WO2013127379A1 - Pathogenresistente transgene pflanze - Google Patents

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WO2013127379A1
WO2013127379A1 PCT/DE2013/000098 DE2013000098W WO2013127379A1 WO 2013127379 A1 WO2013127379 A1 WO 2013127379A1 DE 2013000098 W DE2013000098 W DE 2013000098W WO 2013127379 A1 WO2013127379 A1 WO 2013127379A1
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plant
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PCT/DE2013/000098
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Dietmar Stahl
Stephanie Meinecke
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Kws Saat Ag
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Definitions

  • the present invention relates to a pathogen-resistant plant, in particular a plant with a novel resistance based on the reaction of several parts of an avirulence protein with a corresponding resistance protein in a cell of the plant, a composition of nucleic acids, after integration into the genome of a plant, in this mediates pathogen resistance, a process for producing a pathogen-resistant plant and plants for producing a pathogen-resistant plant.
  • phytopathogens such as fungi, viruses, nematodes and bacteria
  • Plant diseases cause large crop losses worldwide, greatly affect the quality of the harvested products and necessitate a complex use of chemical pesticides. Frequently, the natural measures of the plant immune system, with the help of which the majority of potential pathogens are repelled or their spread can be delayed and limited, do not suffice.
  • transmembrane receptors recognize molecular patterns of a pathogen (so-called MAMPs or PAMPs, microbial- or pathogen-associated molecular patterns) and mediate in the plant the "PAMP-triggered immunity” (PTI) to prevent further spread of the pathogen.
  • MAMPs molecular patterns of a pathogen
  • PAMPs microbial- or pathogen-associated molecular patterns
  • pathogens have developed strategies to pass this first defense response.
  • Pathogens use a wide variety of infection pathways: whereas pathogenic bacteria can enter the plant via stomata and hydathodes, or as a result of wounding, and multiply in the apoplasmic space, fungi invade epidermal plant cells or form hyphae on or between the epidermal cells They are also able to
  • avirulence proteins are very specifically recognized by plant NBS-LRR resistance proteins (R proteins).
  • the avirulence proteins react either directly or indirectly according to the guard hypothesis with the corresponding R protein, whereupon activation of the R protein takes place (Dangl & Jones, 2001, Jones & Dangl, 2006).
  • the activated R protein is capable of triggering a signal cascade that causes an accelerated and enhanced PTI in the plant, the so-called effector triggered immune system, ETI (Jones & Dangl, 2006).
  • ETI effector triggered immune system
  • avirulence proteins are generally inducers of a plant pathogen defense reaction.
  • de Wit introduced his visionary concept as early as the beginning of the 1990s in WO / 1991/15585 (also in de Wit, 1992): It is based on the pathogen-induced coexpression of a plant resistance gene and the corresponding avirulence gene from the pathogen in a cell of a plant, whereby, after pathogen infestation limited to the place of infection one
  • WO / 1995/31564 already refers to the fact that WO / 1991/15585 does not disclose in particular which polynucleotide sequences can be used as suitable promoters for a broad pathogen resistance. It also states that in the case of the proposed tomato resistance gene, Cf-9 in combination with the avirulence gene Because of the specificity of the proposed promoters, Avr9 from Cladosporium f lv m could induce further induced induction of Cf-9 and / or Avr9, which could result in uncontrolled necrosis as a result of the hypersensitive response.
  • WO / 1999/43823 discloses the production of transgenic maize plants which have been biolistically transformed with the fungal avirulence gene avrRxv under the control of a pathogen-inducible promoter while already naturally containing the corresponding resistance protein.
  • the pathogen inducible promoters employed are not specific enough for one approach to obtaining a broad background because of high background activity
  • Transformation process For example, plants, especially those that are less susceptible to transformation processes are able to react, via AMP- or PAMP-responsive receptors in the plant cell membrane, to the presence of A. tumefaciens directly or indirectly, with the activation of pathogen-inducible promoters (Jones & Dangl, 2006; Tripathi, 2005; WO / 2007/068935). Similarly, numerous pathogen-inducible promoters are also activated by wounding, such as occur during biolistic transformation (Stahl et al., 2006). The result is in each case the unwanted expression of the introduced avirulence gene. The synthesized avirulence protein reacts with the already existing corresponding resistance protein and triggers the plant defense measures (ETI). Therefore, this usually already leads to the fact that either the vitality of these transformed cells even without "real pathogen infection" already severely restricted or the transformed cells are even controlled to die off. This circumstance has, above all, the
  • Transformation of avirulence genes which code for inducers of cell-triggering HR reactions in the presence of a corresponding resistance protein, and so far completely prevented the successful regeneration of the transformed cells to vital plants.
  • the invention was made against the background of the prior art described above, wherein it was an object of the present invention to provide a transgenic pathogen-resistant plant in which by means of a stable integration of a pathogenic inducer a stringently regulated resistance protein-mediated plant defense reaction with cell death initiation due to a pathogen infection takes place.
  • the object is achieved by a pathogen-resistant plant comprising at least two nucleic acids stably integrated into the genome, wherein the nucleic acids
  • the promoters is pathogen inducible, such that in a cell of the plant, as a result of infection of the plant by the pathogen, the different parts of the plant
  • an “avirulence protein” is encoded by an “avirulence gene” and is an effector molecule of a pathogen which is involved in pathogen recognition by the plant immune system essential role plays.
  • an avirulence protein is functionally characterized in that it is able to react directly or indirectly with a corresponding resistance protein, if present, in a plant cell, which then leads to the triggering of a plant pathogen defense reaction.
  • physiological responses of the plant obtained, for example, a hypersensitivity reaction (HR), a further strengthening of the cell wall by lignification and callous formation, the synthesis of phytoalexins, the production of PR (pathogenesis-related) proteins and preferably also the controlled cell death of the host tissue especially at the site of pathogen infection.
  • HR hypersensitivity reaction
  • PR pathogenesis-related
  • Avirulence proteins may differ in their degree of induction for a cell-eliciting HR response in the presence of a corresponding resistance protein. Whether an avirulence protein acts as a strong or weak inducer in a plant cell is essentially due to the efficacy of the corresponding resistance protein in the plant
  • hybridize means to hybridize under conventional conditions as described in Sambrook et al. (1989), preferably under stringent conditions.
  • Stringent hybridization conditions are, for example: hybridization in 4 x SSC at 65 ° C and
  • stringent hybridization conditions may also mean hybridization at 68 ° C in 0.25 M sodium phosphate, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA and 1% BSA for 16 hours and then washing twice with 2x SSC and 0.1% SDS at 68 ° C.
  • infection is meant the earliest time at which the metabolism of a pathogen is prepared for penetration of the host tissue. These include e.g. In the case of fungi, the growth of hyphae or the formation of specific infection structures such as penetration hyphae and appressoria.
  • a "true pathogen infection” includes any infection of a plant with a pathogen or any wounding, as a result of which a pathogen infection can take place.
  • pathogen infections and wounds of plants and plant cells which intentionally and specifically in the course of a genetic engineering process, such as Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation or biolistic
  • “Complementary” nucleotide sequence relative to a nucleic acid in the form of a double-stranded DNA, means that the second strand of DNA, complementary to the first DNA strand, has the nucleotides corresponding to the bases of the first strand in accordance with the base pairing rules.
  • Vegetable “organs” mean, for example, leaves, stem axis, stem, roots, vegetative buds, meristems, embryos, anthers, ovules or fruits.
  • Plant “parts” mean an association of several organs, e.g. a flower or seed, or part of an organ, e.g. a cross section through the shoot.
  • Herbal "tissues” are, for example, callus tissue, storage tissue, meristematic tissue, leaf tissue, shoot tissue, root tissue,
  • Plant tumor tissue or reproductive tissue By plant “cells” are meant, for example, isolated cells with a cell wall or aggregates thereof or protoplasts.
  • pathogen in the context of the invention means organisms which, in interactions with a plant, lead to disease symptoms of one or more organs in the plant.
  • pathogens include animal, fungal, bacterial and viral organisms.
  • animal pathogens include those of the filamentous worm (Nematoda) strain, such as species of the genera Angin, Ditylenchus, Globodera, Heterodera, Meloidogyne, Paratrichodorus, Pratylenchus and Trichodorus, and insects (Insecta), such as species of the genera Agriotes, Aphis, Atomaria, Autographa, Blithophaga, Cassida, Chaetocnema, Cleonus, Lixus, Lygus, Mamestra, Mycus, Onychiurus, Pemphigus, Philaenus, Scrobipalpa and Tipula.
  • the fungal pathogens are for example selected from the departments Plasmodiophoromycota, Oomycota, Ascomycota, Basidiomycota or Deuteromycota, these include, for example, species of the genera Actinomycetes, Alternaria, Aphanomyces, Botrytis, Cercospora, Erysiphe, Fusarium, Helicobasidium, Peronospora, Phoma, Phytium, Phytophthora, Pleospora, Ramularia, Rhizoctonia, Typhula, Uromyces and Verticillium.
  • the bacterial pathogens include, for example, species of the genera Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas, Streptomyces and Xanthomonas and to the viral pathogens, for example, species of the genera Benyvirus, Closterovirus, Curtovirus, Luteovirus, Nucleorhabdovirus, Potyvirus and Tobravirus.
  • a “promoter” is an untranslated DNA segment, typically upstream of a coding region, which includes the binding site for the RNA polymerase and initiates transcription of the DNA.
  • a promoter also contains other elements that regulate the
  • Gene expression (e.g., c / s regulatory elements).
  • a “core or minimal promoter” is a promoter that has at least the basic elements needed for transcription initiation (eg, TATA box and / or initiator).
  • synthetic promoter or “chimeric promoter” in this case a promoter is referred to, which does not occur in nature, is composed of several elements and includes a core or minimal promoter and upstream of the core or minimal promoter at least one c i-regulatory element which serves as a binding site for special trans-acting factors (trans-acting factors, eg transcription factors).
  • a synthetic or chimeric promoter is designed to the desired requirements and induced or repressed by various factors.
  • c / ' i regulatory element or a combination of cis regulatory elements is critical to the specificity and activity level of a promoter.
  • a core or minimal promoter may be operatively linked to one or more cw regulatory elements, wherein the promoter / cis element (s) combination of natural promoters are not known or different from natural promoters are designed. Examples are known from the prior art (WO / 00/29592, WO / 2007/147395))
  • a "pathogen-inducible promoter” is a promoter capable of delivering the gene that it regulates as a result of pathogen recognition and / or pathogen infection and / or wounding, which may also be the result of abiotic exposure express.
  • Transgenic plant refers to a plant in the genome of which at least one heterologous nucleic acid (eg an avirulence gene or also a fragment of an avirulence gene from a bacterial pathogen) has been stably integrated, which means that the integrated nucleic acid remains stable in the plant, is expressed and can be stably inherited to the offspring.
  • the stable integration of a nucleic acid into the genome of a plant also includes integration into the genome of a plant of the preceding parental generation, wherein the integrated nucleic acid can be stably inherited.
  • a pathogen-resistant plant according to the invention has at least two nucleic acids stably integrated into the genome. Each of these nucleic acids is characterized by a
  • nucleic acids are different fragments of one and the same avirulence gene.
  • Each nucleic acid comprises at least one fragment of the avirulence gene.
  • Two or more nucleic acids may have nucleotide sequences coding for two or more different parts of the avirulence protein with sections identical or similar
  • Code amino acid sequences By section, it is meant that no full length amino acid sequence is 100% identical or similar in any other amino acid sequence. Identical amino acid sequences are those whose amino acid sequences correspond to each other, similar amino acid sequences indicate one or more conservative and / or semi-conservative Amino acid substitutions based on similar physio-chemical properties of different amino acids. Sectionally identical or similar amino acid sequences may also be terminally overlapping, such that, for example, one sequence at the C-terminus has an identical or similar sequence with a different sequence at the N-terminus. Preferably, such amino acid sequences overlap over a length of more than 3 consecutive amino acids, more preferably over a length of at least 1 1 consecutive amino acids.
  • Similar overlapping amino acid sequences have a similarity of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% in the overlapping sequence region, identical overlapping amino acid sequences are consistent in the overlapping sequence region.
  • the match can be determined according to known methods, eg computer-assisted sequence comparisons (Altschul et al., 1990).
  • a nucleic acid may also be further modified by addition, substitution or deletion of one or more nucleotides.
  • a nucleic acid may be provided with a start codon ATG (translation start) and / or stop codon to ensure stable translation of the nucleic acid in a plant cell, or intron sequences may be deleted.
  • start codon ATG translation start
  • stop codon to ensure stable translation of the nucleic acid in a plant cell
  • Modified nucleic acids also include those nucleic acids which, under customary conditions (Sambrook et al., 1989), preferably hybridize under stringent conditions with the corresponding unmodified nucleic acid or have a homology of at least 60%, 70%, 80% at the DNA level.
  • the amino acid sequence of an avirulence protein moiety encoded by a modified nucleic acid may have an identity of at least 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or a
  • a single fragment of the avirulence gene encodes a non-functional part of the avirulence gene
  • Avirulenzproteins This means that, unlike the entire avirulence protein, a single part of the avirulence protein, when synthesized in a cell of a plant, will in no case function there as an inducer of a plant resistance protein-mediated pathogen defense reaction. However, lie all the different non-functional parts of the same
  • Avirulence protein encoded by the nucleic acids stably integrated into the genome, synthesized together in a plant cell, all of the synthesized partial proteins combine to mediate the action of the complete avirulence protein (complementation of the avirulence protein effect) by reacting directly or indirectly with the corresponding resistance protein.
  • the extent of cell death achieved in this case is not necessarily comparable to that caused by the reaction of the entire avirulence protein with the corresponding one Resistance protein would be effected.
  • the degree of cell death initiation can be increased already after complementation; conversely, for example, an increased N-terminal deletion of
  • Amino acids in a partial protein cause a significant reduction in cell death. This shows that modifications of the amino acid sequence of a partial protein can already control the extent of the complementation-induced cell death triggering, ie the effectiveness of the inducer. Thus, the intensity of the pathogen defense reaction effected by the transgenic inducer is controllable and predetermined.
  • Nucleic acids which can be used according to the invention can be taken from such an avirulence gene of a pathogen which codes for an avirulence protein which
  • a corresponding resistance protein in the plant intended for genomic integration or in at least one cell of this plant, a corresponding resistance protein is found, with which the avirulence protein can react directly or indirectly and consequently a plant pathogen defense reaction is induced, and
  • an avirulence gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and variants thereof satisfies the above requirements.
  • Such nucleotide sequences encode, for example, amino acid sequences according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • Preference is given to using avirulence genes which code for a strong inducer in a plant cell, and thus can efficiently bring about HR-mediated cell death.
  • a suitable avirulence gene may be altered while retaining the original amino acid sequence of the avirulence protein from the pathogen in accordance with the degeneracy of the genetic code.
  • the nucleotide sequence of a suitable avirulence gene can be modified, for example, to change the activity, specificity and / or activity of the avirulence protein or, for example, to remove an existing intron. Modifications can be made by addition,
  • a modified avirulence gene should further encode such an avirulence protein that satisfies the above requirements a) and b).
  • the nucleotide sequence of a modified hybridizes
  • Avirulence gene under standard conditions (Sambrook et al., 1989), preferably under stringent conditions with the unmodified nucleotide sequence, or at DNA level
  • the encoded amino acid sequence has an identity of at least 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or a similarity of at least 60%, 70%, 80%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98% or 99% with the unmodified amino acid sequence.
  • Such genetic modifications may also be used to alter a non-suitable avirulence gene of a pathogen in a manner such that it will be the above
  • Requirement a) and b) is fulfilled in order then to derive therefrom usable nucleic acids for integration into the genome of a plant and for producing a pathogen-resistant plant according to the invention.
  • Nucleic acids which can be used according to the invention from a suitable avirulence gene can be reliably identified by a method comprising the following five steps.
  • This first step can be performed by standard DNA cloning techniques (Sambrook et al., 1989). For example, by introducing new translation starts and / or stop codons from the 5 'and / or 3' end, a shortening of the avirulence gene can be achieved. In this way, several N- and / or C-terminally shortened parts of the avirulence protein can then be synthesized in the next process steps (2) and (3).
  • the constitutive promoter should also be selected such that it is functional in a cell of this plant (eg double 35S ⁇ ⁇
  • step (3) Selection of individual nucleic acids whose expression in step (2) did not lead to HR-mediated cell death.
  • step (3) In order to detect and quantify the cell death triggering in step (3), a
  • the expression of the nucleic acids generated in step (1) and / or of the complete avirulence gene may be used as a reference in the presence of at least two reporter genes, such as e.g. the
  • Luciferasereportergene from Photinns pyralis and Renilla reniformis perform.
  • step (2) the person skilled in the art can use the customary and known methods of the prior art. The necessary requirements for the selection of
  • transformed cells and the insertable constitutive promoters correspond to those from step (2).
  • the cell death induction is comparable to that effected by expression of the complete avirulence gene under the control of a constitutive promoter.
  • the detection and quantification may be as described in step (3)
  • Nucleic acids isolated from an avirulence gene identified by the above method are suitable for the production of a pathogen-resistant plant according to the present invention
  • Synthesis products of these nucleic acids together in a cell of the plant serve as an inducer of a pathogen defense reaction. To ensure that this induction is intended or
  • the regulation and control of the expression of the nucleic acids used in the pathogen-resistant plant is to be designed in the following manner.
  • stably integrated nucleic acids of a pathogen-resistant plant according to the invention are in each case operatively linked to a promoter which expresses the corresponding
  • nucleic acid At least one of these promoters is pathogen-inducible, namely, this promoter is activated as a result of infection of the plant by that pathogen or by those pathogens against which or which resistance in the plant according to the invention should ultimately be established.
  • pathogen-inducible namely, this promoter is activated as a result of infection of the plant by that pathogen or by those pathogens against which or which resistance in the plant according to the invention should ultimately be established.
  • Avirulence protein is then synthesized in cells of the plant.
  • the promoters operably linked to the remaining nucleic acids are characterized by having such specificity that ensures that at the time when the portion of the avirulence protein under the control of said pathogen-inducible promoter in an infected cell of the plant synthesized, also the remaining parts of the avirulence protein synthesized in this cell are present.
  • This is realized by virtue of the fact that the promoters which are operatively linked to the remaining nucleic acids have a specificity such that spatially, temporally and / or differently overlapping expression regulation of the operatively linked nucleic acids is ensured with said pathogen-inducible promoter.
  • three promoters may have overlapping expression regulation, one of which is pulp-specific, another is fruit-specific, and a third
  • nucleic acids operatively linked to the three promoters then takes place only after fungal attack of the fruit and only in the ripening fruit itself.
  • all known promoters can be used as promoters for the regulation of the remaining nucleic acids. These include, for example, constitutive, tissue-specific, organ-specific, storage-induced, development-specific or pathogen-inducible promoters.
  • said pathogen-inducible promoter is to be selected such that it can be induced by as many pathogens or pathogen classes as viruses, bacteria, fungi and / or animals.
  • the more specific one of the pathogen-inducible promoters used is, for example, a specific pathogen or a specific part of a pathogen class, the more the spectrum of pathogens to which an increased resistance is ultimately achieved in the plant according to the invention is limited.
  • different pathogen-inducible promoters are to be used, as this can significantly increase the specificity towards abiotic stimuli.
  • the pathogen-inducible promoter preferably leaves an expression of the regulated
  • Effector molecules for example, the well-known PEP25.
  • pathogens Inducible promoters which are either directly or indirectly induced as a result of wounding, are used primarily to repel pathogens penetrating into the cell / plant.
  • pathogen-inducible promoters whose activation is mediated directly or indirectly by the plant PAMP / MAMP recognition.
  • At least one promoter for regulating the expression of the nucleic acids is a synthetic or chimeric promoter. In a particularly preferred
  • At least one of the pathogen-inducible promoters is a synthetic or chimeric promoter.
  • the reason for this is that so far usually the plant pathogen inducible promoters have been used mainly by pathogen-responsive genes whose specificity could be partially improved by a shortening (Martini et al., 1993).
  • pathogen responsive genes e.g., PR protein genes
  • PR protein genes are not only under biotic stress, but also in response to abiotic stress, hormonal changes, and various pathogen responsive genes.
  • any pathogenresponsive c / 's-regulatory element can be used in a synthetic or chimeric, pathogen-inducible promoter.
  • Such cis-regulatory elements may be in multiple copies and / or in combination with each other and / or with other cis-regulatory elements in a synthetic or chimeric promoter.
  • the usable nucleic acids which are suitable for producing a pathogen-resistant plant according to the invention form operatively linked to the specific and coordinated promoters a composition of nucleic acids comprising at least two nucleic acids for integration into a genome of a plant, wherein the nucleic acids
  • the promoters is pathogen inducible, such that in a cell of the plant, as a result of infection of the plant by the pathogen, the different parts of the plant
  • the pathogen resistance of the plant according to the invention is mediated by the direct or indirect reaction of the synthesized parts of the avirulence protein with a resistance protein already present in a cell of the plant corresponding to the avirulence protein (Flor, 1971, Dangl & Jones, 2001, Jones & Dangl, 2006).
  • the resistance gene which codes for the resistance protein has either already been naturally present in the genome of the plant according to the invention or has been introduced via genetic engineering or breeding methods (Keller et al., 1999, Belbahri et al., 2001).
  • a plant according to the invention may be of the dicotyledonous, monocotyledonous and gymnospermous plants of any species.
  • such plants may be selected from the species of the following group: Arabidopsis, sunflower, tobacco, sugarbeet, cotton, maize, wheat, barley, rice, sorghum, tomato, banana, melon, potato, carrot, soy ssp., Sugar cane, wine, Rye, oats, rape, lawn and forage grass.
  • a plant according to the invention is preferably a plant of the genus Beta.
  • the invention also includes a seed, a part, an organ, a tissue or a cell of the plant according to the invention.
  • pathogen-inducible promoter eg Agrobacterium tumefacial-mediated transformation
  • pathogen-inducible promoter eg Agrobacterium tumefacial-mediated transformation
  • these methods are so invasive that the wounds caused lead to the induction of a pathogen-inducible promoter (eg biolistic transformation).
  • pathogen-inducible promoter eg biolistic transformation
  • one suitable method of production which avoids activation of pathogen-inducible promoters is the crossing of two transgenic parent plants, each of these parent plants characterized by being stably transformed with at least one but not all nucleic acids from the nucleic acid composition, and itself does not have the pathogen resistance intended for the offspring.
  • a parent plant at least the one or more nucleic acid (s) from the composition of
  • Nucleic acid from the composition of nucleic acids does not contain, but which has the other parent plant.
  • the two plants could exhibit the following genetic features:
  • the first parent plant is characterized by a stably integrated into the genome
  • Nucleic acid encoding a first portion of the avirulence protein and operably linked to a pathogen inducible promoter is characterized by a nucleic acid stably integrated into the genome which encodes a second part of the avirulence protein and is operably linked to a promoter having a specificity which has an expression regulation overlapping with the pathogen-inducible promoter.
  • the first and second parts of the avirulence protein are different.
  • the stably integrated into the genome nucleic acids of the first and second parent plants are inherited during the crossing to a descendant of the two plants. This plant produced represents a pathogen-resistant plant according to the invention.
  • the resistance gene which codes for the resistance protein corresponding to the avirulence protein is present at least in a plant used for crossing and has been passed on to the produced plant according to the invention during the crossing.
  • the invention also relates to seeds, parts, organs, tissues or cells of these plants, as well as the use of these for the purpose of producing a plant according to the invention.
  • the skilled person can fall back on the commonly used methods.
  • the abovementioned first parent plant itself to be transformed into Agrobacterium tumefaciens vermi te, because even if this leads to an induction of the pathogen-inducible promoter, the result of the resulting expression of the operatively linked nucleic acid is a non-functional part of the avirulence protein.
  • This part of the avirulence protein is alone is unable to act as an inducer of a pathogen defense response in response to the transformation procedure used.
  • parent plants may be double-haploid, or at least homozygous for the particular nucleic acid (s) and / or resistance gene.
  • the preparation of such plants is well known to those skilled in the art (Gürel et al., 2000).
  • the plant according to the invention may also be a hybrid plant (hybrid) which, in addition to the increased resistance to at least one pathogen, may also have other advantageous agronomic properties due to the heterosis effect. Such properties are for example improved tolerances against abiotic or biotic stress, increased yield, etc.
  • hybrid plants it is advantageous inbred plants as
  • Hybrid system requires that the parent plants of the hybrid offspring do not yet have the pathogen resistance to at least one pathogen mediated by the synthesis products of the nucleic acids. Only in the hybrids (Fl-generation) this characteristic is pronounced. Populations of descendants of Fl hybrids (F2, F3, etc. generations) tend to lose pathogen resistance due to segregation. From a commercial point of view, such a hybrid system is highly interesting.
  • FIG. 1 Representation of the 5 ' and 3' truncations in the pthG gene used for the functional
  • pthG 6 2-488 encodes the PthG protein from amino acid position position 62 to 488.
  • FIG 2 Detection of non-functional parts of the avirulence protein PthG by transient coexpression of nucleic acids in leaves of a beta vw / gam plant. The high of
  • FIG. 3 Schematic representation of the results for identifying the functional regions of the PthG protein necessary for the initiation of cell death.
  • the DNA fragments that can trigger cell death after transient expression are shown in black.
  • the truncated DNA fragments of the pthG gene, which could no longer trigger cell death, are shown in light gray.
  • FIG. 4 Detection of the complementation of the avirulence gene function (cell death triggering)
  • FIG. 5 Detection of the minimally necessary sequences for the complementation of the pthG gene by transient coexpression in sugar beet leaves.
  • the level of relative reporter gene activity is a measure of the vitality of the transformed beta vw / gara cells. Measured values are given as mean values of 3 experiments ⁇ SD.
  • FIG. 6 Functional characterization of the sugar beets stably transformed with the sequences pthGi2i-488 and pthGi.255.
  • FIG. A transient complementation test quantitatively determines the suitability of each independent sugar beet transformant for cell death and thus the intensity of pathogen defense.
  • the level of relative reporter gene activity is a measure of the vitality of the transformed beta vw / gara cells.
  • Lines PR144 are transformed with construct 2xS-2xD-pthGi 2 i-488-kan.
  • the lines PR148 are transformed with the construct 2xS-2xD-pthG 1.255-kan.
  • FIG. 7 Schematic representation of a plant cell in which, by crossing, the two for the
  • Complementation necessary pthG sequences have been brought together from two independent transgenic pus.
  • the expression of the pthG fragments is under the control of two identical or different synthetic pathogen-specific promoters 1 and 2.
  • Coexpression of the PthG protein fragments PthGi.255 and PthGn gg triggers a hypersensitive reaction (cell death) in response to a yet unknown resistance protein. a strong
  • PAMP pathogen-associated molecular pattern
  • FIG. 8 Detection of transcript accumulation of the genes pthGi.255 and pthGn gg in PR144 ⁇ PR148 crosses by qRT-PCR. Normalized transcript accumulation of pthGi.255 (A) and pthG, 21-88 (B) in / M-v / Tro plants of the species Beta vulgaris (see also Table 6) and in the
  • Measured values represent mean values of three biological replicates each.
  • FIG. 9 Detection of reduction of fungal biomass and enhanced pathogen defense in PR144 x PR148 crosses by qRT-PCR. Normalized transcript accumulation of C. beticola ribosomal protein gene 60S (A) and B. vulgaris gene for BvCoMT (B) in / V v Tro plants from PR144 x PR148 crosses (see Table 6) and in the control plants , 3DC4156 and PR167 / 11, at day 0, 1, 2, 4 and 7 after C. beticola infection. Measured values represent mean values of three biological replicates each.
  • FIG. 10 Different development of PthG crosses after germination and in the greenhouse A: rapid cell death of a sugar beet seedling (within 3 days) from the junction PR171 / 19 ⁇ PR 144/4
  • FIG 1 1 Detection of the transcript of the genes pthG 62- 255 and 121 pthG -4gg in the PR171 / PR144 19 x / 19 crossing PR5021 -2010 T-003 by qRT-PCR.
  • transgenic sugar beets carrying the promoter-gene combinations 4xD-pthG 62-255 and 2xS-2xD-pthG 121-488 after crossbreeding, 1 1 day after Inoculation a strong accumulation of both the pthG62-255 and the Transcripts.
  • the transcript amounts are according to Weltmeier et al. (201 1) against a constitutively expressed
  • Progeny PR5021 -2010-T-003 are clonally propagated and are genetically identical.
  • Control non-infected PR5021 -2010-T-003 plant
  • Infected 1 and Infected 2 two infected PR5021-2010-T-003 plants.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of the coding region of the bacterial pthG gene from the plasmid pQE60-pthG, which contains a 2.8 kb genomic BamHI-HindIII fragment from Erwinia herbicola pv. Gypsophilae.
  • SEQ ID NO: 3 nucleotide sequence of the pthG ⁇ gg gene with flanking Ncol and BamHI
  • SEQ ID NO: 5 nucleotide sequence (pthGi.255), coding for partial protein PthG 1 -2 55
  • SEQ ID NO: 7 nucleotide sequence (pthG62-255) encoding partial protein PthG6 2 -255
  • SEQ ID NO: 9 nucleotide sequence (pthG 9 2-255), coding for partial protein PthG 9 2-255
  • SEQ ID NO: 1 nucleotide sequence (pthG 121-255), coding for partial protein PthGi2i-255
  • SEQ ID NO: 15 nucleotide sequence (-488 pthG 92), coding for part of protein PthG 92 _488
  • SEQ ID NO: 17 nucleotide sequence (pthGi62-48s) coding for part of protein PthGi6 2-88
  • SEQ ID NO: 19 nucleotide sequence (pthG205-48s) > coding for partial protein PthG205-488
  • SEQ ID NO: 21 nucleotide sequence (pthG 2 45-488) encoding partial protein PthG 2 45-88
  • SEQ ID NO: 23 nucleotide sequence (pthG253-48s) ; coding for partial protein PthG 2 53-88
  • SEQ ID NO: 27 nucleotide sequence (pthG257-8s) encoding partial protein PthG 2 57-488
  • SEQ ID NO: 29 nucleotide sequence (pthGi.350), coding for partial protein PthGi.350
  • SEQ ID NO: 33 nucleotide sequence (pthGi.412), coding for partial protein PthGj.412
  • SEQ ID NO: 35 nucleotide sequence coding for partial protein
  • SEQ ID NO: 37 nucleotide sequence (pthGi_486) encoding partial protein PthGi_486
  • SEQ ID NO: 39 nucleotide sequence S549, for a primer
  • SEQ ID NO: 40 nucleotide sequence S544, for a primer
  • SEQ ID NO: 41 nucleotide sequence S558, for a primer
  • SEQ ID NO: 42 nucleotide sequence S550, for a primer
  • SEQ ID NO: 43 nucleotide sequence S551, for a primer
  • SEQ ID NO: 44 nucleotide sequence S545, for a primer
  • SEQ ID NO: 45 nucleotide sequence S552, for a primer
  • SEQ ID NO: 46 nucleotide sequence S561, for a primer
  • SEQ ID NO: 47 nucleotide sequence S560, for a primer
  • SEQ ID NO: 48 nucleotide sequence S559, for a primer
  • SEQ ID NO: 49 nucleotide sequence S553, for a primer
  • SEQ ID NO: 50 nucleotide sequence S562, for a primer
  • SEQ ID NO: 51 nucleotide sequence S554, for a primer
  • SEQ ID NO: 52 nucleotide sequence S1420, for a primer for qRT-PCR determination of the ribosomal protein 60S from C. beticola
  • SEQ ID NO: 53 nucleotide sequence S 1421, for a primer for qRT-PCR determination of the ribosomal protein 60S from C. beticola
  • SEQ ID NO: 54 nucleotide sequence (pthG 2-i2o) encoding partial protein PthG9 2- i2o
  • SEQ ID NO: 56 nucleotide sequence (pthG 4 4] .48 6 ), coding for partial protein PthG 4 4i _4g6
  • the avirulence gene pthG (pathogenicity gene on Gypsophila, SEQ ID NO: 1) encodes the 488 amino acid large avirulence protein PthG (SEQ ID NO: 2) and was isolated from the pathogen Erwinia herbicola pv. Gypsophilae ⁇ Pantoea agglomerans pv. Gypsophilae) (Ezra et al., 2000).
  • the pthG gene acts as a virulence factor in gypsophila (Gypsophila).
  • pthG gene is thus an avirulence gene with a broad host range that reacts with a beta conserved, unknown resistance gene.
  • the gene pthG gg (SEQ ID NO: 3) was operatively linked to the currently most suitable synthetic pathogen-inducible promoter comprising the combination of cs-regulatory elements 2xS-2xD (see WO / 00/29592), hereinafter referred to as 2xS 2xD synthetic promoter.
  • 2xS 2xD synthetic promoter The transformation of the construct 2xS-2xD-pthG Mgg -kan in sugar beet cells, carried out according to Lindsey & Gallois, 1990, led to a temporary activation of the synthetic promoter and thus to the death of the Agrobacterium tumefaciens bacteria
  • Table 1 Comparison of the transformability of the pinG ⁇ s gene with the Luc gene in sugar beet.
  • the pthG gene and Luc gene are both under the control of the 2xS-2xD synthetic promoter in the otherwise identical binary vectors 2xS-2xD-pthG-kan and 2xS-2xD-luc-kan. Shown is the number of independent transgenic plants obtained per experiment and in parentheses the sugar beet genotype used.
  • said fragments were determined by PCR using the primer pairs S549 / S544 (SEQ ID NO: 39 / SEQ ID NO: 40), S558 / S544 (SEQ ID NO: 41 / SEQ ID NO: 40), S550 / S544 (SEQ ID NO: 42 / SEQ ID NO: 40) and S551 / S544 (SEQ ID NO: 43 / SEQ ID NO: 40) and the starting plasmid pQE60-pthG using Pfu polymerase.
  • the PCR conditions were as follows:
  • antisense primer (20 ⁇ ) 0.5 or 1 ⁇
  • MgCl 2 was added to some PCR amplifications. Here, concentrations of 1 V to 4 V per PCR were added.
  • the 5 'primers S549 (SEQ ID NO: 39), S558 (SEQ ID NO: 41), S550 (SEQ ID NO: 42), and S551 (SEQ ID NO: 43) contain a Ncol (CCATGG) site with the N-terminal deletions were provided with a starting methionine.
  • the primer S544 (SEQ ID NO: 40) has a BamHI site behind the stop codon of the pthG 88 gene.
  • said DNA fragments were determined by PCR using the primer pairs S545 / S552 (SEQ ID NO: 44 / SEQ ID NO: 45), S545 / S561 (SEQ ID NO: 44 / SEQ ID NO: 46), S545 / S560 (SEQ ID NO: 44 / SEQ ID NO: 47), S545 / S559 (SEQ ID NO: 44 / SEQ ID NO: 48), S545 / S553 (SEQ ID NO: 44 / SEQ ID NO: 49), S545 / S554 (SEQ ID NO: 44 / SEQ ID NO: 51) and S545 / S562 (SEQ ID NO: 44 / SEQ ID NO: 50) as described for the N-terminal deletions amplified and cloned.
  • S545 / S552 SEQ ID NO: 44 / SEQ ID NO: 45
  • S545 / S561 SEQ ID NO: 44 / SEQ ID NO: 46
  • gold powder 60 mg were weighed into an Eppendorf reaction vessel, followed by the addition of 1 ml of 70% EtOH, which was vortexed for 5 min and then allowed to stand for 15 min
  • the gold was sedimented by brief centrifugation (about 5 sec) (Pico Fugue® , Stratagene, Amsterdam) and the supernatant discarded
  • the gold was resuspended in 1 ml bidistilled H 2 O, vortexed for 1 min, allowed to stand for 1 min, and sedimented again (5 sec), the supernatant was discarded and the sediment resuspended in 1 ml bidistilled H 2 O. This washing step was repeated a total of three times and the washed gold was finally taken up in 1 ml 50% glycerol.
  • plasmid DNA was used which had been purified by silica gel columns and adjusted to a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ l.
  • the reporter gene construct used was the plasmid p70S lue with the luciferase gene from Photinus pyralis and as the normalization vector p70S ruc with the luciferase gene from Renilla reniformis.
  • the gold was vortexed for at least 5 min and 2.5 ⁇ effector plasmid DNA (1 ⁇ g / ⁇ l) and 2.5 ⁇ p70S lue plasmid DNA transferred to an Eppendorf tube and mixed, added to 25 ⁇ gold suspension; It was important to constantly vortex the suspension. In addition were "
  • the amounts of the normalizing gold were increased according to the number of repetitions.
  • PthG 2 57-488 ceases cell death, so that the protein region of amino acid position 92-120 (SEQ ID NO: 55) is necessary for cell death initiation, while the protein region from position 1 -91 for ⁇
  • Amino acid position 92-120 and 441-486 are required for the Zeiitodauslect, the inactive partial fragments in sugar beet leaves were transiently co-expressed by the ballistic test. While the individually expressed nucleic acids did not induce cell death, coexpression of the pthGi.255 and pthGi2i- 88 nucleic acids resulted in a strong cell death comparable to the cell death triggered by the complete protein PthG gg.
  • the C-terminally deleted protein PthGi.255 was further shortened starting from the N-terminus.
  • the newly created nucleic acids pthG 6 2-255, pthG 2-255, pthG i.255 and pthGi.255 were cotransformed together with the nucleic acid pthGi2i- 88 in sugar beet leaves in three experiments.
  • the shortening of the molecules in combination with pthGm ⁇ ss resulted in a gradual decrease the cell death trigger.
  • the protein portions encoded by pthGi.255 and pthG) 2 i-488 elicited the strongest cell death, almost as strong as cell death by the complete protein PthGi-488.
  • Table 2 Limitation of the amino acid ranges necessary for the cell death release in the range 1-255 of the two-part avirulence protein (+ indicates the intensity of the triggered cell death, - no cell death).
  • Nucleic acids pthG ⁇ ss, pthG 20 5-488, pthG 24 5-488, pthG 25 3-488, pthG G + 56-i88 and pthG 12 i-48 were co-incubated with the pthGi-255 nucleic acid in three experiments in cells of sugar beet leaves cotransformed.
  • the coding region had been changed to have the amino acid sequence PthG G + 25 6-488 extended at the N-terminus by one glycine.
  • the protein parts PthGi62-488, PthG2os-488 and PthG 2 45-488 were with respect to the
  • Table 3 Limitation of the amino acid ranges necessary for the cell death induction in the range 121-488 of the two-part avirulence protein (+ indicates the intensity of the triggered cell death, - no cell death).
  • a prerequisite for a successful complementation of the cell death triggering effect is a minor overlap of the amino acid sequences of the two PthG subfragments, which in the case of PthGi.255 and 1 is 1 amino acids. An overlap of 3 amino acids as in the case of PthGi.255 and PthG 2 53-488 is not enough.
  • the transgenic lines were selected which had only one T-DNA integration and thus one pthG gene under the control of a synthetic promoter.
  • synthetic promoters employed are very specifically activated by pathogen infestation, these promoters are also wound-induvable (Rushton et al., 2002).
  • Leaves from greenhouse grown transgenic lines were each a) with the empty vector pCaMV-2 as a negative control, b) with the complete pthG 1 -4 88 gene under the control of double 35S promoter (construct 70S-pthGi_4 88) as a positive control and c) transiently ballistically transformed with the complementing partial fragment pthG ⁇ ss or pthGi.255 under the control of the double 35S promoter.
  • the normalized reporter gene activity obtained with the empty vector was set to 100% as a reference.
  • the transgenic lines PR171 and PR173 were functionally analyzed, which were transformed with the 4xD promoter in combination with the minimal necessary sequences pthGö2-255 and pthG245-488. Comparable to the results with the PR144 and PR148 plants, the 4xD-pthG62-255 and 4xD-pthG245_ 88 plants showed a broad range of cell death induction after transient complementation with the constructs 70S-pthG2 5-88 and 70S-pthG62-255 (Table 5) ).
  • transgenic lines PR144, PR148, PR171 and PR173 could be used for different crosses (see for example FIG. 7 and Table 6).
  • One possibility is to cross transgenic sugar beet in which the two pthG subfragments are under the control of the same pathogen inducible promoter, eg, the 2xS 2xD promoter. A corresponding intersection was made for the line PR148 / 56 with the lines PR144 / 4 and PR144 / 30.
  • Seed obtained from crossbreeds was surface disinfected and laid out under tissue culture conditions on MS medium. The thus obtained in-vitro plants were checked by PCR for the presence of the two pthG fragments and amplified clonally.
  • Infected and uninfected plants were harvested 1, 2, 4 and 7 days after inoculation (three biological replicates each), RNA isolated as described and qRT-PCR analysis performed to transcript accumulation of pthGi.255 and pthGi2i-488 according to Cercospora beticola - prove infection.
  • the controls used were non-transgenic sugar beet plants (3DC4156) and transgenic sugar beet plants transformed with the construct FP635 under the control of a pathogen-inducible promoter (PR167 / 11).
  • FP635 codes for a red-fluorescent protein with a stimulation at a maximum wavelength of 589 nm and a light emission at a wavelength maximum of 636 nm. It itself has no influence on the plant pathogen defense.
  • the nucleic acid in the PR148 x PR144 crosses was strongly induced as a result of C. beticola infection (FIG.8B), while no transcript accumulation can be detected in the nontransgenic and transgenic controls.
  • the level of expression of plant pathogen defense components can be quantified.
  • the transcript accumulation of the B. vulgaris gene of caffeic acid O-methyl transferase BvCoMT (FIG. 9B), which is induced in resistance reactions of the sugar beet to C. beticola (Weltmeier et al., 201 1), was in each case three biological replicates of PR148 x PR144 - Crosses (in-vitro plants) on day 1, 2, 4 and 7 after Cercospora beticola-inio txon by qRT-PCR as described in Weltmeier et al.
  • Seeds were obtained from the crossings PR171 / 19x PR144 / 4, PR171 / 19x PR 144/5, PR171 / 19xPR144 / 19 and PR171 / 2xPR144 / 4 and PR171 / 2xPR144 / 19, but only the intersection PR171 / 19xPR144 / 19 resulted viable
  • Parents PR171 / 17 and PR144 / 19 show 64% and 62% relative, respectively
  • Enzyme activity in transient complementation test a lower cell death induction than the rest selected crossing partners (Table 7).
  • the inducibility or expression of the partial fragments should not be too strong in the parent lines and, secondly, the gradual selection of different levels of activity may eventually result in finding a suitable combination of parents.
  • Table 7 Results of crossing transgenic pthG plants with different functional activity.
  • the relative enzyme activity of the transgenic lines in the transient complementation test is given in parentheses (Tables 4 and 5).
  • Doubled haploid plant production from unpollinated ovules of sugar beet (Beta vulgaris L.). Plant Cell Reports 19: 1 155-1 159.
  • WO / 1991/15585 (Rijkslandbouwhogeschool Wageningen). Method for protection of plants against pathogens.
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Abstract

Durch die vorliegende Erfindung werden pathogenresistente transgene Pflanzen bereitgestellt, welche stringent reguliert infolge einer Pathogeninfektion eine Resistenzprotein-vermittelte Pathogenabwehrreaktion in einer Zelle der Pflanze aufzeigen. Dabei werden als Induktor der Pathogenabwehr Teile von Avirulenzproteinen genutzt, deren stabile Integration mittels üblicher Transformationsverfahren möglich ist. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung von Nukleinsäuren, die nach Integration in das Genom einer Pflanze, in dieser die Pathogenresistenz vermittelt, ein Verfahren zur Herstellung einer pathogenresistenten Pflanze und Pflanzen zur Herstellung einer pathogenresistenten Pflanze.

Description

^
Pathogen resistente transgene Pflanze
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pathogenresistente Pflanze, insbesondere eine Pflanze mit einer neuartigen Resistenz basierend auf der Reaktion von mehreren Teilen eines Avirulenzproteins mit einem korrespondierenden Resistenzprotein in einer Zelle der Pflanze, eine Zusammensetzung von Nukleinsäuren, die nach Integration in das Genom einer Pflanze, in dieser die Pathogenresistenz vermittelt, ein Verfahren zur Herstellung einer pathogenresistenten Pflanze und Pflanzen zur Herstellung einer pathogenresistenten Pflanze.
Hintergrund der Erfindung
Durch Phytopathogene wie Pilze, Viren, Nematoden und Bakterien hervorgerufene
Pflanzenkrankheiten bewirken weltweit große Ernteverluste, beeinträchtigen in hohem Maße die Qualität der Ernteprodukte und machen einen aufwendigen Einsatz chemischer Pflanzenschutzmittel notwendig. Häufig reichen die natürlichen Maßnahmen des pflanzlichen Immunsystems, mit deren Hilfe die Mehrzahl potentieller Krankheitserreger abgewehrt oder deren Ausbreitung verzögert und einschränkt werden kann, nicht aus.
Das pflanzliche Immunsystem reagiert auf einen Pathogenbefall. In einer ersten Phase erkennen Transmembranrezeptoren (PRRs, pattern recognition receptors) molekulare Muster eines Pathogens (sog. MAMPs oder PAMPs, microbial- oder pathogen-associated molecular patterns) und vermitteln in der Pflanze die "PAMP-triggered immunity" (PTI), die eine weitere Ausbreitung des Pathogens unterbinden soll.
Pathogene haben jedoch Strategien entwickelt dieser ersten Abwehrreaktion zu bestehen. Pathogene nutzen unterschiedlichste Infektionswege: Während pathogene Bakterien beispielsweise über Stomata und Hydathoden oder als Folge einer Verwundung in die Pflanze gelangen können und sich dort im apoplasmatischen Raum vermehren, dringen Pilze direkt in epidermale Pflanzenzellen ein oder bilden Hyphen auf oder zwischen den epidermalen Zellen, mit denen sie auch in der Lage sind nach
Erreichen der Stomata über diese in das Pflanzengewebe einzuwachsen. Bei all den Unterschieden ist jedoch allen Pathogenklassen gemein, dass sie im Wege der Infektion Effektormoleküle
(Virulenzfaktoren) in die Pflanzenzellen abgeben, wo diese maßgeblich die Virulenz des Pathogens beeinflussen. So sind einige Effektoren in der Lage die PTI derart abzuschwächen, dass eine
|Bestätigungskopie| erfolgreiche Kolonialisierung der Wirtspflanze ermöglicht wird (effector triggered susceptibility, ETS) (Jones & Dangl, 2006).
Gegen diese ETS richten sich weitere Phasen der pflanzlichen Immunabwehr. Einige in die pflanzliche Zelle geschleuste Effektormoleküle, die Avirulenzproteine, werden sehr spezifisch durch pflanzliche NBS-LRR-Resistenzproteine (R-Proteine) erkannt. Dabei reagieren die Avirulenzproteine entweder direkt oder indirekt entsprechend der Guard-Hypothese mit dem korrespondierenden R-Protein, woraufhin eine Aktivierung des R-Protein erfolgt (Dangl & Jones, 2001 ; Jones & Dangl, 2006). Das aktivierte R-Protein ist in der Lage eine Signalkaskade auszulösen, die eine beschleunigte und verstärkte PTI in der Pflanze bewirkt, die sog. effector triggered immunity, ETI (Jones & Dangl, 2006). Somit stellen Avirulenzproteine generell Induktoren einer pflanzlichen Pathogenabwehr- reaktion dar. Diese äußert sich in unterschiedlichen physiologischen Reaktionen der Pflanze, wie in einer hypersensitiven Reaktion (HR), einer weiteren Verstärkung der Zellwand durch Lignifizierung und Kallosenbildung, in der Synthese von Phytoalexinen, der Produktion von PR-(pathogenesis- related)-Proteinen und häufig auch in dem kontrollierten Zelltod des Wirtsgewebes an der
Infektionsstelle des Pathogens.
Trotz dieser Maßnahmen des pflanzlichen Immunsystems gelingt es dennoch manchen Pathogenen die ETI zu behindern und die Pflanze erfolgreich zu infizieren, indem sie beispielsweise die erkannten Effektoren diversifizieren oder zusätzliche ETI-hemmende Effektoren bereitstellen. Daher ist es schon lange ein Ziel der Züchtung und Forschung die Resistenz von Pflanzen, bevorzugt von Nutzpflanzen, gegenüber Pathogenen weiter zu steigern, womit insbesondere beabsichtigt wird, die Pflanzen derart zu verbessern, dass sie gegenüber einer Vielzahl von Pathogenen gleichzeitig resistent gemacht werden (breite Pathogenresistenz).
Mit diesem Ziel stellte auch de Wit bereits Anfang der 1990er Jahre in WO/1991/15585 (auch in de Wit, 1992) sein visionäres Konzept vor: Es basiert auf der Pathogen-induzierten Coexpression eines pflanzlichen Resistenzgens und des korrespondierenden Avirulenzgens aus dem Pathogen in einer Zelle einer Pflanze, wodurch nach Pathogenbefall begrenzt auf den Ort der Infektion eine
Abwehrreaktion der Pflanze durch Aktivierung des synthetisierten Resistenzproteins induziert werden soll, und zwar schneller und effektiver als dies durch die Maßnahmen des pflanzlichen Immunsystems natürlicherweise geschehen würde.
Lange galt dieses Konzept jedoch als nicht umsetzbar. So wird in WO/1995/31564 schon darauf verwiesen, dass aus WO/1991/15585 insbesondere nicht hervorgeht, welche Polynukleotidsequenzen als geeignete Promotoren für eine breite Pathogenresistenz einsetzbar sind. So heißt es außerdem, dass im Falle des vorgeschlagenen Tomaten-Resistenzgens Cf-9 in Kombination mit dem Avirulenzgen Avr9 aus Cladosporium f lv m die induzierte Nekrose aufgrund der Spezifität der vorgeschlagenen Promotoren zu einer weiterführenden Induktion von Cf-9 und/oder Avr9 führen könnte, was eine unkontrollierte Nekrose als Folge der Hypersensitiven Reaktion zur Folge haben könnte.
Erst im Jahre 1999 berichten Joosten und de Wit, dass es gelungen sei, eine Cf-9-tragende
Tomatenpflanze mit einem Avr9-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle eines verkürzten prpl -1 (gstl ) Promotors (Martini et al., 1993) zu transformieren und auf diese Weise eine erhöhte
Pilzresistenz von Tomaten gegenüber mehreren Pilzen zu bewirken (Joosten & de Wit, 1999). Die beiden Autoren räumen jedoch auch ein, dass ein weiterer Optimierungsbedarf hinsichtlich der stringenten Regulation des Promotors und einer unerwünschten Induktion des gst/-Promotorfragments in nichtinfizierten Geweben besteht (Strittmatter et al., 1996).
WO/1999/43823 offenbart die Erzeugung transgener Maispflanzen, welche mit dem fungalen Avirulenzgen avrRxv unter der Kontrolle eines Pathogen-induzierbaren Promotors biolistisch transformiert wurden, während sie das korrespondierende Resistenzprotein bereits natürlicherweise enthielten. Die eingesetzten Pathogen-induzierbaren Promotoren sind jedoch aufgrund einer hohen Hintergrundsaktivität nicht spezifisch genug für einen Ansatz zur Erlangung einer breiten
Pathogenresistenz. Zudem können einige der vorgeschlagenen Promotoren unter Umständen eine systemische Antwort auf eine Pathogeninfektion auslösen, was zu einer unerwünschte Aktivierung dieser Promotoren auch in nichtinfizierten Zellen führen würde. Dass die technische Lehre aus WO/1999/43823 bestenfalls nur auf Avirulenzgene mit einer schwachen Pathogenabwehrinduktion anwendbar ist, zeigt sich auch in dem Vorschlag der Autoren alternativ zu den Pathogen-induzierbaren auch schwach-konstitutive Promotoren zur Expressionskontrolle des Aviruienzgens einzusetzen.
Auch wenn der Stand der Technik bereits Verfahren zur Herstellung von Pflanzen sowie erzeugte Pflanzen mit einer verbesserten Pathogenresistenz nach dem Konzept von de Wit bereithält, können diese technischen Lehren des vorstehenden Stands der Technik jedoch nicht ohne Weiteres auf die Integration jeglicher Avirulenzgene, insbesondere solcher, die für starke Induktoren einer
Zelltodauslösung kodieren, übertragen und angewendet werden. Der Grund hierfür liegt nicht unmittelbar in der unzureichend stringenten Regulation der transgenen Expression des Aviruienzgens, sondern vielmehr in der Schwierigkeit ein solches Avirulenzgen unter der Kontrolle eines Pathogen- induzierbaren Promotors stabil in das Genom einer Pflanze zu integrieren. Denn bereits während der Durchführung der gebräuchlichen Techniken der Pflanzentransformation, welche für die stabile genomische Integration eines Aviruienzgens auch aus vorstehendem Stand der Technik vorgeschlagen werden, werden die heute bekannten Pathogen-induzierbaren pflanzlichen Promotoren ungewollt induziert. Dies betrifft sowohl Agrobacterium
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als auch biolistische
Transformationsverfahren. So sind beispielsweise Pflanzen, insbesondere solche, die weniger empfänglich für Transformationsverfahren sind, in der Lage über AMP- bzw. PAMP-responsive Rezeptoren in der pflanzlichen Zellmembran auf die Anwesenheit von A. tumefaciens direkt oder indirekt mit der Aktivierung von Pathogen-induzierbaren Promotoren zu reagieren (Jones & Dangl, 2006; uta & Tripathi, 2005; WO/2007/068935). Ebenso werden zahlreiche Pathogen-induzierbare Promotoren auch durch Verwundung, wie sie zum Beispiel während der biolistischen Transformation auftreten, aktiviert (Stahl et al., 2006). Das Ergebnis ist in jedem Fall die unerwünschte Expression des eingebrachten Avirulenzgens. Das synthetisierte Avirulenzprotein reagiert mit dem bereits vorhandenen korrespondierenden Resistenzprotein und löst die pflanzliche Abwehrmaßnahmen (ETI) aus. Deshalb fuhrt dies in der Regel schon dazu, dass entweder die Vitalität dieser transformierten Zellen auch ohne "echte Pathogeninfektion" bereits stark eingeschränkt wird oder die transformierten Zellen sogar kontrolliert zum Absterben gebracht werden. Dieser Umstand hat vor Allem die
Transformation von Avirulenzgenen, die für Induktoren von zelltodauslösenden HR-Reaktionen in Gegenwart eines korrespondierenden Resistenzproteins kodieren, und die erfolgreiche Regeneration der transformierten Zellen zu vitalen Pflanzen bislang gänzlich verhindert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung wurde vor dem Hintergrund des vorstehend beschriebenen Stands der Technik gemacht, wobei es Aufgabe der vorliegenden Erfindung war, eine transgene pathogenresistente Pflanze bereitzustellen, in welcher mittels einer stabilen Integration eines pathogenen Induktors eine stringent regulierte Resistenzprotein-vermittelten pflanzliche Abwehrreaktion mit Zelltodauslösung infolge einer Pathogeninfektion stattfindet.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der gestellten Aufgabe durch eine pathogenresistente Pflanze, umfassend mindestens zwei stabil in das Genom integrierte Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäuren
(i) für unterschiedliche Teile eines Avirulenzproteins kodieren und
(ii) mit Promotoren operativ verknüpft sind,
und mindestens einer der Promotoren Pathogen-induzierbar ist, so dass in einer Zelle der Pflanze infolge einer Infektion der Pflanze durch den Pathogen die unterschiedlichen Teile des
Avirulenzproteins synthetisiert vorliegen und mit einem korrespondierenden Resistenzprotein direkt oder indirekt reagieren.
Einige der in dieser Anmeldung verwendeten Begriffe werden nachfolgend zunächst näher erläutert:
Ein "Avirulenzprotein" wird durch ein "Avirulenzgen" kodiert und stellt ein Effektormolekül eines Pathogens dar, welches bei der Pathogenerkennung durch die pflanzliche Immunabwehr eine wesentliche Rolle spielt. Im Zusammenhang mit der pflanzlichen Pathogenabwehr zeichnet sich ein Avirulenzprotein funktionell dadurch aus, dass es in der Lage ist, direkt oder indirekt mit einem korrespondierenden Resistenzprotein, sofern dieses vorhanden ist, in einer pflanzlichen Zelle zu reagieren, was dann zur Auslösung einer pflanzlichen Pathogenabwehrreaktion führt. Somit erzielte physiologische Reaktionen der Pflanze sind beispielsweise eine Hypersensitiven Reaktion (HR), eine weitere Verstärkung der Zellwand durch Lignifizierung und Kallosenbildung, die Synthese von Phytoalexinen, die Produktion von PR-(pathogenesis-related)-Proteinen und bevorzugt auch der kontrollierten Zelltod des Wirtsgewebes insbesondere am Ort der Pathogeninfektion.
Avirulenzproteine können sich unterscheiden im Bezug auf den Grad ihrer Induktionsfähigkeit für eine zelltodauslösende HR-Reaktion in Gegenwart eines korrespondierenden Resistenzproteins. Ob ein Avirulenzprotein als starker oder schwacher Induktor in einer pflanzlichen Zelle fungiert, beruht im Wesentlichen auf der Wirksamkeit des korrespondierenden Resistenzproteins in der
Pflanzenspezies, in welche das AvirulenzgenAprotein eingebracht wird. Wurde das Resistenzgen, welches das Resistenzprotein kodiert, mittels gentechnologischer Verfahren in eine Pflanze eingebracht, welche dieses Resistenzgen natürlicherweise nicht enthält, können weitere Faktoren wie z.B. ein Positionseffekt eines bestimmten Integrationsorts oder die Induzierbarkeit des mit dem Resistenzgen-verknüpften Promotors ebenfalls Auswirkungen auf die Wirksamkeit eines
Resistenzprotein und damit auch auf die Induktionsleistung eines Avirulenzproteins in dieser Pflanze haben.
Der hier verwendete Begriff "hybridisieren" bedeutet hybridisieren unter üblichen Bedingungen, wie sie in Sambrook et al. (1989) beschrieben sind, bevorzugt unter stringenten Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 x SSC bei 65 °C und
anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 x SSC bei 65 °C für insgesamt etwa 1 Stunde. Der hier verwendete Begriff "stringente Hybridisierungsbedingungen" kann auch bedeuten: Hybridisieren bei 68 °C in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA und 1 % BSA für 16 Stunden und anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 x SSC und 0,1 % SDS bei 68 °C.
Unter "Infektion" ist der früheste Zeitpunkt zu verstehen, bei dem der Stoffwechsel eines Pathogens auf eine Penetration des Wirtsgewebes vorbereitet wird. Dazu gehören z.B. bei Pilzen das Auswachsen von Hyphen oder die Bildung von spezifischen Infektionsstrukturen wie Penetrationshyphen und Appressorien. Eine "echte Pathogeninfektion" umfasst jegliche Infektion einer Pflanze mit einem Pathogen bzw. jegliche Verwundung, infolgedessen eine Pathogeninfektion stattfindet kann.
Ausgeschlossen sind jedoch Pathogeninfektionen und Verwundungen von Pflanzen und pflanzlichen Zellen, welche beabsichtigt und gezielt im Zuge eines gentechnologischen Verfahrens, wie beispielsweise Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation oder biolistische
Transformation, auftreten. "Komplementäre" Nukleotidsequenz bedeutet bezogen auf eine Nukleinsäure in Form einer doppelsträngigen DNA, dass der zum ersten DNA Strang komplementäre zweite DNA Strang entsprechend den Basenpaarungsregeln die Nukleotide aufweist, die zu den Basen des ersten Stranges korrespondieren.
Pflanzliche "Organe" meinen beispielsweise Blätter, Sprossachse, Stamm, Wurzeln, vegetative Knospen, Meristeme, Embryos, Antheren, Ovula oder Früchte. Pflanzliche "Teile" meinen einen Zusammenschluss mehrerer Organe, z.B. eine Blüte oder ein Samen, oder einen Teil eines Organs, z.B. eine Querschnitt durch den Spross. Pflanzliche "Gewebe" sind zum Beispiel Kallusgewebe, Speichergewebe, meristematische Gewebe, Blattgewebe, Sprossgewebe, Wurzelgewebe,
Pflanzentumorgewebe oder reproduktives Gewebe. Unter pflanzlichen "Zellen" sind beispielsweise isolierte Zellen mit einer Zellwand oder Aggregate davon oder Protoplasten zu verstehen.
Ein "Pathogen" im Zusammenhang mit der Erfindung meint Organismen, die in Interaktionen mit einer Pflanze zu Krankheitssymptomen an einem oder mehreren Organen bei der Pflanze führen. Zu diesen Pathogenen zählen tierische, pilzliche, bakterielle und virale Organismen. Tierische Pathogene umfassen insbesondere solche des Stamms der Fadenwürmer (Nematoda), wie zum Beispiel Spezies der Gattungen Ang ina, Ditylenchus, Globodera, Heterodera, Meloidogyne, Paratrichodorus, Pratylenchus und Trichodorus, und solche der Klasse der Insekten (Insecta), wie zum Beispiel Spezies der Gattungen Agriotes, Aphis, Atomaria, Autographa, Blithophaga, Cassida, Chaetocnema, Cleonus, Lixus, Lygus, Mamestra, Mycus, Onychiurus, Pemphigus, Philaenus, Scrobipalpa und Tipula. Die pilzlichen Pathogene sind beispielsweise ausgewählt aus den Abteilungen Plasmodiophoromycota, Oomycota, Ascomycota, Basidiomycota oder Deuteromycota, dazu gehören zum Beispiel Spezies der Gattungen Actinomycetes, Alternaria, Aphanomyces, Botrytis, Cercospora, Erysiphe, Fusarium, Helicobasidium, Peronospora, Phoma, Phytium, Phytophthora, Pleospora, Ramularia, Rhizoctonia, Typhula, Uromyces und Verticillium. Zu den bakteriellen Pathogenen gehören beispielsweise Spezies der Gattungen Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas, Streptomyces und Xanthomonas und zu den viralen Pathogenen beispielsweise Spezies der Gattungen Benyvirus, Closterovirus, Curtovirus, Luteovirus, Nucleorhabdovirus, Potyvirus und Tobravirus.
Ein "Promotor" ist ein nicht-translatierter DNA-Abschnitt, typischerweise stromaufwärts einer kodierenden Region, welche die Bindestelle für die RNA-Polymerase beinhaltet und die Transkription der DNA initiiert. Ein Promotor enthält zudem andere Elemente, die als Regulatoren der
Genexpression fungieren (z.B. c/s-regulatorische Elemente).
Ein "Kern- oder Minimalpromotor" ist ein Promotor, der zumindest die Grundelemente, welche für die Transkriptionsinitiation gebraucht werden, aufweist (z.B. TATA-Box und/oder Initiator). Als "synthetischer Promotor" oder "chimärer Promotor" wird hierbei ein Promotor bezeichnet, der so in der Natur nicht vorkommt, aus mehreren Elementen zusammengesetzt ist und einen Kern- oder Minimalpromotor beinhaltet sowie stromaufwärts des Kern- oder Minimalpromotors mindestens ein c i-regulatorisches Element aufweist, welches als Bindungsstelle für spezielle trans- wirkende Faktoren (trans-actingfactors, z.B. Transkriptionsfaktoren) dient. Ein synthetischer oder chimärer Promotor wird den gewünschten Anforderungen nach konzipiert und durch unterschiedliche Faktoren induziert oder reprimiert. Die Wahl des c/'i-regulatorischen Elements oder einer Kombination von cis- regulatorischen Elementen ist entscheidend für die Spezifität und das Aktivitätslevel eines Promotors. In einem synthetischen oder chimären Promotor können ein Kern- oder Minimalpromotor mit einem oder mehreren cw-regulatorischen Elementen funktionell verbunden sein, wobei die Promoter/cis- Element(e)-Kombination(en) aus natürlichen Promotoren nicht bekannt sind oder gegenüber natürlichen Promotoren andersartig ausgestaltet sind. Beispiele sind aus dem Stand der Technik bekannt (WO/00/29592; WO/2007/147395))
Ein "Pathogen-induzierbarer Promotor" ist ein Promotor, der in der Lage ist, das Gen, das er reguliert, in Folge einer Pathogenerkennung und/oder einer Pathogeninfektion und/oder einer Verwundung, welche auch die Folge einer abiotischen Einwirkung sein kann, zu exprimieren.
"Transgene Pflanze" bezieht sich auf einen Pflanze, in dessen Genom mindestens eine heterologe Nukleinsäure (z.B. ein Avirulenzgen oder auch ein Fragment eines Avirulenzgens aus einem bakteriellen Pathogen) stabil integriert wurde, was bedeutet, dass die integrierte Nukleinsäure in der Pflanze stabil erhalten bleibt, exprimiert wird und auch stabil an die Nachkommen vererbt werden kann. Die stabile Integration einer Nukleinsäure in das Genom einer Pflanze schließt auch die Integration in das Genom einer Pflanze der vorhergehenden Parentalgeneration mit ein, wobei die integrierte Nukleinsäure stabil weitervererbt werden kann.
Eine erfindungsgemäße pathogenresistente Pflanze weist mindestens zwei stabil in das Genom integrierte Nukleinsäuren auf. Jede dieser Nukleinsäuren ist charakterisiert durch eine
Nukleotidsequenz, die für jeweils einen unterschiedlichen Teil eines Avirulenzproteins kodiert.
Demnach stellen die Nukleinsäuren unterschiedliche Fragmente von ein und demselben Avirulenzgen dar. Jede Nukleinsäure umfasst mindestens ein Fragment des Avirulenzgens.
Zwei oder mehr Nukleinsäuren können Nukleotidsequenzen aufweisen, die für zwei oder mehr unterschiedliche Teile des Avirulenzproteins mit abschnittsweise identischen oder ähnlichen
Aminosäuresequenzen kodieren. Abschnittsweise meint, dass keine Aminosäuresequenz in seiner gesamten Länge zu 100% identisch oder ähnlich in einer anderen Aminosäuresequenz vorhanden ist. Identische Aminosäuresequenzen sind solche, deren Aminosäureabfolgen einander entsprechen, ähnliche Aminosäuresequenzen zeigen eine oder mehrere konservative und/oder semi-konservative Aminosäuresubstitutionen basierend auf ähnlichen physio-chemischen Eigenschaften der unterschiedlichen Aminosäuren. Abschnittsweise identische oder ähnliche Aminosäuresequenzen können auch endständig überlappend sein, so dass beispielsweise eine Sequenz am C-Terminus eine identische oder ähnliche Sequenz mit einer anderen Sequenz am N-Terminus aufweist. Bevorzugt überlappen solche Aminosäuresequenzen über eine Länge von mehr als 3 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, besonders bevorzugt über eine Länge von mindestens 1 1 aufeinanderfolgenden Aminosäuren. Ähnliche überlappende Aminosäuresequenzen weisen eine Ähnlichkeit von 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% in dem überlappenden Sequenzbereich auf, identische überlappende Aminosäuresequenzen stimmen in dem überlappenden Sequenzbereich überein. Die Übereinstimmung kann gemäß bekannter Verfahren, z.B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Altschul et al., 1990), bestimmt werden.
Eine Nukleinsäure kann auch durch Addition, Substitution oder Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden weiter modifiziert sein. Zum Beispiel kann eine Nukleinsäure mit einem Start-Codon ATG (Translationsstart) und/oder Stoppcodon versehen werden, um eine stabile Translation der Nukleinsäure in einer Pflanzenzelle zu gewährleisten, oder Intron-Sequenzen können deletiert werden. Derartige Modifikationen und deren Durchführung sind dem Fachmann bekannt. Modifizierte Nukleinsäuren, schließen auch solche Nukleinsäuren ein, die unter üblichen Bedingungen (Sambrook et al. 1989), bevorzugt unter stringenten Bedingungen mit der entsprechenden nicht-modifizierten Nukleinsäure hybridisieren oder auf DNA-Level eine Homologie von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%>, 96%, 97%, 98% oder 99% zu der nicht-modifizierten Nukleinsäure zeigen. Die von einer modifizierten Nukleinsäure kodierte Aminosäuresequenz eines Avirulenzproteinteils kann eine Identität von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder eine
Ähnlichkeit von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit der originären Aminosäuresequenz aufweisen.
Ein einzelnes Fragment des Avirulenzgens kodiert für einen nicht-funktionellen Teil des
Avirulenzproteins. Dies bedeutet, dass anders als das gesamte Avirulenzprotein, ein einzelner Teil des Avirulenzproteins für sich, wenn er in einer Zelle einer Pflanze synthetisiert vorliegt, dort in keinem Fall als Induktor einer pflanzlichen Resistenzprotein-vermittelten Pathogenabwehrreaktion funktioniert. Liegen jedoch sämtliche unterschiedlichen nicht-funktionellen Teile desselben
Avirulenzproteins, kodiert durch die stabil in das Genom integrierten Nukleinsäuren, gemeinsam in einer pflanzlichen Zelle synthetisiert vor, vermitteln alle synthetisierten Teilproteine gemeinsam die Wirkung des kompletten Avirulenzproteins (Komplementation der Avirulenzprotein-Wirkung), indem sie direkt oder indirekt mit dem korrespondierenden Resistenzprotein reagieren. Das Ausmaß der hierbei erreichten Zelltodauslösung ist jedoch nicht zwangsläufig vergleichbar mit demjenigen, welches durch die Reaktion des gesamten Avirulenzproteins mit dem korrespondierenden Resistenzprotein bewirkt werden würde. So kann beispielsweise durch die Substitution einer einzelnen Aminosäure in einem Teilprotein bereits nach Komplementation der Grad der Zelltodauslösung gesteigert werden, umgekehrt kann beispielsweise eine vermehrte N-terminale Deletion von
Aminosäuren bei einem Teilprotein eine deutliche Abschwächung der Zelltodauslösung herbeiführen. Dies zeigt, dass mit Hilfe von Modifikationen der Aminosäurensequenz eines Teilproteins bereits das Ausmaß der durch die Komplementation induzierten Zelltodauslösung also die Wirksamkeit des Induktors kontrolliert werden kann. Somit ist die Intensität der durch den transgenen Induktor bewirkten Pathogenabwehrreaktion kontrollierbar und vorbestimmt.
Erfindungsgemäß einsetzbare Nukleinsäuren können aus einem solchen Avirulenzgen eines Pathogens entnommen werden, welches für ein Avirulenzprotein kodiert, das
a) in der zur genomischen Integration vorgesehenen Pflanze bzw. in mindestens einer Zelle dieser Pflanze ein korrespondierendes Resistenzprotein vorfindet, mit dem das Avirulenzprotein direkt oder indirekt reagieren kann und infolgedessen dann eine pflanzliche Pathogenabwehrreaktion induziert wird, und
b) in mindestens zwei unterschiedliche Proteinteile zerlegt werden kann, wobei die
unterschiedlichen Teile des Avirulenzproteins jeweils für sich genommen keine Induktoren einer pflanzlichen Pathogenabwehrreaktion darstellen, jedoch dann, wenn die unterschiedlichen Teile des Avirulenzproteins synthetisiert in einer Zelle der zur genomischen Integration vorgesehenen Pflanze gemeinsam vorliegen, mit dem anwesenden, korrespondierenden Resistenzprotein direkt oder indirekt reagieren und infolgedessen dann eine pflanzliche Pathogenabwehrreaktion induziert wird.
Beispielsweise erfüllt ein Avirulenzgen mit eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ IE) NO: 3 sowie Varianten davon die vorstehenden Erfordernisse. Solche Nukleotidsequenzen kodieren beipielsweise für Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4.
Bevorzugt werden Avirulenzgene eingesetzt, die für einen starken Induktor in einer pflanzlichen Zelle kodieren, und damit effizient einen HR-vermittelten Zelltod herbeiführen können.
Zudem kann ein geeignetes Avirulenzgens unter Beibehaltung der originären Aminosäuresequenz des Avirulenzproteins aus dem Pathogen entsprechend der Degeneration des genetischen Codes verändert sein. Darüber hinaus kann auch, bevor die erfindungsgemäß einsetzbaren Nukleinsäuren entnommen werden, die Nukleotidsequenz eines geeigneten Avirulenzgens modifiziert werden, um beispielsweise die Wirksamkeit, die Spezifität und/oder die Aktivität des Avirulenzproteins zu ändern, oder um beispielsweise ein vorhandenes Intron zu entfernen. Modifikationen können durch Addition,
Substitution oder Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden herbeigeführt werden. Die Durchführung derartiger Modifikationen ist dem Fachmann durchaus bekannt. In jedem Fall sollte ein modifiziertes Avirulenzgen weiterhin ein solches Avirulenzprotein kodieren, das die vorstehenden Erfordernisse a) und b) erfüllt. Zudem hybridisiert die Nukleotidsequenz eines modifizierten
Avirulenzgens unter üblichen Bedingungen (Sambrook et al. 1989), bevorzugt unter stringenten Bedingungen mit der nicht-modifizierten Nukleotidsequenz oder zeigt auf DNA-Level eine
Homologie von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zu der nicht- modifizierten Nukleotidsequenz. Die kodierte Aminosäuresequenz weist eine Identität von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder eine Ähnlichkeit von mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% mit der nicht-modifizierten Aminosäuresequenz auf.
Genannte genetische Modifikationen können auch dafür verwendet werden, um ein nicht-geeignetes Avirulenzgen eines Pathogens in einer Weise abzuändern, so dass es dann die vorstehenden
Erfordernisse a) und b) erfüllt, um dann daraus erfindungsgemäß einsetzbare Nukleinsäuren zur Intergration in das Genom einer Pflanze und zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Pathogenresistenten Pflanze zu gewinnen.
Erfindungsgemäß einsetzbarer Nukleinsäuren aus einem geeigneten Avirulenzgen können mit einem Verfahren, das die nachfolgenden fünf Schritte umfasst, zuverlässig identifiziert werden.
(1 ) Erzeugung von unterschiedlichen Nukleinsäuren, die Fragmente des kodierenden Bereichs eines Avirulenzgens umfassen.
Dieser erste Verfahrensschritt kann mittels Standard DNA Klonierungstechniken durchgeführt werden (Sambrook et al. 1989). Beispielsweise kann durch Einführung von neuen Translationsstarts und/oder Stoppcodons vom 5'- und/oder 3'-Ende her eine Verkürzung des Avirulenzgens erreicht werden. Auf diesem Wege können dann mehrere N- und/oder C-terminal verkürzte Teile des Avirulenzproteins in den nächsten Verfahrensschritten (2) und (3) synthetisiert werden.
(2) Transiente Expression einzelner Nukleinsäuren aus Schritt (1 ) unter der Kontrolle eines
konstitutiven Promotors in pflanzlichen Zellen, die ein zu dem Avirulenzprotein
korrespondierendes Resistenzprotein bereitstellen.
Hierfür kann der Fachmann auf die üblichen und bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik zurückgreifen. Beispielsweise beschreibt Schmidt et al., 2004, ein transientes Expressionssystem in Zellen eines pflanzlichen Blattgewebes auf der Grundlage von biolistischen Transfertechniken. Die transiente Expression ist in Zellen einer solchen Pflanzenart durchzuführen, für welche eine
Pathogenresistenz etabliert werden soll. Dementsprechend ist auch der konstitutive Promotor in der Weise auszuwählen, dass er in einer Zelle dieser Pflanze funktionsfähig ist (z.B. doppelter 35S ^ ^
Promotor). Bevorzugt ist die transiente Expression auf Zellen solcher Organe, Gewebe oder
Pflanzenteile zu beschränken, die als Pathogen-typische Infektionsorte bekannt sind.
(3) Selektion einzelner Nukleinsäuren, deren Expression in Schritt (2) nicht zu einem HR- vermittelten Zelltod geführt hat.
Um die Zelltodauslösung in Schritt (3) zu detektieren und zu quantifizieren kann ein
Nachweisverfahren der Vitalität von pflanzlichen Zellen genutzt werden. Hierfür bietet sich beispielsweise an, die Expression der in Schritt ( 1 ) erzeugten Nukleinsäuren und/oder des kompletten Avirulenzgens als Referenz in Gegenwart von mindestens zwei Reportergenen, wie z.B. die
Luciferasereportergene aus Photinns pyralis und Renilla reniformis durchzuführen.
(4) Transiente Coexpression von mindestens zwei selektierten Nukleinsäuren aus (3) jeweils unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors in pflanzlichen Zellen, die ein zu dem
Avirulenzprotein korrespondierendes Resistenzprotein bereitstellen.
Ebenso wie in Schritt (2) kann der Fachmann auf die üblichen und bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik zurückgreifen. Die notwendigen Anforderungen an die Auswahl der
transformierten Zellen und der einsetzbaren konstitutiven Promotoren entsprechen denjenigen aus Schritt (2).
(5) Identifikation von mindestens zwei selektierten Nukleinsäuren, deren Co-Expression in Schritt (4) zu einem HR-vermittelten Zelltod geführt hat.
In einer bevorzugten Ausführung ist die Zelltodauslösung vergleichbar mit derjenigen, welche durch die Expression des vollständigen Avirulenzgens unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors bewirkt wird. Die Detektion und Quantifizierung kann auf in Schritt (3) beschriebenes
Nachweisverfahren zurückgegriffen werden.
Mit Hilfe des vorstehenden Verfahrens identifizierte Nukleinsäuren, isoliert aus einem Avirulenzgen, sind zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pathogenresistenten Pflanze geeignet, da die
Syntheseprodukte dieser Nukleinsäuren gemeinsam in einer Zelle der Pflanze als Induktor einer Pathogenabwehrreaktion dienen. Um sicherzustellen, dass diese Induktion beabsichtigt bzw.
gewünscht stattfindet, ist die Regulation und Kontrolle der Expression der eingesetzten Nukleinsäuren in der pathogenresistenten Pflanze in nachfolgender Weise auszugestalten.
Die stabil integrierten Nukleinsäuren einer erfindungsgemäßen pathogenresistenten Pflanze sind jeweils operativ verknüpft mit einem Promotor, welcher die Expression der entsprechenden
Nukleinsäure reguliert. Mindestens einer dieser Promotoren ist Pathogen-induzierbar, und zwar wird dieser Promotor aktiviert infolge einer Infektion der Pflanze durch denjenigen Pathogen bzw. durch diejenigen Pathogene, gegenüber welchen bzw. welche eine Resistenz in der erfindungsgemäßen Pflanze letztendlich etabliert werden soll. Dies bedeutet, dass die Expression der mit dem Pathogen- induzierbaren Promotor operativ verknüpften Nukleinsäure erst infolge einer Infektion der Pflanze durch den Pathogen bzw. die Pathogene stattfindet und somit auch der kodierte Teil des
Avirulenzproteins erst im Anschluss in Zellen der Pflanze synthetisiert vorliegt. Die Promotoren, welche operativ mit den verbleibenden Nukleinsäuren verknüpft sind, sind dadurch charakterisiert, dass sie eine solche Spezifität aufweisen, die sicherstellt, dass zum Zeitpunkt, wenn der Teil des Avirulenzproteins unter der Kontrolle des genannten Pathogen-induzierbaren Promotors in einer infizierten Zelle der Pflanze synthetisiert vorliegt, auch die verbleibenden Teile des Avirulenzproteins in dieser Zelle synthetisiert vorliegen. Dies wird dadurch realisiert, dass die Promotoren, welche operativ mit den verbleibenden Nukleinsäuren verknüpft sind, eine solche Spezifität aufweisen, dass mit dem genannten Pathogen-induzierbaren Promotor eine räumlich, eine zeitlich und/oder eine andersartig überlappende Expressionsregulation der operativ verknüpften Nukleinsäuren sichergestellt wird. Beispielsweise können drei Promotoren eine überlappende Expressionsregulation aufweisen, von denen einer Fruchtgewebe-spezifisch, ein weiterer Fruchtreife-spezifisch und ein dritter
Pilzpathogen-spezifisch ist. Eine überlappende Expression der mit den drei Promotoren operativ verknüpften Nukleinsäuren findet dann nur nach Pilzbefall der Frucht und nur in der reifenden Frucht selbst statt. Als Promotoren zur Regulation der verbleibenden Nukleinsäuren können prinzipiell sämtliche bekannten Promotoren eingesetzt werden, dazu gehören beispielhaft konstitutive, gewebespezifische, organspezifische, lagerungsinduzierte, entwicklungsspezifische oder auch Pathogen-induzierbare Promotoren.
Zum Erreichen einer breiten Pathogenresistenz ist der genannte Pathogen-induzierbare Promotor so auszuwählen, dass er durch möglichst viele Pathogene bzw. Pathogenklassen wie Viren, Bakterien, Pilzen und/oder Tieren, induziert werden kann. Je spezifischer einer der verwendete Pathogen- induzierbare Promotoren für beispielsweise einen bestimmten Pathogen oder einen bestimmten Teil einer Pathogenklasse ist, desto stärker wird auch das Spektrum an Pathogenen, gegenüber welchen letztendlich in der erfindungsgemäßen Pflanze eine gesteigerte Resistenz erreicht wird, eingeschränkt. Vorzugsweise sind unterschiedliche Pathogen-induzierbare Promotoren einzusetzen, da dadurch die Spezifität gegenüber abiotischen Stimuli deutlich gesteigert werden kann.
Bevorzugt lässt der Pathogen-induzierbare Promotor zudem eine Expression der regulierten
Nukleinsäure lokal begrenzt auf den Ort einer Pathogeninfektion oder einer Verwundung zu
(Strittmatter et al., 1996; Rushton et al, 2002). Vorteilhaft wäre auch die Verwendung eines Pathogen- induzierbaren Promotors, der direkt oder indirekt durch ein pathogenes Effektormolekül, welches von zahlreichen Pathogenen bzw. Pathogenklassen abgegeben wird, aktiviert wird. Ein solches
Effektormoleküle ist beispielsweise das bekannte PEP25. Ebenso können insbesondere Pathogen- induzierbare Promotoren, die infolge einer Verwundung entweder direkt oder indirekt induziert werden, vor allem zur Abwehr von in die Zelle/Pflanze penetrierenden Pathogenen eingesetzt werden. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von pathogen-induzierbaren Promotoren, deren Aktivierung direkt oder indirekt durch die pflanzliche PAMP-/MAMP-Erkennung vermittelt wird. So wird sobald der Pathogen durch einen Pathogen-responsiven Transmembran-Rezeptor erkannt wird, also noch bevor oder während der Pathogen in die Zelle/Pflanze eindringt, schon die unterschiedlichen Teile des Avirulenzproteins im Zellinneren gemeinsam bereitgestellt, woraufhin als Folge der Reaktion mit dem korrespondierenden Resistenzprotein eine ETI auslöst. Durch diesen "Kurzschluss" zwischen der PAMPTMAMP-Erkennung und der ETI ist die Reaktionszeit von Pathogenerkennung bis hin zur ETI deutlich verkürzt, und die Resistenzleistung deutlich gesteigert.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist mindestens ein Promotor zur Regulation der Expression der Nukleinsäuren ein synthetischer oder chimärer Promotor. In einer besonders bevorzugten
Ausgestaltung ist mindestens einer der Pathogen-induzierbaren Promotoren ein synthetischer oder chimärer Promotor. Der Grund hierfür liegt darin, dass bislang gewöhnlich die pflanzlichen Pathogen- induzierbaren Promotoren vor Allem von pathogenresponsiven Genen verwendet wurden, deren Spezifität teilweise durch eine Verkürzung noch verbessert werden konnte (Martini et al., 1993). Da diese pathogenresponsiven Gene (z.B. PR-Proteingene) aber nicht nur unter biotischem Stress, sondern auch in Reaktion auf abiotischen Stress, hormonelle Veränderungen und diverse
Entwicklungsreize, aktiviert werden, ist das Erlangen einer ausreichenden bzw. ausschließlichen Pathogenspezifität technisch schwierig zu realisieren (Stahl et al., 2006). Synthetische oder chimäre Promotoren dagegen enthalten lediglich die Sequenzmotive (z.B. c s-regulatorische Elemente) aus natürlichen, Pathogen-induzierbaren Promotoren, die für die Pathogeninduktion relevant sind.
Sequenzmotive für andere Stimuli wurden dagegen entfernt. Die c s-regulatorischen Elemente wurden stromaufwärts eines Minimalpromotors kloniert, wodurch ein funktioneller Promotor erzeugt wurde, der eine erhöhte Spezifität im Vergleich zu den natürlichen Promotoren aufweist, aus denen die jeweiligen cw-regulatorischen Elemente isoliert wurden (Rushton et al., 2002).
Aus dem Stand der Technik sind bereits diverse c/'s-regulatorische Elemente zur Vermittlung einer Pathogeninduzierbarkeit eines Promotors bekannt (siehe z.B. WO/00/29592).
Grundsätzlich kann jedes pathogenresponsive c/'s-regulatorische Element in einem synthetischen oder chimären, Pathogen-induzierbaren Promotor eingesetzt werden. Solche cis-regulatorischen Elemente können in multiplen Kopien und/oder in Kombination miteinander und/oder mit anderen cis- regulatorischen Elementen in einem synthetischen oder chimären Promotor vorliegen. Die einsetzbaren Nukleinsäuren, die zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pathogenresistenten Pflanze geeignet sind, bilden operativ verbunden mit den spezifischen und aufeinander abgestimmten Promotoren eine Zusammensetzung von Nukleinsäuren, die mindestens zwei Nukleinsäuren zur Integration in ein Genom einer Pflanze umfasst, wobei die Nukleinsäuren
(i) für unterschiedliche Teile eines Avirulenzproteins kodieren und
(ii) mit Promotoren operativ verknüpft sind,
und mindestens einer der Promotoren Pathogen-induzierbar ist, so dass in einer Zelle der Pflanze infolge einer Infektion der Pflanze durch den Pathogen die unterschiedlichen Teile des
Avirulenzproteins synthetisiert vorliegen und mit einem korrespondierenden Resistenzprotein direkt oder indirekt reagieren.
Die Pathogenresi Stenz der erfindungsgemäßen Pflanze wird durch die direkte oder indirekte Reaktion der synthetisierten Teile des Avirulenzproteins mit einem bereits in einer Zelle der Pflanze vorhandenen zu dem Avirulenzprotein korrespondierenden Resistenzprotein vermittelt (Flor, 1971 ; Dangl & Jones, 2001 ; Jones & Dangl, 2006). Das Resistenzgen, welches für das Resistenzprotein kodiert, ist entweder bereits natürlich im Genom der erfindungsgemäßen Pflanze enthalten oder über gentechnologische oder züchterische Verfahren eingefügt worden (Keller et al., 1999; Belbahri et al., 2001 ).
Eine erfindungsgemäße Pflanze kann von jeder Spezies aus den dikotyledonen, monokotyledonen und gymnospermen Pflanzen sein. Beispielsweise können solche Pflanzen ausgewählt sein aus den Spezies folgender Gruppe: Arabidopsis, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Baumwolle, Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sorghum, Tomate, Banane, Melone, Kartoffel, Karotte, Soja ssp., Zuckerrohr, Wein, Roggen, Hafer, Raps, Rasen- und Futtergras. Eine erfindungsgemäße Pflanze ist vorzugsweise eine Pflanze der Gattung Beta. Von der Erfindung sind ebenfalls auch ein Samen, ein Teil, ein Organ, ein Gewebe oder eine Zelle der erfindungsgemäßen Pflanze miterfasst.
Um bei der Herstellung einer erfindungsgemäßen Pflanze einen unerwünschten Zelltod (z.B. infolge einer Hypersensitiven Reaktion) oder eine andere negative Beeinflussung der Zellen der Pflanze, die Auswirkungen auf die agronomischen Eigenschaften der Pflanze haben könnte, zu vermeiden, ist darauf zu achten, dass während der Herstellung zu keinem Zeitpunkt die unterschiedlichen Teile eines Avirulenzproteins, welche nach Reaktion mit dem korrespondierenden Resistenzprotein zu einer erfolgreichen Induktion einer Pathogenabwehrreaktion führen, in einer Zelle der Pflanze synthetisiert vorliegen. Demzufolge kann für die Integration der entsprechenden Nukleinsäuren in ein gemeinsames pflanzliches Genom nicht auf die gebräuchlichen Techniken der Pflanzentransformation
zurückgegriffen werden, da deren Durchführung eine Pathogenerkennung durch die Pflanze bedingt, welche die Aktivierung des Pathogen-induzierbaren Promotors verursacht (z.B. Agrobacterium tumefaciens- vermittelte Transformation), oder diese Verfahren so invasiv sind, dass die verursachten Verwundungen zur Induktion eines Pathogen-induzierbaren Promotors führen (z.B. biolistische Transformation). Aber gerade diese Aktivierung des Pathogen-induzierbaren Promotors würde als Trigger zum falschen Zeitpunkt und am falschen Ort unbeabsichtigt die Induktion der pflanzlichen Pathogenabwehrreaktion bewirken.
Ein geeignetes Herstellungsverfahren, das eine Aktivierung von Pathogen-induzierbaren Promotoren umgeht, ist beispielsweise die Kreuzung zweier transgener Elternpflanzen, wobei jede dieser Elternpflanzen dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mit mindestens einer, aber nicht mit allen Nukleinsäuren aus der Zusammensetzung von Nukleinsäuren stabil transformiert wurde und selber nicht die für die Nachkommen beabsichtigte Pathogenresistenz aufweist. Zudem ist zu beachten, dass eine Elternpflanze mindestens diejenige(n) Nukleinsäure(n) aus der Zusammensetzung von
Nukleinsäuren umfasst, die die andere Elternpflanze nicht aufweist, und sie mindestens eine
Nukleinsäure aus der Zusammensetzung von Nukleinsäuren nicht enthält, die aber die andere Elternpflanze aufweist. Exemplarisch könnten die beiden Pflanzen folgende genetische Ausstattung zeigen: Die erste Elternpflanze ist gekennzeichnet durch eine stabil in das Genom integrierte
Nukleinsäure, die für einen ersten Teil des Avirulenzproteins kodiert und operativ verknüpft ist mit einem Pathogen-induzierbaren Promotor. Die zweite Elternpflanze ist gekennzeichnet durch eine stabil in das Genom integrierte Nukleinsäure, die für einen zweiten Teil des Avirulenzproteins kodiert und operativ verknüpft ist mit einem Promotor mit einer Spezifität, die eine mit dem Pathogen- induzierbaren Promotor überlappende Expressionsregulation aufweist. Der erste und zweite Teil des Avirulenzproteins sind unterschiedlich. Die stabil in das Genom integrierten Nukleinsäuren der ersten und zweiten Elternpflanze werden während der Kreuzung an einen Nachkommen der beiden Pflanzen vererbt. Diese erzeugte Pflanze stellt eine erfindungsgemäße pathogenresistente Pflanze dar. Das Resistenzgen, das für das zum Avirulenzprotein korrespondierende Resistenzprotein kodiert, ist mindestens in einer zur Kreuzung eingesetzten Pflanze vorhanden und ist an die hergestellte erfindungsgemäße Pflanze während der Kreuzung weitervererbt worden. Neben den Elternpflanzen zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pathogenresistenten Pflanze betrifft die Erfindung auch Samen, Teile, Organe, Gewebe oder Zellen dieser Pflanzen, sowie die Verwendung dieser zum Zwecke der Herstellung einer erfindungsgemäßen Pflanze.
Zur stabilen genomischen Integration der Nukleinsäuren in das jeweilige Genom der Elternpflanze kann der Fachmann auf die üblicherweise verwendeten Verfahren zurückgreifen. Dabei ist es beispielsweise möglich, dass die vorstehend genannte erste Elternpflanze selbst Agrobacterium tumefaciens-vermi te transformiert wird, denn auch wenn dies zu einer Induktion des Pathogen- induzierbaren Promotors führt, ist das Ergebnis der resultierenden Expression der operativ verknüpften Nukleinsäure ein nicht-funktioneller Teil des Avirulenzproteins. Dieser Teil des Avirulenzproteins ist allein nicht in der Lage als Reaktion auf das verwendete Transformationsverfahren als Induktor einer Pathogenabwehrreaktion zu fungieren.
Für eine stabile Vererbung der Nukleinsäuren und des Resistenzgens von den Elternpflanzen auf die erfindungsgemäße pathogenresistente Pflanze im Zuge des Kreuzungsprozesses können die
Elternpflanzen beispielsweise doppelhaploid, oder zumindest homozygot für die jeweilige(n) Nukleinsäure(n) und/oder für das Resistenzgen sein. Die Herstellung solcher Pflanzen ist dem Fachmann durchaus bekannt (Gürel et al., 2000).
Bei der erfindungsgemäßen Pflanze kann es sich auch um eine hybride Pflanze (Hybrid) handeln, die neben der gesteigerten Resistenz gegenüber mindestens einem Pathogen aufgrund des Heterosis- Effekts auch andere vorteilhafte agronomische Eigenschaften aufweisen kann. Solche Eigenschaften sind beispielsweise verbesserte Toleranzen gegenüber abiotischen oder biotischen Stress, gesteigerter Ertrag, etc. Zur Erzeugung von hybriden Pflanzen ist es vorteilhaft Inzucht-Pflanzen als
Elternpflanzen zu verwenden. Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Pflanze in einem
Hybridsystem bedingt, dass die Elternpflanzen der hybriden Nachkommen die Pathogenresistenz gegenüber mindestens einem Pathogen vermittelt durch die Syntheseprodukte der Nukleinsäuren noch nicht aufweisen. Erst in den Hybriden (Fl -Generation) wird dieses Merkmal ausgeprägt. Populationen von Nachkommen der Fl -Hybriden (F2, F3, etc. Generationen) neigen aufgrund von Segregation dazu die Pathogenresistenz wieder zu verlieren. Unter kommerziellen Gesichtpunkten ist ein solches Hybridsystem hochinteressant.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die angehängten Figuren und Sequenzen beschrieben:
FIG 1 : Darstellung der 5'- und 3 '- Verkürzungen im pthG-Gen, die für die funktionelle
Charakterisierung des PthG-Protein erstellt wurden. Die Lage der im Protein deletierten N- und C- terminalen Bereiche ist dunkelgrau und die der verbleibenden Bereiche hellgrau dargestellt. Die von den DNA-Fragmenten kodierten Aminosäuresequenzen sind durch tiefergestellte Zahlen
wiedergegeben (z. B. pthG62-488 codiert für das PthG-Protein von Aminosäureposition Position 62 bis 488.
FIG 2: Nachweis von nicht-funktionellen Teilen des Avirulenzproteins PthG durch transiente Coexpression von Nukleinsäuren in Blättern einer Beta vw/gam-Pflanze. Die Höhe der
Reportergenaktivität ist ein Maß für die Vitalität der transformierten Beta vulgaris-Zdlen. Messwerte sind angegeben als Mittelwerte von 3 Versuchen + SD. Als Kontrolle dient der Leervektor ohne pthG- Gen. 100 % Enzymaktivität = kein Zelltod, 0 % Enzymaktivität = vollständiger Tod der transformierten Zellen. Die mit a gekennzeichneten Konstrukte unterscheiden sich statistisch signifikant von den übrigen Konstrukten.
FIG 3: Schematische Darstellung der Ergebnisse zur Identifizierung der für die Zelltodauslösung notwendigen funktionellen Bereiche des PthG-Protein. Die DNA-Fragmente, die nach transienter Expression einen Zelltod auslösen können, sind schwarz dargestellt. Die verkürzten DNA-Fragmente des pthG-Gens, die keinen Zelltod mehr auslösen konnten, sind hellgrau wiedergegeben.
FIG 4: Nachweis der Komplementierung der Avirulenzgenfunktion (Zelltodauslösung) durch
Coexpression verkürzter inaktiver pthG-Genfragmente. Durch Coexpression der DNA-Sequenzen pthGi-255 mit der DNA-Sequenz pthGi 21-488 kann die Funktion der Zelltodauslösung restauriert werden. Linke Darstellung: Normalisierte Reportergenaktivitäten (Luziferase) nach transienter Expression von pthG-Genfragmenten in Zuckerrübenblättern. Dargestellt der Mittelwert eines repräsentativen Experimentes mit 6 biologischen Replikaten pro Konstrukt. Als Kontrolle dient der Leervektor ohne pthG-Gen. 100 % Enzymaktivität = kein Zelltod, 0% Enzymaktivität = vollständiger Tod der transformierten Zellen. Die mit a gekennzeichneten Konstrukte unterscheiden sich statistisch signifikant von den übrigen Konstrukten.
Rechte Darstellung: Größe und Anzahl der bei dem Experiment pro Ansatz exprimierten PthG- Proteinfragmenten .
FIG 5: Nachweis der für die Komplementation minimal notwendigen Sequenzen des pthG-Gens durch transiente Coexpression in Zuckerrübenblättern. Durch Kombination unterschiedlicher pthG- Gensequenzen im Komplementationsexperiment kann die Intensität der Zelltodauslösung quantitativ gesteuert werden.
Die Höhe der relativen Reportergenaktivität ist ein Maß für die Vitalität der transformierten Beta vw/garä-Zellen. Messwerte sind angegeben als Mittelwerte von 3 Versuchen ± SD. Als Kontrolle dient der Leervektor ohne pthG-Gen. 100 % Enzymaktivität = kein Zelltod, 0 % Enzymaktivität = vollständiger Tod der transformierten Zellen.
FIG 6: Funktionelle Charakterisierung der mit den Sequenzen pthGi2i-488 und pthGi.255 stabil transformierter Zuckerrüben. Durch einen transienten Komplementationstest wird die Eignung jeder unabhängigen Zuckerrüben-Transformanten zur Zelltodauslösung und damit die Intensität der Pathogenabwehr quantitativ bestimmt. Die Höhe der relativen Reportergenaktivität ist ein Maß für die Vitalität der transformierten Beta vw/garä-Zellen. Als Kontrolle dient der Leervektor ohne pthG-Gen. 100 % Enzymaktivität = kein Zelltod, 0 % Enzymaktivität = vollständiger Tod der transformierten Zellen.
A. Die Linien PR144 sind mit dem Konstrukt 2xS-2xD-pthGi2i-488 -kan transformiert. B. Die Linien PR148 sind mit dem Konstrukt 2xS-2xD-pthG 1.255 -kan transformiert.
FIG 7: Schematische Darstellung einer Pflanzenzelle, in der durch Kreuzung die zwei für die
Komplementation notwendigen pthG-Sequenzen aus zwei unabhängigen transgenen Eiterlinien zusammengeführt worden sind. Die Expression der pthG-Fragmente steht unter der Kontrolle zweier identischer oder unterschiedlicher synthetischer, pathogenspezifischer Promotoren 1 und 2. Die Coexpression der PthG-Proteinfragmente PthGi.255 und PthGn gg löst in Reaktion mit einem noch unbekannten Resistenzprotein eine Hypersensitive Reaktion (Zelltod) bzw. eine starke
Verteidigungsreaktion aus, die zu einer verbesserten Pilzresistenz führt. PAMP =„pathogen- associated molecular pattern" (Signalsubstanzen, die pathogenresponsive Promotoren aktivieren).
FIG 8: Nachweis der Transkriptakkumulation der Gene pthGi.255 und pthGn gg in PR144 x PR148 - Kreuzungen durch qRT-PCR. Normalisierte Transkriptakkumulation von pthGi.255 (A) und pthG, 21 - 88 (B) in /M-v/Tro-Pflanzen der Spezies Beta vulgaris aus (siehe auch Tabelle 6) und in den
Kontrollpflanzen, 3DC4156 und PR167/1 1 , am Tag 0, 1, 2, 4 und 7 nach C. beticola-lnfektion.
Messwerte stellen Mittelwerte von je drei biologischen Replikaten dar.
FIG 9: Nachweis der Reduktion pilzlicher Biomasse und einer verstärkten Pathogenabwehr in PR144 x PR148 - Kreuzungen durch qRT-PCR. Normalisierte Transkriptakkumulation des C. beticola ribosomalen Proteingens 60S (A) und des B. vulgaris-Gens für das BvCoMT (B) in /«-v/Tro-Pflanzen aus PR144 x PR148 - Kreuzungen (siehe Tab. 6) und in den Kontrollpflanzen, 3DC4156 und PR167/1 1 , am Tag 0, 1 , 2, 4 und 7 nach C. beticola-lnfektion. Messwerte stellen Mittelwerte von je drei biologischen Replikaten dar.
FIG 10: Unterschiedliche Entwicklung von PthG Kreuzungen nach der Keimung und im Gewächshaus A: schneller Zelltod eines Zuckerrüben-Keimlings (innerhalb 3 Tagen) aus der Kreuzung PR171/19 x PR 144/4
B: verzögerter Zelltod des Keimlings (innerhalb 8 Tagen) aus der Kreuzung PR 171/19 x PR144/5 ;
C: regenerierte, vitale Zuckerrübenpflanze aus der Kreuzung PR171/19xPR144/19.
D: Bewurzelte regenerierte, vitale Zuckerrübenpflanze aus der Kreuzung PR171/19 x PR144/19.
E: Normales Wachstum von Nachkommen aus der Kreuzung PR171/19 x PR144/19 im Gewächshaus.
Pfeile zeigen Keimlingsgewebe, in denen eine unerwünschte Zelltodauslösung stattgefunden hat.
FIG 1 1 : Nachweis der Transkriptakkumulation der Gene pthG62-255 und pthG 121 -4gg in der PR171/19 x PR144/19 Kreuzung PR5021 -2010-T-003 durch qRT-PCR.
Im Gewächshaus zeigen transgene Zuckerrüben, die nach der Kreuzung die Promotor- Genkombinationen 4xD-pthG 62-255 und 2xS-2xD-pthG 121-488 tragen, 1 1 Tage nach der Inokulation eine starke Akkumulation sowohl der pthG62-255 als auch der
Figure imgf000020_0001
Transkripte. Die Transkriptmengen sind nach Weltmeier et al. (201 1) gegen ein konstitutiv exprimiertes
Zuckerrübengen normalisiert worden. Die analysierten Pflanzen wurden ausgehend von der
Abstammung PR5021 -2010-T-003 klonal vermehrt und sind genetisch identisch. Kontrolle = nichtinfizierte PR5021 -2010-T-003 Pflanze, Infiziert 1 und Infiziert 2 = zwei infizierte PR5021-2010- T-003 Pflanzen.
Sequenzen:
SEQ ID NO: 1 Nukleotidsequenz des codierenden Bereichs des bakteriellen pthG-Gens aus dem Plasmid pQE60-pthG, das ein 2,8 kb großes genomisches BamHI-Hindlll Fragment aus Erwinia herbicola pv. gypsophilae enthält.
SEQ ID NO: 2 Aminosäuresequenz des PthG-Proteins
SEQ ID NO: 3 Nukleotidsequenz des pthG ^gg Gens mit flankierender Ncol und BamHI
Schnittstelle
SEQ ID NO: 4 Aminosäuresequenz des PthG «« Proteins
SEQ ID NO: 5 Nukleotidsequenz (pthGi.255), kodierend für Teilprotein PthG1 -255
SEQ ID NO: 6 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGi.255
SEQ ID NO: 7 Nukleotidsequenz (pthG62-255), kodierend für Teilprotein PthG62-255
SEQ ID NO: 8 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG62-255
SEQ ID NO: 9 Nukleotidsequenz (pthG92-255), kodierend für Teilprotein PthG92-255
SEQ ID NO: 10 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG92-255
SEQ ID NO: 1 1 Nukleotidsequenz (pthG 121-255), kodierend für Teilprotein PthGi2i-255
SEQ ID NO: 12 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGi2i-255
SEQ ID NO: 13 Nukleotidsequenz
Figure imgf000020_0002
SEQ ID NO: 14 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG|2i-488
SEQ ID NO: 15 Nukleotidsequenz (pthG92-488), kodierend für Teilprotein PthG92_488
SEQ ID NO: 16 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG92- 88
SEQ ID NO: 17 Nukleotidsequenz (pthGi62-48s), kodierend für Teilprotein PthGi62- 88
SEQ ID NO: 18 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG 162-488
SEQ ID NO: 19 Nukleotidsequenz (pthG205-48s)> kodierend für Teilprotein PthG205-488
SEQ ID NO: 20 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG205-488
SEQ ID NO: 21 Nukleotidsequenz (pthG245-488), kodierend für Teilprotein PthG245- 88
SEQ ID NO: 22 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG245- 88
SEQ ID NO: 23 Nukleotidsequenz (pthG253-48s); kodierend für Teilprotein PthG253- 88
SEQ ID NO: 24 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG253- 88
SEQ ID NO: 25 Nukleotidsequenz (pthGG+256-488), kodierend für Teilprotein PthGc+256-488 _
SEQ ID NO: 26 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGo+256-488
SEQ ID NO: 27 Nukleotidsequenz (pthG257- 8s), kodierend für Teilprotein PthG257-488
SEQ ID NO: 28 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG257-488
SEQ ID NO: 29 Nukleotidsequenz (pthGi.350), kodierend für Teilprotein PthGi.350
SEQ ID NO: 30 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG]_35o
SEQ ID NO: 31 Nukleotidsequenz (pthG].38o), kodierend für Teilprotein PthGi_3 o
SEQ ID NO: 32 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGi.380
SEQ ID NO: 33 Nukleotidsequenz (pthGi.412), kodierend für Teilprotein PthGj.412
SEQ ID NO: 34 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGun
SEQ ID NO: 35 Nukleotidsequenz
Figure imgf000021_0001
kodierend für Teilprotein
SEQ ID NO: 36 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGi_44o
SEQ ID NO: 37 Nukleotidsequenz (pthGi_486), kodierend für Teilprotein PthGi_486
SEQ ID NO: 38 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthGi_486
SEQ ID NO: 39 Nukleotidsequenz S549, für einen Primer
SEQ ID NO: 40 Nukleotidsequenz S544, für einen Primer
SEQ ID NO: 41 Nukleotidsequenz S558, für einen Primer
SEQ ID NO: 42 Nukleotidsequenz S550, für einen Primer
SEQ ID O: 43 Nukleotidsequenz S551 , für einen Primer
SEQ ID NO: 44 Nukleotidsequenz S545, für einen Primer
SEQ ID NO: 45 Nukleotidsequenz S552, für einen Primer
SEQ ID NO: 46 Nukleotidsequenz S561, für einen Primer
SEQ ID NO: 47 Nukleotidsequenz S560, für einen Primer
SEQ ID NO: 48 Nukleotidsequenz S559, für einen Primer
SEQ ID NO: 49 Nukleotidsequenz S553, für einen Primer
SEQ ID NO: 50 Nukleotidsequenz S562, für einen Primer
SEQ ID NO: 51 Nukleotidsequenz S554, für einen Primer
SEQ ID NO: 52 Nukleotidsequenz S1420, für einen Primer zur qRT-PCR Bestimmung des ribosomalen Proteins 60S aus C. beticola
SEQ ID NO: 53 Nukleotidsequenz S 1421 , für einen Primer zur qRT-PCR Bestimmung des ribosomalen Proteins 60S aus C. beticola
SEQ ID NO: 54 Nukleotidsequenz (pthG 2-i2o), kodierend für Teilprotein PthG92-i2o
SEQ ID NO: 55 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG92-i2o
SEQ ID NO: 56 Nukleotidsequenz (pthG44].486), kodierend für Teilprotein PthG44i _4g6
SEQ ID NO: 57 Aminosäuresequenz des Teilproteins PthG44i-486
Figure imgf000022_0001
dem kompletten Avirulenzgen pthG aus Erwinia herbicola py. gypsophilae
Das Avirulenzgen pthG (Pathogenitätsgen auf Gypsophila, SEQ ID NO: 1) kodiert für das 488 Aminosäuren-große Avirulenzprotein PthG (SEQ ID NO: 2) und wurde aus dem Pathogen Erwinia herbicola pv. gypsophilae {Pantoea agglomerans pv. gypsophilae) isoliert (Ezra et al., 2000). Das pthG-Gen wirkt als Virulenzfaktor im Schleierkraut (Gypsophila). Zudem kodiert es für ein hochwirksames Avirulenzprotein, welches eine Hypersensitive Reaktion in allen untersuchten Beta- Spezies {Beta vulgaris, Beta patula, Beta webbiana, Beta macrocarpa, Beta patellaris, Beta corolliflora, Beta lomatogond) auslöst und dadurch eine Infektion von Zteta-Spezies durch Erwinia herbicola pv. gypsophilae verhindert (Ezra et al., 2004). Das pthG-Gen ist somit ein Avirulenzgen mit einem breiten Wirtsbereich, das mit einem in Beta konservierten, unbekannten Resistenzgen reagiert.
Das Gen pthG gg (SEQ ID NO: 3) wurde operativ mit dem derzeit geeignetesten synthetischen, Pathogen-induzierbaren Promotor, umfassend die Kombination von c s-regulatorischen Elementen 2xS-2xD (vgl. WO/00/29592), verknüpft, im Weiteren als synthetischer Promotor 2xS-2xD bezeichnet. Die Transformation des Konstruktes 2xS-2xD-pthGMgg-kan in Zuckerrübenzellen, durchgeführt nach Lindsey & Gallois, 1990, führte aufgrund der eingesetzten Agrobacterium tumefaciens -Bakterien zu einer zeitweilige Aktivierung des synthetischen Promotors und damit zum Absterben der
transformierten Pflanzenzellen nach der Expression des Avirulenzgens. Die Regeneration einer vitalen Zuckerrübenpflanze war bei Verwendung von 3 verschiedenen Zuckerrübengenotypen in wiederholten Versuchen unmöglich. Die Transformation des synthetischen Promoter 2xS-2xD in Kombination mit dem Luciferasegen führte hingegen zu 1 - 15 Transformanten pro Versuch. Dieses Ergebnis zeigte, dass zwar das Luciferasegen nicht jedoch das vollständige Gen
Figure imgf000022_0002
(SEQ ID NO: 3) in Zuckerrüben transformierbar ist (Tabelle 1 ).
Tabelle 1 : Vergleich der Transformierbarkeit des Gens pinG^s mit dem Luc-Gen in Zuckerrüben. Das pthG- Gen und Luc-Gen stehen beide unter der Kontrolle des synthetischen Promotors 2xS-2xD in den ansonsten identischen binären Vektoren 2xS-2xD-pthG-kan und 2xS-2xD-luc-kan. Dargestellt ist die Zahl der pro Versuche erhaltenen unabhängigen transgenen Pflanzen und in Klammern der verwendete Zuckerrübengenotyp.
Figure imgf000022_0003
Identifikation der für die Zelltodauslösung notwendigen funktionellen Bereiche des PthG-Proteins Der kodierende Bereich des
Figure imgf000023_0001
wurde unter Einführung von neuen Translationsstart- und Stoppcodons vom 5'- und 3'-Ende her verkürzt, so dass zehn N- und C-terminal verkürzte PthG- Proteine synthetisiert werden konnten (FIG. 1 ). Bei den N-terminalen Deletionen wurden die ersten 61 , 91 , 120 und 256 Aminosäuren entfernt. Die entstehenden Genfragmente wurden als pthG62-488, pthG92.488, pthGi2i-488, pthG257-488 bezeichnet. Dazu wurden die genannten Fragmente durch PCR unter Verwendung der Primerpaare S549/S544 (SEQ ID NO: 39/SEQ ID NO: 40), S558/S544 (SEQ ID NO: 41/SEQ ID NO: 40), S550/S544 (SEQ ID NO: 42/SEQ ID NO: 40) und S551/S544 (SEQ ID NO: 43/SEQ ID NO: 40) und des Ausgangsplasmides pQE60-pthG mit Hilfe der Pfu-Polymerase amplifiziert. Die PCR Bedingungen waren wir folgt:
Pfu-PCR (50μ1 Ansatz):
10 x Pfu Ultra High Fidelity-Puffer 5 μΐ
dNTP's (je lO mM) 5 μΐ
Pfu Ultra High Fidelity Polymerase (1 U/μΙ) 1 μΐ
sense-Primer (20 μΜ) 0,5 bzw. 1 μΐ
antisense-Primer (20 μΜ) 0,5 bzw. 1 μΐ
DNA (1-100 ng/μΐ) 4 μΐ
bidest. H20 33 bzw. 34 μΐ
Bei Bedarf wurde einigen PCR-Amplifikationen MgCl2 zugesetzt. Hier wurden Konzentrationen von 1 V bis 4 V pro PCR zugesetzt.
PCR-Programm Pfu gen. DNA:
1. Zyklus 2 min 95 °C (initiale Denaturierung)
2. -(25.-35.) Zyklus 30 sec 95 °C (Denaturierung)
30 sec 58 °C- 60 °C (Annealing)
2 min 72 °C (DNA- Synthese)
Terminale Extension 10 min 72 °C
Endtemperatur 10 °C
Die 5 '-Primer S549 (SEQ ID NO: 39), S558 (SEQ ID NO: 41 ), S550 (SEQ ID NO: 42) und S551 (SEQ ID NO: 43) enthalten eine Ncol (CCATGG) Schnittselle mit der die N-terminalen Deletionen mit ein Startmethionin versehen wurden. Der Primer S544 (SEQ ID NO: 40) weist eine BamHI Schnittstelle hinter dem Stoppcodon des Gens pthG 88 auf. Durch Schneiden mit den
Restriktionsenzymen Ncol und BamHI konnten die DNA-Fragmente S549/S544 (SEQ ID NO:
39/SEQ ID NO: 40), S558/S544 (SEQ ID NO: 41 /SEQ ID NO: 40), S550/S544 (SEQ ID NO: 42/SEQ ID NO: 40) und S551/S544 (SEQ ID NO: 43/SEQ ID NO: 40) in den Vektor p70S-165-# 176-NcoI (Vektor bekannt aus WO/2006/128444) kloniert und unter die Expressionskontrolle des doppelten 35S Promotors gestellt werden.
Bei den C-terminalen Deletionen wurden die letzten 2, 48, 76, 108, 138 und 233 Aminosäuren entfernt. Die entstehenden Genfragmente wurden als pthGi.486,
Figure imgf000024_0001
pthGi.35o und pthGj.255 bezeichnet. Dazu wurden die genannten DNA-Fragmente durch PCR unter Verwendung der Primerpaare S545/S552 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 45), S545/S561 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 46), S545/S560 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 47), S545/S559 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 48), S545/S553 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 49), S545/S554 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 51 ) und S545/S562 (SEQ ID NO: 44/SEQ ID NO: 50) wie für die N-terminalen Deletionen beschrieben amplifiziert und kloniert.
Die Expression der verkürzten pthG-Varianten und des kompletten Gens pthG 88 erfolgte unter Kontrolle des doppelten 35S-Promotors durch transiente ballistische Transformation unter
Verwendung einer PDS-1000 Genkanone (BioRad, München, Deutschland) in Gegenwart von zwei Luciferasereportergenen aus Photinus pyralis und Renilla reniformis. Mit Hilfe der Reportergene war es möglich die Vitalität der transformierten Zellen zu messen. Die transiente ballistische
Transformation wurde folgendermaßen durchgeführt:
Vorbereitung der Macrocarrierpräparation
Es wurde 60 mg Gold (Goldpulver; AU Typ 200-03 (Heraeus GmbH, Hanau, Deutschland) in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß eingewogen, danach erfolgte die Zugabe von 1 ml 70 % EtOH, dieses wurde 5 min gevortext und anschließend 15 min stehen gelassen. Das Gold wurde durch kurzes Zentrifugieren sedimentiert (ca. 5 sec) (Pico Fuge®, Stratagene, Amsterdam) und der Überstand verworfen. Das Gold wurde in 1 ml bidest. H20 resuspendiert, 1 min gevortext, 1 min stehen gelassen und wiederum sedimentiert (5 sec), der Überstand wurde verworfen und das Sediment in 1 ml bidest. H20 resuspendiert. Diesen Waschschritt wiederholte man insgesamt dreimal. Das gewaschene Gold wurde letztendlich in 1 ml 50 % Glycerin aufgenommen.
Beladen der Macrocarrier mit DNA (für 6 Schuss)
Für die Transformation wurde nur Plasmid-DNA verwendet, die durch Silicamembransäulen gereinigt und auf eine Konzentration von 1 μg/μl eingestellt worden war. Als Reportergenkonstrukt wurde das Plasmid p70S lue mit dem Luciferasegen aus Photinus pyralis und als Normalisierungsvektor p70S ruc mit dem Luciferasegen von Renilla reniformis eingesetzt.
Ansatz für Effektorgold
Das Gold wurde für mindestens 5 min gevortext und 2,5 μΐ Effektor Plasmid-DNA (1 μg/μl) und 2,5 μΐ p70S lue Plasmid-DNA in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und gemischt, dazu 25 μΐ Goldsuspension gegeben; dabei war es wichtig die Suspension ständig zu vortexen. Zudem wurden „
- 24 - noch 25 μΐ CaCl2 (2,5 M) und 10 μΐ Spermidin (0,1 M) dazugegeben. Der Ansatz wurde 3 min gevortext, anschließend 1 min ruhen gelassen, das Gold wurde durch kurzes Zentrinagieren (2-3 sec) sedimentiert und der Überstand abgenommen und verworfen. Das Sediment wurde mit 70 μΐ 70 % EtOH und anschließend mit 70 μΐ 100 % EtOH gewaschen, danach in 24 μΐ 100 % EtOH
aufgenommen und gut gevortext.
Ansatz für Normalisierungsgold
Die Durchführung war identisch mit der vom Effektorgold, allerdings unterschieden sich die eingebrachten Mengen. Es wurde 5 μΐ p70S ruc DNA (1 μ /μ1) in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und 50 μΐ Goldsuspension, 50 μΐ CaCl2 (2,5 M) und 20 μΐ Spermidin (0,1 M) dazugegeben. Das Sediment wurde mit 140 μΐ 70 % EtOH und anschließend mit 140 μΐ 100 % EtOH gewaschen, danach in 48 μΐ 100 % EtOH aufgenommen und gut gevortext.
Um das Normalisierungsgold einsetzen zu können und um die verschiedenen Ansätze miteinander vergleichen zu können, wurden die Mengen des Normalisierungsgoldes entsprechend der Zahl der Wiederholungen erhöht.
Es wurden 40 μΐ Normalisierungsgold und 10 μΐ Effektorgold gemischt, dann wurde jeweils 6 μΐ der Suspension mit einer 10 μΐ Gilson-Pipette gleichmäßig in der Mitte des Macrocarriers verteilt. Die Macrocarrier wurden zuvor in Macrocarrierholder positioniert. Nachdem das Gold getrocknet war, indem das EtOH verdampfte, konnten die Macrocarrier für den Beschuss verwendet werden.
Der Beschuss der Zuckerrübenblätter mit den DNA-beladenen Goldpartikeln und die Messung der dualen Luciferaseaktivitäten wurden wie beschrieben (Schmidt et al., 2004) durchgeführt. Die Expression der funktionellen pthG-Fragmente durch den doppelten 35S Promotor löst in den mit dem Effektorgold transient transformierten Zuckerrübenzellen eine Hypersensitive Reaktion aus, die zu einem lokalen Zelltod führt. Der lokale Zelltod der transformierten Zelle verhindert auch die
Expression des mit dem Effektorgold cotransformierten Luciferasegens aus Photinus pyralis (p70S lue). Die Messung der mit Hilfe des Normalisierungsgoldes in das Blattgewebe geschossenen Luciferase von Renilla reniformis erlaubt eine Normalisierung der Beschussversuche. Im Vergleich zu den Kontrollansatz der statt eines pthG-Konstruktes nur den Leervektor pCaM-V2 (Vektor bekannt aus WO/2006/128444) enthält, kann so die zelltodauslösende Wirkung der pthG-Fragmente gemessen werden.
Die Deletionsexperimente und anschließenden Funktionsprüfungen zeigten, dass neben dem
Ausgangsprotein
Figure imgf000025_0001
auch die N-terminalen Deletionen PthGö2-488 und PthG92_488 eine starke zelltodauslösende Wirkung haben. Der Proteinteil PthG|2i-488 hingegen löste wie der Proteinteil
PthG257-488 keinen Zelltod mehr aus, so dass der Proteinbereich von Aminosäureposition 92-120 (SEQ ID NO: 55) für die Zelltodauslösung notwendig ist, während der Proteinbereich von Position 1 -91 für ^
die Zeiitodauslösung entbehrlich sind. Im Fall der C-terminalen Deletionen löste der Proteinteil PthG]. 486 noch einen starken Zelltod aus. Die Proteinteile
Figure imgf000026_0001
PthGi.38o und PthGi.350 hingegen lösten keinen Zelltod mehr aus. Am C-Terminus ist somit die Aminosäuresequenz von Position 441-486, nicht jedoch die Sequenz von Position 487-488 notwendig für die Zeiitodauslösung (FIG. 2 und FIG. 3).
Komplementierung der Avirulenzgenfunktion durch Coexpression verkürzter inaktiver pthG- Genfragmente
Nachdem die Deletionsanalysen gezeigt hatten, dass zwei Sequenzabschnitte im Bereich von
Aminosäureposition 92-120 und 441-486 Voraussetzung für die Zeiitodauslösung sind, wurden die inaktiven Teilfragmente in Zuckerrübenblättern durch den ballistischen Test transient coexprimiert. Während die Nukleinsäuren einzeln exprimiert keinen Zelltod auslösten, führte die Coexpression der Nukleinsäuren von pthGi.255 und pthGi2i- 88 zu einem starken Zelltod, der vergleichbar zu dem Zelltod ist, der durch das vollständige Protein PthG gg ausgelöst wird. Durch die gemeinschaftliche
Expression der Proteinteile PthGi.255 und PthGi2i- 88 kam es zu einer Komplementierung der
Avirulenzprotein-Wirkung und zu einer Induktion der Hypersensitiven Reaktion (FIG. 4). Die Coexpression der Nukleinsäuren von pthGi.255 und pthG257- 88 hingegen führte zu keinem Zelltod und damit zu keiner Wiederherstellung der Avirulenzgenfunktion. Der Unterschied zwischen der
Coexpression von pt.hG1.255 und pthGi2 88 'm Vergleich zu pthGi.255 und pthG257- 88 egt darin, dass im Fall der erfolgreichen Komplementation die Aminosäuresequenzen der beiden Proteinfragmente teilweise überlappen.
Die Ergebnisse sind in mehrfacher Hinsicht überraschend. Zum einen ist bei anderen
Avirulenzgenproteinen bekanntermaßen die Zelltod auslösende Domäne immer nur einem
Proteinabschnitt zugeordnet und zum anderen ist eine intramolekulare Komplementation der
Avirulenzgenfunktion nicht bekannt.
Identifizierung der für die Komplementation minimal notwendigen Sequenzen des pthG-Gens
Die bisherigen Arbeiten zur Expression des zweiteiligen Avr-Gens hatten gezeigt, das die Moleküle PthGi.255 und PthGi22- 88 nach einer Coexpression Zelltod in Zellen von Zuckerrübenblättern auslösen. Durch weiterfuhrende Arbeiten konnten die minimal notwendigen Sequenzen identifiziert werden, die für die funktionelle Komplementation notwendig sind.
Dazu wurde zunächst das C-terminal deletierte Protein PthGi.255 ausgehend vom N-Terminus weiter verkürzt. Die neu erstellten Nukleinsäuren pthG62-255, pthG 2-255, pthG i.255 sowie pthGi.255 wurden gemeinsam mit der Nukleinsäure pthGi2i- 88 in drei Versuchen in Zuckerrübenblätter cotransformiert. Die Verkürzung der Moleküle führte in Kombination mit pthGm^ss ZU einer schrittweisen Abnahme der Zelltodauslösung. Kombiniert lösten die Proteinteile kodiert durch pthGi.255 und pthG)2 i-488 den stärksten Zelltod aus, der fast so stark wie der Zelltod durch das vollständige Protein PthGi-488 war. Die Proteinteile kodiert durch pthGö2-255 und pthG92- 55 in Kombination mit PthGi22- 88 lösten einen schwächeren Zelltod aus, während pthGm^ss bei der Coexpression inaktiv war (Tabelle 2). Insgesamt war eine Aktivitätsabnahme von pthGi.255 über pthG62-255 zu pthG92-255 zu beobachten.
Tabelle 2: Eingrenzung der für die Zelltodauslösung notwendigen Aminosäurebereiche im Bereich 1-255 des zweigeteilten Avirulenzproteins (+ zeigt die Intensität des ausgelösten Zelltods an; - kein Zelltod).
Figure imgf000027_0001
Die Verkürzung des Moleküls PthGi2i-488 erfolgte vom N-Terminus aus. Die neu erstellten
Nukleinsäuren pthG^ss, pthG205-488, pthG245-488, pthG253-488, pthGG+ 56-i88 sowie pthG12i-48 wurden gemeinsam mit der Nukleinsäure pthGi-255 in drei Versuchen in Zellen von Zuckerrübenblätter cotransformiert. Im Fall der Nukleinsäure von pthG<3+256-488 war der codierende Bereich so verändert worden, das die Aminosäuresequenz PthGG+256-488 , am N-Terminus um ein Glycin erweitert worden war. Die Proteinteile PthGi62-488, PthG2os-488 und PthG245-488 waren im Hinblick auf die
Zelltodauslösung genauso wirksam wie das Ausgangsmolekül PthGi2i-488- Eine weitere Verkleinerung auf die Sequenz PthG253-488 führte zum Funktionsverlust (Tabelle 3).
Tabelle 3: Eingrenzung der für die Zelltodauslösung notwendigen Aminosäurebereiche im Bereich 121-488 des zweigeteilten Avirulenzproteins (+ zeigt die Intensität des ausgelösten Zelltods an; - kein Zelltod).
Figure imgf000027_0002
Während die Aminosäuresequenz von Position 121 -244 entbehrlich ist, ist der Sequenzabschnitt von thG245-488 in Kombination mit pth.G1.255 notwendig für die erfolgreiche Komplementation.
Voraussetzung für eine erfolgreiche Komplementation der Zelltod auslösenden Wirkung ist eine geringe Überlappung der Aminosäuresequenzen von den zwei PthG Teilfragmenten, die im Fall von PthGi.255 und 1 1 Aminosäuren beträgt. Eine Überlappung von 3 Aminosäuren wie im Fall von PthGi.255 und PthG253-488 genügt nicht.
In einer weiteren Serie von Coexpressions-Experimenten wurde die Wirksamkeit der als minimal notwendig identifizierten Sequenzen PthG 2-255 und PthG245- 88 mit der von PthGi.255 und PthGi 21-488 direkt verglichen. Die Moleküle PthG62-255 und PthG245-488 lösten bei der Coexpression einen genauso starken Zelltod aus wie die gemeinschaftlich exprimierten Proteine PthGi-255 und PthGi2i-488 (FIG. 5). Durch Verwendung der Moleküle PthG 2.255 und PthG245-488 wurde ein schwächerer Zelltod ausgelöst. Durch den Einsatz von PthG62-255 oder von PthG 2-255 kann die Intensität der Zelltodinduktion moduliert werden.
Funktionelle Analyse und Auswahl von 2xS-2xD-PthGu2jj und 2xS-2xD-PthGj r 4gg Elternpflanzen für Kreuzungen
Identifizierte und isolierte Deletionskonstrukte pthGi.255 und
Figure imgf000028_0001
wurden mit verschiedenen Promotoren, z.B. auch mit synthetischen Pathogen-induzierbaren Promotoren 2xS-2xD und 4xD responsiv auf Cercospora beticola, operativ verknüpft. Mit den binären Vektoren2xS-2xD-pthG 1.255- kan und 2xS-2xD-pthGi2 i -488-kan wurden dann jeweils separat Zuckerrübenpflanzen transformiert (Lindsey & Gallois, 1990). Im Fall von eingesetzten Pathogen-induzierbaren Promotoren wie auch konstitutiven Promotoren konnten trotz der Aktivierung bzw. Aktivität dieser Promotoren während der A. tumefaciens-vermittelten Transformation stabile, lebensfähige Transformanten mit den Konstrukten umfassend pthGi-255 oder
Figure imgf000028_0002
produziert werden, da die nicht-funktionellen Teilproteine PthGi. 255 und PthGi2i- 88 in ihren jeweiligen Transformanten nicht als Induktoren eines Zelltods fungierten. Zuckerrüben-Transformanten, welche die rekombinanten Teilproteine beispielsweise nach einer künstlichen C. beticola Infektion schnell und ausreichend produzierten, konntendurch qRT-PCR identifiziert werden. Die künstliche Infektion von Zuckerrüben, RNA-Isolation, cDNA-Synthese und qRT-PCR wurde durchgeführt wie beschrieben (Weltmeier et al., 201 1). Idealerweise wurde durch einen ballistischen, transienten Komplementationstest die Eignung einer transgenen Linie zur Zelltodauslösung quantitativ bestimmt. Dazu wird zunächst durch eine Southern-Blot Analyse, wie bei Stahl et al., 2004 für Zuckerrüben beschrieben, die Zahl der genomischen Integrationen der pthG- Genfragmente bestimmt.
Für die Komplementations-Untersuchungen wurden die transgenen Linien ausgewählt, die nur eine T- DNA Integration und damit ein pthG-Gen unter der Kontrolle eines synthetischen Promotors aufwiesen. Obwohl die eingesetzten synthetischen Promotoren sehr spezifisch durch Pathogenbefall aktiviert werden, sind diese Promotoren auch wundinduzierbar (Rushton et al., 2002). Diese
Wundinduzierbarkeit wurde bei der ballistischen Transformation gezielt genutzt.
Blätter von im Gewächshaus angezogenen transgenen Linien wurden jeweils a) mit dem Leervektor pCaMV-2 als Negativkontrolle, b) mit dem vollständigen pthG1 -488 Gen unter der Kontrolle des doppelten 35S-Promotor (Konstrukt 70S-pthGi_488) als Positivkontrolle und c) mit dem komplementierenden Teilfragment pthG^ ss bzw. pthGi.255 unter der Kontrolle des doppelten 35S- Promotors transient ballistisch transformiert. Die mit dem Leervektor erhaltene normalisierte Reportergenaktivität wurde als Referenz gleich 100% gesetzt. Während das Konstrukt 70S-pthGi.488 als Positivkontrolle einen starken Zelltod auslöste, so dass für alle untersuchten Linien nur 1 -14 % normalisierte Enzymaktivität gemessen werden konnte, führte die transiente Transformation mit dem komplementären pthG-Genfragment in Abhängigkeit von der analysierten transgenen Linie zu stark unterschiedlichen Enzymaktivitäten (FIG. 6A, Tabelle 4). Die mit dem Konstrukt 2xS-2xD-pthG12i. 488kan erstellten transgenen PR144 Linien zeigten nach der Komplementation mit dem Konstrukt 70S- pthGi.255 eine normalisierte Enzymaktivität von 20, 28, 30, 48, 55, 62 und 100%. Für die mit dem Konstrukt 2xS-2xD-pthG 1.255 -kan gewonnenen transgenen PR148 Linien wurde nach der
Komplementation mit dem Konstrukt 70S-pthG| 2i-488 eine normalisierte Enzymaktivität von 13, 16, 22, 26, 43, 49, 55, 67 und 100% ermittelt (FIG. 6B, Tabelle 4). Das unterschiedliche Ausmaß der Induktion eines Zelltodes bzw. einer Hypersensitiven Reaktion in verschiedenen transgenen Linien gleicher Genetik, die jeweils nur eine Integration des gleichen Konstruktes aufwiesen, war vermutlich auf den Einfluss des Integrationsortes zurückzuführen. Die Integration der T-DNA eines Konstruktes erfolgt bei der Agrobacterium tumefacie s vermittelten Transformation bekanntermaßen zufällig. Durch die funktionelle Analyse stand nun ein ganzes Spektrum von transgenen Pflanzen zu
Verfügung, die in einer abgestuften Weise zur Induktion einer Hypersensitiven Reaktion fähig sind und die für Kreuzungen ausgewählt werden konnten.
Tabelle 4: Funktionelle Charakterisierung transgener 2xS-2xD-pthG1_255 und 2xS-2xD-pthGi2i-488 Zuckerrüben durch ballistische transiente Komplementation. Alle transgenen Linien weisen nur eine pthG Integration im Genom auf. Bestimmt wurde die relative Enzymaktivität der mit den Effektorgenen
Figure imgf000029_0001
pthGi-255 und pthG12 88 contransformierten Luciferasegene (100% = kein Zelltod, 0% = sehr starker Zelltod. n.b. = nicht bestimmt).
Transiente Komplementation
Transgene Linie
Zuckerrrübe # relative normalisierte Enzymaktivität (%)
Konstrukt
Leervektor pthG 8s PthG 1.255 pthG | 88
Kontrolle
100 8 100 100 nicht transgen
PR 144 / 4 2xS-2xD-pthG-i21_488 -kan 100 7 20 n.b.
PR 144 / 34 100 4 28 n.b.
PR 144 / 30 100 2 30 n.b.
PR 144 / 17 100 4 48 n.b.
PR 144 / 5 100 1 55 n.b.
PR 144 / 19 100 2 62 n.b.
PR 148 / 35 2xS-2xD-pthG-,_255 -kan 100 6 n.b. 13
PR 148 / 54 100 8 n.b. 16
PR 148 / 45 100 6 n.b. 22
PR 148 / 46 100 12 n.b. 26
PR 148 / 53 100 12 n.b. 43
PR 148 / 49 100 6 n.b. 49
PR 148 / 59 100 9 n.b. 55 PR 148 / 52 100 13 n.b. 67
PR 148 / 56 100 14 n.b. 100
In der gleichen Weise wurden die transgenen Linien PR171 und PR173 funktionell analysiert, die mit dem 4xD Promotor in Kombination mit den minimal notwendigen Sequenzen pthGö2-255 und pthG245- 488 transformiert worden sind. Vergleichbar zu den Ergebnissen mit den PR144 und PR148 Pflanzen zeigten die 4xD-pthG62-255 und 4xD-pthG245_ 88 Pflanzen nach der transienten Komplementation mit den Konstrukten 70S- pthG2 5- 88 und 70S-pthG62-255 eine große Spannbreite an Zelltodinduktion (Tabelle 5).
Tabelle 5: Funktionelle Charakterisierung transgener 4xD-pthG 62.255 und 4xD-pthG 245^88 Zuckerrüben durch ballistische transiente Komplementation. Alle transgenen Linien weisen nach Southern-Blot Analyse nur eine pthG Integration im Genom auf. Bestimmt wurde die relative Enzymaktivität der mit den Effektorgenen pthG 488, pthG 245-488 und pthG 62.255 contransformierten Luciferasegene. 100% = kein Zelltod, 0% = sehr starker
Zelltod. n.b. = nicht bestimmt
Figure imgf000030_0001
Kombination des zweigeteilten Avirulenzproteins durch Kreuzung ausgewählter Zuckerrüben Transformanten
Die funktionell charakterisierten transgenen Linien PR144, PR148, PR171 und PR173 konnten für unterschiedliche Kreuzungen eingesetzt werden (siehe beispielhaft FIG. 7 und Tabelle 6). Eine Möglichkeit besteht in der Kreuzung von transgenen Zuckerrüben, bei denen die beiden pthG Teilfragmente unter der Kontrolle des gleichen Pathogen-induzierbaren Promotor, z.B. des 2xS-2xD Promotor, stehen. Eine entsprechende Kreuzung wurde für die Linie PR148/56 mit den Linien PR144/4 und PR144/30 durchgeführt. Das aus den Kreuzungen gewonnene Saatgut wurde oberflächendesinfiziert und unter Gewebekulturbedingungen auf MS-Medium ausgelegt. Die so erhaltenden in-vitro Pflanzen wurden durch PCR auf die Anwesenheit der beiden pthG-Fragmente überprüft und klonal vermehrt. Die PCR Analyse zeigte, dass die Kreuzungsnummern 5258/1 und 5260/1, die aus der Kreuzung PR148/56 x PR144/4 stammen, sowie die Kreuzungsnummern 5398/1 und 5398/3, die Nachkommen der Kreuzung PR148/56 x PR144/30 sind, sowohl die Sequenz pthGi-255 als auch pthGi2i-488 trugen. Die vermehrten in-vitro Pflanzen wurden im in-vitro Test mit C. beticola nach Schmidt et al., 2008 infiziert. Infizierte und nichtinfizierte Pflanzen wurden 1 , 2, 4 und 7 Tage nach der Inokulation geerntet (je drei biologischen Replikaten), RNA wie beschrieben isoliert und eine qRT-PCR Analyse durchgeführt, um die Transkriptakkumulation von pthGi.255 und pthGi2i-488 nach Cercospora beticola- Infektion nachzuweisen. Als Kontrollen dienten nicht-transgene Zuckerrübenpflanzen (3DC4156) und transgene Zuckerrübenpflanzen, die mit dem Konstrukt FP635 unter der Kontrolle eines Pathogen- induzierbaren Promotors transformiert wurden (PR167/1 1). FP635 kodiert für ein rot-fluoreszierendes Protein mit einer Anregung bei einem Wellenlängenmaximum von 589 nm und einer Lichtemission bei einem Wellenlängenmaximum von 636 nm. Es hat selbst keinen Einfluss auf die pflanzliche Pathogenabwehr. Die Ergebnisse zeigten, dass die Nukleinsäure pthGi.255 in den PR148 x PR144 - Kreuzungen schwach exprimiert und durch den Pathogenbefall induziert wird (Fig. 8A). Obwohl die transgene Linie PR148/56 im transienten Komplementationstest keinen Zelltod zeigte, kann die Induktion und schwache Expression der Sequenz pthG 1 -255 durch die sensitive qRT-PCR nachgewiesen werden.
Die Nukleinsäure
Figure imgf000031_0001
in den PR148 x PR144 - Kreuzungen wurde infolge der C. beticola- Infektion stark induziert (FIG. 8B), während in der nichttransgenen und der transgenen Kontrolle keine Transkriptakkumulation nachzuweisen ist. Die Aktivitäten der Promotoren der beiden
Nukleinsäuren zeigten somit eine überlappende Expressionsregulation für den Fall einer
Pathogeninfektion.
Tabelle 6: Identifizierung von Nachkommen aus den Kreuzungen PR148/56 x PR144/4, PR148/56 x PR144/30 und PR144/19xPR171/19 (kan: Kanamycin als Selektionsmarker; 1 Relative Enzymaktivität im transienten Komplementationstest (100 % = kein Zelltod, 0% = maximaler Zelltod)
Kreuzung Elter 1 PCR Enzymaktivität1 Elter 2 PCR Enzymaktivität1 -Nr. Promotor und Elter 1 Elter 1 [%] Promotor und Elter 2 Elter 2 [%] pthG-Fragment pthG-Fragment
5258/1 PR148/56 positiv 100% PR144/04 positiv 20%
2xS-2xD- 2xS-2xD- pthG!.255 pthGi21-488
5260/1 PR 148/56 positiv 100% PR144/04 positiv 20%
2xS-2xD- 2xS-2xD- pthG,.255 pthG12i-488
Figure imgf000032_0001
002 pthG62-255 pthG12l-488
Nachweis der verstärkten Pathogenabwehrreaktion durch Quantifizierung der pilzlichen Biomasse nach Cercospora &e/ co/a-Infektion mittels Expressionsanalyse
Eine verbesserte Pathogenabwehr ließ sich durch die quantitative Bestimmung von
pathogen spezifischen Expressionstranskripten nachweisen, welche ein Maß für die pathogene Biomasse als Folge der Pathogeninfektion darstellte. Zu diesem Zweck wurde die Akkumulation des C. beticola-Gens für das 60S ribosomale Protein (FIG. 9A) durch qRT-PCR mit den Primern S1420 (SEQ ID NO: 52) und S1421 (SEQ Π) NO: 53) quantifiziert. Je drei biologischen Replikate der PR148 x PR144 - Kreuzungen 5258/1 , 5260/1 , 5398/1 und 5398/3 wurden am Tag 1 , 2, 4 und 7 nach Cercospora Äe//co/a-Infektion analysiert. Als Kontrollen dienten weiterhin 3DC4156 und PR167/1 1. Das Ergebnis zeigte, dass die pilzliche Biomasse der Kontrollpflanzen am Versuchsende, 7 Tage nach der Infektion, ca. 50% höher war als diejenige der transgenen Pflanzen der PR148 x PR144 - Kreuzungen. Dieses Ergebnis beweist, dass durch die Coexpression von pthGi.255 und pthGi2i-488 infolge der C. Äe/ co/a-Infektion eine Pathogenabwehrreaktion in den Pflanzen ausgelöst wurde, die anders als in den Kontrollen eine verzögerte und eingeschränkte Ausbreitung des Pathogens C.
beticola bewirken konnte.
Nachweis der verstärkten Pathogenabwehrreaktion durch Quantifizierung von Komponenten der pflanzlichen Pathogenabwehr mittels Expressionsanalyse
Zum Nachweis einer erhöhten Pathogenantwort in einer der PR148 x PR144 - Kreuzungen kann das Expressionslevel von Komponenten der pflanzlichen Pathogenabwehr quantitativ bestimmt werden. Hierfür wurde die Transkript-Akkumulation des B. vulgaris-Gens der Kaffeesäure-O-Methyl- Transferase BvCoMT (Fig. 9B), das bei Resistenzreaktionen der Zuckerrrübe gegenüber C. beticola induziert wird (Weltmeier et al., 201 1) in je drei biologischen Replikaten der PR148 x PR144 - Kreuzungen (In-vitro Pflanzen) am Tag 1 , 2, 4 und 7 nach Cercospora beticola-lnio txon durch qRT- PCR wie bei Weltmeier et al. 201 1 für das Gen PLT3_005_g06.f beschrieben, durchgeführt (FIG. 9B). Das Ergebnis zeigte, dass die Expression des BvCOMT Gens, das im Zusammenhang mit der Pathogenabwehr exprimiert wurde, in den transgenen in-vitro Pflanzen der PR148 x PR144 - Kreuzungen 5398/1 und 5398/3 im Vergleich zu den Kontrollen (3DC4156 und PR167/1 1 ) sieben Tage nach der C. öet co/o-Infektion höher ist. Die Expression bei den Kreuzungsnummern 5258/1 und 5260/1 war vergleichbar zu den Kontrollen. Da die pilzliche Biomasse in den Kontrollen jedoch 50 % höher war, sollte in den Kontrollen auch eine stärkere BvCOMT Transkriptmenge als in den
Kreuzungsprodukten erwartet werden. Die gleiche hohe bzw. sogar höhere BvCOMT
Tran skriptmenge in den Kreuzungen zeigt, das die Syntheseprodukte der Nukleinsäuren pthG^s und pthGi2i-488, gebildet in Reaktion auf die C. beticola-lnfektion, zu einer erhöhten pflanzlichen
Pathogenantwort führen.
Erzeugung von Kreuzungsprodukten, in denen die pthG-Nukleinsäuren unter der Kontrolle unterschiedlicher pathogen-induzierter Promotoren stehen
Um sicherzustellen, dass alle Teile des Avirulenzproteins PthG ausschließlich zum Zeitpunkt einer "echten Infektion" in einer Zelle synthetisiert vorliegen und deren Expression nicht durch andere Stimuli (Transformation, Entwicklung, abiotischer Stress etc.) induziert wird, ist die Verwendung zweier unterschiedlicher synthetischer pathogeninduzierbarer Promotoren besonders vorteilhaft. Aus diesem Grund wurde eine Kreuzung ausgewählter PR144 (Konstrukt 2xS-2xD-pthG]2i-488) und PR171 (Konstrukt 4xD-pthGö2-255) Transformanten auf der Grundlage der funktionell analysierten Transformanten (Tabellen 4 und 5) durchgeführt. Von den Kreuzungen PR171/19x PR144/4, PR171/19x PR 144/5, PR171/19xPR144/19 sowie PR171/2xPR144/4 und PR171/2xPR144/19 wurde Saatgut erhalten, jedoch führte nur die Kreuzung PR171/19xPR144/19 zu lebensfähigen
Nachkommen.
Zahlreiche der erhaltenen Kreuzungsprodukte zeigten trotz der hervorragenden Pathogen Spezifität der eingesetzten synthetischen Promotoren auch bei Abwesenheit eines Pathogens vor Allem während der Keimungsphase eine geringe Induktion einer HR-Reaktion. Diese war in der Regel ausreichend, um die empfindlichen Keimlinge absterben zu lassen (FIG. 10A und FIG. 10B). Aus einigen Kreuzungen gelang es jedoch erfolgreich vitale Zuckerrübenpflanzen heranzuziehen, bei denen eine derartige Induktion während der Keimphase ausblieb. Diese Pflanzen ließen sich klonal vermehren (FIG. 10C), bewurzeln (FIG. 10D) und in das Gewächshaus überführen. Dort entwickelten sich die Pflanzen unauffällig (FIG. 10E).
Mit Blick auf die funktionellen Eigenschaften der ausgewählten Kreuzungspartner ergeben sich zwei Rückschlüsse. Die Eltern PR171/17 und PR144/19 zeigen mit 64 % bzw. 62% relativer
Enzymaktivität im transienten Komplementationstest einen geringere Zelltodinduktion als die übrigen ausgewählten Kreuzungspartner (Tabelle 7). Die Induzierbarkeit bzw. Expression der Teilfragmente sollte in den Elternlinien nicht zu stark sein und zum anderen kann durch die graduelle Auswahl unterschiedlicher Aktivitätsniveaus letztendlich eine geeignete Kombination von Eltern gefunden werden.
Eine Infektion der in das Gewächshaus überführten Kreuzungsprodukte PR5021-2010-T-003
(PRl 71/17 xPR144/19) mit C. beticola zeigte nach qRT-PCR Analyse, dass sowohl die Transkription der Sequenz pfhGfc>-255 als auch der Sequenz
Figure imgf000034_0001
1 1 Tage nach Inokulation stark in den Pflanzen induziert werden (FIG. 1 1).
Tabelle 7: Ergebnisse der Kreuzung von transgenen pthG Pflanzen mit unterschiedlicher funktioneller Aktivität. In Klammern angegeben die relative Enzymaktivität der transgenen Linien im transienten Komplementationstest (Tabelle 4 und 5).
Figure imgf000034_0002
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Claims

Ansprüche:
1. Pathogenresistente Pflanze, umfassend mindestens zwei stabil in das Genom integrierte
Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäuren
(i) für unterschiedliche Teile eines Avirulenzproteins kodieren und
(ii) mit Promotoren operativ verknüpft sind,
und mindestens einer der Promotoren Pathogen-induzierbar ist, so dass in einer Zelle der Pflanze infolge einer Infektion der Pflanze durch den Pathogen die unterschiedlichen Teile des
Avirulenzproteins synthetisiert vorliegen und mit einem korrespondierenden Resistenzprotein direkt oder indirekt reagieren.
2. Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die unterschiedlichen Teile des
Avirulenzproteins jeweils für sich genommen keine Induktoren einer pflanzlichen
Pathogenabwehrreaktion darstellen.
3. Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass zwei oder mehr der unterschiedlichen Teile des Avirulenzproteins eine abschnittsweise identische oder ähnliche
Aminosäuresequenz aufweisen.
4. Pflanze nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die abschnittsweise identische oder ähnliche Aminosäuresequenz eine Länge von mehr als 3 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, besonders bevorzugt eine Länge von mindestens 1 1 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aufweist.
5. Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Resistenzgen, das das korrespondierende Resistenzprotein kodiert, im Genom der Pflanze natürlich enthalten ist oder über gentechnologische oder züchterische Verfahren eingebracht wurde.
6. Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die operativ verknüpften Promotoren jeweils eine solche Spezifität aufweisen, dass in der Pathogen-resistenten Pflanze die unterschiedlichen Teile des Avirulenzproteins infolge einer Infektion der Pflanze durch den Pathogen in Zellen lokal begrenzt auf die Infektionsstelle synthetisiert vorliegen.
7. Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze eine Pflanze der Gattung Beta ist.
8. Pflanze nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Avirulenzprotein kodiert wird durch ein Avirulenzgen mit einer Nukleotidsequenz aus der folgenden Gruppe: (i) eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3,
(ii) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 kodiert,
(iii) eine komplementäre Nukleotidsequenz zu der Nukleotidsequenz aus (i) oder (ii),
(iv) eine Nukleotidsequenz, die mit einer der Nukleotidsequenzen aus (i), (ii) oder (iii) unter
stringenten Bedingungen hybridisiert,
(v) eine Nukleotidsequenz mit einer Homologie von mindestens 60% auf DNA-Level zu einer der Nukleotidsequenz aus (i), (ii) oder (iii), oder
(vi) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche eine Identität von mindestens 60% oder eine Ähnlichkeit von mindestens 60% im Vergleich mit der
Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 2 aufweist.
9. Pflanze nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe aufweist:
(i) eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 35,
(ii) ein Fragment der Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 35, umfassend eine
Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 54,
(iii) eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:
29, SEQ ID NO: 31 oder SEQ ID NO: 33,
(iv) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 36 kodiert,
(v) eine Nukleotidsequenz, die für ein Fragment der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO:
36 kodiert, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 55,
(vi) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 kodiert,
(vii) eine komplementäre Nukleotidsequenz zu einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vi),
(viii) eine Nukleotidsequenz, die mit einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vii) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
(ix) eine Nukleotidsequenz mit einer Homologie von mindestens 60% auf DNA-Level zu einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vii), oder
(x) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche eine Identität von mindestens 60% oder eine Ähnlichkeit von mindestens 60% im Vergleich mit einer der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 oder mit einem Fragment der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 36, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 55, aufweist.
10. Pflanze nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe aufweist:
(i) eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 13,
(ii) ein Fragment der Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 13, umfassend eine
Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 56,
(iii) eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 oder SEQ ID NO: 27,
(iv) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 14 kodiert,
(v) eine Nukleotidsequenz, die für ein Fragment der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO:
14 kodiert, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 57,
(vi) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 oder SEQ ID NO: 28 kodiert,
(vii) eine komplementäre Nukleotidsequenz zu einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vi),
(viii) eine Nukleotidsequenz, die mit einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vii) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
(ix) eine Nukleotidsequenz mit einer Homologie von mindestens 60% auf DNA-Level zu einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vii), oder
(x) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche eine Identität von mindestens 60% oder eine Ähnlichkeit von mindestens 60% im Vergleich mit einer der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 oder SEQ ID NO: 28 oder mit einem Fragment der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 14, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 57, aufweist.
1 1. Samen, Teil, Organ, Gewebe oder Zelle der Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
12. Zusammensetzung von Nukleinsäuren mit mindestens zwei Nukleinsäuren zur Integration in ein Genom einer Pflanze, wobei die Nukleinsäuren
(i) für unterschiedliche Teile eines Avirulenzproteins kodieren und
(ii) mit Promotoren operativ verknüpft sind,
und mindestens einer der Promotoren Pathogen-induzierbar ist, so dass in einer Zelle der Pflanze infolge einer Infektion der Pflanze durch den Pathogen die unterschiedlichen Teile des
Avirulenzproteins synthetisiert vorliegen und mit einem korrespondierenden Resistenzprotein direkt oder indirekt reagieren.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe aufweist: (i) eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 35,
(ii) ein Fragment der Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 35, umfassend eine
Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 54,
(iii) eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:
29, SEQ ID NO: 31 oder SEQ ID NO: 33,
(iv) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 36 kodiert,
(v) eine Nukleotidsequenz, die für ein Fragment der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO:
36 kodiert, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 55,
(vi) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 kodiert,
(vii) eine komplementäre Nukleotidsequenz zu einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vi),
(viii) eine Nukleotidsequenz, die mit einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vii) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
(ix) eine Nukleotidsequenz mit einer Homologie von mindestens 60% auf DNA-Level zu einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vii), oder
(x) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche eine Identität von mindestens 60% oder eine Ähnlichkeit von mindestens 60% im Vergleich mit einer der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 oder SEQ ID NO: 34 oder mit einem Fragment der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 36, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 55, aufweist.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe aufweist:
(i) eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 13,
(ii) ein Fragment der Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 13, umfassend eine
Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 56,
(iii) eine Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 oder SEQ ID NO: 27,
(iv) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 14 kodiert,
(v) eine Nukleotidsequenz, die für ein Fragment der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO:
14 kodiert, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 57,
(vi) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 oder SEQ ID NO: 28 kodiert,
(vii) eine komplementäre Nukleotidsequenz zu einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vi),
(viii) eine Nukleotidsequenz, die mit einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vii) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, (ix) eine Nukleotidsequenz mit einer Homologie von mindestens 60% auf DNA-Level zu einer der Nukleotidsequenzen aus (i) bis (vii), oder
(x) eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche eine Identität von mindestens 60% oder eine Ähnlichkeit von mindestens 60% im Vergleich mit einer der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 oder SEQ ID NO: 28 oder mit einem Fragment der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 14, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 57, aufweist.
15. Elternpflanze zur Herstellung einer Pflanze nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze mit mindestens einer, aber nicht mit allen Nukleinsäuren aus der Zusammensetzung nach Anspruch 12 bis 14 stabil transformiert wurde.
16. Samen, Teil, Organ, Gewebe oder Zelle der Elternpflanze nach Anspruch 15.
17. Verwendung einer Pflanze nach Anspruch 15 oder eines Samens, Teils, Organs, Gewebes oder einer Zelle nach Anspruch 16 zur Herstellung einer Pflanze nach Anspruch 1.
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