JP2005502348A

JP2005502348A - 真核生物の内部リボソームエントリー部位（ｉｒｅｓ）要素の同定法

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Publication number: JP2005502348A
Application number: JP2003525631A
Authority: JP
Inventors: アタベコフ、ヨゼフ; ドロクホフ、ユーリー; スクラチェフ、マキシム; イヴァノフ、ペーター; グレバ、ユーリ
Original assignee: アイコン・ジェネティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-09-03
Publication date: 2005-01-27
Also published as: DE60207275T2; MXPA04002097A; US20050014150A1; DE10143238A1; WO2003020928A3; EP1423516B1; WO2003020928A2; EP1423516A2; CA2457038A1; DE60207275D1; AU2002339478B2; ATE309341T1; US8257945B2

Abstract

真核生物細胞中のＲＮＡのキャップ非依存的翻訳において活性な真核生物ＩＲＥＳ要素を探索し同定する方法であって、ｉ）ａ）長さが少なくとも３０ヌクレオチド、ｂ）アデニンヌクレオチド含有量が少なくとも４０ｍｏｌ％、かつｃ）ピリミジンヌクレオチド含有量が４０ｍｏｌ％未満であるヌクレオチドブロックを含む潜在的ＩＲＥＳ要素を探して、真核生物のｍＲＮＡ配列、又は対応するＤＮＡ配列をスクリーニングするステップと、ｉｉ）前記潜在的ＩＲＥＳ要素を、線状ジシストロン性構築体の上流遺伝子と下流ＧＵＳレポーター遺伝子の間に挿入し、それによって、前記潜在的ＩＲＥＳ要素を、前記下流ＧＵＳ遺伝子がＩＲＥＳ依存的に翻訳されるように位置され、かつ位置させて安定したヘアピン構造の前記下流に上流遺伝子を前記遺伝子のＩＲＥＳ非依存的翻訳を阻止する、ステップと、ｉｉｉ）ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイにおいて、ウサギ網状赤血球の溶解液、又はコムギ胚芽抽出液中で、前記潜在的ＩＲＥＳ要素が前記ＧＵＳ遺伝子をＩＲＥＳ依存的に翻訳できるかを試験し、それによって、好ましくは前記上流遺伝子と前記ＧＵＳ遺伝子の間に、基準ＩＲＥＳ要素又は非ＩＲＥＳ要素を有する構築体を比較対象として、ＧＵＳ遺伝子発現を定量するステップとを含む方法が提供される。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物、哺乳動物、及び酵母細胞中で活性な新規な真核生物のＩＲＥＳ要素を探索し同定する方法、並びに当該方法に従って同定した又は同定可能なＩＲＥＳ要素を使用して、真核生物細胞中でキャップ非依存的に目的とするヌクレオチド配列を発現させる方法に係るものである。本発明は、さらに、上記の方法に従って同定した又は同定可能なＩＲＥＳ要素、並びにこのようなＩＲＥＳ要素を含むベクターで形質転換した遺伝子組換え真核生物細胞又は一過性に形質移入された真核生物細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物細胞中で外来遺伝子をキャップ非依存的に発現させるために、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）要素を使用することに関心が高まっている。キャップ非依存的翻訳を促進することを示された、公知のヌクレオチド配列数は急増しているが、これまでに公表された新規なＩＲＥＳの同定は、まれで偶発的であり、ＩＲＥＳ活性を予測する明瞭な方法論はない。
【０００３】
真核生物細胞中でのｍＲＮＡの翻訳開始は、多数の因子が協調的に相互作用し合う複雑なプロセスである（Ｐａｉｎ、（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２３６号７４７〜７７１頁）。大多数のｍＲＮＡでは、第一ステップは、ｍＲＮＡ上のキャップ付き５’末端又はその近くに、リボソームの４０Ｓサブユニットを呼び寄せる（ｒｅｃｒｕｉｔ）ことである（図１）。ｍＲＮＡへの４０Ｓの結合は、キャップ結合蛋白質複合体ｅＩＦ４Ｆによって大いに促進される。ｅＩＦ４Ｆ因子は、３個のサブユニットから構成される。ＲＮＡヘリカーゼｅＩＦ４Ａ、キャップ結合蛋白質ｅＩＦ４Ｅ、及びマルチアダプタ蛋白質ｅＩＦ４Ｇであり、このｅＩＦ４Ｇは、複合体中で蛋白質の足場の役割をし、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４ａ、ｅＩＦ３、及びポリ（Ａ）結合蛋白質に対する結合部位を有する。
【０００４】
様々なＲＮＡウイルスに細胞が感染すると、宿主の翻訳は選択的に阻害されるが、ウイルスｍＲＮＡの翻訳は阻害されない。例えば、細胞質性（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）ＲＮＡウイルスであるポリオウイルスに細胞が感染すると、いくつかの翻訳開始因子が改変される。具体的には、ウイルスがコードしている蛋白質分解酵素によって、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４ＧＩ、及びｅＩＦ４ＧＩＩにおける両方の形態が蛋白質分解されると（Ｇｒａｄｉら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５号１１０８９〜１１０９４頁）、大部分のキャップ付き細胞ｍＲＮＡの翻訳が阻害される。これに反して、ウイルスの５’非翻訳領域（５’ＮＣＲ）中に４５０ｎｔの配列を含むポリオウイルスｍＲＮＡの翻訳は阻害されない。この配列は、完全なｅＩＦ４Ｆが存在しない場合には、４０Ｓサブユニットを呼び寄せることができる。この配列要素は、「内部リボソームエントリー部位（ＩＮＴＥＲＮＡＬＲＩＢＯＳＯＭＥＥＮＴＲＹＳＩＴＥ）」又は「ＩＲＥＳ」と名付けられた（Ｊａｎｇら、１９８８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６２号２３６３〜２６４３頁）。このようなＩＲＥＳ要素は、ピコルナウイルス、フラビウィルス、ペスチウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、並びに昆虫ウイルスのＲＮＡ（表１）、及び動物細胞のＲＮＡ（表２）で見つかっている。ＩＲＥＳを含む動物ｍＲＮＡは、おそらく、キャップ付き５’末端又はＩＲＥＳ要素のどちらによっても、４０Ｓリボソームを呼び寄せることができ、ＩＲＥＳ要素は、キャップ依存的翻訳が低減した条件下（例えば、ウイルス感染中、細胞周期Ｇ２／Ｍ期、及びストレスやアポトーシスの条件下）、翻訳を可能にすると思われる（Ｊｏｈａｎｎｅｓら、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６号１３１１８〜１３１２３頁；Ｃｏｒｎｅｌｉｓら、（２０００）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ、５号５９７〜６０５頁；Ｐｙｒｏｎｎｅｔら、（２０００）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ、５号６０７〜６１６頁；Ｓｔｅｉｎら、１９９８年Ｍｏｌ．ａｎｄＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、１８号３１１２〜３１１９頁；Ｈｏｌｃｉｋら、２０００年Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９号４１７４〜４１７７頁；Ｓｔｏｎｅｌｅｙら、２０００年、Ｍｏｌ．ａｎｄＣｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、２０号１１６２〜１１６９頁）。動物細胞ｍＲＮＡは最高で３％が、キャップ結合複合体ｅＩＦ４Ｆの濃度が低いときに翻訳される（Ｊｏｈａｎｎｅｓら、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６号１３１１８〜１３１２３頁）。
【０００５】
過去数年、再構成リボソーム結合アッセイによって、様々なＩＲＥＳ要素が作用する機構が解明された（Ｐｅｓｔｏｖａら、１９９８年、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．、１２号６７〜８３頁）。これらの要素のあるものは、ｅＩＦ４Ｇ上のＲＮＡ結合表面に高親和性結合部位を与えることによって作用する。他のものは、ｅＩＦ３、及び／又は４０Ｓサブユニットに結合することによって作用する（図２を参照のこと）。最近、ＩＲＥＳＲＮＡ／１８ＳｒＲＮＡ間の直接の相互作用による重要な役割が判明した。ＧｔｘＩＲＥＳは、内部翻訳開始を媒介することが示されている１８ＳｒＲＮＡに対して相補性を有するいくつかの非重複セグメントを含んでいる（Ｈｕら、１９９９年Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６号１３３９〜１３４４頁）。こうしたセグメントの１つとして、１８ＳｒＲＮＡのヌクレオチド１１３２−１１２４に対して１００％相補的であり、ＧＣに富む９ｎｔの配列ＣＣＧＧＣＧＧＧＵが同定された。この９ｎｔのＩＲＥＳモジュールの複数のコピーを連結して構成される合成ＩＲＥＳが、動物細胞において内部翻訳の開始を劇的に増大させることが分かった（Ｃｈａｐｐｅｌら、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７号１５３６〜１５４１頁）。
【０００６】
ポティウイルス科、コモウイルス科のウイルスを含む、いくつかの植物ウイルスのポリシストロン性ゲノムＲＮＡの５’リーダーは、キャップ非依存性翻訳を司る役割を担う。トバモウイルス、及びポテクスウイルスＸのＩＲＥＳは、ウイルスゲノムの内部に位置する（表２）。タバコモザイクトバモウイルス（ＴＭＶ）は、分断されていない（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）６３９５ヌクレオチド（ｎｔ）長のゲノムを有するプラス鎖ＲＮＡ植物ウイルスである（Ｇｏｅｌｅｔら、１９８２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９号５８１８〜５８２２頁）。複製蛋白質をコードする５’近位ＯＲＦは、ゲノムＲＮＡから直接発現され、小さい方の蛋白質（１２６ｋＤａ）が１８３ｋＤａの蛋白質レベルのおよそ１０倍以上産生される。この１８３ｋＤａの蛋白質は、１２６ｋＤａのＯＲＦの終止コドンの偶発的な読み飛ばしによって産生される（Ｐｅｌｈａｍ、１９７８年、Ｎａｔｕｒｅ、２７２号４６９〜４７１頁）。大きい方の蛋白質のみで複製が起こることもあるが、両方の蛋白質が、効率のよい複製には欠かせない（Ｉｓｈｉｋａｗａら、１９８６年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１４号８２９１〜８３０５頁）。残りのＴＭＶ遺伝子産物である、移行蛋白質（ＭＰ）及びコート蛋白質（ＣＰ）は、３’共末端（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ）サブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）から発現される（Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ及びＺａｉｔｌｉｎの総説、１９８６年、「植物ウイルス（ＴｈｅＰｌａｎｔｖｉｒｕｓ）」、Ｍ．Ｈ．Ｖ．ｖａｎＲｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ、及びＭ．Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ編、第２巻、１０５〜１３１頁、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、ＮＹ）。したがって、内部移行蛋白質（ＭＰ）遺伝子、及び３’近位コート蛋白質遺伝子が、通常のトバモウイルスのゲノムＲＮＡから翻訳されることはない（ＴＭＶＵＩは、トバモウイルス属の基準ウイルス（ｔｙｐｅｍｅｍｂｅｒ）である）。ｓｇＲＮＡＩ₂ ＲＮＡと称する、ジシストロン性で中間長のＲＮＡ−２が、翻訳されて３０ｋＤａのＭＰを産生する（Ｂｒｕｅｎｉｎｇら、１９７６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１号４９８〜５１７頁；Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９７６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７１号４８６〜４９７頁；Ｂｅａｃｈｙ及びＺａｉｔｌｉｎ、１９７７年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８１号１６０〜１６９頁；Ｇｏｅｌｅｔ及びＫａｒｎ、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１５４号５４１〜５５０頁）。一方、Ｉ₂ ＲＮＡの３’近位コート蛋白質（ＣＰ）遺伝子は翻訳上サイレントである。この遺伝子は、小さなモノシストロン性ｓｇＲＮＡからしか発現されない（Ｓｉｅｇｅｌら、１９７６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３号３６３〜３７１頁；Ｂｅａｃｈｙ及びＺａｉｔｌｉｎ、１９７７年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８１号１６０〜１６９頁）。
【０００７】
通常のトバモウイルスのＲＮＡとは異なり、アブラナ科植物に感染するトバモウイルス（ｃｒＴＭＶ）では、ＣＰ遺伝子の翻訳が内部リボソームエントリー機構によってｉｎｖｉｔｒｏで生じることが分かっている（Ｉｖａｎｏｖら、１９９７年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３２号３２〜４３頁）。ｃｒＴＭＶ（６３１２ｎｔ）のゲノムは、レプリカーゼ（１２２ｋＤａの蛋白質、及び１２２ｋＤａの読み飛ばし産生物である１７８ｋＤａの蛋白質）の２成分、３０ｋＤａのＭＰ、及び１７ｋＤａのＣＰをコードする４個の通常の遺伝子を含む（Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９３年、Ｄｏｋｌ．ＲｕｓｓｉａｎＡｃａｄＳｃｉ．、３３２号５１８〜５２頁；Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４年、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３５０号５〜８）頁）。ｃｒＴＭＶＲＮＡのＣＰ遺伝子上流の１４８ｎｔ領域は、ＣＰ遺伝子、及び種々のレポーター遺伝子の内部翻訳開始を促進する、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ_CP148 ^CR）を含むことが判明している（Ｉｖａｎｏｖら、（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３２号３２〜４３頁）。ｃｒＴＭＶとの類似性から、ジャガイモウイルスＸの３’近位ＣＰ遺伝子も、内部翻訳開始機構によって生じる（Ｈｅｆｆｅｒｏｎら、１９９７年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、７８号３０５１〜３０５９頁；Ｈｅｆｆｅｒｏｎら、２０００年、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ、１４５号９４５〜９５６頁）。ｃｒＴＭＶＩＲＥＳ^CR _CPの内部翻訳媒介能の点で、このトバモウイルスは、同属の周知のウイルスＴＭＶＵ１と区別される。ＴＭＶＵ１ＲＮＡに由来する同等の１４８ｎｔ配列（ＵＩ_CP，₁₄₈ ^SP）は、内部翻訳を媒介することができなかった（Ｉｖａｎｏｖら、（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３２号３２〜４３頁）。
【０００８】
最近、ｃｒＴＭＶ及びＴＭＶＵ１のＲＮＡのＭＰ遺伝子の上流２２８ｎｔ及び７５ｎｔ領域が、ＩＲＥＳ要素のＩＲＥＳ_MP,75 ^CR、又はＩＲＥＳ_MP,228 ^CRを含むことが分かった。これらのＩＲＥＳ要素は、無細胞翻訳系、及び単離したプロトプラストにおいて、ジシストロン性構築体からの３’近位レポーター遺伝子の発現を指令する（Ｓｋｕｌａｃｈｅｖら、１９９９年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６３号１３９〜１５４頁）。さらに、シストロン間スペーサとして利用されているＴＭＶＵ１ＲＮＡ由来の同等の配列（ＩＲＥＳ_MP,75 ^U1）が、ジシストロン性転写物中の第２遺伝子の内部翻訳を媒介することができた。
【０００９】
線状多シストロン性ｍＲＮＡ中で外来遺伝子を、キャップ非依存的に発現するために、ＩＲＥＳ要素を使用した発明がいくつかある。これらの発明では、哺乳動物細胞中のＩＲＥＳ要素（ＵＳ６０６０２７３号、ＵＳ６１１４１４６号、ＵＳ５３５８８５６号、ＵＳ６０９６５０５号、ＵＳ１７１８２１号、ＵＳ５７６６９０３号）、植物細胞中のＩＲＥＳ要素（Ｗ０９８／５４３４２号）、及び一般に、真核生物細胞中のＩＲＥＳ要素（ＵＳ１７１８２１号、ＵＳ５７６６９０３号、ＵＳ５９２５５６５号、ＵＳ６１１４１４６号）を介して、外来遺伝子を発現する。キャップ非依存的にＩＲＥＳが媒介する遺伝子発現を得るために、環状ＲＮＡも開発された（ＵＳ５７６６９０３号）。真核生物ｍＲＮＡのキャップ非依存的翻訳は、主に、既知のＩＲＥＳとは異なるオオムギ黄萎病ウイルスＲＮＡの５’ＵＴＲを使用することによって達成できた（ＵＳ５９１０６２８号）。一般的に、すべての発明で、動物ウイルス（例えば、ＵＳ５３５８８５６号）又は植物ウイルス（Ｗ０９８／５４３４２号）から単離した、異界交差活性（ｃｒｏｓｓ−ｋｉｎｇｄｏｍａｃｔｉｖｉｔｙ）を持たない天然ＩＲＥＳを使用している。すなわち、これらの発明のＩＲＥＳは、植物又は動物細胞のどちらかに限定されている。動物及び植物細胞中で効率のよいキャップ非依存的遺伝子発現を提供できる、非天然の人工ＩＲＥＳを作製するための手法を開発した発明はない。さらに、異界交差活性を有する新規なＩＲＥＳ要素を探索する手法もない。
【００１０】
動物細胞ｍＲＮＡとは対照的に、植物細胞中でＩＲＥＳが媒介するｍＲＮＡの翻訳開始についての公表されている報告（表２を参照のこと）は、シロイヌナズナＲＰＳ１８Ｃ遺伝子の植物ＩＲＥＳ要素を記載した、最近の１件の特許（ＷＯ０１／５９１３８号）以外にはない。しかし、この特許出願で使用された方法、その実験的手法、及びその結果の解釈のいずれにおいても、ｉｎｖｉｖｏでのＩＲＥＳ活性を直接、かつ明白に結論付けることができないし、植物転写物中の前記要素を確実に検出することもできない。第一に、この試験はＩＲＥＳ活性に対する理解を伴わない試験であった。通常、ＩＲＥＳ活性の検出には、ジシストロン性ｍＲＮＡアッセイを使用する（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３４号３２０〜３２５頁）。この試験では、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏでの発現能力を分析するために、（第一シストロンの前のヘアピン構造を有する又はもたない）推定上のＩＲＥＳ要素によって隔てられたキャップ付きの２種類のビシストロン性ｍＲＮＡを分析する。ヘアピン構造のない構築体では、リボソームが読み取られ、最初の５’近位シストロンが翻訳されるが、ヘアピン構造を有する構築体では、最初のシストロンのキャップ依存的翻訳は阻止される。ＷＯ０１／５９１３８号の発明者達は、ヘアピン構造のない人工ビシストロン性転写物でのみ推定上のＩＲＥＳ要素ＲＰＳ１８Ｃを試験した。したがって、ＷＯ０１／５９１３８号で示された結果は、おそらく翻訳の再開の結果であろう（Ｋｏｚａｋ、２００１年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、２１号１８９９〜１９０７頁）。さらに、ｉｎｖｉｔｒｏでＩＲＥＳ活性を示すヌクレオチド配列は、しばしば、真核生物細胞中ではＩＲＥＳ活性を示さないことが知られている。ＷＯ０１／５９１３８号は、シロイヌナズナの推定上のＩＲＥＳ要素ＲＰＳ１８Ｃが、（植物又は動物）真核生物細胞中で機能することを直接、明白に示す実験的証拠を含んでいない。
【００１１】
動物細胞のｍＲＮＡと対照的に、植物細胞中ｉｎｖｉｖｏで細胞性ｍＲＮＡのＩＲＥＳが媒介する翻訳の開始について公表されている報告はない（表２）。植物中で動物ウイルスのＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、ＩＲＥＳ_emcv）の活性が低いことは報告されている（Ｕｒｗｉｎら、２０００年、ＰｌａｎｔＪ．、２４号５８３〜５８９頁）。これまで、どんなＩＲＥＳ要素による（植物、動物、酵母）異界交差活性の証拠も示されていない。キャップ非依存的翻訳を提供できると公表されたヌクレオチドの配列数は順調に増加しているが、新規なＩＲＥＳの同定は偶然にしか起きず、明瞭な予測方法は存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の一の目的は、新規な真核生物のＩＲＥＳ要素の同定方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、新規な真核生物のＩＲＥＳ要素、特に植物由来のＩＲＥＳ要素を提供することである。
【００１４】
他の目的は、異界交差活性を有する新規なＩＲＥＳ要素を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、新規なＩＲＥＳ要素、特に植物由来のＩＲＥＳ要素の翻訳制御下で、真核生物細胞中で目的とするヌクレオチド配列を発現させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の目的は、特許請求の範囲に記載の本発明によって解決される。
【００１７】
本発明は、真核生物細胞中でＲＮＡのキャップ非依存的翻訳において活性な真核生物ＩＲＥＳ要素を探索し同定する方法であって、
（ｉ）（ａ）長さが少なくとも３０ヌクレオチドで、
（ｂ）アデニンヌクレオチド含有量が少なくとも４０ｍｏｌ％で、
（ｃ）ピリミジンヌクレオチド含有量が４０ｍｏｌ％未満
である、ヌクレオチドブロックを有する潜在的ＩＲＥＳ要素を探して、真核生物のｍＲＮＡ配列、又は対応するＤＮＡ配列をスクリーニングするステップと、
（ｉｉ）前記潜在的ＩＲＥＳ要素を、線状ジシストロン性構築体の上流遺伝子と下流ＧＵＳレポーター遺伝子の間に挿入し、それによって、前記潜在的ＩＲＥＳ要素を前記下流ＧＵＳ遺伝子がＩＲＥＳ依存的に翻訳されるように位置させ、かつ安定したヘアピン構造の前記上流遺伝子を下流に位置させて、前記遺伝子のＩＲＥＳ非依存的翻訳を阻止するステップと、
（ｉｉｉ）前記潜在的ＩＲＥＳ要素を、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイで、ウサギ網状赤血球の溶解液、又はコムギ胚芽抽出液中において、前記ＧＵＳ遺伝子をＩＲＥＳ依存的に翻訳できるかについて、試験し、それによって、好ましくは前記上流遺伝子と前記ＧＵＳ遺伝子の間に基準ＩＲＥＳ要素、又は非ＩＲＥＳ要素を有する構築体を比較対象として、ＧＵＳ遺伝子の発現を定量するステップとを含む方法を提供する。
【００１８】
その結果、前記ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイの少なくとも１つにおいて、ＧＵＳの発現を引き起こすＩＲＥＳ要素を選択することができる。
【００１９】
驚くべきことに、本発明者らは、ＩＲＥＳ活性を示すヌクレオチド配列（ＩＲＥＳ要素）、すなわち、内部リボソームエントリー機構によって下流遺伝子たるコード配列のキャップ非依存的翻訳を提供できる配列、を同定するための判定基準を確認した。本発明者らは、アデニン含有量が高く、且つピリミジンヌクレオチド含有量が低い、少なくとも３０ヌクレオチドのブロック（ｂｌｏｃｋ）を有するヌクレオチド配列が、ＩＲＥＳ活性を示す傾向が強いことを見出した。上記の判定基準を利用して既知のヌクレオチド配列をスクリーニングすることにより、ＩＲＥＳ活性を有する傾向が強い１つ又は１組のヌクレオチド配列を同定することができる。本発明のスクリーニングは、全ての既知のヌクレオチド配列から事前にヌクレオチド配列を選択することからなる。その結果、事前に選択した１つのＩＲＥＳ要素、又は１組のこのような潜在的ＩＲＥＳ要素が実際にＩＲＥＳ活性（度）を有するか実験的に試験することができる。本発明によるスクリーニング、即ち事前選択により、ＩＲＥＳ活性について実験的に試験する配列数が桁外れに減少し、実験的確認を含む、新規なＩＲＥＳ要素の方向性を持った同定が初めて可能になる。
【００２０】
当該スクリーニングは、既知のどんなヌクレオチド配列であっても、将来解明されるであろうどんな配列であっても実施することができる。真核生物に由来するヌクレオチド配列、すなわち植物及び動物の配列をスクリーニングし、高等な植物又は高等な動物の配列をスクリーニングすることがより好ましい。ウイルスの配列のスクリーニングは、本発明の範囲には含まれない。
【００２１】
核ゲノム、並びに色素体やミトコンドリアのゲノムのようなオルガネラゲノムを含む全ゲノムの配列をスクリーニングすることができるが、真核生物の核ゲノムの配列をスクリーニングすることが好ましい。スクリーニングは、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列で実施することができる。二本鎖ＤＮＡを使用する場合、両方の鎖をスクリーニングすることができ、コード鎖をスクリーニングすることが特に好ましい。スクリーニングを、遺伝子の５’ＵＴＲ配列に限定することもできる。それは、ｍＲＮＡレベルで５’ＵＴＲ配列をスクリーニングすることに等しい。アデニン及びピリミジン含有量に関する本発明のスクリーニング判定基準は、メッセンジャーＲＮＡ、又はＤＮＡレベルの対応するコード鎖に関するものである。
【００２２】
最も単純な場合では、印刷した又は書いたヌクレオチド配列に沿ってスキャンすること又は、眼で読み取っていくことによって、スクリーニングを実施することができる。５’ＵＴＲ配列を重点的に取り扱うならば、この手法で首尾よく行うことができる。自動スクリーニング法、例えばコンピュータ及び適当なコンピュータプログラムを使用する方法を利用するとより好都合である。このように、ヌクレオチド配列の大データベース、特にゲノムのデータベースをスクリーニングして、多くのＩＲＥＳ要素を見つけられる可能性がある。
【００２３】
本明細書において、「アデニンに富む」、又は「高アデニン含有量」とは、少なくとも４０ｍｏｌ％であるアデニン含有量を意味する。「ピリミジンの少ない」、又は「低ピリミジン含有量」とは、チミン（ウラシル）＋シチジンが４０ｍｏｌ％未満である、チミン（ウラシル）＋シチジンの含有量を意味する。スクリーニング中に適用する判定基準については、アデニン含有量が少なくとも４０ｍｏｌ％、好ましくは少なくとも５０ｍｏｌ％、最も好ましくは少なくとも６０ｍｏｌ％である、少なくとも３０ヌクレオチドのブロックを探索する。ピリミジン含有量は、４０ｍｏｌ％未満、好ましくは３０ｍｏｌ％未満、最も好ましくは２０ｍｏｌ％未満である。
【００２４】
当該ヌクレオチドブロックの長さには厳格な上限はない。但し、当該ブロックは、実用上、スクリーニング中において５００ヌクレオチド未満のものを選択する。当該ブロックの長さは、少なくとも３０ヌクレオチドであり、３０〜２００ヌクレオチドのブロックを探索することが好ましく、４０〜１００ヌクレオチドのブロックを探索することがより好ましい。
【００２５】
本発明による当該ヌクレオチドのブロックは、そのブロックを含む配列にＩＲＥＳ活性を付与する傾向が強い。５’ＵＴＲ配列をスクリーニングすれば、２、３、又はより多数の本発明によるヌクレオチドブロックを見つけることができるであろう。
【００２６】
コンピュータを用いてスクリーニングを実施する場合には、スクリーニングを何度も行い、スクリーニング判定基準をその都度、変更することができる。最も高い可能性でＩＲＥＳ活性を有する配列を見つけるためには、厳格な判定基準、すなわち高アデニン含有量、低ピリミジン含有量で、かつ短いヌクレオチドブロックという判定基準からスクリーニングを始めることが好ましい。上記で示した判定基準内で、低めのアデニン含有量、高めのピリミジン含有量、又は長めのブロック、あるいはそれらを組み合わせた厳格でない判定基準を適用することによって、さらなるＩＲＥＳ要素を見つけることができる。このようにして、様々なＩＲＥＳ活性のＩＲＥＳ要素を見つけることができ、このことは、ＩＲＥＳ要素の翻訳制御下で目的とする遺伝子を発現させるとき、所望の発現レベルを実現するのに有用である。
【００２７】
図７及び図８は、それぞれヒト及び植物由来の本発明によるヌクレオチドブロックを含む、いくつかの５’ＵＴＲ配列を示す図である。これらの５’ＵＴＲ配列は、請求項１のステップ（ｉ）に記載の潜在的ＩＲＥＳ要素である。こうした潜在的ＩＲＥＳ要素の幾つかについて異界交差ＩＲＥＳ活性を実施例で示す。
【００２８】
次いで、請求項１のステップ（ｉ）で見つかった潜在的ＩＲＥＳ要素のＩＲＥＳ活性を実験的に確認する。このため、ｍＲＮＡレベル上に安定したヘアピン（Ｈ）を形成する構造体、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子（ＧＦＰコード配列）、潜在的ＩＲＥＳ要素を挿入するための制限部位を有するシストロン間スペーサ、及びＧＵＳ遺伝子（ＧＵＳコード配列）を、この順序で有するビシストロン性ＤＮＡ構築体「Ｈ−ＧＦＰ−ＧＵＳ」を含む、試験系を考案した。潜在的ＩＲＥＳ要素をＧＵＳとＧＦＰの間のスペーサに挿入する。次いで、この構築体をｉｎｖｉｔｒｏで、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用し転写してｍＲＮＡを得る。続いて、ウサギ網状赤血球の溶解液（ＲＲＬ）、又はコムギ胚芽抽出液（ＷＧＥ）のｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系を使用して、得られたｍＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏで翻訳する。どちらのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系も、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社やＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から市販されており、メーカーの説明書に従って使用することができる。翻訳後、例えば、その酵素活性や比色検出によって、オートラジオグラフィ、又はウェスタンブロッティングを用いてＧＵＳ発現を定量することができる。
【００２９】
ＧＵＳ遺伝子発現は、前記上流遺伝子と前記ＧＵＳ遺伝子との間に基準ＩＲＥＳ要素又は非ＩＲＥＳ要素を含む構築体を比較対象として定量することが好ましい。強力なＩＲＥＳ活性を有する基準ＩＲＥＳ要素として、ヌクレオチドブロック（ＧＡＡＡ）₁₆（実施例を参照のこと）、又は他の既知のＩＲＥＳ要素を使用することができる。非ＩＲＥＳ要素としては、例えば、図４で記述する前記合成スペーサ（実施例を参照のこと）、又は任意のヌクレオチドブロックを使用することができる。
【００３０】
前記ビシストロン性ＤＮＡ構築体中の前記ヘアピン構造は、キャップ依存的翻訳を阻止する。したがって、ＧＵＳ発現は全て、前記構築体の前記シストロン間スペーサ中に挿入した潜在的ＩＲＥＳ要素の翻訳活性によるものとすることができる。前記ヘアピンは、キャップ依存的翻訳を効率よく阻止するのに十分なほど安定していなければならない。その安定性は、３０ｋｃａｌ／ｍｏｌより高いことが好ましい（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３号２８５０〜２８５０頁を参照のこと）。前記ヘアピンの安定性が不十分なことは、前記ＧＦＰ遺伝子の発現によって認識することができる。ＧＦＰの翻訳は、例えば、その蛍光によって、ウェスタンブロッティング又はオートラジオグラフィで検出することができる。
【００３１】
本発明で使用されるＨ−ＧＦＰ−ＧＵＳ構築体は、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌＳＫ＋、ＧＵＳヌクレオチド配列、及びＧＦＰ配列から作製した。ヘアピン構造の配列は、ｇｇｔａｃｃｇｇｇｃｃｃｃｃｃｃｔｃｇａｇｇｔｃｇａｃｇｇｔａｔｃｇａｔａｃｃｇｔｃｇａｃｃｔｃｇａｇｇｇｇｇｇｇｃｃｃｇｇｔａｃｃである。同等の構造は、当業者によって容易に作製することができる。
【００３２】
こうしたｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系に関連する総ての点は、従来技術でよく研究され公知である。以下の文書、及びそこに引用した参照文献に詳細に記載されている。Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃ．ら（１９８５）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、１０１号６３５頁；Ｋｒｉｅｇ、Ｐ．及びＭｅｌｔｏｎ、Ｄ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ、１２号７０５７頁；Ｋｉｎｇ、Ｒ．Ｗ．ら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７号９７３頁；ＤｉＤｏｎａｔｏ、Ｊ．Ａ．及びＫａｒｉｎ、Ｍ．（１９９３）ＰｒｏｍｅｇａＮｏｔｅｓ、４２号１８頁；Ｐｅｌｈａｍ、Ｈ．Ｒ．Ｂ．及びＪａｃｋｓｏｎ、Ｒ．Ｊ．（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、６７号２４７頁；Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｒ．Ｊ．及びＨｕｎｔ、Ｔ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、９６号５０頁；以下Ｐｒｏｍｅｇａ社より、ＴｅｃｈｎｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎｓ、１２６号及び１６５号、又はＴｅｃｈｎｉｃａｌＭａｎｕａｌ、２３２号。
【００３３】
このようなＷＧＥ又はＲＲＬ翻訳アッセイで、ＧＵＳ遺伝子発現をもたらす潜在的ＩＲＥＳ要素は、本発明によるＩＲＥＳ要素である。本発明に従って同定した又は同定可能なＩＲＥＳ要素は、通常、異界交差活性を示す。すなわち植物及び動物中で、当該ＩＲＥＳの翻訳制御下、目的とする遺伝子を発現させるために、それらの要素を使用することができる。当該異界交差活性にもかかわらず、植物系又は動物系で目的とする遺伝子の発現を比較した場合、通常、当該ＩＲＥＳ要素の活性は同じではない。上述の２種のｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系の間で発現レベルに差がある。ｉｎｖｉｖｏ系では、一般に、これらの差はより大きい。それにもかかわらず、本発明で同定したＩＲＥＳ要素は、両方のｉｎｖｉｔｒｏ系で、植物細胞及び動物細胞で驚くほど高いＩＲＥＳ活性を示す。
【００３４】
ＩＲＥＳ活性は、上記のｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイだけでなく、植物細胞又は動物細胞中で、あるいはｉｎｖｉｖｏでも検出できることも述べなくてはならない。ビシストロン性Ｈ−ＧＦＰ−ＧＵＳベクター中でシストロン間スペーサとして使用される一連の合成配列を作製し、ＲＲＬ、タバコプロトプラスト、及びＨｅＬａ細胞で試験した。さらに、本研究者らは、１９ｎｔの順方向反復配列（ｄｉｒｅｃｔｒｅｐｅａｔ）の４個の連鎖コピー（Ｅｃｐｘ４）と、ＧＡＡＡ配列（ＧＡＡＡ）₁₆の１６個のコピーとを示す２つの合成配列を作製した。これらは共に、ＩＲＥＳ要素として機能することが判明した。アデニンに富むヌクレオチド配列の重要な役割が、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏでの、植物及び動物翻訳系で証明された。
【００３５】
本発明の原理の使用により、普遍的で、異なる界の生物において効率のよい翻訳開始モチーフとなる、多数の植物真核生物のＩＲＥＳ要素が明らかになった。本発明者らの知る限りでは、本発明者らは、植物体のゲノム中で最初のＩＲＥＳ要素を同定した。
【００３６】
さらに、本発明は、真核生物ＩＲＥＳ要素を探索し同定する上記の方法に従って、同定した又は同定可能な上流のＩＲＥＳ要素に動作可能に結合している目的のヌクレオチド配列を含むベクターを、真核生物細胞に導入することによって、当該真核生物細胞中で目的とするヌクレオチド配列を発現させ、当該目的とするヌクレオチド配列を、前記ＩＲＥＳ要素によってキャップ非依存的に翻訳する方法を提供する。
【００３７】
当該目的とするヌクレオチド配列を、植物、又は植物細胞中で発現させることができる。また、動物、又は動物細胞中で発現させることもできる。動物の中では、哺乳動物細胞、又はヒトを含む（例えば、遺伝子治療のため）哺乳動物が好ましい。さらに、当該目的とするヌクレオチド配列を真菌、好ましくは酵母細胞中で発現させることもできる。
【００３８】
前記ベクターに含まれるＩＲＥＳ要素は、真核生物由来であり、植物由来、又は哺乳動物由来であることが好ましい。前記ＩＲＥＳ要素が、図７又は図８の配列のうちの１つによる配列、又はその配列のＩＲＥＳ機能性部分を含むことがより好ましい。好ましくは、前記ＩＲＥＳ要素が、熱ショック因子１、ポリ（Ａ）結合蛋白質、及び４８ＫＭＡＰキナーゼの植物遺伝子のいずれか１つの５’ＵＴＲに由来することがなお一層好ましい。これらの遺伝子がタバコ由来であることが最も好ましい。
【００３９】
本発明の前記発現方法は、図１１に示す配列の１つをＩＲＥＳ要素として使用することを含まない。
【００４０】
前記の目的とするヌクレオチド配列は、モノシストロン性ｍＲＮＡから発現させることができる。しかし、ＩＲＥＳ技術の高い潜在能力は、ビシストロン性又はポリシストロン性発現にあり、これによって蛋白質複合体のサブユニットの発現、又は生化学的カスケード又は経路全体の設計が可能となる。
【００４１】
前記ベクターを用いて前記真核生物細胞又は真核生物を安定的に形質転換したり、一過性に形質移入することができる。動物細胞又は植物細胞を形質転換又は形質移入する方法は、当技術分野ではよく知られている。ＤＮＡ又はＲＮＡベクターを植物細胞中に送り込むために、微粒子銃、電気穿孔法、又はプロトプラストのＰＥＧ媒介処置法によって前記ベクターを植物細胞中に直接導入する方法を含めて、様々な方法を使用することができる（概説は以下を参照のこと。Ｇｅｌｖｉｎ、Ｓ．Ｂ．、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９号２２７〜２３２頁；Ｈａｎｓｅｎ及びＷｒｉｇｈｔ、１９９９年、ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔＳＣＩ．、４号２２６〜２３１頁）。植物ＲＮＡ及びＤＮＡウイルスも、効率のよい送達系である（Ｈａｙｅｓら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３４号１７９〜１８２頁；Ｐａｌｍｅｒら、１９９９年、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１４４号１３４５〜１３６０頁；Ｌｉｎｄｂｏら、２００１年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、４号１８１〜１８５頁）。前記ベクターによって、植物のゲノム／色素体ゲノム中に組換え遺伝子を送り込んで安定的に組み込む（直接又はアグロバクテリウム媒介ＤＮＡ組込み法）ことも、又はその組換え遺伝子を一過的に発現させる（「アグロ浸潤法（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ」）こともできる。同様に、動物細胞を電気穿孔し、ウイルスベクターに感染させ、又はリポフェクチンを使用して形質移入することもできる。
【００４２】
本発明の発現方法のためのベクターの構築は、分子生物学の標準手順に従って行うことができる。特定の実施形態を図、及び実施例の項で説明する。
【００４３】
本発明は、本発明の方法によって同定した又は同定可能なＩＲＥＳ要素を含む。具体的には、本発明は、図７又は図８の配列のうちの１つの配列、又はその配列のＩＲＥＳ機能性部分を含むＩＲＥＳ要素を含む。
【００４４】
本発明は、初めて植物由来のＩＲＥＳ要素を開示する。したがって、このようなＩＲＥＳ要素は本発明に含まれる、このようなＩＲＥＳ要素を含むベクターも同様である。シロイヌナズナＲＰＳ１８遺伝子ファミリのリーダー、特にＲＰＳ１８Ｃ遺伝子のリーダー、あるいはそれに相同な又はオーソロガスな遺伝子のリーダーに含まれるＩＲＥＳは、本発明のＩＲＥＳ要素から除外することが好ましい。
【００４５】
さらに本発明は、本発明によるＩＲＥＳ要素を含むベクターで形質転換又は形質移入した、遺伝子組換え又は一過性に形質移入した真核生物細胞を含む。
【００４６】
さらに、新規なＩＲＥＳＲＮＡ配列を含むＲＮＡベクター、及び新規なＩＲＥＳＤＮＡ配列のＤＮＡコピーを含むＤＮＡベクターも記載する。
【００４７】
本発明は、当業者がＩＲＥＳ活性を有する未知の天然翻訳要素を予め同定できるようにするので有用である。これにより、今までに報告されているＩＲＥＳ要素より活性の高いＩＲＥＳ要素を同定できるようになる。さらに、これにより、普遍的で、分類学上の異なる界にわたって活性なＩＲＥＳ要素が同定できるようになる。
【００４８】
本発明の極めて重要な長所は、一過性に又は安定的に形質転換した植物細胞（遺伝子組換え植物）中で、多シストロン性カセット中の２個より多くの遺伝子を発現させることができることである。
【００４９】
本発明の別の長所は、一過性に、及び安定的に形質転換したヒト及び哺乳動物細胞（遺伝子組換え動物）中で、多シストロン性カセット中の２個より多くの遺伝子を発現させることができることである。
【００５０】
本発明の別の長所は、酵母細胞中で、多シストロン性カセット中の２個より多くの遺伝子を発現させることができることである。
【００５１】
本発明によって提供されるもう１つの長所は、本発明の新規なＩＲＥＳを用いて、哺乳類、特にヒトにおいて、外来遺伝子を発現させるためのウイルスベクターを構築できることである。
【実施例】
【００５２】
以下において、特定の実施例を使用して本発明をさらに説明する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．２^nd（分子クローニング：実験室マニュアル第２版）」ニューヨーク州コールドスプリングハーバー編））による標準の分子生物学的技術を実施した。本発明で使用するプラスミドは全て、容易に入手できる材料を使用し、過度の実験をすることなく当技術分野の通常の技術者により、本明細書の指示に従って調製することができる。
【００５３】
これらの実施例の目的は、真核生物ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ配列中の、かつて同定されていない天然ＩＲＥＳを明らかにし、作製するための手法を実証することである。
【００５４】
（実施例１）
ＮｔＨＳＦｍＲＮＡの５’ＵＴＲから単離した新規なＩＲＥＳ配列の同定
クローニング戦略
ＮｔＨＳＦ−１の５’ＵＴＲをスクリーニングにより選択した。この５’ＵＴＲは、アデニンに富むヌクレオチドブロックを含んでいる。これを図３で概略を述べた通りにクローニングして、転写ベクターｐＨ−ＧＦＰ−ＮｔＨＳＦ−ＧＵＳを産生した。
【００５５】
ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイ
ＷＧＥ及びＲＲＬ翻訳アッセイを、それぞれカタログ番号Ｌ４１４０及びＬ４６１０の１対の転写／翻訳系を使用し、それぞれＰｒｏｍｅｇａ社「技術誌（ＴｅｃｈｎｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ）」１６５号、及び１２６号に記載の通りに実施した。あるいは、Ｐｒｏｍｅｇａ社製の従来のＲＲＬ系、カタログ番号Ｌ４９６０（「技術マニュアル（ＴｅｃｈｎｉｃａｌＭａｎｕａｌ）」２３２号）を使用した。Ｔ７プロモータ／ＲＮＡポリメラーゼ系を使用して、潜在的ＩＲＥＳ要素がＧＦＰとＧＵＳの間に挿入されている線状Ｈ−ＧＦＰ−ＧＵＳベクターを転写した。ＲＮＡ転写物をＬｉＣｌで沈殿させ、水に溶解し、エタノールで再沈殿させた。ＲＮＡの濃度を分光光度法によって測定し、５μｇの各転写物を取って２５μｌのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳試料とし、オートラジオグラフィによってＧＦＰ及びＧＵＳの発現を検出した。
【００５６】
植物プロトプラスト由来一過性アッセイ系
プロトプラストの調製、及び形質移入を以下の手順で行った。
（ｉ）（Ｓａａｌｂａｃｈら、１９９６年、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，１１２号９７５〜９８５頁）に記載の通りにタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）（ｃｖ．Ｗ３８）の葉からプロトプラストを単離した。４×１０⁵のプロトプラストのアリコットを、３０μｇのｐＦＦ１９ベースのジシストロン性ＤＮＡ構築体「ＧＦＰ−スペーサ−ＧＵＳ」で形質移入し、暗所で２５℃で３６時間培養した。ＧＵＳ活性を相対的光ユニット（ＲＬＵ）として測定した。ＭＵＧを使用し、（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，１９８７年、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ、５号３８７〜４０５頁）に従ってＧＵＳ活性を定量した。各実験ではバックグラウンドとして、非形質移入プロトプラストに関連するＧＵＳ活性を差し引いた。Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（１９７６年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２号２４８〜２５４頁）に基づくＢｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイキットを使用して、蛋白質濃度を見積もった。モノクロナールマウス抗体（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社製第１８１４４６０号）を使用し、メーカーのマニュアルに従い、ウエスタンブロット分析によってＧＦＰ発現を検出した。ウエスタンブロットバンド中のＧＦＰの量をＢｉｏ−Ｒａｄ社製ソフトウェアＱｕａｌｉｔｙ−Ｏｎｅを使用して計算した。
【００５７】
ワクシニアウイルス、及びＧＵＳをコードし、Ｔ７プロモータを含むプラスミドを使用する、Ｈｅｌａ細胞の形質移入
１０％熱不活化ウシ胎仔血清、並びに１００単位／ｍｌのストレプトマイシン及びペニシリンを補充したダルベッコ改変最小基本培地を入れた３．５ｃｍシャーレで、ＨｅＬａ細胞の単層を増殖させた。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現している、改変ワクシニアウイルスアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）のウイルスストックを通常の方法に従って作製した。８０〜９０％コンフルエントなＨｅＬａ細胞のシャーレを３０〜４０プラーク形成単位／細胞（ｐｆｕ／ｃｅｌｌ）のウイルスで感染させた。４５分間の吸収の後、細胞を洗浄し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）プラスミドＤＮＡ、及びリポフェクチン（ｌｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して形質移入した。ＤＮＡ２μｇを含むリポフェクチン５μｌの形質移入混合物を３．５ｃｍプレート用に使用した。各構築体ごとに、各実験で６枚のプレートを使用した。細胞を３７℃で６時間培養した。培養後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで二度洗浄し、２５０μｌの溶解緩衝液（１００ｍＭＫＨＰＯ₃、ｐＨ７．８、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５ｍＭＤＴＴ）を入れたプレート中で１０分間直接溶解した。溶解液を採取し、２０００ｇで１０分間遠心分離機にかけて上清を分離し、−７０℃で保存した。ＧＵＳＬｉｇｈｔ^TM反応試薬系（Ｔｒｏｐｉｘ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用し、メーカーのプロトコルに従って２０μｌの溶解液でＧＵＳ活性を検出した。
【００５８】
（結果）
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）熱ショック因子１（ＮｔＨＳＦ−１、ＥＭＢＬヌクレオチドデータベース受託番号ＡＢ０１４４８３）の４５３ｎｔの５’リーダーをタバコｃＤＮＡバンクから単離し、ビシストロン性構築体Ｈ−ＧＦＰ−ＧＵＳ中のシストロン間スペーサとして使用した。この構築体を、ＷＧＥ及びＲＲＬのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系（図４）、タバコプロトプラスト（図５）、及びＨｅＬａ細胞（図７）で試験した。ＮｔＨＳＦ−１の５’リーダーを含む、ＷＧＥビシストロン性構築体Ｈ−ＧＦＰ−ＧＵＳでの翻訳の結果を、対照とした３６ｎｔの人工配列ＧＣＧＵＧＧＧＣＧＧＣＧＵＧＧＧＣＧＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＵＵＵＧＡＣＣ、並びに正の対照とした（ＧＡＡＡ）₁₆、及びＲＥＳ_CP _、 ₁₄₈ ^CRを含む構築体と比較して図４に示す。５’近位遺伝子（ＧＦＰ）の発現は安定したヘアピン構造によって阻止されたが、ＮｔＨＳＦ−１リーダーは、ＷＧＥにおいてＧＵＳ遺伝子を効率よく発現できることが分かった。同様の結果は、ＲＲＬ系によっても得られた（データは示さず）。ｉｎｖｉｔｒｏで得られた結果を確認するために、本発明者らは、植物のタバコプロトプラスト、及びヒトＨｅＬａ細胞におけるＩＲＥＳ活性についてＮｔＨＳＦ−１リーダーを試験した。図５及び図６に示す結果は、ＮｔＨＳＦ−１リーダーは、両方のタイプの真核生物細胞中でＩＲＥＳ_CP _， ₁₄₈ ^CRに匹敵するＩＲＥＳ活性を有することをそれぞれ示している。したがって、ＮｔＨＳＦ−１リーダーは、ＩＲＥＳ_CP _， ₁₄₈ ^CRと同様に、異界交差活性を有し、ＩＲＥＳ配列（ＩＲＥＳ^NtHSF-1）と見なすことができるとの結論付けられた。
【００５９】
これらの結果は、本発明の探索判定基準の適用によって真核生物ｍＲＮＡの５’リーダー中のＩＲＥＳ要素を同定できることを実証する。
【００６０】
（実施例２）
タバコポリ（Ａ）結合蛋白質ｍＲＮＡの５’ＵＴＲから単離された新規なＩＲＥＳ配列の同定
本発明の判定基準に従ってヒト及び植物ｍＲＮＡの５’ＵＴＲを分析し、ＩＲＥＳ活性を有する可能性が高い他の配列が明らかになった（図７及び図８）。本発明者らは、新規なＩＲＥＳ配列を予測し同定する本方法の効率性を確認するために、５’ＵＴＲの配列のこのリストからタバコポリ（Ａ）結合蛋白質（ＰＡＢＰ）を選択した。
【００６１】
クローニング戦略
ＰＡＢＰのＩＲＥＳを単離するための手法を図９に説明する。
得られたＤＮＡ構築体をＮｏｔｌ酵素で直線化し、Ｔ７ポリメラーゼで転写した。ＲＮＡ転写物をＬｉＣｌで沈殿させ、水に溶解し、エタノールで再沈殿させた。ＲＮＡの濃度を分光光度法によって測定し、５μｇの各転写物を取って２５μｌのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳試料（ＲＲＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）とした。
【００６２】
表３に示す結果からＰＡＢＰの５’ＵＴＲは、ＲＲＬ系で効率のよいＧＵＳ遺伝子発現を指令できることが分かった。加えて、ＰＡＢＰの５’ＵＴＲは、ＨｅＬａ細胞においても同様にＧＵＳ遺伝子発現をもたらした（表４）。
【００６３】
（実施例３）
タバコ４８ＫＭＡＰキナーゼ５’ＵＴＲのｍＲＮＡから単離された新規なＩＲＥＳ配列の同定
この実施例の目的は、新規な植物ＩＲＥＳを探索するための本手法の有効性を確認することである。本発明者らは、新規なＩＲＥＳ配列を予測し同定する本方法の有効性を確認するために、推定ＩＲＥＳのリスト（図８）からタバコ４８ＫＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）の５’ＵＴＲを選択した。
【００６４】
クローニング戦略
４８Ｋ−ＭＡＰＫのＩＲＥＳを単離するための手法を図１０に説明する。
得られたＤＮＡ構築体を、Ｎｏｔｌ酵素を用いて直線化し、Ｔ７ポリメラーゼを用いて転写した。ＲＮＡ転写物をＬｉＣｌで沈殿させ、水に溶解し、エタノールで再沈殿させた。ＲＮＡの濃度を分光光度法によって測定し、５μｇの各転写物を取って２５−μｌのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳試料（ＲＲＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）とした。
【００６５】
表５に示す結果から４８Ｋ−ＭＡＰＫの５’ＵＴＲは、ＲＲＬ中で効率よくＧＵＳ遺伝子の発現を指令できることが分かる。
【００６６】
【表１】

【００６７】
【表２】

【００６８】
【表３】

【００６９】
【表４】

【００７０】
【表５】

【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】標準的な真核生物キャップ依存的翻訳開始の簡略化したモデルを示す図である。ｅＩＦ４Ｅ−ｅＩＦ４Ｇ相互作用は、リボソームの小サブユニットをｍＲＮＡの５’末端に向かわせる。ｅＩＦ４Ｇはまた、Ｐａｂ１ｐ、ｅＩＦ３、及びＲＮＡヘリカーゼｅＩＦ４Ａと相互作用して、開始プロセスを媒介する。ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム、ＰＡＢＰ：ポリ（Ａ）結合蛋白質
【図２】Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳが媒介する翻訳開始中に、リボソームをｍＲＮＡに呼び寄せる機構の簡単なモデルを示す図である。ＩＲＥＳ要素は、リボソームをｍＲＮＡに呼び寄せる代替手段を提供することによって、ｅＩＦ４Ｅ−ｅＩＦ４Ｇ相互作用の必要性をなくする。矢印は、ＩＲＥＳ要素と４０Ｓ開始複合体との間の様々な直接的相互作用を示す。
【図３】ＮｔＨＳＦ−１ｍＲＮＡの５’リーダーのヌクレオチド配列（ＥＭＢＬ受託番号：ＡＢ０１４４８３）（Ａ）、及びクローニングステップ（Ｂ）を示す図である。開始コドンＡＵＧをイタリック体で強調して表示してある。
【図４】シストロン間スペーサとして（ｉ）３６ｎｔの人工配列（スペーサ）ＧＣＧＵＧＧＧＣＧＧＣＧＵＧＧＧＣＧＵＵＵＧＵＵＣＵＵＵＧＵＵＵＧＡＣＣ、（ｉｉ）４５３ｎｔのＮｔＨＳＦ−１ｍＲＮＡの５’リーダー、（ｉｉｉ）（ＧＡＡＡ）₁₆及びＩＲＥＳ_ｃｐ， ₁₄₈ ^CR、を含むＨ−ＧＦＰ−ＧＵＳによってＷＧＥにおいて翻訳された蛋白質のオートラジオグラフを示す図である。矢印は、ＧＵＳの位置、及びＧＦＰの予想位置を示す。
【図５】棒グラフの下に示すヌクレオチド配列を含む、３５Ｓをベースとするヘアピン構造のないビシストロン性ＧＦＰ−ＧＵＳ構築体で形質移入したタバコプロトプラスト中でのＧＵＳ遺伝子の発現を示す図である。各遺伝子組換え植物のＧＵＳ活性値を、ウエスタンブロット法で得たＧＦＰバンドのデンシトメトリによって決定した同じプロトプラスト試料中のＧＦＰ含有量に対して正規化した。平均値を計算するために少なくとも３回の独立した実験を行い、標準誤差を縦棒で表す。
【図６】ビシストロン性Ｔ７をベースとする構築体Ｈ−ＧＦＰ−ＧＵＳを用いて形質移入したＨｅＬａ細胞中のＧＵＳ遺伝子の発現を示す図である。ＧＵＳ値を試料の蛋白質含有量にに対して正規化した。平均値を計算するために少なくとも３回の独立した実験を行い、標準誤差を縦棒で表す。
【図７−１】推定上のヒトＩＲＥＳとしてのヒト５’ＵＴＲヌクレオチド配列を示す図である。
【図７−２】推定上のヒトＩＲＥＳとしてのヒト５’ＵＴＲヌクレオチド配列を示す図である。
【図８−１】推定上の植物ＩＲＥＳとしての植物５’ＵＴＲヌクレオチド配列を示す図である。
【図８−２】推定上の植物ＩＲＥＳとしての植物５’ＵＴＲヌクレオチド配列を示す図である。
【図９】タバコポリアデニン結合蛋白質ＰＡＢＰのｍＲＮＡの５’ＵＴＲから新規な植物ＩＲＥＳを同定し単離する実験ステップを示す図である。
【図１０】タバコ４８ＫＭＡＰキナーゼの５’ＵＴＲから新規な植物ＩＲＥＳを同定し単離する実験ステップを示す図である。
【図１１−１】既知の動物及びウイルスＩＲＥＳ要素のヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１−２】既知の動物及びウイルスＩＲＥＳ要素のヌクレオチド配列を示す図である。

Claims

真核生物細胞中のＲＮＡのキャップ非依存的翻訳において活性な真核生物ＩＲＥＳ要素を探索し、かつ同定する方法であって、
（ｉ）（ａ）長さが少なくとも３０ヌクレオチドで、
（ｂ）アデニンヌクレオチド含有量が少なくとも４０ｍｏｌ％で、
（ｃ）ピリミジンヌクレオチド含有量が４０ｍｏｌ％未満
である、ヌクレオチドブロックを有する潜在的ＩＲＥＳ要素を探して、真核生物のｍＲＮＡ配列又は対応するＤＮＡ配列をスクリーニングするステップと、
（ｉｉ）前記潜在的ＩＲＥＳ要素を、線状ジシストロン性構築体の上流遺伝子と下流ＧＵＳレポーター遺伝子の間に挿入し、それによって、前記潜在的ＩＲＥＳ要素を、前記下流ＧＵＳ遺伝子がＩＲＥＳ依存的に翻訳されるように位置させ、かつ、前記上流遺伝子を、安定したヘアピン構造の下流に位置させて、前記遺伝子のＩＲＥＳ非依存的翻訳を阻止するステップと、
（ｉｉｉ）前記潜在的ＩＲＥＳ要素を、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイで、ウサギ網状赤血球の溶解液、又はコムギ胚芽抽出液中において、前記ＧＵＳ遺伝子をＩＲＥＳ依存的に翻訳できるかについて試験し、それによって、好ましくは前記上流遺伝子と前記ＧＵＳ遺伝子の間に基準ＩＲＥＳ要素、又は非ＩＲＥＳ要素を含む構築体を比較対象として、ＧＵＳ遺伝子発現を定量するステップとを含む方法。
前記ヌクレオチドブロックのアデニンヌクレオチド含有量が、少なくとも５０ｍｏｌ％である、請求項１に記載の方法。
前記ヌクレオチドブロックのアデニンヌクレオチド含有量が、少なくとも６０ｍｏｌ％である、請求項１に記載の方法。
前記ヌクレオチドブロックのピリミジンヌクレオチド含有量が、３０ｍｏｌ％未満である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
前記ヌクレオチドブロックのピリミジンヌクレオチド含有量が、２０ｍｏｌ％未満である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
前記ヌクレオチドブロックの長さが、少なくとも４０ヌクレオチドである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
前記ヌクレオチドブロックの長さが、３０から２００ヌクレオチドである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
前記ヌクレオチドブロックの長さが、４０から１００ヌクレオチドである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｉ）でゲノム配列をスクリーニングする、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
オープンリーディングフレームの５’非翻訳領域をスクリーニングする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｉ）を実施するためにコンピュータプログラムを利用する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法のステップ（ｉ）を実施するためのコンピュータプログラム。
請求項１から１１のいずれか一項に記載の、同定した又は同定可能な、上流のＩＲＥＳ要素に動作可能に結合している前記の目的とするヌクレオチド配列を含むベクターを、真核生物細胞中に導入することによって、前記細胞中で目的とするヌクレオチド配列を発現させ、それによって、前記の目的とするヌクレオチド配列を、前記ＩＲＥＳ要素によってキャップ非依存的に翻訳する方法。
前記の目的とするヌクレオチド配列が、ビシストロン性又はポリシストロン性ｍＲＮＡから発現させる、請求項１３に記載の方法。
前記ＩＲＥＳ要素が植物由来である、請求項１３又は１４に記載の方法。
前記ＩＲＥＳ要素が哺乳動物由来である、請求項１３又は１４に記載の方法。
前記ＩＲＥＳ要素が図７又は図８の配列の１個に記載される配列、又はその配列のＩＲＥＳ機能性部分を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
前記ＩＲＥＳ要素が、植物遺伝子である熱ショック因子１、ポリ（Ａ）結合蛋白質、及び４８ＫＭＡＰキナーゼのいずれか１つの５’ＵＴＲに由来する、請求項１３又は１４に記載の方法。
前記遺伝子が、タバコ遺伝子、あるいはそれに相同な、又はオーソロガスな遺伝子である、請求項１８に記載の方法。
前記真核生物細胞が植物細胞である、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の方法。
前記真核生物細胞が動物細胞である、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の方法。
前記真核生物細胞が酵母細胞である、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の方法。
請求項１から１１のいずれか一項の方法によって同定した、又は同定可能なＩＲＥＳ要素。
図７又は図８の配列のうち１つの配列、又はその配列のＩＲＥＳ機能性部分を含むＩＲＥＳ要素。
植物由来のＩＲＥＳ要素。
請求項２３又は２５の一項に記載のＩＲＥＳ要素を含むベクター。
請求項１３から１９までのいずれか一項で定義したベクター、又は請求項２６に記載のベクターで形質転換又は形質移入した、遺伝子組換え又は一過性に形質移入された真核生物細胞。