente wurden stromaufwärts eines Minimalpromotors kloniert, wodurch ein funktioneller Promotor erzeugt wurde, der eine erhöhte Spezifität im Vergleich zu den natürlichen Promotoren aufweist, aus denen die jeweiligen cw-regulatorischen Elemente isoliert wurden (Rushton et al., 2002).
Aus dem Stand der Technik sind bereits diverse c/'s-regulatorische Elemente zur Vermittlung einer Pathogeninduzierbarkeit eines Promotors bekannt (siehe z.B. WO/00/29592).
Grundsätzlich kann jedes pathogenresponsive c/'s-regulatorische Element in einem synthetischen oder chimären, Pathogen-induzierbaren Promotor eingesetzt werden. Solche cis-regulatorischen Elemente können in multiplen Kopien und/oder in Kombination miteinander und/oder mit anderen cis- regulatorischen Elementen in einem synthetischen oder chimären Promotor vorliegen.
Die einsetzbaren Nukleinsäuren, die zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pathogenresistenten Pflanze geeignet sind, bilden operativ verbunden mit den spezifischen und aufeinander abgestimmten Promotoren eine Zusammensetzung von Nukleinsäuren, die mindestens zwei Nukleinsäuren zur Integration in ein Genom einer Pflanze umfasst, wobei die Nukleinsäuren
(i) für unterschiedliche Teile eines Avirulenzproteins kodieren und
(ii) mit Promotoren operativ verknüpft sind,
und mindestens einer der Promotoren Pathogen-induzierbar ist, so dass in einer Zelle der Pflanze infolge einer Infektion der Pflanze durch den Pathogen die unterschiedlichen Teile des
Avirulenzproteins synthetisiert vorliegen und mit einem korrespondierenden Resistenzprotein direkt oder indirekt reagieren.
Die Pathogenresi Stenz der erfindungsgemäßen Pflanze wird durch die direkte oder indirekte Reaktion der synthetisierten Teile des Avirulenzproteins mit einem bereits in einer Zelle der Pflanze vorhandenen zu dem Avirulenzprotein korrespondierenden Resistenzprotein vermittelt (Flor, 1971 ; Dangl & Jones, 2001 ; Jones & Dangl, 2006). Das Resistenzgen, welches für das Resistenzprotein kodiert, ist entweder bereits natürlich im Genom der erfindungsgemäßen Pflanze enthalten oder über gentechnologische oder züchterische Verfahren eingefügt worden (Keller et al., 1999; Belbahri et al., 2001 ).
Eine erfindungsgemäße Pflanze kann von jeder Spezies aus den dikotyledonen, monokotyledonen und gymnospermen Pflanzen sein. Beispielsweise können solche Pflanzen ausgewählt sein aus den Spezies folgender Gruppe: Arabidopsis, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Baumwolle, Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sorghum, Tomate, Banane, Melone, Kartoffel, Karotte, Soja ssp., Zuckerrohr, Wein, Roggen, Hafer, Raps, Rasen- und Futtergras. Eine erfindungsgemäße Pflanze ist vorzugsweise eine Pflanze der Gattung Beta. Von der Erfindung sind ebenfalls auch ein Samen, ein Teil, ein Organ, ein Gewebe oder eine Zelle der erfindungsgemäßen Pflanze miterfasst.
Um bei der Herstellung einer erfindungsgemäßen Pflanze einen unerwünschten Zelltod (z.B. infolge einer Hypersensitiven Reaktion) oder eine andere negative Beeinflussung der Zellen der Pflanze, die Auswirkungen auf die agronomischen Eigenschaften der Pflanze haben könnte, zu vermeiden, ist darauf zu achten, dass während der Herstellung zu keinem Zeitpunkt die unterschiedlichen Teile eines Avirulenzproteins, welche nach Reaktion mit dem korrespondierenden Resistenzprotein zu einer erfolgreichen Induktion einer Pathogenabwehrreaktion führen, in einer Zelle der Pflanze synthetisiert vorliegen. Demzufolge kann für die Integration der entsprechenden Nukleinsäuren in ein gemeinsames pflanzliches Genom nicht auf die gebräuchlichen Techniken der Pflanzentransformation
zurückgegriffen werden, da deren Durchführung eine Pathogenerkennung durch die Pflanze bedingt, welche die Aktivierung des Pathogen-induzierbaren Promotors verursacht (z.B. Agrobacterium
tumefaciens- vermittelte Transformation), oder diese Verfahren so invasiv sind, dass die verursachten Verwundungen zur Induktion eines Pathogen-induzierbaren Promotors führen (z.B. biolistische Transformation). Aber gerade diese Aktivierung des Pathogen-induzierbaren Promotors würde als Trigger zum falschen Zeitpunkt und am falschen Ort unbeabsichtigt die Induktion der pflanzlichen Pathogenabwehrreaktion bewirken.
Ein geeignetes Herstellungsverfahren, das eine Aktivierung von Pathogen-induzierbaren Promotoren umgeht, ist beispielsweise die Kreuzung zweier transgener Elternpflanzen, wobei jede dieser Elternpflanzen dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mit mindestens einer, aber nicht mit allen Nukleinsäuren aus der Zusammensetzung von Nukleinsäuren stabil transformiert wurde und selber nicht die für die Nachkommen beabsichtigte Pathogenresistenz aufweist. Zudem ist zu beachten, dass eine Elternpflanze mindestens diejenige(n) Nukleinsäure(n) aus der Zusammensetzung von
Nukleinsäuren umfasst, die die andere Elternpflanze nicht aufweist, und sie mindestens eine
Nukleinsäure aus der Zusammensetzung von Nukleinsäuren nicht enthält, die aber die andere Elternpflanze aufweist. Exemplarisch könnten die beiden Pflanzen folgende genetische Ausstattung zeigen: Die erste Elternpflanze ist gekennzeichnet durch eine stabil in das Genom integrierte
Nukleinsäure, die für einen ersten Teil des Avirulenzproteins kodiert und operativ verknüpft ist mit einem Pathogen-induzierbaren Promotor. Die zweite Elternpflanze ist gekennzeichnet durch eine stabil in das Genom integrierte Nukleinsäure, die für einen zweiten Teil des Avirulenzproteins kodiert und operativ verknüpft ist mit einem Promotor mit einer Spezifität, die eine mit dem Pathogen- induzierbaren Promotor überlappende Expressionsregulation aufweist. Der erste und zweite Teil des Avirulenzproteins sind unterschiedlich. Die stabil in das Genom integrierten Nukleinsäuren der ersten und zweiten Elternpflanze werden während der Kreuzung an einen Nachkommen der beiden Pflanzen vererbt. Diese erzeugte Pflanze stellt eine erfindungsgemäße pathogenresistente Pflanze dar. Das Resistenzgen, das für das zum Avirulenzprotein korrespondierende Resistenzprotein kodiert, ist mindestens in einer zur Kreuzung eingesetzten Pflanze vorhanden und ist an die hergestellte erfindungsgemäße Pflanze während der Kreuzung weitervererbt worden. Neben den Elternpflanzen zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pathogenresistenten Pflanze betrifft die Erfindung auch Samen, Teile, Organe, Gewebe oder Zellen dieser Pflanzen, sowie die Verwendung dieser zum Zwecke der Herstellung einer erfindungsgemäßen Pflanze.
Zur stabilen genomischen Integration der Nukleinsäuren in das jeweilige Genom der Elternpflanze kann der Fachmann auf die üblicherweise verwendeten Verfahren zurückgreifen. Dabei ist es beispielsweise möglich, dass die vorstehend genannte erste Elternpflanze selbst Agrobacterium tumefaciens-vermi te transformiert wird, denn auch wenn dies zu einer Induktion des Pathogen- induzierbaren Promotors führt, ist das Ergebnis der resultierenden Expression der operativ verknüpften Nukleinsäure ein nicht-funktioneller Teil des Avirulenzproteins. Dieser Teil des Avirulenzproteins ist
allein nicht in der Lage als Reaktion auf das verwendete Transformationsverfahren als Induktor einer Pathogenabwehrreaktion zu fungieren.
Für eine stabile Vererbung der Nukleinsäuren und des Resistenzgens von den Elternpflanzen auf die erfindungsgemäße pathogenresistente Pflanze im Zuge des Kreuzungsprozesses können die
Elternpflanzen beispielsweise doppelhaploid, oder zumindest homozygot für die jeweilige(n) Nukleinsäure(n) und/oder für das Resistenzgen sein. Die Herstellung solcher Pflanzen ist dem Fachmann durchaus bekannt (Gürel et al., 2000).
Bei der erfindungsgemäßen Pflanze kann es sich auch um eine hybride Pflanze (Hybrid) handeln, die neben der gesteigerten Resistenz gegenüber mindestens einem Pathogen aufgrund des Heterosis- Effekts auch andere vorteilhafte agronomische Eigenschaften aufweisen kann. Solche Eigenschaften sind beispielsweise verbesserte Toleranzen gegenüber abiotischen oder biotischen Stress, gesteigerter Ertrag, etc. Zur Erzeugung von hybriden Pflanzen ist es vorteilhaft Inzucht-Pflanzen als
Elternpflanzen zu verwenden. Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Pflanze in einem
Hybridsystem bedingt, dass die Elternpflanzen der hybriden Nachkommen die Pathogenresistenz gegenüber mindestens einem Pathogen vermittelt durch die Syntheseprodukte der Nukleinsäuren noch nicht aufweisen. Erst in den Hybriden (Fl -Generation) wird dieses Merkmal ausgeprägt. Populationen von Nachkommen der Fl -Hybriden (F2, F3, etc. Generationen) neigen aufgrund von Segregation dazu die Pathogenresistenz wieder zu verlieren. Unter kommerziellen Gesichtpunkten ist ein solches Hybridsystem hochinteressant.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die angehängten Figuren und Sequenzen beschrieben:
FIG 1 : Darstellung der 5'- und 3 '- Verkürzungen im pthG-Gen, die für die funktionelle
Charakterisierung des PthG-Protein erstellt wurden. Die Lage der im Protein deletierten N- und C- terminalen Bereiche ist dunkelgrau und die der verbleibenden Bereiche hellgrau dargestellt. Die von den DNA-Fragmenten kodierten Aminosäuresequenzen sind durch tiefergestellte Zahlen
wiedergegeben (z. B. pthG62-488 codiert für das PthG-Protein von Aminosäureposition Position 62 bis 488.
FIG 2: Nachweis von nicht-funktionellen Teilen des Avirulenzproteins PthG durch transiente Coexpression von Nukleinsäuren in Blättern einer Beta vw/gam-Pflanze. Die Höhe der
Reportergenaktivität ist ein Maß für die Vitalität der transformierten Beta vulgaris-Zdlen. Messwerte sind angegeben als Mittelwerte von 3 Versuchen + SD. Als Kontrolle dient der Leervektor ohne pthG- Gen. 100 % Enzymaktivität = kein Zelltod, 0 % Enzymaktivität = vollständiger Tod der
transformierten Zellen. Die mit a gekennzeichneten Konstrukte unterscheiden sich statistisch signifikant von den übrigen Konstrukten.
FIG 3: Schematische Darstellung der Ergebnisse zur Identifizierung der für die Zelltodauslösung notwendigen funktionellen Bereiche des PthG-Protein. Die DNA-Fragmente, die nach transienter Expression einen Zelltod auslösen können, sind schwarz dargestellt. Die verkürzten DNA-Fragmente des pthG-Gens, die keinen Zelltod mehr auslösen konnten, sind hellgrau wiedergegeben.
FIG 4: Nachweis der Komplementierung der Avirulenzgenfunktion (Zelltodauslösung) durch
Coexpression verkürzter inaktiver pthG-Genfragmente. Durch Coexpression der DNA-Sequenzen pthGi-255 mit der DNA-Sequenz pthGi 21-488 kann die Funktion der Zelltodauslösung restauriert werden. Linke Darstellung: Normalisierte Reportergenaktivitäten (Luziferase) nach transienter Expression von pthG-Genfragmenten in Zuckerrübenblättern. Dargestellt der Mittelwert eines repräsentativen Experimentes mit 6 biologischen Replikaten pro Konstrukt. Als Kontrolle dient der Leervektor ohne pthG-Gen. 100 % Enzymaktivität = kein Zelltod, 0% Enzymaktivität = vollständiger Tod der transformierten Zellen. Die mit a gekennzeichneten Konstrukte unterscheiden sich statistisch signifikant von den übrigen Konstrukten.
Rechte Darstellung: Größe und Anzahl der bei dem Experiment pro Ansatz exprimierten PthG- Proteinfragmenten .
FIG 5: Nachweis der für die Komplementation minimal notwendigen Sequenzen des pthG-Gens durch transiente Coexpression in Zuckerrübenblättern. Durch Kombination unterschiedlicher pthG- Gensequenzen im Komplementationsexperiment kann die Intensität der Zelltodauslösung quantitativ gesteuert werden.
Die Höhe der relativen Reportergenaktivität ist ein Maß für die Vitalität der transformierten Beta vw/garä-Zellen. Messwerte sind angegeben als Mittelwerte von 3 Versuchen ± SD. Als Kontrolle dient der Leervektor ohne pthG-Gen. 100 % Enzymaktivität = kein Zelltod, 0 % Enzymaktivität = vollständiger Tod der transformierten Zellen.
FIG 6: Funktionelle Charakterisierung der mit den Sequenzen pthGi2i-488 und pthGi.255 stabil transformierter Zuckerrüben. Durch einen transienten Komplementationstest wird die Eignung jeder unabhängigen Zuckerrüben-Transformanten zur Zelltodauslösung und damit die Intensität der Pathogenabwehr quantitativ bestimmt. Die Höhe der relativen Reportergenaktivität ist ein Maß für die Vitalität der transformierten Beta vw/garä-Zellen. Als Kontrolle dient der Leervektor ohne pthG-Gen. 100 % Enzymaktivität = kein Zelltod, 0 % Enzymaktivität = vollständiger Tod der transformierten Zellen.
A. Die Linien PR144 sind mit dem Konstrukt 2xS-2xD-pthGi2i-488 -kan transformiert.
B. Die Linien PR148 sind mit dem Konstrukt 2xS-2xD-pthG 1.255 -kan transformiert.
FIG 7: Schematische Darstellung einer Pflanzenzelle, in der durch Kreuzung die zwei für die
Komplementation notwendigen pthG-Sequenzen aus zwei unabhängigen transgenen Eiterlinien zusammengeführt worden sind. Die Expression der pthG-Fragmente steht unter der Kontrolle zweier identischer oder unterschiedlicher synthetischer, pathogenspezifischer Promotoren 1 und 2. Die Coexpression der PthG-Proteinfragmente PthGi.255 und PthGn gg löst in Reaktion mit einem noch unbekannten Resistenzprotein eine Hypersensitive Reaktion (Zelltod) bzw. eine starke
Verteidigungsreaktion aus, die zu einer verbesserten Pilzresistenz führt. PAMP =„pathogen- associated molecular pattern" (Signalsubstanzen, die pathogenresponsive Promotoren aktivieren).
FIG 8: Nachweis der Transkriptakkumulation der Gene pthGi.255 und pthGn gg in PR144 x PR148 - Kreuzungen durch qRT-PCR. Normalisierte Transkriptakkumulation von pthGi.255 (A) und pthG, 21 - 88 (B) in /M-v/Tro-Pflanzen der Spezies Beta vulgaris aus (siehe auch Tabelle 6) und in den
Kontrollpflanzen, 3DC4156 und PR167/1 1 , am Tag 0, 1, 2, 4 und 7 nach C. beticola-lnfektion.
Messwerte stellen Mittelwerte von je drei biologischen Replikaten dar.
FIG 9: Nachweis der Reduktion pilzlicher Biomasse und einer verstärkten Pathogenabwehr in PR144 x PR148 - Kreuzungen durch qRT-PCR. Normalisierte Transkriptakkumulation des C. beticola ribosomalen Proteingens 60S (A) und des B. vulgaris-Gens für das BvCoMT (B) in /«-v/Tro-Pflanzen aus PR144 x PR148 - Kreuzungen (siehe Tab. 6) und in den Kontrollpflanzen, 3DC4156 und PR167/1 1 , am Tag 0, 1 , 2, 4 und 7 nach C. beticola-lnfektion. Messwerte stellen Mittelwerte von je drei biologischen Replikaten dar.
FIG 10: Unterschiedliche Entwicklung von PthG Kreuzungen nach der Keimung und im Gewächshaus A: schneller Zelltod eines Zuckerrüben-Keimlings (innerhalb 3 Tagen) aus der Kreuzung PR171/19 x PR 144/4
B: verzögerter Zelltod des Keimlings (innerhalb 8 Tagen) aus der Kreuzung PR 171/19 x PR144/5 ;
C: regenerierte, vitale Zuckerrübenpflanze aus der Kreuzung PR171/19xPR144/19.
D: Bewurzelte regenerierte, vitale Zuckerrübenpflanze aus der Kreuzung PR171/19 x PR144/19.
E: Normales Wachstum von Nachkommen aus der Kreuzung PR171/19 x PR144/19 im Gewächshaus.
Pfeile zeigen Keimlingsgewebe, in denen eine unerwünschte Zelltodauslösung stattgefunden hat.
FIG 1 1 : Nachweis der Transkriptakkumulation der Gene pthG62-255 und pthG 121 -4gg in der PR171/19 x PR144/19 Kreuzung PR5021 -2010-T-003 durch qRT-PCR.
Im Gewächshaus zeigen transgene Zuckerrüben, die nach der Kreuzung die Promotor- Genkombinationen 4xD-pthG 62-255 und 2xS-2xD-pthG 121-488 tragen, 1 1 Tage nach der
Inokulation eine starke Akkumulation sowohl der pthG62-255 als auch der
Transkripte. Die Transkriptmengen sind nach Weltmeier et al. (201 1) gegen ein konstitutiv exprimiertes
Zuckerrübengen normalisiert worden. Die analysierten Pflanzen wurden ausgehend von der
Abstammung PR5021 -2010-T-003 klonal vermehrt und sind genetisch identisch. Kontrolle = nichtinfizierte PR5021 -2010-T-003 Pflanze, Infiziert 1 und Infiziert 2 = zwei infizierte PR5021-2010- T-003 Pflanzen.
Sequenzen:
SEQ ID NO: 1 Nukleotidsequenz des codierenden Bereichs des bakteriellen pthG-Gens aus dem Plasmid pQE60-pthG, das ein 2,8 kb großes genomisches BamHI-Hindlll Fragment aus Erwinia herbicola pv. gypsophilae enthält.
SEQ ID NO: 2 Aminosäuresequenz des PthG-Proteins
SEQ ID NO: 3 Nukleotidsequenz des pthG ^gg Gens mit flankierender Ncol und BamHI
Schnittstelle
SEQ ID NO: 4 Aminosäuresequenz des PthG «« Proteins
SEQ ID NO: 5 Nukleotidsequenz (pthGi.255), kodierend für Teilprotein PthG1 -255
SEQ ID NO: 6 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGi.255
SEQ ID NO: 7 Nukleotidsequenz (pthG62-255), kodierend für Teilprotein PthG62-255
SEQ ID NO: 8 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG62-255
SEQ ID NO: 9 Nukleotidsequenz (pthG92-255), kodierend für Teilprotein PthG92-255
SEQ ID NO: 10 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG92-255
SEQ ID NO: 1 1 Nukleotidsequenz (pthG 121-255), kodierend für Teilprotein PthGi2i-255
SEQ ID NO: 12 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGi2i-255
SEQ ID NO: 13 Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 14 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG|2i-488
SEQ ID NO: 15 Nukleotidsequenz (pthG92-488), kodierend für Teilprotein PthG92_488
SEQ ID NO: 16 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG92- 88
SEQ ID NO: 17 Nukleotidsequenz (pthGi62-48s), kodierend für Teilprotein PthGi62- 88
SEQ ID NO: 18 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG 162-488
SEQ ID NO: 19 Nukleotidsequenz (pthG205-48s)> kodierend für Teilprotein PthG205-488
SEQ ID NO: 20 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG205-488
SEQ ID NO: 21 Nukleotidsequenz (pthG245-488), kodierend für Teilprotein PthG245- 88
SEQ ID NO: 22 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG245- 88
SEQ ID NO: 23 Nukleotidsequenz (pthG253-48s); kodierend für Teilprotein PthG253- 88
SEQ ID NO: 24 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG253- 88
SEQ ID NO: 25 Nukleotidsequenz (pthGG+256-488), kodierend für Teilprotein PthGc+256-488
_
SEQ ID NO: 26 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGo+256-488
SEQ ID NO: 27 Nukleotidsequenz (pthG257- 8s), kodierend für Teilprotein PthG257-488
SEQ ID NO: 28 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG257-488
SEQ ID NO: 29 Nukleotidsequenz (pthGi.350), kodierend für Teilprotein PthGi.350
SEQ ID NO: 30 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG]_35o
SEQ ID NO: 31 Nukleotidsequenz (pthG].38o), kodierend für Teilprotein PthGi_3 o
SEQ ID NO: 32 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGi.380
SEQ ID NO: 33 Nukleotidsequenz (pthGi.412), kodierend für Teilprotein PthGj.412
SEQ ID NO: 34 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGun
SEQ ID NO: 35 Nukleotidsequenz
kodierend für Teilprotein
SEQ ID NO: 36 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGi_44o
SEQ ID NO: 37 Nukleotidsequenz (pthGi_486), kodierend für Teilprotein PthGi_486
SEQ ID NO: 38 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGi_486
SEQ ID NO: 39 Nukleotidsequenz S549, für einen Primer
SEQ ID NO: 40 Nukleotidsequenz S544, für einen Primer
SEQ ID NO: 41 Nukleotidsequenz S558, für einen Primer
SEQ ID NO: 42 Nukleotidsequenz S550, für einen Primer
SEQ ID O: 43 Nukleotidsequenz S551 , für einen Primer
SEQ ID NO: 44 Nukleotidsequenz S545, für einen Primer
SEQ ID NO: 45 Nukleotidsequenz S552, für einen Primer
SEQ ID NO: 46 Nukleotidsequenz S561, für einen Primer
SEQ ID NO: 47 Nukleotidsequenz S560, für einen Primer
SEQ ID NO: 48 Nukleotidsequenz S559, für einen Primer
SEQ ID NO: 49 Nukleotidsequenz S553, für einen Primer
SEQ ID NO: 50 Nukleotidsequenz S562, für einen Primer
SEQ ID NO: 51 Nukleotidsequenz S554, für einen Primer
SEQ ID NO: 52 Nukleotidsequenz S1420, für einen Primer zur qRT-PCR Bestimmung des ribosomalen Proteins 60S aus C. beticola
SEQ ID NO: 53 Nukleotidsequenz S 1421 , für einen Primer zur qRT-PCR Bestimmung des ribosomalen Proteins 60S aus C. beticola
SEQ ID NO: 54 Nukleotidsequenz (pthG 2-i2o), kodierend für Teilprotein PthG92-i2o
SEQ ID NO: 55 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG92-i2o
SEQ ID NO: 56 Nukleotidsequenz (pthG44].486), kodierend für Teilprotein PthG44i _4g6
SEQ ID NO: 57 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG44i-486
dem kompletten Avirulenzgen pthG aus Erwinia herbicola py. gypsophilae
Das Avirulenzgen pthG (Pathogenitätsgen auf Gypsophila, SEQ ID NO: 1) kodiert für das 488 Aminosäuren-große Avirulenzprotein PthG (SEQ ID NO: 2) und wurde aus dem Pathogen Erwinia herbicola pv. gypsophilae {Pantoea agglomerans pv. gypsophilae) isoliert (Ezra et al., 2000). Das pthG-Gen wirkt als Virulenzfaktor im Schleierkraut (Gypsophila). Zudem kodiert es für ein hochwirksames Avirulenzprotein, welches eine Hypersensitive Reaktion in allen untersuchten Beta- Spezies {Beta vulgaris, Beta patula, Beta webbiana, Beta macrocarpa, Beta patellaris, Beta corolliflora, Beta lomatogond) auslöst und dadurch eine Infektion von Zteta-Spezies durch Erwinia herbicola pv. gypsophilae verhindert (Ezra et al., 2004). Das pthG-Gen ist somit ein Avirulenzgen mit einem breiten Wirtsbereich, das mit einem in Beta konservierten, unbekannten Resistenzgen reagiert.
Das Gen pthG gg (SEQ ID NO: 3) wurde operativ mit dem derzeit geeignetesten synthetischen, Pathogen-induzierbaren Promotor, umfassend die Kombination von c s-regulatorischen Elementen 2xS-2xD (vgl. WO/00/29592), verknüpft, im Weiteren als synthetischer Promotor 2xS-2xD bezeichnet. Die Transformation des Konstruktes 2xS-2xD-pthGMgg-kan in Zuckerrübenzellen, durchgeführt nach Lindsey & Gallois, 1990, führte aufgrund der eingesetzten Agrobacterium tumefaciens -Bakterien zu einer zeitweilige Aktivierung des synthetischen Promotors und damit zum Absterben der
transformierten Pflanzenzellen nach der Expression des Avirulenzgens. Die Regeneration einer vitalen Zuckerrübenpflanze war bei Verwendung von 3 verschiedenen Zuckerrübengenotypen in wiederholten Versuchen unmöglich. Die Transformation des synthetischen Promoter 2xS-2xD in Kombination mit dem Luciferasegen führte hingegen zu 1 - 15 Transformanten pro Versuch. Dieses Ergebnis zeigte, dass zwar das Luciferasegen nicht jedoch das vollständige Gen
(SEQ ID NO: 3) in Zuckerrüben transformierbar ist (Tabelle 1 ).
Tabelle 1 : Vergleich der Transformierbarkeit des Gens pinG^s mit dem Luc-Gen in Zuckerrüben. Das pthG- Gen und Luc-Gen stehen beide unter der Kontrolle des synthetischen Promotors 2xS-2xD in den ansonsten identischen binären Vektoren 2xS-2xD-pthG-kan und 2xS-2xD-luc-kan. Dargestellt ist die Zahl der pro Versuche erhaltenen unabhängigen transgenen Pflanzen und in Klammern der verwendete Zuckerrübengenotyp.
Identifikation der für die Zelltodauslösung notwendigen funktionellen Bereiche des PthG-Proteins
Der kodierende Bereich des
wurde unter Einführung von neuen Translationsstart- und Stoppcodons vom 5'- und 3'-Ende her verkürzt, so dass zehn N- und C-terminal verkürzte PthG- Proteine synthetisiert werden konnten (FIG. 1 ). Bei den N-terminalen Deletionen wurden die ersten 61 , 91 , 120 und 256 Aminosäuren entfernt. Die entstehenden Genfragmente wurden als pthG62-488, pthG92.488, pthGi2i-488, pthG257-488 bezeichnet. Dazu wurden die genannten Fragmente durch PCR unter Verwendung der Primerpaare S549/S544 (SEQ ID NO: 39/SEQ ID NO: 40), S558/S544 (SEQ ID NO: 41/SEQ ID NO: 40), S550/S544 (SEQ ID NO: 42/SEQ ID NO: 40) und S551/S544 (SEQ ID NO: 43/SEQ ID NO: 40) und des Ausgangsplasmides pQE60-pthG mit Hilfe der Pfu-Polymerase amplifiziert. Die PCR Bedingungen waren wir folgt:
Pfu-PCR (50μ1 Ansatz):
10 x Pfu Ultra High Fidelity-Puffer 5 μΐ
dNTP's (je lO mM) 5 μΐ
Pfu Ultra High Fidelity Polymerase (1 U/μΙ) 1 μΐ
sense-Primer (20 μΜ) 0,5 bzw. 1 μΐ
antisense-Primer (20 μΜ) 0,5 bzw. 1 μΐ
DNA (1-100 ng/μΐ) 4 μΐ
bidest. H20 33 bzw. 34 μΐ
Bei Bedarf wurde einigen PCR-Amplifikationen MgCl2 zugesetzt. Hier wurden Konzentrationen von 1 V bis 4 V pro PCR zugesetzt.
PCR-Programm Pfu gen. DNA:
1. Zyklus 2 min 95 °C (initiale Denaturierung)
2. -(25.-35.) Zyklus 30 sec 95 °C (Denaturierung)
30 sec 58 °C- 60 °C (Annealing)
2 min 72 °C (DNA- Synthese)
Terminale Extension 10 min 72 °C
Endtemperatur 10 °C
Die 5 '-Primer S549 (SEQ ID NO: 39), S558 (SEQ ID NO: 41 ), S550 (SEQ ID NO: 42) und S551 (SEQ ID NO: 43) enthalten eine Ncol (CCATGG) Schnittselle mit der die N-terminalen Deletionen mit ein Startmethionin versehen wurden. Der Primer S544 (SEQ ID NO: 40) weist eine BamHI Schnittstelle hinter dem Stoppcodon des Gens pthG 88 auf. Durch Schneiden mit den
Restriktionsenzymen Ncol und BamHI konnten die DNA-Fragmente S549/S544 (SEQ ID NO:
39/SEQ ID NO: 40), S558/S544 (SEQ ID NO: 41 /SEQ ID NO: 40), S550/S544 (SEQ ID NO: 42/SEQ ID NO: 40) und S551/S544 (SEQ ID NO: 43/SEQ ID NO: 40) in den Vektor p70S-165-# 176-NcoI
(Vektor bekannt aus WO/2006/128444) kloniert und unter die Expressionskontrolle des doppelten 35S Promotors gestellt werden.
Bei den C-terminalen Deletionen wurden die letzten 2, 48, 76, 108, 138 und 233 Aminosäuren entfernt. Die entstehenden Genfragmente wurden als pthGi.486,
pthGi.35o und pthGj.255 bezeichnet. Dazu wurden die genannten DNA-Fragmente durch PCR unter Verwendung der Primerpaare S545/S552 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 45), S545/S561 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 46), S545/S560 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 47), S545/S559 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 48), S545/S553 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 49), S545/S554 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 51 ) und S545/S562 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 50) wie für die N-terminalen Deletionen beschrieben amplifiziert und kloniert.
Die Expression der verkürzten pthG-Varianten und des kompletten Gens pthG 88 erfolgte unter Kontrolle des doppelten 35S-Promotors durch transiente ballistische Transformation unter
Verwendung einer PDS-1000 Genkanone (BioRad, München, Deutschland) in Gegenwart von zwei Luciferasereportergenen aus Photinus pyralis und Renilla reniformis. Mit Hilfe der Reportergene war es möglich die Vitalität der transformierten Zellen zu messen. Die transiente ballistische
Transformation wurde folgendermaßen durchgeführt:
Vorbereitung der Macrocarrierpräparation
Es wurde 60 mg Gold (Goldpulver; AU Typ 200-03 (Heraeus GmbH, Hanau, Deutschland) in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß eingewogen, danach erfolgte die Zugabe von 1 ml 70 % EtOH, dieses wurde 5 min gevortext und anschließend 15 min stehen gelassen. Das Gold wurde durch kurzes Zentrifugieren sedimentiert (ca. 5 sec) (Pico Fuge®, Stratagene, Amsterdam) und der Überstand verworfen. Das Gold wurde in 1 ml bidest. H20 resuspendiert, 1 min gevortext, 1 min stehen gelassen und wiederum sedimentiert (5 sec), der Überstand wurde verworfen und das Sediment in 1 ml bidest. H20 resuspendiert. Diesen Waschschritt wiederholte man insgesamt dreimal. Das gewaschene Gold wurde letztendlich in 1 ml 50 % Glycerin aufgenommen.
Beladen der Macrocarrier mit DNA (für 6 Schuss)
Für die Transformation wurde nur Plasmid-DNA verwendet, die durch Silicamembransäulen gereinigt und auf eine Konzentration von 1 μg/μl eingestellt worden war. Als Reportergenkonstrukt wurde das Plasmid p70S lue mit dem Luciferasegen aus Photinus pyralis und als Normalisierungsvektor p70S ruc mit dem Luciferasegen von Renilla reniformis eingesetzt.
Ansatz für Effektorgold
Das Gold wurde für mindestens 5 min gevortext und 2,5 μΐ Effektor Plasmid-DNA (1 μg/μl) und 2,5 μΐ p70S lue Plasmid-DNA in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und gemischt, dazu 25 μΐ Goldsuspension gegeben; dabei war es wichtig die Suspension ständig zu vortexen. Zudem wurden
„
- 24 - noch 25 μΐ CaCl2 (2,5 M) und 10 μΐ Spermidin (0,1 M) dazugegeben. Der Ansatz wurde 3 min gevortext, anschließend 1 min ruhen gelassen, das Gold wurde durch kurzes Zentrinagieren (2-3 sec) sedimentiert und der Überstand abgenommen und verworfen. Das Sediment wurde mit 70 μΐ 70 % EtOH und anschließend mit 70 μΐ 100 % EtOH gewaschen, danach in 24 μΐ 100 % EtOH
aufgenommen und gut gevortext.
Ansatz für Normalisierungsgold
Die Durchführung war identisch mit der vom Effektorgold, allerdings unterschieden sich die eingebrachten Mengen. Es wurde 5 μΐ p70S ruc DNA (1 μ /μ1) in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und 50 μΐ Goldsuspension, 50 μΐ CaCl2 (2,5 M) und 20 μΐ Spermidin (0,1 M) dazugegeben. Das Sediment wurde mit 140 μΐ 70 % EtOH und anschließend mit 140 μΐ 100 % EtOH gewaschen, danach in 48 μΐ 100 % EtOH aufgenommen und gut gevortext.
Um das Normalisierungsgold einsetzen zu können und um die verschiedenen Ansätze miteinander vergleichen zu können, wurden die Mengen des Normalisierungsgoldes entsprechend der Zahl der Wiederholungen erhöht.
Es wurden 40 μΐ Normalisierungsgold und 10 μΐ Effektorgold gemischt, dann wurde jeweils 6 μΐ der Suspension mit einer 10 μΐ Gilson-Pipette gleichmäßig in der Mitte des Macrocarriers verteilt. Die Macrocarrier wurden zuvor in Macrocarrierholder positioniert. Nachdem das Gold getrocknet war, indem das EtOH verdampfte, konnten die Macrocarrier für den Beschuss verwendet werden.
Der Beschuss der Zuckerrübenblätter mit den DNA-beladenen Goldpartikeln und die Messung der dualen Luciferaseaktivitäten wurden wie beschrieben (Schmidt et al., 2004) durchgeführt. Die Expression der funktionellen pthG-Fragmente durch den doppelten 35S Promotor löst in den mit dem Effektorgold transient transformierten Zuckerrübenzellen eine Hypersensitive Reaktion aus, die zu einem lokalen Zelltod führt. Der lokale Zelltod der transformierten Zelle verhindert auch die
Expression des mit dem Effektorgold cotransformierten Luciferasegens aus Photinus pyralis (p70S lue). Die Messung der mit Hilfe des Normalisierungsgoldes in das Blattgewebe geschossenen Luciferase von Renilla reniformis erlaubt eine Normalisierung der Beschussversuche. Im Vergleich zu den Kontrollansatz der statt eines pthG-Konstruktes nur den Leervektor pCaM-V2 (Vektor bekannt aus WO/2006/128444) enthält, kann so die zelltodauslösende Wirkung der pthG-Fragmente gemessen werden.
Die Deletionsexperimente und anschließenden Funktionsprüfungen zeigten, dass neben dem
Ausgangsprotein
auch die N-terminalen Deletionen PthGö2-488 und PthG92_488 eine starke zelltodauslösende Wirkung haben. Der Proteinteil PthG|2i-488 hingegen löste wie der Proteinteil
PthG257-488 keinen Zelltod mehr aus, so dass der Proteinbereich von Aminosäureposition 92-120 (SEQ ID NO: 55) für die Zelltodauslösung notwendig ist, während der Proteinbereich von Position 1 -91 für
^
die Zeiitodauslösung entbehrlich sind. Im Fall der C-terminalen Deletionen löste der Proteinteil PthG]. 486 noch einen starken Zelltod aus. Die Proteinteile
PthGi.38o und PthGi.350 hingegen lösten keinen Zelltod mehr aus. Am C-Terminus ist somit die Aminosäuresequenz von Position 441-486, nicht jedoch die Sequenz von Position 487-488 notwendig für die Zeiitodauslösung (FIG. 2 und FIG. 3).
Komplementierung der Avirulenzgenfunktion durch Coexpression verkürzter inaktiver pthG- Genfragmente
Nachdem die Deletionsanalysen gezeigt hatten, dass zwei Sequenzabschnitte im Bereich von
Aminosäureposition 92-120 und 441-486 Voraussetzung für die Zeiitodauslösung sind, wurden die inaktiven Teilfragmente in Zuckerrübenblättern durch den ballistischen Test transient coexprimiert. Während die Nukleinsäuren einzeln exprimiert keinen Zelltod auslösten, führte die Coexpression der Nukleinsäuren von pthGi.255 und pthGi2i- 88 zu einem starken Zelltod, der vergleichbar zu dem Zelltod ist, der durch das vollständige Protein PthG gg ausgelöst wird. Durch die gemeinschaftliche
Expression der Proteinteile PthGi.255 und PthGi2i- 88 kam es zu einer Komplementierung der
Avirulenzprotein-Wirkung und zu einer Induktion der Hypersensitiven Reaktion (FIG. 4). Die Coexpression der Nukleinsäuren von pthGi.255 und pthG257- 88 hingegen führte zu keinem Zelltod und damit zu keiner Wiederherstellung der Avirulenzgenfunktion. Der Unterschied zwischen der
Coexpression von pt.hG1.255 und pthGi2 88 'm Vergleich zu pthGi.255 und pthG257- 88 egt darin, dass im Fall der erfolgreichen Komplementation die Aminosäuresequenzen der beiden Proteinfragmente teilweise überlappen.
Die Ergebnisse sind in mehrfacher Hinsicht überraschend. Zum einen ist bei anderen
Avirulenzgenproteinen bekanntermaßen die Zelltod auslösende Domäne immer nur einem
Proteinabschnitt zugeordnet und zum anderen ist eine intramolekulare Komplementation der
Avirulenzgenfunktion nicht bekannt.
Identifizierung der für die Komplementation minimal notwendigen Sequenzen des pthG-Gens
Die bisherigen Arbeiten zur Expression des zweiteiligen Avr-Gens hatten gezeigt, das die Moleküle PthGi.255 und PthGi22- 88 nach einer Coexpression Zelltod in Zellen von Zuckerrübenblättern auslösen. Durch weiterfuhrende Arbeiten konnten die minimal notwendigen Sequenzen identifiziert werden, die für die funktionelle Komplementation notwendig sind.
Dazu wurde zunächst das C-terminal deletierte Protein PthGi.255 ausgehend vom N-Terminus weiter verkürzt. Die neu erstellten Nukleinsäuren pthG62-255, pthG 2-255, pthG i.255 sowie pthGi.255 wurden gemeinsam mit der Nukleinsäure pthGi2i- 88 in drei Versuchen in Zuckerrübenblätter cotransformiert. Die Verkürzung der Moleküle führte in Kombination mit pthGm^ss ZU einer schrittweisen Abnahme
der Zelltodauslösung. Kombiniert lösten die Proteinteile kodiert durch pthGi.255 und pthG)2 i-488 den stärksten Zelltod aus, der fast so stark wie der Zelltod durch das vollständige Protein PthGi-488 war. Die Proteinteile kodiert durch pthGö2-255 und pthG92- 55 in Kombination mit PthGi22- 88 lösten einen schwächeren Zelltod aus, während pthGm^ss bei der Coexpression inaktiv war (Tabelle 2). Insgesamt war eine Aktivitätsabnahme von pthGi.255 über pthG62-255 zu pthG92-255 zu beobachten.
Tabelle 2: Eingrenzung der für die Zelltodauslösung notwendigen Aminosäurebereiche im Bereich 1-255 des zweigeteilten Avirulenzproteins (+ zeigt die Intensität des ausgelösten Zelltods an; - kein Zelltod).
Die Verkürzung des Moleküls PthGi2i-488 erfolgte vom N-Terminus aus. Die neu erstellten
Nukleinsäuren pthG^ss, pthG205-488, pthG245-488, pthG253-488, pthGG+ 56-i88 sowie pthG12i-48 wurden gemeinsam mit der Nukleinsäure pthGi-255 in drei Versuchen in Zellen von Zuckerrübenblätter cotransformiert. Im Fall der Nukleinsäure von pthG<3+256-488 war der codierende Bereich so verändert worden, das die Aminosäuresequenz PthGG+256-488 , am N-Terminus um ein Glycin erweitert worden war. Die Proteinteile PthGi62-488, PthG2os-488 und PthG245-488 waren im Hinblick auf die
Zelltodauslösung genauso wirksam wie das Ausgangsmolekül PthGi2i-488- Eine weitere Verkleinerung auf die Sequenz PthG253-488 führte zum Funktionsverlust (Tabelle 3).
Tabelle 3: Eingrenzung der für die Zelltodauslösung notwendigen Aminosäurebereiche im Bereich 121-488 des zweigeteilten Avirulenzproteins (+ zeigt die Intensität des ausgelösten Zelltods an; - kein Zelltod).
Während die Aminosäuresequenz von Position 121 -244 entbehrlich ist, ist der Sequenzabschnitt von thG245-488 in Kombination mit pth.G1.255 notwendig für die erfolgreiche Komplementation.
Voraussetzung für eine erfolgreiche Komplementation der Zelltod auslösenden Wirkung ist eine
geringe Überlappung der Aminosäuresequenzen von den zwei PthG Teilfragmenten, die im Fall von PthGi.255 und 1 1 Aminosäuren beträgt. Eine Überlappung von 3 Aminosäuren wie im Fall von PthGi.255 und PthG253-488 genügt nicht.
In einer weiteren Serie von Coexpressions-Experimenten wurde die Wirksamkeit der als minimal notwendig identifizierten Sequenzen PthG 2-255 und PthG245- 88 mit der von PthGi.255 und PthGi 21-488 direkt verglichen. Die Moleküle PthG62-255 und PthG245-488 lösten bei der Coexpression einen genauso starken Zelltod aus wie die gemeinschaftlich exprimierten Proteine PthGi-255 und PthGi2i-488 (FIG. 5). Durch Verwendung der Moleküle PthG 2.255 und PthG245-488 wurde ein schwächerer Zelltod ausgelöst. Durch den Einsatz von PthG62-255 oder von PthG 2-255 kann die Intensität der Zelltodinduktion moduliert werden.
Funktionelle Analyse und Auswahl von 2xS-2xD-PthGu2jj und 2xS-2xD-PthGj r 4gg Elternpflanzen für Kreuzungen
Identifizierte und isolierte Deletionskonstrukte pthGi.255 und
wurden mit verschiedenen Promotoren, z.B. auch mit synthetischen Pathogen-induzierbaren Promotoren 2xS-2xD und 4xD responsiv auf Cercospora beticola, operativ verknüpft. Mit den binären Vektoren2xS-2xD-pthG 1.255- kan und 2xS-2xD-pthGi2 i -488-kan wurden dann jeweils separat Zuckerrübenpflanzen transformiert (Lindsey & Gallois, 1990). Im Fall von eingesetzten Pathogen-induzierbaren Promotoren wie auch konstitutiven Promotoren konnten trotz der Aktivierung bzw. Aktivität dieser Promotoren während der A. tumefaciens-vermittelten Transformation stabile, lebensfähige Transformanten mit den Konstrukten umfassend pthGi-255 oder
produziert werden, da die nicht-funktionellen Teilproteine PthGi. 255 und PthGi2i- 88 in ihren jeweiligen Transformanten nicht als Induktoren eines Zelltods fungierten. Zuckerrüben-Transformanten, welche die rekombinanten Teilproteine beispielsweise nach einer künstlichen C. beticola Infektion schnell und ausreichend produzierten, konntendurch qRT-PCR identifiziert werden. Die künstliche Infektion von Zuckerrüben, RNA-Isolation, cDNA-Synthese und qRT-PCR wurde durchgeführt wie beschrieben (Weltmeier et al., 201 1). Idealerweise wurde durch einen ballistischen, transienten Komplementationstest die Eignung einer transgenen Linie zur Zelltodauslösung quantitativ bestimmt. Dazu wird zunächst durch eine Southern-Blot Analyse, wie bei Stahl et al., 2004 für Zuckerrüben beschrieben, die Zahl der genomischen Integrationen der pthG- Genfragmente bestimmt.
Für die Komplementations-Untersuchungen wurden die transgenen Linien ausgewählt, die nur eine T- DNA Integration und damit ein pthG-Gen unter der Kontrolle eines synthetischen Promotors aufwiesen. Obwohl die eingesetzten synthetischen Promotoren sehr spezifisch durch Pathogenbefall aktiviert werden, sind diese Promotoren auch wundinduzierbar (Rushton et al., 2002). Diese
Wundinduzierbarkeit wurde bei der ballistischen Transformation gezielt genutzt.
Blätter von im Gewächshaus angezogenen transgenen Linien wurden jeweils a) mit dem Leervektor pCaMV-2 als Negativkontrolle, b) mit dem vollständigen pthG1 -488 Gen unter der Kontrolle des
doppelten 35S-Promotor (Konstrukt 70S-pthGi_488) als Positivkontrolle und c) mit dem komplementierenden Teilfragment pthG^ ss bzw. pthGi.255 unter der Kontrolle des doppelten 35S- Promotors transient ballistisch transformiert. Die mit dem Leervektor erhaltene normalisierte Reportergenaktivität wurde als Referenz gleich 100% gesetzt. Während das Konstrukt 70S-pthGi.488 als Positivkontrolle einen starken Zelltod auslöste, so dass für alle untersuchten Linien nur 1 -14 % normalisierte Enzymaktivität gemessen werden konnte, führte die transiente Transformation mit dem komplementären pthG-Genfragment in Abhängigkeit von der analysierten transgenen Linie zu stark unterschiedlichen Enzymaktivitäten (FIG. 6A, Tabelle 4). Die mit dem Konstrukt 2xS-2xD-pthG12i. 488kan erstellten transgenen PR144 Linien zeigten nach der Komplementation mit dem Konstrukt 70S- pthGi.255 eine normalisierte Enzymaktivität von 20, 28, 30, 48, 55, 62 und 100%. Für die mit dem Konstrukt 2xS-2xD-pthG 1.255 -kan gewonnenen transgenen PR148 Linien wurde nach der
Komplementation mit dem Konstrukt 70S-pthG| 2i-488 eine normalisierte Enzymaktivität von 13, 16, 22, 26, 43, 49, 55, 67 und 100% ermittelt (FIG. 6B, Tabelle 4). Das unterschiedliche Ausmaß der Induktion eines Zelltodes bzw. einer Hypersensitiven Reaktion in verschiedenen transgenen Linien gleicher Genetik, die jeweils nur eine Integration des gleichen Konstruktes aufwiesen, war vermutlich auf den Einfluss des Integrationsortes zurückzuführen. Die Integration der T-DNA eines Konstruktes erfolgt bei der Agrobacterium tumefacie s vermittelten Transformation bekanntermaßen zufällig. Durch die funktionelle Analyse stand nun ein ganzes Spektrum von transgenen Pflanzen zu
Verfügung, die in einer abgestuften Weise zur Induktion einer Hypersensitiven Reaktion fähig sind und die für Kreuzungen ausgewählt werden konnten.
Tabelle 4: Funktionelle Charakterisierung transgener 2xS-2xD-pthG1_255 und 2xS-2xD-pthGi2i-488 Zuckerrüben durch ballistische transiente Komplementation. Alle transgenen Linien weisen nur eine pthG Integration im Genom auf. Bestimmt wurde die relative Enzymaktivität der mit den Effektorgenen
pthGi-255 und pthG12 88 contransformierten Luciferasegene (100% = kein Zelltod, 0% = sehr starker Zelltod. n.b. = nicht bestimmt).
Transiente Komplementation
Transgene Linie
Zuckerrrübe # relative normalisierte Enzymaktivität (%)
Konstrukt
Leervektor pthG 8s PthG 1.255 pthG | 88
Kontrolle
100 8 100 100 nicht transgen
PR 144 / 4 2xS-2xD-pthG-i21_488 -kan 100 7 20 n.b.
PR 144 / 34 100 4 28 n.b.
PR 144 / 30 100 2 30 n.b.
PR 144 / 17 100 4 48 n.b.
PR 144 / 5 100 1 55 n.b.
PR 144 / 19 100 2 62 n.b.
PR 148 / 35 2xS-2xD-pthG-,_255 -kan 100 6 n.b. 13
PR 148 / 54 100 8 n.b. 16
PR 148 / 45 100 6 n.b. 22
PR 148 / 46 100 12 n.b. 26
PR 148 / 53 100 12 n.b. 43
PR 148 / 49 100 6 n.b. 49
PR 148 / 59 100 9 n.b. 55
PR 148 / 52 100 13 n.b. 67
PR 148 / 56 100 14 n.b. 100
In der gleichen Weise wurden die transgenen Linien PR171 und PR173 funktionell analysiert, die mit dem 4xD Promotor in Kombination mit den minimal notwendigen Sequenzen pthGö2-255 und pthG245- 488 transformiert worden sind. Vergleichbar zu den Ergebnissen mit den PR144 und PR148 Pflanzen zeigten die 4xD-pthG62-255 und 4xD-pthG245_ 88 Pflanzen nach der transienten Komplementation mit den Konstrukten 70S- pthG2 5- 88 und 70S-pthG62-255 eine große Spannbreite an Zelltodinduktion (Tabelle 5).
Tabelle 5: Funktionelle Charakterisierung transgener 4xD-pthG 62.255 und 4xD-pthG 245^88 Zuckerrüben durch ballistische transiente Komplementation. Alle transgenen Linien weisen nach Southern-Blot Analyse nur eine pthG Integration im Genom auf. Bestimmt wurde die relative Enzymaktivität der mit den Effektorgenen pthG 488, pthG 245-488 und pthG 62.255 contransformierten Luciferasegene. 100% = kein Zelltod, 0% = sehr starker
Zelltod. n.b. = nicht bestimmt
Kombination des zweigeteilten Avirulenzproteins durch Kreuzung ausgewählter Zuckerrüben Transformanten
Die funktionell charakterisierten transgenen Linien PR144, PR148, PR171 und PR173 konnten für unterschiedliche Kreuzungen eingesetzt werden (siehe beispielhaft FIG. 7 und Tabelle 6). Eine Möglichkeit besteht in der Kreuzung von transgenen Zuckerrüben, bei denen die beiden pthG Teilfragmente unter der Kontrolle des gleichen Pathogen-induzierbaren Promotor, z.B. des 2xS-2xD Promotor, stehen. Eine entsprechende Kreuzung wurde für die Linie PR148/56 mit den Linien PR144/4 und PR144/30 durchgeführt.
Das aus den Kreuzungen gewonnene Saatgut wurde oberflächendesinfiziert und unter Gewebekulturbedingungen auf MS-Medium ausgelegt. Die so erhaltenden in-vitro Pflanzen wurden durch PCR auf die Anwesenheit der beiden pthG-Fragmente überprüft und klonal vermehrt. Die PCR Analyse zeigte, dass die Kreuzungsnummern 5258/1 und 5260/1, die aus der Kreuzung PR148/56 x PR144/4 stammen, sowie die Kreuzungsnummern 5398/1 und 5398/3, die Nachkommen der Kreuzung PR148/56 x PR144/30 sind, sowohl die Sequenz pthGi-255 als auch pthGi2i-488 trugen. Die vermehrten in-vitro Pflanzen wurden im in-vitro Test mit C. beticola nach Schmidt et al., 2008 infiziert. Infizierte und nichtinfizierte Pflanzen wurden 1 , 2, 4 und 7 Tage nach der Inokulation geerntet (je drei biologischen Replikaten), RNA wie beschrieben isoliert und eine qRT-PCR Analyse durchgeführt, um die Transkriptakkumulation von pthGi.255 und pthGi2i-488 nach Cercospora beticola- Infektion nachzuweisen. Als Kontrollen dienten nicht-transgene Zuckerrübenpflanzen (3DC4156) und transgene Zuckerrübenpflanzen, die mit dem Konstrukt FP635 unter der Kontrolle eines Pathogen- induzierbaren Promotors transformiert wurden (PR167/1 1). FP635 kodiert für ein rot-fluoreszierendes Protein mit einer Anregung bei einem Wellenlängenmaximum von 589 nm und einer Lichtemission bei einem Wellenlängenmaximum von 636 nm. Es hat selbst keinen Einfluss auf die pflanzliche Pathogenabwehr. Die Ergebnisse zeigten, dass die Nukleinsäure pthGi.255 in den PR148 x PR144 - Kreuzungen schwach exprimiert und durch den Pathogenbefall induziert wird (Fig. 8A). Obwohl die transgene Linie PR148/56 im transienten Komplementationstest keinen Zelltod zeigte, kann die Induktion und schwache Expression der Sequenz pthG 1 -255 durch die sensitive qRT-PCR nachgewiesen werden.
Die Nukleinsäure
in den PR148 x PR144 - Kreuzungen wurde infolge der C. beticola- Infektion stark induziert (FIG. 8B), während in der nichttransgenen und der transgenen Kontrolle keine Transkriptakkumulation nachzuweisen ist. Die Aktivitäten der Promotoren der beiden
Nukleinsäuren zeigten somit eine überlappende Expressionsregulation für den Fall einer
Pathogeninfektion.
Tabelle 6: Identifizierung von Nachkommen aus den Kreuzungen PR148/56 x PR144/4, PR148/56 x PR144/30 und PR144/19xPR171/19 (kan: Kanamycin als Selektionsmarker; 1 Relative Enzymaktivität im transienten Komplementationstest (100 % = kein Zelltod, 0% = maximaler Zelltod)
Kreuzung Elter 1 PCR Enzymaktivität1 Elter 2 PCR Enzymaktivität1 -Nr. Promotor und Elter 1 Elter 1 [%] Promotor und Elter 2 Elter 2 [%] pthG-Fragment pthG-Fragment
5258/1 PR148/56 positiv 100% PR144/04 positiv 20%
2xS-2xD- 2xS-2xD- pthG!.255 pthGi21-488
5260/1 PR 148/56 positiv 100% PR144/04 positiv 20%
2xS-2xD- 2xS-2xD- pthG,.255 pthG12i-488
002 pthG62-255 pthG12l-488
Nachweis der verstärkten Pathogenabwehrreaktion durch Quantifizierung der pilzlichen Biomasse nach Cercospora &e/ co/a-Infektion mittels Expressionsanalyse
Eine verbesserte Pathogenabwehr ließ sich durch die quantitative Bestimmung von
pathogen spezifischen Expressionstranskripten nachweisen, welche ein Maß für die pathogene Biomasse als Folge der Pathogeninfektion darstellte. Zu diesem Zweck wurde die Akkumulation des C. beticola-Gens für das 60S ribosomale Protein (FIG. 9A) durch qRT-PCR mit den Primern S1420 (SEQ ID NO: 52) und S1421 (SEQ Π) NO: 53) quantifiziert. Je drei biologischen Replikate der PR148 x PR144 - Kreuzungen 5258/1 , 5260/1 , 5398/1 und 5398/3 wurden am Tag 1 , 2, 4 und 7 nach Cercospora Äe//co/a-Infektion analysiert. Als Kontrollen dienten weiterhin 3DC4156 und PR167/1 1. Das Ergebnis zeigte, dass die pilzliche Biomasse der Kontrollpflanzen am Versuchsende, 7 Tage nach der Infektion, ca. 50% höher war als diejenige der transgenen Pflanzen der PR148 x PR144 - Kreuzungen. Dieses Ergebnis beweist, dass durch die Coexpression von pthGi.255 und pthGi2i-488 infolge der C. Äe/ co/a-Infektion eine Pathogenabwehrreaktion in den Pflanzen ausgelöst wurde, die anders als in den Kontrollen eine verzögerte und eingeschränkte Ausbreitung des Pathogens C.
beticola bewirken konnte.
Nachweis der verstärkten Pathogenabwehrreaktion durch Quantifizierung von Komponenten der pflanzlichen Pathogenabwehr mittels Expressionsanalyse
Zum Nachweis einer erhöhten Pathogenantwort in einer der PR148 x PR144 - Kreuzungen kann das Expressionslevel von Komponenten der pflanzlichen Pathogenabwehr quantitativ bestimmt werden. Hierfür wurde die Transkript-Akkumulation des B. vulgaris-Gens der Kaffeesäure-O-Methyl- Transferase BvCoMT (Fig. 9B), das bei Resistenzreaktionen der Zuckerrrübe gegenüber C. beticola induziert wird (Weltmeier et al., 201 1) in je drei biologischen Replikaten der PR148 x PR144 -
Kreuzungen (In-vitro Pflanzen) am Tag 1 , 2, 4 und 7 nach Cercospora beticola-lnio txon durch qRT- PCR wie bei Weltmeier et al. 201 1 für das Gen PLT3_005_g06.f beschrieben, durchgeführt (FIG. 9B). Das Ergebnis zeigte, dass die Expression des BvCOMT Gens, das im Zusammenhang mit der Pathogenabwehr exprimiert wurde, in den transgenen in-vitro Pflanzen der PR148 x PR144 - Kreuzungen 5398/1 und 5398/3 im Vergleich zu den Kontrollen (3DC4156 und PR167/1 1 ) sieben Tage nach der C. öet co/o-Infektion höher ist. Die Expression bei den Kreuzungsnummern 5258/1 und 5260/1 war vergleichbar zu den Kontrollen. Da die pilzliche Biomasse in den Kontrollen jedoch 50 % höher war, sollte in den Kontrollen auch eine stärkere BvCOMT Transkriptmenge als in den
Kreuzungsprodukten erwartet werden. Die gleiche hohe bzw. sogar höhere BvCOMT
Tran skriptmenge in den Kreuzungen zeigt, das die Syntheseprodukte der Nukleinsäuren pthG^s und pthGi2i-488, gebildet in Reaktion auf die C. beticola-lnfektion, zu einer erhöhten pflanzlichen
Pathogenantwort führen.
Erzeugung von Kreuzungsprodukten, in denen die pthG-Nukleinsäuren unter der Kontrolle unterschiedlicher pathogen-induzierter Promotoren stehen
Um sicherzustellen, dass alle Teile des Avirulenzproteins PthG ausschließlich zum Zeitpunkt einer "echten Infektion" in einer Zelle synthetisiert vorliegen und deren Expression nicht durch andere Stimuli (Transformation, Entwicklung, abiotischer Stress etc.) induziert wird, ist die Verwendung zweier unterschiedlicher synthetischer pathogeninduzierbarer Promotoren besonders vorteilhaft. Aus diesem Grund wurde eine Kreuzung ausgewählter PR144 (Konstrukt 2xS-2xD-pthG]2i-488) und PR171 (Konstrukt 4xD-pthGö2-255) Transformanten auf der Grundlage der funktionell analysierten Transformanten (Tabellen 4 und 5) durchgeführt. Von den Kreuzungen PR171/19x PR144/4, PR171/19x PR 144/5, PR171/19xPR144/19 sowie PR171/2xPR144/4 und PR171/2xPR144/19 wurde Saatgut erhalten, jedoch führte nur die Kreuzung PR171/19xPR144/19 zu lebensfähigen
Nachkommen.
Zahlreiche der erhaltenen Kreuzungsprodukte zeigten trotz der hervorragenden Pathogen Spezifität der eingesetzten synthetischen Promotoren auch bei Abwesenheit eines Pathogens vor Allem während der Keimungsphase eine geringe Induktion einer HR-Reaktion. Diese war in der Regel ausreichend, um die empfindlichen Keimlinge absterben zu lassen (FIG. 10A und FIG. 10B). Aus einigen Kreuzungen gelang es jedoch erfolgreich vitale Zuckerrübenpflanzen heranzuziehen, bei denen eine derartige Induktion während der Keimphase ausblieb. Diese Pflanzen ließen sich klonal vermehren (FIG. 10C), bewurzeln (FIG. 10D) und in das Gewächshaus überführen. Dort entwickelten sich die Pflanzen unauffällig (FIG. 10E).
Mit Blick auf die funktionellen Eigenschaften der ausgewählten Kreuzungspartner ergeben sich zwei Rückschlüsse. Die Eltern PR171/17 und PR144/19 zeigen mit 64 % bzw. 62% relativer
Enzymaktivität im transienten Komplementationstest einen geringere Zelltodinduktion als die übrigen
ausgewählten Kreuzungspartner (Tabelle 7). Die Induzierbarkeit bzw. Expression der Teilfragmente sollte in den Elternlinien nicht zu stark sein und zum anderen kann durch die graduelle Auswahl unterschiedlicher Aktivitätsniveaus letztendlich eine geeignete Kombination von Eltern gefunden werden.
Eine Infektion der in das Gewächshaus überführten Kreuzungsprodukte PR5021-2010-T-003
(PRl 71/17 xPR144/19) mit C. beticola zeigte nach qRT-PCR Analyse, dass sowohl die Transkription der Sequenz pfhGfc>-255 als auch der Sequenz
1 1 Tage nach Inokulation stark in den Pflanzen induziert werden (FIG. 1 1).
Tabelle 7: Ergebnisse der Kreuzung von transgenen pthG Pflanzen mit unterschiedlicher funktioneller Aktivität. In Klammern angegeben die relative Enzymaktivität der transgenen Linien im transienten Komplementationstest (Tabelle 4 und 5).
Referenzen:
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. und Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215(3): 403-410.
Belbahri, L., Boucher, C, Candresse, T., Nicole, M., Ricci, P. und Keller, H. (2001 ) A local accumulation of the Ralstonia solanacearum PopA protein in transgenic tobacco renders a compatible plant-pathogen interaction incompatibile. The Plant Journal 28(4): 419-430.
Dangl, J.L. und Jones, J.D.G. (2001 ). Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature U : 826-833.
de Wit, P. J. G. M. ( 1992) Molecular characterization of gene-for-gene Systems in plant-fungus interactions and the application of avirulence genes in control of plant pathogens. Annual Review of Phytopathology 30: 391-418.
Ezra, D., Barash, 1., Valinky, L. und Manulis, S. (2000) The dual function in virulence and host ränge resitriction of a gene isolated from the pPATHEhg plasmid of Erwinia herbicola pv. gypsophilae. Molecular Plant-Microbe Interactions 13(6), 683-692.
Ezra, D., Barash, I., Weinthal, D. M., Gaba, V. und Manulis, S. (2004) pthG from Pantoea agglomerans pv. gypsophilae encodes an avirulence effector that determines incompatibility in multiple beet species. Molecular Plant Pathology 5(2), 105-1 13.
Flor, H. H. (1971) Current Status of the gene-for-gene concept. Annual Review of Phytopathology 9: 275-296.
Gürel, S., Gürel, E. and Kaya, Z. (2000). Doubled haploid plant production from unpollinated ovules of sugar beet (Beta vulgaris L.). Plant Cell Reports 19: 1 155-1 159.
Gutierrez, J. R., Balmuth, A. L., Ntoukakis, V., Mucyn, T. S., Gimenez-Ibanez, S., Jones, A. M. E. und Rathjen, J. P. (2010) Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto- like kinases that diversify effector recognition. The Plant Journal 61 , 507-518.
Jones, J. D. G. und Dangl, J. L. (2006) The plant immune system. Nature 444, 323-329
Joosten, M. H. A. J. und de Wit, P. J. G. M. (1999) The tomato-Cladosporium fulvum interaction: A versatile experimental system to study plant-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology 37: 335-367.
Keller, H., Pamboukdjian, N., Ponchet, M., Poupet, A., Delon, R., Verrier, J.-L., Roby, D., and Ricci, P., 1999: Pathogen-induced elicitin production in transgenic tobacco generates a hypersensitive response and nonspecific disease resistance. Plant Cell 1 1 : 223-235.
Kuta, D. D. und Tripathi, L. (2005) Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. Africc Journal of Biotechnology 4(8): 752-757.
Lindsey, K. und Gallois, P. (1990) Transformation of Sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Experimental Botany 226(41): 529-536.
Martini, N., Egen, M., Rüntz, I., und Strittmatter, G., 1993: Promoter sequences of a potato pathogenesis-related gene mediate transcriptional activation selectively upon fungal infection.
Molecular and General Genetics 236: 179-186.
Rushton, P. J., Reinstadler, A., Lipka, V., Lippok, B. und Somssich, I. E., 2002: Synthetic plant Promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound- induced signaling. Plant Cell 14(4), 749-62.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Aufl.
Schmidt, K., Heberle , B., Kurrasch J., Nehls, R. and Stahl D. J. (2004) Suppression of Phenylalanine ammonia lyase expression in sugar beet by the fungal pathogen Cercospora beticola is mediated at the core promoter of the gene. Plant Molecular Biology 55: 835-852.
Schmidt, K., Pflugmacher, M., Klages, S., Mäser, Mock, A. und Stahl D.J. (2008) Accumulation of the hormone abscisic acid (ABA) at the infection site of the fungus Cercospora beticola Supports the role of ABA as a repressor of plant defence in sugar beet. Molecular Plant Pathogology 9(5): 661-673.
Stahl, D. J., Kloos, D. U., and Hehl, R. (2004). A sugar beet Chlorophyll a/b binding protein void of G- box like elements confer strong and leaf specific reporter gene expression in transgenic sugar beet. BMC Biotechnology 4;31 : 12
Stahl, D. J., Schmidt, K. und Nehls, R. (2006) Einsatz gentechnischer Methoden zur Verbesserung der Kulturpflanzenresistenz gegenüber parasitären Pilzen. Schriftenreihe der Deutschen
Phytomedizinischen Gesellschaft e. V. Bd. 8: 80-93.
Strittmatter, G., Gheysen, G., Gianinazzi-Pearson, V., Hahn, K., Niebel, A., et al. (1996) Infections with various types of organisms stimulate transcription from a short promoter fragment of the potato gstl gene. Molecular Plant-Microbe Interactions 9:68-73.
Weltmeier, F., Mäser, A., Menze, A., Hennig, S., Schad, M., Breuer, F., Schulz, B., Holtschulte, B., Nehls, R., and Stahl, D. J. (201 1 ). Transcript profiles in sugar beet genotypes uncover timing and strength of defense reactions to Cercospora beticola infection. Mol. Plant Microbe Interat. 24, 758- 772.
WO/1991/15585 (Rijkslandbouwhogeschool Wageningen). Method for protection of plants against pathogens.
WO/ 1995/31564 (Gatsby Charitable Foundation). Method of introducing pathogen resistance in plants.
WO/1999/43823 (Pioneer Hi-Bred International, Inc.). Methods for enhancing disease resistance in plants.
WO/2000/29592 (Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.). Chimeric Promoters capable of mediating gene expression in plants upon pathogen infection and uses thereof.
WO/2006/128444 ( WS SAAT AG). Autoaktiviertes Resistenzprotein.
WO/2007/068935 (Plant Bioscience Ltd.). Methods, means and compositions for enhancing Agrobacterium-mediated plant cell transformation efficiency.
WO/2007/147395 (KWS SAAT AG). Pathogen induzierbarer synthetischer Promotor.