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000GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Methode zur Suche und Identifizierung
neuer eukaryotischer IRES-Elemente, die in pflanzlichen, Säuger- und
Hefezellen aktiv sind, und ein Verfahren zur Cap-unabhängigen Expression
einer gewünschten
Nucleotid-Sequenz in eukaryotischen Zellen unter Verwendung eines
gemäß der obigen
Methode identifizierten oder identifizierbaren IRES-Elements. Die
Erfindung betrifft ferner gemäß der obigen
Methode identifizierte oder identifizierbare IRES-Elemente und transgene
oder transient transfizierte eukaryotische Zellen, die mit einem
ein solches IRES-Element enthaltenden Vektor transformiert sind.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Es
besteht ein wachsendes Interesse an der Verwendung Interner Ribosomeneingangsstellen (IRES)-Elemente
zur Expression fremder Gene in eukaryotischen Zellen. Obwohl die
Anzahl von Nukleotidsequenzen, die eine Cap-unabhängige Translation bewirken
können,
ständig
steigt, findet die Identifizierung neuer IRESs nur gelegentlich
oder zufällig
statt ohne gezielte Strategie zur Vorhersage von IRES-Elementen.
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Die
Translationsinitiation von mRNA in eukaryotischen Zellen ist ein
komplexer Prozess, der die konzertierte Interaktion zahlreicher
Faktoren beinhaltet (Pain, V.M., 1996, Eur. J. Biochem. 236, 747–771). Für die meisten
mRNAs besteht der erste Schritt in der Rekrutierung ribosomaler
40S Untereinheiten zur RNA an oder in der Nähe ihres 5'Endes (1). Die
Assoziierung von 40S an die mRNA wird von dem Cap-bindenden Komplex
eIF4F sehr erleichtert. Faktor eIF4F besteht aus drei Untereinheiten:
der RNA-Helicase eIF4A, dem Cap-Bindeprotein eIF4E und dem Multiadaptorprotein
eIF4G, das als Rahmen für
die Proteine in dem Komplex wirkt und Bindestellen für eIF4E,
eIF4a, eIF3 und ein Poly(A)-bindendes Protein aufweist.
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Die
Infektion von Zellen mit einer Vielzahl von RNA Viren führt zur
selektiven Inhibition der Translation von mRNA des Wirts jedoch
nicht des Virus. Zum Beispiel führt
die Infektion von Zellen mit dem Poliovirus, einem zytoplasmatischen
RNA-Virus, zur Modifizierung mehrerer Translationsinitiationsfaktoren.
Insbesondere die Proteolyse beider Formen von eIF4G, eIF4GI und
eIF4GII (Gradi et al. 1998, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95, 11089–11094),
durch viruskodierte Proteasen führt
zur Inhibition der Translation der meisten zellulären mRNAs
mit Cap. Dagegen wird die Translation polioviraler mRNA, die eine
450 nt Sequenz in der 5'nichtkodierenden
Region (5'NCR) enthält, welche
40S Untereinheiten in Abwesenheit von intaktem eIF4F rekrutieren kann,
nicht inhibiert. Dieses Sequenzelement wurde Interne Ribosomeneingangsstelle
(internal ribosome entry site) oder IRES genannt (Jang et al. 1988
J. Virol. 62, 2363–2643).
Solche IRES Elemente wurden in picornaviraler, flaviviraler, pestiviraler,
retroviraler, lentiviraler, insektenviraler RNA (Tabelle 1) und
in tierischer zellulärer
RNA (Tabelle 2) gefunden. IRES enthaltende tierische mRNAs können 40S-Ribosomen
vermutlich sowohl über
ihr 5'-Cap-Ende
oder ihre IRES-Elemente
rekrutieren, was wahrscheinlich die Translation unter Bedingungen
erlaubt, wenn die Cap-abhängige
Translation reduziert ist, wie z.B. während einer viralen Infektion, während der
G2/M-Phase des Zellzyklus, Apoptose- oder Stressbedingungen (Johannes
et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13118–13123;
Cornelis et al. (2000), molecular Cell 5, 597–605; Pyronnet et al. (2000),
molecular Cell 5, 607–616;
Stein et al., 1998, Mol. and Cell. Biol. 18, 3112–3119; Holcik
et al., 2000, Oncogene 19, 4174–4177;
Stoneley et al., 2000, mol. and Cell. Biol. 20, 1162–1169).
Bis zu 3% der zellulären mRNAs
von Tieren werden bei verminderter Konzentration des Cap-bindenden Komplexes
eIF4F translatiert (Johannes et al., 1999).
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In
den letzten Jahren hat ein rekonstituierter Ribosomenbindungsassay
die Aufklärung
der Mechanismen erlaubt, nach denen verschiedene IRES Elemente arbeiten
(Pestova el al. 1998 Genes Dev. 12, 67–83). Einige dieser Elemente
wirken, indem sie der RNA-Bindungsoberfläche auf eIF4G eine hochaffine
Bindungsstelle bereitstellen. Andere wirken durch Binden and eIF3
und/oder die 40S Untereinheit (2). Kürzlich wurde
eine wichtige Rolle der IRES RNA/18S rRNA gezeigt. Die Gtx-IRES
enthält
mehrere nicht überlappende Segmente,
die Komplementarität
zur 18S rRNA zeigen, und die interne Translationsinitiation vermitteln
können (Hu
et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1339–1344).
In einem dieser Segmente wurde eine 9-nt-GC-reiche Sequenz CCGGCGGGU
identifiziert, die 100% komplementär zur 18S rRNA bei den Nucleotiden
1132–1124
ist, und es wurde gezeigt, dass synthetische IRESs, die aus mehreren
verbundenen Kopien dieses 9-nt-IRES-Moduls zusammengesetzt sind,
die interne Initiation in tierischen Zellen stark unterstützen (Chappel
et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1536–1541).
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5'-Leader-Sequenzen
mehrerer pflanzenviraler polycistronischer genomischer RNAs, darunter
der Familien der Poty- und
Comoviren, sind für
eine Cap-unabhängige
Translation verantwortlich. Tobamovirus und Potexvirus X IRESs sind
in internen Regionen der viralen Genome lokalisiert (Tabelle 2).
Tabakmosaik-Tobamovirus (TMV) ist ein positiv-Strang-RNA-Pflanzenvirus
mit einem einteiligen (monopartite) Genom von 6395 Nucleotiden (nt)
Länge (Goelet
et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5818–5822).
Die 5'-proximalen ORFs,
die replikative Proteine kodieren, werden direkt von der genomischen
RNA exprimiert, und das Syntheselevels des kleineren (126 kDa) Proteins
ist ungefähr
zehnmal höher
als das Expressionsniveau des 183 kDa-Proteins, das durch gelegentliches
Hindurchlesen (read through) des Stop-Kodons für das 126-kDa-ORF produziert
wird (Pelham, 1978, Nature 272, 469–471). Obwohl etwas Replikation
mit dem größeren Protein
alleine stattfinden kann, werden beide Proteine für eine effiziente
Replikation benötigt
(Ishikawa et al., 1986, Nucl. Acid. Res. 14, 8291–8305).
Die übrigen
TMV-Genprodukte,
das Movement-Protein (MP) und das Hüllprotein (coat protein, CP)
werden von 3'-koterminalen
subgenomischen mRNAs (sgRNAs) exprimiert (für eine Übersicht siehe Palukaitis und
Zaitlin, 1986, in: "The
plant virus", herausgeber:
M.H.V. van Regenmortel und M. Fraenkel-Conrat, Band 2, S. 105–131, Plenum
Press, NY). Das interne Movement-Protein (MP)-Gen und das 3'-proximale Hüllprotein-Gen
können
also nicht von genomischer RNA typischer Tobamoviren translatiert werden
(TMV UI ist ein typisches Mitglied der Gattung Tobamovirus). Die
dicistronische RNA-2 mittlerer Länge, genannt
sgRNA I2 RNA, wird translatiert und produziert
das 30 kDa-MP (Bruening et al., 1976, Virology 71, 498–517; Higgins
et al., 1976, Virology 61, 486–497;
Beachy und Zaitlin, 1977, Virology 81, 160–169; Goelet und Karn, 1982,
J. mol. Biol. 154, 541–550),
während
das 3'-proximalen
Hüllprotein
(CP)-Gen von I2 RNA translatorisch still
ist. Dieses Gen wird nur von der kleinen monocistronischen sgRNA
exprimiert (Siegel et al., 1976, Virology 73, 363–371; Beachy
und Zaitlin, 1977).
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Es
wurde gezeigt (Ivanov et al. (1997), Virology 232, 32–43), dass
die Translation des CP-Gens eines Kreuzblütlerinfizierenden Tobamovirus
(crTMV) im Gegensatz zu typischen Tobamoviren in vitro über einen
internen Ribosome-Entry-Mechanismus
geschieht. Das crTMV-Genom (6312 nts) enthält vier traditionelle Gene, die
für zwei
Komponenten der Replikase kodieren (Proteine von 122 und 178 kDa,
das Durchleseprodukt des 122 kDa-Proteins), ein 30 kDa-MP und ein
17 kDa-CP-Gen (Dorokhov et al., 1993, Dokl. Russian Acad. Sci. 332,
518–552;
Dorokhov et al., 1994 FEBS Lett. 350, 5–8). Es wurde gefunden, daß die 148-nt-Region
stromaufwärts
des CP-Gens von crTMV RNA eine interne Ribosomen-Eingangsstelle
(IRESCP148 CR) enthält, die
die interne Translationsinitiation des CP-Gens und verschiedener
Reportergene fördert
(Ivanov et al., 1997). Analog zu crTMV findet die Translation des
3'-proximalen CP-Gens
von Kartoffelvirus X über
einen internen Initiationsmechanismus statt (Hefferon et al., 1997).
Die Fähigkeit
der crTMV IRESCR CP,
die interne Translationsinitiation zu vermitteln, unterscheidet
diesen Tobamovirus von dem bekannten Mitglied der Gattung, TMV UI.
Die äquivalente
148-nt-Sequenz des TMV UI-RNA
(UICP,148 SP) konnte
die interne Translationsinitiation nicht vermitteln (Ivanov et al.,
1997).
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Vor
kurzem wurde gezeigt, dass die 228- und 75-nt-Regionen stromaufwärts des
MP-Gens der crTMV- und TMV UI-RNA
IRES-Elemente enthalten, IRS
MP,75 CR bzw. IRES
MP,228 CR, die die Expression von 3'-proximalen Reportergenen
aus dicistronischen Konstrukten in zellfreien Translationssystemen
und in isolierten Protoplasten bestimmen (Skulachev et al., 1999).
Darüber
hinaus konnte die äquivalente
Sequenz der TMV UI-RNA, die als intercistronischer Spacer verwendet
wurde (IRES
MP,75 UI),
die Translation des zweiten Gens in dicistronischen Transkripten
vermitteln. Es gibt mehrere Erfindungen, die IRES-Elemente beschreiben,
die zur Cap-unabhängigen
Expression fremder Gene in linearer multicistronischer mRNA in tierischen
Zellen benutzt wurden (
US 6 060
273 ;
US 6 114 146 ;
US 5 358 856 ;
US 6 096 505 ;
US 171 821 ;
US 5 766 903 ), in Pflanzenzellen (WO
98/54342) und, allgemein, in eukaryotischen Zellen (
US 171 821 ;
US 5 766 903 ;
US 5 925 565 ;
US 6 114 146 ). Ferner wurde zirkuläre RNA zur
Cap-unabhängigen IRES-vermittelte
Expression eines Gens entwickelt (
US
5 766 903 ). Die Cap-unabhängige Translation einer eukaryotischen
mRNA konnte von einer 5'-UTR
aus Gersten-Yellow Dwarf Virus-RNA erreicht werden, die sich prinzipiell
von bekannten IRES unterscheidet (
US 5
910 628 ). Allgemein beschreiben alle veröffentlichten
Erfindungen auf diesem Gebiet natürliche IRESs, die aus tierischen
(siehe z.B.
US 5 358 856 )
oder Pflanzenviren (WO 98/54342) isoliert wurden, ohne die Frage nach
der Cross-Kingdom-Aktivität
zu stellen, d.h. die Aktivität
bekannter IRESs ist entweder auf tierische oder auf pflanzliche
Zellen beschränkt.
Ansätze
für die
Herstellung nicht natürlicher,
künstlicher
IRESs, die die Cap-unabhängige
Expression fremder Gene in tierischen und pflanzlichen Zellen vermitteln
können,
wurden nicht beschrieben. Ferner gibt es keine Ansätze zur
Herstellung oder Identifizierung neuer IRES-Elemente, die im Tier-
und Pflanzenreich aktiv sind.
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Im
Gegensatz zu tierischer zellulärer
mRNA, gibt es keine Berichte über
IRES-vermittelte mRNA-Translationsinitiation
in Pflanzenzellen (siehe Tabelle 2) mit der Ausnahme einer Patentanmeldung (WO01/59138),
die ein pflanzliches IRES-Element des RPS18C-Gens aus Arabidopsis
beschreibt. Jedoch erlaubt weder die in dieser Patentanmeldung verwendete
Methodik, noch der experimentellen Ansatz, noch die Interpretation
der Ergebnisse eine direkte und eindeutige Schlussfolgerung einer
IRES-Aktivität
in vivo, noch eine verlässliche
Detektion solcher Elemente in pflanzlichen Transkripts. Zunächst wurde
ein untauglicher Test auf IRES-Aktivität verwendet. Um eine IRES-Aktivität zu detektieren,
wird üblicherweise
der dicistronische mRNA-Assay eingesetzt (Pelletier & Sonenberg, 1988,
Nature, 334, 320–325).
In diesem Test werden zwei Typen gecapter bicistronischer mRNAs,
die von einem vermuteten IRES-Element getrennt sind (mit und ohne Haarnadelstruktur
vor dem ersten Cistron), auf die Fähigkeit, eine Expression in
vitro und in vivo so bewirken. Das Konstrukt ohne Haarnadelstruktur
erlaubt Ribosome-Scanning und Translation des ersten, 5'-proximalen Cistrons,
während
in eine Cap-abhängige
Translation des ersten Cistrons in den Konstrukt mit der Haarnadelstruktur
blockiert ist. Die Autoren der WO01/59138 testeten das vermutete
IRES-Elemente des
RPS18C-Gens nur in dem künstlichen
bicistronischen Transkript ohne Haarnadelstruktur. Daher kann das
in der WO01/59138 beschriebene Ergebnis sehr wohl die Folge einer
Reinitiation der Translation sein (Kozak, 2001, Mol.Cell.Bio1 21,
1899–1907).
Außerdem
ist bekannt, dass eine Nucleotidsequenz mit IRES-Aktivität in vitro häufig keine IRES-Aktivität in eukaryotischen
Zellen zeigt. WO01/59138 enthält
keinen direkten und eindeutigen experimentellen Nachweis, dass das
vermutete IRES-Element des RPS18C-Gens aus Arabidopsis in eukaryotischen
Zellen (in Pflanzen unter Tieren) aktiv ist.
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Im
Gegensatz zu tierischer zellulärer
mRNA gibt es keine Berichte über
eine IRES-vermittelte Initiation der Translation in Pflanzenzellen
in vivo (Tabelle 2). Die geringe Aktivität tierischer viraler IRESs
(Enzephalomyokarditis-Virus-IRES, IRESEMCV)
in Pflanzen wurde berichtet (Urwin et al., 2000, Plant J. 24, 583–589). Bislang
gibt es keine Hinweise auf Aktivität eines IRES-Elements in verschiedenen
Reichen (Pflanzen, Tiere, Hefe; Cross-kingdom activity). Obwohl
die Anzahl der Nucleotid-Sequenzen, die eine Cap-unabhängige Translation
bewirken können,
ständig
ansteigt, geschieht die Identifizierung neuer IRES selten und rein
zufällig,
und es gab keine Methode zu ihrer Vorhersage.
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Es
ist deshalb eine Aufgabe dieser Erfindung, eine Methode zur Identifzierung
neuer eukaryotischer IRES-Elemente bereitzustellen. Es ist eine
weitere Aufgabe der Erfindung, neue eukaryotische IRES-Elemente,
insbesondere pflanzlichen Ursprungs, bereitzustellen. Es ist eine
weitere Aufgabe, neue IRES-Elemente mit Aktivität in mehreren Organismenreichen
bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren
zur Expression einer gewünschten
Nucleotid-Sequenz in eukaryotischen Zellen und translationeller Kontrolle
eines neuen IRES-Elements, insbesondere eines IRES-Elements pflanzlichen
Ursprungs, bereitzustellen.
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BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
obigen Aufgaben werden von den Ansprüchen der Erfindung gelöst.
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Diese
Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Suche nach und zur Identifizierung
eines eukaryotischen IRES-Elements,
das bei der cap-unabhängigen
Translation von RNA in eukaryotischen Zellen aktiv ist, wobei das
Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- (i)
Screening von eukaryotischen mRNA Sequenzen oder von entsprechenden
DNA Sequenzen nach einem potentiellen IRES-Element, das einen Nukleotidblock
aufweist, der
(a) eine Länge
von mindestens 30 Nukleotiden,
(b) einen Adeninnukleotidgehalt
von mindestens 40 mol-%, und
(c) einen Pyrimidinnukleotidgehalt
von weniger als 40 mol-% hat,
- (ii) Einführen
des potentiellen IRES-Elements in ein lineares dicistronisches Konstrukt
zwischen ein stromaufwärts
gelegenes Gen und ein stromabwärts
gelegenes GUS Reportergen, wobei das potentielle IRES-Element für eine IRES-abhängige Translation
des stromabwärts
gelegenen GUS-Gens positioniert wird und wobei dem stromaufwärts gelegene
Gen eine stabile Hairpin-Struktur vorausgeht, um die IRES-unabhängige Translation
der Gene zu verhindern, und
- (iii) Testen des potentiellen IRES-Elements auf IRES-abhängige Translation
des GUS-Gens in Kaninchen-Reticulocyten-Lysat-
oder Weizenkeimextrakt-Translationstests in vitro, wobei die GUS
Genexpression quantifiziert wird, vorzugsweise bezüglich eines
Konstrukts, das ein Referenz-IRES-Element oder ein nicht-IRES-Element zwischen
dem stromaufwärts
gelegenen Gen und dem stromabwärts
gelegenen GUS Gen enthält.
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Ein
IRES Element, das in mindestens einem dieser in vistro Translationsassays
zur GUS Expression führt,
kann dann ausgewählt
werden.
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Die
Erfinder dieser Erfindung haben überraschenderweise
Kriterien zur Identifizierung von Nucleotid-Sequenzen, die IRES-Aktivität zeigen,
(IRES-Elemente) identifiziert, d.h. Sequenzen, die eine Cap-unabhängige Translation
eines stromabwärts
gelegenen Gens oder einer Kodiersequenz über einen internen Ribosomen-Eintrittsmechanismus
bewerkstelligen können.
Die Erfinder haben gefunden, dass Nucleotid-Sequenzen mit einem
Block von mindestens 30 Nucleotiden mit einem hohen Adeningehalt
und einem niedrigen Pyridmidinnucleotidgehalt eine hohe Neigung
haben, IRES-Aktivität
zu zeigen. Durch ein Screening bekannter Nucleotid-Sequenzen unter
Anwendung dieser Kriterien kann eine Nucleotid-Sequenz oder ein
Satz von Nucleotid-Sequenzen mit hoher Neigung, IRES-Aktivität zu haben,
identifiziert werden. Das erfindungsgemäße Screening stellt eine Vorauswahl
von Nucleotid-Sequenzen aus allen bekannten Nucleotid-Sequenzen
dar. Ein vorausgewähltes
potentielles IRES-Element oder ein Satz solcher potentieller IRES-Elemente
kann dann experimentell auf tatsächliche
IRES-Aktivität
und den Grad derselben getestet werden. Das Screening oder die Vorausauswahl
gemäß der Erfindung
reduziert die experimentell auf IRES-Aktivität zu testende Anzahl von Sequenzen
enorm, so dass eine direkte Identifzierung neuer IRES-Elemente,
einschließlich
der experimentellen Bestätigung,
erstmals möglich
wird.
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Das
Screening kann auf jede bekannte Nucleotid-Sequenz und auf Sequenzen,
die in Zukunft bekannt werden, angewandt werden. Nucleotid-Sequenzen
eukaryotischen Ursprungs, d.h. pflanzliche oder tierische Sequenzen,
werden gescreent, und diejenigen von höheren Pflanzen oder höheren Tieren
sind bevorzugt. Das Screening viraler Sequenzen liegt nicht im Bereich
dieser Erfindung.
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Ganze
Genom-Sequenzen, einschließlich
von Kerngenomen und Organellgenomen, wie Plastiden oder mitochondriellen
Genomen, können
gescreent werden. Eukaryotische Kerngenom-Sequenzen sind bevorzugt.
Das Screening kann auf DNA- oder RNA-Sequenzen angewandt werden.
Wenn doppelsträngige
DNA verwendet wird, können
beide Stränge
gescreent werden. Der kodierende Strang wird vorzugsweise gescreent.
Das Screening kann auf die 5'-untranslatierten
Sequenzen (5'UTR
sequences) von Genen beschränkt werden.
Es ist dazu äquivalent,
5'UTR-Sequenzen auf RNA-Ebene
zu screenen. Die Screeningkriterien der Erfindung bezüglich dem
Adenin- und dem Pyrimidingehalt sind auf Messenger-RNA oder den
entsprechenden kodierenden Strang auf DNA-Ebene bezogen. Das Screening
kann im einfachsten Fall per Auge ausgeführt werden durch Ablesen gedruckter
oder geschriebener Nucleotid-Sequenzen. Dieser Ansatz kann erfolgreich
sein, insbesondere wenn man sich auf 5'UTR-Sequenzen konzentriert. Es ist jedoch
einfacher, eine automatisierte Screeningmethode z.B. unter Verwendung
eines Computers und eines geeigneten Computerprogramms zu verwenden.
Auf diese Weise können
große
Datenbanken von Nucleotid-Sequenzen, insbesondere Genom-Datenbanken,
gescreent werden, mit dem Potential, viele IRES-Elemente zu finden.
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Hierin
bedeutet "adeninreich" oder "hoher Adeningehalt" einen Adeningehalt,
der mindestens 40 mol% beträgt. "Pyrimidinarm" oder "niederer Pyrimidingehalt" bedeutet einen Gehalt
an Thymin (Uracil) + Cytidin, der geringer als 40 mol% Thymin (Uracil)
+ Cytidin ist. Bezüglich
der beim Screening anzuwendenden Kriterien wird ein Block von mindestens
30 Nucleotiden mit einem Adeningehalt von mindestens 40, vorzugsweise
mindestens 50 und am bevorzugtesten von mindestens 60 mol% gesucht.
Der Pyrimidingehalt sollte unter 40 mol%, vorzugsweise unter 30
mol% und am bevorzugtesten unter 20 mol% liegen.
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Es
gibt keine strikte obere Grenze für die Länge des Nucleotidblocks. Aus
praktischen Erwägungen wird
der Block beim Screening kürzer
als 500 Nucleotide gewählt.
Der Block hat eine Länge
von mindestens 30 Nucleotiden. Bevorzugt wird nach Blocks zwischen
200 und 30 Nucleotiden gesucht. Bevorzugter hat der Block eine Länge zwischen
40 und 100 Nucleotiden.
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Der
erfindungsgemäße Nucleotidblock
weist eine hohe Neigung auf, einer Sequenz, die ihn enthält, IRES-Aktivität zu verleihen.
Wenn 5'UTR-Sequenzen
gescreent werden, können
2, 3 oder noch mehr erfindungsgemäße Nucleotidblocks gefunden
werden.
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Wenn
das Screening mit der Hilfe eines Computers durchgeführt wird,
kann es mehrfach durchgeführt werden,
wobei die Screeningkriterien jedes Mal geändert werden können. Vorzugsweise
beginnt man mit strikten Kriterien, d.h. einem hohen Adeningehalt,
niedrigen Pyrimidingehalt und kurzem Nucleotidblock, um Sequenzen
mit der höchsten
Wahrscheinlichkeit, IRES-Aktivität
zu haben, zu finden. Weitere IRES-Elemente können durch Anwenden von weniger
strengen Kriterien mit niedrigerem Adeningehalt, höherem Pyrimidingehalt
oder längeren
Blocks oder Kombinationen davon angewandt werden, innerhalb der
oben gegebenen Kriterien. Auf diese Weise können IRES-Elemente verschiedener IRES-Aktivitäten gefunden
werden, was nützlich
ist, um ein gewünschtes
Expressionsniveau zu erreichen, wenn ein gewünschtes Gen unter translationeller Kontrolle
eines IRES-Elements exprimiert wird.
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Die 7 und 8 zeigen
mehrere 5'UTR-Sequenzen,
die erfindungsgemäße Nucleotidblocks menschlichen
bzw. pflanzlichen Ursprungs zeigen. Diese 5'UTR-Sequenzen sind potentielle IRES-Elemente gemäß Schritt
(i) von Anspruch 1. Für
einige dieser potentiellen IRES-Elemente wird in den Beispielen Cross-Kingdom-IRES-Aktivität gezeigt.
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Ein
gemäß Schritt
(i) von Anspruch 1 gefundenes potentielles IRES-Element wird dann
einer experimentellen Bestätigung
seiner IRES-Aktivität
zugeführt.
Zu diesem Zweck wurde ein Testsystem entworfen, das das bicistronische
DNA-Konstrukt "H-GFP-GUS" mit den folgenden
Elementen in dieser Reihenfolge umfasst: Eine Struktur, die eine
stabile Haarnadel (H) auf mRNA-Ebene bildet, ein Gen des Grünfluoreszierenden
Proteins (GFP) (GFP-kodierende Sequenz), einen intercistronischen
Spacer mit einer oder mehreren Restriktionsstellen zur Insertion
potentieller IRES-Elemente und das GUS-Gen (die GUS-kodierende Sequenz).
Ein potentielles IRES-Element wird in den Spacer zwischen GUS und
GFP inseriert. Dieses Konstrukt wird dann in vitro transkribiert,
z.B. mit T7 RNA-Polymerase,
um mRNA zu erhalten. Die erhaltene mRNA wird dann in vitro translatiert
unter Verwendung von in-vitro-Translationssystemen
auf der Basis von Kaninchen-Reticulozytenlysat (RRL) oder von Weizenkeimextrakt
(WGE). Beide in-vitro-Translationssysteme sind kommerziell erhältlich,
z.B. von Promega und von Roche Diagnostics und können gemäß den Instruktionen der Hersteller
verwendet werden. Nach der Translation kann die GUS-Expression z.B. über die
enzymatische Aktivität
und eine kolorimetrische Detektion, über Autoradiographie oder mittels
Western-Blotting bestimmt werden.
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Die
GUS-Genexpression wird vorzugsweise relativ zu einem Konstrukt,
das ein Referenz-IRES-Element oder ein Nicht-IRES-Element zwischen
dem stromaufwärts
gelegenen Gen und dem GUS-Gen enthält, bestimmt. Als ein Referenz-IRES-Element
mit starker IRES-Aktivität
kann der Nucleotidblock (GAAA)16 (siehe Beispiele)
oder jedes andere bekannte IRES-Element verwendet werden. Als Nicht-IRES-Element
kann der synthetische, in 4 genannte
Spacer (siehe Beispiele) z.B. verwendet werden, oder ein zufälliger Nucleotidblock.
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Die
Haarnadelstruktur in dem bicistronischen DNA-Konstrukt verhindert
die Cap-abhängige
Translation, so dass die gesamte GUS-Expression der translationalen
Aktivität
des potentiellen IRES-Elements, das in den intercistronischen Spacer
des Konstrukts inseriert ist, zugeschrieben werden kann. Die Haarnadelstruktur muss
stabil genug sein, um die Cap-abhängige Translation effizient
zu verhindern. Vorzugsweise ist die Stabilität größer als 30 kcal/mol (siehe
Kozak, M. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2850). Eine nicht
ausreichende Stabilität
der Haarnadel kann durch eine Expression des GFP-Gens erkannt werden.
Eine GFP-Translation kann z.B. über
die Fluoreszenz, durch Western-Blotting
oder durch Autoradiographie detektiert werden.
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Das
H-GFP-GUS-Konstrukt wurde aus dem Plasmid pBluescriptII Sk+, einer
GUS-Nucleotid-Sequenz und einer GFP-Sequenz hergestellt. Die Haarnadelstruktur
hat die folgende Sequenz:
ggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataccgtcgacctcgagggggggcccggtacc. Äquivalente
Strukturen können von
einem Fachmann leicht hergestellt werden.
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Alle
Aspekte im Zusammenhang mit den in-vitro-Translationssystemen sind
gut untersucht und im Stand der Technik bekannt. Details können in
den folgenden Dokumenten und darin zitierten Referenzen gefunden
werden: Anderson, C. et al. (1985), Meth. Enzymol. 101, 635; Krieg,
P. und Melton, D. (1984), Nucl. Acids Res. 12, 7057; King, R.W.
et al. (1997), Science 277, 973; DiDonato, J.A. und Karin, M. (1993),
Promega Notes 42, 18; Pelham, H.R.B. und Jackson, R.J. (1976), Eur.
J. Biochem. 67, 247; Jackson, R.J. und Hunt, T. (1983), Meth. Enzymol.
96, 40; Technical Bulletins Nr. 126 und Nr. 165, oder Technical
Manual Nr. 232, alle von Promega Corp.
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Potentielle
IRES-Elemente, die in einem solchen WGE- oder RRL-Translationsassay
zu einer GUS-Genexpression führen,
sind erfindungsgemäße IRES-Elemente.
Die gemäß dieser
Erfindung identifizierten oder identifizierbaren IRES-Elemente zeigen
typischerweise Cross-Kingdom-Aktivität, d.h., sie können dazu
benutzt werden, ein gewünschtes
Gen unter translationaler Kontrolle der IRES in Pflanzen und in
Tieren zu exprimieren. Trotz der Cross-Kingdom-Aktivität ist die Aktivität des IRES-Elements
normalerweise nicht dieselbe, wenn die Expression eines gewünschten
Gens im pflanzlichen und im tierischen System verglichen wird. Es
existieren Unterschiede im Expressionsniveau zwischen den beiden
oben genannten in-vitro-Translationssystemen. In in-vivo-Systemen
sind diese Unterschiede im allgemeinen noch größer. Dennoch zeigen die in
dieser Erfindung identifizierten IRES-Elemente eine überraschend hoher IRES-Aktivität in beiden
in-vitro-Systemen, in Pflanzenzellen und in tierischen Zellen.
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Es
sollte erwähnt
werden, dass IRES-Aktivität
nicht nur anhand der oben erwähnten
in-vitro-Translationsassays sondern auch in pflanzlichen oder tierischen
Zellen oder in vivo detektiert werden kann. Reihen synthetischer
Sequenzen, die als intercistronische Spacer in den bicistronischen
H-GFP-GUS-Vektoren verwendet wurden, wurden entworfen und in RRL,
Tabakprotoplasten und in HeLa-Zellen untersucht. Ferner wurden zwei
synthetische Sequenzen, nämlich
vier verknüpfte
Kopien eines 19-nt-direkten Repeats (Ecp x4) und 16 Kopien der GAAA-Sequenz (GAAA)16 hergestellt, die sich beide als IRES-Elemente
erwiesen. Die wichtige Rolle adeninreicher Nucleotid-Sequenzen wurde
in pflanzlichen und tierischen Translationssystemen in vitro und
in vivo bewiesen.
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Die
Anwendung des Prinzips dieser Erfindung erlaubte die Entdeckung
zahlreicher pflanzlicher eukaryotischer IRES-Elemente, die universell sind und die
effiziente Translationsinitiationsmotive in verschiedenen Reichen
lebender Organismen darstellen. Unseres Wissens haben wir die ersten
IRES-Elemente in Genomen pflanzlicher Organismen identifiziert.
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Diese
Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Expression einer gewünschten
Nucleotid-Sequenz in eukaryotischen Zellen bereit durch Einführung eines
Vektors in die Zellen, wobei der Vektor die gewünschte Nucleotid-Sequenz umfasst,
die operationell mit einem stromaufwärts gelegenen IRES-Element
verknüpft
ist, das gemäß der Methode
dieser Erfindung zur Suche nach und zur Identifizierung von einem
eukaryotischen IRES-Element identifiziert wurde oder identifzierbar
ist, wobei die gewünschte
Nucleotid-Sequenz Cap-unabhängig
mittels des IRES-Elements translatiert wird.
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Die
gewünschte
Nucleotid-Sequenz kann in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen exprimiert
werden. Sie kann auch in einem Tier oder in tierischen Zellen exprimiert
werden. Unter Tieren sind Säugerzellen
oder Säugetiere,
einschließlich
von Menschen (z.B. zur Gen-Therapie), bevorzugt. Ferner kann die
gewünschte
Nucleotid-Sequenz in Pilzen exprimiert werden, vorzugsweise in Hefezellen.
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Das
in dem Vektor enthaltene IRES-Element ist eukaryotischen Ursprungs,
vorzugsweise pflanzlichen oder säugetierischen
Ursprungs. Bevorzugter umfasst das IRES-Element eine Sequenz gemäß einer
der Sequenzen von 7 oder 8 oder ein
IRES-funktioneller Teil dieser Sequenzen. Noch bevorzugter ist das IRES-Element
von der 5' UTR-Sequenz
eines der folgenden Pflanzengene abgeleitet: Hitzeschockfaktor 1,
Poly(A)-bindendes Protein, 48K MAP-Kinase. Am bevorzugtesten sind
diese Gene aus Tabak.
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Das
erfindungsgemäße Expressionsverfahren
umfasst nicht die Verwendung einer der in 11 gezeigten
Sequenzen als IRES-Element.
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Die
gewünschte
Nucleotid-Sequenz kann von monocistronischer mRNA exprimiert werden.
Das große Potential
der IRES-Technologie liegt jedoch auf dem Gebiet der bicistronischen
oder polycistronischen Expression, was die Expression von Untereinheiten
eines Proteinkomplexes oder das Entwerfen einer ganzen biochemischen
Kaskade oder eines biochemischen Weges erlaubt.
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Die
eukaryotischen Zellen oder die eukaryotischen Organismen können stabil
mit dem Vektor transformiert oder transient transfiziert sein. Verfahren
zur Transformation oder Transfektion tierischer oder pflanzlicher
Zellen sind im Stand der Technik bekannt. Verschiedene Methoden
können
zum Einbringen eines DNA- oder RNA-Vektors in eine Pflanzenzelle
verwendet werden, darunter die direkte Einführung eines solchen Vektors
in eine Pflanzenzelle mittels Mikroprojektilbombardierung, Elektroporation
oder PEG-vermittelter Behandlung von Protoplasten (für Übersichtsartikel
siehe: Gelvin, S.B., 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227–232; Hansen & Wright, 1999,
Trends Plant Sci., 4, 226–231).
Auch Pflanzen-RNA- und -DNA-Viren sind effiziente Transformations-
oder Transfektionssysteme (Hayes et al., 1988, Nature, 334, 179–182; Palmer
et al., 1999, Arch. Virol., 144, 1345–1360; Lindbo et al., 2001,
Curr. Opin. Plant. Biol., 4, 181–185). Die Vektoren können ein
Transgen entweder zur stabilen Integration in das Genom/Plastom
der Pflanze (durch direkte oder Agrobacterium-vermittelte DNA-Integration)
oder zur transienten Expression des Transgens (durch "Agroinfiltration") einführen. Ähnlich können tierische
Zellen elektroporiert, mit viralen Vektoren infiziert oder transfiziert
werden unter Verwendung von Lipofectin.
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Die
Herstellung der Vektoren für
das erfindungsgemäße Expressionsverfahren
kann nach Standardverfahren der Molekularbiologie durchgeführt werden.
Spezifische Ausführungsformen
sind in den Figuren und in den Beispielen beschrieben.
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Die
Erfindung umfasst IRES-Elemente, die nach der erfindungsgemäßen Methode
identifiziert wurden oder identifizierbar sind. Insbesondere umfasst
die Erfindung ein IRES-Element mit einer Sequenz gemäß einer
der Sequenzen von 7 oder 8 oder eines
IRES-funktionellen Teils einer dieser Sequenzen.
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Die
Erfindung beschreibt erstmals IRES-Elemente pflanzlichen Ursprungs.
Diese IRES-Elemente sind deshalb von dieser Erfindung umfasst, ebenso
wie Vektoren, die solche IRES-Elemente enthalten. Vorzugsweise ist
eine IRES in einen Leader der Arabidopsis RPS18 Genfamilie, insbesondere
im Leader des Arabidopsis RPS18 Gens, oder in dazu homologen oder
orthologen Leadern von den erfindungsgemäßen IRES-Elemente ausgeschlossen.
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Die
Erfindung umfasst ferner transgene oder transient transfizierte
eukaryotische Zellen, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert
wurden, der ein erfindungsgemäßes IRES-Element
enthält.
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Ferner
wird ein RNA-Vektor, der neue IRES-RNA-Sequenzen enthält, sowie
ein DNA-Vektor, der DNA-Kopien neuer IRES-DNA-Sequenzen enthält, beschrieben.
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Die
Erfindung ist nützlich,
da sie einem Durchschnittsfachmann erlaubt, vormals unbekannte natürliche Translationselemente
mit IRES-Aktivität
zu identifizieren. Sie erlaubt es, IRES-Elemente zu identifizieren, die
aktiver sind als vormals beschriebene. Ferner erlaubt sie die Identifizierung
von IRES-Elementen, die universell sind und in verschiedenen taxonomischen
Reichen aktiv sind.
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Ein
wesentlicher Vorteil dieser Erfindung ist die Möglichkeit, mehr als zwei Gene
in multicistronischen Kassetten in transient oder stabil (transgene
Pflanzen) transformierten Pflanzenzellen zu exprimieren. Ein weiterer
Vorteil der Erfindung ist die Möglichkeit,
mehr als zwei Gene in multicistronischen Kassetten in transient oder
stabil transformierten (nichtmenschliche transgene Tiere) menschlichen
oder Säugerzellen
zu exprimieren. Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung beruht in
der Möglichkeit,
mehr als zwei Gene in multicistronischen Kassetten in Hefezellen
zu exprimieren. Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung ist die Möglichkeit,
virale Vektoren zur Expression fremder Gene über die neuen IRES der Erfindung
in Säugetieren
und insbesondere in Menschen herzustellen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1:
Vereinfachtes Modell kanonischer eukaryotischer Cap-abhängiger Translationsinitiation.
Die eIF4E-eIF4G-Interaktion
rekrutiert die kleine ribosomale Untereinheit zum 5'-Ende der mRNA. eIF4G
interagiert auch mit Pab1p, eIF3 und der RNA-Helicase eIF4A, um
den Initiationsprozess zu vermitteln. ORF: open reading frame (Offener
Leserahmen); PABP: poly (A)-binding protein.
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2:
Vereinfachtes Modell des Mechanismus der Rekrutierung des Ribosoms
zur mRNA während der
Hepatitis-C-Virus-IRES-vermittelten
Translationsinitiation. Das IRES-Element ersetzt die Notwendigkeit
für eine
eIF4E-eIF4G-Interaktion,
indem es eine alternative Möglichkeit
zur Rekrutierung des Ribosoms zur mRNA bereitstellt. Pfeile zeigen
die verschiedenen direkten Wechselwirkungen zwischen IRES-Elementen und
dem 40S-Initiationskomplex.
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3 zeigt
in (A) die Nucleotid-Sequenz des NtHSF-1-mRNA-5'-Leaders (EMBL-Zugriffsnummer AB014483)
und in (B) Klonierungsschritte. Das Initiationscodon AUG ist kursiv
gezeigt.
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4 zeigt
ein Autoradiogramm von in WGE translatierten Proteinen über H-GFP-GUS,
enthaltend (i) die 36-nt-künstliche
Sequenz (Spacer) GCGUGGGCGGCGUGGGCGUUUGUUCUUUGUUUGACC, (ii) den 453-nt-NtHSF-1
mRNA-5'-Leader,
(iii) (GAAA)16 und IRESCP,148 CR als intercistronischer Spacer. Pfeile
zeigen die Position von GUS und die erwartete Position von GFP an.
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5 zeigt
ein Diagramm der GUS-Genexpression in Tabakprotoplasten, die mit
einem 35S-basierten haarnadelstrukturlosen bicistronischen GFP-GUS-Konstrukt
transfiziert wurden, das die unter den Diagrammbalken gezeigten
Nucleotid-Sequenzen enthielt. GUS-Aktivitätswerte jeder transgene Pflanze
wurden zum GFP-Gehalt in derselben Protoplastenprobe, der über Densitometrie
von GFP-Banden von Westernblots bestimmt wurde, normalisiert. Mindestens
drei unabhängige
Experimente wurden zur Berechnung von Durchschnittswerten und den
gezeigten Standardfehlern verwendet.
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6 zeigt
ein Diagramm der GUS-Genexpression in HeLa-Zellen, die mit dem bicistronischen
T7-basierten Konstrukt H-GFP-GUS transfiziert wurden. GUS-Werte
wurden zu den Proteingehalten der Proben normalisiert. Mindestens
drei unabhängige
Experimente wurden für
die Berechnung von Durchschnittswerten und den gezeigten Standardfehlern
verwendet.
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7 zeigt
humane 5'UTR-Nucleotid-Sequenzen
als vermutliche humane IRESs.
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8 zeigt
pflanzliche 5'UTR-Nucleotid-Sequenzen
als vermutliche pflanzliche IRESs.
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9 zeigt
experimentelle Schritte zur Identifizierung und Isolierung einer
neuen pflanzlichen IRES von der 5'UTR der mRNA des Polyadenin-bindenden
Proteins PABP aus Tabak.
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10 zeigt
experimentelle Schritte der Identifizierung und Isolierung einer
neuen pflanzlichen IRES von der 5'UTR der 48K MAP-Kinase (48K MAPK) aus
Tabak.
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11 zeigt
Nucleotid-Sequenzen bekannter tierischer und viraler IRES-Elemente.
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Im
folgenden wird die Erfindung anhand von spezifischen Beispielen
weiter beschrieben. Standardtechniken der Molekularbiologie wurden
gemäß Sambrook
et al. (1989, molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Ausgabe,
Cold Spring Harbor, New York) durchgeführt. Alle in der Erfindung
verwendeten Plasmide können
gemäß den Vorschriften
der Beschreibung von einem Durchschnittsfachmann ohne unzumutbaren Aufwand
mit gängigen
Materialien durchgeführt
werden.
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BEISPIELE
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Das
Ziel dieser Beispiele ist es, Verfahren zur Entdeckung und Herstellung
bisher nicht identifizierter natürlicher
IRES in eukaryotischen 5'UTR-mRNA-Sequenzen
zu demonstrieren.
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BEISPIEL 1
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Identifizierung einer
neuen IRES-Sequenz aus der NtHSF-mRNA 5'UTR
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Klonierstrategie
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Die
5'UTR von NtHSF-1
wurde durch Screening ausgewählt.
Sie enthält
adeninreiche Nucleotidblocks und wurde wie in 3 dargestellt
kloniert, um den Transkriptionsvektor pH-GFP-NtHSF-GUS herzustellen.
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In-vitro-Translationsassays:
WGE- und RRL-Translationsassays wurden wie im Technical Bulletin
Nr. 165 bzw. Nr. 126 von Promega beschrieben durchgeführt unter
Verwendung der gekoppelten Transkriptions-/Translationssysteme der
Katalog Nr. L4140 bzw. L4610. Alternativ wurde ein konventionelles
RRL-System von Promega, Katalog Nr. L4960 (Technical Manual Nr.
232) verwendet. Lineare H-GFP-GUS-Vektoren, die potentielle IRES-Elemente
zwischen dem GFP und GUS inseriert hatten, wurden unter Verwendung
des T7-Promotor/RNA-Polymerasesystems transkribiert. RNA-Transkripte
wurden mit LiCl präzipitiert,
in Wasser gelöst
und mit Ethanol repräzipitiert.
RNA-Konzentrationen
wurden mittels Spektrophotometrie gemessen, und 5 μg Transkript
wurden pro 25 μl
in-vitro-Translationsprobe
verwendet. GFP- und GUS-Expression wurden mittels Autoradiographie
detektiert.
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Transientes
Assaysystem mit pflanzlichen Protoplasten: Das folgende Verfahren
zur Präparation
und Transfektion von Protoplasten wurde verwendet: (i) Die Protoplasten
wurden aus Blättern
von N. tabacum (cv. W38) isoliert wie beschrieben (Saalbach et al.,
1996, Plant Physiol. 112, 975–985).
Aliquots von 4 × 105 Protoplasten wurden mit 30 μg pFF19-basierten
dicistronischen DNA-Konstrukten "GFP-Spacer-GUS" transfiziert und
36 Stunden bei 25°C
im Dunkeln inkubiert. Die GUS-Aktivität wurde als relative Lichteinheiten
(RLU) gemessen. Die GUS-Aktivität
wurde gemäß Jefferson
(1987, Plant mol. Biol. Rep. 5, 387–405) unter Verwendung von
MUG bestimmt. In jedem Experiment wurden Hintergrundaktivitätswerte
infolge nicht-transfizierter Protoplasten substrahiert. Die Proteinkonzentrationen
wurden mit dem Bio-Rad-Protein-Assaykit auf der Grundlage der Methode
von Bradford (1976, Anal. Biochem. 72, 248–254) geschätzt. Die GFP-Expression wurde
mittels Westernblot-Analyse bestimmt unter Verwendung monoklonaler
Maus-Antikörper
(Boehringer Mannheim Nr. 1 814 460) gemäß den Hinweisen des Herstellers.
GFP-Mengen in Westerblot-Banden wurden unter Verwendung der Bio-Rad-Quality-One-Software
berechnet.
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Transfektion von HeLa-Zellen
mit Vaccinia-Virus und T7-Promotor enthaltenden Plasmiden, die für GUS kodieren
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HeLa-Zellmonolayer
wurden auf 3,5 cm Petrischalen in Dulbeccos modifiziertem minimalem
essentiellem Medium, das mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum
und 100 Units/ml Streptomycin und Penicillin ergänzt war, gezogen. Virusvorräte (stocks)
an modifiziertem Vaccinia-Virus Ankara (MVA), die das Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase-Gen exprimieren,
wurde nach herkömmlichen
Methoden bereitet. HeLa-Zellplatten, die 80 bis 90% konfluent waren,
wurden mit Virus infiziert unter Verwendung von 30 bis 40 pfu/Zelle.
Nach einer 45-minütigen
Absorptionsperiode wurden die Zellen gewaschen und unter Verwendung von
Opti-MEM (Life Technologies, Inc.)-Plasmid-DNA und Lipofektin (Life Technologies,
Inc.) transfiziert. Transfektionsmischungen aus 2 μg DNA in
5 μl Lipofektin
wurden für
eine 3,5 cm-Platte verwendet. Für
jedes Konstrukt wurden für
jedes Experiment 6 Platten verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C 6 Stunden
inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt, die Zellen
zweimal mit PBS gewaschen und direkt auf der Platte in 250 μl Lyse-Puffer
(100 mM KHPO3, pH 7,8, 0,2% Triton X-100,
0,5 mM DTT) 10 Minuten lysiert. Das Lysat wurde gesammelt, durch
Zentrifugation bei 2000 g 10 Minuten geklärt und bei –70°C gelagert. Die GUS-Aktivität wurde
in 20 μl
Lysat mit dem GUS-LightTM-Reagenzsystem (Tropix,
MA, USA) gemäß den Protokollen
des Herstellers gemessen.
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ERGEBNISSE
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Der
453-nt-5'-Leader
des Nicotiana tabacum-Hitzeschockfaktors 1 (NtHSF-1, EMBL-Nucleotid-Datenbank-Zugriffsnr. AB014483)
wurde aus einer Tabak-cDNA-Bank isoliert und als intercistronischer
Spacer im bicistronischen Konstrukt H-GFP-GUS verwendet, das dann
in WEG- und RRL-in-vitro-Translationssystemen (4)
sowie in Tabakprotoplasten (5) und HeLa-Zellen
(7) getestet wurde. 4 zeigt
die Ergebnisse der Translation in WGE mit dem bicistronischen Konstrukt
H-GFP-GUS, enthaltend den NtHSF-1 5'-Leader im Vergleich mit der 36-nt-künstlichen
Sequenz GCGUGGGCGGCGUGGGCGUUUGUUCUUUGUUUGACC als Kontrolle. (GAAA)16 und IRESCP,148 CR wurden als Positivkontrollen verwendet.
Man erkennt, dass der NtHSF-1-Leader eine effiziente Expression
des GUS-Gens in WGE ergab, obwohl die Expression des 5'-proximalen Gens
(GFP) von einer stabilen Haarnadelstruktur blockiert war. Analoge
Ergebnisse wurden im RRL-System erhalten (Daten nicht gezeigt).
Um die in vitro erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen, wurde der NtHSF-1-Leader
in Tabakprotoplasten und humanen HeLa-Zellen auf IRES-Aktivität getestet.
Die in 5 bzw. 6 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass der
NtHSF-1-Leader in beiden Typen von eukaryotischen Zellen eine der
IRESCP,148 CR vergleichbare
IRES Aktivität
zeigte. Es wurde gefolgert, dass der NtHSF-1-Leader wie IRESCP,148 CR Cross-Kingdom-Aktivität aufweist
und als IRES-Sequenz betrachtet werden kann (IRESNtHSF-1).
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Die
Ergebnisse zeigen, dass die Anwendung der erfindungsgemäßen Suchkriterien
es erlauben, IRES-Elemente in 5'-Leadern eukaryotischer
mRNA zu identifizieren.
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BEISPIEL 2
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Identifizierung einer
neuen IRES-Sequenz, die aus der mRNA 5'-UTR des Po1y(A)-bindenden Proteins
aus Tabak isoliert wurde
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Eine
Analyse humaner und pflanzlicher mRNA 5'-UTR nach den Kriterien dieser Erfindung
ergab weitere Sequenzen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit von IRES-Aktivität (7 und 8).
Von dieser Sequenzliste wurde die 5'UTR des Poly(A)-bindenden Proteins (PABP)
aus Tabak ausgewählt,
um die Effizienz unserer Methode zur Vorhersage und Identifizierung
neuer IRES-Sequenzen zu bestätigen.
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Klonierstrategie:
Der Ansatz zur Isolation der PABP-IRES ist in 9 dargestellt.
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Die
erhaltenen DNA-Konstrukte wurden mit NotI linearisiert und mit T7-Polymerase
transkribiert. RNA-Transkripte wurden mit LiCl präzipitiert,
in Wasser gelöst
und mit Ethanol repräzipitiert.
RNA-Konzentrationen wurden mittels Spektrophotometrie gemessen,
und je 5 μg
jeden Transkripts wurden für
eine 25 μl-in vitro-Translationsprobe
(RRL, Promega) verwendet.
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Die
in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die PABP 5'UTR-Sequenz zu einer
effizienten GUS-Genexpression
im RRL-System führte.
Ferner führte
PABP 5'UTR zu einer
GUS-Genexpression in HeLa-Zellen (Tabelle 4).
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BEISPIEL 3
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Identifizierung einer
neuen IRES-Sequenz, die aus der mRNA 5'UTR der 48K MAP-Kinase aus Tabak isoliert wurde
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Das
Ziel dieses Beispiels ist es, die Gültigkeit unseres Ansatzes zur
Suche neuer pflanzlicher IRESs zu bestätigen. Von der Liste vermutlicher
IRESs (8) wurde die 5'UTR
der 48K MAP-Kinase (MAPK) aus Tabake ausgewählt, um die Effizienz der Methode
zur Vorhersage und Identifizierung neuer IRES-Sequenzen zu bestätigen.
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Klonierstrategie:
Der Ansatz zur Isolation der 48K MAPK-IRES ist in 10 dargestellt.
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Die
erhaltenen DNA-Konstrukte wurden mit NotI linearisiert und mit T7-Polymerase
transkribiert. RNS-Transkripte wurden mit LiCl präzipitiert,
in Wasser gelöst
und mit Ethanol repräzipitiert.
RNA-Konzentrationen wurden mittels Spektrophotometrie gemessen,
und je 5 μg
jeden Transkripts wurden für
eine 25 μl-in vitro-Translationsprobe
(RRL, Promega) verwendet.
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Die
in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse zeigen das die 5'UTR der 48K-MAPK
zu einer effizienten GUS-Genexpression
in RRL führen
kann.
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Tabelle
2: Eukaryotische zelluläre
mRNA IRESs
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Tabelle
3: GUS-Genexpression in RRL mittels der PABP 5'UTR in bicistronischen Konstrukten.
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Tabelle
4: GUS Expression in HeLa Zellen mittels der PABP 5'UTR (Aktivitäten in RLU).
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Tabelle
5: GUS-Genexpression in RRL mittels der 48K MAPK 5'UTR in bicistronischen
Konstrukten.
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